WO2021060901A1 - 새로운 암 poct 진단시스템 - Google Patents

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WO2021060901A1
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magnetic
magnetic particles
cancer
detection
biomaterial
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정용균
김주호
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주식회사 이지다이아텍
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Definitions

  • the present invention relates to a new cancer POCT diagnosis system, and more particularly, it is possible to quickly determine early cancer and to obtain a prognosis diagnosis in which cancer treatment effects such as anticancer drugs can be seen. As it has high sensitivity, it is possible to accurately detect cancer. It relates to a cancer POCT diagnosis system that can be determined.
  • ITD In vitro diagnosis
  • immunodiagnostic technology can be used for diagnosis and tracking of a wide variety of diseases based on measuring the presence or absence of a specific protein that causes a disease through an antigen-antibody reaction.
  • the immunodiagnostic technology has a disadvantage in that it is possible to diagnose when the target protein is present at a concentration above the detection limit, and various technologies have been developed to amplify the protein generation signal of a low concentration.
  • target substances to be analyzed are diversified in fields such as new drug development and diagnosis, and as one of the detection methods that ensure high-sensitivity signal generation to detect trace amounts of target substances, Several methods of using magnetic particles have been reported (Modern magnetic immunoassay: Biophysical and biochemical aspects (2017) Regul. Mech. Biosyst., 9(1), 47-55).
  • magnetic particles of a nanometer unit size are used, and the surface is modified with silica.
  • magnetic particles having such a silica-modified surface have difficulty in effectively extracting or releasing them from the inside of a well performing an immune reaction. That is, such small-sized magnetic particles often exist in a floating state in a solution state and are not easy to separate, so they are often used for qualitative analysis rather than quantitative analysis.
  • conventional analysis methods can only inspect one magnetic particle at a time, so it takes a long time and complicates the inspection.
  • cancer refers to a malignant neoplasm in which human cells proliferate indefinitely, and has a limit on the rate of metastasis. It means a tumor that invades and metastases.
  • CT or MRI which is difficult to diagnose in small and medium-sized hospitals, is suggested as the only method.
  • CT or MRI it is difficult to distinguish small-sized cancers, and as the cancer is classified by simply using a photographed image, false negatives are high according to the skill level of the medical personnel, and a clear result for the patient cannot be provided.
  • Cancer diagnosis can be applied in an emergency situation, and the test time should be fast and accurate within 1 hour so that the patient can be notified of quick results, results should be derived even with a small number of samples, and two or more biomarkers with high sensitivity. ) Must be able to perform multiple tests simultaneously. In addition, inspection should be simple and maintenance costs should be low with a small equipment so that it can be applied in emergency rooms or small and medium-sized hospitals.
  • Progranulin (GP88) is being injured as a diagnostic marker for breast cancer, liver cancer, gallbladder cancer, and lung cancer. In particular, it has been reported that it is excellent in monitoring the effectiveness of individual chemotherapy and diagnosing individual prognosis. (Vanessa Abellaet et al. (2017) Drug Discovery Today; Tkaczuk, KR et al. (2011) Breast Cancer; Abdulrahman et al. (2019) Cancers; Serrero1 et al. (2012) Cancer Research) Therefore Progranulin (GP88) marker If the companion diagnosis and individual breast cancer prognosis diagnosis kits are developed in the form of POCT, it is thought that individual anticancer treatment effects can be enhanced.
  • the present invention enables rapid detection of early cancer and prognostic diagnosis capable of seeing cancer treatment effects such as anticancer drugs, and magnetism capable of accurately determining cancer as it has high sensitivity. It is intended to provide a cancer POCT diagnosis system including particles.
  • the present invention includes a core comprising a magnet reactive metal; A shell layer surrounding the core and having a uniform thickness; And a capture probe introduced on the shell layer to capture a biomaterial, wherein the capture probe includes an antibody having a biomarker for cancer diagnosis as an antigen.
  • the cancer may be breast cancer, lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, renal carcinoma, leukemia, or glioblastoma.
  • the biomarker may include GP88.
  • the magnetic particles may have a detection limit of 1 ng/ml or less and a dynamic range of log 3 or more.
  • the magnetic particles may be a mixture of two or more types of magnetic particles having different lengths, and capable of simultaneously diagnosing two or more types of the biomarkers.
  • the surface of the shell may have a hydrophilic functional group of 1 ⁇ 80 /nm.
  • the hydrophilic functional group may be a silanol group or a carboxyl group derived from a silanol group, an amino group, a hydroxy group, a thiol group, or an aldehyde group.
  • the capture probe is a magnetic particle that is connected to a hydrophilic functional group on the surface of the shell layer.
  • the core may be 60% or more of the total volume of the magnetic particles.
  • the average surface roughness (Ra) of the surface of the shell layer may be 15 nm or less.
  • the thickness of the shell layer may be 1 to 100 ⁇ m.
  • the magnetic particles may be cuts of glass-coated metal microwires.
  • the magnetic particles may have a size and specific gravity that do not float in water.
  • the magnetic particles may have a microrod shape.
  • the length of the microrod may be 10 to 1,000 ⁇ m.
  • the aspect ratio of the microrod may be 2 or more.
  • the biomarker may be a biomarker in a sample solution derived from an organism.
  • the present invention also includes the steps of: (i) preparing a magnetic microrod composed of a core including a shell made of glass and a magnetic material; (ii) forming silanol by surface-treating the surface of the magnetic microrod with an acidic solution; (iii) immersing the surface-treated magnetic microrods in a silane-based solution to bind a silane compound to the silanol; (iv) replacing the end of the silane compound with an end capable of binding to a probe; And (v) attaching a probe to an end of the silane compound, wherein the probe provides a method for producing magnetic particles comprising an antibody having a biomarker for cancer diagnosis as an antigen.
  • the step (iv) may be performed by immersing the magnetic microrod in a silane-based solution for 6 to 24 hours.
  • the acidic solution may be a mixed solution of sulfuric acid and hydrogen peroxide.
  • the present invention also includes the steps of (1) providing the magnetic particles in a first well; (2) moving the magnetic particles of the first well to a second well using magnetic force; (3) A detection probe conjugated with a luminescent material that can specifically bind to a biological material and emit light by an external stimulus is provided in the second well, and the capture probe, the biological material, and the detection probe react to make magnetic Forming a complex of particle-biomaterial-detection probes; And (4) moving the complex of the magnetic particle-biomaterial-detection probe to the third well using magnetic force, and detecting the biomaterial by measuring a luminescent signal emitted from the luminescent material in the complex by an external stimulus. It provides a method for detecting a biological material comprising the step of.
  • the formation of the complex may include a process of promoting a reaction using an external magnetic force.
  • the detection of the biological material may be multiple detection of two or more kinds of the biological material using two or more kinds of magnetic particles.
  • the multiple detection may include reading the magnetic particles labeled to be distinguished from each other by length, diameter, thickness, shape, color, or identification code.
  • the washing well is provided with 2 to 10 washing wells between the second and third wells, and the washing wells sequentially immerse the complex of the magnetic particle-biomaterial-detection probe to wash the complex. It may contain additionally.
  • the washing step may be a step of immersing and moving the magnetic particle-biomaterial-detection probe complex using an external magnetic force.
  • the method for detecting the biological material may be a diagnosis time of less than 30 minutes.
  • the biomaterial detection method may be performed through a POCT method.
  • the magnetic particles for cancer diagnosis according to the present invention have higher magnetic properties than conventional magnetic particles (especially magnetic beads), so they can be mixed or moved using a magnet with high efficiency, and can be manufactured at a low price. Compared to the diagnosis equipment using particles, the same diagnosis is possible at a lower price.
  • the magnetic particles for cancer diagnosis according to the present invention are capable of simultaneously diagnosing various biomarkers by combining different capture probes according to their length, it is fast when using the Point-Of-Care Test (POCT) diagnosis method according to the present invention.
  • POCT Point-Of-Care Test
  • FIG. 1 is a process flow diagram illustrating a magnetic particle diagnosis system and a diagnosis method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows a method of manufacturing a magnetic microrod according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 3 is a microscope image of the diameter and length of a magnetic microrod according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows a chemical surface treatment process of a magnetic microrod according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a measurement of the change in fluorescence according to the surface treatment of the magnetic particles according to an embodiment of the present invention.
  • (a) is a magnetic particle that is not surface-treated using an acidic solution
  • (b) is an acidic solution. This is a photograph showing each of the magnetic particles that have been surface-treated.
  • FIG. 6 is a comparison of the surface of the magnetic microrod according to an embodiment of the present invention with the surface of the conventional magnetic bead.
  • (a) is the surface of the magnetic microrod of the present invention
  • (b) is the magnetic microrod of the present invention.
  • (C) shows the surface of the conventional magnetic bead
  • (d) shows the outline of the light emission of the conventional magnetic bead, respectively.
  • FIG. 7 shows the optimization results of the magnetic microrod according to an embodiment of the present invention.
  • (a) is a photograph of the change in light emission according to the silanization time
  • (b) is a graph showing the experimental results according to the silanization time. .
  • FIG. 8 shows an example of a length coding system of a magnetic microrod that performs multiple detection functions according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of an antigen-antibody reaction between a magnetic microload and a marker (antigen) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing a mixing heating and washing process of an immune reaction using a magnetic rod and a heating block according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 shows the result of detecting the image and the fluorescence signal detected by the ultra-high sensitivity fluorescence image analyzer according to an embodiment of the present invention.
  • (a) is an image of a magnetic microrod according to an embodiment of the present invention.
  • (b) is a fluorescence image according to an embodiment of the present invention,
  • (c) is a fluorescence image of a magnetic microrod by the analysis system of the present invention,
  • (d) is a fluorescence image by a conventional analysis system, respectively.
  • FIG. 12 shows the results of fluorescence image detection and multiplex analysis of three or more biomarkers using the magnetic microrod length coding system according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of an experiment at a concentration of 0 to 60 ng/ml of GP88 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of an experiment at a concentration of 0 to 60 ng/ml of GP88 according to an embodiment of the present invention.
  • 15 is a photograph showing the results of performing multiple detection of GP88 (on 300 ⁇ m magnetic particles) and P53 (on 400 ⁇ m magnetic particles) according to an embodiment of the present invention. Each of the results is shown.
  • first or second are used to distinguish one component from other components, and the scope of rights is not limited by these terms.
  • a first component may be referred to as a second component, and similarly, a second component may be referred to as a first component.
  • the term'and/or' includes a combination of a plurality of listed items or any of a plurality of listed items.
  • 'A or B' may include'A','B', or'both A and B'.
  • the present invention is a core comprising a magnet reactive metal; A shell layer surrounding the core and having a uniform thickness; And a capture probe introduced on the shell layer to capture a biomaterial, wherein the capture probe comprises an antibody having a biomarker for cancer diagnosis as an antigen.
  • the core portion may include a magnet reactive metal, preferably a magnetic metal or a metal alloyed with a magnetic metal.
  • the magnetic metal may be an alloy including iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), and manganese (Mn).
  • the magnet reactive metal may include rare earth metals such as gadolinium (Gd), terbium (Tb), samarium (Sm), etc., with transition metals such as iron, nickel, cobalt, manganese as a main component, and other boron (B), It may contain silicon (Si), carbon (C), and the like.
  • Representative examples of the magnet reactive metal include an iron alloy or a cobalt alloy.
  • the magnetic metal may be mixed with or alloyed with copper (Cu), gold (Au), silver (Ag), iron (Fe), or platinum (Pt), and more preferably may include a superparamagnetic metal.
  • the core portion does not have magnetism directly, it is magnetized as the magnet approaches, and thus can have an attractive force with the magnet, so that it can be usefully used for movement and mixing using a magnet.
  • the magnetic particles preferably have a size and specific gravity that do not float in the water so that they can be quickly collected or separated by an external magnet such as a permanent magnet or an electromagnet.
  • the core may occupy more than 60% of the total volume of the magnetic particles.
  • the core may be 60 to 99%, preferably 75 to 99% of the total volume of the magnetic particles.
  • the magnetic particles may have a size (eg, diameter or length) of about tens to hundreds of ⁇ m, and a specific gravity of 5 or more, for example, 5 or more and 30 or less.
  • the magnetic particles 130 are nanoparticles having a size of less than 1 micrometer, even particles having a high specific gravity (ex: 7.876 in the case of iron) may float in water.
  • the magnetic particles form a core-shell structure by having a magnet reactive metal in the center and a shell layer surrounding it, and the shell layer may be made of an organic material or an inorganic material, preferably glass ( glass).
  • the glass may be a compound selected from the group consisting of soda lime, borosilicate, aluminosilicate, silica, alkali silicate, pyrex, and quartz as a main component.
  • heat resistance, acid resistance, and water resistance are required for experiments, and may be a borosilicate capable of minimizing non-specific binding to an antibody.
  • the shell surface may include a hydrophilic functional group.
  • the shell surface it may be combined with a capture probe to be described later, including various functional groups.
  • the functional group is a hydrophilic functional group
  • the hydrophilic functional group is a silanol group or a carboxyl group derived from a silanol group, an amino group, a hydroxy group, a thiol group, or an aldehyde. It can be a flag. More preferably, the functional group may be a silanol group.
  • the hydrophilic functional group may be directly bonded to the capture probe, but preferably, it may be bonded using a linker.
  • the linker is located between the hydrophilic functional group and the capture probe so that the capture probe is easily attached to the shell layer.
  • a silane compound more preferably an amino-silane, most preferably 3-aminopropyltri Methoxysilane (3-Aminopropyltrimethoxysilane, APTES) may be used.
  • the silane compound may preferably have a structure of H 2 NL-Si(OR) 3.
  • L is a C 1 to C 12 alkylene or a C 6 to C 20 arylene, or the alkylene and the arylene are optionally bonded.
  • a part of the main chain of L may be substituted with 0 to 4 -NH-, and R is hydrogen or C 1 to C 8 alkyl.
  • the silane compound may preferably be an amino-silane, and as specific examples of the amino-silane, 3-aminopropyltriethoxysilane, aminosilane hydrolysate, and 3-aminopropyl Trimethoxysilane (3-Aminopropyltrimethoxysilane), 2-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane, 2-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane (2-Aminoethyl -3-aminopropyltriethoxysilane), 2-Aminoethyl-3-aminopropyl methyldimethoxysilane, 3-Aminopropylmethyldiethoxysilane, 3-aminopropyl Trimethoxysilane (3-aminopropyltrimethoxysilane), N-2-aminoethyl-3-aminopropyltriethoxysilane, trie
  • the shell layer may substantially completely surround the magnetic particles, but if necessary or during the manufacturing process, the surface of the fine particles may not be completely covered by the shell layer, and a partial area of the magnetic particle surface may be exposed.
  • the core-shell structure may be formed by applying a liquid shell component to a core metal, or may be formed by filling a core metal component into a hollow frame.
  • the shell layer may be solidified from an organic or inorganic liquid coating solution. More specifically, the shell layer may be formed by dissolving a shell component in the form of an organic or inorganic substance at a high temperature or making a liquid coating solution by dissolving it in a solvent or dissolving it in a solvent and then applying it to the core metal.
  • the organic material may be mainly a polymer
  • the inorganic material may be a metal or ceramic, especially glass.
  • a coating solution obtained by melting plastic in a solvent or melting glass may be applied to magnetic particles by dip coating or spray coating to form a shell layer.
  • the magnetic particles may include a capture probe introduced on the shell layer to capture a biomaterial, and the capture probe may be an antibody having a biomarker for cancer diagnosis as an antigen.
  • the presence or absence of cancer is determined by using a biomarker present in the blood, so it is a small equipment applicable to small and medium hospitals and requires less human and spatial costs.
  • it takes an average of 20 to 30 minutes for diagnosis and shows a very high accuracy of about 98% it is very useful for rapid and accurate diagnosis of cancer.
  • the first antibody capable of specifically binding to a cancer biomarker is immobilized on the surface-modified magnetic particles.
  • the magnetic particles are a more improved form of non-spherical/asymmetric fine particles having a structure coated with a magnetic metal with glass, and are configured in a state that can be distinguished by length.
  • the first antibody of the magnetic particle and the cancer biomarker may induce an immune response, and since the binding process of the immune response cannot be directly observed, a labeling material capable of generating a measurable signal may be used.
  • a second antibody-marker complex may be used as a labeling material, and the second antibody is an antibody capable of specifically binding to a cancer biomarker, and the marker may generally include a fluorescent substance or enzyme.
  • the cancer may be breast cancer, lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, renal carcinoma, leukemia or glioblastoma. In the case of the cancer, it can be detected through a common biomarker.
  • PCDGF The 88 kDa glycoprotein PC cell-derived growth factor
  • PCDGF is an autocrine growth factor and was first isolated from highly tumorigenic mouse teratoma PC cells.
  • PCDGF is also known as GP88, Granulin-Epitlin Precursor (GEP), Granulin Precursor, Progranulin, Epitlin Precursor, Proepitlin (PEPI), and Aclogranin (hereinafter referred to as GP88), and is rich in cysteine. It is the largest member of the granulin/Epitlin family of polypeptide growth regulators.
  • GP88 has been reported to stimulate the proliferation and survival of several types of cells of mesenchymal and epithelial origin by stimulating the MAP kinase, PI-3 kinase and FAK kinase pathways.
  • overexpression of GP88 has been found in various cancer cell lines and/or tumor tissues including breast cancer, ovarian cancer, renal carcinoma, various leukemias and glioblastomas.
  • GP88 is not expressed in benign tumors and normal mammary epithelial tissues, so if it is used as a biomarker, it is possible to manufacture a cancer diagnostic kit with high accuracy.
  • GP88 In cancer cells, GP88 is known to play a key role in tumorigenesis. GP88 overexpression is positively associated with estrogen independent growth, tamoxifen resistance and tumorigenesis. Inhibition of GP88 expression by antisense cDNA transfection in MDA-MB-468 cells resulted in complete inhibition of growth factors in nude mice. In addition, GP88 has been demonstrated to inhibit the apoptotic effect of tamoxifen in estrogen receptor positive cancer cells. Pathological studies using breast cancer biopsies revealed that GP88 was expressed in 80% invasive ductal carcinoma with respect to poor prognostic markers such as tumor grade, p53 expression and Ki67 index, but benign lesions were Most indicated that it was negative.
  • the cancer may be breast cancer, lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, renal carcinoma, leukemia or glioblastoma, preferably breast cancer.
  • the GP88 it is known that it is commonly expressed in several carcinomas, and is particularly deeply related to the onset and progression of breast cancer. Therefore, when the GP88 is used as a biomarker, breast cancer, lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, renal carcinoma, leukemia or glioblastoma, especially breast cancer, can be diagnosed with high accuracy.
