WO2021087539A1 - Herstellung und verwendung von verdichtetem kollagen - Google Patents

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WO2021087539A1
WO2021087539A1 PCT/AT2020/060387 AT2020060387W WO2021087539A1 WO 2021087539 A1 WO2021087539 A1 WO 2021087539A1 AT 2020060387 W AT2020060387 W AT 2020060387W WO 2021087539 A1 WO2021087539 A1 WO 2021087539A1
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collagen
hours
pressing
pressing direction
container
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PCT/AT2020/060387
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English (en)
French (fr)
Inventor
Christian BURGARD
Alex KRABLER
Original Assignee
3D Spine Matrix Biotechnologie Gmbh
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    • B30B9/04—Presses specially adapted for particular purposes for squeezing-out liquid from liquid-containing material, e.g. juice from fruits, oil from oil-containing material using press rams
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/38—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of the spine, vertebrae or intervertebral discs

Definitions

  • the invention relates to compacted, gelled collagen which, among other things, can be used as an implant for the surgical treatment of a herniated disc.
  • the causes of this wear and tear can be complex and can be traced back to increased stress or overexertion, such as through obesity or incorrect posture, pathological causes, little physical activity or aging.
  • the damage caused by the above causes to cartilage tissue, which serves as a shock absorber in the joints, leads to increased wear on the joints.
  • the consequences of wear and tear on the joints include pain, which can also radiate into other parts of the body, and a restriction in mobility.
  • One possibility of treating worn joints is an operation, together with a joint replacement (i.e. endoprosthesis) or a cartilage transplant or chondrocyte implantation.
  • Intervertebral discs are compression-elastic intervertebral discs which are located between the vertebral bodies of the cervical, thoracic and len denspine.
  • the intervertebral disc is ver malleable and has limited compressibility and flexibility. Because of these properties, it takes part in the movements of the spine.
  • the intervertebral disc and the vertebral joints form a functional unit that reacts elastically even to strong mechanical loads.
  • the inside of the intervertebral discs consists of a nucleus pulposus.
  • This cell-poor tissue consists of about 80% water and also of fibroblasts and type 2 Collagen.
  • the fibrous cartilage tissue (annulus fibrosus) encloses the nucleus pulposus.
  • Hyaline cartilage is located at the upper and lower interfaces of the intervertebral disc with the bones of the vertebral bodies.
  • the leaked nucleus pulposus material can lead to nerve irritation and / or pinching, which leads to pain, especially radiating into the legs or arms, or to sensory disturbances and a reduction in strength.
  • Herniated discs are treated both non-surgically, such as through physiotherapy or the use of painkillers, and surgically, such as by means of nucleotomy, in which the protruding part of the intervertebral disc is removed. Following a nucleotomy, for example, a replacement material can be implanted.
  • Patent application DE 10026 789 A1 discloses a bio-matrix as a cartilage replacement which contains at least 1.5 mg / mL non-compacted collagen.
  • An uncompacted collagen biomatrix is generally not suitable as a replacement for mechanically stressed collagen, such as the nucleus pulposus, due to its lower strength.
  • biomatrix examples of a biomatrix that could be used, among other things, as a replacement material for nucleus pulposus material is disclosed in patent application DE 10241 817 A1.
  • the biomatrix described therein is preferably used gelled collagen fibers, which are then compressed, whereby a final collagen concentration of up to 1000 mg / mL is possible.
  • the compression takes place, for example, by pressure, which is exerted one-dimensionally.
  • a first aspect of the present invention relates to a method for producing compacted collagen comprising the steps of a) pressing a gelled collagen in a first pressing direction and b) pressing the gelled collagen from step a) in a substantially orthogonal to the first pressing direction nalen, second pressing direction, the pressing in step a) being carried out at a pressure in the range from 0.01 to 0.05 bar and in step b) at a pressure in the range from 0.5 bar to 2 bar.
  • gelled collagen is first pressed in one direction.
  • This is followed by a second step in which the one-dimensional compressed Collagen from the first process step is further pressed in a second pressing direction essentially orthogonal to the first pressing direction.
  • a compacted collagen matrix can be produced which has sufficient strength to be used, among other things, as a nucleus pulposus replacement. Comparable strengths or collagen densities cannot be achieved with conventional methods (see, for example, DE 10241 817 A1).
  • Another aspect of the present invention relates to a collagen-containing product comprising compressed collagen obtainable by a method according to the present invention.
  • the compressed collagen which can be produced by the method according to the invention, can be part of a collagen-containing product which is used for a wide variety of purposes.
  • Yet another aspect of the present invention relates to an implant comprising a collagen-containing product according to the present invention or compressed collagen obtainable by a method according to the present invention.
  • Collagen in particular compressed collagen, can be used, inter alia, as a replacement for cartilage. Since cartilage is characterized primarily by its strength and flexibility at the same time, it is crucial that a cartilage substitute has comparable properties, in particular with regard to its biocompatibility, as endogenous cartilage. These properties can be achieved by pressing gelled collagen at least two-dimensionally. Therefore, a collagen-containing product, which according to the invention comprises compressed collagen, is particularly suitable for use as an implant.
  • Another aspect of the present invention relates to a device for carrying out the method according to the invention, comprising:
  • a container comprising an interior space delimited by a floor and at least one wall, wherein the The container is designed to receive a gelled water-containing collagen in the interior and • a piston which closes the interior of the container and is displaceable in a first pressing direction running in the direction of the bottom, characterized in that the at least one wall comprises segments, at least one of these Segments is displaceable in a, essentially orthogonally oriented to the first pressing direction, second pressing direction.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a use of the device according to the invention in the method according to the invention.
  • Fig. 1 shows the results of the determination of the flexibility when using the implant according to the invention in a section of the human spine.
  • Fig. 2 shows the results of the determination of the pressure within the intervertebral disc when using the inventive implant in a section of the human spine.
  • Fig. 3 shows the results of the determination of the disc height when using the implant according to the invention in a section of the human spine.
  • FIG. 4 shows the results of the determination of the resistance to renewed prolapse when the implant according to the invention is used in a section of the human spine.
  • Fig. 5 shows an embodiment of the device according to the invention.
  • gelled collagen is first pressed in a first pressing direction and then in a second pressing direction.
  • the pressing in the first and / or second pressing direction takes place at least in each case once.
  • the starting material for this process is gelled collagen.
  • Gelled collagen can be made by gelling dissolved collagen.
  • Cartilage, tendons, ligaments and bones can serve as a source of dissolved collagen, with cartilage being the most preferred source.
  • the cartilage, tendons, ligaments and bones come preferably from mammals such as cattle, pigs, sheep and rats and are obtained according to methods known in the prior art (e.g. DE 10026 789).
  • the use of certain methods for the production of collagen, such as that of DE 100 26 789, have the advantage that the collagen does not have to be further processed after its production in order to be used in a mammal or human.
  • Compressed collagen refers to gelled collagen which has a higher density than non-compressed collagen due to at least two pressing processes.
  • Compressed or compressed collagen preferably has at least 10 times, preferably one at least 20-fold, even more preferably at least 40-fold compression (for example from 6 mg / ml to 240 mg / ml), even more preferably at least 80-fold compression, compared to the starting material (uncompacted collagen).
  • a second pressing direction essentially orthogonal to a first pressing direction means that in the method according to the invention at least one pressing step is provided which has a pressing direction 9 which is essentially orthogonal to a first pressing direction 6 is.
  • Pressing direction is the direction in which pressure is applied to the gelled collagen.
  • the pressing of the gelled collagen in step a) in a first direction and / or the pressing in step b) in a second direction, which is essentially orthogonal to the first pressing direction can take place taking into account various parameters selected from a group consisting of pressure, duration, temperature and final dimension, wherein the parameters pressure, duration and temperature can preferably be varied in order to produce the compressed collagen according to the invention.
  • the pressing is carried out in step a) at a pressure in the range from 0.012 to 0.03 bar, preferably in the range from 0.015 to 0.025 bar, particularly preferably at 0.01833 bar, and / or in step b) carried out at a pressure in the range from 1 to 1.5 bar, preferably at 1.01551 bar.
  • the air pressure is not included in these pressure specifications. This means that the pressure actually applied to the collagen to be compressed is the sum of the pressures or pressure ranges mentioned above and the prevailing air pressure (e.g. 1.01325 bar at sea level).
  • the pressing takes place in step a) and / or step b) by a linear or stepwise increasing pressure.
  • the pressure that is exerted on the collagen during pressing can either be constant (i.e. a defined pressure during steps a) and b)) or increase over time.
  • the pressure on the collagen can be increased linearly or in stages.
  • step a) is for 1 to 48 hours, preferably for 6 to 24 hours, even more preferably for 8 hours to 18 hours, even more preferably for 10 hours to 14 hours, in particular for 12 hours, and / or step b) for 6 to 96 hours, preferably for 12 to 72 hours, even more preferably for 24 to 66 hours, even more preferably for 30 to 60 hours , even more preferably for 36 to 54 hours, even more preferably for 42 hours to 52 hours, even more preferably for 46 hours to 50 hours, in particular for 48 hours.
  • the pressure is preferably applied over a longer period of time, in particular in order to achieve the maximum possible and, on the other hand, constant compression in the compressed collagen body.
  • step a) and / or step b) takes place at a temperature from 0 ° C to 20 ° C, preferably from 0 ° C to 15 ° C, even more preferably from 0 ° C to 10 ° C , even more preferably from 1 ° C to 9 ° C, even more preferably from 2 ° C to 8 ° C, in particular from 4 ° C to 6 ° C.
  • the pressed collagen produced with the method according to the invention can have different dimensions, depending on the subsequent area of use.
  • a final dimension of the pressed gelled collagen of 1.5 to 5 mm, preferably from 2 to 4 mm, even more preferably from 2.4 mm to 3.0 mm, even more preferably from 2.6 mm to 2.8 mm, in particular from 2.7 mm edge length.
  • the gelled collagen used for the two-dimensionally pressed gelled collagen can, according to a preferred embodiment, be provided by gelling a collagen-containing solution.
  • the collagen-containing solution comprises preferably 1 to 20 mg, more preferably 1 to 10 mg, even more preferably 2 mg to 8 mg, even more preferably 4 mg to 6 mg, in particular 5.5 mg to 6.5 mg, dissolved collagen per mL of solution.
  • the collagen-containing solution by dissolving collagen in a first aqueous solution comprising 0.01 to 1%, preferably 0.05 to 0.5%, preferably 0.01 to 0.2%, in particular 0.1%, of an organic acid with a pKa value of preferably 4.5 to 5, even more preferably from 4.6 to 4.9, in particular from 4.7 to 4.8 , wherein the organic acid is preferably acetic acid.
  • a first aqueous solution comprising 0.01 to 1%, preferably 0.05 to 0.5%, preferably 0.01 to 0.2%, in particular 0.1%, of an organic acid with a pKa value of preferably 4.5 to 5, even more preferably from 4.6 to 4.9, in particular from 4.7 to 4.8 , wherein the organic acid is preferably acetic acid.
  • cartilage, tendons, ligaments and bones can serve as a source of dissolved collagen.
  • the dissolved collagen is particularly preferably isolated from tendons of rat tails, the method described in DE 10026 789 preferably being used for its isolation.
  • the dissolved collagen is of type 1 collagen.
  • This type of collagen is fiber-forming and occurs in skin, tendons, bones, dentine, fiber cartilage and the cornea.
