WO2014014309A1 - 표적 물질의 검출 또는 정량 방법, 및 키트 - Google Patents

표적 물질의 검출 또는 정량 방법, 및 키트 Download PDF

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WO2014014309A1
WO2014014309A1 PCT/KR2013/006484 KR2013006484W WO2014014309A1 WO 2014014309 A1 WO2014014309 A1 WO 2014014309A1 KR 2013006484 W KR2013006484 W KR 2013006484W WO 2014014309 A1 WO2014014309 A1 WO 2014014309A1
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WO
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probe
sample
target material
quantum dot
metal nanoparticles
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Application number
PCT/KR2013/006484
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English (en)
French (fr)
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용 박이노치
동진후아
이재범
저우훙젠
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부산대학교 산학협력단
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting or quantifying a target substance in a sample, and a kit and a sensor therefor.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent adsorption
  • Neospora disease in cows is caused by the infection of neospora caninum , a protozoa, and has been found in cattle, goats and horses since it was discovered in the United States in 1988. Infected cows do not have the ability of protozoan killing even if the immunoglobulin increases, and continue to abortion at the next delivery, and because the infection through the placenta cows of the same family has a characteristic of aborting for several generations. This is why California's U.S. parasite, which accounts for about 12 percent of all abortion-caused diseases, is the most important abortion factor, resulting in economic losses worth $ 35 million annually, and dairy breeding disorders. Is the biggest economic loss factor for the dairy industry.
  • an object of the present invention is to provide a novel method for detecting or quantifying a target substance in a sample and a kit therefor.
  • the present invention relates to a method for detecting or quantifying a target substance in a sample, the method comprising culturing by adding a metal nano-particle to which a first probe is bound and a quantum dot to which a second probe is bound to a sample, wherein the first probe and The second probe does not bind to each other, but binds to the target material, and the fluorescence intensity of the quantum dot is enhanced when both the first probe and the second probe bind to the target material, respectively.
  • the detection method of the target material provides a method further comprising a fluorescence measurement step of measuring the fluorescence intensity of the cultured sample and a determination step of determining the presence or absence of the target material in the sample by comparing the measured quantum dots with the control.
  • the quantification method of the target material further includes a fluorescence measurement step of measuring the fluorescence intensity of the cultured sample and a quantification step of quantifying the target material in the sample by comparing the fluorescence intensity of the measured quantum dots with the quantum dot fluorescence intensity of the standard sample.
  • the present invention also relates to a kit for detecting a target substance in a sample, comprising a metal nanoparticle having a first probe coupled thereto and a quantum dot having a second probe coupled thereto, wherein the first probe and the second probe bind to the target substance, respectively.
  • the first probe and the second probe do not bind to each other, and when both the first probe and the second probe bind to the target material, the fluorescence intensity of the quantum dot is enhanced.
  • the present invention also relates to a sensor for detecting a disease marker, comprising a metal nanoparticle having a first probe coupled thereto and a quantum dot having a second probe coupled thereto, wherein the first probe and the second probe are respectively associated with the disease marker.
  • the metal nanoparticles may have a concave-convex structure having protrusions formed on the surface of the metal nanoparticles having a spherical shape.
  • the metal nanoparticles may have plasmon properties.
  • the quantum dot could be to fluoresce in the visible light region.
  • the first probe and the second probe may be any one selected from the group consisting of antigen, antibody, lectin, oligosaccharide, receptor ligand, aptamer, nucleic acid, and combinations thereof.
  • the present invention can provide a new method for detecting or quantifying a target substance in a sample.
  • This method uses a phenomenon in which the fluorescence intensity of the quantum dots is enhanced when the metal nanoparticles and the quantum dots are located in close proximity.
  • the fluorescence intensity of the quantum dots is enhanced.
  • the measurement can be used to detect the target substance in the sample or to quantify the content of the target substance in comparison to the fluorescence intensity of the control or standard sample.
  • the method of the present invention it is possible to detect the target material in the sample without performing the washing step, which is an essential step in the conventional ELISA method, so that the target material can be easily detected, and the sensitivity of the detection of the target material by washing can be achieved. The degradation can be prevented.
  • the present invention can provide a kit or sensor for detecting a target substance in a sample, and according to the kit or sensor of the present invention, the disease marker can be detected with excellent detection sensitivity and detection accuracy.
  • the detection or quantification method of the target substance in the sample according to the present invention does not require washing, so that the detection and quantification of the target substance can be easily performed, and the degradation of the detection sensitivity by washing can be prevented.
  • Target substances can be detected or quantified.
  • FIG. 1 illustrates a phenomenon in which the fluorescence intensity of quantum dots is enhanced when the metal nanoparticles 20 and the quantum dots 10 are close to each other.
  • Arrows indicated by dotted lines indicate irradiation of excitation light, and arrows indicated by solid lines indicate fluorescence of quantum dots.
  • "+" And "-" represent the charge of the metal nanoparticle 20.
  • FIG. 2 illustrates an embodiment of a method for detecting a target substance.
  • 10 represents a quantum dot
  • 11 represents a second probe that binds to the quantum dot
  • 20 represents metal nanoparticles
  • 21 represents a first probe that binds to the metal nanoparticles.
  • 30 indicates a target material, and below the arrow, a quantum dot to which the second probe is bound and a metal nanoparticle to which the first probe is bound are respectively bound to the target material.
  • FIG. 3 is a graph showing a fluorescence spectrum showing the results of Experimental Example 1.
  • the horizontal axis of the graph represents fluorescence wavelength (nm)
  • the vertical axis of the graph represents fluorescence intensity
  • the solid line represents quantum dot
  • the long dashed line represents quantum dot-NcSAG1
  • the short dashed line represents quantum dot-NcSRS2.
  • Example 4 is a graph showing the results of Example 1;
  • the horizontal axis of the graph represents the type of sample, and the vertical axis of the graph represents the fluorescence intensity.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Example 2.
  • FIG. The horizontal axis of the graph represents the type of sample, and the vertical axis of the graph represents the fluorescence intensity.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Example 3.
  • FIG. The horizontal axis of the graph represents the type of sample, and the vertical axis of the graph represents the fluorescence intensity.
  • FIG. 7 is a calibration curve graph showing the result of Example 4.
  • FIG. The horizontal axis of the graph shows the concentration of recombinant influenza H1N1 protein HA (pg / ml), and the vertical axis shows the fluorescence intensity.
  • a quantum dot refers to a semiconductor crystal of several tens of nm or less, and has a characteristic of emitting fluorescence when irradiated with excitation light.
  • the fluorescence property of the quantum dots is that when the metal nanoparticles are located in close proximity to the quantum dots, the intensity of the fluorescence is stronger, the detection method and quantitative method of the present invention is to enhance the fluorescence intensity of the quantum dots when the metal nanoparticles and the quantum dots are close It is using the phenomenon.
  • the fluorescence enhancement effect of the quantum dots 10 proximate the metal nanoparticles is caused by the charge present in the metal nanoparticles 20, and the excitation light is irradiated only to the quantum dots.
  • the intensity of fluorescence emitted in comparison with is increased.
  • the intensity of fluorescence emitted by the quantum dots is increased by the charge of the metal nanoparticles.
  • FIG. 2 shows an embodiment of a method for detecting a target substance in a sample, and shows a case where an anti-Neospora antibody is detected in a sample for diagnosing Neospora disease according to an embodiment of the present invention.
  • Bovine Neospora disease is a parasitic disease, and since anti-neophora antibodies are present in the serum of bovine infected Neosora disease, anti-neospora antibodies are detected in bovine serum. Neospora disease can be diagnosed.
  • the target substance 30 is an anti neosphora antibody.
  • the target material 30 binds to the first probe 21 coupled to the metal nanoparticle 20.
  • the first probe 21 is an antigen of an anti neosphora antibody, preferably an NcSAG1 protein.
  • the target material 30 couples with the second probe 11 coupled to the quantum dot 10.
  • the second probe 11 is, for example, an anti bovine IgG antibody.
  • the metal nanoparticles and the second probe is coupled to each of the first sample and the control sample that does not contain the target material to determine the presence or absence of the target material
  • the fluorescence measurement step of measuring the fluorescence intensity of the quantum dots of the sample and the control sample to be confirmed after the culturing step and the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample is stronger by comparing the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample and the control group
  • the target material refers to a material to be detected or quantified, and the target material may be a biological marker for diagnosing a disease. According to the method of the present invention using the disease marker as a target material it is possible to diagnose whether the disease is infected simply, quickly and accurately.
  • the target material specifically binds to an antigen and an antibody, a lectin and a sugar, a receptor and a ligand, a target of an aptamer and an aptamer, and a nucleic acid-nucleic acid.
  • One of the pairs of materials can be used to probe the other. More specifically, the specific binding from the group consisting of proteins, peptides, DNA, RNA, chemicals, hormones, viruses, sugars can be selected for use in the target material or probe.
  • the probe may be any one selected from the group consisting of antigens, antibodies, lectins, oligosaccharides, receptor ligands, aptamers, nucleic acids, and combinations thereof.
  • a probe binds to a target material, but a first probe and a second probe may be used that do not bind to each other.