  • the biomarker by observing the increase or decrease of the biomarker, it is possible to quickly monitor the individual treatment effect of the commercially available breast cancer treatment, so that it is possible to select a suitable treatment for each patient, diagnose the prognosis, and monitor. In addition, it can be used to confirm the effectiveness of a breast cancer treatment that is currently being developed, so it can be used to develop an effective breast cancer treatment.
  • the sequence of the GP88 is shown in Korean Patent Registration No. 10-1690249, and may be a GP88 of a published or deposited sequence or a recombinant of the GP88.
  • the capture probe or detection probe for binding to the GP88 may include an anti-GP88 antibody.
  • 6B3 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5262), 6B2 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5261), 6C12 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5597), 5B4 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA5260), 5G6 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5595), 4D1 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5593), 3F8 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5591), 3F5 Hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5259), 3F4 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5590), 3G2 (ATCC accession number PTA-5592), 2A5 hybridoma cell line (ATCC accession number PTA-5589) , and 4F10 (ATCC Accession No. PTA-8763).
  • the magnetic particles of the present invention have excellent surface uniformity.
  • a silica precursor such as TEOS is used to form a shell layer and grown on the core particle surface.
  • the shell layer has a very rough surface. Thus, a lot of non-specific binding of the substance to be detected may occur. This may cause unnecessary background noise.
  • the shell layer may be surface-treated with an acidic material, preferably a mixture of strong acid and hydrogen peroxide.
  • the mixture of the strong acid and hydrogen peroxide is named and used as a piranha solution, and generally, sulfuric acid and hydrogen peroxide may be mixed in a ratio of 3:1 to 7:1.
  • the mixture of the strong acid and hydrogen peroxide is a solution having a strong oxidizing power to oxidize and remove foreign substances present on the shell layer, and at the same time, by etching and removing the protrusions formed on the surface of the shell layer, the surface roughness is minimized and the adhesion of unwanted fluorescent substances. Can be prevented.
  • the acidic material may form a hydrophilic functional group on the surface of the shell layer so that the above-described linker or capture probe can be easily bonded.
  • hydrophilic functional group of 1 to 80/nm 2 may be introduced on the surface of the shell.
  • the number of linkers or capture probes that can be bound may be determined according to the number of the hydrophilic functional groups. Therefore, when a plurality of hydrophilic functional groups are formed on the surface of the magnetic particle, it is possible to attach a large amount of linkers or probes to the surface of the magnetic particle (FIG. 5). At this time, when the density of the hydrophilic functional group is less than 1/nm 2 , measurement may be difficult as low fluorescence is shown during fluorescence measurement, and when the density of the hydrophilic functional group exceeds 80/nm 2 , the probes are bound to each other. There may be no further increase in fluorescence due to the interference of.
  • the capture probe when the capture probe is directly bound to the silanol, it is possible to have a density of 1 to 80 pieces/nm 2.
  • the linker since the linker is bound to the three silanol molecules, it is possible to have a density of 1 to 30 pcs./nm 2 when the capture probe is bound using a linker.
  • the surface of the shell layer may be surface-treated using an acidic material.
  • a silanol group which is a hydrophilic functional group present on the glass surface, may be bonded to the probe.
  • a piranha solution preferably a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide solution, may be used as the acidic substance to form a hydrophilic functional group on the surface of the shell layer.
  • the hydrophilic functional group formed by the acidic substance may be a silanol group or a carboxyl group derived from a silanol group, an amino group, a hydroxy group, a thiol group, or an aldehyde group. More preferably, the hydrophilic functional group may be a silanol group.
  • the method of forming the hydrophilic functional group may use a dry method such as oxygen plasma treatment, corona treatment, or UV ozone treatment, but it is possible to uniformly form a hydrophilic functional group on the surface of the magnetic microrod, but it is acidic that is not affected by magnetism. It is more preferable to use a wet treatment with the material. That is, in the case of the present invention, the reaction point (hydrophilic functional group) to which the probe can be bound can be greatly increased by performing oxidative hydrophilic treatment using an acidic substance, especially a piranha solution, and accordingly, fluorescence analysis can further increase the intensity of fluorescence. Can (see Fig. 5).
  • the glass forming the shell layer of the present invention for example, borosilicate glass
  • the magnetic particles according to an embodiment of the technology disclosed in the present specification have a coating layer derived from a liquid component as a shell layer) and thus have a very uniform surface.
  • the average surface roughness (Ra) of the surface of the shell layer may be 15 nm or less, preferably 10 nm or less, more preferably 5 nm or less, more preferably 2 nm or less, and particularly 1.5 nm or less.
  • Ra may be, for example, 3 nm or more, 2 nm or more, and 1 nm or more.
  • the thickness of the shell layer may be 1 to 100 ⁇ m, preferably 1 to 50 ⁇ m, more preferably 1 to 10 ⁇ m, and most preferably 4 to 8 ⁇ m. If the thickness of the shell layer is less than the above range, the surface of the shell layer may be easily broken or cracked, and if the thickness of the shell layer exceeds the above range, problems depending on laser characteristics and wavelength may occur during glass cutting.
  • the magnetic particles may have a detection limit of 1 ng/ml or less and a dynamic range of log 3 or more.
  • the magnetic particles of the present invention may have a detection limit of 1 ng/ml or less, preferably 3.7 ng/ml or less, and most preferably 7 ng/ml or less.
  • the detection limit may be, for example, 0.001 ng/ml or more, 0.01 ng/ml or more, or 0.1 ng/ml or more. As shown in FIG.
  • the dynamic range may have a range of log 3 or more, preferably log 5 or more.
  • the dynamic range may have a range of log 3 to 10, and preferably may have a range of log 5 to 7.
  • the fluorescence signal increased as the concentration increased in the range of 0 to 60 ng/ml, and thus had a very high correlation (decision coefficient R 2 value: 0.9909). Therefore, when the magnetic particles of the present invention are used, the sensitivity is increased by about 40 times compared to the conventional magnetic particles, and when optimized, the sensitivity may be about 100 times or more.
  • the magnetic particles are a mixture of two or more types of magnetic particles having different lengths, and may be capable of simultaneously diagnosing two or more types of the biomarkers.
  • the magnetic particles may be combined with different capture probes according to each length (FIG. 8). When this is used, fluorescence of different lengths is generated according to each capture probe, so that two or more biomarkers can be diagnosed at the same time.
  • the magnetic particles may be used by mixing 2 to 20 types of magnetic particles having a length difference of 5 to 200 ⁇ m. By using magnetic particles having various lengths, it is possible to detect 2 to 20 kinds of biomarkers at the same time.
  • each magnetic particle is less than 5 ⁇ m, it is difficult to identify the difference in length using optical equipment, and if it exceeds 200 ⁇ m, it is easy to identify, but it is difficult to use various types of magnetic particles. Difficult to identify.
  • an antibody that reacts with GP88 and an antibody-antigen on the surface of a magnetic particle having a length of 300 ⁇ m is bound with a capture probe, and an antibody that reacts with P53 and an antibody-antigen is captured on the surface of a magnetic particle having a length of 400 ⁇ m.
  • the magnetic material generates the same fluorescence, but due to the difference in length of the magnetic material, it is determined whether the biomarker is GP88 (fluorescence length 300 ⁇ m) or P53 (fluorescence length 400 ⁇ m). It can be read, and this means that the type of biomarker can be accurately determined through simple optical observation without using methods through genetic identification such as PCR.
  • the magnetic particles may be cuts of glass-coated metal microwires. Magnetic particles having various lengths can be easily obtained by simply cutting the glass-coated metal microwire with a laser.
  • the magnetic particles may have various shapes including a fixed shape or an atypical shape such as a rod shape, a flat plate shape, and a spherical shape. Even when the magnetic particles have a flat plate shape, the cross section may have various shapes such as star shape, polygonal shape, and circle shape, and is not particularly limited.
  • the magnetic particles are in the form of microrods, microdisc, or microbeads, and particularly preferably in the form of microrods for convenience of manufacture and ease of observation.
  • the length of the microrod may be 10 to 1,000 ⁇ m.
  • the length of the microrod is less than the above range, it is not easy to distinguish between particles of different lengths, and as the size of the particles decreases, the magnetism decreases, so that mixing, washing, and movement by a magnet may not be easy.
  • the above range is exceeded, it is difficult to observe because the particles may overlap, and a desired amount of magnetic particles may be difficult to enter into one well, so that smooth diagnosis may be difficult.
  • the ratio of the length to the diameter of the microrod may be 2 or more, 5 or more, or 10 or more, and the aspect ratio may preferably be 20 or less.
  • the aspect ratio is less than 2, it may be difficult to distinguish from each other because it is similar to the spherical fine particles. If the aspect ratio exceeds 20, the diameter of the magnetic particles decreases, the relatively magnetic core portion becomes thinner and thus the magnetism may be weakened. . In addition, when the aspect ratio exceeds 20, the durability decreases as it has a thin diameter, and thus magnetic particles may break during inspection.
  • the above-described magnetic particles may be suitably used for in vitro diagnostics for detecting a biological material in a specific sample solution derived from a living organism.
  • the sample solution may be tissue extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, eye fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, and the like.
  • the pretreatment of the sample solution may be simplified or may be omitted in some cases.
  • the biomaterial may be a biomarker, blood, plasma, serum, body fluid, protein, peptide, nucleic acid, bacteria, virus, endoplasmic reticulum, miRNA, exosomes, circulatory tumor cells, and the like.
  • the biomaterial may be a biomarker.
  • the technology disclosed in the present specification can be very usefully used for biomarker detection in that a disease can be quickly diagnosed early by detecting several types of biomaterials in a single test.
  • the biomarker can be used without limitation as long as it is used in conventional science or medical fields such as measurement or evaluation of a biological treatment process, a process causing pathogenicity, or a pharmacological process for treatment.
  • the biomarker may be, for example, a polypeptide, a peptide, a nucleic acid, a protein, or a metabolite that can be detected in a biological fluid such as blood, saliva, and urine.
  • a biological fluid such as blood, saliva, and urine.
  • the biomarker is breast cancer, lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, kidney carcinoma, leukemia or glioblastoma, especially if there is breast cancer, any biomarker whose blood concentration is increased can be used without limitation, but preferably includes GP88. can do.
  • the biomarker is known to be expressed not only in general breast cancer, but also in lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, renal carcinoma, leukemia, or glioblastoma. It can be diagnosed using particles.
  • the magnetic particle may have a capture probe introduced on the shell layer.
  • the capture probe serves to specifically bind the biomaterial and capture the biomaterial to the magnetic particles.
  • the capture probe may be an antibody, protein, nucleic acid, or aptamer, and may be, for example, a capture antibody capable of specifically binding and capturing a biomarker.
  • the capture probe may be immobilized by adsorbing or chemically connecting to the surface of the magnetic particle, and preferably connected to a hydrophilic functional group present on the surface of the shell layer.
  • biotin is introduced to the surface of the capture probe, and avidin, neutravidin, or streptavidin that binds biotin is introduced into the magnetic particle to attach the capture probe to the magnetic particle.
  • the capture probe may be connected to the magnetic particle using a hydrophilic functional group on the surface of the magnetic particle.
  • the hydrophilic functional group may be directly bonded to the capture probe, but preferably, it may be bonded using a linker.
  • the linker may be a silane compound, as described above (see FIG. 4).
  • the present invention also includes the steps of: (i) preparing a magnetic microrod composed of a core including a shell made of glass and a magnetic material; (ii) surface-treating the surface of the magnetic microrod with an acidic solution to form silanol; (iii) immersing the surface-treated magnetic microrods in a silane-based solution to bind a silane compound to the silanol; (iv) replacing the end of the silane with an end capable of binding to a probe; And (v) attaching a probe to an end of the silane compound, wherein the probe relates to a method for producing magnetic particles for detecting a biomaterial including an antibody having a biomarker for cancer diagnosis as an antigen.
  • step (i) a magnetic microrod composed of a shell made of glass and a core including a magnetic material is prepared.
  • the step (i) is a step of preparing a magnetic microrod composed of a shell made of glass and a core including a magnetic material.
  • the magnetic microrod fills a glass tube with metal powder and then pulls it out under heating conditions.
  • a glass-coated microwire may be manufactured and cut to a predetermined length to undergo a process of manufacturing a magnetic microrod (see FIG. 2). This process is based on the Talyor-Ulitovsky technique, and the basic principle is described in, for example, WO1993/005904 A2. This document can be used as a reference material for the present invention.
  • the glass-coated microwire it is placed in a heating unit that is filled with metal (magnetic particles) in a glass tube and heated by a heating means.
  • the metal may be a metal powder or a compound that is melted to form a metal, and it is also possible to directly inject the molten metal.
  • the metal powder when used, the metal powder may have an average particle diameter of 40 to 300 ⁇ m, preferably 50 to 200 ⁇ m, more preferably 70 to 150 ⁇ m. If the average particle diameter of the metal powder is less than 40 ⁇ m, it may be scattered into the air during operation, and the price of the powder may increase, resulting in an increase in the overall manufacturing cost. If a metal powder exceeding 300 ⁇ m is used, the glass tube may be used. Because the transfer of the material is not smooth, a blank space in which no metal exists in the microwire to be manufactured may result in defects (FIG. 3).
  • a glass tube having an inner diameter of 0.2 to 2 mm, preferably 0.3 to 1.5 mm, more preferably 0.5 to 1 mm. If the inner diameter of the glass tube is less than 0.2mm, the metal constituting the core may not be injected smoothly, and if it exceeds 2mm, the relative diameter of the core may increase, so that the thickness of the glass shell layer may decrease when drawing. Accordingly, durability may be reduced or a bend or protrusion may occur on the surface (FIG. 3).
  • the material of the glass tube may be soda lime, borosilicate, aluminosilicate, silica, alkali silicate, pyrex, or quartz. Separately, glass containing lead oxide, tellurium dioxide or silica as main components is processed into a tube shape and used. I can.
  • the softening point of the glass may be in the range of about 1,000 to 1,900°C, preferably about 1,100 to 1,700°C. If the softening point of the glass is less than 1,000°C, the glass tube may be softened before the metal powder is melted, resulting in defects, and if the softening temperature exceeds 1,900°C, a lot of time and cost are required for heating, resulting in poor economic efficiency. I can.
  • glass forming the shell layer for example, borosilicate glass, has almost no non-specific binding due to adsorption by a chemical reaction with a reaction sample, so noise can be minimized.
  • the metal has a melting temperature lower than the softening point of the glass tube.
  • the melting temperature of the metal is higher than the softening point of the glass, the metal powder cannot be melted during the drawing process and the metal powder is located between the glass tubes as it is. Not only it can cause contamination by foreign substances.
  • the heating means may be disposed at a lower portion of the glass tube or at a position adjacent thereto, and heats the glass tube to a softening point at which the glass tube can be drawn out.
  • the metal powder forms droplets, and the glass tube adjacent to the metal powder softens to surround the droplets formed by the metal powder. Specifically, since the metal powder filled in the glass tube is melted and the glass tube is softened and drawn out, the magnetic particle core portion is drawn in a form coated with the glass.
  • the heating means may be, for example, an induction heating device known in the art, specifically an inductor.
  • a spiral coil for example, a copper material
  • a heating region may be formed inside the coil.
  • the number of coils may be selected in consideration of the desired height of molten metal and the like.
  • the heating region is heated by the eddy-current loss generated by the magnetic field at the required frequency.
  • the heating means may be a high-frequency inductor, and the frequency may be, for example, in the range of about 0.5 to 800 kHz, specifically about 10 to 500 kHz, but is not limited thereto.
  • the temperature in the heating zone is preferably 1,000 to 2,000° C., which is a temperature capable of softening the glass tube, and may be changed according to the material of the glass tube and the type of metal constituting the magnetic particle core.
  • the magnetic particles filled in the glass tube may include copper (Cu), gold (Au), silver (Ag), iron (Fe), or platinum (Pt), as described above, more preferably superparamagnetic It may contain metal.
  • representative examples of magnetic metals include cobalt alloys or iron-rich alloys.
  • small amounts eg, up to about 5 atomic percent, specifically up to about 3 atomic percent
  • copper may be added or incorporated into the magnetic metal to increase the number of nucleation centers and promote nanocrystallization.
  • the molten metal of the metal constituting the core of the fine wire inside the glass tube is drawn while filling the glass capillary tube.
  • the inside of the glass tube may be an inert gas, for example, Helyun, neon, argon, or nitrogen gas atmosphere.
  • an inert gas atmosphere for example, Helyun, neon, argon, or nitrogen gas atmosphere.
  • a microwire in which the metal core is substantially completely coated by glass may be formed, and the drawn microwire may be solidified while being cooled by a cooling means disposed at a rear end of the heating unit.
  • the cooling means may be used without limitation as long as it is a device capable of cooling the fine wires, but it is preferable to use a method of immersing the fine wires in a coolant to cool them.
  • Water, oil, or various refrigerants may be used as the coolant, but water may be preferably used.
  • the microwires solidified as described above are recovered by a winding device installed in the system.
  • the winding device may have a coil shape, specifically, a wire bobbin type.
  • the diameter of the core metal may be in the range of 30 to 100 ⁇ m, preferably 40 to 80 ⁇ m, and more preferably 50 to 70 ⁇ m.
  • the thickness of the glass coating (shell layer) may be in the range of 3 to 50 ⁇ m, preferably 5 to 20 ⁇ m, and more preferably 7 to 15 ⁇ m.
  • the diameter of the entire microwire may be selected within a range of, for example, about 30 to 120 ⁇ m, preferably 30 to 100 ⁇ m, and more preferably 40 to 80 ⁇ m.
  • the microwire including the magnetic material manufactured as described above can be continuously manufactured on a winding device in a length of 1 to 15 km, preferably 5 to 10 km, and packaged in a wound form, and as described below, a non-spherical microrod Can be used in manufacturing.
  • the microwire manufactured as described above may be cut to a predetermined length to produce a non-spherical magnetic microrod.
  • a plurality of fine wires are arranged in a transverse direction (for example, in parallel) and cut into a predetermined length to provide the advantage of manufacturing a large amount of non-spherical/asymmetric fine particles.
  • a non-contact laser It adopts the cutting method using
  • This cutting method may specifically use the method shown in Korean Patent Application Publication No. 2018-0130436, and more specifically, at least of the glass-coated metal microwire in the groove of the wire holder in which a plurality of grooves are arranged in the transverse direction. Positioning one; And non-contact using a laser having a pulse width shorter than the heat propagation time of the glass-coated metal microwire in a direction traversing at least one glass-coated metal microwire positioned in the wire holder at a predetermined interval. It can be manufactured by a manufacturing method including the step of cutting by way of processing.