  • the dissolved collagen has a purity of greater than 90%, preferably greater than 95%, even more preferably greater than 99%, in particular greater than 99.8%.
  • the gelling of the dissolved collagen can be carried out by adding a pH-increasing agent.
  • the gelation process preferably takes place over a period of 30 minutes to 10 hours, preferably from 45 minutes to 5 hours, even more preferably from 1 to 4 hours, even more preferably from 2 to 3 hours, most preferably for about 2.5 hours Hours instead.
  • the solution can be stirred or mixed continuously or irregularly for the purpose of improved mixing. It is crucial in this process that the mixing takes place in such a way that the structure of the gelled collagen is not destroyed.
  • the pH-increasing agent is used in a ratio to the collagen in the collagen-containing solution of 0.1: 2 (v / v), preferably 0.5: 1.5 ( v / v), even more preferably from 0.8: 1.2 (v / v), most preferably from 1: 1
  • the pH-increasing agent is added in an amount of the collagen-containing solution that the pH of the resulting collagen-containing solution to 7.0 to 9.0, preferably to 7.0 to 8.0, more preferably from 7.1 to 7.8, even more preferably from 7.3 to 7.5.
  • the pH-increasing agent is preferably added to the collagen-containing solution in an amount such that the solution in which the collagen gels has a pH of from 7.0 to 7.4.
  • the pH-increasing agent is a buffer substance, preferably 2- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid (HEPES).
  • HEPES 2- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid
  • the pH-increasing agent can either be dissolved in water or added directly (also as a solid substance) to the dissolved collagen.
  • the pH-increasing agent is part of an aqueous composition comprising preferably at least one component selected from the group consisting of Ham's F12 medium, sodium hydrogen carbonate and D-glucose.
  • the compacted collagen is transferred to a receiving vessel which contains a second aqueous solution.
  • the shape of the receptacle is preferably not angular, but essentially elliptical, essentially round or circular.
  • the second aqueous solution is preferably a saline solution, more preferably PBS + .
  • the transfer into the receiving vessel is preferably used to adapt the outer shape of the compressed collagen to the cross section of the receiving vessel by the transition from an essentially angular cross-section to an essentially non-angular, more preferably essentially elliptical, even more preferably essentially round, most preferably substantially circular, cross-section.
  • Another aspect of the present invention relates to a collagen-containing product which comprises the compressed collagen according to the invention and which can be obtained by the method according to the invention.
  • the product which can be produced using the method according to the invention has an opaque to yellowish color.
  • the product has a three-dimensional shape, which is preferably essentially cylindrical.
  • This cylindrical three-dimensional shape is preferably characterized in that it comprises an essentially non-angular, more preferably essentially elliptical, even more preferably essentially round, most preferably essentially circular base area with a diameter of 2 mm to 5 mm, preferably 2, 7 mm to 4.5 mm, even more preferably from 3.2 mm to 3.8 mm, in particular from approx. 3.5 mm.
  • the product according to the invention preferably has viscoelastic and / or osmotic properties (preferably comparable to those of a native nucleus pulposus material), is mechanically stable and / or highly compressed (preferably up to or more than 240 mg / ml).
  • the compressed collagen produced according to the invention also has the properties of a hydrogel.
  • Another aspect of the present invention relates to an implant which comprises the collagen-containing product according to the invention.
  • the implant according to the invention can be used for a wide variety of purposes.
  • the implant according to the invention can be used as a nucleus pulposus replacement, meniscus replacement, ligament replacement and / or tendon replacement, whereby it is particularly good as a nucleus pulposus replacement, for the treatment of meniscus injuries (e.g. meniscus tear) and ligament injuries (carpal ligament, yellow ligament, inguinal ligament , Kneecap ligament, anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament).
  • meniscus injuries e.g. meniscus tear
  • ligament injuries carpal ligament, yellow ligament, inguinal ligament , Kneecap ligament, anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament.
  • the kollagenhal term product according to the invention can be shaped into a suitable implant and implanted.
  • the implant is a long-term implant, which is characterized in that cells, more preferably cells of the intervertebral disc, can migrate.
  • the implant according to the invention in the case of an intervertebral disc implant, can become a tissue similar to nucleus pulpo.
  • the implant can be implanted by means of an operation.
  • This operation can be performed on animals, especially mammals, and humans.
  • the implant according to the invention can be displaced by means of an aid from the receiving vessel to the target location, which is preferably located within the annulus fibrosus. Because of its properties, the implant according to the invention is suitable as a replacement for nucleus pulposus material.
  • the operation is carried out using a minimally invasive surgical technique.
  • the operation is preferably carried out as the treatment of a herniated disc, which is preferably associated with pain, preferably with back pain and / or leg pain.
  • the amount of the implant according to the invention is preferably determined according to the height of the adjacent intervertebral disc and / or pressed in at its target location.
  • the operation preferably takes place after a nucleotomy and / or is preferably concluded by closing the annulus fibrosus.
  • the collagen-containing product or the implant comprises compressed collagen with a density of greater than 150 mg / ml, more preferably greater than 200 mg / ml, most preferably greater than 240 mg / ml.
  • the collagen-containing product and / or the implant with the above-mentioned density is preferably produced by the method according to the invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a device 1 for carrying out the method according to the invention, comprising:
  • a container 2 comprising an interior space 5 delimited by a bottom 3 and at least one wall 4, the container 2 being designed to receive and receive a gelated water-containing collagen in the interior space 5
  • a piston 7 which terminates the interior 5 of the container 2 and can be displaced in a first pressing direction 6 running in the direction of the bottom, the at least one wall comprising 4 segments, at least one of these segments 8 being essentially orthogonal the first pressing direction 6 oriented, the second pressing direction 9 is displaceable.
  • the container 2 preferably comprises a sterilizable material suitable for cell culture, preferably Polytetrafon® HS 11097, or is at least partially coated on the surface that is brought into contact with the collagen with this material suitable for cell culture .
  • the base 3, the at least one wall 4 and / or the piston 7 has at least one opening 10 opening into the interior 5 for removing water from the interior 5 of the container 2.
  • This at least one opening 10 is preferably designed in such a way that gelled collagen cannot be pressed through this at least one opening 10 in the course of a pressing process.
  • the at least one opening 10 therefore preferably has a size from 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, preferably from 100 to 300 ⁇ m, even more preferably from 120 to 250 ⁇ m, even more preferably from 130 to 200 ⁇ m, in particular from 160 ⁇ m.
  • the bottom 3, the at least one wall 4 and / or the piston 7 can also comprise or consist of a sufficiently mechanically stable material, which is porous, preferably over the entire area that was in contact with the piston when used properly Contact is made and what can be permeable to water.
  • a sufficiently mechanically stable material which is porous, preferably over the entire area that was in contact with the piston when used properly Contact is made and what can be permeable to water.
  • the use of porous and water-permeable materials is particularly advantageous, as this can be produced without inserting separate openings (e.g. by drilling).
  • the pores of a porous material correspond to the openings 10 as defined herein.
  • Porous plastics which are composed of granules which are connected to one another in the sintering process are particularly suitable. This creates cavities (pores) that allow gases and, above all, liquids such as water to flow through the parts.
  • Porous plastic products can be made from various thermoplastic materials, with ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE), high-density polyethylene (HDPE), polypropylene (PP), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylidene fluoride (PVDF) ), Polyethersulfone (PES) and PE / PP copolymer are particularly preferred.
  • UHMWPE ultra-high molecular weight polyethylene
  • HDPE high-density polyethylene
  • PP polypropylene
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PES Polyethersulfone
  • PE / PP copolymer are particularly preferred.
  • the pore size is dimensioned so
  • water can include further substances and salts that are contained in the starting material to be compressed.
  • water can be equated with “aqueous solution”.
  • the at least one opening 10 for removing water from the interior 5 of the container 2 is connected to at least one further container 11 for receiving water.
  • the device according to the invention has an additional container 11 for absorbing water. This prevents water from leaking out of the device directly into the environment.
  • the water can be removed from the container 11.
  • the device 1 comprises at least one locking means 12, which is designed for the piston 7 displaceable in the first pressing direction 6 and / or the segment 8 displaceable in the second pressing direction 9 in an end position of the first 6 and / or second pressing direction 9 to lock the container 2.
  • a locking is particularly advantageous since this enables the piston 7, which is displaceable in the first pressing direction 6, and / or the segment 8, which is displaceable in the second pressing direction 9, to be fixed in one position. If the pressure on the collagen to be compressed is reduced or completely removed after the compression process, the shape of the compressed collagen can be retained by means of a lock. In addition, the locking enables the collagen to be compressed in a second direction. This makes it possible to compress the piston in both compression directions in a single device without using a second device.
  • the locking of the at least one locking means 12 is preferably releasable.
  • the at least one locking means 12 is preferably a screw connection (eg screw, nut), a nail, a pin or a clamp. Another aspect of the present invention relates to a use of the device 1 according to the invention in the method according to the invention.
  • steps a) and / or b) are carried out in the container 2 of the device 1 according to the invention.
  • the container 2 in which the gelled collagen is pressed is at least partially water-permeable.
  • the base 3, the at least one wall 4 and / or the piston 7 preferably have at least one opening 10 opening into the interior 5 for removing water from the interior 5 of the container 2.
  • These openings 10 are preferably designed in such a way that gelled collagen is not pressed through these openings 10 in the course of a pressing process.
  • the walls or boundaries therefore have openings 10 with a size of 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, preferably 100 to 300 ⁇ m, even more preferably 120 to 250 ⁇ m, even more preferably 130 to 200 ⁇ m, in particular 160 ⁇ m, on.
  • the gelling of the dissolved collagen is carried out in the same container 2 as the pressing of the gelled collagen.
  • This container 2 preferably consists of a sterilizable material suitable for cell culture, preferably PolytetrafIon® HS 11097, or is at least partially coated on the surface that is brought into contact with the collagen with this material suitable for cell culture.
  • FIG. 5 shows a section of the front view (a) and a section of the side view that is independent of the first section View (b) of a preferred embodiment of the device 1 according to the invention, which comprises a container 2, comprising an interior space 5 delimited by a base 3 and at least one wall 4.
  • the container 2 is designed to receive a gelled, water-containing collagen in the interior space 5.
  • the container 2 comprises a piston 7, which closes the inner space 5 of the container 2 and extends in the direction of the bottom, displaceable first pressing direction 6.
  • the device 1 is characterized in that the at least one wall comprises 4 segments, at least one of these segments 8 is displaceable in a second pressing direction 9 oriented essentially orthogonally to the first pressing direction 6.
  • the bottom 3 has an opening 10 opening into the interior 5 for removing water from the interior 5 of the container 2.
  • This opening 10 for removing water from the interior 5 of the container 2 is connected to a further container 11 for absorbing water.
  • the device 1 comprises two locking means 12, which are designed to lock the piston 7, which is displaceable in the first pressing direction 6, and the segment 8, which is displaceable in the second pressing direction 9, in an end position of the first and second pressing direction on the container 2.
  • Example 1 describes the production of collagen from tendons of rat tails and refers to commercially available collagen type I solutions.
  • Example 2 describes the gelation of the collagen GC.
