WO2021049634A1 - キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト - Google Patents

キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト Download PDF

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侑作 堅田
一男 坪田
秀樹 神取
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株式会社レストアビジョン
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    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • This disclosure relates to prevention and suppression of progression of retinal diseases, improvement of visual cognitive behavioral function, and enhancement of visual function.
  • Rhodopsin is a photosensitive receptor that has a 7-transmembrane structure in the retina of human animals, and is also applied in medicine.
  • the present disclosure provides: (Item X1) A nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein comprising at least a portion of the ion transport receptor rhodopsin and at least a portion of the G protein conjugated receptor rhodopsin and a nucleic acid sequence encoding a signal sequence.
  • (Item X2) The nucleic acid according to item X1, wherein the signal sequence is an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • (Item X3) The nucleic acid according to item X1 or 2, wherein the nucleic acid comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 26.
  • (Item X4) The nucleic acid according to any one of items X1 to 3, further comprising a nucleic acid sequence encoding a FLAG tag.
  • (Item X5) The nucleic acid according to any one of items X1 to 4, wherein the nucleic acid contains the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • (Item X6) The nucleic acid according to any one of items X1 to 3, wherein the nucleic acid is the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 26.
  • (Item X7) A polypeptide consisting of a chimeric protein and a signal sequence of an ion-transporting receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the nucleic acid of item X1 which comprises a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of any one of items X7-9.
  • the nucleic acid of item X10 further comprising a nucleic acid sequence encoding a FLAG tag.
  • nucleic acid of item X10 or 11 comprising a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein comprising at least a portion of an ion channel receptor rhodopsin and at least a portion of a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • nucleic acid comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • (Item X15) A polypeptide comprising a chimeric protein of a portion of an ion channel receptor rhodopsin and a portion of a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • (Item X16) The polypeptide according to item X15, wherein the polypeptide is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • (Item X17) The nucleic acid of item X13, comprising a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of item X15 or 16.
  • (Item X18) The nucleic acid according to item X17, which comprises a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • nucleic acid construct that contains a nucleic acid that allows expression.
  • nucleic acid construct of item X19 further comprising a vector.
  • nucleic acid construct according to item X20 wherein the vector is a viral vector.
  • nucleic acid construct according to item X20 or 21 wherein the vector is a retroviral vector, a lentiviral vector or an adeno-associated virus (AAV) vector.
  • AAV adeno-associated virus
  • nucleic acid construct according to any one of items X20 to 22, wherein the vector is an AAV vector.
  • a composition for gene transfer which comprises a construct.
  • a pharmaceutical composition comprising one or more of the cells.
  • (Item A1) A method of treating, preventing or controlling the progression of a retinal disease, disorder or condition in a subject.
  • a method comprising administering to a subject an effective amount of one or more of the cells.
  • (Item A2) A method of improving visual cognitive behavioral function in a subject.
  • nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12 the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and the nucleic acid according to any one of items X13 to 14 and 17 to 18.
  • a method comprising administering to a subject an effective amount of one or more of the cells.
  • (Item A3) A method of enhancing visual function in a subject The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and the nucleic acid according to any one of items X13 to 14 and 17 to 18. , The polypeptide of items X15-16, the nucleic acid construct of any one of items X19-24, the gene transfer composition of item X25, or any one of items X26-27. A method comprising administering to a subject an effective amount of one or more of the cells.
  • (Item A4) A method of enhancing the object recognition function in a subject, The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and the nucleic acid according to any one of items X13 to 14 and 17 to 18. , The polypeptide of items X15-16, the nucleic acid construct of any one of items X19-24, the gene transfer composition of item X25, or any one of items X26-27. A method comprising administering to a subject an effective amount of one or more of the cells.
  • (Item B1) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, any one of items X7 to 9, in the manufacture of a medicament for treating, preventing or suppressing the progression of a retinal disease, disorder or symptom.
  • (Item B2) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and items X13 to in the manufacture of a drug for improving visual cognitive-behavioral function.
  • (Item B4) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and items X13 to 14 in the manufacture of a drug for enhancing the object recognition function. And the nucleic acid according to any one of items 17 to 18, the polypeptide according to item X15 to 16, the nucleic acid construct according to any one of items X19 to 24, and the composition for gene transfer according to item X25. Alternatively, use of one or more of the cells according to any one of items X26-27.
  • (Item B5) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the nucleic acid according to any one of items X13 to 14 and 17 to 18, in the manufacture of a drug for introducing a gene, item X19 to Use of the gene for the nucleic acid construct according to any one of 24, or the cell according to any one of items X26-27.
  • (Item C1) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, and any one of items X7 to 9, for treating, preventing or suppressing the progression of a retinal disease, disorder or symptom.
  • the cell according to any one of 27. (Item C2) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and items X13 to 14 and 17 to improve visual cognitive-behavioral function.
  • (Item C3) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and items X13 to 14 and 17 to 18 for enhancing visual function.
  • the cell according to any one of the above. (Item C4) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the polypeptide according to any one of items X7 to 9, and items X13 to 14 and 17 to 18 for enhancing the object recognition function.
  • nucleic acid according to any one of the above items, the polypeptide according to the item X15 to 16, the nucleic acid construct according to any one of the items X19 to 24, or the cell according to any one of the items X26 to 27. (Item C5) The nucleic acid according to any one of items X1 to 6 and 10 to 12, the nucleic acid according to any one of items X13 to 14 and 17 to 18, or any of items X19 to 24 for introducing a gene.
  • a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein comprising at least a portion of the ion transport receptor rhodopsin and at least a portion of the G protein conjugated receptor rhodopsin and a nucleic acid sequence encoding a signal sequence.
  • the nucleic acid according to item 1 wherein the signal sequence is an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • the nucleic acid according to item 1 or 2 wherein the nucleic acid comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • (Item 5) The nucleic acid according to any one of items 1 to 4, wherein the nucleic acid contains the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • (Item 6) A polypeptide consisting of a chimeric protein and a signal sequence of an ion-transporting receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • (Item 7) Item 6. The polypeptide according to item 6, wherein the signal sequence is an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • (Item 8) The polypeptide according to item 7 or 8, wherein the polypeptide is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • nucleic acid according to item 1 which comprises a nucleic acid sequence encoding the polypeptide according to any one of items 6 to 8.
  • (Item 10) 9. The nucleic acid of item 9, further comprising a nucleic acid sequence encoding a FLAG tag.
  • (Item 11) 9. The nucleic acid of item 9 or 10, comprising a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein comprising at least a portion of an ion channel receptor rhodopsin and at least a portion of a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • nucleic acid according to item 12 wherein the nucleic acid comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 A polypeptide comprising a chimeric protein of a portion of an ion channel receptor rhodopsin and a portion of a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • polypeptide according to item 14 A polypeptide comprising a chimeric protein of a portion of an ion channel receptor rhodopsin and a portion of a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • polypeptide according to item 14 wherein the polypeptide is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • nucleic acid of item 12 which comprises a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of item 14 or 15.