  • the magnetic microrod manufactured by the above method is subjected to surface treatment using a mixed solution composed of a mixture of strong acid and hydrogen peroxide to make the surface smooth. Prior to this process, a cleaning process for removing foreign substances present on the surface may be additionally included.
  • the washing process may be performed using various organic solvents. Looking at the process in detail, the produced magnetic particles (magnetic microrods) are washed with an organic solvent, and then the organic solvent is removed using ethanol. It is preferable that the organic solvent used at this time is acetone. After the organic solvent treatment is finished, the magnetic particles may be acid treated. It is preferable to use sulfuric acid as the acid, and after the acid treatment is completed, it is washed with a mixture of water and ethanol.
  • the magnetic particles that have been subjected to acid treatment are subjected to base treatment, and the base used at this time is sodium hydroxide, and it is preferable to dissolve sodium hydroxide in a mixed solvent of water and ethanol. After the base treatment is completed as described above, it is preferable to wash with water and ethanol.
  • step (ii) the surface of the magnetic microrod is surface-treated with an acidic solution to form silanol.
  • the magnetic particles may be surface-treated using an acidic solution.
  • the acidic solution may be a mixture of a strong acid and hydrogen peroxide, for example, a piranha solution.
  • the piranha solution generally refers to a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide, and is used by mixing in different ratios, but all are called piranha solutions.
  • a typical piranha solution refers to a solution of 3:1 to 7:1 by volume of sulfuric acid: hydrogen peroxide. Separately, it is used as a mixture of aqueous ammonia and hydrogen peroxide called the base piranha solution.
  • the acidic solution is preferably used by mixing the strong acid and the hydrogen peroxide in a volume ratio of 1:1 to 7:1, more preferably 2:1 to 5:1, most preferably 3:1 It is preferable to mix and use in a volume ratio of. If the ratio is less than 1:1, that is, the content of hydrogen peroxide is greater than that of the strong acid, there is a high possibility of explosion due to the generation of a lot of heat and gas when preparing an acidic solution. As a result, it may not be easy to form a silanol group.
  • the hydrogen peroxide used at this time may be a solution of 10 to 50% by volume, preferably 20 to 40% by volume, more preferably 30% by volume of a hydrogen peroxide solution may be used.
  • the piranha solution is highly corrosive and is a strong oxidizing agent, so care should be taken in handling it. Before using the piranha solution, foreign substances on the surface of the object must be completely washed, and the solvent used for washing must also be removed.
  • the piranha solution can be removed by dissolving organic contaminants, but a large amount of contaminants or a cleaning solvent may generate a violent bubble or cause an explosive reaction to release a large amount of gas.
  • the hydrogen peroxide may preferably have a content of 50% by volume or less, and more preferably, a content of 30% by volume.
  • the piranha solution prepared in this way can oxidize the metal surface or the glass surface.
  • the acidic solution may convert 1 to 90% of the magnetic microrod glass surface molecules to silanol, and when a plurality of silanols are formed on the surface of the magnetic microrod, a large amount of probes may be applied to the surface of the magnetic particles. It is possible to attach to. That is, when a silanol group is formed on the surface using the acidic solution, a large amount of hydrophilic functional groups or functional groups (linkers) bonded with silane may be bonded to the silanol group (FIG. 5).
  • the capture probe when the capture probe is directly bound to the silanol, it is possible to have a density of 1 to 80 pieces/nm 2.
  • the linker since the linker is bound to the three silanol molecules, it is possible to have a density of 1 to 30 pcs./nm 2 when the capture probe is bound using a linker.
  • the magnetic microrod surface-treated in step (iii) may be immersed in a silane-based solution to bind a silane compound to the silanol.
  • a silane compound is reacted with the shell layer of the magnetic particles.
  • a silane compound may be attached to the silanol group formed on the surface of the shell layer using 3-aminopropyltriethoxy silane (APTES), and the APTES is preferably dissolved in acetone or toluene solution.
  • the APTES may be combined with the silanol group to form an amino-silane, and preferably reacted for 6 to 24 hours to exhibit optimal fluorescence in a subsequent fluorescence analysis. If the reaction time is less than 6 hours, the amount of APTES bound to silanol decreases, so the intensity of fluorescence may be weakened. If the reaction time exceeds 24 hours, there is no change in the intensity of fluorescence and only a lot of manufacturing time is consumed, resulting in manufacturing cost. This can increase (see Fig. 7).
  • an end of the silane may be substituted with an end capable of binding to a probe.
  • the surface of the shell layer of the magnetic particles on which the amino-silane is formed is substituted with a carboxyl group, a hydroxy group, a thiol group, or an aldehyde group.
  • the end of the amino silane (amine group) can be replaced with an end capable of binding to the probe because the end of the amino silane (amine group) is different depending on the type of the capture probe.
  • the capture probe when the capture probe is easily bonded to the amino group of the amino-silane (linker), it may be used as it is without substitution.
  • the terminal of the amino-silane may be substituted with a carboxyl group by reacting gamma-butyrolactone or succinic anhydride.
  • a probe may be attached to the end of the silane compound.
  • the magnetic microrod manufactured as described above may be used with a probe attached thereto.
  • the probe is preferably a capture probe.
  • the capture probe is a probe that performs an antigen-antibody reaction with a biomarker and serves to attach the biomarker to the magnetic microrod.
  • a detection probe may be attached to the biomarker, and the biomarker may be detected by the action of a fluorescent substance or enzyme located on the detection probe.
  • the probe may include an antibody that uses a biomarker for cancer diagnosis as an antigen.
  • the biomarker may be GP88, which is known to be expressed in breast cancer, lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, kidney carcinoma, leukemia or glioblastoma, especially breast cancer, and has high accuracy when an anti-GP88 antibody is included in the probe.
  • Cancer diagnosis kits can be manufactured.
  • a method for detecting a biological material using the magnetic particles described above includes the steps of (1) providing the magnetic particles in a first well; (2) moving the magnetic particles of the first well to a second well using magnetic force; (3) A detection probe conjugated with a luminescent material that can specifically bind to a biological material and emit light by an external stimulus is provided in the second well, and the capture probe, the biological material, and the detection probe react to make magnetic Forming a complex of particle-biomaterial-detection probes; And (4) moving the complex of the magnetic particle-biomaterial-detection probe to the third well using magnetic force, and detecting the biomaterial by measuring a luminescent signal emitted from the luminescent material in the complex by an external stimulus. It relates to a method for detecting a biological material comprising the step of.
  • the magnetic particles may be provided in the first well.
  • the magnetic particles may be magnetic microrods manufactured in the manufacturing method, and the magnetic microrods may be immersed in the first well and stored.
  • step (2) the magnetic particles in the first well may be moved to the second well by using magnetic force.
  • the magnetic particles are magnetic particles, they may be moved to the second well by using magnetic force.
  • the magnetic force is preferably formed by a magnetic rod, and since the magnetic rod is covered with a cap, when the magnetic particles are moved using the magnetic rod and the magnetic rod is removed while the cap is fixed, the magnetic particles become the second It may be immersed in the well or may be suspended in a solvent contained in the second well.
  • a method of moving magnetic particles using magnetism may be performed in the same manner.
  • step (3) a detection probe conjugated with a light-emitting material that can specifically bind to a biological material and emit light by an external stimulus is provided in the second well, and the capture probe, the biological material, and the detection probe are reacted.
  • a complex of magnetic particles-biomaterial-detection probes can be formed.
  • the detection probe may be an antibody, protein, nucleic acid, or aptamer capable of specifically binding to the biomaterial, for example, a detection antibody specifically binding to a biomarker and having a luminescent material. I can.
  • the detection antibody and the capture antibody of the capture probe may be an antibody using a cancer biomarker as an antigen.
  • the antigen may be used without limitation as long as it is a biomarker whose blood concentration increases in the presence of breast cancer, lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, kidney carcinoma, leukemia or glioblastoma, especially breast cancer. I can.
  • the biomarker is known to be expressed not only in general breast cancer, but also in lung cancer, liver cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, renal carcinoma, leukemia, or glioblastoma. It can be diagnosed using particles.
  • the luminescent material is connected to the detection probe to generate light by external stimuli such as ultraviolet rays, electron beams, chemical reactions, enzyme-substrate reactions, etc., thereby enabling detection of the presence of the biomaterial.
  • external stimuli such as ultraviolet rays, electron beams, chemical reactions, enzyme-substrate reactions, etc.
  • the light-emitting material include fluorescent molecules, quantum dots, metal nanoparticles, magnetic nanoparticles, enzymes, and enzyme substrates.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • fluorescein fluorescein
  • FAM fluorescein amidite
  • PE phycoerythrin
  • TRITC tetramethyl-rhodamine isothiocyanate
  • Cy3 Cyanine 3
  • Cy5 Cyanine 5
  • Cy7 Cyanine 7
  • Alexa Alexa fluorine dye
  • a fluorescent molecule selected from the group consisting of rhodamine (rhodamine) can be commonly used.
  • the magnetic particle-biomaterial-detection probe complex is obtained by mixing, for example, a magnetic particle to which the capture antibody is immobilized, a detection antibody specifically binding to the biomaterial, and a sample solution containing the biomaterial in a reaction tube. I can make it. At this time, by simultaneously inducing a first immune response between the biological material and the magnetic particle and a second immune response between the biological material and the detection antibody in the reaction tube, a complex of magnetic particle-biomaterial-detection probe can be obtained. have.
  • the formation of the complex may include a process of promoting a reaction using an external magnetic force.
  • the reaction tube is placed on a heating block and heated to an appropriate temperature, and the magnetic rod is continuously moved up and down inside the reaction tube to rapidly mix the immune reaction substances. I can.
  • the method of detecting the biological material may include a process of washing the complex using an external magnetic force. That is, after the first and second immune reactions are completed, the step of continuously washing the magnetic particle-biomaterial-detecting probe complex and the magnetic rod in two or more washing tubes may be further included. After washing, the type and amount of the biomaterial can be accurately identified by detecting the light emission signal from the complex.
  • the detection method may be performed using an independent reaction tube as described above, but preferably a multi-well plate may be used.
  • the magnetic particles may be injected into the first well of the well plate, the magnetic particles may be moved to the second well during examination, and the detection probe and the biological particles may be injected into the second well. Accordingly, in the second well, the magnetic particle, the detection probe, and the bioparticle may react to form a magnetic particle-biomaterial-detection probe complex, which may be moved to the third well to measure fluorescence.
  • 2 to 10 cleaning wells may be provided between the second well and the third well.
  • the washing well is simply a well injected with a washing solution and may be washed by immersing the magnetic particle-biomaterial-detecting probe complex.
  • biomaterials and detection probes that are not bound to magnetic particles can be removed, and as described above, the magnetic particles of the present invention can minimize non-specifically bound fluorescent molecules (detection probes), so accurate fluorescence measurement can be performed. You can do it.
  • the washing process may immerse and move the magnetic particle-biomaterial-detection probe complex by using an external magnetic force in the same manner as the complex formation process.
  • step (4) the magnetic particle-biomaterial-detection probe complex is moved to the third well by using magnetic force, and the biomaterial is measured by measuring a luminescent signal emitted from the luminescent material in the complex by an external stimulus. Can be detected.
  • the detection method may be performed by an immunodiagnostic method.
  • detection of the luminescent signal may be performed by, for example, an ELISA method or a fluorescence measurement method.
  • the detection target material in the sample is bound to the capture antibody immobilized on the macromagnetic particle, and then the detection antibody is treated.
  • the detection antibody binds to the opposite side of the target substance to which the capture antibody is bound.
  • an enzyme called Horse Radish Peroxidase (HRP) is conjugated, so that the TMB substrate is decomposed using hydrogen peroxide to give it a color.
  • the degree of this color is measured by the OD value. That is, in this method, as the number of substances to be detected increases in the sample, the capture antibody and the detection antibody are quantitatively attached in proportion, and as a result, the amount of HRP conjugated to the detection antibody increases, and the enzyme reaction proceeds relatively quickly.
  • the fluorescence measurement method uses a capture antibody and a detection antibody, and the principle of performing a sandwich assay is the same as that of the ELISA method, but after conjugating a biotin material to the detection antibody instead of HRP enzyme, it is conjugated with streptavidin.
  • the fluorescent substance is treated and the fluorescence value is measured.
  • the capture antibody is first reacted with the GP88 protein, and then the detection antibody conjugated with biotin is treated, and the detection antibody is attached to the GP88 on the other side of the GP88, not the place where the capture antibody is attached to the GP88. After that, the fluorescent substance e-flour conjugated with streptavidin is treated to measure the fluorescence signal of each of the magnetic particles.
  • the location of the magnetic particles in the reaction well is checked with a bright field microscope and the fluorescence signal corresponding to the location is determined. It is measured in units of pixels, and it automatically analyzes the fluorescence signal from around 10 magnetic particles.
  • the detection concentration of the target protein to be detected in the final sample by reacting the target substance to be detected by concentration and applying the fluorescence value from the test detection to a standard curve that draws a graph using the fluorescence value obtained by the same method. Calculate the value. All image analysis and calculation of fluorescence values are performed by an automatic image analysis program installed in the analyzer.
  • the biomaterial detection method may be performed through a POCT method.
  • POCT refers to a point-of-care test, which means performing a test directly at a patient's location.
  • the clinical pathology test is not performed in an independent space such as the central laboratory of a hospital, but is performed by a doctor, a nurse, or a clinical pathologist in the vicinity of a patient such as a hospital room, emergency room, operating room, or intensive care unit.
  • Existing traumatic brain injury diagnosis required large equipment such as Ct or MRI, so on-site examination was not possible.
  • large-scale diagnostic equipment such as PCR equipment was required, so it was only used for on-site diagnosis. .
  • diagnosis can be performed in the form using the POCT method.
  • Step 1 Fabrication and surface treatment of magnetic microrods
  • the magnetic microrod manufactured in the present invention was prepared in accordance with the contents of the Korean patent application 10-2018-0130436 to prepare a glass-coated microwire. And the fine wire was cut to an appropriate size.
  • the length is 400 ⁇ m
  • the diameter of the magnetic metal core is 50 ⁇ m
  • the thickness of the glass coating is 10 ⁇ m.
  • a final magnetic microrod having a diameter of 60 ⁇ m and a length of 400 ⁇ m was prepared.
  • a washing step was performed in order to remove foreign substances on the surface of the prepared magnetic microrod.
  • the prepared magnetic microrod was placed in a vial, acetone was added dropwise to precipitate, washed with ethanol, and then the magnetic microrod was dried.
  • the dried magnetic microrod was immersed in sulfuric acid, washed with water and ethanol, and dried.
  • the magnetic microrod after the sulfuric acid treatment was treated with a sodium hydroxide solution (a mixture of 1 g of NaOH, 4 ml of water and 6 ml of ethanol), and then washed with ethanol.
  • the first antibody binding to the antigen of the specimen was bound to the magnetic microrod.
  • the glass surface of the magnetic microrod was appropriately modified.
  • the first antibody may be immobilized using a microrod surface-modified with amino-silane, but preferably, the amino group is substituted with a carboxyl group.
  • the substitution of the surface from an amine group to COOH was collectively referred to as a method for producing carboxyl beads.
  • Approximately 10,000 of the above microrods (500 ⁇ 75 ⁇ m) could be processed in a 1.5 ml E-tube.
  • two methods of using ⁇ -butyrolactone or mixing succinic anhydride with triethylamine could be used. It was judged to be more effective to use succinic anhydride and triethylamine.
  • the uniformity and degree of modification can be confirmed by measuring fluorescence by coating amino-silane with FITC (Fluorescein isothiocyanate isomer).
  • FITC Fluorescein isothiocyanate isomer
  • the surface was found to have a very uniform surface compared to the magnetic beads (see Fig. 6). Therefore, non-specific binding of unwanted substances can be reduced, and noise generation can be greatly reduced.
  • detection and analysis were possible at a very low concentration ( ⁇ 1 ng/ml) of the GP88 biomarker as an antigen, and a signal amplification effect could be exhibited.
  • the surface of the magnetic particles of the present invention is modified using the piranha solution, many amino-silanes can be bonded, so it was confirmed that it is possible to exhibit high fluorescence compared to the conventional magnetic particles (see FIG. 5(b)). ).
  • Step 2 Preparation of large microrod magnetic conjugate to which the first antibody is immobilized
  • a large microrod magnetic conjugate in which the first antibody specifically binding to the antigen of the target marker in the sample solution is immobilized using the surface-modified magnetic microrod prepared in step 1 (preferably with a carboxyl group). bead) was prepared. A detailed look at this is as follows.
  • Wash buffer (0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3 ) was completely removed from the E-tube after the washing process was completed.
  • Blocking buffer 1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3 ) 500 ⁇ l was added, and then slowly mixed at room temperature for 1 hour. (Proceed at 30 rpm in a rotary mixer (Rotation machine))
  • the large microrod magnetic conjugate recognizes a matrix multiple code and binds the antibody of possible high titer.
  • the first antibody refers to an antibody that specifically binds to an antigen (GP88) corresponding to a specimen contained in a sample solution or the like.
  • different first antibodies may be combined according to the length of the magnetic microrod, and this may form a length coding system and may be used for multiple detection analysis.
  • Step 3 QC of the large microrod immobilized with the first antibody
  • a second antibody (Biotin-conjugated secondary antibody) conjugated with 2 ⁇ g/ml of biotin was prepared using a sample buffer (0.1% BSA, 1x PBS. 0.1% T-20).
  • SAPE Streptavidin-Phycoerytherin
  • RSMP large microrod magnetic conjugate
  • the sample solution may be a tissue extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, and the like.
  • magnetic microrods of different shapes are prepared. Each magnetic microrod is configured in a state in which an antibody that specifically binds to capture only a specific marker among a plurality of markers included in the sample solution is fixed.
  • a second antibody-fluorescent conjugate that specifically binds to the antigen of the marker in the sample solution is prepared.
  • the fluorescent substance it may be substituted with an enzyme or the like.
  • Step 5 dropping the specimen
  • RSMPs giant microload magnetic conjugates
  • Antigen was 1: 1 using sample diluent (1x PBS, 1% BSA (Fatty acid free), 10mM EDTA (pH8), 1% T-20, 0.2mg/mL Tru-Block, 1% human pooling serum). Diluted and added to the second well, the second antibody was 1 ⁇ g/ml, and SAPE was 4 ⁇ g/ml. (Total reaction volume: 250 ⁇ l)
  • the antigen corresponding to the marker was present on the RSMP, so that a first immune response and a second immune response were induced between them.