  • the gelation of the collagen GC comprised, for example, the following steps: a. Production of a gel neutralization solution comprising the following components, shown in Table 1:
  • Table 1 Components of the gel neutralization solution b.Mixing the collagen GC solution with the gel neutralization solution in a ratio of 1: 1 (v / v) until it is homogeneous, which results in neutralization to the physiological pH value. c. Pouring the homogeneous solution from the previous step into a rectangular cross-section Casting chamber (length: 20 cm, width: 2.7 cm, height 5 cm). The casting chamber is placed in an apparatus. d.Gelling of the homogeneous solution from the previous step in the casting chamber for 2.5 h at 34 ° C
  • Example 3 describes the two-dimensional pressing of the gelled collagen GC.
  • the two-dimensional pressing of the gelled collagen GC comprised, for example, the following steps: a. Conversion of the apparatus from Example 2, in which the plastic lid was replaced by a cover with a stamp (weight of hood + stamp 1.01 kg) lower filter plate with PBS + solution c. using the spacers d. closing the apparatus with the cover e.First pressing for 12 h at 2-6 ° C to a final dimension of 2.7 mm f. Removal of the one-dimensionally pressed gelled column GC g. Inserting the one-dimensionally pressed gelled column GC into the apparatus with the lateral opening of the Casting chamber i.e. using the spacers in the second pressing at 2-6 ° C to a final dimension of 2.7 mm comprised the following steps: i. 2.5 kg for 4 h ii. 5 kg for 20 h iii. 10 kg for 24 hours
  • Example 4 Further processing of the pressed collagen GC
  • Example 4 describes the further processing of the two-dimensionally pressed collagen GC.
  • the further processing of the two-dimensionally pressed collagen GC comprised, for example, the following steps: a. Removal of the two-dimensionally pressed collagen GC with an edge length of 2.7 mm from the apparatus b. Assembly of the two-dimensionally pressed collagen GC in, for example, 5 cm long pieces c Transfer the pieces from the previous step into application tubes with an inner diameter of 3.5 mm filled with PBS + buffer, causing the pieces to swell to a round cross-section with a diameter of 3.5 mm. D. Storage of the pieces from the previous step at 2-10 ° C e.Gamma sterilization of the pieces from one of the two previous steps at 15-20 kGy, preferably 17.5-17.7 kGy at 2-37 ° C
  • Example 5 Biomechanical tests of the product according to the invention as an implant after a herniated disc
  • Example 5 describes the biomechanical properties of the product according to the invention, which is used as an implant in Splitting human spine after a herniated disc was used.
  • the product according to the invention can be used as an implant in the treatment of a herniated disc.
  • These properties include, for example, the collagen content of 240 mg / mL, which is similar to that of the native nucleus pulposus.
  • the implant according to the invention was produced by the method according to the invention.
  • the implant consisted of 98.5% pure native collagen type I and had the following dimensions: 50 mm x 3.5 mm (length x diameter).
  • Example 5b Origin and preparation of the samples of the spine
  • the six samples were from four human donors. Each sample consisted of a disc and its two adjacent vertebrae, which gives the disc level. A Pfirmann grade of 1-3 was rated as appropriate disc quality for the indication of disc prolapse.
  • the samples were freed from soft tissue and muscle fibers. To adequately mount the samples in the test equipment To be able to do this, they were embedded in polymethyl methacrylate (PMMA) at the cranial and caudal ends.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • a "box-cut" of 6 x 7 mm was made in the anulus fibrosus.
  • a box-cut is a rectangular opening that can be made using a gouge. This cavity was created in order to include the anulus fibrosus in a later step to be able to close a corresponding implant.
  • Disc prolapse i.e. the passage of the nucleus pulposus material through the annulus fibrosus.
  • the cyclical load test was carried out in the servohydraulic loading frame (Instron 8871, Darmstadt, Germany).
  • a specially made rotating base was mounted on the support surface of the materials testing machine.
  • the sample was flanged to the rotating base, which maintained a rotating speed of 360 ° / min.
  • the rotation base was then shifted sideways by 30 mm in order to achieve an eccentric cyclic loading of the samples.
  • the load on the hydraulic piston has been increased linearly to 350 N.
  • a sinusoidal force in the range of 100-600 N was applied at 5 Hz up to a maximum of 100,000 cycles. This maximum of 100,000 cycles was defined in order to carry out the experiments within 12 hours and thus avoid degradation of the samples.
  • the 30 mm side shift worked effectively like a lever arm, so that a maximum of 18 Nm could be applied.
  • the test or exposure was stopped when the nucleus pulposus material leaked.
  • the leaked nucleus pulposus material was removed, including from the box cut produced. A partial nucleotomy was therefore performed.
  • Implantation of the implant according to the invention The implantation was minimally invasive.
  • the implant according to the invention was pressed into the intervertebral disc by means of a stamp.
  • the nucleus pulposus material is enclosed in an intact intervertebral disc by the annulus fibrosus, giving it natural support.
  • the defect produced by means of a "box cut" was made by the anulus fibrosus closure device Barricaid®
  • Example 5d Performing the Biomechanical Tests Test Environment
  • the sample was first fixed at the caudal end. Pure flexion moments were applied to the cranial end at a constant 1.5 ° / s. Here, ⁇ 7.5 Nm were used for the following directions: lateral flexion right / left (+/-), flexion / stretching (+/-) and left / right (+/-) axial rotation.
  • the samples were exposed to 3.5 load cycles. The first 2.5 served as pre-cycles to minimize the effect of a visco-elastic reaction. The last cycle was used for the results.
  • the pressure within the intervertebral disc was recorded by means of an implanted pressure sensor which was positioned in the nucleus of the intervertebral disc. Determination of the intervertebral disc height
  • the height of the intervertebral disc was determined using the Instron material testing machine. A pre-force of 100 N was applied to the sample for 5 s before the measurement.
  • the cyclical load tests were carried out in the servo-hydraulic loading frame (Instron 8871, Darmstadt, Germany).
  • a specially made rotating base was mounted on the support surface of the materials testing machine.
  • the samples were flanged to the rotation base, which maintained a rotation speed of 360 ° / min.
  • the rotation base was then shifted sideways by 30 mm in order to achieve an eccentric cyclic loading of the samples.
  • the load on the hydraulic piston has been increased linearly to 350 N. Then a sinusoidal force in the range of 100-600 N was applied at 5 Hz up to a maximum of 100,000 cycles. The 30 mm side shift worked effectively like a lever arm, so that a maximum of 18 Nm could be applied. After the implantation, the test was not stopped before 100,000 load cycles when the core material emerged, but when the implant emerged. This maximum of 100,000 cycles was defined in order to carry out the experiments within 12 hours and thus avoid degradation of the samples.
  • Figure 1 shows the results of this test, which in the intact intervertebral disc (a), after the "box cut” (b), after the nucleotomy (c), after the implantation of the inventive implant (d) and after the cyclical load test (s) has been carried out.
  • Figure 2 shows the results of this test, which in the intact disc (a), after the "box cut” (b), after the nucleotomy (c), after the implantation of the inventive implant (d) and after the cyclical load test (s) has been carried out.
  • the pressure within the intervertebral disc could even be increased by the implantation above that in the intact intervertebral disc. In most cases, the pressure could not be reduced by the cyclical stress test either.
  • Figure 3 shows the results of this test, which in the intact intervertebral disc (a), after the "box cut” (b), after the herniated disc (c), after the nucleotomy (d), after the implantation of the invention Implant (e) and after the cyclic exercise test (f).
  • the implantation made it possible to reduce the height of the intervertebral disc to that of an intact intervertebral disc. Here, too, the effect was canceled out by the cyclical stress test. Determination of resistance to renewed prolapse
  • FIG. 4 shows the result of this test.
  • the tweezers point to the implant.
  • the implant remained within the surrounding nucleus pulposus material at the implanted site.
  • the cyclical stress test did not result in any new intervertebral disc prolapse.
  • a disc prolapse has been inflicted on a functional section of the human lumbar spine.
  • the implant according to the invention enabled both the flexibility and the height of the intervertebral disc to be matched to that of the intact intervertebral disc. Following the implantation, the pressure within the intervertebral disc even exceeded that of the intact intervertebral disc.
  • the implant according to the invention is suitable for restoring the properties of an intervertebral disc after a herniated disc.
  • a herniated disc that is associated with back and / or leg pain can be treated using a nucleotomy.
  • nucleus pulposus material is removed.
  • the implant according to the product according to the invention can be used as a replacement for the removed nucleus pulposus material and pushed out of the application tube into the defect by means of a pestle.
  • the amount of the implanted implant can be determined according to the height of the adjacent intervertebral discs, as for example in Hong et al. (Asian Spine Journal, Volume 4, No. 1, Pages 1-6, 2010).
  • the implant according to the invention can be used as a replacement for the removed nucleus pulposus material using a minimally invasive surgical technique. Following the insertion of the implant, the annulus fibrosus should be closed. Suitable closure systems are commercially available, such as Barricaid® (Intrinsic Therapeutics, Germany).

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von verdichtetem Kollagen umfassend die Schritte: a) Pressen eines gelierten Kollagens in einer ersten Pressrichtung und b) Pressen des gelierten Kollagens aus Schritt a) in einer zur ersten Pressrichtung im Wesentlichen orthogonalen zweiten Pressrichtung, wobei das Pressen in Schritt a) bei einem Druck im Bereich von 0,01 bis 0,05 bar und in Schritt b) bei einem Druck im Bereich von 0,5 bar bis 2 bar durchgeführt wird.

Description

HERSTELLUNG UND VERWENDUNG VON VERDICHTETEM KOLLAGEN
TECHNISCHES GEBIET
[0001] Die Erfindung betrifft verdichtetes geliertes Kol- lagen, welches u.a. als Implantat zur operativen Behandlung eines Bandscheibenvorfalles eingesetzt werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
[0002] Die Abnutzung der Gelenke bei Tieren, insbesondere Säu getieren, und Menschen ist ein weit verbreitetes Problem.
Die Ursachen für diese Abnutzung können vielschichtig sein und auf verstärkte Belastung bzw. Überanstrengung, wie etwa durch Übergewicht oder eine falsche Körperhaltung, patholo gische Ursachen, geringe körperliche Bewegung oder Altern zurückzuführen sein. In vielen Fällen führt die durch obige Ursachen hervorgerufene Schädigung von Knorpelgewebe, das in den Gelenken als Stoßdämpfer dient, zu einer erhöhten Abnutzung der Gelenke. Folgen der Abnutzung der Gelenke sind u.a. Schmerzen, die auch in andere Körperregionen aus strahlen können, und eine Einschränkung der Beweglichkeit. Eine Möglichkeit der Behandlung von abgenützten Gelenken ist eine Operation, einhergehend mit einem Gelenkersatz (d.h. Endoprothese) oder einer Knorpeltransplantation bzw. Chondrozyten Implantation.
[0003] Ein Krankheitsbild, bei dem Knorpelgewebe eine ent scheidende Rolle spielt, ist der Bandscheibenvorfall. Band scheiben sind druckelastische Zwischenwirbelscheiben, wel che zwischen den Wirbelkörpern der Hals-, Brust- und Len denwirbelsäule lokalisiert sind. Die Bandscheibe ist ver formbar und weist eine begrenzte Kompressibilität und Dehn barkeit auf. Aufgrund dieser Eigenschaften nimmt sie an den Bewegungen der Wirbelsäule teil. Die Bandscheibe und die Wirbelgelenke bilden eine funktionelle Einheit, die auch bei starker mechanischer Belastung elastisch reagieren.