  • first probe and the second probe are directly bonded to each other, since the metal nanoparticles and the quantum dots are located close to each other regardless of the presence or absence of the target material, fluorescence enhancement occurs, so that the presence or absence of the target material cannot be properly determined. do.
  • the antigen to which the target material (antibody) binds and the secondary antibody that binds to the target material (antibody) may be the first and second probes, respectively.
  • the target material is an antigen
  • two antibodies may be used as the first probe and the second probe, respectively, which bind to different epitopes of the target material.
  • the target material when the target material is an antigen and two or more antigens are present in proximity, an antibody that binds to the same epitope on the target material may be used as the first probe and the second probe.
  • the target substance when the antigen forms a multimer, the target substance may be a plurality of antigens present on the surface of a virus, a microorganism, a cell, etc., but is not limited thereto.
  • the first probe and the second probe when the fluorescence intensity of the quantum dot is increased by combining the first probe and the second probe to the target material and the metal nanoparticles and the quantum dots are in close proximity, the first probe and the second probe are used. It is not limited.
  • the target material to be detected and quantified can be in a liquid, solid, powder or gas, and is not limited to that phase.
  • the method for detecting a target substance of a sample according to an embodiment of the present invention may be performed in a liquid state.
  • the target substance may be detected or quantified in a liquid state by dissolving or suspending the sample in an appropriate buffer solution. Can be.
  • the metal nanoparticle of the present invention is meant to include all metal particles having a nano size (nm) as an average particle diameter, and preferably may be metal nanoparticles exhibiting Plasmon properties.
  • the plasmon property also called plasmon reocnance, refers to an optical property that represents a phenomenon in which electrons occurring on a metal surface collectively vibrate.
  • the metal nanoparticle may use a metal such as gold, silver, nickel, aluminum, or a transition metal such as copper or iron, and may be formed to a size of several tens of nm to several hundred nm.
  • the metal nanoparticles may be formed in various shapes such as spherical, tetrahedron, hexahedron, octahedron, and rod pillars, and may use only one shape of nanoparticles, and different shapes may be mixed by mixing nanoparticles. It can also be used.
  • the metal nanoparticles may be any one selected from the group consisting of gold (Au), platinum (Pt), silver (Ag), iron (Fe), and combinations thereof.
  • Au may have a large effect of enhancing fluorescence (Au). Since the gold or silver nanoparticles strongly resonate with light in the visible region, absorption and scattering are very strong, and thus, the detection and quantification of the target material according to fluorescence enhancement of the quantum dots is more accurate.
  • the gold nanoparticles may be prepared by reducing chlorinated chloride (HAuCl 4 ) with citric acid and tannic acid.
  • the iron nanoparticles may be prepared by reducing the silver nitrate aqueous solution with citric acid.
  • the metal nanoparticle having the surface of the concave-convex structure of the present invention means a metal nanoparticle having a surface of the concave-convex structure by forming protrusions on the surface, and is also called star candy metal nanoparticle or sea urchin-shaped metal nanoparticle.
  • metal nanoparticles of the present invention preferably, spherical metal nanoparticles may be used, and most preferably, metal nanoparticles having an uneven structure having protrusions formed on the surface of the spherical metal nanoparticles may be used.
  • the surface area of the metal nanoparticles is increased, and thus, the strengthening phenomenon of the quantum dots is further increased in comparison with the metal nanoparticles having the smooth surface. Therefore, the diagnostic effect and accuracy of detecting or quantifying a target substance can be further improved, and the target substance can be efficiently detected even in a small amount of sample.
  • TEM transmission electron microscope
  • the manufacturing method of the metal nanoparticles having the surface of the concave-convex structure is not particularly limited as long as it is a method used to prepare the metal nano-particles of the concave-convex structure in the art, for example, 10 mL of 10 mM HEPES buffer solution. After adding 250 l of 20 mM chloroauric acid solution to pH 7.4, it can be prepared by standing at room temperature for 30 minutes until the color of the solution changes from yellow to dark blue.
  • the quantum dot is a nano-sized crystal having a quantum well structure having an average diameter of about 2 to 10 nm.
  • Quantum dots include both core structures and core / shell structures.
  • the quantum dot having the core structure may be a Cd-based quantum dot including CdS, CdSe, CdTe, CdSeTe, etc., a Pb-based quantum dot including PbS, PbSe, and the like, and a Zn-based quantum dot including ZnSe, ZnTe, and the like.
  • the quantum dots having a shell structure may be CdSe / ZnS, CdSe / CdS / ZnS, CdSe / ZnSe / ZnS, and GaAs / AlGaAs, but are not particularly limited to the types of quantum dots in the present invention.
  • the quantum dots may use Cd-based quantum dots, and more preferably CdTe.
  • the fluorescence wavelength of the quantum dots may appear differently depending on the particle size of the quantum dots.
  • the CdSe quantum dots may generate fluorescence from blue green to red (500 to 650 nm) by changing the particle size from 3 to 5 nm.
  • the particle size of the quantum dot By controlling the particle size of the quantum dot, the reaction time of the synthesis reaction, the thermal decomposition reaction temperature of the organometallic compound used in the synthesis, etc. can be used in one embodiment of the present invention.
  • the fluorescence wavelength of the quantum dots may appear differently depending on the type of the quantum dot material semiconductor.
  • Quantum dots that emit fluorescence in the visible and near infrared regions can be synthesized using semiconductors such as ZnSe, CdS, CdSe, CdSeTe, PbS, or PbSe.
  • a top-down method there are mainly two methods of synthesizing the quantum dots, a top-down method and a bottom-up method.
  • a top-down method an electron beam lithography and a molecular beam epitaxy are used on a semiconductor substrate.
  • Synthesize quantum dots An example of a bottom up method is a synthesis method in a liquid phase.
  • an organic solvent which is mainly synthesized in an aqueous solution for chemical synthesis of a liquid phase, but is not limited thereto.
  • CdTe quantum dots can be synthesized by reacting a thiol-based compound with a protective agent and reacting hydrogen telluride sodium with an aqueous solution of cadmium salt.
  • a coordination organic compound trioctylphosphine (TOP) and trioctylphosphineoxide (TOPO) as a solvent is synthesized in an organic solvent, dimethyl cadmium, S, Se and Te Quantum dots can be synthesized by pyrolysing the TOP complex or organometallic compound at about 300 ° C.
  • the type of the method for producing the quantum dots is not particularly limited, and quantum dots synthesized by one or more methods may also be used in the practice of the present invention.
  • the method of bonding the probe to the metal nanoparticle and the quantum dot may be a conventional method in the field of the present invention, but is not particularly limited.
  • a method of introducing a functional group such as an amino group, a carboxyl group, a thiol group, etc. onto the surface of the metal nanoparticles or quantum dots, and then fixing the probe using a chemical crosslinking agent may be used. have.
  • the crosslinking agent may be used without limitation as long as it is a crosslinking agent commonly used for crosslinking the compound in the field of the present invention, and preferably 1-ethyl-3- (3-dimethylamino propyl) carbodiimide hydrochloride ( 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), succinimidyl-4- (N-maleimide methyl) cyclohexane-1-carboxyl Any one selected from the group consisting of Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), and combinations thereof can be used.
  • SMCC Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • amphiphilic thiol compound is not limited to the kind, but preferably 8-mercapto octanoic acid can be used.
  • the first and second metal nanoparticles and the second probe each of which is combined with a first probe of a sample and a control which do not contain the target material, to which the target substance is present and its content are combined. It can be carried out by the method of culturing by adding quantum dots.
  • the first probe and the second probe bind to the target material, respectively, so that the metal nanoparticles and the quantum dots are located close to each other.
  • the amount of the metal nanoparticles and the quantum dots may be selected and used in consideration of the amount of the sample, the kind of the target material, and the like.
  • the culture temperature may be selected and used in consideration of the amount of the sample, the kind of the target material, and the like to the target material and the probe.
  • Incubation time is preferably used to set the time it takes for the binding of the target material first probe and the second probe to reach equilibrium.
  • the fluorescence measurement step is performed by a method of measuring the fluorescence intensity of the quantum dots of the sample and the control after the culture step.
  • the measurement may include a fluorescence measuring device that is commonly used, including a spectrophotometer. More specifically, the fluorescence intensity generated by irradiating the excitation light of the quantum dots to the sample and the control after the culturing step can be measured.
  • the present invention when using a quantum dot to fluoresce the visible light region, if there is an excitation light irradiation device, it is possible to observe the naked eye to detect the fluorescence without using a fluorescence measuring device to detect the target substance There is an effect of detecting the presence of the target material right at this necessary site.
  • the determining step may be performed by a method of determining whether a target substance exists in the sample according to the fluorescence intensity measured in the fluorescence measuring step.
  • the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample is stronger than the fluorescence intensity of the quantum dots of the control group can be determined that the target material is present in the sample, and the quantum dots emitting fluorescence in the visible region
  • the fluorescence can be detected by visual observation without using a fluorescence measuring device.
  • the presence or absence of the target substance can be determined visually according to the enhancement of the fluorescence intensity.
  • the method of quantifying a target substance in a sample may be performed through a quantification step by comparing the fluorescence intensity result of the sample with the fluorescence intensity result of the standard sample, as in the method of detecting the target substance in the sample. .