  • the reaction time could be shortened by simultaneously proceeding the first and second immune reactions in the same reactor.
  • Step 6 mixing/heating step
  • the well subjected to the fifth step was put on a heating block and heated to an appropriate temperature to control.
  • the immune response takes place actively at about 35°C.
  • Step 7 washing step
  • the RSMP having the reaction completed in the second well was sequentially moved from the 3rd well to the 5th well and washed with a magnetic rod. Wash buffer (0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, and 0.05% NaN 3 ) is injected into each of 250 ⁇ l in wells 3 to 5, and RSMP is non-specific using a magnetic rod for 2 minutes in each well. The fluorescent substance attached to was removed. At this time, in the same manner as in step 6, the magnetic rod positioned at the top of the well was continuously moved up and down to rapidly mix and wash the immune reaction material.
  • Wash buffer (0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, and 0.05% NaN 3
  • washing process non-specific substances are removed, washing/recovery of the large microrod magnetic conjugate is performed, and not only serum and plasma, but also a low blood sample is possible.
  • Step 8 Measuring the detection signal
  • the detection signal is measured using an ultra-sensitive fluorescence image analyzer specialized for magnetic particles (see FIG. 11). Code recognition is performed through image analysis, and multi-detection with one fluorescent material. ) was possible to implement.
  • a single marker antigen as well as a fluorescent signal it can be detected by an enzymatic reaction by ELISA. It takes approximately 30 minutes to perform all of the above steps, and the detection limit is approximately 1 ng/ml to 10,000 ng/ml.
  • the biomarker of the same concentration is used, it can be confirmed that the fluorescence of the present invention is more intense.
  • the marker material in the sample was bound to a capture probe fixed to a large microrod magnetic conjugate, and then the detection probe was treated.
  • This detection probe was bound to the opposite side of the marker material to which the capture probe was bound.
  • an enzyme called HRP Hydrogen Radish Peroxidase
  • HRP Hydrogen Radish Peroxidase
  • the fluorescence measurement method is the same as the principle of using the capture and detection antibody in the ELISA method, but the detection antibody is conjugated with a biotin material instead of the HRP enzyme, and the fluorescent material conjugated with streptavidin is later processed.
  • the fluorescence value was measured.
  • the biomarker protein (GP88) is first reacted to the capture antibody, and then the detection antibody is treated with a biotin material conjugated to capture the detection antibody. Attached to Thereafter, the fluorescent substance e-flour conjugated with streptavidin was treated to automatically measure the fluorescence values of each of the magnetic beads.
  • the detection concentration value of the corresponding marker protein in the final sample was calculated by applying the fluorescence value from the test detection to the Standard Curve, which draws a graph using the fluorescence value generated by the same method by reacting the marker substance to be detected by concentration. (At this time, a trend line is drawn to calculate the concentration of the data, and the concentration is calculated using this trend line.) All image analysis and fluorescence value calculations were performed with an automatic image analysis program installed in the analyzer.
  • the magnetic microrod of the present invention was used to test for the following kinds of antigens, and the magnetic microrod of the present invention was able to perform a quick test according to a rapid response, has high accuracy, and enables multiple detection.
  • a capture antibody (anti-GP88 antibody) coupled to RSMP prepared by the above method was applied.
  • Antigen GP88 was added to Serum at 0, 1, 3.7, 7, 15, 30, 60 ng/ml, and then applied in the same manner as in the previous method.
  • the concentration is in the range of 0 to 60 ng/mL while having a dynamic range equivalent to that of the conventional immunological cancer diagnostic test method.
  • the fluorescence signal increased, indicating a very high correlation result value (decision coefficient R 2 value: 0.9909) (see FIGS. 13 and 14).
  • the silanization time in order to observe the change in the fluorescence intensity according to the silanization time, the same experiment was performed with the silanization time of 1 hour, 3 hours, 9 hours, and 24 hours, respectively. As a result, it was found that the silanization time had a high fluorescence value after 9 hours had elapsed, and the increase after 24 hours was found to be very insignificant (see FIG. 7).

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Abstract

본 발명은 조기 암을 신속하게 판별할 수 있고 항암제등의 암치료 효과를 볼 수 있는 예후 진단이 가능하며, 높은 감도를 가짐에 따라 정확하게 암을 판정할 수 있는 암 POCT 진단시스템에 관한 것이다. 본 발명은 자석 반응 금속을 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하되, 상기 포획 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 것인 자성입자를 제공한다.

Description

새로운 암 POCT 진단시스템
본 발명은 새로운 암 POCT 진단시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 조기 암을 신속하게 판별할 수 있고 항암제등의 암치료 효과를 볼 수 있는 예후 진단이 가능하며, 높은 감도를 가짐에 따라 정확하게 암을 판정할 수 있는 암 POCT 진단시스템에 관한 것이다.
체외진단(IVD)은 인체로부터 채취된 혈액, 소변, 세포 등의 대상물을 분석하여 건강 상태를 진단할 수 있게 하는 기술로서, 면역 진단, 자가 혈당 측정, 분자 진단 기술이 있다. 이중 면역 진단 기술은 질병의 원인이 되는 특정 단백질의 유무를 항원-항체 반응을 통해 측정하는 것을 기초로 하여 매우 다양한 질환의 진단과 추적에 활용될 수 있다. 다만 면역 진단 기술은 타겟 단백질이 감지한계 이상의 농도로 존재하여야 진단이 가능한 단점이 있어, 낮은 농도의 단백질 발생신호를 증폭하기 위해 다양한 기술이 개발되어 왔다.
특히 최근에는 합성화학과 생명과학의 발전으로 신약개발 및 진단 등의 분야에 있어 분석될 표적물질이 다양화되고, 극미량의 표적물질을 검출하기 위해 고감도의 신호발생을 보장하는 검출방법들 중 하나로서, 자성 입자들을 이용하는 여러 가지 방법들이 보고되어 왔다.(Modern magnetic immunoassay: Biophysical and biochemical aspects (2017) Regul. Mech. Biosyst., 9(1), 47-55)
종래의 자성 입자를 이용한 면역진단은 나노미터 단위 크기의 자성입자를 사용하고 실리카로 표면을 개질된 것을 이용하여 왔다. 그런데 이러한 실리카 개질 표면을 갖는 자성 입자들은 면역 반응을 수행하는 웰 내부에서 효과적으로 추출하거나 방출하는데 어려움이 있다. 즉 이러한 작은 크기의 자성 입자는 용액 상태에서 흔히 부유하는 상태로 존재하여 분리하기가 용이하지 않아, 정량분석보다는 정성분석에 사용되는 경우가 많았다. 또한, 종래의 분석방법들은 한 번에 하나의 자성입자만을 검사할 수 있어서 시간이 오래 걸리고 검사가 복잡해지는 문제점이 있다.
또한 암은 인체 세포가 무제한적으로 증식하는 악성 신생물을 의미하는 것으로 전이속도에 한계를 가지고 있으며 주변장기로 침습이나 전이를 일으키지 않는 양성 신생물과는 다르게 그 크기가 지속적으로 증대되며 주변장기를 침습하여 전이되는 종양을 의미한다. 이러한 암을 진단하는 기술은 비싼 가격과 운영 전문 인력이 필요하기 때문에 중소병원에서 진단하기 힘든 CT나 MRI가 유일한 방법으로 제시되고 있다. 또한 CT 또는 MRI의 경우, 크기가 작은 암을 구별하기 어려우며, 단순히 촬영된 화상을 이용하여 암을 구분함에 따라 진료인력의 숙련도에 따라 위음성이 높고 환자에 대한 명확한 결과를 제공하지 못한다. 또한 진단 시간이 많이 소요되고 높은 비용이 들며, 방사선 노출 위험이나 자장에 의한 체내 금속성분의 이상을 감수해야 하는 단점을 지니고 있다.
따라서 더 정확하고 안전한 새로운 암 진단 시스템이 필요하다. 암 진단은 긴급 상황에서 적용이 가능하며 환자에게 빠른 결과를 알려줄 수 있도록 검사시간이 1시간 이내로 빠르고 정확해야하며, 적은 샘플로도 결과 도출이 가능해야 하고 고감도로 두 가지 또는 그 이상의 바이오마커(biomarker)를 동시 다중 검사할 수 있어야 한다. 또한 응급실 또는 중소형병원에서도 적용이 가능하도록 소형의 장비로 검사가 간편해야 하고 유지관리 비용이 적게 들어야 한다.
기존 유방암 치료는 HR(ER, PR) 양성, HER2 양성, Triple 음성 여부에 따라 결정하여 각각 치료를 하지만 항암제에 대한 개인차에 있어서 항암제 효능 차이가 크기 때문에 개인별 유방암 치료효과 모닝터링 필요하다. 그러므로 유방암 치료효과를 개인적으로 판정할 수 있는 유방암 예후진단 시스템이 요구되어 왔다.
Progranulin (GP88)은 유방암, 간암, 담낭암, 폐암 등의 진단 마커로 부상 중이며, 특히 개인별 항암치료의 효과 Monitoring, 개인별 예후 진단에 탁월하다는 보고가 되고 있다. (Vanessa Abellaet et al. (2017) Drug Discovery Today ; Tkaczuk, K.R. et al. (2011) Breast Cancer; Abdulrahman et al. (2019) Cancers; Serrero1 et al. (2012) Cancer Research) 그러므로 Progranulin (GP88) 마커를 이용한 동반진단 및 개인별 유방암 예후 진단키트가 POCT 형태로 개발된다면 개인별 항암제 치료효과를 높일 수 있을 것이라 생각된다.
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 조기 암을 신속하게 판별할 수 있고 항암제등의 암치료 효과를 볼 수 있는 예후 진단이 가능하며, 높은 감도를 가짐에 따라 정확하게 암을 판정할 수 있는 자성입자를 포함하는 암 POCT 진단시스템을 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 자석 반응 금속을 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하되, 상기 포획 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 것인 자성입자를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커는 GP88을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 검출한계가 1ng/ml 이하이며, 동적범위(Dynamic Range)가 log3 이상일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 2종 이상의 상이한 길이를 가지는 자성입자가 혼합되어 있으며, 2종 이상의 상기 바이오마커를 동시에 진단할 수 있는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 쉘의 표면은 1~80개/nm의 친수성 작용기를 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 포획 프로브는 상기 쉘 층의 표면의 친수성 작용기와 연결된 것인 자성입자.
일 실시예에 있어서, 상기 코어가 상기 자성입자 총 부피의 60% 이상인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 쉘 층 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 쉘 층의 두께는 1 내지 100㎛인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 수중에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 마이크로로드의 형태를 갖는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 마이크로로드의 종횡비가 2 이상일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커는 생명체로부터 유래된 시료액 내의 바이오마커일 수 있다.
본 발명은 또한, (i) 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계; (ii) 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성하는 단계; (iii) 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시키는 단계; (iv) 상기 실란화합물의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하는 단계; 및 (v) 상기 실란 화합물의 말단에 프로브를 부착하는 단계를 포함하되, 상기 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 자성입자 제조방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 (iv) 단계는 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 6~24시간 침지하여 수행될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 산성용액은 황산과 과산화수소의 혼합용액일 수 있다.
본 발명은 또한 (1) 제1웰에 상기 자성입자를 제공하는 단계; (2) 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시키는 단계; (3) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (4) 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질의 검출은 2종 이상의 상기 생체물질들에 대해 2종 이상의 상기 자성입자들을 이용하여 다중검출하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 다중검출은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 상기 자성입자들을 판독하는 과정을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2웰 및 제3웰 사이에 2~10개의 세척웰을 구비하며, 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 상기 세척웰이 순차적으로 침지하여 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 세척 단계는 외부 자력을 이용하여 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 침지 및 이동시키는 단계일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 검출방법은 진단시간이 30분 이내인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 검출방법은 POCT방법을 통하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 암 진단을 위한 자성입자는 기존의 자성입자(특히 자성 비드)에 비하여 높은 자성을 가지고 있어 높은 효율로 자석을 이용한 혼합 또는 이동이 가능하며, 저렴한 가격으로 제조 가능함에 따라 기존의 자성입자를 이용한 진단장비에 비하여 저렴한 가격으로 동일한 진단이 가능하다.
또한 본 발명에 의한 암 진단을 위한 자성입자는 길이에 따라 상이한 포획 프로브를 결합시키는 것으로 다양한 바이오마커를 동시에 진단 가능하므로 본 발명에 의한 POCT(Point-Of-Care Test)진단방법을 사용하는 경우 빠른 시간내에 원하는 질환의 진단이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성입자 진단 시스템 및 진단 방법을 나타낸 공정 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드 제조 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 직경, 길이 등에 대한 현미경 상의 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 화학표면 처리과정을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성입자의 표면 처리에 따른 형광의 변화를 측정한 것으로 (a)는 산성용액을 이용하여 표면 처리하지 않은 자성입자, (b)는 산성용액을 이용하여 표면 처리한 자성입자를 각각 타나낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 표면을 기존의 자성비드의 표면과 비교하여 나타낸 것으로 (a)는 본 발명의 자성 마이크로로드의 표면 (b)는 본 발명의 자성 마이크로로드의 발광 개요, (c)는 기존의 자성 비드의 표면, (d)는 기존의 자성비드의 발광 개요를 각각 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 최적화 결과를 나타낸 것으로 (a)는 실란화 시간에 따른 발광의 변화 사진, (b)는 실란화 시간에 따른 실험결과 그래프를 각각 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 다중 검지기능을 수행하는 자성 마이크로로드의 길이 코딩 시스템의 일 예를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드와 마커(항원)의 항원-항체 반응의 모식도를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 자석 봉과 히팅 블록을 이용한 면역반응의 혼합 가열 및 세척과정을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 초고감도 형광이미지 분석기기에 의해 검출된 이미지 및 형광 신호를 검출한 결과를 나타낸 것으로 (a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 이미지, (b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광이미지, (c)는 본 발명의 분석시스템에 의한 자성 마이크로로드의 형광이미지, (d)는 기존의 분석 시스템에 의한 형광이미지를 각각 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 길이 코딩 시스템을 이용하여 세 개 이상의 바이오 마커를 형광 이미지 검출 및 다중 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 의한 GP88 농도 0~60ng/ml에서 실험한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 의한 GP88 농도 0~60ng/ml에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 의한 GP88(on 300㎛ 자성입자), P53(on 400㎛ 자성입자)의 다중검출을 수행한 결과를 나타낸 사진으로 (a)는 GP88결과 (b)는 P53의 결과를 각각 나타낸 것이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
한편, 본 명세서에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. “제1 ” 또는“제2 ” 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명은 자석 반응 금속을 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하되, 상기 포획 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 것인 자성입자에 관한 것이다.
상기 코어부는 자석 반응 금속, 바람직하게는 자성금속 또는 자성금속과 합금이 된 금속을 포함할 수 있다. 상기 자성금속은 철 (Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn)을 포함한 합금일 수 있다. 상기 자석 반응 금속은 철, 니켈, 코발트, 망간 등과 같은 전이금속을 주성분으로 하여 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 사마륨(Sm) 등과 같은 희토류 금속을 포함할 수 있고, 기타 붕소(B), 규소(Si), 탄소(C) 등을 포함할 수 있다. 상기 자석 반응 금속의 대표적인 예로서 철 합금 또는 코발트 합금을 들 수 있다. 구체적인 철 합금의 예로 Fe 70B 15Si 10C 5를 들 수 있고, 코발트 합금의 예로 Co 68Mn 7Si 10B 15를 들 수 있다. 또한 상기 자성금속은 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 철(Fe) 또는 백금(Pt)과 혼합되거나 합금되어 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 초상자성 금속을 포함할 수 있다. 상기 코어부는 자성을 직접 가지지는 않지만 자석이 접근함에 따라 자화되어 자석과 인력을 가질 수 있어 자석을 이용한 이동 및 혼합에 유용하게 사용될 수 있다. 다만 본 발명의 경우 강자성체가 아닌 상자성체를 사용하는 것이 바람직한데 이는 자석을 제거하는 경우 각 자성입자 사이의 자성인력이 발생하여 뭉치는 형상을 줄이기 위한 것으로 강자성체를 사용하는 경우 이러한 뭉침 현상으로 인하여 각 입자의 개별적인 형광관찰이 용이하지 않을 수 있다. 따라서 본원발명의 코어부는 강자성입자를 사용하는 것이 바람직하다. 아울러 상기 자성 입자는 영구자석이나 전자석과 같은 외부 자석에 의해 신속하게 수집되거나 분리될 수 있도록 수상에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것이 바람직하다.
상기 코어는 자성입자 총 부피의 60% 이상을 차지할 수 있다. 예를 들어 코어는 자성입자 총 부피의 60 내지 99%, 바람직하게는 75 내지 99%일 수 있다. 또한 자성입자는 그 크기(예를 들어 직경 또는 길이)가 수십 내지 수백 ㎛ 정도일 수 있으며, 비중은 5 이상, 예를 들어 5이상 30이하인 것이 바람직하다. 자성입자(130)가 1 마이크로미터 미만의 크기를 갖는 나노입자일 경우 높은 비중을 가지는 입자(ex: 철의 경우 7.876)라 하더라도 수중에서 부유할 수 있다. 이 경우 자성입자를 이용하여 웰 내의 생체물질을 검출하는 바이오 어세이 과정에서 자장 인가 시 미세 입자의 낮은 자력으로 말미암아 상기 자성입자의 자성 제어가 원활하지 않아 분리에 어려움을 겪을 수 있다. 면역 반응을 촉진시키기 위해 자석봉을 웰 내에서 상하 이동할 때 미세 입자들의 탈부착이 발생하는데, 자석봉이 상하 이동하는 과정에서 자석봉에 한번 부착된 자성입자들이 낮은 무게로 인하여 자기장을 제거하여도 웰 바닥으로 다시 떨어지지 않고 자석봉에 비특이적 결합으로 계속 잔존할 수 있다. 이 경우 웰 내 생체물질을 검출할 때 정량분석의 재현성이 저하될 수 있다.
한편, 본 자성입자는 중심부에 자석 반응 금속이 있고 그 주위를 둘러싼 쉘 층(shell layer)을 구비함으로써 코어-쉘 구조를 형성하는데, 쉘 층은 유기물 또는 무기물로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유리(glass)이다.
상기 유리는 소다라임, 보로실리케이트, 알루미노실리케이트, 실리카, 알칼리 실리케이트, 파이렉스 및 석영으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물이 주성분이 될 수 있다. 바람직하게는 내열성, 내산성, 내수성이 요구되는 실험용이며, 항체와 비특이적 결합이 최소화 될 수 있는 보로실리케이트일 수 있다.
상기 쉘 표면은 친수성 작용기를 포함할 수 있다.