[0004] Bandscheiben bestehen im Inneren aus einem Gallertkern (Nucleus pulposus). Dieses zellarme Gewebe besteht etwa zu 80 % aus Wasser und außerdem aus Fibroblasten und Typ-2 Kollagen. Das Faserknorpelgewebe (Anulus fibrosus) um schließt den Nucleus pulposus. An der oberen und unteren Grenzfläche der Bandscheibe zu den Knochen der Wirbelkörper befinden sich hyaline Knorpel.
[0005] Durch degenerative Prozesse entstehen mit steigendem Alter Risse in der Bandscheibe. Nach anschließender Druck belastung, wie etwa durch eine ruckartige Verdrehung der Wirbelsäule, kommt es zum Durchtreten des Nucleus pulposus durch den Anulus fibrosus, was typischerweise mit plötzli chen Schmerzen einhergeht. Dieser pathologische Ablauf wird als Bandscheibenvorfall bezeichnet.
[0006] Durch das ausgetretene Nucleus pulposus-Material kann es zu Nervenreizungen und/oder -quetschungen kommen, welche zu Schmerzen, auch insbesondere ausstrahlend in die Beine oder Arme, oder auch zu Gefühlsstörungen und Kraftminderung führt .
[0007] Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten beseitigen in der Re gel nur die Schmerzen, ohne jedoch die Ursache selbst zu beheben. Bandscheibenvorfälle werden sowohl nicht-operativ, wie etwa durch Krankengymnastik oder die Einnahme von Schmerzmitteln, als auch operativ, wie etwa mittels Nukleo- tomie, bei der der hervorgetretene Teil der Bandscheibe entfernt wird, behandelt. Im Anschluss einer Nukleotomie, beispielsweise, kann ein Ersatzmaterial implantiert werden.
[0008] In der WO 2012/004564 wird u.a. ein Verfahren zur Her stellung eines Biomaterials, welches durch die Verdichtung von Kollagen erhalten wird, beschrieben.
[0009] In der Patentanmeldung DE 10026 789 Al wird eine Bio matrix als Knorpelersatz offenbart, welche mindestens 1,5 mg/mL nicht verdichtetes Kollagen enthält. Eine unverdich- tete Kollagen-Biomatrix ist aufgrund der geringeren Festig keit im Allgemeinen nicht als Ersatz für mechanisch stark belastetes Kollagen, wie z.B. den Nucleus pulposus, geeig net.
[0010] Beispiele für eine Biomatrix, die unter anderem als Er satzmaterial für Nucleus pulposus-Material verwendet werden könnte, ist in der Patentanmeldung DE 10241 817 Al offen bart. Die darin beschriebene Biomatrix nutzt vorzugsweise gelierte Kollagenfasern, welche anschließend verdichtet werden, wodurch eine Kollagenendkonzentration von bis zu 1000 mg/mL möglich ist. Die Verdichtung erfolgt beispiels weise durch Druck, welcher eindimensional ausgeübt wird.
[0011] Die eindimensionale Verdichtung, wie in der
DE 10241 817 Al offenbart, führt zu einer höheren Festig keit in Verdichtungsrichtung im Vergleich zu der nicht ver dichteten Richtung. Dieses eindimensional verdichtete Mate rial gewährleistet jedoch keine ausreichende Festigkeit für dessen Einsatz als Ersatz für den Nucleus pulposus, bei spielsweise.
[0012] Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Biomatrix umfassend verdichtetes Kollagen bereitzu stellen, das eine hohe Dichte und somit eine hohe Festig keit aufweist, um u.a. als Ersatz für den Nucleus pulposus eingesetzt zu werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
[0013] Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass ver dichtetes geliertes Kollagen, welches zumindest zweidimen sional gepresst wurde, eine höhere Festigkeit aufweist, als geliertes Kollagen, welches nur eindimensional oder nicht gepresst wurde. Daher betrifft ein erster Aspekt der vor liegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von ver dichtetem Kollagen umfassend die Schritte a) Pressen eines gelierten Kollagens in einer ersten Pressrichtung und b) Pressen des gelierten Kollagens aus Schritt a) in ei ner zur ersten Pressrichtung im Wesentlichen orthogo nalen zweiten Pressrichtung, wobei das Pressen in Schritt a) bei einem Druck im Bereich von 0,01 bis 0,05 bar und in Schritt b) bei einem Druck im Bereich von 0,5 bar bis 2 bar durchgeführt wird.
[0014] Im erfindungsgemäßen Verfahren wird geliertes Kollagen zunächst in einer Richtung gepresst. Anschließend erfolgt ein zweiter Schritt, in dem das eindimensional verdichtete Kollagen aus dem ersten Verfahrensschritt in einer zur ers ten Pressrichtung im Wesentlichen orthogonalen zweiten Pressrichtung weiter gepresst wird. Durch diesen zweiten Schritt kann eine verdichtete Kollagenmatrix erzeugt wer den, die eine ausreichende Festigkeit aufweist, um u.a. als Nucleus pulposus-Ersatz eingesetzt zu werden. Vergleichbare Festigkeiten oder Kollagendichten können mit herkömmlichen Verfahren (siehe z.B. DE 10241 817 Al) nicht erzielt wer den.
[0015] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein kollagenhaltiges Produkt umfassend verdichtetes Kol lagen erhältlich nach einem Verfahren gemäß der vorliegen den Erfindung.
[0016] Das verdichtete Kollagen, welches durch das erfindungs gemäße Verfahren hergestellt werden kann, kann Teil eines kollagenhaltigen Produkts sein, welches für verschiedenste Zwecke eingesetzt wird.
[0017] Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung be trifft ein Implantat umfassend ein kollagenhaltiges Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung bzw. verdichtetes Kollagen erhältlich nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Er findung .
[0018] Kollagen, insbesondere verdichtetes Kollagen, kann u.a. als Knorpelersatz eingesetzt werden. Da sich Knorpel vor allem durch seine Festigkeit bei gleichzeitiger Flexibili tät auszeichnet, ist es entscheidend, dass ein Knorpeler satz vergleichbare Eigenschaften insbesondere auch hin sichtlich dessen Biokompatibilität aufweist, wie körperei gener Knorpel. Diese Eigenschaften können dadurch erzielt werden, in dem geliertes Kollagen zumindest zweidimensional gepresst wird. Daher eignet sich ein kollagenhaltiges Pro dukt, welches erfindungsgemäß verdichtetes Kollagen um fasst, besonders zum Einsatz als Implantat.
[0019] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Ver fahrens, umfassend:
• ein Behältnis, umfassend einen von einem Boden und zumindest einer Wand begrenzten Innenraum, wobei das Behältnis dazu ausgebildet ist ein geliertes wasser haltiges Kollagen im Innenraum aufzunehmen und • einen den Innenraum des Behältnisses abschließenden in eine, in Richtung des Bodes verlaufende, erste Pressrichtung verschiebbaren Kolben, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Wand Seg mente umfasst, wobei zumindest eines dieser Segmente in eine, im Wesentlichen orthogonal auf die erste Pressrichtung orientierte, zweite Pressrichtung verschiebbar ist.
[0020] Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung be trifft eine Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
[0021] Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Flexibi lität bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Implantats in einem Abschnitt der menschlichen Wirbelsäule.
[0022] Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung des Druckes innerhalb der Bandscheibe bei der Anwendung des erfindungs gemäßen Implantats in einem Abschnitt der menschlichen Wir belsäule.
[0023] Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Band scheibenhöhe bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Im plantats in einem Abschnitt der menschlichen Wirbelsäule.
[0024] Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Wider standsfähigkeit gegen einen erneuten Prolaps bei der Anwen dung des erfindungsgemäßen Implantats in einem Abschnitt der menschlichen Wirbelsäule.
[0025] Fig. 5 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung .
BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
[0026] Im erfindungsgemäßen Verfahren wird geliertes Kollagen zunächst in einer ersten Pressrichtung und anschließend in einer zweiten Pressrichtung gepresst. Die Pressung in die erste und/oder zweite Pressrichtung erfolgt zumindest je einmal. Ausgangsmaterial für dieses Verfahren ist geliertes Kollagen .
[0027] Geliertes Kollagen kann durch Gelieren von gelösten Kollagen hergestellt werden. Als Quelle von gelösten Kol lagen können Knorpel, Sehnen, Bänder und Knochen dienen, wobei Knorpel die am meisten bevorzugte Quelle darstellt.
Die Knorpel, Sehnen, Bänder und Knochen stammen bevorzugt von Säugetieren wie z.B. Rinder, Schweine, Schafe und Rat ten und werden nach im Stand der Technik bekannten Verfah ren (z.B. DE 10026 789) gewonnen. Die Verwendung bestimmter Verfahren zur Gewinnung von Kollagen, wie z.B. jenes der DE 100 26 789, haben den Vorteil, dass das Kollagen im An schluss an dessen Gewinnung nicht weiterverarbeitet werden muss, um in einem Säugetier bzw. Menschen angewendet zu werden .
[0028] Neben Kollagen aus Säugetieren, eignen sich auch Qual len und Pflanzen als weitere Quellen für Kollagen.
[0029] „Verdichtetes Kollagen", wie hier verwendet, bezieht sich auf geliertes Kollagen, welches durch zumindest zwei Pressvorgänge eine höhere Dichte aufweist, als nicht ver- presstes Kollagen. Verpresstes bzw. verdichtetes Kollagen weist vorzugsweise eine mindestens 10-fache, vorzugsweise eine mindestens 20-fache, noch mehr bevorzugt eine mindes tens 40-fache Verdichtung (beispielsweise von 6 mg/ml auf 240 mg/ml), noch mehr bevorzugt eine mindestens 80-fache Verdichtung, gegenüber dem Ausgangsmaterial (unverdichtetes Kollagen) auf.
[0030] „Eine zu einer ersten Pressrichtung im Wesentlichen or thogonale zweite Pressrichtung", wie hier verwendet, bedeu tet, dass im erfindungsgemäßen Verfahren zumindest ein Pressschritt vorgesehen ist, der eine Pressrichtung 9 auf weist, die im Wesentlichen orthogonal zu einer ersten Pressrichtung 6 ist.
[0031] „Pressrichtung", wie hier verwendet, ist die Richtung in die der Druck auf das gelierte Kollagen ausgeübt wird.
[0032] Das Pressen des gelierten Kollagens in Schritt a) in einer ersten Richtung und/oder das Pressen in Schritt b) in einer zweiten Richtung, welche im Wesentlichen orthogonal zur ersten Pressrichtung ist, kann unter Berücksichtigung verschiedener Parameter, die ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus Druck, Dauer, Temperatur und Endmaß, erfolgen, wobei vorzugsweise die Parameter Druck, Dauer und Temperatur variiert werden können, um das erfindungsgemäße verdichtete Kollagen herzustellen.
[0033] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Pres sen in Schritt a) bei einem Druck im Bereich von 0,012 bis 0,03 bar, vorzugsweise im Bereich von 0,015 bis 0,025 bar, besonders bevorzugt bei 0,01833 bar, und/oder in Schritt b) bei einem Druck im Bereich von 1 bis 1,5 bar, vorzugsweise bei 1,01551 bar, durchgeführt. In diesen Druckangaben ist der Luftdruck nicht enthalten. D.h. der tatsächlich auf das zu verdichtende Kollagen aufgebrachte Druck ist die Summe der oben erwähnten Drücke bzw. Druckbereiche und dem vor herrschenden Luftdruck (z.B. auf Meereshöhe 1,01325 bar).