  • nucleic acid according to item 16 which comprises a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • nucleic acid construct that contains a nucleic acid that allows expression in a cell operably linked to the nucleic acid according to any one of items 1-5 and 9-11 and / or the nucleic acid according to any one of items 12-13 and 16-17.
  • a nucleic acid construct that contains a nucleic acid that allows expression. (Item 19) The nucleic acid construct of item 18, further comprising a vector. (Item 20) 19. The nucleic acid construct according to item 19, wherein the vector is a viral vector.
  • (Item 21) The nucleic acid construct of item 19 or 20, wherein the vector is a retroviral vector, a lentiviral vector or an adeno-associated virus (AAV) vector.
  • (Item 22) The nucleic acid construct according to any one of items 19 to 21, wherein the vector is an AAV vector.
  • (Item 24) The nucleic acid according to any one of items 1 to 5 and 9 to 11, the nucleic acid according to any one of items 12 to 13 and 16 to 17, or the nucleic acid according to any one of items 18 to 23.
  • a composition for gene transfer which comprises a construct.
  • (Item 25) The nucleic acid according to any one of items 1 to 5 and 9 to 11, the polypeptide according to any one of items 6 to 8, and the nucleic acid according to any one of items 12 to 13 and 16 to 17.
  • a cell comprising one or more of the polypeptides according to items 14-15, or the nucleic acid constructs according to any one of items 18-23.
  • (Item 27) The nucleic acid according to any one of items 1 to 5 and 9 to 11, the polypeptide according to any one of items 6 to 8, and the nucleic acid according to any one of items 12 to 13 and 16 to 17.
  • a pharmaceutical composition comprising one or more of the cells.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of a nucleic acid construct encoding chimeric rhodopsin (first nucleic acid construct) and a nucleic acid construct encoding chimeric rhodopsin to which a signal sequence has been added (nucleic acid construct of the present disclosure).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of a multi-electrode array test in mice injected with the first nucleic acid construct.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of a multi-electrode array test in mice injected with the nucleic acid construct of the present disclosure.
  • FIG. 4 is a diagram quantifying the results of FIGS. 2 and 3.
  • FIG. 5 is a diagram quantifying the results of FIGS. 2 and 3. At a stimulus intensity of 1x10 15 photons / cm 2 / s, the nucleic acid construct of the present disclosure has a significantly higher number of firing cells per unit area.
  • FIG. 6 is a diagram evaluating the wavelength sensitivity of mice injected with the nucleic acid construct of the present disclosure.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an overall evaluation of visual evoked potentials of a mouse injected with the first nucleic acid construct and a mouse injected with the nucleic acid construct of the present disclosure.
  • FIG. 8 is a diagram showing a space designed for an evaluation experiment of the object recognition function. Tablet terminals were installed on both sides of the space where the mouse was placed, and it was designed to flow a video of the mouse on one side and an empty mouse cage on the other side with a brightness of 10 lux.
  • FIG. 9 is a diagram showing the evaluation test results of the object recognition function.
  • FIG. 10 is a diagram of measuring the GPCR activity of the protein encoded by the nucleic acid construct of the present disclosure using GloSensor TM.
  • FIG. 11 is a diagram in which the GPCR activity of a chimeric protein of an ion channel rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin was measured using GloSensor TM.
  • FIG. 12 shows the results of measuring the ion transport ability of the chimeric protein between the ion channel type rhodopsin and the G protein-coupled receptor rhodopsin by the patch clamp method.
  • FIG. 13 shows experimental data in which each gene was forcibly expressed in HEK293T cells using the lipofection method, and the change in cAMP concentration was measured with and without light stimulation.
  • Rhodopsin is a protein having a pigment called retinal inside, which is activated by receiving light, and a visual signal is transmitted to the brain.
  • Rhodopsin an ion-transporting receptor typified by microbial origin, can be repeatedly activated by absorbing light because retinal does not come off even when irradiated with light. Like the protein-coupled receptor rhodopsin, it cannot activate G proteins.
  • the chimeric rhodopsin of the ion-transporting receptor rhodopsin and the G protein-coupled receptor rhodopsin provided in the present disclosure is considered to have enhanced functions as compared with the conventional rhodopsin, in particular.
  • the ion-transporting receptor rhodopsin preferably one that can be derived from microorganisms and can be used repeatedly, is used, and the G protein-coupled receptor rhodopsin is derived from animals, preferably from mammals. When one is used, it is possible to obtain high activity via an endogenous G protein while retaining the function of repeatedly activating.
  • the chimeric proteins utilized in this disclosure are expressed with sufficient activity in mammals such as rodents and primates, as demonstrated in animal models.
  • the effect of preventing and suppressing the progression of retinal diseases, disorders or symptoms, in particular, preventing or suppressing the progression of retinitis pigmentosa can be achieved, or the visual cognitive-behavioral function (for example, improvement of the light-dark judgment function, avoidance of light and darkness). Improvement of function and / or improvement of crisis avoidance function) is brought about, or an effect of enhancing visual function such as improvement of visual acuity is produced.
  • the "ion transport type receptor rhodopsin” refers to any rhodopsin having a function of transporting ions, and examples thereof include an ion pump type receptor rhodopsin and an ion channel type receptor rhodopsin.
  • the three-dimensional structural compatibility with the G protein activation loop and the membrane transfer efficiency are considered to be important.
  • the ion-transporting receptor rhodopsin derived from algae or microorganisms activates the G protein.
  • the three-dimensional structural compatibility with the loop and the membrane transfer efficiency are good, and among them, those belonging to the genus Gloeobacter or Guillardia are preferable.
  • the microorganisms Gloeobacter violaseus belonging to the genus Gloeobacter and the guillardia theta belonging to the genus Gloeobacter are preferable.
  • rhodopsin for example, SEQ ID NO: 14
  • rhodopsin for example, SEQ ID NO: 16
  • G protein-coupled receptor rhodopsin derived from mammals and is derived from mammals. It is used in combination with the G protein-coupled receptor rhodopsin, preferably the G protein-coupled receptor rhodopsin of mammals such as bovine (eg, SEQ ID NO: 12) and primates such as humans (eg, SEQ ID NO: 10). Is preferable.
  • algae such as the genus Gloeobacter and the genus Gyraldia are also preferable in that they have an important property that they are well expressed in both Escherichia coli, which is a eubacterium, and human cells, which are eukaryotes.
  • the "ion pump type receptor rhodopsin” refers to any pump type rhodopsin having a function of transporting ions. When it senses light, it functions by actively transporting ions such as hydrogen ions, chloride ions, and sodium ions.
  • ion channel type receptor rhodopsin refers to any channel type rhodopsin having a function of transporting ions. When it senses light, it functions by allowing ions such as hydrogen ions, chloride ions, and sodium ions to flow into the cell.