상기 쉘 표면의 경우 여러 가지 작용기를 포함하여 후술할 포획 프로브와 결합될 수 있는데 상기 작용기는 친수성 작용기이며, 상기 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 작용기는 실라놀기 일 수 있다.
또한 상기 친수성 작용기는 상기 포획 프로브와 직접 결합할 수 있지만 바람직하게는 링커를 이용하여 결합될 수 있다. 상기 링커는 상기 친수성 작용기와 상기 포획 프로브 사이에 위치하여 포획 프로브가 상기 쉘 층에 용이하게 부착되도록 하는 것으로 바람직하게는 실란화합물, 더욱 바람직하게는 아미노-실란, 가장 바람직하게는 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane, APTES)이 사용될 수 있다.
상기 실란화합물은 바람직하게는 H 2N-L-Si(OR) 3의 구조를 가질 수 있다. 이때 상기 L은 C 1 내지 C 12의 알킬렌 또는 C 6 내지 C 20의 아릴렌이거나 상기 알킬렌과 상기 아릴렌이 임의로 결합된 것이다. 또한 상기 L의 주쇄의 일부가 0 내지 4개의 -NH-로 치환될 수 있으며, 상기 R은 수소 또는 C 1 내지 C 8의 알킬이다.
상기 실란화합물은 바람직하게는 아미노-실란 일 수 있으며, 상기 아미노-실란의 구체적인 예로서, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminopropyltriethoxysilane), 아미노실란 가수분해물(Aminosilane Hydrolysate), 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane), 2-아미노에틸-3-아미노프로필트리메톡시실란(2-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane), 2-아미노에틸-3-아미노프로필트리에톡시실란(2-Aminoethyl-3-aminopropyltriethoxysilane), 2-아미노에틸-3-아미노프로필메틸다이메톡시실란(2-Aminoethyl-3-aminopropyl methyldimethoxysilane), 3-아미노프로필메틸다이에톡시실란(3-Aminopropylmethyldiethoxysilane), 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane), N-2-아미노에틸-3-아미노프로필트리메톡시실란(N-2-Aminoethyl-3-aminopropyltriethoxysilane), 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민(triethoxysilylpropyldiethylenetriamine), 비스(트리메톡시실리프로필)아민[Bis(trimethoxysilypropyl)amine], 및 비스(트리에톡시실리프로필)아민[Bis(triethoxysilypropyl)amine]으로이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 경제성을 고려하여 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTES)이 사용될 수 있다. 일 구현예에서 상기 아민 말단은 상기 포획 프로브와 용이하게 결합될 수 있도록 카복실기로 치환될 수 있다.
또한 상기 쉘 층은 자성입자를 실질적으로 완전히 둘러쌀 수도 있지만, 필요시 또는 제조 과정에서 미세 입자의 표면이 쉘 층으로 완전히 덮이지 않고 자성입자 표면의 일부 영역이 노출될 수도 있다.
상기 코어-쉘 구조는 코어 금속에 액상의 쉘 성분을 도포하여 형성되거나 중공형 틀에 코어 금속 성분을 충진하여 형성된 것일 수 있다.
쉘 층은 유기물 또는 무기물의 액상 코팅액으로부터 고화된 것 일 수 있다. 좀 더 구체적으로 쉘 층은 유기물 또는 무기물 형태의 쉘 성분을 고온에서 녹이거나 흐름성이 있게 만드는 방식 또는 용매 중에 녹이는 방식을 통해 액상 코팅액을 만든 후 코어 금속에 도포하여 형성될 수 있다. 상기 유기물은 주로 고분자일 수 있고, 상기 무기물은 금속 혹은 세라믹, 특히 유리일 수 있다. 예를 들어, 쉘 층을 형성하기 위해 플라스틱을 용매에 녹이거나 유리를 용융하여 얻은 코팅 액을 딥코팅, 스프레이코팅 등의 방식으로 자성입자에 도포할 수도 있다.
상기 자성입자는 생체물질을 포획하기 위하여 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 포획 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체일 수 있다.
중소형 병원의 경우 암을 진단하기 위한 CT 또는 MRI와 같은 단층촬영장비를 구비하고 있는 경우가 많지 않다. 또한 이러한 단층촬영장비를 구비하고 있더라도 이를 판독하는데 많은 시간이 필요하여 적절한 치료가 이루어지기 어렵다. 따라서 대부분의 중소형 병원의 경우 결과를 시각적으로 즉시 판독할 수 있는 초음파 장비를 이용하여 종양의 유무만을 검사하는 것에 그치고 있다. 또한 단층촬영장비의 경우 그 해상도에 한계가 있어 미세한 종양을 잡아내지 못하는 경우가 있으며, 초음파 장비의 경우 파장이 긴 초음파를 사용함에 따라 그 해상도에 한계를 가지고 있어 진단의 정확도가 의사의 숙련도에 좌우되며, 숙련된 의사의 경우에도 종양의 유무만을 판정할 수 있어 정확한 진단에는 조직검사가 필수적으로 수반되고 있다. 하지만 조직검사의 경우 침습적인 검사에 해당함에 따라 환자의 신체에 많은 부담을 줄 수 있으며, 그 검사비용 및 시간이 상당하여 즉각적인 검사에는 한계를 가지고 있다. 하지만 본원 발명의 POCT방법의 경우 혈액내에 존재하는 바이오마커를 이용하여 암의 유무를 판정하고 있으므로, 중소병원에 적용 가능한 소형 장비로 인적, 공간적 비용이 적게 소요된다. 또한, 평균 20~30분의 진단 시간이 소요되고 약 98%로 매우 높은 정확도를 나타내고 있어 암의 신속하고 정확한 진단을 수행하는 데 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 암 POCT 진단시스템 및 진단 방법을 나타낸 공정 흐름도이다. 본 발명에서 암 바이오마커와 특이적으로 결합될 수 있는 제 1 항체는 표면 개질된 자성입자에 고정된다. 상기 자성입자는 자성 금속을 유리로 코팅한 구조의 비구형/비대칭 미립자의 보다 개량된 형태로, 길이로 구별이 가능한 상태로 구성된다. 상기 자성입자의 제 1 항체와 암 바이오마커는 면역반응을 일으킬 수 있으며, 이러한 면역반응의 결합과정은 직접 관측될 수 없기 때문에 측정 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 표지물질로 제 2 항체-표지자 복합체를 사용할 수 있으며, 제 2 항체는 암 바이오마커에 특이적으로 결합될 수 있는 항체이고, 표지자는 일반적으로 형광물질이나 효소를 포함할 수 있다.
이때 상기 암은 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종일 수 있다. 상기 암의 경우 공통된 바이오마커를 통하여 탐지될 수 있다.
88 kDa 당단백질 PC 세포 유래 성장 인자 (PCDGF)는 자가 분비되는 성장 인자이고, 고도로 종양형성성인(tumorigenic) 마우스 기형종 (teratoma) PC 세포로부터 최초로 분리되었다. PCDGF는 GP88, 그래뉼린-에피틀린 전구체 (GEP), 그래뉼린 전구체, 프로그래뉼린, 에피틀린 전구체, 프로에피틀린 (PEPI) 및 아크로그래닌으로도 알려져 있으며 (이하, GP88로 통칭), 시스테인 풍부 폴리펩타이드 성장 조절제의 그래뉼린/에피틀린 패밀리의 가장 큰 구성원이다. GP88은 MAP 키나아제, PI-3 키나아제 및 FAK 키나아제 경로를 자극함으로써, 중간엽(mesenchymal) 및 상피 (epithelial) 기원의 여러 가지 타입의 세포의 증식 및 생존을 자극하는 것으로 보고된 바 있다. 흥미롭게도, GP88의 과다 발현은 유방암, 난소암, 신장암종, 여러 가지 백혈병 및 교아세포종을 비롯한 각종 암 세포주 및/또는 종양 조직에서 발견되었다. 하지만 이러한 GP88은 양성종양과 정상 유선 상피조직에서는 발현되지 않는 것으로 알려져 있어 이를 바이오마커로서 사용하는 경우 높은 정확도를 가지는 암 진단키트의 제작이 가능하다.
암 세포에서, GP88은 종양 발생에 있어 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있다. GP88 과다 발현은 에스트로겐 비의존성 성장, 타목시펜 내성 및 종양 형성과 양성적으로 연관되어 있다. MDA-MB-468 세포에서 안티센스 cDNA 트랜스펙션에 의한 GP88 발현의 억제는 누드 마우스에서 성장 인자의 완전한 억제를 초래하였다. 뿐만 아니라, GP88은 에스트로겐 수용체 양성 암 세포에서 타목시펜의 세포 자멸 효과를 억제하는 것으로 증명되었다. 유방암 생검을 사용한 병리학적 연구 결과는, 종양 그레이드 (grade), p53 발현 및 Ki67 인덱스 등의 양호하지 않은 예후 마커와 관련하여 GP88은 80% 침윤성 관상 암종 (invasive ductal carcinoma)에서 발현되었지만, 양성 병변은 대부분 음성이었음을 나타내었다. 또, 난소암에서의 병리학적 연구 결과는, 낮은 악성 가능성을 가진 종양과 비교하였을 때 침윤성인 상피 난소 종양에서 GP88이 높은 양으로 발현되었음을 나타내었다. 이들 연구는 GP88이 종양 세포의 증식을 자극하는 것 외에도, 침윤에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 증명하고 있다.
상기 암은 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종일 수 있으며, 바람직하게는 유방암일 수 있다. 상기 GP88의 경우 여러 암 종에서 공통적으로 발현된다고 알려져 있으며, 특히 유방암의 발병 및 진행에 깊이 관련되어 있다. 따라서 상기 GP88을 바이오마커로서 사용하는 경우 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종, 특히 유방암을 높은 정확도로 진단할 수 있다. 또한 상기 바이오마커의 증감을 관찰하는 것으로 시중에 나와 있는 유방암치료제의 개인별 치료효과를 신속하게 모니터링 할 수 있어 환자별 적합한 치료제의 선별, 예후진단 및 모니터링이 가능하다. 아울러 현재 개발 중인 유방암 치료제의 효과를 확인하는 것에도 사용 가능하여 효과적인 유방암 치료제의 개발에도 사용될 수 있다.
상기 GP88의 서열은 대한민국 등록특허 제 10-1690249에 나타나 있으며, 이외에도 공개되거나 기탁된 서열의 GP88 또는 상기 GP88의 재조합체 일 수 있다. 또한 상기 GP88과 결합하기 위한 포획 프로브 또는 검출프로브는 항-GP88항체를 포함할 수 있으며. 일 예로서 6B3 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5262), 6B2 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5261), 6C12 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5597), 5B4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA5260), 5G6 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5595), 4D1 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5593), 3F8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5591), 3F5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5259), 3F4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5590), 3G2 (ATCC 기탁 번호 PTA-5592), 2A5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5589), and 4F10 (ATCC 기탁 번호 PTA-8763)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 하이브리도마 세포주로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 자성입자는 표면 균일도가 매우 뛰어나다. 종래 바이오 어세이용 입자의 경우, 쉘 층을 형성하기 위해 TEOS와 같은 실리카 전구체를 이용하여 코어 입자 표면 위에 성장시키는데, 이 경우 쉘 층은 매우 거친 표면을 갖게 된다. 그리하여 검출대상 물질의 비특이적 결합이 많이 발생할 수 있다. 이는 불필요한 백그라운드 노이즈를 발생시키는 원인이 될 수 있다.
또한 상기와 같이 굴곡이나 돌기가 없는 쉘 층을 형성하기 위하여 상기 쉘 층은 산성물질, 바람직하게는 강산과 과산화수소의 혼합물로 표면 처리될 수 있다. 상기 강산과 과산화수소의 혼합물은 일명 피라냐 용액(Piranha solution)으로 명명되고 사용되는 것으로 일반적으로는 황산과 과산화수소를 3:1~7:1의 비율로 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 강산과 과산화수소의 혼합물은 강력한 산화력을 가지는 용액으로 상기 쉘 층 상에 존재하는 이물질을 산화시켜 제거함과 동시에 쉘 층의 표면에 형성된 돌기를 식각하여 제거함으로서 표면조도를 최소화하여 원하지 않은 형광물질의 부착을 막을 수 있다. 또한 상기 산성물질은 상기 쉘 층의 표면에 친수성 작용기를 형성하여 전술한 링커 또는 포획 프로브가 용이하게 결합될 수 있도록 할 수 있다.
이를 통하여, 상기 쉘의 표면에는 1~80개/nm 2의 친수성 작용기가 도입될 수 있다.
상기 링커 또는 포획 프로브의 경우 쉘 층의 친수성 작용기과 결합하여 상기 자성입자에 부착되므로, 상기 친수성 작용기의 수에 따라 결합 가능한 링커 또는 포획 프로브의 수가 정해질 수 있다. 따라서 상기 자성입자의 표면에 다수개의 친수성 작용기를 형성하는 경우 많은 양의 링커 또는 프로브를 상기 자성입자의 표면에 부착시키는 것이 가능하다(도 5). 이때 상기 친수성 작용기의 밀도가 1개/nm 2 미만인 경우 형광 측정시 낮은 형광을 보임에 따라 측정이 어려울 수 있으며, 상기 친수성 작용기의 밀도가 80개/nm 2를 초과하는 경우 프로브의 결합시 프로브 사이의 간섭으로 인하여 더 이상의 형광의 증대는 없을 수 있다.
또한 상기 포획 프로브는 상기 실라놀에 직접 결합되는 경우 1~80개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다. 다만 도 4에 나타난 바와 같이 상기 링커는 상기 실라놀 3개의 분자와 결합하고 있으므로 링커를 이용하여 상기 포획 프로브가 결합되는 경우 1~30개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다.
상기 쉘 층의 표면은 산성물질을 이용하여 표면 처리될 수 있다. 상기 쉘 층이 유리로 제작되는 경우 유리 표면에 존재하는 친수성 작용기인 실라놀기가 상기 프로브와 결합될 수 있다. 하지만 이 경우 소수의 포획 프로브만이 상기 쉘 층의 표면에 부착될 수 있어 형광 분석시 형광의 강도가 낮아질 수 있다. 따라서 본원 발명에서는 상기 산성물질로서 바람직하게는 황산과 과산화수소수의 혼합물인 피라냐 용액을 이용하여 쉘 층의 표면에 친수성 작용기를 형성할 수 있다. 이때 상기 산성물질에 의하여 형성된 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기, 또는 알데히드기 등일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 친수성 작용기는 실라놀기일 수 있다.
이때 상기 친수성 작용기를 형성하는 방법은 산소플라즈마 처리, 코로나 처리, UV오존처리와 같은 건식 방법을 이용할 수도 있지만, 자성 마이크로로드의 표면에 일정하게 친수성 작용기를 형성할 수 있으면서도 자성의 영향을 받지 않는 산성 물질을 이용한 습식처리를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 즉 본원 발명의 경우 산성물질 특히 피라냐 용액을 이용한 산화적 친수화처리를 하는 것으로 상기 프로브가 결합될 수 있는 반응점(친수성 작용기)을 크게 늘릴 수 있으며, 이에 따라 형광 분석이 형광의 강도를 더욱 강하게 할 수 있다(도 5 참조).
반면 본 발명의 쉘 층을 형성하는 유리(glass), 예를 들어 보로실리케이트 글라스(Borosilicate glass)는 반응 시료와 화학적 반응에 의한 흡착에 의한 비특이적 반응(non-specific binding)이 거의 없다. 특히 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 자성입자는 액상의 성분으로부터 유래된 코팅 층을 쉘 층)으로 가지고 있으므로 매우 균일한 표면을 갖는다. 쉘 층 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하, 바람직하게는 10nm 이하, 더 바람직하게는 5nm이하, 더욱 바람직하게는 2nm 이하, 특히 1.5nm 이하일 수 있다. 또한 Ra는 예를 들어 3nm 이상, 2nm 이상, 1nm 이상일 수 있다. 상기 표면 거칠기가 15nm를 초과하는 경우 쉘 층의 표면에 형광물질의 비특이적 흡착이 늘어남에 따라 형광 관찰시 노이즈가 커질 수 있다.
상기 쉘 층의 두께는 1 내지 100㎛, 바람직하게는 1 내지 50㎛, 더욱 바람직하게는 1 내지 10㎛, 가장 바람직하게는 4 내지 8㎛일 수 있다. 쉘 층의 두께가 상기 범위 미만에서는 쉘 층의 표면이 부서지거나 크랙이 쉽게 발생 될 수 있고, 상기 범위 초과에서는 글라스 절단 가공시 레이저 특성 및 파장에 따른 문제가 발생할 수 있다.
상기 자성입자는 검출한계가 1ng/ml 이하이며, 동적범위(Dynamic Range)가 log3 이상일 수 있다. 상기 자성입자를 이용하여 형광분석을 수행하는 경우 도 13에 나타난 바와 같이 30ng/ml부근에서 가장 큰 형광의 변화를 보이는 것으로 나타났으며, 1ng/ml의 농도에서도 분석이 가능한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 자성입자는 검출한계가 1ng/ml 이하, 바람직하게는 3.7ng/ml 이하, 가장 바람직하게는 7ng/ml 이하일 수 있다. 또한 상기 검출한계는 예를 들어 0.001ng/ml이상, 0.01ng/ml이상 또는 0.1ng/ml이상일 수 있다. 도 14에 나타난 바와 같이 동적범위가 log3이상, 바람직하게는 log5 이상의 범위를 가질 수 있다. 예를 들어 상기 동적범위는 log3~10의 범위를 가질 수 있으며, 바람직하게는 log 5~7의 범위를 가질 수 있다. 또한 도 14에 나타난 바와 같이, 0~60ng/ml의 범위에서 농도가 증가할수록 형광신호가 증가하여 매우 높은 상관관계를 가지는 것으로 나타났다(결정계수 R 2값 : 0.9909). 따라서 본원 발명의 자성입자를 시용하는 경우 기존의 자성입자에 비하여 감도가 약 40배로 증가하며, 최적화시 약 100배 이상의 감도를 가질 수 있다.
상기 자성입자는 2종 이상의 상이한 길이를 가지는 자성입자가 혼합되어 있으며, 2종 이상의 상기 바이오마커를 동시에 진단할 수 있는 것일 수 있다. 이 경우 각 길이에 따라 상기 자성입자는 상이한 포획 프로브와 결합될 수 있다(도 8). 이를 이용하면 각 포획 프로브에 따라 상이한 길이의 형광을 발생하게 되므로 2종 이상의 바이오마커를 동시에 진단할 수 있다. 이를 위하여 상기 자성입자는 5~200㎛의 길이 차이를 가지는 2~20종의 자성입자를 혼합하여 사용할 수 있다. 다양한 길이를 가지는 자성입자를 사용하는 것으로 2~20종의 바이오마커를 동시에 검출가능하다. 이때 상기 각 자성입자의 길이 차이가 5㎛미만인 경우 광학장비를 이용하여 길이 차이를 식별하기 어려우며, 200㎛를 초과하는 경우 식별은 용이하지만 다종의 자성입자를 사용하는 것이 어려워 다종의 바이오마커를 동시에 식별하기 어렵다.