[0034] Es hat sich gezeigt, dass es bei Anwendung eines Drucks in dem genannten Bereich auf Kollagen zu einer schonenden und gleichzeitig gleichmäßigen Verdichtung des Kollagens führt. Der auf das Kollagen aufgebrachte Druck wird vor zugsweise auf das gesamte zu verdichtende Kollagen im We sentlichen gleichmäßig verteilt aufgebracht.
[0035] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Pressen in Schritt a) und/oder Schritt b) durch einen li near oder stufenförmig steigenden Druck.
[0036] Der Druck, der beim Pressen auf das Kollagen ausgeübt wird, kann entweder konstant sein (d.h. ein definierter Druck während der Schritte a) und b)) oder über die Zeit ansteigen. Die Steigerung des Drucks auf das Kollagen kann dabei linear oder stufenförmig erfolgen. Selbstverständlich ist es auch möglich zunächst einen steigenden Druck gefolgt von einem konstanten Druck oder umgekehrt auf das zu ver dichtende Kollagen anzulegen. Bei einem steigenden Druck liegt der Endpunkt (d.h. der maximal zu erreichende Druck) in den oben genannten Bereich.
[0037] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt a) für 1 bis 48 Stunden, vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden, noch mehr bevorzugt für 8 Stunden bis 18 Stunden, noch mehr bevorzugt für 10 Stunden bis 14 Stunden, insbesondere für 12 Stunden, und/oder Schritt b) für 6 bis 96 Stunden, vor zugsweis für 12 bis 72 Stunden, noch mehr bevorzugt für 24 bis 66 Stunden, noch mehr bevorzugt für 30 bis 60 Stunden, noch mehr bevorzugt für 36 bis 54 Stunden, noch mehr bevor zugt für 42 Stunden bis 52 Stunden, noch mehr bevorzugt für 46 Stunden bis 50 Stunden, insbesondere für 48 Stunden, durchgeführt .
[0038] Aufgrund der bevorzugten Pressdrücke, die im erfin dungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, wird der Druck vorzugsweise über einen längeren Zeitraum angelegt, insbe sondere um einerseits die maximal mögliche und andererseits eine konstante Kompression im komprimierten Kollagenkörper zu erreichen.
[0039] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt a) und/oder Schritt b) bei einer Temperatur von 0°C bis 20°C, vorzugsweise von 0°C bis 15°C, noch mehr bevorzugt von 0°C bis 10°C, noch mehr bevorzugt von 1°C bis 9°C, noch mehr bevorzugt von 2°C bis 8°C, insbesondere von 4°C bis 6°C.
[0040] Das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte gepresste Kollagen kann unterschiedliche Maße aufweisen, abhängig vom späteren Einsatzgebiet. Für bestimmte Anwen dungen (z.B. als Ersatz für Discus intervertebralis) ent steht gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bei Schritt a) und/oder Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Endmaß des gepressten gelierten Kollagens von 1,5 bis 5 mm, vorzugsweise von 2 bis 4 mm, noch mehr bevorzugt von 2,4 mm bis 3,0 mm, noch mehr bevorzugt von 2,6 mm bis 2,8 mm, insbesondere von 2,7 mm Kantenlänge.
[0041] Das für das zweidimensional gepresste gelierte Kollagen eingesetzte gelierte Kollagen kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform durch Gelieren einer Kollagen-haltigen Lö sung bereitgestellt werden. Die Kollagen-haltige Lösung um fasst vorzugsweise 1 bis 20 mg, noch mehr bevorzugt 1 bis 10 mg, noch mehr bevorzugt 2 mg bis 8 mg, noch mehr bevor zugt 4 mg bis 6 mg, insbesondere 5,5 mg bis 6,5 mg, gelös tes Kollagen pro mL Lösung.
[0042] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kollagen-haltige Lösung durch Lösen von Kollagen in einer ersten wässrigen Lösung umfassend 0,01 bis 1%, vorzugsweise 0,05 bis 0,5%, vorzugs weise 0,01 bis 0,2%, insbesondere 0,1%, einer organischen Säure mit einem pKs-Wert von vorzugsweise 4,5 bis 5, noch mehr bevorzugt von 4,6 bis 4,9, insbesondere von 4,7 bis 4,8, hergestellt, wobei die organische Säure vorzugsweise Essigsäure ist. Verfahren zur Herstellung der Kollagen-hal- tigen Lösung sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
[0043] Wie bereits eingangs erwähnt, können als Quelle von ge lösten Kollagen Knorpel, Sehnen, Bänder und Knochen dienen. Besonders bevorzugt wird das gelöste Kollagen aus Sehnen von Rattenschwänzen isoliert, wobei vorzugsweise das in der DE 10026 789 beschrieben Verfahren zu dessen Isolation verwendet wird.
[0044] Gemäß einer bevorzugteren Ausführungsform ist das ge löste Kollagen vom Kollagen Typ 1. Dieser Kollagentyp ist faserbildend und kommt in Haut, Sehnen, Knochen, Dentin, Faserknorpel und der Kornea vor.
[0045] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das gelöste Kollagen eine Reinheit von größer als 90 %, vorzugsweise von größer als 95 %, noch mehr bevorzugt von größer als 99 %, insbesondere von größer als 99,8 % auf.
[0046] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen den Erfindung kann das Gelieren des gelösten Kollagens durch Zugabe eines pH erhöhenden Mittels erfolgen. Der Ge liervorgang findet vorzugsweise über einem Zeitraum von 30 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise von 45 Minuten bis 5 Stunden, noch mehr bevorzugt von 1 bis 4 Stunden, noch mehr bevorzugt von 2 bis 3 Stunden, am meisten bevorzugt für ca. 2,5 Stunden statt. Besonders vorteilhaft ist das Gelieren des Kollagens bei einer Temperatur im Bereich von 15°C bis 50°C, vorzugsweise von 20°C bis 45°C, noch mehr bevorzugt von 25°C bis 40°C, noch mehr bevorzugt von 30°C bis 39°C, am meisten bevorzugt bei ca. 34 °C. Während des Geliervor gangs kann die Lösung zwecks verbesserter Durchmischung kontinuierlich oder unregelmäßig gerührt bzw. vermischt werden. Entscheidend bei diesem Vorgang ist, dass das Durchmischen in einer Weise erfolgt, dass die Struktur des gelierten Kollagens nicht zerstört wird.
[0047] Gemäß einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das pH erhöhende Mittel in ei nem Verhältnis zum Kollagen in der Kollagen-haltigen Lösung von 0,1:2 (v/v), vorzugsweise von 0,5:1,5 (v/v), noch mehr bevorzugt von 0,8:1,2 (v/v), am meisten bevorzugt von 1:1
(v/v) zugegeben.
[0048] Gemäß einer noch bevorzugteren Ausführungsform wird das pH erhöhende Mittel in einer Menge der Kollagen-haltigen Lösung zugegeben, dass sich der pH Wert der sich ergebenden Kollagen-haltigen Lösung auf 7,0 bis 9,0, vorzugsweise auf 7,0 bis 8,0, noch mehr bevorzugt auf 7,1 bis 7,8, noch mehr bevorzugt auf 7,3 bis 7,5, erhöht. Das pH erhöhende Mittel wird vorzugsweise in einer Menge der Kollagen-haltigen Lö sung zugegeben, dass die Lösung in der Kollagen geliert ei nen pH Wert von 7,0 bis 7,4 aufweist.
[0049] Gemäß einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das pH erhöhende Mittel eine Puffersubstanz, vorzugsweise 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinyl)-ethansulfonsäure (HEPES).
[0050] Das pH erhöhende Mittel kann entweder in Wasser gelöst oder direkt (auch als Festsubstanz) dem gelösten Kollagen zugesetzt werden.
[0051] Gemäß einer noch bevorzugten Ausführungsform ist das pH erhöhenden Mittel Teil einer wässrigen Zusammensetzung um fassend vorzugsweise mindestens eine Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ham's F12 Medium, Natriumhyd rogencarbonat und D-Glucose.
[0052] In einer bevorzugten Ausführungsform wird das verdich tete Kollagen im Anschluss an Schritt a) und b) in ein Auf nahmegefäß überführt, welches eine zweite wässrige Lösung enthält . [0053] Vorzugsweise ist die Form des Aufnahmegefäßes nicht eckig, sondern im Wesentlichen ellipsenförmig, im Wesentli chen rund oder kreisrund.
[0054] Die zweite wässrige Lösung ist bevorzugt eine salzhal tige Lösung, noch bevorzugter PBS+.
[0055] Das Überführen in das Aufnahmegefäß dient bevorzugt der Anpassung der Außenform des verdichteten Kollagens an den Querschnitt des Aufnahmegefäßes durch den Übergang von ei nem im Wesentlichen eckigen Querschnitt auf einen im We sentlichen nicht eckigen, bevorzugter im Wesentlichen el lipsenförmigen, noch bevorzugter im Wesentlichen runden, am bevorzugtesten im Wesentlichen kreisrunden Querschnitt.
Dies geschieht bevorzugt durch Aufquellen des Kollagens, noch bevorzugter durch Wasseraufnahme.
[0056] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein kollagenhaltiges Produkt, welches das erfindungsgemäße verdichtete Kollagen umfasst, und welches durch das erfin dungsgemäße Verfahren erhältlich ist.
[0057] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das Pro dukt, welches mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herge stellt werden kann, eine opake bis gelbliche Farbe auf.
[0058] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das Pro dukt eine dreidimensionale Form auf, welche bevorzugt im Wesentlichen zylinderförmig ist. Diese zylinderförmige dreidimensionale Form ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie eine im Wesentlichen nicht eckige, bevorzugter im Wesentlichen ellipsenförmige, noch bevorzugter im Wesentli chen runde, am bevorzugtesten im Wesentlichen kreisrunde Grundfläche umfasst mit einem Durchmesser von 2 mm bis 5 mm, vorzugsweise von 2,7 mm bis 4,5 mm, noch mehr bevorzugt von 3,2 mm bis 3,8 mm, insbesondere von ca. 3,5 mm.
[0059] Das erfindungsgemäße Produkt weist vorzugsweise visko- elastische und/oder osmotische Eigenschaften (bevorzugt vergleichbar mit jenen eines nativen Nucleus pulposus Mate rials) auf, ist mechanisch stabil und/oder hochkomprimiert (vorzugsweise bis zu oder mehr als 240 mg/ml).
[0060] Das erfindungsgemäß hergestellte komprimierte Kollagen weist zudem die Eigenschaften eines Hydrogels auf. [0061] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Implantat, welches das erfindungsgemäße kollagenhaltige Produkt umfasst.
[0062] Das erfindungsgemäße Implantat kann für verschiedenste Zwecke eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Implantat kann als Nucleus pulposus-Ersatz, Meniskusersatz, Bander satz und/oder Sehnenersatz verwendet werden, wobei es sich besonders gut als Nucleus pulposus-Ersatz, zur Behandlung von Meniskusverletzungen (z.B. Meniskusriss) und Bänderver letzungen (Karpalband, gelbes Band, Leistenband, Knieschei benband, vorderes Kreuzband, hinteres Kreuzband) eignet. Je nach Einsatzgebiet kann das erfindungsgemäße kollagenhal tige Produkt zu einem geeigneten Implantat geformt und im plantiert werden.