  • G protein-coupled receptor rhodopsin is classified into a G protein-coupled receptor which is a kind of receptor existing on the cytoplasmic membrane of eukaryotic cells or on the constituent membrane inside the cell. Refers to rhodopsin.
  • the G protein-coupled receptor has seven ⁇ -helix structures that penetrate the cytoplasmic membrane, the N-terminal side is extracellular and the C-terminal side is intracellular, and three extracellular loops (Extracellular loop; ECL1 / 2/3). It is said that it has three intracellular loops (Intracellular loop; ICL1 / 2/3).
  • Rhodopsin is composed of apoprotein and chromophore retinal, and retinal absorbs light to isomerize and cause structural changes in the protein moiety, driving the intracellular signal transduction system via the G protein.
  • retinal disease, disorder or symptom refers to any disease, disorder or symptom related to the retinal, such as retinitis pigmentosa (retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, etc.) or retinopathy (for example,). , Diabetic retinopathy, proliferative retinopathy, simple retinopathy, etc.), flying mosquitoes, retinal detachment, retinal detachment (for example, rhegmatogenous retinal detachment, non-rhegmatogenous retinal detachment, etc.), etc.
  • disorders or symptoms include disorders such as visual acuity, contrast sensitivity, light-dark adaptation, color vision, and related symptoms.
  • the "visual cognitive-behavioral function” means that the visual information recognized by a visual organ (eye, etc.) functions as an action of a target organism, for example, a light-dark judgment function, a bright place. It means that it appears as an actual action such as a repellent function and a crisis avoidance function. It is a function that can be confirmed not only by confirming photosensitivity but also by actually verifying with an animal model or the like.
  • the "brightness / darkness determination function” means an ability or function capable of determining lightness / darkness.
  • the improvement is that it is sufficient if there is some improvement in the light / dark judgment function. For example, in addition to being able to do something that could not be judged as light / dark, it is necessary to improve something that can finally judge light / dark. Etc. are also included.
  • the "bright place repellent function” refers to the ability or function of being able to move away from a light source or avoid bright light.
  • the improvement means that the ability to avoid the bright spot is restored or enhanced.
  • the "crisis avoidance function” refers to a function or ability to avoid a crisis based on a visual function.
  • the improvement includes not only the regeneration of crisis avoidance ability but also the increase in level.
  • “enhancement” or “enhancement” of “visual function” refers to improvement, enhancement or enhancement of any visual function (for example, visual acuity, color vision, contrast sensitivity, light-dark adaptation, etc.).
  • improved of visual acuity means improvement or recovery of visual acuity.
  • visual acuity can be measured by a Snellen chart or an E chart in addition to a visual acuity test using a Randold ring, and can be expressed by decimal visual acuity or fractional visual acuity. These can also be displayed with logMAR visual acuity.
  • a mouse it can be measured by using a visual stimulus that manipulates the spatial frequency of the light-dark stripe pattern. Experimentally, it can also be determined by measuring the visual evoked potential.
  • the "object recognition function” means a function or ability to visually recognize an object.
  • the "object recognition function” requires not only a “brightness determination function” but also a certain level of “visual acuity”. The improvement is only required if there is some improvement in the object recognition function. For example, in addition to being able to do something that the object recognition function could not do, something that can finally recognize the object will be improved. Things are also included.
  • retina degenerative disease refers to any disease caused by degeneration of the retina, and examples thereof include retinitis pigmentosa and age-related macular degeneration.
  • retinitis pigmentosa is a hereditary disease in which abnormalities are observed in the retina, and is a disease in which photoreceptor cells and pigment epithelial cells of the retina are widely degenerated. Three symptoms appear: night blindness (difficult to see things in the dark), narrowing of the visual field (narrow vision), and decreased visual acuity. Of the photoreceptor cells, degeneration of only rod cells is called rod dystrophy, and degeneration of both rod cells and cone cells is called rod cone dystrophy. Research is being promoted on gene therapy, artificial retina, retinal regeneration, photoreceptor protection therapy, etc., but no cure has been established. It is very significant to suppress the progression because it is binocularly progressive and often leads to social blindness in childhood at an early stage.
  • retinitis pigmentosa includes autosomal recessive inheritance, autosomal dominant inheritance, and X chromosome recessive inheritance.
  • the most common type shows autosomal recessive inheritance, which accounts for about 35% of the total, the next most common type shows autosomal dominant inheritance, which accounts for 10% of the total, and the least is X-linked inheritance (X-chromosome recessive). It is a type showing inheritance), and this accounts for about 5% of the total.
  • progression suppression means that the progression of a certain disease (for example, retinitis pigmentosa) is suppressed, and the suppression has a reduced rate of deterioration as compared with the case without treatment.
  • the maintenance and improvement of disease levels are also included. If a certain disease has not developed, it falls under "prevention of onset”.
  • onset means that subjective symptoms appear from a state in which subjective symptoms of the disease do not appear, and for example, symptoms such as night blindness, narrowing of the visual field, photophobia, decreased visual acuity, and color vision deficiency are the subjective symptoms. Can be mentioned.
  • onset and “immediately after” refer to within a certain period of time from the time when the patient's subjective symptoms appear, for example, within 1 year, within 6 months, within 3 months, and the like. Not limited to.
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide refers to a polymer of amino acids of any length.
  • the polymer may be linear, branched or cyclic.
  • the amino acid may be natural or non-natural, or may be a modified amino acid.
  • the term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also includes naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • amino acid is a general term for organic compounds having an amino group and a carboxyl group.
  • amino acid sequence may be chemically modified.
  • any amino acid in the amino acid sequence may form a salt or a solvate.
  • any amino acid in the amino acid sequence may be L-type or D-type.
  • the protein according to the embodiment of the present disclosure contains the above-mentioned "specific amino acid sequence”.
  • Chemical modifications that amino acids contained in proteins undergo in vivo include, for example, N-terminal modification (eg, acetylation, myristoylation, etc.), C-terminal modification (eg, amidation, glycosylphosphatidylinositol addition, etc.), or side chain. Modifications (eg, phosphorylation, glycosylation, etc.) are known. It may be natural or non-natural as long as it meets the purposes of the present disclosure.
  • chimera protein, rhodopsin
  • the chimeric protein is a mixture of gene sequences derived from, for example, two or three or more organisms.
  • sequence information contained in the chimeric protein may include a sequence other than the sequence derived from the organism to be mixed.
  • polynucleotide refers to a polymer of nucleotides of arbitrary length.
  • the term also includes “oligonucleotide derivatives" or “polynucleotide derivatives”.
  • oligonucleotide derivative refers to an oligonucleotide or polynucleotide containing a derivative of a nucleotide or having an unusual bond between nucleotides, and is used interchangeably.