일예로서 300㎛의 길이를 가지는 자성입자의 표면에 GP88과 항체-항원 반응을 하는 항체를 포획 프로브로 결합하고 400㎛의 길이를 가지는 자성입자의 표면에 P53과 항체-항원 반응을 하는 항체를 포획 프로브로 결합할 수 있다. 상기 두 가지의 자성물질을 혼합하여 사용하는 경우 상기 자성물질은 동일한 형광을 발생하지만 자성물질의 길이 차이로 인하여 상기 바이오마커가 GP88인지(형광길이 300㎛), P53인지(형광길이 400㎛)를 판독할 수 있으며, 이는 PCR등 유전자확인을 통한 방법을 통하지 않고도 단순히 광학적인 관찰을 통하여 바이오마커의 종류를 정확하게 판정할 수 있다는 것이다.
이를 확장하여 각기 다른 길이를 가지는 10종의 자성입자에 각각의 포획 프로브를 결합하고 이를 혼합하여 사용하는 경우 10종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다는 것을 의미한다. 다만 상기 각각 다른 길이를 가지는 자성입자가 20종을 넘는 경우 각 자성입자의 수량이 부족하여 적절한 형광을 나타나지 못할 수 있으며, 충분한 형광을 나타내기 위해서는 많은 양의 자성입자를 투입해야 하므로 효율이 떨어질 수 있다.
상기 자성입자는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물일 수 있다. 유리가 코팅된 금속 미세와이어를 레이저로 단순히 절단함으로써 다양한 길이를 갖는 자성입자를 용이하게 얻을 수 있다.
상기 자성입자는 막대형, 평판형, 구형 등과 같은 정형적인 형태나 비정형적인 형태를 포함한 다양한 형태를 가질 수 있다. 자성입자가 평판 형태를 가질 경우에도 단면은 별형, 다각형, 원형 등의 다양한 모양을 가질 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 자성입자는 제조의 편이성과 관찰의 용이성으로 마이크로로드(microrod), 마이크로디스크(microdisc), 또는 마이크로비드(microbead) 형태인 것이 바람직하며, 특히 마이크로로드의 형태를 갖는 것이 바람직하다. 자성입자가 마이크로로드의 형태를 가질 경우 자성입자들 간의 겹침에 의한 구분이 용이하고, 웰 내에 배치될 경우 포커싱이 쉬우며, 개별입자가 차지하는 면적이 적어 하나의 관찰화면에 다수의 미세 입자들을 관찰할 수 있다. 한편 자성입자가 별 모양과 같이 단면이 복잡한 구조를 갖는 형상을 가질 경우 웰 내부에서 움직이는 과정에서 서로 간 또는 벽과의 충돌에 의하여 모서리 부분의 깨짐이 발생할 수 있으므로 마이크로로드와 같이 단순한 형태를 갖는 것이 더욱 유리하다.
상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛일 수 있다. 상기 마이크로로드의 길이가 상기 범위 미만에서는 서로 다른 길이의 입자간의 구분이 쉽지 않고 입자의 크기가 작아짐에 따라 자성이 줄어들게 되어 자석에 의한 혼합, 세척 및 이동이 용이하지 않을 수 있다. 또한, 상기 범위 초과에서는 입자들의 겹침이 발생할 수 있어 관찰이 용이하지 않으며, 하나의 웰에 원하는 양의 자성입자를 넣기 어려워 원활한 진단이 어려울 수 있다. 또한, 상기 마이크로로드의 직경 대비 길이의 비(종횡비)는 2 이상, 5 이상 또는 10이상일 수 있으며 상기 종횡비는 바람직하게는 20이하일 수 있다. 종횡비가 2미만인 경우 구형의 미립자와 유사하여 서로 구별하기가 어려울 수 있으며 종횡비가 20을 초과하는 경우 자성입자의 직경이 줄어듦에 따라 상대적으로 자성을 가지는 코어부가 얇아지고 이에 따라 자성이 약해질 수 있다. 또한 종횡비가 20을 초과하는 경우에는 얇은 직경을 가짐에 따라 내구성이 저하되어 검사중 자성입자가 부러지는 현상이 발생할 수 있다.
상술한 자성입자는 생명체로부터 유래된 특정 시료액 내의 생체물질을 검출하는 체외진단용으로 적합하게 사용될 수 있다. 상기 시료액은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 신속 진단을 위해 상기 시료액의 전처리는 간소화되거나 경우에 따라서 생략될 수 있다.
상기 생체물질은 바이오마커, 혈액, 혈장, 혈청, 체액, 단백질, 펩타이드, 핵산, 박테리아, 바이러스, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 생체물질은 바이오마커일 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술은 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기 진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하다. 상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있다. 구체적으로 상기 바이오마커는 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종, 특히 유방암이 있는 경우 그 혈중 농도가 증가하는 바이오마커라면 제한없이 사용할 수 있지만 바람직하게는 GP88을 포함할 수 있다. 상기 바이오마커는 일반적인 유방암 뿐만 아니라 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종이 있는 경우에도 발현하는 것으로 알려져 있으므로, 증상이 명확한 중증의 환자뿐만 아니라 경증의 환자까지도 본 발명의 자성입자를 이용하여 진단할 수 있다.
시료액 내의 상기 생체물질을 포획하기 위해 본 발명의 일 구현예에 따른 자성입자는 쉘 층 위에 포획 프로브가 도입될 수 있다. 포획 프로브는 상기 생체물질과 특이적으로 결합하여 상기 생체물질을 자성입자에 포획시키는 역할을 한다. 포획 프로브는 항체, 단백질, 핵산 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 포획항체일 수 있다. 포획 프로브는 자성입자의 표면에 흡착시키거나 화학적으로 연결시켜 고정시킬 수 있으며, 바람직하게는 쉘 층의 표면에 존재하는 친수성 작용기와 연결될 수 있다. 예를 들어 포획 프로브의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 자성입자에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 포획 프로브를 자성입자에 부착시킬 수 있다. 이때 자성입자 표면의 친수성 작용기를 이용하여 포획 프로브를 자성입자에 연결시킬 수 있다.
이때 상기 친수성 작용기는 상기 포획 프로브와 직접 결합될 수도 있지만 바람직하게는 링커를 이용하여 결합될 수 있다. 상기 링커는 실란화합물일 수 있으며 이는 위에서 살펴본 바와 같다(도 4 참조).
이하 본 발명을 자성입자의 제조방법을 통하여 상세하게 설명한다.
본 발명은 또한 (i) 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계; (ii) 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성하는 표면 처리하는 단계; (iii) 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시키는 단계; (iv) 상기 실란의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하는 단계; 및 (v) 상기 실란화합물의 말단에 프로브를 부착하는 단계를 포함하되, 상기 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 생체물질 검출을 위한 자성입자 제조방법에 관한 것이다.
단계 (i)에서 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비한다.
상기 (i)단계는 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계로 상기 자성 마이크로로드는 금속 분말을 유리튜브에 충진한 다음, 이를 가열조건하에서 인발하여 유리가 코팅된 미세와이어를 제작하며 이를 일정한 길이로 절단하여 자성 마이크로로드를 제조하는 과정을 거칠 수 있다(도 2 참조). 이러한 과정은 Talyor-Ulitovsky 테크닉을 기반으로 하는 바, 예를 들면 WO1993/005904 A2 등에 기본적인 원리가 기재되어 있다. 상기 문헌은 본 발명의 참고자료로 사용될 수 있다.
상기 유리로 코팅된 미세와이어 제조방법을 상세히 살펴보면 유리 튜브 내에 금속(자성입자)을 충진하고 이를 가열수단에 의하여 가열되는 가열부에 위치하게 된다. 이때 상기 금속은 금속 분말이거나 용융되어 금속을 형성하는 화합물일 수 있으며, 용융된 금속을 직접 주입하는 것도 가능하다. 또한 상기 금속 분말을 사용하는 경우 상기 금속분말은 평균입경이 40~300㎛, 바람직하게는 50~200㎛, 더욱 바람직하게는 70~150㎛일 수 있다. 상기 금속분말의 평균입경이 40㎛미만인 경우 작업시 공기중으로 비산될 수 있음과 더불어 분말의 가격이 높아져 전체적인 제조비용이 증가할 수 있으며, 300㎛를 초과하는 금속 분말을 사용하는 경우 상기 유리 튜브로의 이송이 원활하지 않아 제작되는 미세와이어 내부에 금속이 존재하지 않는 빈공간이 생겨 불량이 발생할 수 있다(도 3).
또한 사용되는 유리 튜브는 내경이 0.2~2mm, 바람직하게는 0.3~1.5mm, 더욱 바람직하게는 0.5~1mm인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유리튜브의 내경이 0.2mm미만인 경우 코어부를 구성하는 상기 금속의 주입이 원활하지 않을 수 있으며, 2mm를 초과하는 경우 코어부의 상대적인 직경이 증가하게 되어 인발시 유리 쉘 층의 두께가 얇아질 수 있으며 이에 따라 내구성이 떨어지거나 표면에 굴곡 또는 돌기가 발생할 수 있다(도 3).
상기 유리 튜브의 재질은, 소다라임, 보로실리케이트, 알루미노실리케이트, 실리카, 알칼리 실리케이트, 파이렉스 또는 석영일 수 있으며 이와는 별도로 주성분으로 산화납, 이산화텔루륨 또는 실리카를 함유하는 유리를 튜브형으로 가공하여 사용할 수 있다. 또한 상기 유리의 연화점은 약 1,000 내지 1,900℃, 바람직하게는 약 1,100 내지 1,700℃ 범위일 수 있다. 상기 유리의 연화점이 1,000℃ 미만인 경우 상기 금속분말이 용융되기 이전에 유리 튜브가 연화되어 불량이 발생할 수 있으며, 1,900℃를 초과하는 연화온도를 가지는 경우 가열에 많은 시간과 비용이 필요하여 경제성이 떨어질 수 있다.
또한 쉘 층을 형성하는 유리(glass), 예를 들어 보로실리케이트 글라스(Borosilicate glass)는 반응 시료와 화학적 반응에 의한 흡착에 의한 비특이적 반응(non-specific binding)이 거의 없어 노이즈를 최소화 할 수 있다.
또한 상기 금속의 경우 상기 유리튜브의 연화점보다 낮은 용융온도를 가지는 것이 바람직하다. 상기 금속의 용융온도가 상기 유리의 연화점보다 높은 온도를 가지는 경우 인발과정에서 용융되지 못하고 금속 분말이 그대로 유리튜브 사이에 위치하게 되며, 이는 사용시 금속분말의 외부유출이 가능하여 자성입자의 수명을 떨어트릴 뿐만 아니라 이물질로 인한 오염을 발생시킬 수 있다.
한편 상기 가열수단은 상기 유리튜브의 하측부위 또는 이와 인접한 위치에 배치될 수 있으며, 상기 유리튜브를 인발할 수 있는 연화점까지 상기 유리튜브를 가열하게 된다.
상기와 같이 가열되는 동안 상기 금속 분말은 액적을 형성하게 되며, 상기 금속 분말에 인접해있는 유리 튜브는 연화되어 상기 금속분말이 형성한 액적을 둘러싸게 된다. 구체적으로는 상기 유리 튜브 내에 충진된 금속 분말은 용융됨과 동시에 상기 유리튜브가 연화되어 인발되므로, 상기 자성입자 코어부를 상기 유리가 코팅하는 형태로 인발되게 된다.
상기 가열수단은 예를 들면 당업계에서 알려진 인덕션 가열 장치, 구체적으로 인덕터일 수 있다. 예시적으로, 인덕터는 나선형의 코일(예를 들면, 구리 재질)이 감겨져 있는 바, 구체적으로 상기 코일 내부에 가열 영역을 형성할 수 있다. 코일의 수는 원하는 용융 금속의 높이 등을 고려하여 선택될 수 있다. 이때, 가열 영역은 요구 주파수에서 자기장에 의하여 생성된 에디-전류 손실에 의하여 가열된다. 또한, 가열수단은 고주파 인덕터일 수 있는 바, 이때 주파수는 예를 들면 약 0.5 내지 800 kHz, 구체적으로 약 10 내지 500 kHz 범위일 수 있으나, 이는 한정되는 것은 아니다.
상기 가열영역내의 온도는 상기 유리 튜브를 연화할 수 있는 온도인 1,000~2,000℃인 것이 바람직하며, 상기 유리 튜브의 재질, 자성입자 코어부를 구성하는 금속의 종류 등에 따라 변경하여 사용할 수 있다.
상기 유리튜브 내에 충진되는 자성입자는 위에서 살펴본 바와 같이, 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 철(Fe) 또는 백금(Pt)을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 초상자성 금속을 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 자성 금속의 대표적인 예로서 코발트 합금 또는 철-풍부 합금을 들 수 있다. 특정 예에서는, 자성 금속 내에 구리를 소량(예를 들면, 약 5 원자%까지, 구체적으로 약 3 원자%까지) 첨가 또는 혼입하여 핵생성 중심의 개수를 증가시키고 나노결정화를 촉진할 수도 있다.
상기와 같이 가열과정이 끝나면, 유리 튜브 내부에 미세와이어의 코어를 구성하는 금속의 용융물이 유리 모세관을 충진하면서 인발된다.
또한 상기 인발과정 중 상기 유리 튜브 내부는 비활성 가스, 예를 들면 헬륜, 네온, 아르곤, 질소 가스 분위기일 수 있다. 상기와 같이 유리튜브를 불활성 가스 분위기로 치환하게되면 상기 자성입자의 용융에 의한 산화를 방지할 수 있다.
상기와 같은 인발 과정을 통하여 금속 코어가 글라스에 의하여 실질적으로 완전히 코팅되어 있는 미세와이어를 형성할 수 있으며, 인발된 미세와이어는 가열 수단 후단에 배치된 냉각 수단에 의하여 냉각되면서 고상화될 수 있다.
상기 냉각수단은 상기 미세와이어를 냉각할 수 있는 장치라면 제한없이 사용할 수 있지만, 냉각제에 상기 미세와이어를 침지하여 냉각하는 방식을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 냉각제는 물, 오일 또는 각종 냉매를 사용할 수 있지만 바람직하게는 물을 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이 고형화된 미세와이어는 시스템 내에 장착된 권취 장치에 의하여 회수된다. 이때 상기 권취 장치는 코일 형상, 구체적으로 와이어 보빈(wire bobbin) 타입일 수 있다.
글라스-코팅 금속 미세와이어에 있어서, 코어 금속의 직경은, 30~100㎛, 바람직하게는 40~80㎛, 더욱 바람직하게는 50~70㎛ 범위일 수 있다. 또한, 유리 코팅(쉘 층)의 두께는, 3~50㎛, 바람직하게는 5~20㎛, 더욱 바람직하게는 7~15㎛ 범위일 수 있다. 또한, 전체 미세와이어의 직경은, 예를 들면 약 30~120㎛, 바람직하게는 30~100㎛, 더욱 바람직하게는 40~80㎛ 범위 내에서 선택될 수 있다.
이와 같이 제조된 자성물질을 포함하는 미세와이어는 권취 장치 상에 1~15 km, 바람직하게는 5~10km의 길이로 연속 제조되어 권취된 형태로 패키징될 수 있으며, 후술하는 바와 같이 비구형 마이크로로드 제조에 사용될 수 있다.
상기와 같이 제조된 미세와이어는 이를 일정 길이로 절단하여 비구형의 자성 마이크로로드를 제작할 수 있다. 이를 상세히 살펴보면 복수 개의 미세와이어를 횡 방향으로(예를 들면, 평행하게) 배열하고, 소정의 길이로 절단하여 비구형/비대칭 미립자를 대량으로 제조할 수 있는 장점을 제공하는 바, 이를 위하여 비접촉식 레이저를 이용한 절단 방식을 채택한다.
이러한 절단 방법은 구체적으로 대한민국 공개특허 제2018-0130436호에 나타난 방법을 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 복수 개의 그루브가 횡 방향으로 배열되어 있는 와이어 홀더의 그루브 내에 상기 글라스-코팅 금속 미세와이어의 적어도 하나를 위치시키는 단계; 및 상기 와이어 홀더에 위치하는 적어도 하나의 글라스-코팅 금속 미세와이어를 소정의 간격을 두고 가로지르는(traverse) 방향으로 상기 글라스-코팅 금속 미세와이어의 열 전파 시간보다 짧은 펄스 폭을 갖는 레이저를 이용한 비접촉 방식의 가공에 의하여 절단하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 자성 마이크로로드는 표면을 매끄럽게 만들기 위하여 강산 및 과산화수소의 혼합물로 구성된 혼합용액을 이용하여 표면 처리를 수행한다. 이 과정 이전 표면에 존재하는 이물질을 제거하기 위한 세척과정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 세척과정은 다양한 유기용매를 이용하여 수행될 수 있으며 그 과정을 구체적으로 살펴보면 제작된 자성입자(자성 마이크로로드)를 유기용매를 이용하여 세척한 다음 에탄올을 이용하여 유기용매를 제거한다. 이때 사용되는 유기용매는 아세톤인 것이 바람직하다. 유기용매 처리가 끝난 다음, 상기 자성입자를 산처리 할 수 있다. 상기 산은 황산을 사용하는 것이 바람직하며, 산처리가 완료된 이후 물과 에탄올의 혼합물을 이용하여 세정한다. 산처리가 완료된 자성입자는 염기처리를 수행하게 되는데 이때 사용되는 염기는 수산화나트륨이며, 물과 에탄올의 혼합용매에 수산화나트륨을 용해하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기와 같이 염기 처리가 완료된 이후에는 물과 에탄올을 이용하여 세척하는 것이 바람직하다.
단계 (ii)에서, 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성한다.
예를 들어, 상기와 같은 세척과정이 끝난 이후 상기 자성입자는 산성용액을 이용하여 표면 처리할 수 있다.