  • the culturing step and the fluorescence measurement step were performed by adding the metal nanoparticles with the first probe and the quantum dots with the second probe, respectively, of the sample and various standard samples including the target substance of known concentration, This can be done by performing the quantitative steps described.
  • the quantitative step may be performed by comparing the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample with the fluorescence intensity of the quantum dots of various standard samples to determine the amount of the target substance present in the sample.
  • a calibration curve may be prepared based on the fluorescence intensities of quantum dots of several standard samples, and the concentration of a target substance in the sample may be obtained by applying the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample to the calibration curve.
  • the kit for detecting or quantifying a target substance in a sample includes a metal nanoparticle having a first probe bound thereto and a quantum dot having a second probe bound thereto.
  • the metal nanoparticles to which the first probe is bound and the quantum dots to which the second probe is bound are not particularly limited to a phase provided, and preferably, may be provided in a solution state or a dry state.
  • the metal nanoparticles to which the first probe is bound and the quantum dots to which the second probe is bound may be dissolved or suspended in a buffer when used.
  • the target material in the sample may be detected or quantified by performing the culture step, the fluorescence detection step, the determination step or the quantification step using the metal nanoparticle and the quantum dot of the present invention.
  • the metal nanoparticles to which the first probe is bound and the quantum dots to which the second probe is bound may be supplied in a form included in a delivery means.
  • the delivery means is not limited to the kind provided that the present invention can detect or quantify a target substance, including metal nanoparticles to which the first probe is bound and quantum dots to which the second probe is bound.
  • the delivery means may be used by appropriately adjusting the appropriate shape and size, preferably in the form of paper.
  • a medium or a filter paper may be used.
  • a control containing no sample and target material is dropped on the delivery means in which the metal nanoparticles to which the first probe is bound and the quantum dots to which the second probe is bound are present. Therefore, when the target material is present in the sample, both the target material, the first probe and the second probe are combined in the delivery means, and the excitation light is irradiated to the delivery means to generate fluorescence at the quantum dots.
  • the sensor for detecting a disease marker includes a metal nanoparticle having a first probe coupled thereto and a quantum dot having a second probe coupled thereto.
  • the metal nanoparticles to which the first probe is bound and the quantum dots to which the second probe is bound are not particularly limited to a phase provided, and preferably, may be provided in a solution state or a dry state.
  • the metal nanoparticles to which the first probe is bound and the quantum dots to which the second probe is bound may be dissolved or suspended in a buffer when used.
  • the target material in the sample may be detected or quantified by performing the culture step, the fluorescence detection step, the determination step or the quantification step using the metal nanoparticle and the quantum dot of the present invention.
  • the disease marker includes all that can be used to diagnose or prevent a disease, and means a substance that can be objectively measured and evaluated in the normal course of a living organism, pathogenic mechanism or pharmacological response.
  • the disease marker may be a gene, protein, carbohydrate or lipid of a specific pathogen capable of diagnosing a disease, a pathogen in a pathogen associated with the diagnosis and detection of a disease, and a recognizer in an organism capable of specifically detecting the disease, and Includes all substances associated with characterization of other pathogens.
  • the disease indicator may be an anti-neophora protein or an antibody against influenza present in serum of a cow infected with Neospora disease, but is not limited thereto.
  • Solution A A mixed solution of 1 mL of 1% Geum Chloride and 79 mL of pure water
  • Solution B 4 mL of 1% citric acid, 0.025 mL of 1% tannic acid, and pure water (20 mL total)
  • the A solution and B solution were each heated to about 60 ° C. and the B solution was rapidly mixed while stirring the A solution. The color of the mixed solution was reddened and then boiled for about 5 to 10 minutes to prepare a gold colloid.
  • gold nanoparticles having a particle size of 3.5 to 14 nm were prepared by adjusting the particle size of the gold particles by varying the capacity of the tannin acid in the B solution.
  • CdTe quantum dots were prepared using a thiol-based compound as a protective agent. Specifically, Cd (ClO 4 ) 2 .6H 2 O (0.985 g, 2.35 mmol) was dissolved in 125 mL of water, and 5.7 mmol of thio glycolic acid was added with stirring. Then 1 M NaOH was added dropwise to adjust the pH to 11.4 to 11.6. The solution was placed in a flask and degassed by performing nitrogen bubbling for 30 minutes. Then, while stirring the solution, H 2 Te gas was passed through the solution for 20 minutes with the flow of nitrogen gas slowly.
  • H 2 Te gas was prepared by reacting 0.2 g (0.46 mmol) of Al 2 Te 3 mass with 15 to 20 mL of 0.5 MH 2 SO 4 under a nitrogen atmosphere. The reaction mixture was refluxed for 20 minutes under an open-air condition at 100 ° C. to produce a CdTe precursor, which was converted into CdTe nanocrystals.
  • the gold nanoparticles were first reacted with 8-mercapto octanoic acid.
  • 1.0 mL 8-mercapto octanoic acid was mixed with 9.0 mL of the gold nanoparticles having the surface of the above-mentioned concave-convex structure to a final concentration of 0.5 mM.
  • the cells were cultured under vibration at room temperature for one day to form a self-assembled monolayer (SAM) of 8-mercapto octanoic acid on the surface of the gold nanoparticles.
  • SAM self-assembled monolayer
  • the solution was then centrifuged at 4000 rpm, 15 minutes, 4 ° C., then the supernatant was discarded and the washing process was repeated three more times, rinsing the pellet with phosphate buffer (PBS, 0.01M, pH7.4). 8-mercapto octanoic acid was removed and the gold nanoparticles coated with 8-mercapto octanoic acid were suspended in 5 mL of water.
  • PBS phosphate buffer
  • the probe was bonded to the metal nanoparticle having a smooth surface by the above method.
  • Quantum dots reacted with 8-mercapto octanoic acid were washed twice with ethanol.
  • the probes secrete NcSAG1 and NcSRS2 corresponding to neospora proteins, and each of the proteins binds the probe to the quantum dots in the same manner as the probe is bound to the gold nanoparticles.
  • Quantum dots with probes were stored at 4 ° C. until suspended use with 1.0 mL of phosphate buffer.
  • Quantum dots without binding probes, quantum dots with neospora protein NcSAG1 recombinants, and quantum dots with neospora protein NcSRS2 recombinants were prepared, and fluorescence spectra of the quantum dots were measured.
  • the measurement of the fluorescence spectrum was carried out using an Infinite M200 NanoQuant (trade name, TECAN Co., Ltd.) which is a spectrophotometer (fluorescence microplate reader), and the measurement results are shown in FIG. 3.
  • the probe was fixed to the quantum dot so that the fluorescence wavelength did not change.
  • the recombinant neosphora protein NcSAG1 was bound to the quantum dot prepared above as a second probe.
  • the anti- IgG IgG goat antibody was fixed to the gold nanoparticles having an uneven structure with a first probe.
  • phosphate buffer and bovine serum (positive serum) infected with bovine neospora disease and healthy bovine serum (negative serum) were added for 1 hour, and the fluorescence intensity was measured. The results are shown in FIG. 5. It was confirmed that the fluorescence intensity of positive serum added was 18% higher than that of negative serum, and the difference was also statistically significant.
  • the effect of increasing the fluorescence intensity was about 2 times higher than that of the metal nanoparticle having the smooth surface.
  • the detection and quantification of the target substance can be made more accurately and quickly.
  • Detection was confirmed using a probe different from Example 2.
  • Recombinant neosphora protein NcSRS2 was bound to the quantum dots prepared above as a first probe, and the anti- IgG IgG goat antibody was bound to the gold nanoparticles having the surface of the uneven structure prepared above as a second probe.
  • Phosphate buffer, bovine serum (positive serum) infected with bovine neospora disease and healthy bovine serum (negative serum) were added to the mixed solution of quantum dots and gold nanoparticles, respectively, and reacted for 1 hour. The results are shown in FIG.
  • the anti-influenza H1N1 hemagglutinin (HA) antibody (polyclonal antibody) was bound to the quantum dot prepared above with a second probe.
  • anti-influenza H1N1 HA antibody (polyclonal antibody) was bound to the gold nanoparticles with the first probe.
  • the fluorescence intensity was measured, and the results are shown in FIG. 7. It was confirmed that the intensity of fluorescence intensity (increase in fluorescence intensity) occurred according to the concentration of recombinant flu H1N1 HA protein, and it was confirmed that the target substance in the sample could be quantified by calculating the concentration of the target substance through a calibration curve graph.

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Abstract

본 발명은 시료 내 표적 물질을 검출 또는 정량하는 새로운 방법, 및 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 질병표지물질을 검출하는 센서를 제공한다. 시료에 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 첨가하여 배양하는 배양 단계를 포함하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 표적 물질과 결합하지만 서로 결합하지 않고 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 표적 물질과 결합하는 경우 양자점의 형광강도가 강화되므로 검출의 정확도 및 신속도를 향상시켜주는 효과가 있다.

Description

표적 물질의 검출 또는 정량 방법, 및 키트
본 발명은 시료 내 표적 물질을 검출 또는 정량하는 방법, 및 이를 위한 키트와 센서에 관한 것이다.