  • such an oligonucleotide includes, for example, 2'-O-methyl-ribonucleotide, an oligonucleotide derivative in which a phosphate diester bond in an oligonucleotide is converted into a phosphorothioate bond, and a phosphate diester bond in an oligonucleotide.
  • oligonucleotide derivatives converted to N3'-P5'phosphoroamidate bond an oligonucleotide derivative in which ribose and phosphate diester bond in the oligonucleotide are converted into peptide nucleic acid bond, and uracil in the oligonucleotide is C- 5 Oligonucleotide derivatives substituted with propynyl uracil, oligonucleotide derivatives in which uracil in the oligonucleotide is replaced with C-5 thiazole uracil, oligonucleotide derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with C-5 propynyl citosine, oligonucleotides Oligonucleotide derivatives in which cytosine in nucleotides is replaced with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which
  • a particular base sequence is also a conservatively modified variant (eg, a degenerate codon substitution) and a complementary sequence, as well as the explicitly indicated sequence. Is intended to be included.
  • the nucleic acid sequence is also referred to as a nucleic acid sequence, a nucleotide sequence, or the like in addition to a base sequence, but they all have the same meaning.
  • the degenerate codon substituent creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosin residue.
  • nucleic acid is also used herein interchangeably with genes, DNA such as cDNA, RNA such as mRNA, oligonucleotides, and polynucleotides.
  • DNA such as cDNA
  • RNA such as mRNA
  • oligonucleotides such as oligonucleotides
  • polynucleotides such as mRNA
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • Nucleic acids can be DNA or RNA herein.
  • the "gene” refers to a factor that defines a genetic trait, and the “gene” may refer to a "polynucleotide", an “oligonucleotide”, and a “nucleic acid”.
  • nucleic acid constructs As used herein, “nucleic acid constructs,” “constructs,” or “gene constructs” are used interchangeably with nucleic acids that are isolated from naturally occurring genes or combined and juxtaposed in a manner that does not exist naturally. , A nucleic acid molecule containing a vector.
  • homology of a gene means the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally, having “homology” means a high degree of identity or similarity.
  • Identity refers to the equivalent degree of sequence of the same amino acid
  • similarity refers to the equivalent degree of sequence including amino acids having similar properties in addition to the same amino acid. Therefore, the higher the homology of two genes, the higher the identity or similarity of their sequences. Whether or not the two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization under stringent conditions. When two gene sequences are directly compared, the DNA sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, and more preferably at least 80%, 90%.
  • a "homologous” or “homologous gene product” is a protein in another species, preferably a mammal, that exerts the same biological functions as the protein components of the complex further described herein. Means. Such homologues are also sometimes referred to as "ortholog gene products.” It is understood that such homologues, homologous gene products, ortholog gene products and the like can also be used as long as they meet the purposes of the present disclosure.
  • Amino acids can be referred to herein by either their generally known three-letter symbols or the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides can also be referred to by the generally recognized one-letter code.
  • comparison of amino acid sequence and base sequence similarity, identity and homology is calculated using default parameters using BLAST, a tool for sequence analysis.
  • the identity search can be performed using, for example, NCBI's BLAST 2.2.28 (issued 2013.4.2) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993).
  • the value of identity in the present specification usually refers to the value when the above BLAST is used and aligned under the default conditions.
  • the highest value is set as the identity value.
  • identity is evaluated in multiple regions, the highest value among them is set as the identity value.
  • Similarity is a number that takes into account similar amino acids in addition to identity.
  • Blastp can be used with default settings for algorithms when comparing amino acid sequences in BLAST. The measurement result is quantified as Positives or Ideas.
  • the homology of the amino acid sequence and the base sequence can be determined by the algorithm BLAST by Karlin and Altschul. Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990).
  • the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
  • the nucleic acid or protein used in the present disclosure may include a sequence in which one or more amino acids or nucleotides are substituted, deleted and / or added in the amino acid or base sequence of interest.
  • “one or more" in the chimeric protein full-length amino acid sequence is usually 50 amino acids or less, preferably 30 amino acids or less, and more preferably 10 amino acids or less (for example, 5 amino acids or less, 3 amino acids or less, 1 amino acid).
  • "one or more” is usually 6 amino acids or less, preferably 5 amino acids or less, and more preferably 4 amino acids or less (for example, 3 amino acids or less, 2 amino acids or less, 1). Amino acid).
  • the mutated amino acid residue be mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • the properties of the amino acid side chain include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids (C, M) with, carboxylic acid and amino acids with amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains Amino acids (H, F, Y, W) having (H, F, Y, W) can be mentioned (all in parentheses represent the one-
  • the "several” may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, 3, or 2, or may be less than or equal to any of these values.
  • the deleted chimeric protein can be produced, for example, by a site-specific mutagenesis method, a random mutagenesis method, biopanning using an antibody phage library, or the like.
  • a site-specific mutagenesis method for example, KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.) Can be used. It is possible to select an antibody having the same activity as the wild type from the mutant antibody into which the deletion or the like has been introduced by performing various characterizations such as FACS analysis and ELISA.
  • signal sequence refers to an amino acid sequence that, when functionally linked to a protein or peptide, facilitates transport of the linked protein or peptide to a functional position. If the protein to which the signal sequence is linked is a membrane protein, the endoplasmic reticulum transfer signal peptide or the endoplasmic reticulum export signal peptide may be linked.
  • the "endoplasmic reticulum transfer signal peptide” is an amino acid centered on a hydrophobic amino acid of about 5 to 10 amino acids attached to the amino terminus of a protein that promotes the transfer to the endoplasmic reticulum. If a particular amino acid sequence in a protein known to translocate to the endoplasmic reticulum is deleted or mutated and the translocation to the endoplasmic reticulum is significantly reduced, then that particular amino acid sequence is signaled to translocate to the endoplasmic reticulum. It can be judged that there is.
  • the "endoplasmic reticulum export signal peptide” is an amino acid that promotes the transport of a protein from the endoplasmic reticulum to other organelles such as the Golgi apparatus. ER2 sequences and the like are known. When a protein known to remain in the endoplasmic reticulum is given a specific amino acid sequence and is significantly transported from the endoplasmic reticulum compared to a protein that does not, the specific amino acid sequence is given by the endoplasmic reticulum export signal peptide. It can be judged that there is.
  • the amino acid and nucleic acid sequences of the chimeric proteins of the present disclosure have 70% or more, 80% or more, or 90% or more identity or similarity to the reference sequence. May be good.
  • 70% or more may be, for example, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more with respect to the amino acid sequence or the base sequence.
  • % Or more may be, for example, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more
  • “90% or more” may be, for example, 90, 95, 96, 97, 98, 99%. It may be the above, or it may be within the range of any two of them.