[0063] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Implantat ein Langzeitimplantat, welches dadurch ge kennzeichnet ist, dass bevorzugt Zellen, noch bevorzugter Zellen der Bandscheibe, einwandern können. Durch das Ein wandern der Zellen kann das erfindungsgemäße Implantat, im Falle eines Bandscheibenimplantats, zu einem Nucleus pulpo sus ähnlichem Gewebe werden.
[0064] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Implantat mittels einer Operation implantiert werden. Diese Operation kann an Tieren, insbesondere Säugetieren, und Menschen durchgeführt werden.
[0065] Im Rahmen der Operation kann das erfindungsgemäße Im plantat mittels eines Hilfsmittels aus dem Aufnahmegefäß an den Zielort, welcher sich bevorzugt innerhalb des Anulus fibrosus befindet, verlagert werden. Das erfindungsgemäße Implantat eignet sich aufgrund seiner Eigenschaften bevor zugt als Ersatz von Nucleus pulposus Material.
[0066] Gemäß einer bevorzugteren Ausführungsform wird die Ope ration mittels minimalinvasiver Operationstechnik durchge führt .
[0067] Die Operation wird bevorzugt als Behandlung eines Band scheibenvorfalles, welcher bevorzugt mit Schmerzen, bevor zugter mit Rücken- und/oder Beinschmerzen einhergeht, durchgeführt . [0068] Die Menge des erfindungsgemäßen Implantats wird bevor zugt nach der Höhe der benachbarten Bandscheibe bestimmt und/oder an seinem Zielort eingepresst.
[0069] Die Operation findet bevorzugt im Anschluss an eine Nukleotomie statt und/oder wird bevorzugt durch den Ver schluss des Anulus fibrosus abgeschlossen.
[0070] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das kollagenhaltige Produkt oder das Implantat verdichtetes Kollagen mit einer Dichte von größer 150 mg/mL, bevorzugter größer 200 mg/mL, am bevorzugtesten größer 240 mg/mL.
[0071] Bevorzugt wird das kollagenhaltige Produkt und/oder das Implantat mit der oben genannten Dichte durch des erfin dungsgemäße Verfahren hergestellt.
[0072] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung 1 zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend:
• ein Behältnis 2, umfassend einen von einem Boden 3 und zumindest einer Wand 4 begrenzten Innenraum 5, wobei das Behältnis 2 dazu ausgebildet ist ein ge liertes wasserhaltiges Kollagen im Innenraum 5 auf zunehmen und
• einen den Innenraum 5 des Behältnisses 2 abschlie ßenden in eine, in Richtung des Bodes verlaufende, erste Pressrichtung 6 verschiebbaren Kolben 7, wobei die zumindest eine Wand 4 Segmente umfasst, wobei zu mindest eines dieser Segmente 8 in eine, im Wesentlichen or thogonal auf die erste Pressrichtung 6 orientierte, zweite Pressrichtung 9 verschiebbar ist.
[0073] Das Behältnis 2 umfasst vorzugsweise ein sterilisierba res zellkultur-geeignetem Material, bevorzugt Polytetraf- lon® HS 11097, oder ist an der Oberfläche, die mit dem Kol lagen in Kontakt gebracht wird, mit diesem zellkultur-ge eignetem Material zumindest teilweise beschichtet.
[0074] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen den Erfindung weist der Boden 3, die zumindest eine Wand 4 und/oder der Kolben 7 zumindest eine in den Innenraum 5 einmündende Öffnung 10 zum Entfernen von Wasser aus dem In nenraum 5 des Behältnisses 2 auf. [0075] Diese zumindest eine Öffnung 10 ist vorzugsweise so ge staltet, dass geliertes Kollagen im Zuge eines Pressvor gangs nicht durch diese zumindest eine Öffnung 10 gepresst werden kann. Daher weist die zumindest eine Öffnung 10 be vorzugt eine Größe von 50 pm bis 500 pm, vorzugsweise von 100 bis 300 pm, noch mehr bevorzugt von 120 bis 250 pm, noch mehr bevorzugt von 130 bis 200 pm, insbesondere von 160 pm, auf.
[0076] Der Boden 3, die zumindest eine Wand 4 und/oder der Kolben 7 können auch ein ausreichend mechanisch stabiles Material umfassen bzw. aus diesem bestehen, welches porös, vorzugsweise über den gesamten Bereich, der mit dem Kol lagen bei sachgemäßer Anwendung in Kontakt steht, und was serdurchlässig sein kann. Die Verwendung von porösen und wasserdurchlässigen Materialen ist insbesondere von Vor teil, da dieses ohne Einfügung von gesonderten Öffnungen (z.B. durch Bohrungen) herstellbar ist. Die Poren eines po rösen Materials entsprechen den Öffnungen 10 wie hierin de finiert .
[0077] Besonders geeignet sind poröse Kunststoffe, die sich aus Granulaten zusammensetzen, welche im Sinterprozess mit einander verbunden werden. Dadurch entstehen Hohlräume (Po ren) die bewirken, dass Gase und vor allem Flüssigkeiten wie Wasser die Teile durchströmen können. Poröse Kunst stoffprodukte, wie in der erfindungsgemäßen Vorrichtung einsetzbar, können aus diversen thermoplastischen Materia lien hergestellt werden, wobei ultrahochmolekulares Po lyethylen (UHMWPE), hochdichtes Polyethylen (HDPE), Polyp ropylen (PP), Polytetrafluoroethylen (PTFE), Polyvinyliden- fluorid (PVDF), Polyethersulfon (PES) und PE/PP Copolymer besonders bevorzugt verwendet werden. Die Porengröße wird so bemessen, dass Wasser das Material durchdringen kann, jedoch nicht das kollagenhaltige Material.
[0078] Der Begriff „Wasser", wie hier verwendet, kann weitere Substanzen und Salze, die im zu komprimierenden Ausgangsma terial enthalten sind, umfassen. In diesem Zusammenhang kann „Wasser" mit „wässriger Lösung" gleichgesetzt werden. [0079] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die zumindest eine Öffnung 10 zum Entfernen von Wasser aus dem Innenraum 5 des Behältnis ses 2 mit zumindest einem weiteren Behältnis 11 zur Was seraufnahme verbunden sind.
[0080] Um das bei der Kompression des kollagenhaltigen Materi als anfallende Kompressionswasser abzuführen, weist die er findungsgemäße Vorrichtung ein zusätzliches Behältnis 11 zur Wasseraufnahme auf. Dadurch wird verhindert, dass Was ser aus der Vorrichtung direkt in die Umgebung austritt.
Nach Abschluss des Kompressionsverfahrens kann das Wasser aus dem Behältnis 11 entfernt werden.
[0081] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Vorrichtung 1 zumindest ein Arretierungsmittel 12, welches dazu ausgebildet ist den in die erste Pressrichtung 6 verschiebbaren Kolben 7 und/o der das in die zweite Pressrichtung 9 verschiebbare Segment 8 in einer Endposition der ersten 6 und/oder zweiten Press richtung 9 am Behältnis 2 zu arretieren.
[0082] Eine Arretierung ist besonders vorteilhaft, da diese ermöglicht den in die erste Pressrichtung 6 verschiebbaren Kolben 7 und/oder das in die zweite Pressrichtung 9 ver schiebbare Segment 8 in einer Position zu fixieren. Sollte nach dem Kompressionsvorgang der Druck auf das zu kompri mierende Kollagen reduziert bzw. zur Gänze entfernt werden, kann durch eine Arretierung die Form des komprimierten Kol- lagens beibehalten werden. Zudem ermöglicht die Arretie rung, dass das Kollagen in einer zweiten Richtung kompri miert wird. Dadurch ist es möglich die Kompression des Kol- lagens in beiden Kompressionsrichtungen in einer einzigen Vorrichtung zu ermöglichen ohne eine zweite Vorrichtung zu verwenden .
[0083] Die Arretierung des zumindest einen Arretierungsmittels 12 ist bevorzugt lösbar.
[0084] Das zumindest eine Arretierungsmittel 12 ist vorzugs weise eine Schraubverbindung (z.B. Schraube, Mutter), ein Nagel, ein Stift oder eine Klemme. [0085] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
[0086] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen den Erfindung werden die Schritte a) und/oder b) in dem Be hältnis 2 der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 durchgeführt.
[0087] Da Wasser nicht komprimierbar ist, ist es beim Pressen des gelierten Kollagens von Vorteil, wenn das Behältnis 2, in dem das gelierte Kollagen verpresst wird, zumindest teilweise wasserdurchlässig gestaltet ist.
[0088] Der Boden 3, die zumindest eine Wand 4 und/oder der Kolben 7 weisen vorzugsweise zumindest eine in den Innen raum 5 einmündende Öffnung 10 zum Entfernen von Wasser aus dem Innenraum 5 des Behältnisses 2 auf. Diese Öffnungen 10 sind vorzugsweise so gestaltet, dass geliertes Kollagen im Zuge eines Pressvorgangs nicht durch diese Öffnungen 10 ge presst wird. Daher weisen die Wände bzw. Begrenzungen Öff nungen 10 in einer Größe von 50 gm bis 500 gm, vorzugsweise von 100 bis 300 pm, noch mehr bevorzugt von 120 bis 250 pm, noch mehr bevorzugt von 130 bis 200 pm, insbesondere von 160 pm, auf.
[0089] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen den Erfindung wird das Gelieren des gelösten Kollagens im selben Behältnis 2 durchgeführt wie das Pressen des gelier ten Kollagens. Dieses Behältnis 2 besteht vorzugsweise aus einem sterilisierbaren zellkultur-geeignetem Material, be vorzugt PolytetrafIon® HS 11097, oder ist an der Oberflä che, die mit dem Kollagen in Kontakt gebracht wird, mit diesem zellkultur-geeignetem Material zumindest teilweise beschichtet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
[0090] Figuren 1 bis 4 sind im Abschnitt der Beispiele be schrieben.
[0091] Figur 5 zeigt einen Schnitt der Vorderansicht (a) und einen vom ersten Schnitt unabhängigen Schnitt der Seitenan- sicht (b) einer bevorzugte Ausführungsform der erfindungs- gemäßen Vorrichtung 1, welche ein Behältnis 2, umfassend einen von einem Boden 3 und zumindest einer Wand 4 begrenz ten Innenraum 5 umfasst. Das Behältnis 2 ist dazu ausgebil det ein geliertes wasserhaltiges Kollagen im Innenraum 5 aufzunehmen. Weiters umfasst das Behältnis 2 einen den In nenraum 5 des Behältnisses 2 abschließenden, in Richtung des Bodes verlaufende, erste Pressrichtung 6 verschiebbaren Kolben 7. Die Vorrichtung 1 ist dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Wand 4 Segmente umfasst, wobei zu mindest eines dieser Segmente 8 in eine, im Wesentlichen orthogonal auf die erste Pressrichtung 6 orientierte, zweite Pressrichtung 9 verschiebbar ist. Der Boden 3 weist eine in den Innenraum 5 einmündende Öffnung 10 zum Entfer nen von Wasser aus dem Innenraum 5 des Behältnisses 2 auf. Diese Öffnung 10 zum Entfernen von Wasser aus dem Innenraum 5 des Behältnisses 2 ist mit einem weiteren Behältnis 11 zur Wasseraufnahme verbunden. Die Vorrichtung 1 umfasst zwei Arretierungsmittel 12, welche dazu ausgebildet sind den in die erste Pressrichtung 6 verschiebbaren Kolben 7 und das in die zweite Pressrichtung 9 verschiebbare Segment 8 in einer Endposition der ersten und zweiten Pressrichtung am Behältnis 2 zu arretieren.