병의 진단을 위하여 시료 내 표적 물질을 검출 또는 정량하는 방법으로 항원과 항체 반응을 이용한 효소 결합 면역 흡착법 (ELISA)이 알려져있다. 최근에는 나노 입자를 이용하여 생체 또는 세포 내에서 일어나는 생물학적 변화를 분자 수준에서 관찰할 수 있는 질병을 진단하는 방법이 다양하게 개발되고 있으며, 형광물질의 광학 영상을 이용하는 방법도 지속적으로 연구되고 있다. 이 때 사용되는 형광체는 유기물로만 이루어져 있어서 pH 또는 용해도 등의 환경적 요인에 의하여 강도가 크게 좌우될 뿐만 아니라, 빛의 노출에 따른 비가역적인 광표백 및 강한 소수성으로 인하여, 생체 내에서 사용되는데 한계를 가진다. 최근에는 양자점을 이용하여 질병의 진단 효율을 높이기 위하여 형광을 증강시키는 기술 등에 대한 연구가 진행 중이며 삼원색 발광하는 Si 양자점을 금나노 입자 구조를 이용하여 발광 증강하는 기술이 보고된 바 있다(URL:http://photomolecule.net/newsletter/2010/kenkyu1117.pdf).
그러나 다양한 질병에 대하여 병을 진단하기 위해 표적 물질을 검출하는 방법을 사용할 수 있도록 더 다양한 방법으로 시료 내 표적 분자를 검출 또는 정량할 수 있도록 검출 감도 및 검출 정밀도가 향상된 방법 및 장비의 제공이 요구되고 있다.
소의 네오스포라 병은 원충의 일종인 네오스포라 카니늄(Neospora Caninum)에 의해 감염되어 발생하고, 1988년 미국에서 발견된 이후 소, 산양, 말 등에서 발견되는 질병으로 증상으로는 소의 유산 또는 기형 송아지 출산 등이 있고, 감염된 소는 면역글로불린이 증가하여도 원충사멸능력이 없어 다음 분만 때도 계속 유산을 하며, 태반을 통하여 감염되기 때문에 동일한 가계의 소가 몇 대에 걸쳐 유산을 하는 특성이 있다. 때문에 미국의 캘리포니아주에서는 젖소의 유산을 일으키는 질병 중 본 기생충이 약 12%를 차지하여 가장 중요한 유산 원인체라는 것이 밝혀졌고, 연간 3천 5백만 달러 상당의 경제적 손실을 초래하고 있으며, 젖소의 번식장애는 낙농업의 가장 큰 경제적 손실 요인이다.
전 세계적으로 네오스포라 병의 치료를 위한 연구는 아직까지 세포배양방법과 마우스를 통한 실험결과만 있을 뿐, 소나 개에 대한 치료 결과는 미흡한 실정이다. 세포배양을 통해 이 원충에 대한 치료약제 선발시험 결과 설파다이아진, 트리메토프림, 라살로디스, 모넨신 등의 약제가 어느 정도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 네오스포라 병은 감염을 방지하기 위한 예방이 매우 중요하며, 아직 해결되지 못한 부분이 많이 있기 때문에 명확한 근절대책이나 방역조치 사항이 부실한 실정이다. 그러나 국내 및 세계적으로 상당한 피해를 주고 있기 때문에 농장 내에 질병이 유입되지 않도록 차단 및 신속한 진단을 위한 방법의 개발이 요구되고 있다.
더 다양한 방법으로 시료 내 표적 분자를 검출 또는 정량할 수 있다면, 검출 감도 향상, 검출 정밀도 향상, 종래 불가능했던 측정의 가능 등의 이점을 얻을 수 있는 가능성이 있다. 따라서, 본 발명은 시료 내 표적 물질을 검출 또는 정량하는 새로운 방법과 이를 위한 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 시료 내 표적 물질의 검출 또는 정량 방법에 관한 것으로, 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 시료에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않고, 표적 물질과 각각 결합하며, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 각각 표적 물질과 결합하면 상기 양자점의 형광 강도가 강화되는 방법을 제공한다.
상기 표적 물질의 검출 방법은 상기 배양된 시료의 형광 강도를 측정하는 형광 측정 단계 및 상기 측정된 양자점을 대조군과 비교하여 시료 내 표적 물질의 유무를 판정하는 판정단계를 더 포함하는 방법을 제공한다.
상기 표적 물질의 정량 방법은 상기 배양된 시료의 형광 강도를 측정하는 형광측정 단계 및 상기 측정된 양자점의 형광 강도를 표준 시료의 양자점 형광 강도와 비교하여 시료 내 표적 물질을 정량하는 정량 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 시료 내 표적 물질 검출용 키트에 관한 것으로, 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 포함하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 표적 물질과 각각 결합하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않으며, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 각각 표적 물질과 결합하면 양자점의 형광 강도가 강화되는 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 질병표지물질 검출용 센서에 관한 것으로, 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 포함하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 상기 질병표지물질과 각각 결합하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않으며, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 각각 질병표지물질과 결합하면 양자점의 형광 강도가 강화되어 질병표지물질을 검출할 수 있는 센서를 제공한다.
상기 금속 나노 입자는 구 형태의 금속 나노 입자 표면에 돌기가 형성된 요철구조를 갖는 것일 수이었다.
상기 금속 나노 입자는 플라즈몬 특성을 갖는 것일 수이었다.
상기 양자점은 가시광선 영역의 형광을 발하는 것일 수이었다.
상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 독립적으로 항원, 항체, 렉틴, 올리고당, 수용체 리간드, 앱타머, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 시료 내 표적 물질을 검출 또는 정량하는 새로운 방법을 제공 할 수 있다. 이 방법은 금속 나노 입자와 양자점이 근접하여 위치하게 되면 양자점의 형광 강도가 강화하는 현상을 이용하는 것이다. 시료 내 표적 물질에 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점이 결합하여 금속 나노 입자와 양자점이 근접하여 위치하는 경우 양자점의 형광 강도가 강화되므로, 상기 강화된 형광 강도를 측정하여 대조군 또는 표준 시료의 형광 강도와 비교하여 시료 내 표적 물질을 검출 또는 표적 물질의 함량을 정량할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면 기존의 ELISA 법에서 필수 단계인 세척 단계를 수행하지 않고 시료 내 표적 물질을 검출할 수 있어 표적 물질 검출을 간편하게 수행할 수 있고, 세척에 의한 표적 물질의 검출 감도의 저하를 방지 할 수 있다.
본 발명은 시료 내 표적 물질 검출용 키트 또는 센서를 제공할 수 있고, 본 발명의 키트 또는 센서에 의하면, 우수한 검출 감도 및 검출 정밀도로 질병표지물질을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 시료내 표적 물질의 검출 또는 정량 방법은 세척을 필요로 하지 않아 표적 물질의 검출 및 정량을 간편하게 수행 할 수 있고 세척에 의한 검출 감도의 저하를 방지할 수 있어 우수한 검출 감도 및 정밀도로 표적 물질을 검출 또는 정량할 수 있다.
도 1은 금속 나노 입자(20)와 양자점(10)이 근접하면 양자점의 형광 강도가 강화하는 현상을 나타내는 도이다. 점선으로 표시된 화살표는 여기광의 조사를 나타내고, 실선으로 표시된 화살표는 양자점의 형광을 나타낸다. "+"및 "-"는 금속 나노 입자(20)의 전하를 나타낸다.
도 2는 표적 물질을 검출하는 방법의 일 실시 형태를 나타내는 도이다. 10은 양자점이고, 11은 양자점과 결합하는 제 2 프로브를 나타내며, 20은 금속 나노 입자이고, 21은 금속 나노 입자와 결합하는 제 1 프로브를 나타낸다. 30은 표적 물질을 나타내고, 화살표 아래는 표적 물질에 제 2 프로브가 결합된 양자점 및 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자가 각각 결합된 것을 나타내는 도이다.
도 3은 실험예 1의 결과를 나타내는 형광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. 그래프의 가로축은 형광파장(nm)를 나타내고, 그래프의 세로축은 형광강도를 나타내며, 실선은 양자점, 긴 파선은 양자점-NcSAG1 그리고 짧은 파선은 양자점-NcSRS2를 나타낸다.
도 4는 실시예 1의 결과를 나타내는 그래프 이다. 그래프의 가로축은 시료의 종류를 나타내고, 그래프의 세로축은 형광 강도를 나타낸다.
도 5는 실시예 2의 결과를 나타내는 그래프 이다. 그래프의 가로축은 시료의 종류를 나타내고, 그래프의 세로축은 형광 강도를 나타낸다.
도 6은 실시예 3의 결과를 나타내는 그래프 이다. 그래프의 가로축은 시료의 종류를 나타내고, 그래프의 세로축은 형광 강도를 나타낸다.
도 7은 실시예 4의 결과를 나타내는 검량선 그래프 이다. 그래프의 가로축은 재조합체 인플루엔자 H1N1단백질HA의 농도(pg/ml)를 나타내고, 세로축은 형광 강도를 나타낸다.