  • “Homology” may be calculated by calculating the ratio of the number of amino acids homologous in an amino acid sequence between two or a plurality of amino acids according to a method known in the art. Before calculating the proportions, align the amino acid sequences of the amino acid sequences to be compared and introduce gaps in part of the amino acid sequences if necessary to maximize the proportion of the same amino acids. Methods for alignment, methods for calculating proportions, comparison methods, and related computer programs are well known in the art (eg, BLAST, GENETYX, etc.). In the case of "identity”, the ratio of the same amino acids is calculated, and in the case of “similarity”, the ratio of similar amino acids is calculated. Similar amino acids include, but are not limited to, amino acids that can be conservatively substituted.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art.
  • a polynucleotide can be obtained by using a polynucleotide selected from the polynucleotides of the present disclosure as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. Specifically, using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized, hybridization is performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, and then the concentration is 0.1 to 2 times.
  • a polynucleotide that can be identified by washing the filter under 65 ° C. conditions using an SSC (saline-sodium citrate) solution (the composition of the 1-fold SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate).
  • SSC saline-sodium citrate
  • the composition of the 1-fold SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate.
  • stringent condition for example, the following conditions can be adopted. (1) Use low ionic strength and high temperature for cleaning (eg, at 50 ° C., 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate), (2).
  • a denaturing agent such as formamide is used during hybridization (eg, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin / 0.1% ficol / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM. 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), or (3) 20% formamide, 5 ⁇ SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 ⁇ denatured solution, 10 Incubate overnight at 37 ° C. in a solution containing% dextran sulfate and 20 mg / ml denatured shear salmon sperm DNA, then wash the filter with 1 ⁇ SSC at about 37-50 ° C.
  • formamide eg, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin / 0.1% ficol / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM. 750 mM sodium chloride, 75
  • the formamide concentration may be 50% or more.
  • the washing time may be 5, 15, 30, 60, or 120 minutes, or more. Multiple factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors that affect the stringency of the hybridization reaction. For details, see Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publicers, (1995) can be referred to. Examples of "highly stringent conditions" are 0.0015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, 65-68 ° C, or 0.015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, and 50% formamide, 42. °C. Hybridization, Molecular Cloning 2nd ed.
  • sequences containing only the A sequence or only the T sequence are preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions.
  • Moderate stringent conditions can be readily determined by one of ordinary skill in the art, eg, based on the length of the DNA, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, No. 3, Vol.
  • polypeptides used in the present disclosure are encoded by nucleic acid molecules that hybridize under highly or moderately stringent conditions to the nucleic acid molecules encoding the polypeptides specifically described herein. Polypeptides are also included.
  • a "purified" substance or biological factor is one in which at least some of the factors naturally associated with the substance or biological factor have been removed. .. Therefore, the purity of the biological factor in the purified biological factor is usually higher (ie, enriched) than in the state in which the biological factor is normally present.
  • the term "purified” as used herein is preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight. It means that the same type of biological factor is present.
  • the substance or biological factor used in the present disclosure is preferably a "purified" substance.
  • an "isolated" substance or biological factor eg, nucleic acid or protein
  • isolated varies depending on its purpose and therefore does not necessarily have to be expressed in purity, but if necessary, preferably at least 75% by weight, more preferably. Means that there are at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight of the same type of biological factor.
  • the substance used in the present disclosure is preferably an "isolated" substance or biological factor.
  • a "corresponding" amino acid or nucleic acid or moiety is a predetermined amino acid or nucleotide or moiety in a polypeptide or polynucleotide to be compared in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule (eg, rhodopsin).
  • Amino acids or nucleotides that have or are expected to have similar effects especially in the case of enzyme molecules, amino acids that are present at similar positions in the active site and make similar contributions to catalytic activity.
  • a complex molecule it means the corresponding moiety (for example, heparan sulfate, etc.).
  • corresponding amino acids are specified to be, for example, cysteineized, glutathioneized, SS bond formed, oxidized (eg, methionine side chain oxidation), formylation, acetylation, phosphorylation, glycosylation, myristylation, etc.
  • the corresponding amino acid can be the amino acid responsible for dimerization.
  • Such "corresponding" amino acids or nucleic acids may be regions or domains over a range. Thus, such cases are referred to herein as "corresponding" regions or domains. Such corresponding regions or domains are useful in designing complex molecules in the present disclosure.
  • a "corresponding" gene eg, a polynucleotide sequence or molecule
  • a gene for example, a polynucleotide sequence or a molecule
  • the gene corresponding to a gene can be the ortholog of that gene.
  • each human rhodopsin can find a corresponding rhodopsin in other animals, especially mammals.
  • Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art.
  • the corresponding gene in a certain animal is the reference gene for the corresponding gene (for example, rhodopsin, etc.), and the sequence of SEQ ID NO: 9 to 16 or the like is used as a query sequence of the animal. It can be found by searching the database containing the array.
  • a "part", “fragment” or “fragment” is a polypeptide having a sequence length from 1 to n-1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length n). Or a polynucleotide.
  • the length of the fragment can be appropriately changed according to its purpose. For example, in the case of a polypeptide, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and so on. Amino acids such as 15, 20, 25, 30, 40, 50 and above are mentioned, and lengths represented by integers not specifically listed here (eg, 11) are also suitable as lower limits. obtain.
  • a length represented by a non-integer (eg, 11) may also be a suitable lower bound.
  • such fragments fall within the scope of the present disclosure, for example, if the full length acts as a marker or target molecule, as long as the fragment itself also functions as a marker or target molecule. Is understood.
  • the term "activity” refers to the function of a molecule in the broadest sense herein. Activities are not intended to be limiting, but generally include the biological, biochemical, physical or chemical functions of the molecule. The activity, for example, activates, promotes, stabilizes, inhibits, suppresses, or destabilizes enzymatic activity, the ability to interact with other molecules, and the function of other molecules. Includes the ability to do, stability, and the ability to localize to specific intracellular locations. Where applicable, the term also relates to the function of protein complexes in the broadest sense. As used herein, "biological activity” includes activation of photochemical reactions and the like.
  • the "functional equivalent” means an arbitrary entity having the same target function but a different structure with respect to the target entity.
  • the functional equivalent of "rhodopsin” or its chimera is not rhodopsin or its chimera itself, but a variant or variant of rhodopsin or its chimera (eg, amino acid sequence variant), rhodopsin or its chimera.
  • rhodopsin or its antibody itself or a variant or variant of this rhodopsin or its chimera at the time of action eg, rhodopsin or its chimera or It is understood that includes a nucleic acid encoding rhodopsin or a chimeric variant or variant thereof, and a vector, cell, etc. containing the nucleic acid).
  • one or more amino acids inserted, substituted and / or deleted, or added to one or both ends of the amino acid sequence can be used.
  • insertion, substitution and / or deletion of one or more amino acids in an amino acid sequence, or addition to one or both ends is a well-known method such as a site-specific mutagenesis method. It means that the modification has been made by a technical method or by a natural mutation, such as by substituting a plurality of amino acids that can occur naturally.