[0092] Im Folgenden sind Beispiele zur Veranschaulichung der Erfindung beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung des Kollagen GC
[0093] Beispiel 1 beschreibt die Herstellung des Kollagen aus Sehnen von Rattenschwänzen und verweist auf kommerziell er hältliche Kollagen Typ I Lösungen.
[0094] Die Isolation von Kollagen aus Sehnen von Rattenschwän zen kann wie im Stand der Technik, beispielsweise in DE 100 26 789, beschrieben durchgeführt werden.Hierbei entsteht Kollagen MS, welches von älteren Ratten isoliert wurde als Kollagen GC.
Beispiel 2: Gelierung des Kollagen GC
[0095] Beispiel 2 beschreibt die Gelierung des Kollagen GC. [0096] Die Gelierung des Kollagen GC umfasste beispielhaft folgende Schritte: a.Herstellung einer Gelneutralisationslösung, umfassend folgende Bestandteile, dargestellt in Tabelle 1:
Tabelle 1: Bestandteile der Gelneutralisationslösung
Figure imgf000019_0001
b.Mischen der Kollagen GC Lösung mit der Gelneutralisa tionslösung im Verhältnis 1:1 (v/v) bis zur Homogeni tät, wodurch eine Neutralisation auf physiologischen pH-Wert erfolgte c.Gießen der homogenen Lösung aus dem vorherigen Schritt in eine im Querschnitt rechteckige Gießkammer (Länge: 20 cm, Breite: 2,7 cm, Höhe 5 cm). Die Gießkammer ist in einer Apparatur platziert. d.Gelierung der homogenen Lösung des vorherigen Schrit tes in der Gießkammer für 2,5 h bei 34 °C
Beispiel 3: Pressen des gelierten Kollagens GC
[0097] Beispiel 3 beschreibt das zweidimensionale Pressen des gelierten Kollagen GC.
[0098] Das zweidimensionale Pressen des gelierten Kollagen GC umfasste beispielhaft folgende Schritte: a.Umbau der Apparatur aus Beispiel 2, worin der Kunst stoffdeckel durch eine Abdeckhaube mit einem Stempel (Gewicht Haube + Stempel 1,01 kg) ersetzt wurde b.Anfeuchten der unteren Filterplatte mit PBS+-Lösung c.Verwendung der Spacer d.Verschließen der Apparatur mit der Abdeckhaube e.Erste Pressung für 12 h bei 2-6 °C auf ein Endmaß von 2,7 mm f.Entnahme des eindimensional gepressten gelierten Kol- lagens GC g.Einlegen des eindimensional gepressten gelierten Kol- lagens GC in die Apparatur unter seitlicher Öffnung der Gießkammer h.Verwendung der Spacer i.Zweite Pressung bei 2-6 °C auf ein Endmaß von 2,7 mm umfasste folgende Schritte: i. 2,5 kg für 4 h ii. 5 kg für 20 h iii. 10 kg für 24 h
Beispiel 4: Weiterverarbeitung des gepressten Kollagens GC
[0099] Beispiel 4 beschreibt die Weiterverarbeitung des zwei dimensional gepressten Kollagens GC.
[0100] Die Weiterverarbeitung des zweidimensional gepressten Kollagens GC umfasste beispielhaft folgende Schritte: a.Entnahme des zweidimensional gepressten Kollagens GC mit einer Kantenlänge von 2,7 mm aus der Apparatur b.Konfektionieren des zweidimensional gepressten Kolla gens GC in beispielsweise 5 cm lange Stücke c.Überführen der Stücke aus dem vorherigen Schritt in mit PBS+-Puffer gefüllte Applikationsröhrchen mit einem Innendurchmesser von 3,5 mm, wodurch die Stücke auf einen runden Querschnitt mit einem Durchmesser von 3,5 mm aufquollen d.Lagerung der Stücke aus dem vorherigen Schritt bei 2- 10°C e.Gamma-Sterilisation der Stücke aus einem der beiden vorherigen Schritte bei 15-20 kGy, bevorzugt 17,5-17,7 kGy bei 2-37 °C
Beispiel 5: Biomechanische Tests des erfindungsgemäßen Produktes als Implantat nach einem Bandscheibenvorfall
[0101] Beispiel 5 beschreibt die biomechanischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Produktes, welches als Implantat in Teilen humaner Wirbelsäulen nach einem Bandscheibenvorfall eingesetzt wurde.
[0102] Aufgrund der Eigenschaften des erfindungsgemäßen Pro duktes kann es als Implantat bei der Behandlung eines Band scheibenvorfalles verwendet werden. Zu diesen Eigenschaften zählen beispielsweise der Kollagengehalt von 240 mg/mL, welcher dem vom nativen Nucleus pulposus ähnelt.
[0103] Beispiel 5a: Herstellung des Implantats
[0104] Die Herstellung des erfindungsgemäßen Implantats er folgte nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Das Implantat bestand zu 98,5 % aus purem nativem Kollagen Typ I und hatte folgende Dimensionen: 50 mm x 3,5 mm (Länge x Durch messer) .
[0105] Beispiel 5b: Herkunft und Vorbereitung der Proben der Wirbelsäule
[0106] Die in vitro Versuche wurden an sechs Proben, welche funktionelle Einheiten der menschlichen Lendenwirbelsäule darstellten, durchgeführt. Tabelle 2 stellt eine Übersicht der Proben dar.
Tabelle 2
Figure imgf000021_0001
[0107] Die sechs Proben stammten von vier menschlichen Spen dern. Jede Probe bestand aus einer Bandscheibe und ihren beiden angrenzenden Wirbeln, wodurch sich das Bandscheiben- level ergibt. Ein Pfirmann-Grad von 1-3 wurde als angemes sene Bandscheibenqualität für die Indikation eines Band scheibenprolapses gewertet.
[0108] Die Proben wurden von Weichteilgewebe und Muskelfasern befreit. Um die Proben in den Testgeräten adäquat montieren zu können wurden diese jeweils am kranialen und am kaudalen Ende in Polymethylmethacrylat (PMMA) eingebettet.
[0109] Beispiel 5c: Schritte der Probenbehandlung
[0110] Erzeugung eines posterioren Defektes
[0111] Mittels einer Knochenzange wurde jede Probe einer La- minektomie unterzogen. Hierbei wurde ein „Box-cut" von 6 x 7 mm im Anulus Fibrosus erzeugt. Ein Box-cut ist eine rechteckige Öffnung, welche mittels eines Hohlmeißels er stellt werden kann. Dieser Hohlraum wurde erzeugt, um in einem späteren Schritt den Anulus Fibrosus mit einem ent sprechenden Implantat verschließen zu können.
[0112] Erzeugen eines Bandscheibenprolapses
[0113] Mittels eines zyklischen Belastungstests wurde ein
Bandscheibenprolaps, d.h. der Durchtritt des Nucleus pulpo- sus-Materials durch den Anulus fibrosus, erzeugt.
[0114] Der zyklische Belastungstest wurden im servohydrauli- schen Laderahmen (Instron 8871, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Ein speziell angefertigter Drehsockel wurde an der Stützfläche der Materialprüfmaschine montiert. Die Probe wurde an die Rotationsbasis angeflanscht, die eine Rotationsgeschwindigkeit von 360°/min beibehielt. Die Rota tionsbasis wurde dann um 30 mm seitlich verschoben, um eine exzentrische zyklische Belastung der Proben zu erreichen. Die Belastung des Hydraulikkolbens wurde linear auf 350 N erhöht. Anschließend wurde eine sinusförmige Kraft im Be reich von 100-600 N bei 5 Hz bis maximal 100.000 Zyklen aufgebracht. Dieses Maximum von 100.000 Zyklen wurde defi niert, um die Experimente innerhalb von 12 Stunden durchzu führen und so eine Degradation der Proben zu vermeiden. Die 30 mm Seitenverschiebung wirkte effektiv wie ein Hebelarm, so dass maximal 18 Nm aufgebracht werden konnten. Der Test bzw. die Belastung wurde abgebrochen, als der das Nucleus pulposus-Material austrat. Das ausgetretene Nucleus pulpo- sus-Material wurde entfernt, auch aus dem erzeugten Box- cut. Es wurde daher eine Teil-Nukleotomie durchgeführt.
[0115] Implantation des erfindungsgemäßen Implantats Die Implantation erfolgte minimalinvasiv. Das erfindungsgemäße Implantat wurde mittels eines Stempels in die Bandscheibe ge drückt. Das Nucleus pulposus-Material ist in einer intakten Bandscheibe durch den Anulus fibrosus umschlossen und erhält dadurch eine natürliche Stütze. Um die Funktionalität des er findungsgemäßen Implantats festzustellen und diese mit dem Nu cleus pulposus-Material in einer intakten Bandscheibe zu ver gleichen, wurde der mittels „Box-cut" erzeugte Defekt durch die Anulus fibrosus-Verschlussvorrichtung Barricaid®
(Intrinsic Therapeutics, Deutschland) verschlossen.
[0116] Beispiel 5d: Durchführung der biomechanischen Tests [0117] Testumgebung
[0118] Die Tests wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Dabei waren die Proben in mit Salzlösung getränktem Verbandsmull gewickelt um Dehydrierung und Desintegration zu vermeiden^ [0119] Bestimmung der Flexibilität
[0120] Dieser Test wurde bei der intakten Bandscheibe, nach dem „Box-cut", nach der Nukleotomie, nach der Implantation des erfindungsgemäßen Implantats und nach dem zyklischen Belastungstest durchgeführt.
[0121] Zur Bestimmung der Flexibilität wurde die Probe zu nächst am kaudalen Ende fixiert. Auf das kraniale Ende wur den reine Beugemomente mit konstant 1,5 °/s aufgebracht. Hierbei wurden ± 7,5 Nm für folgende Richtungen eingesetzt: laterale Beugung rechts/links (+/-), Beugung/Dehnung (+/-) und links/rechts (+/-) axiale Rotation.
[0122] Die Proben wurden 3,5 Belastungszyklen ausgesetzt. Die ersten 2,5 dienten als Vorzyklen, um den Effekt einer visko-elastischen Reaktion zu minimieren. Der letzte Zyklus wurde für die Ergebnisse herangezogen.
[0123] Bestimmung des Druckes innerhalb der Bandscheibe [0124] Dieser Test wurde bei der intakten Bandscheibe, nach dem „Box-cut", nach der Nukleotomie, nach der Implantation des erfindungsgemäßen Implantats und nach dem zyklischen Belastungstest durchgeführt.
[0125] Der Druck innerhalb der Bandscheibe wurde mittels einem implantierten Drucksensors erfasst, welcher im Nucleus der Bandscheibe positioniert wurde. [0126] Bestimmung der Bandscheibenhöhe
[0127] Dieser Test wurde bei der intakten Bandscheibe, nach dem „Box-cut", nach dem Bandscheibenvorfall, nach der Nuk- leotomie, nach der Implantation des erfindungsgemäßen Im plantats und nach dem zyklischen Belastungstest durchge führt .
[0128] Die Höhe der Bandscheibe wurde mittels der Instron Ma- terialtestmaschine bestimmt. Es wurde eine Vorkraft von 100 N für 5 s vor der Messung auf die Probe aufgebracht.