(원리)
양자점은 수십 nm 이하의 반도체 결정을 의미하고, 여기광을 조사하면 형광을 발하는 특성을 가진다. 상기 양자점의 형광을 발하는 성질은 양자점에 금속 나노 입자가 근접하여 위치하는 경우 형광의 세기가 강해지는데, 본 발명의 검출 방법 및 정량 방법은 금속 나노 입자와 양자점이 근접하면 양자점의 형광 강도가 강화하는 현상을 이용하는 것이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 양자점에 여기광을 조사하면 금속 나노 입자(20)에 존재하는 전하에 의하여 금속나노 입자에 근접한 양자점(10)의 형광 증강 효과가 나타나, 양자점에만 여기광을 조사하는 경우와 비교해서 발하는 형광의 강도가 세진다. 본 발명에 따른 금속 나노 입자와 양자점에 각각 결합된 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 표적 물질과 결합하는 경우 금속 나노 입자의 전하에 의하여 양자점이 발하는 형광의 강도가 증가하게 된다.
도 2는 시료 내 표적 물질을 검출하는 방법의 일 실시 형태를 나타내는 것으로, 본발명의 일 실시예에 따라 네오스포라 병을 진단하기 위해 항-네오스포라(Neospora) 항체를 시료에서 검출하는 경우를 나타낸다.
소 네오스포라(Neospora) 병은 기생충 질환으로, 네오스포라(Neospora) 질환에 감염된 소의 혈청에는 항(anti) 네오스포라 항체가 존재하므로, 소 혈청에 존재하는 항(anti) 네오스포라 항체를 검출하여 소 네오스포라(Neospora) 병의 감염여부를 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 표적 물질(30)은 항(anti) 네오스포라 항체이다. 표적 물질(30)은 금속 나노 입자(20)에 결합된 제 1의 프로브(21)와 결합한다. 상기 제 1의 프로브(21)는 항(anti) 네오스포라 항체의 항원이고, 바람직하게는 NcSAG1 단백질 이다. 또한 표적 물질(30)은 양자점(10)에 결합된 제 2의 프로브(11)와 결합한다. 상기 제 2 프로브(11)는 일 예로 항(anti) 소 IgG 항체 이다. 상기와 같이 표적 물질에 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 각각 결합하는 경우, 금속 나노 입자(20)와 양자점(10)이 표적 물질을 중심으로 근접하여 위치하게 되므로, 상기 금속 나노 입자의 전하에 의하여 양자점의 형광 강도가 증가한다. 상기 형광 강도의 측정을 통해서 시료 내 표적 물질의 유무 및 함량을 검출 및 정량하여 네오스포라 병의 감염여부를 진단할 수 있다.
(시료 내 표적 물질을 검출하는 방법)
본 발명의 일 실시예에 따른 시료의 표적 물질을 검출하는 방법은, 표적 물질의 유무를 판단하고 싶은 시료 및 표적 물질을 포함하지 않는 대조군 시료 각각에 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 첨가하여 배양하는 배양 단계를 포함한다. 또한 상기 배양 단계 후 확인하고자 하는 시료와 대조군 시료의 양자점의 형광 강도를 측정하는 형광 측정 단계 그리고 시료 내 양자점의 형광 강도와 대조군의 양자점 형광 강도를 비교하여 시료 내 양자점의 형광 강도가 더 강한 경우 시료 내에 표적 물질이 존재한다고 판정하는 판정 단계를 포함한다.
(표적 물질 및 프로브)
본 발명에 있어서 표적 물질은 검출 또는 정량의 대상이 되는 물질을 의미하고, 상기 표적 물질은 질병을 진단하기 위한 질병표지물질(biological biomarker) 일 수 있다. 상기 질병표지물질을 표적 물질로 하여 본 발명의 방법에 의하는 경우 질병의 감염여부를 간단하고 신속하면서도 정확하게 진단할 수 있다.
상기 표적 물질의 일 예로 항원과 항체, 렉틴(lectin)과 당, 리셉터(receptor)와 리간드(ligand), 앱타머(aptamer)와 앱타머의 표적물질, 핵산-핵산 등의 서로 특이적으로 결합하는 물질 쌍 중 하나를 이용해 다른 쪽을 프로브(probe)로 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 단백질, 펩티드, DNA, RNA, 화학 물질, 호르몬, 바이러스, 당으로 이루어진 군에서 서로 특이적 결합하는 것을 선택하여 표적 물질 또는 프로브에 사용할 수 있다.
상기 프로브는 항원, 항체, 렉틴, 올리고당, 수용체 리간드, 앱타머, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 프로브(probe)는 표적 물질과는 결합하지만, 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않는 것을 사용할 수 있다. 상기 제 1 프로브와 제 2 프로브가 서로 직접 결합하는 경우, 표적 물질의 존재 유무에 관계없이 금속 나노 입자와 양자점이 근접하여 위치하게 되므로 형광 강화 현상이 일어나, 표적 물질의 유무를 제대로 판단할 수 없게 된다.
상기 프로브의 일 예로, 표적 물질이 항원에 특이 적으로 결합하는 항체 인 경우, 표적 물질(항체)이 결합하는 항원 및 표적 물질(항체)에 결합하는 2차 항체를 제 1 및 제 2 프로브로 각각 사용할 수 있다. 또한 예를 들어, 표적 물질이 항원 인 경우, 제 1 프로브 및 제 2 프로브로는 표적 물질의 다른 에피토프에 각각 결합하는 두 가지 항체를 사용할 수 있다.
상기 프로브의 또 다른 일 예로, 표적 물질이 항원이고, 상기 항원이 근접해 둘 이상 존재하는 경우, 제 1 프로브 및 제 2 프로브로는 표적 물질 상의 동일한 에피토프(epitope)에 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 상기 근접해서 둘 이상 존재하는 항원의 일 예로, 항원이 다량체를 형성하고 있는 경우, 표적 물질이 바이러스, 미생물, 세포 등의 표면에 복수 존재하는 항원인 경우일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명에 있어서 표적 물질에 제 1 프로브 및 제 2 프로브가 각각 결합하여 금속 나노 입자와 양자점이 근접하여 위치함으로써 양자점의 형광 강도가 증가되는 경우 라면, 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하는데 제한되지 않는다.
검출 및 정량의 대상이 되는 표적 물질은 액체, 고체, 분말 상 또는 기체에 존재하는 것일 수 있고, 그 상(phase)에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따른 시료의 표적 물질을 검출하는 방법은 액체 상태로 실시할 수 있고, 시료가 액체 아닌 경우에는 적절한 완충액 등에 시료를 용해 또는 현탁하여 액체 상태로 표적 물질을 검출 또는 정량할 수 있다.
(금속 나노 입자)
본 발명의 금속 나노 입자는 평균 입경으로 나노 크기(nm)를 갖는 금속 입자를 모두 포함하는 것을 의미이고, 바람직하게는 플라즈몬(Plasmon) 특성을 나타내는 금속 나노 입자 일 수 있다. 상기 플라즈몬 특성은 플라즈몬 공명(Plasmon reocnance) 이라고도 하며, 금속 표면에서 일어나는 전자들이 집단적 진동하는 현상을 나타내는 광학적 성질을 의미한다.
상기 금속 나노 입자는 일 예로, 금, 은, 니켈, 알루미늄 등의 금속, 또는 구리, 철 등의 전이 금속을 이용할 수 있고, 수십 nm 내지 수백 nm 의 크기로 형성되는 것 일 수 있다. 상기 금속 나노 입자의 형태는 구형, 4면체, 6면체, 8면체 및 막대 기둥 등 다양한 모양으로 형성될 수 있고, 하나의 모양으로 된 나노 입자만 이용할 수도 있고, 서로 다른 모양이 나노입자들을 혼합하여 이용할 수도 있다.
상기 금속 나노 입자는 바람직하게는 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag), 철(Fe) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 가장 바람직한 실시형태로는 양자점의 형광을 증강시키는 효과가 큰 금(Au)일 수 있다. 상기 금 또는 은 나노 입자의 경우 가시광선 영역의 빛과 강하게 공명하여 흡광 및 산란이 매우 강하게 나타나므로 양자점의 형광 강화에 따른 표적 물질의 검출 및 정량을 더욱 정확하게 할 수 있는 효과를 가진다.
금속 나노 입자의 제조 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 일 예로, 금 나노 입자는 염화 금산(HAuCl4)을 구연산과 탄닌산(tannic acid)으로 환원하여 제조할 수 있다. 또한 철 나노 입자는 질산은 수용액을 구연산 등으로 환원하여 제조할 수 있다.
(요철구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자)
본 발명의 요철구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자는 표면에 돌기가 형성되어 요철구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자를 의미하고, 별사탕 모양 금속 나노 입자 또는 성게 모양 금속 나노 입자 라고도 한다.
본 발명의 금속 나노 입자는 바람직하게는 구형태의 금속 나노 입자를 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 구형태의 금속 나노 입자의 표면에 돌기가 형성된 요철 구조의 금속 나노 입자를 이용할 수 있다. 요철 구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자를 이용하는 경우 금속 나노 입자의 표면적이 넓어져 일반적으로 매끈한 표면을 갖는 금속 나노 입자와 비교하여 양자점의 형강 강화 현상이 더욱 증가된다. 따라서 표적 물질의 검출 또는 정량하는 진단 효과 및 정확도를 더욱 향상 시킬 수 있고, 적은 양의 시료에서도 효율적으로 표적 물질을 검출 할 수 있게 해준다.