  • the modified amino acid sequence includes, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 9, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 2 amino acids inserted, substituted, or missing. It can be lost, or added to one or both ends.
  • the modified amino acid sequence is preferably an amino acid sequence in which the amino acid sequence has one or more (preferably one or several or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions in the rhodopsin amino acid sequence. You may.
  • drug As used herein, “drug”, “drug” or “factor” (both of which correspond to agents in English) are used interchangeably as long as they can achieve their intended purpose. It may also be a substance or other element (eg, energy such as light, radioactivity, heat, electricity). Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (including, for example, cDNA, DNA such as genomic DNA, RNA such as mRNA), poly.
  • cDNA DNA such as genomic DNA
  • RNA such as mRNA
  • Saccharides oligosaccharides, lipids, organic small molecules (eg, hormones, ligands, signaling substances, organic small molecules, molecules synthesized with combinatorial chemistries, small molecules that can be used as pharmaceuticals (eg, small molecule ligands, etc.)) , These complex molecules include, but are not limited to.
  • parenteral administration it may be formulated in a unit-dose ampoule or in a multi-dose container or tube, and additives such as stabilizers, buffers, preservatives, and isotonic agents may also be used. It may be contained.
  • the preparation in the case of parenteral administration may be formulated into a powder that can be redissolved with an appropriate carrier (sterilized water or the like) at the time of use.
  • Parenteral administration includes intravitreal administration, subconjunctival administration, anterior chamber administration, eye drop administration, etc., and intravitreal administration is preferable.
  • the compositions and the like of the present disclosure can be used for treatment, prevention, suppression of progression, etc. by administering to humans by the method described above.
  • treatment refers to a disease or disorder (eg, retinal degenerative disease) that, in the event of such a condition, prevents the exacerbation of such disease or disorder, preferably maintains the status quo. More preferably, it refers to alleviation, more preferably withdrawal, and includes being able to exert a symptom-improving effect or a preventive effect on a patient's disease or one or more symptoms associated with the disease. Diagnosis in advance and appropriate treatment is called “companion treatment”, and the diagnostic agent for that purpose is sometimes called “companion diagnostic agent”. Since the present disclosure covers genetic disorders, the gene may be tested in advance to treat the patient.
  • a disease or disorder eg, retinal degenerative disease
  • the "therapeutic agent (drug)” means any drug capable of treating a target condition (for example, retinal degenerative disease) in a broad sense.
  • the "therapeutic agent” may be a pharmaceutical composition comprising an active ingredient and one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition can be produced, for example, by mixing the active ingredient with the above carrier and using any method known in the technical field of pharmaceutics.
  • the therapeutic agent is not limited in the form of use as long as it is used for treatment, and may be an active ingredient alone or a mixture of an active ingredient and an arbitrary ingredient.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and may be, for example, a solid or a liquid (for example, a buffer solution).
  • prevention means to prevent a certain disease or disorder (for example, retinal degenerative disease) from becoming such a state before it becomes such a state.
  • the agent of the present disclosure can be used for diagnosis, and if necessary, the agent of the present disclosure can be used to prevent, for example, retinal degenerative diseases, or to take preventive measures.
  • preventive drug drug
  • the term “preventive drug (drug)” broadly refers to any drug that can prevent a desired condition (for example, a disease such as retinal degenerative disease).
  • kits are usually divided into two or more compartments, and parts to be provided (for example, nucleic acid, nucleic acid construct, cell into which a nucleic acid of interest has been transgenic, test agent, diagnostic agent, treatment).
  • the form of this kit is preferred when the purpose is to provide a composition that should not be mixed and provided for stability and the like, but is preferably mixed and used immediately before use.
  • kits preferably use the parts provided (eg, nucleic acids, nucleic acid constructs, cells into which the nucleic acid of interest has been transgenic, test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, or reagents.
  • kits are usually a test agent, a diagnostic agent. , Instructions describing how to use therapeutic agents, antibodies, etc. are included.
  • the term "active ingredient” refers to an ingredient contained in an amount necessary for obtaining the desired therapeutic, prophylactic or inhibitory effect of the composition of the present disclosure, etc., and the effect is less than a desired level. Other components may also be contained, as long as they are not impaired.
  • the pharmaceuticals, compositions and the like of the present disclosure may be formulated.
  • the route of administration of the pharmaceuticals, compositions and the like of the present disclosure may be oral or parenteral, and can be appropriately set according to the form of the preparation and the like.
  • the "instructions" (including package inserts and labels used by the US FDA) describe the method of using this disclosure to a doctor or other user.
  • This instruction sheet contains words instructing the detection method of the present disclosure, how to use a diagnostic agent, or administration of a medicine or the like.
  • the instruction sheet may include words instructing the administration site to be administered orally or to the retina (for example, by injection).
  • This instruction is prepared and approved by the regulatory agency of the country in which this disclosure is implemented (eg, Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.). It is clearly stated that it has been received. Instructions are so-called package inserts and labels, which are usually provided in paper media, but are not limited thereto, and are, for example, electronic media (for example, homepages and e-mails provided on the Internet). ) Can also be provided.
  • the present disclosure provides a novel nucleic acid construct of chimeric rhodopsin.
  • the chimeric rhodopsin used in the present disclosure may be any chimeric rhodopsin as long as the object of the present disclosure can be achieved.
  • the chimeric rhodopsin used in the present disclosure is typically a chimeric protein containing at least a portion of the ion transport receptor rhodopsin and at least a portion of the G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • a part of the animal-derived G protein-coupled receptor rhodopsin is fused with a part of the reusable microbial-derived ion-transporting receptor rhodopsin to form a microbial-derived ion-transporting type.
  • the repetitive activation function of the receptor ion channel type receptor rhodopsin it is possible to obtain high activity via the endogenous G protein by the G protein-coupled receptor, which is further disclosed in the present disclosure.
  • By producing a nucleic acid construct it is possible to further improve the therapeutic, ameliorating, preventive, and progression-suppressing effects on excellent retinal diseases, disorders and symptoms.
  • the disclosure provides a nucleic acid construct encoding a chimeric rhodopsin and a signal sequence comprising at least a portion of the ion transport receptor rhodopsin and at least a portion of the G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the disclosure provides a nucleic acid construct of chimeric rhodopsin comprising at least a portion of the ion channel receptor rhodopsin and at least a portion of the G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • algae rhodopsin can be used as the ion channel type receptor rhodopsin.
  • the algae may be Guillardia theta.
  • the amino acid sequences of the second loop on the cytoplasmic side and / or the third loop on the cytoplasmic side of the rhodopsin amino acid sequence of Guillardia theta are G protein-coupled. It has been replaced with the amino acid sequence of the cytoplasmic second loop and / or the cytoplasmic third loop of the type receptor rhodopsin.
  • the ion transport type receptor rhodopsin used in the chimeric protein of the present disclosure an ion pump type receptor rhodopsin and an ion channel type receptor rhodopsin can be used.