바람직하게는 상기 산성 용액은 강산과 과산화수소의 혼합물일 수 있으며, 예를 들어 피라냐(pyranha) 용액일 수 있다. 상기 피라냐 용액은 일반적으로 황산과 과산화수소의 혼합물을 의미하는 것으로 각기 다른 비율로 혼합되어 사용되고 있지만 모두 피라냐 용액으로 불리고 있다. 전형적인 피라냐 용액은 황산:과산화수소의 부피비가 3:1~7:1의 용액을 의미한다. 이와는 별도로 베이스 피라냐 용액이라 불리는 암모니아수와 과산화수소의 혼합물로 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 산성용액은 상기 강산과 상기 과산화수소를 1:1~7:1의 부피비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2:1~5:1, 가장 바람직하게는 3:1의 부피비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비율이 1:1미만 즉 과산화수소의 함량이 상기 강산보다 많은 경우 산성용액의 제조시 많은 발열 및 가스가 발생하여 폭발할 가능성이 높으며, 7:1을 초과하는 비율에서는 피라냐 용액에 의한 산화가 원활하지 못하여 실라놀기의 형성이 용이하지 않을 수 있다. 또한 이때 사용되는 과산화수소는 10~50부피%의 용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 20~40부피%, 더욱 바람직하게는 30부피%의 과산화수소용액을 사용할 수 있다. 상기 10부피% 미만의 과산화수소용액을 사용하는 경우 피라냐 용액을 이용한 산화가 원활하지 못하여 실라놀기의 형성이 용이하지 않을 수 있으며, 50부피%를 초과하는 용액을 사용하는 경우 산성용액의 제조시 많은 발열 및 가스가 발생하여 폭발할 가능성이 있다.
상기 피라냐 용액은 부식성이 매우 높고 강력한 산화제이므로 취급에 주의를 해야 한다. 상기 피라냐 용액을 사용하기 이전 대상물의 표면의 이물질은 완전히 세척되어야 하며, 세척에 사용된 용매 역시 제거되어야 한다. 상기 피라냐 용액은 유기오염물을 용해하여 제거할 수 있지만 다량의 오염물 또는 세척용 용매는 격렬하게 거품을 발생시키거나 폭발적인 반응을 일으켜 다량의 가스를 방출할 수 있다.
이러한 피라냐 용액을 제조시 황산에 과산화수소를 첨가하여 제조하는 것이 바람직하다. 과산화수소에 황산을 첨가하는 경우 다량의 가스가 발생하며, 폭발할 가능성이 있기 때문에 황산에 과산화수소를 첨가하여 제조하는 것이 바람직하다. 또한 황성에 과산화수소를 첨가하는 경우에도 격렬한 발열반응이 수행되므로 적절한 냉각을 수행하여 온도를 낮추는 것이 바람직하다. 또한 이러한 격렬한 반응을 제어하기 위하여 상기 과산화수소는 50부피%이하의 함량을 가지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30부피%의 함량을 가질 수 있다.
이렇게 제조된 피라냐 용액은 금속 표면 또는 유리 표면을 산화시킬 수 있으며, 특히 유리의 경우 표면의 이물질과 원하지 않게 생성된 돌기를 산화시켜 제거함과 동시에 유리표면을 친수화하여 다량의 실라놀기를 형성할 수 있다.
이때 상기 산성 용액은 상기 자성 마이크로로드 유리표면 분자의 1~90%를 실라놀로 전환할 수 있으며, 상기 자성 마이크로로드의 표면에 다수개의 실라놀을 형성하는 경우 많은 양의 프로브를 상기 자성입자의 표면에 부착시키는 것이 가능하다. 즉 상기 산성용액을 이용하여 표면에 실라놀기가 형성된 경우 상기 실라놀기에 다량의 친수성 작용기 또는 실란과 결합한 작용기(링커)가 결합될 수 있다(도 5). 상기 실라놀의 밀도가 1개/nm 2 미만인 경우 형광 측정시 낮은 형광을 보임에 따라 측정이 어려울 수 있으며, 상기 실라놀의 밀도가 80개/nm 2를 초과하는 경우 프로브의 결합시 프로브 사이의 간섭으로 인하여 더 이상의 형광의 증대는 없을 수 있다.
또한 상기 포획 프로브는 상기 실라놀에 직접 결합되는 경우 1~80개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다. 다만 도 4에 나타난 바와 같이 상기 링커는 상기 실라놀 3개의 분자와 결합하고 있으므로 링커를 이용하여 상기 포획 프로브가 결합되는 경우 1~30개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다.
단계(iii)에서 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시킬 수 있다.
상기와 (ii)단계와 같이 표면 처리가 완료된 이후 상기 자성입자의 쉘 층에 실란화합물을 반응시키게 된다. 위에서 살펴본 바와 같이 APTES(3-aminopropyltriethoxy silane)를 이용하여 쉘 층 표면에 형성된 실라놀기에 실란화합물을 부착할 수 있으며, 이때 상기 APTES는 아세톤 또는 톨루엔 용액에 용해하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 APTES는 상기 실라놀기와 결합하여 아미노-실란을 형성할 수 있으며, 바람직하게는 6~24시간 동안 반응시키는 것으로 차후에 있을 형광 분석에서 최적의 형광을 나타낼 수 있다. 상기 반응시간이 6시간 미만인 경우 실라놀에 결합하는 APTES의 양이 줄어들어 형광의 세기가 약해질 수 있으며, 24시간을 초과하는 경우에는 형광의 세기에 변화는 없으면서 제작시간만 많이 소모하게 되어 제작비용이 증가할 수 있다(도 7 참조).
단계 (iv)에서 상기 실란의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환할 수 있다.
상기 아미노-실란이 형성된 상기 자성입자의 쉘층은 표면이 카복실기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기로 치환되어 사용되는 것이 바람직하다. 상기 포획 프로브의 경우 그 종류에 따라 결합이 용이한 말단이 상이하므로 상기 아미노 실란의 말단(아민기)을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하여 사용할 수 있다. 또한 상기 포획 프로브가 상기 아미노-실란(링커)의 아미노기와 결합이 용이한 경우에는 치환 없이 그대로 사용하는 것도 무방하다.
상기 아미노-실란의 말단은 더욱 바람직하게는 감마-부티로락톤(γ-butyrolactone) 또는 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 반응시켜 상기 아민기를 카르복실기로 치환시킬 수도 있다.
단계(v)에서 상기 실란화합물의 말단에 프로브를 부착할 수 있다.
상기와 같이 제조된 자성 마이크로로드는 이후 프로브가 부착되어 사용될 수 있다. 이때 상기 프로브는 포획 프로브인 것이 바람직하다. 상기 포획 프로브는 바이오마커와 항원-항체 반응을 수행하는 프로브로서 상기 자성 마이크로로드에 바이오마커를 부착시키는 역할을 한다. 또한 이와는 별도로 검출 프로브가 상기 바이오마커에 부착될 수 있으며, 상기 검출 프로브에 위치하는 형광물질 또는 효소의 작용에 의하여 상기 바이오마커를 탐지할 수 있다.
이때 상기 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함할 수 있다. 상기 바이오마커는 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종, 특히 유방암에서 발현되는 것으로 알려진 GP88일 수 있으며, 항-GP88항체가 상기 프로브에 포함되는 경우 높은 정확도를 가지는 암 진단키트의 제작이 가능하다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 상술한 자성입자를 이용한 생체물질의 검출방법이 제공된다. 본 검출방법은 (1) 제1웰에 상기 자성입자를 제공하는 단계; (2) 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시키는 단계; (3) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (4) 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법에 관한 것이다.
단계 (1)에서 제1웰에 상기 자성입자를 제공할 수 있다.
상기 자성입자는 상기 제조방법에서 제조된 자성 마이크로로드 일 수 있으며 상기 자성 마이크로로드는 상기 제1웰에 침지되어 보관될 수 있다.
단계 (2)에서 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시킬 수 있다.
상기 자성입자는 자성을 가지고 있는 입자이므로 자력을 이용하여 상기 제2웰로 이동될 수 있다. 상기 자력은 자석봉에 의하여 형성되는 것이 바람직하며, 상기 자석봉은 캡이 씌워져 있으므로 상기 자석봉을 이용하여 상기 자성입자를 이동시킨 다음 캡을 고정한 상태로 자석봉을 제거하면 상기 자성입자는 상기 제2웰 내부에 침지되거나 제2웰에 포함된 용매에 부유될 수 있다. 이하 자성을 이용한 자성입자의 이동 방법은 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
단계 (3)에서 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성할 수 있다.
상기 검출 프로브는 상기 포획 프로브와 마찬가지로 상기 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단백질, 핵산 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하며 발광물질을 구비한 검출항체일 수 있다.
상기 검출항체 및 상기 포획 프로브의 포획항체는 암 바이오마커를 항원으로 하는 항체일 수 있다. 예를 상기 항원은 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종, 특히 유방암이 있는 경우 그 혈중 농도가 증가하는 바이오마커라면 제한없이 사용할 수 있지만 바람직하게는 GP88을 포함할 수 있다. 상기 바이오마커는 일반적인 유방암 뿐만 아니라 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종이 있는 경우에도 발현하는 것으로 알려져 있으므로, 증상이 명확한 중증의 환자뿐만 아니라 경증의 환자까지도 본 발명의 자성입자를 이용하여 진단할 수 있다.
상기 발광물질은 상기 검출 프로브에 연결되어 자외선, 전자선, 화학반응, 효소-기질 반응 등과 같은 외부 자극에 의해 빛을 생성함으로써 상기 생체물질의 존재를 검출할 수 있게 한다. 상기 발광물질의 예로서, 형광분자, 양자점, 금속 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질 등을 들 수 있다. 이들 중 입수용이성 및 적용의 편이성 면에서 상기 발광물질로서, FITC(fluorescein isothiocyanate), 플루오레세인(fluorescein), FAM(fluorescein amidite), PE(phycoerythrin), TRITC(tetramethyl-rhodamine isothiocyanate), Cy3(Cyanine 3), Cy5(Cyanine 5), Cy7(Cyanine 7), 알렉사(Alexa) 플루오르 염료, 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 형광분자가 흔히 사용될 수 있다.
상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체는 예를 들어 상기 포획항체가 고정화된 자성입자 및 상기 생체물질에 특이적으로 결합하는 검출항체 및 상기 생체물질을 포함하는 시료액을 반응 튜브에서 혼합하여 만들 수 있다. 이때 상기 반응튜브에서 상기 생체물질과 상기 자성입자 사이의 제1 면역반응 및 상기 생체물질과 상기 검출항체 사이의 제2 면역반응을 동시에 유도함으로써 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체가 얻어질 수 있다.
상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 면역반응의 촉진을 위해 상기 반응 튜브는 히팅 블록(heating block)에 올려져 적절한 온도로 가열되고, 상기 반응 튜브의 내부에 자석봉을 상하로 연속적으로 이동시킴으로써 면역반응 물질들을 빠르게 혼합시킬 수 있다.
또한 상기 생체물질의 검출방법은 외부 자력을 이용한 상기 복합체의 세척 과정이 포함될 수 있다. 즉 상기 제1 및 제2 면역반응이 완료된 후, 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체와 자석봉을 2개 이상의 세척 튜브에서 연속적으로 세척시키는 단계가 더 포함될 수 있다. 세척 후에 상기 복합체로부터의 발광 신호를 검출하여 상기 생체물질의 종류 및 양을 정확히 확인할 수 있다.
상기 검출방법은 상술한 바와 같이 독립적인 반응튜브를 이용하여 수행될 수도 있지만 바람직하게는 멀티 웰 플레이트를 사용할 수 있다. 이때 상기 웰 플레이트의 제1웰에는 상기 자성입자가 주입될 수 있으며, 상기 자성입자는 검사시 제2웰로 이동되며 제2웰에는 검출프로브 및 생체입자가 주입될 수 있다. 따라서 제2웰에서는 상기 자성입자, 검출 프로브 및 생체입자의 반응이 수행되어 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성할 수 있으며 이는 제3웰로 이동되어 형광 측정될 수 있다.
또한 상기 제2웰과 제3웰의 사이에는 2~10개의 세척웰을 구비할 수 있다. 상기 세척웰은 단순히 세척액을 주입한 웰로서 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체가 침지되어 세척될 수 있다. 이 세척 과정에서 자성입자에 결합되지 않은 생체물질 및 검출프로브를 제거할 수 있으며, 상술한 바와 같이 본 발명의 자성입자는 비특이적으로 결합되는 형광분자(검출 프로브)를 최소화 할 수 있으므로 정확한 형광 측정을 수행할 수 있다. 이때 상기 세척과정은 상기 복합체 형성과정과 동일하게 외부 자력을 이용하여 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 침지 및 이동시킬 수 있다.
단계 (4)에서 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출할 수 있다.
상기 검출방법은 면역진단 방법으로 수행될 수 있다. 특히 상기 발광 신호의 검출은 예를 들어 ELISA 방법 또는 형광측정 방법으로 수행될 수 있다.
좀더 구체적으로 설명하면, ELISA 방법은 시료 안에 있는 검출대상물질을 거대자성입자에 고정되어 있는 포획 항체에 바인딩되도록 하고 그 후 검출항체를 처리한다. 이 검출항체는 포획항체가 바인딩한 검출대상 물질의 반대편 쪽에 바인딩한다. 검출항체에는 호스 래디시 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase, HRP)라는 효소가 콘쥬게이션(conjugation)되어 있어 TMB 기질을 과산화수소를 이용하여 분해하여 색깔을 내게 한다. 이 색깔의 정도를 OD 값으로 측정한다. 즉 이 방법은 시료에 검출대상 물질이 많아짐에 따라 비례하여 포획항체 및 검출항체가 정량적으로 많이 붙고, 그 결과 검출항체에 콘쥬게이션되어 있는 HRP가 많아져 효소반응이 상대적으로 빠르게 진행되어 TMB 기질의 색깔이 빠르게 변하는 원리를 이용한 것이다. 사전에 미리 검출대상 물질을 임의로 여러 농도를 처리하여 얻은 OD값을 가지고 표준곡선(standard curve)를 그린 다음, 실제 시료를 처리한 후에 얻은 OD값을 표준곡선과 대비함으로써 시료 내의 검출대상 물질의 양을 측정할 수 있다. 이때 모든 OD값 산출 및 농도계산은 분석기기에 설치되어있는 자동 분석 프로그램으로 실시할 수 있다.
형광측정 방법은 포획항체 및 검출항체를 사용하여 샌드위치 어세이를 하는 원리는 ELISA 방법과 동일하나 검출항체에 HRP 효소 대신 비오틴(biotin)물질을 컨쥬게이션시킨 후 스트렙타비딘(streptavidin)과 콘쥬게이션되어 있는 형광물질을 처리해서 형광값을 측정한다. 포획항체에 먼저 GP88 단백질을 반응시켜 붙이고 그 후에 비오틴(biotin) 물질이 콘쥬게이션되어 있는 검출항체를 처리하여 검출항체를 포획항체가 GP88과 붙은 곳이 아닌 다른 쪽의 GP88에 붙인다. 그 후 스트렙타비딘과 콘쥬게이션되어 있는 형광물질 e-flour를 처리해서 자성입자들 각각의 형광 신호를 측정한다. 검체에 속해있는 진단마커의 농도가 높을수록 자성입자의 형광신호가 강해지는 원리에 따라 명시야 현미경(bright field microscope)으로 반응 웰 안에서의 자성입자들의 위치를 확인하고 그 위치에 해당되는 형광신호를 픽셀 단위로 측정하며, 10개 내외의 자성입자들로부터 나오는 형광 신호를 자동 이미지 분석을 한다. 검출하고자 하는 대상물질을 농도별로 반응시켜 동일한 방법으로 나온 형광 값을 이용하여 그래프를 그린 표준 곡선(standard curve)에 시험 검출에서 나온 형광값을 적용시켜 최종 시료 안에 들어 있는 해당 검출대상 단백질의 검출 농도값을 산출한다. 모든 이미지 분석 및 형광값의 산출은 분석기기내에 설치되어있는 자동 이미지 분석 프로그램으로 실시한다.
상기 생체물질 검출방법은 POCT방법을 통하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 POCT란 현장검사(Point-Of-Care Test)를 위미하는 것으로 환자가 있는 곳에서 직접 검사를 수행하는 것을 의미한다. 다시 말해서 임상병리검사가 병원의 중앙검사실과 같은 독립적인 공간에서 수행되는 것이 아닌 병실, 응급실, 수술실 또는 중환자실과 같은 환자의 주변에서 의사, 간호사 또는 임상병리사에 의하여 수행되는 것을 의미한다. 기존의 외상성 뇌손상 진단의 경우 Ct나 MRI와 같은 대형장비를 필요로 함에따라 현장검사가 불가능하였으며, 면역진단의 경우에도 PCR기기와 같은 대형진단 장비가 필요로 하여 현장진담에는 제한적으로만 사용되었다. 하지만 본원 발명의 경우 소형화된 진단장비를 사용할 수 있으므로 POCT방법을 이용하여 형장에서 진단이 가능하다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
[실시예]
제 1 단계: 자성 마이크로로드의 제조 및 표면 처리
본 발명에서 제조되는 자성 마이크로로드는 대한민국 특허출원 10-2018-0130436에 기재된 내용에 따라 유리-코팅 미세와이어를 제조하였다. 그리고 상기 미세와이어를 적절한 크기로 절단하였다. 바람직하게는 길이는 400㎛이고, 금속 자성 코어의 직경은 50㎛, 글라스 코팅의 두께는 10㎛이다. 따라서, 직경 60㎛, 길이가 400㎛인 최종 자성 마이크로로드를 제조하였다.
상기 제조된 자성 마이크로로드의 표면 이물질을 제거하기 위하여 세척 단계를 수행하였다. 제작된 자성 마이크로로드를 바이알에 담고 아세톤을 점가하여 침전시키고 에탄올을 이용하여 세척한 다음 자성 마이크로로드를 건조하였다. 건조된 자성 마이크로로드를 황산에 침적한 다음, 물과 에탄올을 이용하여 세척하고 건조하였다. 황산처리가 끝난 자성 마이크로로드는 수산화나트륨 용액(NaOH 1g, 물 4ml 및 에탄올 6ml의 혼합물)을 이용하여 처리한 다음, 에탄올을 이용하여 세척하였다.
다음 단계로 검체의 항원과 결합하는 제 1 항체를 상기 자성 마이크로로드에 결합시켰다. 이를 위하여 자성 마이크로로드의 유리 표면을 적절히 개질하였다. 우선 상기 세척된 자성 마이크로로드를 피라냐 용액(부피비로서 H 2SO 4 :　30부피% H 2O 2 = 3 : 1의 혼합용액)에 침지하여 표면유리를 실라놀(Si-OH, silanol)로 개질시키고 물과 에탄올을 이용하여 세척한 다음 건조하였다. 이후 실란화를 위하여 표면 개질된 자성 마이크로로드를 2부피% APTES용액에 침지한 다음, 올루엔 에탄올 및 물을 이용하여 제작하고 110℃의 온도에서 큐어링을 수행하였다.