일 예로, 금속 나노 입자의 표면에 요철구조가 있는지 여부는 투과 전자 현미경(TEM)으로 관찰하여 확인할 수 있다. 일반적으로 금속 나노 입자(표면이 매끄럽고 돌기가 형성되지 않은 금속 나노 입자)가 구형인 반면, 요철구조의 금속 나노 입자는 나노 입자의 표면에 돌기가 형성되어 오목함과 볼록함이 반복되는 요철구조를 가진다.
상기 요철구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자의 제조방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 요철 구조의 금속 나노 입자를 제조하기 위해 사용하는 방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 일 예로, 10 mL의 10 mM HEPES 완충액(pH 7.4)에 250 l의 20 mM 염화 금산(chloroauric acid) 용액을 첨가한 후, 상기 용액의 색이 황색에서 어두운 파란색으로 바뀔 때까지 실온에서 30 분간 방치하여 제조할 수 있다.
(양자점)
본 발명에 있어서, 양자점(Quantum Dot)은 평균 지름이 2 내지 10 nm 정도의 양자 우물 구조(quantum well structure)를 갖는 나노 크기의 결정이다. 양자점은 코어 구조 만으로 이루어진 것과 코어/쉘 구조로 이루어진 것을 모두 포함한다. 상기 코어 구조를 갖는 양자점은 CdS, CdSe, CdTe, CdSeTe 등을 포함하는 Cd계 양자점, PbS, PbSe 등을 포함하는 Pb계 양자점 그리고 ZnSe, ZnTe 등을 포함하는 Zn계 양자점 일 수 있고, 상기 코어/쉘 구조를 갖는 양자점은 CdSe/ZnS, CdSe/CdS/ZnS, CdSe/ZnSe/ZnS 및 GaAs/AlGaAs 일 수 있으나, 본 발명에 있어서 양자점의 종류에 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 양자점은 바람직하게는 Cd 계 양자점을 이용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 CdTe를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 양자점의 형광 파장은 양자점의 입자 크기에 의하여 의존하여 상이하게 나타날 수 있다. 일 예로, CdSe 양자점은 입자 크기를 3 내지 5 nm로 변화시킴으로써 파랑 녹색에서 빨간색까지 (500 내지 650nm)의 형광을 발생시킬 수 있다.
상기 양자점의 입자 크기, 합성 반응의 반응 시간, 합성에 사용되는 유기 금속 화합물의 열분해 반응 온도 등에 의해 제어하여 본 발명의 일 실시예서 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 양자점의 형광 파장은 양자점 재료 반도체의 종류에 의존하여 상이하게 나타날 수 있다. ZnSe, CdS, CdSe, CdSeTe, PbS 또는 PbSe 등의 반도체를 이용하여 가시광선 및 근적외선 영역(400 내지 2000 nm)의 형광을 발하는 양자점을 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양자점의 합성법에는 주로 하향식 방법과 상향식 방법의 두 가지 존재하며, 상기 하향식 방법의 일 예로, 반도체 기판에 전자 빔 리소그래피와 분자빔에피택시법(molecular beam epitaxy) 등을 이용하여 양자점을 합성한다. 상향식 방법의 일 예로, 액상에서 합성방법이 있다. 또한 액상의 화학 합성에 주로 수용액에서 합성하는 것으로 유기 용매에서 합성하는 방법의 두 가지가 존재하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 수용액에서 합성하는 방법의 일 예로, 티올계 화합물을 보호제로, 카드뮴 염 수용액에 텔루르화 수소 나트륨(hydrogen telluride sodium)을 반응시킴으로써 CdTe 양자점을 합성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예로, 유기 용매에서 합성하는 방법으로 배위 유기 화합물인 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine, TOP) 및 트리옥틸포스핀옥사이드(trioctylphosphineoxide, TOPO)를 용매로 디메틸 카드뮴, S, Se 및 Te의 TOP 착물(complex) 또는 유기 금속 화합물을 약 300 ?에서 열분해하여 양자점을 합성할 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 있어서, 양자점의 제조방법의 종류에 특별히 제한되는 것은 아니고, 하나 이상의 방법으로 합성된 양자점도 본 발명의 실시에 사용할 수 있다.
(금속 나노 입자와 양자점에 프로브 결합하는 방법)
금속 나노 입자와 양자점에 프로브를 결합하는 방법은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 방법을 사용할 수 있으나, 특별히 한정되지 않는다.
상기 금속 나노 입자 및 양자점에 프로브를 결합하는 방법의 일 예로, 금속 나노 입자 또는 양자점 표면에 아미노기, 카르복실기, 티올기 등의 작용기를 도입한 다음, 화학가교제를 사용하여 프로브를 고정하는 방법을 사용할 수 있다.
상기 가교제는 본 발명이 속하는 분야에서 화합물의 가교를 위해서 통상적으로 사용되는 가교제라면 종류에 제한되지 않고 사용할 수 있고, 바람직하게는 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노 프로필)카르보디이미드 염산염(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC), N-하이드록시숙신이미드(n-hydroxysuccinimide, NHS), 숙신이미딜-4-(N-말레이미드 메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, SMCC), 및 이들의 결합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
상기 금속 나노 입자 또는 양자점 표면에 작용기를 도입하는 방법의 일 예로, 금속 나노 입자 또는 양자점을 양친매성의 티올 화합물과 반응시키는 방법이 있다. 상기 양친매성 티올 화합물은 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 8-머캅토 옥탄산을 사용할 수 있다.
(배양 단계)
본 발명의 일 실시예에 따른 배양 단계에서 표적 물질의 유무 및 그 함량을 확인하고자 하는 시료 및 표적 물질을 포함하지 않는 대조군의 각각 제 1의 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 첨가하여 배양하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 배양 단계는 시료 중에 표적 물질이 존재하는 경우에는 표적 물질에 제 1 프로브 및 제 2 프로브가 각각 결합하므로, 금속 나노 입자와 양자점이 근접한 위치에 자리하게 된다. 금속 나노 입자와 양자점의 양은 시료의 양, 표적 물질의 종류 등을 고려하여 선택하여 사용할 수 있다. 배양 온도는 표적 물질과 프로브에 시료의 양, 표적 물질의 종류 등을 고려하여 선택하여 사용할 수 있다. 배양 시간은 표적 물질 제 1 프로브 및 제 2 프로브의 결합이 평형에 도달하는데 걸리는 시간으로 설정하여 사용하는 것이 바람직 하다.
(형광 측정 단계)
본 발명에 있어서, 형광 측정 단계에서는 배양 단계 후의 시료와 대조군의 양자점의 형광 강도를 측정하는 방법으로 수행한다. 상기 측정은 분광 형광 광도계를 포함하여, 통상적으로 사용되는 형광 측정 장치를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 배양 단계 후의 시료와 대조군에 대해 양자점의 여기 광을 조사하여 발생하는 형광 강도를 측정 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 양자점으로 가시광선 영역의 형광을 발하는 것을 사용하는 경우 여기광 조사 장치가 있으면, 형광 측정 장치를 사용하지 않아도 육안으로 관찰하여 형광을 검출하는 것도 가능하여 표적 물질 검출이 필요한 현장에서 바로 표적 물질의 존재를 감지할 수 있는 효과가 있다.
(판정 단계)
본 발명에 있어서, 판정 단계에서는 형광 측정 단계에서 측정된 형광 강도에 따라 시료 중 표적 물질이 존재하는지 여부를 판정하는 방법으로 수행할 수 있다.
일 예로, 형광 측정기를 이용한 측정값을 비교하여, 시료 내 양자점의 형광 강도가 대조군의 양자점의 형광 강도에 비해 강한 경우 시료 중에 표적 물질이 존재한다고 판정할 수 있고, 가시광선 영역의 형광을 발하는 양자점의 경우에는 형광 측정 장치를 사용하지 않아도 육안으로 관찰하여 형광을 검출할 수 있다. 그리고 육안으로 형광 강도의 강화에 따라 표적 물질의 존재 또는 부재를 판정할 수 있다.
(시료 내 표적 물질을 정량하는 방법)
본 발명에 있어서, 시료 내 표적 물질을 정량하는 방법은 상기 시료 내 표적 물질을 검출하는 방법과 같이, 시료의 형광강도 결과를, 표준시료의 형광강도 결과와 비교하여 정량 단계를 통해 실시할 수 있다.
일 예로 시료 및 알려진 농도의 표적 물질을 포함한 여러 표준 시료의 각각 제 1의 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 첨가하여 상기 배양 단계 및 형광 측정 단계를 실시한 후, 다음 아래 설명된 정량 단계를 실시하는 방법으로 수행 할 수 있다.
(정량 단계)
본 발명에 있어서, 정량 단계는 시료 내 양자점의 형광 강도를 여러 표준 시료의 양자점의 형광 강도와 비교하여 시료 내 표적 물질의 존재량을 구하는 방법으로 수행할 수 있다. 일 예로, 도 7에 나타낸 것과 같이, 여러 개의 표준 시료의 양자점의 형광 강도를 바탕으로 검량선을 작성하여 시료 내 양자점의 형광 강도를 검량선에 적용하여 시료 내 표적 물질의 농도를 구할 수 있다.