  • the ion-transporting receptor rhodopsin is preferably derived from a microorganism, for example, a cyanobacteria (cyanobacteria) is typical, and for example, a eubacteria such as the genus Gloeobacter. , Volvox, Chlamydomonas, Gillardia, and other eukaryotes. Examples of the genus Gloeobacter include Gloeobacter violaceus and the like.
  • Examples of the genus Volvox include Volvox carteri and the like.
  • Examples of the genus Chlamydomonas include Chlamydomonas reinhardtii.
  • Examples of the genus Guillardia include Guillardia theta.
  • the G protein-coupled receptor rhodopsin used in the chimeric proteins of the present disclosure is typically of animal origin, and rodents, artiodactyls, artiodactyls, primates, meats. Rhodopsin derived from the above is preferable, cloven-hoofed animals or primates are preferable, and primate rhodopsin is more preferable.
  • preferred G protein-coupled receptor rhodopsin includes, for example, rhodopsin derived from cattle, humans, mice, rats, cats, dogs, pigs, sheep, horses and the like. Of these, bovine or human-derived rhodopsin is particularly preferred.
  • the chimeric protein encoded by the nucleic acid constructs and the like of the present disclosure is a chimeric protein containing a part of an ion transport type receptor rhodopsin and a part of a G protein-coupled receptor rhodopsin, and is a 7-transmembrane protein.
  • a chimeric protein containing a part of the ion-transporting receptor rhodopsin and a part of the G protein-coupled receptor rhodopsin has a function of repeatedly activating the ion-transporting receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor.
  • the chimeric protein encoded by the nucleic acid construct of the present disclosure is the cytoplasmic side of the amino acid sequence of the ion-transporting receptor rhodopsin because the activities of both are maintained high and particularly high visual function regeneration ability is exhibited.
  • the amino acid sequence of the second loop and / or the third loop on the cytoplasmic side of Rhodopsin was replaced with the amino acid sequence of the second loop on the cytoplasmic side and / or the third loop on the cytoplasmic side of the G protein-conjugated receptor rhodopsin. It is preferable to have.
  • the "second loop on the cytoplasmic side” and the "third loop on the cytoplasmic side” refer to the loops located at the second from the N-terminal side and the third from the N-terminal side, respectively, among the seven loops. ..
  • the chimeric protein encoded by the nucleic acid construct of the present disclosure has an amino acid sequence in which glutamic acid corresponding to position 132 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (GR) is replaced with glutamine.
  • glutamine-substituted amino acid sequence include, but are not limited to, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the method for obtaining nucleic acid such as DNA of the present disclosure is not particularly limited, but is limited to a method for obtaining cDNA by reverse transcription from mRNA (for example, RT-PCR method), a method for preparing from genomic DNA, and a method for synthesizing by chemical synthesis. Examples thereof include known methods such as a method for isolating from a genomic DNA library and a cDNA library (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-29599).
  • the chimeric protein encoded by the nucleic acid construct of the present disclosure can be prepared, for example, by using a transformant into which an expression vector containing the nucleic acid construct of the present disclosure has been introduced. For example, first, this transformant is cultured under appropriate conditions to synthesize a chimeric protein encoded by the nucleic acid construct or the like of the present disclosure. Then, the chimeric protein of the present disclosure can be obtained by recovering the synthesized protein from the transformant or the culture medium.
  • the "appropriate vector” may be any vector that can replicate, retain or self-proliferate in various hosts of prokaryotes and / or eukaryotes, and can be appropriately selected depending on the purpose of use.
  • a high copy vector can be selected when a large amount of nucleic acid such as the nucleic acid construct of the present disclosure is desired to be obtained, and an expression vector can be selected when a polypeptide (chimeric protein) is to be obtained.
  • Specific examples thereof are not particularly limited, and examples thereof include known vectors described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-29599.
  • the expression vector can be used not only for synthesizing chimeric proteins but also for the compositions of the present disclosure. That is, the composition of the present disclosure and the like may contain an expression vector in which the above-mentioned nucleic acid construct of the present disclosure and the like are incorporated as an active ingredient.
  • the vector in this case a vector that can be introduced into human cells is used.
  • an adeno-associated virus vector (AAV vector) and a lentivirus vector are suitable.
  • the vector introduction method can be appropriately selected according to the type of vector and host. Specific examples thereof include, but are not limited to, known methods such as a protoplast method and a competent method (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-29599) when a bacterium is used as a host.
  • known methods such as a protoplast method and a competent method (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-29599) when a bacterium is used as a host.
  • the expression vector is used as an active ingredient of the visual function regenerating agent or the visual function deterioration preventive agent of the present disclosure, it can be introduced by injecting the above-mentioned AAV vector or the like into the eye, for example.
  • the host into which the expression vector is introduced may be any host that is compatible with the expression vector and can be transformed, and specific examples thereof are not particularly limited, but known natural cells such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells. Alternatively, artificially established cells (see JP-A-11-295999), or animals such as humans and mice can be mentioned.
  • the transformant is appropriately selected from known nutrient media according to the type of transformant and the like so that a large amount of chimeric protein can be easily obtained, and the temperature, pH of the nutrient medium, culture time and the like are adjusted. It can be adjusted as appropriate (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-29599).
  • the method for isolating and purifying the chimeric protein is not particularly limited, and known methods such as a method using solubility, a method using a difference in molecular weight, and a method using electric charge (for example, JP-A-11-295999). (See Gazette).
  • the nucleic acid constructs and the like of the present disclosure may include any of the following: (A) Nucleotide sequence containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 26; (B) In the nucleic acid sequence shown in (A), a polynucleotide containing a nucleic acid sequence containing one or more nucleotides of substitution, addition, deletion or a combination thereof; (C) A polypeptide comprising a nucleic acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the nucleic acid sequence shown in (A) or (B) and having biological activity.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having (E) A polynucleotide that is an allelic variant of the nucleic acid sequence of any one of (A) to (D) and encodes a polypeptide having biological activity; (F) A polynucleotide encoded by a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 27; (G) A polynucleotide encoding a polypeptide having biological activity, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, additions, deletions or combinations thereof in the amino acid sequence of (F); (H) Encodes a polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in (F) or (G) and having biological activity.
  • Polynucleotides or polynucleotides, which contain fragments of the nucleic acid sequences shown in (I) (F)-(H).
  • the chimeric protein that is a polynucleotide and is encoded by the polynucleotide has biological activity.