[0129] Zyklischer Belastungstests
[0130] Dieser Test wurde nach der Implantation des erfindungs gemäßen Implantats durchgeführt.
[0131] Die zyklischen Belastungstests wurden im servohydrauli- schen Laderahmen (Instron 8871, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Ein speziell angefertigter Drehsockel wurde an der Stützfläche der Materialprüfmaschine montiert. Die Proben wurden an die Rotationsbasis angeflanscht, die eine Rotationsgeschwindigkeit von 360°/min beibehielt. Die Rota tionsbasis wurde dann um 30 mm seitlich verschoben, um eine exzentrische zyklische Belastung der Proben zu erreichen.
Die Belastung des Hydraulikkolbens wurde linear auf 350 N erhöht. Anschließend wurde eine sinusförmige Kraft im Be reich von 100-600 N bei 5 Hz bis maximal 100.000 Zyklen aufgebracht. Die 30 mm Seitenverschiebung wirkte effektiv wie ein Hebelarm, sodass maximal 18 Nm aufgebracht werden konnten. Nach der Implantation wurde der Test nicht vor 100.000 Belastungszyklen beim Austritt von Kernmaterial ge stoppt, sondern beim Austritt des Implantats. Dieses Maxi mum von 100.000 Zyklen wurde definiert, um die Experimente innerhalb von 12 Stunden durchzuführen und so eine Degrada tion der Proben zu vermeiden.
[0132] Bestimmung der Widerstandsfähigkeit gegen einen erneu ten Prolaps
[0133] Dieser Test wurde nach dem zyklischen Belastungstest- durchgeführt . [0134] Zur makroskopischen Beurteilung wurden die Bandscheiben an der mittleren transversalen Ebene der Bandscheibe durch geschnitten. Es wurden Fotos zur Bestimmung des Zustandes des Implantats mit einer digitalen Kamera angefertigt.
[0135] Beispiel 5e: Ergebnisse der biomechanischen Tests
[0136] Bestimmung der Flexibilität
[0137] Figur 1 zeigt die Ergebnisse dieses Tests, welcher bei der intakten Bandscheibe (a), nach dem „Box-cut" (b), nach der Nukleotomie (c), nach der Implantation des erfindungs gemäßen Implantats (d) und nach dem zyklischen Belastungs test (e) durchgeführt wurde.
[0138] Es ist ersichtlich, dass der Bewegungsradius im An schluss an die Implantation auf ein vergleichbares Level mit jenem der intakten Bandscheibe sank. Dieser positive Effekt wurde durch den zyklischen Belastungstest wieder aufgehoben .
[0139] Bestimmung des Druckes innerhalb der Bandscheibe
[0140] Figur 2 zeigt die Ergebnisse dieses Tests, welcher bei der intakten Bandscheibe (a), nach dem „Box-cut" (b), nach der Nukleotomie (c), nach der Implantation des erfindungs gemäßen Implantats (d) und nach dem zyklischen Belastungs test (e) durchgeführt wurde.
[0141] Der Druck innerhalb der Bandscheibe konnte durch die Implantation sogar über jenen in der intakten Bandscheibe erhöht werden. Der Druck konnten in den meisten Fällen auch durch den zyklischen Belastungstest nicht gesenkt werden.
[0142] Bestimmung der Bandscheibenhöhe
[0143] Figur 3 zeigt die Ergebnisse dieses Tests, welcher bei der intakten Bandscheibe (a), nach dem „Box-cut" (b), nach dem Bandscheibenvorfall (c), nach der Nukleotomie (d), nach der Implantation des erfindungsgemäßen Implantats (e) und nach dem zyklischen Belastungstest (f) durchgeführt wurde.
[0144] Die Höhe der Bandscheibe konnte durch die Implantation auf jene einer intakten Bandscheibe gesenkt werden. Auch hier wurde der Effekt durch den zyklischen Belastungstest wieder aufgehoben. [0145] Bestimmung der Widerstandsfähigkeit gegen einen erneu ten Prolaps
[0146] Figur 4 zeigt das Ergebnis dieses Tests. Die Pinzette zeigt auf das Implantat. Das Implantat verblieb innerhalb des umgebenden Nucleus pulposus-Materials an der implan tierten Stelle. Es kam durch den zyklischen Belastungstest zu keinem erneuten Bandscheibenprolaps.
[0147] Zusammenfassung der Ergebnisse
[0148] Einem funktionellen Abschnitt der menschlichen Lenden wirbelsäule wurde ein Bandscheibenprolaps zugefügt. Durch das erfindungsgemäße Implantat konnte sowohl die Flexibili tät, als auch die Höhe der Bandscheibe an jene der intakten Bandscheibe angeglichen werden. Der Druck innerhalb der Bandscheibe überstieg im Anschluss an die Implantation so gar jene der intakten Bandscheibe.
[0149] Möglichkeit der Anwendung des erfindungsgemäßen Implan tats im Menschen
[0150] Wie durch die obigen Beispiele gezeigt wurde, eignet sich das erfindungsgemäße Implantat dazu, die Eigenschaften einer Bandscheibe nach einem Bandscheibenvorfall wiederher zustellen. Allgemein, kann ein Bandscheibenvorfall, welcher mit Rücken- und/oder Beinschmerzen einhergeht, mittels ei ner Nukleotomie behandelt werden. Im Rahmen dessen wird Nu cleus pulposus-Material entfernt. Das Implantat gemäß dem erfindungsgemäßen Produkt kann als Ersatz für das entfernte Nucleus pulposus-Material verwendet werden und mittels Stö ßel aus dem Applikationsröhrchen in den Defekt geschoben werden. Die Menge des implantierten Implantats kann nach der Höhe der benachbarten Bandscheiben bestimmt werden, wie beispielsweise in Hong et al. (Asian Spine Journal, Band 4, Nr. 1, Seite 1-6, 2010) beschrieben.
[0151] Der Einsatz des erfindungsgemäßen Implantats als Ersatz für das entfernte Nucleus pulposus-Material kann mittels minimalinvasiver Operationstechnik erfolgen. [0152] Im Anschluss an das Einsetzen des Implantats sollte der Anulus fibrosus verschlossen werden. Geeignete Ver schlusssysteme sind kommerziell erhältlich, wie beispiels weise Barricaid® (Intrinsic Therapeutics, Deutschland).

Claims

ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum Herstellen von verdichtetem Kollagen umfassend die Schritte a) Pressen eines gelierten Kollagens in einer ersten Press richtung (6) und b) Pressen des gelierten Kollagens aus Schritt a) in einer zur ersten Pressrichtung (6) im Wesentlichen orthogonalen zweiten Pressrichtung (9), wobei das Pressen in Schritt a) bei einem Druck im Bereich von 0,01 bis 0,05 bar und in Schritt b) bei einem Druck im Bereich von 0,5 bar bis 2 bar durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Pressen in Schritt a) bei einem Druck im Bereich von 0,012 bis 0,03 bar, vorzugsweise bei 0,01833 bar, und/oder Schritt b) bei einem Druck im Bereich von 1 bar bis 1,5 bar, vorzugsweise bei 1,01551 bar, durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Pressen durch linear oder stufenförmig steigenden Druck erfolgt .
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, dass Schritt a) für 1 bis 48 Stunden, vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden, noch mehr bevorzugt für 8 Stunden bis 18 Stun den, noch mehr bevorzugt für 10 Stunden bis 14 Stunden, insbe sondere für 12 Stunden, und/oder Schritt b) für 6 bis 96 Stun den, vorzugsweis für 12 bis 72 Stunden, noch mehr bevorzugt für 24 bis 66 Stunden, noch mehr bevorzugt für 30 bis 60 Stunden, noch mehr bevorzugt für 36 bis 54 Stunden, noch mehr bevorzugt für 42 Stunden bis 52 Stunden, noch mehr bevorzugt für 46 Stun den bis 50 Stunden, insbesondere für 48 Stunden, durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, dass das gelierte Kollagen durch Gelieren einer Kol- lagen-haltigen Lösung, umfassend 1 bis 20 mg, noch mehr bevor zugt 1 bis 10 mg, noch mehr bevorzugt 2 mg bis 8 mg, noch mehr bevorzugt 4 mg bis 6 mg, insbesondere 5,5 mg bis 6,5 mg, gelös tes Kollagen pro mL Lösung, bereitgestellt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagen-haltige Lösung durch Lösen von Kollagen in ersten einer wässrigen Lösung umfassend 0,01 bis 1%, vorzugsweise 0,05 bis 0,5%, vorzugsweise 0,01 bis 0,2%, insbesondere 0,1%, einer orga nischen Säure mit einem pKs-Wert von vorzugsweise 4,5 bis 5, noch mehr bevorzugt von 4,6 bis 4,9, insbesondere von 4,7 bis 4,8, hergestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelieren des gelösten Kollagens durch Zugabe eines pH erhöhenden Mittels erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das pH erhöhende Mittel eine Puffersubstanz, vorzugsweise 2—(4—(2— Hydroxyethyl)-1-piperazinyl )-ethansulfonsäure (HEPES), ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, dass das verdichtete Kollagen in ein Aufnahmegefäß überführt wird welches eine zweite wässrige Lösung enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite wässrige Lösung salzhaltige Lösung ist.
10. Kollagenhaltiges Produkt umfassend verdichtetes Kollagen er hältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Implantat umfassend ein kollagenhaltiges Produkt nach An spruch 10.
12. Implantat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Implantat als Nucleus pulposus-Ersatz, Meniskusersatz, Bander satz und/oder Sehnenersatz geeignet ist.
13. Kollagenhaltiges Produkt oder Implantat umfassend verdichte tes Kollagen mit einer Dichte von größer 150 mg/mL, bevorzugt größer 200 mg/mL, am bevorzugtesten größer 240 mg/mL.
14. Vorrichtung (1) zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend:
• ein Behältnis (2), umfassend einen von einem Boden (3) und zumindest einer Wand (4) begrenzten Innenraum (5), wobei das Behältnis (2) dazu ausgebildet ist ein gelier tes wasserhaltiges Kollagen im Innenraum (5) aufzunehmen und
• einen den Innenraum (5) des Behältnisses (2) abschließen den in eine, in Richtung des Bodes verlaufende, erste Pressrichtung (6) verschiebbaren Kolben (7), dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Wand (4) Seg mente umfasst, wobei zumindest eines dieser Segmente (8) in eine, im Wesentlichen orthogonal auf die erste Pressrichtung (6) orientierte, zweite Pressrichtung (9) verschiebbar ist.
15. Vorrichtung (1) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden (3), die zumindest eine Wand (4) und/oder der Kolben (7) zumindest eine in den Innenraum (5) einmündende Öff nung (10) zum Entfernen von Wasser aus dem Innenraum (5) des Be hältnisses (2) aufweist.
16. Vorrichtung (1) nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekenn zeichnet, dass die zumindest eine Öffnung (10) zum Entfernen von Wasser aus dem Innenraum (5) des Behältnisses (2) mit zumindest einem weiteren Behältnis (11) zur Wasseraufnahme verbunden sind.
17. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (1) zumindest ein Arretie rungsmittel (12) umfasst, welches dazu ausgebildet ist den in die erste Pressrichtung (6) verschiebbaren Kolben (7) und/oder das in die zweite Pressrichtung (9) verschiebbare Segment (8) in einer Endposition der ersten (6) und/oder zweiten Pressrichtung (9) am Behältnis (2) zu arretieren.
18. Verwendung der Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 14 bis 17 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
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