(키트)
본 발명에 있어서, 시료 내 표적 물질 검출 또는 정량용 키트는 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 포함한다.
상기 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점은 제공되는 상(phase)에 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 용액 상태 또는 건조 상태로 제공될 수 있다. 상기 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점은 사용시 완충액에 용해 또는 현탁하여 사용할 수 있다. 상기 본 발명의 금속 나노 입자와 양자점을 이용하여 상기 배양 단계, 형광 검출 단계, 판정 단계 또는 정량 단계를 실시하여 시료 내 표적 물질을 검출 또는 정량할 수 있다.
다른 실시예에 따른 시료의 표적 물질 검출 또는 정량용 키트에서, 상기 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점은 전달 수단에 포함된 형태로 공급될 수 있다. 상기 전달 수단은 본 발명읜 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 포함하여 표적 물질을 검출 또는 정량할 수 있도록 하는 것이면 그 종류에 제한되지 않는다. 상기 전달 수단은 적당한 형상 및 크기를 적절하게 조정하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 종이형태일 수 있다. 상기 전달 수단의 일 예로 배지 또는 여과지 등을 이용할 수 있다.
장비 사용시에는 시료 및 표적 물질을 포함하지 않는 대조군을 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점이 존재하는 전달 수단에 떨어뜨린다. 따라서 시료 중에 표적 물질이 존재하는 경우에는 전달 수단 내에서 표적 물질과 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 결합하게 되고, 상기 전달 수단에 여기 광을 조사하여 양자점에서 형광이 발생한다.
본 발명에 따른 키트를 이용하는 경우 검출하고자 하는 표적 물질의 신속한 검출이 필요한 현장에서 신속하게 검출하여 확인할 수 있는 효과가 있다.
(센서)
본 발명에 있어서, 질병표지물질 검출용 센서는 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 포함한다.
상기 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점은 제공되는 상(phase)에 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 용액 상태 또는 건조 상태로 제공될 수 있다. 상기 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점은 사용시 완충액에 용해 또는 현탁하여 사용할 수 있다. 상기 본 발명의 금속 나노 입자와 양자점을 이용하여 상기 배양 단계, 형광 검출 단계, 판정 단계 또는 정량 단계를 실시하여 시료 내 표적 물질을 검출 또는 정량할 수 있다.
상기 질병표지물질은 질병의 진단 또는 예방에 사용될 수 있는 것을 모두 포함하는 것으로, 생물체의 정상적인 과정, 병원성 기작 또는 약리반응이 객관적으로 측정 및 평가 될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 질병표지물질은 질병의 진단 등이 가능한 특정 병원체의 유전자, 단백질, 탄수화물 또는 지질 등 일 수 있고, 질병의 진단, 탐지와 연관된 병원체 내의 병인물질과 이를 특이하게 감지할 수 있는 생물체내의 인식물질 및 그 외의 병원체의 특성 규명과 연관된 물질을 모두 포함한다.
상기 질병 지표물질의 일 예로 네오스포라 병에 감염된 소의 혈청에 존재하는 항 네오스포라 단백질 또는 인플루엔자에 대한 항체 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(표면이 매끄러운 금 나노 입자의 제조)
표면이 매끄러운 금 나노 입자 용액(금 콜로이드 용액) 100 mL를 제조하였다. 먼저 사용하는 모든 기구를 왕수(aqua regia, 염산과 질산을 용량비 3:1로 혼합한 액체)로 세척하고 에탄올 및 초순수(비저항 값 18.2 MΩ·cm)로 헹구었다.
하기의 2 종류의 A 용액 및 B 용액을 준비하였다.
A 용액 : 1 % 염화 금산 1 mL와 순수한 물 79 mL의 혼합 용액
B 용액 : 1 % 구연산 4 mL, 1 % 탄닌산 0.025 mL 및 순수한 물의 혼합 용액 (총 20 mL)
상기 A 용액 및 B 용액을 각각 약 60 ℃로 가열하고 A 용액을 교반하면서 B 용액을 빠르게 혼합하였다. 혼합한 용액의 색이 붉어진 후 약 5 ~ 10 분간 비등시켜, 금 콜로이드를 제조하였다. 또한 상기 제조 방법에 있어서, B 용액의 타닌산의 용량을 다르게 하여 금 입자의 입경을 조절하여, 3.5 내지 14 nm의 입경을 가지는 금 나노 입자를 제조하였다.
(요철구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자의 제조)
먼저 사용하는 모든 기구를 왕수(aqua regia, 염산과 질산을 용량비 3:1로 혼합한 액체)로 세척하고 에탄올 및 초순수(비저항 값 18.2 MΩ·cm)로 헹구었다. 100 mM HEPES 용액을 초순수로 제조하여 1M NaOH로 pH를 7.4(25 ℃)로 조절하였다. 이어 100 mM HEPES 용액 1 mL 및 초순수 9 mL를 혼합하고, 이어 20 mM HAuCl4 용액 250 ㎕를 첨가하였다. 실온에서 30 분 이내에 용액의 색이 옅은 노란색에서 분홍색으로 변화하는 것을 관찰하였고, 최종적으로 불투명한 청색이 된 후, 표면에 돌기가 있어 요철구조의 표면을 갖는 별사탕 모양의 금 나노 입자를 얻었다.
(양자점의 제조)
티올계 화합물을 보호제로 CdTe 양자점을 제조하였다. 구체적으로는, Cd(ClO4)2·6H2O(0.985 g, 2.35 mmol)를 125 mL의 물에 용해하고, 5.7 mmol의 티오 글리콜 산을 교반하면서 첨가하였다. 이어서 1 M의 NaOH를 적가하여, pH를 11.4 내지 11.6으로 조절하였다. 상기 용액을 플라스크에 넣고 질소 버블링을 30 분간 실시하여 탈기하였다. 이어 용액을 교반하면서 천천히 질소 가스의 흐름과 함께 H2Te 가스를 용액에 20 분간 통하게 했다. H2Te 가스는 질소 분위기 하에서 0.2 g(0.46mmol)의 Al2Te3 덩어리와 0.5 M H2SO4 15 내지 20 mL 를 반응시켜 제조하였다. 응축 장치를 연결하여 반응 혼합물을 100 ℃ 대기 아래(open-air condition)에서 20 분간 환류하여 CdTe 전구체를 생성, CdTe 나노 결정으로 변환된 것을 실험에서 사용하였다.
(금속 나노 입자에 프로브의 결합)
상기 금 나노 입자를 먼저 8-머캅토 옥탄산과 반응시켰다. 1.0 mL 8-머 캅토 옥탄산을 9.0 mL의 상기에서 제조한 요철구조의 표면을 갖는 금 나노 입자와 혼합하여 최종 농도 0.5 mM가 되게 하였다. 실온에서 하룻동안 진동을 가하면서 배양하여, 금 나노 입자의 표면에 8-머캅토 옥탄산의 자가조립 단분자막(Self-Assembled Monolayer, SAM)을 형성하였다. 이어 용액을 4000 rpm, 15 분, 4 ℃에서 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH7.4)으로 펠렛을 헹구는 세척 과정을 3 회 이상 반복하였다. 8-머캅토 옥탄산을 제거하고, 8-머캅토 옥탄산으로 코팅한 금 나노 입자를 5 mL의 물에 현탁하였다. 이어 400 ㎕의 0.1 M 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노 프로필)카르보디이미드 염산염(EDC)을 첨가하여 10 분간 배양한 후 100 ㎕의 0.1 M N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 첨가하였다. 이어 항(anti) 소 IgG 염소 항체를 최종 농도 10 ㎍/mL가 되도록 첨가하였다. 이 혼합 용액을 부드럽게 진탕하면서 실온에서 8 시간 배양한 후, 상기와 같은 원심/헹굼 단계를 3 회 이상 반복하여, 결합하지 않은 항 소 IgG 염소 항체를 제거하였다. 최종 펠렛을 5.0 mL의 인산 완충액에 현탁 사용하기 전까지 4 ℃에서 저장하였다.
또한 상기의 방법으로 표면이 매끄러운 금속 나노 입자에도 프로브를 결합하였다.
(양자점에 프로브의 결합)
8-머캅토 옥탄산과 반응시킨 양자점을 에탄올로 2 회 세척하였다.
프로브로 네오스포라 단백질에 해당하는 NcSAG1 및 NcSRS2을 분비하고, 상기 단백질 각각을 상기 금 나노 입자에 프로브를 결합한 것과 동일한 방법으로 양자점에도 프로브를 결합시켰다. 프로브를 결합한 양자점은 1.0 mL의 인산 완충액으로 현탁 사용하기 전까지 4 ℃에서 저장하였다.
(실험예 1)
(프로브가 결합된 양자점의 형광 파장과 형광 강도의 변화 검토)
프로브를 결합시키지 않은 양자점과, 네오스포라 단백질 NcSAG1 재조합체가 결합된 양자점 그리고 네오스포라 단백질 NcSRS2 재조합체가 결합된 양자점을 준비하고, 상기 각 양자점의 형광 스펙트럼을 측정하였다. 형광 스펙트럼의 측정은 분광 형광 광도계(형광 마이크로 플레이트 리더)인피니트 M200 NanoQuant(상품명, TECAN사)를 사용하여 실시하고, 상기 측정 결과를 도 3에 나타내었다. 양자점에 프로브를 고정해서 형광 파장에는 변화가 없었다.