상기 아미노-실란으로 표면 개질된 마이크로로드를 이용하여 제 1 항체를 고정화시킬 수도 있으나, 바람직하게는 상기 아미노기를 카르복실기로 치환하였다. 이와 같이, 상기 표면을 아민기부터 COOH로 치환하는 것을 통칭 카르복실비드(Carboxyl bead) 제조 방법이라 명명하였다. 1.5 ㎖ E-튜브에 대략 상기 마이크로로드 (500 × 75㎛) 1만개가 처리될 수 있었다. 이를 위해 γ-부티롤락톤(Butyrolactone)을 사용하거나 숙신산무수물(Succinic anhydride)을 트리에틸아민(Triethylamine)과 혼합하여 사용하는 2가지 방법이 이용될 수 있었다. 숙신산무수물과 트리에틸아민을 이용하는 것이 보다 효과적인 것으로 판단되었다.
최종적으로 FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer)으로 아미노-실란을 코팅하여 형광을 측정함으로써 개질의 균일도와 개질정도를 확인할 수 있는데, 본 발명에서 제조되는 상기 표면 개질된 마이크로로드는 기존에 알려진 Silica(TEOS) 처리된 자성 비드에 비해 표면이 매우 균일한 표면을 가지는 것으로 나타났다(도 6 참조). 따라서 원하지 않는 물질의 비특이적 결합이 줄어들어 노이즈 발생이 매우 감소될 수 있었다. 또한 항원으로 하는 GP88 바이오마커의 매우 낮은 농도(<~1 ng/ml)에서도 검출 및 분석이 가능하며, 신호증폭 효과를 나타낼 수 있었다.
아울러 본 발명의 자성입자는 표면을 상기 피라냐 용액을 이용하여 개질함에 따라 많은 아미노-실란이 결합될 수 있어 기존의 자성입자에 비하여 높은 형광을 나타내는 것이 가능한 것으로 확인되었다(도 5의 (b) 참조).
제 2 단계: 제 1 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체의 제조
상기 1 단계에서 제조한 (바람직하게는 카르복실기로) 표면 개질된 자성 마이크로로드를 사용하여 시료액내에 목표로 하는 마커의 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체(Rod bead)를 제조하였다. 이를 상세히 살펴보면 다음과 같다.
1) 자성 마이크로로드를 1vial(약 2,500개 정도)를 새로운 E-tube에 옮겨 담았다.
2) 자성 마이크로로드를 MES buffer(pH 5.0) 500μl씩 1회 washing 하였다.
3) 아래 조성대로 자성 마이크로로드가 있는 E-tube에 넣은 후 실온(25℃)에서 30분동안 천천히 혼합(shaking) 시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
① MES buffer(pH 5.0) 400μl ②EDC 50mg/ml ③NHS 50mg/ml (총 500μl 반응)
4) 3번 과정이 끝난 후 MES buffer 500μl을 이용하여 2회 세척(washing) 하였다. (탭핑(tapping) 30회 수행)
5) 세척 과정을 마친 E-tube에서 MES buffer를 완전히 제거하였다.
6) 5번 tub에 MES buffer(pH 6.0)을 이용하여 제 1 항체 농도가 0.1mg/ml이 되도록 넣은 후 실온에서 2시간동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
7) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 이용하여 2회 세척하였다. (탭핑(tapping) 30회 수행)
8) 세척 과정을 마친 E-tube에서 Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3)를 완전히 제거하였다.
9) Blocking buffer(1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 넣은 후 실온에서 1시간동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
10) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 이용하여 2회 세척한 후 blocking buffer에 보관하였다.(이렇게 제조된 자성 마이크로로드를 RSMP라 한다)
상기 자성 마이크로로드의 유리 코팅에 원하는 항체를 비특이적 반응으로 결합시킬 수 있다. 상기 거대 마이크로로드 자성 결합체는 매트릭스(matrix) 다중 코드를 인식하고, 가능한 고역가의 항체를 결합시킨다. 제 1 항체는 시료액 등에 함유된 검체에 해당하는 항원(GP88)과 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
이때 자성 마이크로로드의 길이에 따라 서로 다른 제 1 항체가 결합될 수 있으며, 이는 길이 코딩 시스템을 형성해 다중 검출 분석에 이용될 수 있다.
제 3 단계: 제 1 항체가 고정화된 거대 마이크로로드의 QC
1) 새로운 1.5ml E-tube에 상기 2단계에서 제조된 RSMP를 약 30개정도 넣고 상층액을 제거하였다.
2) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 넣어 1% BSA/PBS buffer를 완전히 제거하였다. (2회 반복)
3) Sample buffer (0.1% BSA, 1x PBS. 0.1% T-20)를 이용하여 2μg/ml의 비오틴과 결합된 제 2 항체(Biotin-conjugated secondary antibody)를 준비하였다.
4) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3)를 제거한 tube에 3번에서 제조한 제 2 항체(secondary antibody) 용액을 500μl씩 넣고 실온에서 1시간동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
5) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 이용하여 2회 세척하였다. (탭핑(tapping) 30회 수행)
6) Sample buffer (0.1% BSA, 1x PBS. 0.1% T-20)로 SAPE(Streptavidin-Phycoerytherin)를 2μg/ml의 농도로 맞춰 준비하여 500μl 넣고 30분동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
7) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 이용하여 2번 세척한 후 형광현미경을 이용하여 측정하였다. [Exposure time: 200ms/ gain 5.1x]
제 4 단계: 면역반응 물질의 준비 단계
시료액, 검체에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체(RSMP), 상기 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 항체-형광 복합체(conjugate)를 준비하였다.
시료액은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등을 사용할 수 있다.
이때, 만일 상기 시료액에는 복수 개의 마커 항원을 검출하고자 한다면, 각기 다른 형상(예를 들면, 다른 길이)의 자성 마이크로로드를 준비한다. 각 자성 마이크로로드는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 마커 중에서 각각 특정 마커만을 포획할 수 있는 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 상태로 구성시킨다.
아울러, 시료액내의 마커의 상기 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 항체-형광 복합체(conjugate)를 준비한다. 상기 형광물질 대신에 효소 등으로 대신할 수도 있다.
제 5 단계: 검체 투하 단계
제1웰에 마커에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체(RSMP)를 약 30개 투입하였다(도 10 참조).
자석 봉(Magnetic bar)를 이용하여 상기 RSMP를 제2웰이 옮긴 다음. 항원은 sample diluent(1x PBS, 1% BSA(Fatty acid free), 10mM EDTA (pH8), 1% T-20, 0.2mg/mL Tru-Block, 1% human Pooling serum)을 이용하여 1:1로 희석하여 넣고 제 2 항체는 1μg/ml, SAPE는 4μg/ml의 농도가 되도록 2번 well에 투입하였다. (총 반응 volume: 250μl)
이때 시료액(검체)에는 마커에 해당하는 항원이 상기 RSMP상에 존재하므로 이들 간에 제 1 면역반응 및 제 2 면역반응을 유도하였다. 본 발명에서는 동일한 반응기 내에서 상기 제 1 면역반응 및 제 2 면역반응이 동시에 진행됨으로써 반응시간을 단축시킬 수 있었다. 이때 상기 웰은 기존에 사용되는 일정간격으로 배열된 웰플레이트를 사용하는 것이 바람직하지만 튜브형 반응기를 사용하는 것도 가능하다.
제 6 단계: 혼합/가열 단계
제 5 단계가 진행된 웰을 히팅 블록(heating block)에 올려져 적절한 온도로 가열하여 조절시켰다. 통상 면역반응은 35℃ 정도에서 활발하게 이루어진다.
아울러, 상기 웰의 상부에 위치하는 자석 봉을 상하로 연속적으로 이동시켜 상기 면역반응 물질을 빠르게 혼합시켜 면역반응 시간을 단축시킬 수 있었다.
제 7 단계: 세척 단계
반응이 완료된 후 자석봉을 이용하여 상기 제2웰에 있는 반응이 완료된 RSMP를 제3웰에서 제5웰까지 순차적으로 이동시키며 세척하였다. 제3웰에서 제5웰에는 Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3)가 각각 250μl씩 주입되어 있으며, 각 웰마다 2분씩 RSMP를 자석봉을 이용하여 비특이적으로 붙은 형광물질을 제거하였다. 이때 상기 6단계와 동일하게 상기 웰의 상부에 위치하는 자석 봉을 상하로 연속적으로 이동시켜 상기 면역반응 물질을 빠르게 혼합시켜 세척하였다.
이러한 세척과정에서 비특이적 물질이 제거되고, 거대 마이크로로드 자성 결합체의 세척/회수가 이루어지며, 혈청, 혈장뿐만 아니라 저혈 검체도 가능하게 된다.
제 8 단계: 검출신호 측정 단계
반응이 완료된 후, 자성입자에 특화된 초고감도 형광 이미지 분석기기를 이용하여 검출 신호를 측정하는데(도 11 참조) 이미지 분석을 통한 코드 인식을 수행하며, 1개의 형광물질로도 다중검지(multi-detection)를 구현하는 것이 가능하였다. 형광신호뿐 아니라 단일 마커의 항원인 경우 ELISA에 의한 효소반응에 의해서도 탐지가능하다. 상기 단계를 모두 수행하는데 대략 30분이 소요되며, 검출한계는 대략 수 1ng/ml 내지 10,000ng/ml이다. 또한 도 11의 (c) 및 (d)에 나타난 바와 같이 동일한 농도의 바이오마커를 사용하는 경우 본 발명의 형광이 더욱 강하게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.
ELISA 방법은 시료 안에 있는 마커 물질을 거대 마이크로로드 자성 결합체에 고정되어 있는 캡처(Capture) 프로브에 결합하도록 하고 그 후 탐지 프로브를 처리하였다. 이 탐지 프로브는 캡처 프로브가 결합한 마커 물질의 반대편 쪽에 결합되었다. 탐지 프로브에는 HRP(Horse Radish Peroxidase)라는 효소가 컨쥬케이션(Conjugation)되어 있어 TMB 기질을 과산화수소를 이용 분해하여 색깔을 내게하였다. 이 색깔 정도를 OD 값으로 측정하였다. 결론적으로 시료 안에 마커 물질이 많으면 캡처 및 탐지 항체가 정량적으로 많이 붙게 되고 탐지 항체에 컨쥬케이션되어 있는 HRP가 많게 되어 효소반응이 상대적으로 빠르게 진행되어 TMB 기질이 색깔이 빠르게 변하는 원리를 이용한 것이다. 이미 마커 물질을 임의로 여러 농도를 처리하여 얻은 OD값을 가지고 표준곡선을 그린 값에 시료를 처리한 OD값을 적용시켜 시료 안에 마커 물질의 양을 측정하는 원리이다 (ata의 농도계산을 위해 추세선을 그리고 추세선을 이용 농도 계산). 이때 모든 OD값 산출 및 농도계산은 분석기기에 설치되어있는 자동분석 프로그램으로 실시하였다.
형광 측정방법은 ELISA 방법에서 캡처 및 탐지 항체를 쓰는 원리는 동일하나 탐지 항체에 HRP 효소 대신 바이오틴(biotin) 물질을 컨쥬케이션을 하고 나중에 스트렙트아비딘(Streptavidin)과 컨쥬케이션 되어 있는 형광물질을 처리해서 형광값을 측정하였다. 캡처 항체에 먼저 바이오마커 단백질(GP88)을 반응시켜 붙이고 그 후에 바이오틴 물질이 컨쥬케이션 되어 있는 탐지 항체를 처리하여 탐지 항체를 캡처 항체가 바이오마커 단백질(GP88)과 붙은 곳이 아닌 다른 쪽 바이오마커 단백질에 붙였다. 그후 스트렙트아비딘과 컨쥬케이션 되어 있는 형광물질 e-flour을 처리해서 자성 비드의 각각의 형광 값을 자동으로 측정하였다. 검체에 속해있는 진단마커의 농도가 높을수록 자성입자의 형광신호가 강해지는 원리로 반응 웰 안에서 명시야(Bright Field)로 거대자성입자의 위치를 확인하고 그 위치에 해당되는 형광신호를 픽셀(Pixel) 단위로 측정하여 평균을 구하였다. 10개 내외 자성입자의 평균을 구하고 여기서 형광값의 평균값을 구하였다.
검출하고자 하는 마커 물질을 농도별로 반응시켜 동일한 방법으로 나온 형광 값 이용 그래프를 그린 Standard Curve에 시험 검출에서 나온 형광 값을 적용시켜 최종 시료 안에 들어 있는 해당 마커 단백질의 검출 농도 값을 산출하였다. (이때 데이터의 농도 계산을 위해 추세선을 그리고 이 추세선을 이용 농도계산 한다.) 모든 이미지 분석 및 형광 값의 산출은 분석기기내에 설치되어있는 자동 이미지 분석 프로그램으로 실시하였다.
하기와 같은 종류의 항원의 검사에 본 발명의 자성 마이크로로드를 사용하여, 본 발명의 자성 마이크로로드가 신속한 반응에 따른 빠른 검사가 가능하면서도 높은 정확도를 가지며, 다중 탐지가 가능함을 확인할 수 있었다.
<실험예 1> GP88 검사
상기의 방법으로 제작된 RSMP에 coupling된 캡처 항체 (항-GP88항체)를 적용하였다. 항원 GP88을 Serum에 0, 1, 3.7, 7, 15, 30, 60 ng/ml되게 첨가한 다음 앞에 인 방법과 동일한 방법으로 적용하였다.
본 발명의 진단 시스템을 이용하여 GP88 농도 0~60ng/mL에서 시험한 결과를 보면, 기존 면역학적 암 진단 검사법과 동등한 동적범위(dynamic range)를 가지면서, 0 ~ 60ng/mL의 범위에서 농도가 증가할수록 형광신호가 증가하여 매우 높은 상관관계(correlation) 결과 값을 보이는 것으로 나타났다(결정계수 R 2값 : 0.9909)(도 13 및 도 14 참조).
또한, 본 발명의 진단 시스템을 이용한 GFAP 초 저농도 시험에서 블랙 웰 플레이트(black well plate)를 사용할 경우, 1ng/ml의 검출한계를 가지는 것으로 나타났다. 이는 기존의 검출법에 비하여 감도가 약 40배 증가된 것이며, 최적화시 약 100배 이상의 높은 감도를 지닐 수 있는 가능성을 확인하였다(도 13).
또한 제1단계에서 실란화 시간에 따른 형광 크기의 변화를 관찰하기 위하여 실란화 시간을 각각 1시간, 3시간, 9시간, 24시간으로 하여 동일한 실험을 실시하였다. 그 결과 실란화시간이 9시간이 경과한 이후부터 높은 형광수치를 가지는 것으로 나타났으며, 24시간 이후의 증가폭은 매우 미미한 것으로 나타났다(도 7 참조).
<실험예 2> GP88, P-53의 다중 검출
본 발명의 진단 시스템을 이용하여 GP88(on 400μm 자성입자), P53(on 300μm 자성입자)의 다중 검출(multiplex assay)을 수행한 결과를 살펴보면(도 12참조), 면역반응시 넣어준 특정 항원에 해당하는 자성입자만 농도별 형광신호가 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 즉 본원 발명의 경우 입자 이미지(Bright field)를 통해 길이에 따라 원하는 자성 마이크로로드를 확인 및 검출할 수 있으며, 형광 이미지(fluorescent images)를 통해 상기 자성 마이크로로드 중 원하는 바이오마커의 형광 신호를 검출 및 분석할 수 있는 것으로 나타났다.(도 15)
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (28)

  1. 자석 반응 금속을 포함하는 코어;
    상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및
    생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하되,
    상기 포획 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 것인 자성입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 폐암, 간암, 담낭암, 난소암, 신장암종, 백혈병 또는 교아세포종인 자성입자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 바이오마커는 GP88을 포함하는 것인 자성입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자성입자는 검출한계가 1ng/ml 이하이며, 동적범위(Dynamic Range)가 log3 이상인 자성입자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자성입자는 2종 이상의 상이한 길이를 가지는 자성입자가 혼합되어 있으며, 2종 이상의 상기 바이오마커를 동시에 진단할 수 있는 것인 자성입자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 쉘의 표면은 1~80개/nm 2의 친수성 작용기를 가지는 자성입자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기인 자성입자.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 포획 프로브는 상기 쉘 층의 표면의 친수성 작용기와 연결된 것인 자성입자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 코어가 상기 자성입자 총 부피의 60% 이상인 것인 자성입자.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 쉘 층 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하인 것인 자성입자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 쉘 층의 두께는 1 내지 100㎛인 것인 자성입자.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 자성입자는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물인 것인 자성입자.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 자성입자는 수중에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것인 자성입자.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 자성입자는 마이크로로드의 형태를 갖는 것인 자성입자.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛인 것인 자성입자.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 마이크로로드의 종횡비가 2 이상인 것인 자성입자.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커는 생명체로부터 유래된 시료액 내의 바이오마커인 것인 자성입자.
  18. (i) 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계;
    (ii) 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성하는 단계;
    (iii) 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시키는 단계;
    (iv) 상기 실란화합물의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하는 단계; 및
    (v) 상기 실란 화합물의 말단에 프로브를 부착하는 단계;
    를 포함하되, 상기 프로브는 암 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 자성입자 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 (iv) 단계는 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 6~24시간 침지하여 수행되는 자성입자 제조방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 산성용액은 황산과 과산화수소의 혼합용액인 자성입자 제조방법.
  21. (1) 제1웰에 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 자성입자를 제공하는 단계;
    (2) 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시키는 단계;
    (3) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (4) 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함하는 것인 생체물질의 검출방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 생체물질의 검출은 2종 이상의 상기 생체물질들에 대해 2종 이상의 상기 자성입자들을 이용하여 다중검출하는 것인 생체물질의 검출방법.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 다중검출은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 상기 자성입자들을 판독하는 과정을 포함하는 것인 생체물질의 검출방법.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 제2웰 및 제3웰 사이에 2~10개의 세척웰을 구비하며, 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 상기 세척웰이 순차적으로 침지하여 세척하는 단계를 추가로 포함하는 생체물질의 검출방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 세척 단계는 외부 자력을 이용하여 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 침지 및 이동시키는 단계인 생체물질의 검출방법.
  27. 제21항에 있어서,
    상기 생체물질 검출방법은 진단시간이 30분 이내인 것인 생체물질의 검출방법.
  28. 제12항에 있어서,
    상기 생체물질 검출방법은 POCT방법을 통하여 수행되는 것인 생체물질의 검출방법.
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