(실시예 1)
(표면의 매끄러운 금 나노 입자와 양자점을 이용한 소 네오스포라(Neospora) 병 감염의 진단)
상기에서 제조한 양자점에 제 2 프로브로 항 소 IgG 염소 항체를 결합하였다. 또한, 표면이 매끄러운 금 나노 입자에 재조합체 네오스포라 단백질 NcSAG1을 제 1 프로브로 고정하였다. 이러한 양자점과 금 나노 입자의 혼합 용액에 소 네오스포라(Neospora) 질병에 감염된 소 혈청(양성 혈청)과 건강한 소 혈청(음성 혈청)을 각각 첨가하여 1 시간 배양 후 형광 강도를 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 양성 혈청을 첨가한 경우의 형광 강도가 음성 혈청을 첨가한 경우의 형광강도 보다 9% 강화된 것을 확인하였고, 그 차이도 통계적으로 유의적임을 확인하였다. 따라서 본 발명의 방법은 소 네오스포라(Neospora) 병의 감염을 진단할 수 있음을 확인하였다.
(실시예 2)
(별 사탕 모양 금 나노 입자와 양자점을 이용한 소 네오스포라(Neospora) 병 감염의 진단)
상기에서 제조한 양자점에 제 2 프로브로 재조합체 네오스포라 단백질 NcSAG1을 결합하였다. 또한 요철 구조를 갖는 금 나노 입자에 제 1 프로브로 항 소 IgG 염소 항체를 고정하였다. 이러한 양자점과 금 나노 입자의 혼합 용액에 인산 완충액, 소 네오스포라(Neospora) 질병에 감염된 소 혈청 (양성 혈청)과 건강한 소 혈청(음성 혈청)을 각각 첨가하여 1 시간 반응한 후 형광 강도를 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 양성 혈청을 첨가한 경우의 형광 강도가 음성 혈청을 첨가한 경우의 형광 강도 보다 18 % 증가한 것을 확인하였고, 그 차이도 통계적으로 유의적임을 확인하였다.
또한, 실시예 1과 실시예 2에서는 양자점과 금 나노 입자에 결합한 제 1 및 제 2 프로브를 각각 반대로 사용하였지만, 본 발명의 방법에 의한 검출효과는 동일하여, 상기 프로브의 종류에 한정되지 않음을 실험적으로 확인하였다.
또한 본 발명의 요철 구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자의 경우 형광 강도의 증가효과가 매끈한 표면을 갖는 금속 나노 입자보다 2 배 정도 높은 것을 확인하여, 본 발명의 요철 구조의 표면을 갖는 금속 나노 입자를 이용하는 경우 표적 물질의 검출 및 정량이 더욱 정확하고 신속하게 이루어 질 수 있음을 확인하였다.
(실시예 3)
(요철 구조의 표면을 갖는 금 나노 입자와 양자점을 이용한 소 네오스포라(Neospora) 병 감염의 진단)
실시예 2와 다른 프로브를 사용하여 검출을 확인하였다. 상기에서 제조한 양자점에 재조합체 네오스포라 단백질 NcSRS2을 제 1 프로브로 결합하고, 상기에서 제조한 요철 구조의 표면을 갖는 금 나노 입자에 항 소 IgG 염소 항체를 제 2 프로브로 결합하였다. 상기 양자점과 금 나노 입자의 혼합 용액에 인산 완충액, 소 네오스포라(Neospora) 질병에 감염된 소 혈청(양성 혈청)과 건강한 소 혈청(음성 혈청)을 각각 첨가하여 1 시간 반응한 후 형광 강도를 측정 하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
양성 혈청을 첨가한 경우의 형광 강도가 음성 혈청을 첨가한 경우의 형광 강도 보다 48 % 증가한 것을 확인하였고, 그 차이도 통계적으로 유의성을 가짐을 확인하였다.
(실시예 4)
(독감 단백질의 검출)
상기에서 제조한 양자점에 항 인플루엔자 H1N1 헤마글루티닌(HA) 항체(다 클론 항체)를 제 2 프로브로 결합하였다. 또한 금 나노 입자에 항 인플루엔자 H1N1 HA 항체(다 클론 항체)를 제 1 프로브로 결합하였다. 96-웰 플레이트에 상기 양자점과 금 나노 입자의 혼합 용액을 분주하고, 재조합 독감 H1N1 HA 단백질을 최종 농도가 1000 nm/mL, 100 nm/mL, 10 nm/mL, 1 nm/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL 및 1 pg/mL가 되도록 각각 첨가하여 30 분간 배양한 후 형광 강도를 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 재조합 독감 H1N1 HA 단백질의 농도에 따라 형광 강도의 강화(형광 강도의 증가)가 일어나는 것을 확인하였고, 검량선 그래프를 통해서 표적 물질의 농도를 계산하여 시료 내 표적 물질을 정량할 수 있는 것을 확인 하였다.
[부호의 설명]
10 양자점 11 제 2 프로브
20 금속 나노 입자 21 제 1 프로브
30 표적 물질

Claims (18)

  1. 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제2 프로브가 결합된 양자점을 시료에 첨가하여 배양하는 배양 단계를 포함하는 시료 내 표적 물질의 검출 방법이고,
    상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않고,
    상기 제 1 프로브 및 상기제 2 프로브는 표적 물질과 각각 결합하며,
    상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 각각 표적 물질과 결합하면 상기 양자점의 형광 강도가 강화되는 것인, 시료 내 표적 물질의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배양된 시료의 형광 강도를 측정하는 형광 측정 단계, 및
    상기 측정된 양자점을 대조군과 비교하여 시료 내 표적 물질의 유무를 판정하는 판정단계를 더 포함하는, 시료 내 표적 물질의 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노 입자는 구 형태의 금속 나노 입자 표면에 돌기가 형성된 요철구조를 갖는 것인, 시료 내 표적 물질의 검출 방법.
  4. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노 입자는 플라즈몬 특성을 갖는 것인, 시료 내 표적 물질의 검출 방법.
  5. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양자점은 가시광선 영역의 형광을 발하는 것인, 시료 내 표적 물질의 검출 방법.
  6. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 독립적으로 항원, 항체, 렉틴, 올리고당, 수용체 리간드, 앱타머, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 시료 내 표적 물질의 검출 방법.
  7. 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제2 프로브가 결합된 양자점을 시료에 첨가하여 배양하는 배양 단계를 포함하는 시료 내 표적 물질의 정량 방법이고,
    상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않고,
    상기 제 1 프로브 및 상기제 2 프로브는 표적 물질과 각각 결합하며,
    상기 제 1 프로브 및 상기 제 2 프로브가 모두 표적 물질과 결합하면 상기 양자점의 형광 강도가 강화되는 것인, 시료 내 표적 물질의 정량 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 배양된 시료의 형광 강도를 측정하는 형광 측정 단계, 및
    상기 측정된 시료 내 양자점의 형광 강도를 표준 시료의 양자점 형광 강도와 비교하여 시료 내 표적 물질을 정량하는 정량 단계를 더 포함하는, 시료 내 표적 물질의 정량 방법.
  9. 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노 입자는 구 형태의 금속 나노 입자 표면에 돌기가 형성된 요철구조를 갖는 것인, 시료 내 표적 물질의 정량 방법.
  10. 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노 입자는 플라즈몬 특성을 갖는 것인, 시료 내 표적 물질의 정량 방법.
  11. 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양자점은 가시광선 영역의 형광을 발하는 것인, 시료 내 표적 물질의 정량 방법.
  12. 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 독립적으로 항원, 항체, 렉틴, 올리고당, 수용체 리간드, 앱타머, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 시료 내 표적 물질의 정량 방법.
  13. 제 1 프로브가 결합된 금속 나노 입자 및 제 2 프로브가 결합된 양자점을 포함하고,
    상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 표적 물질과 각각 결합하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않으며, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 각각 표적 물질과 결합하면 양자점의 형광 강도가 강화되는, 시료 내 표적 물질 검출용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 금속 나노 입자는 구 형태의 금속 나노 입자 표면에 돌기가 형성된 요철구조를 갖는 것인, 시료 내 표적 물질 검출용 키트.
  15. 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노 입자는 플라즈몬 특성을 갖는 것인, 시료 내 표적 물질 검출용 키트.
  16. 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양자점은 가시광선 영역의 형광을 발하는 것인, 시료 내 표적 물질 검출용 키트.
  17. 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프로브 및 상기 제 2 프로브는 독립적으로 항원, 항체, 렉틴, 올리고당, 수용체 리간드, 앱타머, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 시료 내 표적 물질 검출용 키트.
  18. 제 1 프로브가 결합되고, 구 형태의 금속 나노 입자 표면에 돌기가 형성된 요철구조의 플라즈마 특성을 갖는 금속 나노 입자 및
    제 2 프로브가 결합되고, 가시광선 영역의 형광을 발하는 양자점을 포함하고,
    상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 상기 질병표지물질과 각각 결합하고, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 서로 결합하지 않으며, 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브 모두가 각각 질병표지물질과 결합하면 양자점의 형광 강도가 강화되는 것인, 질병표지물질 검출용 센서.
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