  • the nucleic acid constructs and the like of the present disclosure may encode a polypeptide comprising the following amino acid sequence: (A) The amino acid sequence or fragment thereof according to SEQ ID NO: 2, 4 or 27; (B) A polypeptide having biological activity, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, additions, deletions or combinations thereof in the amino acid sequence of (a); (C) A polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in (a) or (b) and having biological activity; (D) A polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 27; (E) In the nucleic acid sequence shown in (d), a polypeptide having biological activity encoded by a nucleic acid sequence containing one or more nucleotides of substitution, addition, deletion or a combination thereof; (f) (d) or A polypeptide having biological activity encoded by a nucleic acid sequence having at
  • the chimeric protein of the present disclosure which comprises a polypeptide and has biological activity, which comprises a fragment of, may comprise an amino acid sequence encoded by a nucleic acid according to any of the following: (Aa) Nucleic acid having the base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4 or 27 or the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 26 (bb) Amino acid according to SEQ ID NO: 2, 4 or 27 Nucleic acid having a base sequence encoding a sequence or a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 26 and a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions (cc) SEQ ID NO: 2, 4 or Nucleic acid (dd) SEQ ID NO: 2 having a base sequence
  • the nucleic acid of the present disclosure may be a nucleic acid sequence having at least 6 or more triplets in common with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 26.
  • the nucleic acid constructs of the present disclosure are the nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3 or 26 among the nucleic acid sequences encoding the same amino acids as SEQ ID NOs: 1, 3 or 26, and 6, 9 to.
  • nucleic acid sequence encoding the second loop on the cytoplasmic side of the above-mentioned G protein-coupled receptor rhodopsin those having the following nucleic acid sequences are preferable.
  • A Nucleotide sequence containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 18;
  • B In the nucleic acid sequence shown in (A), a polynucleotide containing a nucleic acid sequence containing one or more nucleotides of substitution, addition, deletion or a combination thereof;
  • C A polypeptide comprising a nucleic acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the nucleic acid sequence shown in (A) or (B) and having biological activity.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having (E) A polynucleotide that is an allelic variant of the nucleic acid sequence of any one of (A) to (D) and encodes a polypeptide having biological activity; (F) A polynucleotide encoded by a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25; (G) A polynucleotide encoding a polypeptide having biological activity, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, additions, deletions or combinations thereof in the amino acid sequence of (F); (H) Encodes a polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in (F) or (G) and having biological activity. , Polynucleotides; or polynucleotides comprising fragments of the nucleic acid sequences shown in (I) (F)-(H).
  • the nucleic acid sequence encoding the second loop on the cytoplasmic side of the G protein-coupled receptor rhodopsin described above is preferably a nucleic acid sequence having at least two triplets in common with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the second loop on the cytoplasmic side of the above-mentioned G protein-coupled receptor rhodopsin preferably has an amino acid sequence encoded by the nucleic acid described below.
  • nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25 is preferably any of the following.
  • the nucleic acid sequence encoding the cytoplasmic third loop of the G protein-coupled receptor rhodopsin described above has at least one triplet in common with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25. preferable.
  • nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25 (Ii) A nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25 and a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions; (Iii) A nucleic acid having a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25; (Iv) Nucleic acid consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25: (X) Nucleic acid having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 25 or a fragment thereof; (Y) Nucleic acid having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% identity to (x); (Z) Nucleic acid in which one
  • nucleic acid sequence encoding the third loop on the cytoplasmic side of the above-mentioned G protein-coupled receptor rhodopsin those having the following nucleic acid sequences are preferable.
  • A Nucleotide sequence containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 20 or 21;
  • B In the nucleic acid sequence shown in (A), a polynucleotide containing a nucleic acid sequence containing one or more nucleotides of substitution, addition, deletion or a combination thereof;
  • C A polypeptide comprising a nucleic acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the nucleic acid sequence shown in (A) or (B) and having biological activity.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having (E) A polynucleotide that is an allelic variant of the nucleic acid sequence of any one of (A) to (D) and encodes a polypeptide having biological activity; (F) A polynucleotide encoded by a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (G) A polynucleotide encoding a polypeptide having biological activity, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, additions, deletions or combinations thereof in the amino acid sequence of (F); (H) Encodes a polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in (F) or (G) and having biological activity. , Polynucleotides; or polynucleotides comprising fragments of the nucleic acid sequences shown in (I) (F)-(H).
  • the third loop on the cytoplasmic side of the G protein-coupled receptor rhodopsin described above preferably has an amino acid sequence encoded by the nucleic acid described in any of the following: (L) Nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (K) A nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 and a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions; (M) Nucleic acid having a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (N) A nucleic acid consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, and at least 95% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the nucleic acid encoding the cytoplasmic third loop of the G protein-coupled receptor rhodopsin is preferably one of the following: (L) Nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (K) A nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 and a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions; (M) Nucleic acid having a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (N) Nucleic acid consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (Xx) Nucleic acid having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 20 or a fragment thereof; (L)
  • This disclosure also includes: (A) Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence or fragment thereof set forth in SEQ ID NO: 2, 4 or 27; (B) The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 26 or a fragment thereof; (C) Nucleic acid having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% identity to (A) or (B); (D) Nucleotide sequence in which one or more nucleotides are substituted, added and / or deleted with respect to any one of (A) to (C); (E) A base sequence that hybridizes to any of (A) to (D) under stringent conditions. Also provided is a nucleic acid having one of the above, wherein the protein encoded by the nucleic acid has biological activity.
  • the disclosure provides a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein of an ion channel receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the ion channel receptor rhodopsin include, but are not limited to, rhodopsins derived from microorganisms belonging to eukaryotes such as Volvox, Chlamydomonas, and Guillardia.
  • the ion channel receptor rhodopsin is, as the genus Guillardia, rhodopsin of the guillardia theta, and the G protein-coupled receptor rhodopsin is bovine rhodopsin.
  • the nucleic acid constructs and the like of the present disclosure may comprise any of the following: (A) a base sequence comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7; (B) In the nucleic acid sequence shown in (A), a polynucleotide containing a nucleic acid sequence containing one or more nucleotides of substitution, addition, deletion or a combination thereof; (C) A polypeptide comprising a nucleic acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the nucleic acid sequence shown in (A) or (B) and having biological activity.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having (E) A polynucleotide that is an allelic variant of the nucleic acid sequence of any one of (A) to (D) and encodes a polypeptide having biological activity; (F) A polynucleotide encoded by a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; (G) A polynucleotide encoding a polypeptide having biological activity, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, additions, deletions or combinations thereof in the amino acid sequence of (F); (H) Encodes a polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in (F) or (G) and having biological activity.
  • Polynucleotides or polynucleotides, which contain fragments of the nucleic acid sequences shown in (I) (F)-(H).
  • the chimeric protein that is a polynucleotide and is encoded by the polynucleotide has biological activity.
  • the nucleic acid of the present disclosure may be a nucleic acid sequence having at least 14 or more triplets in common with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleic acid construct of the present disclosure comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, among the nucleic acid sequences encoding the same amino acids as SEQ ID NO: 7, and 1, 2, 4 to 9, 11 to 17, 21, 22, 27-30, 33, 34, 36-41, 43, 45, 48, 49, 51, 54, 56-58, 60, 63, 65, 68, 70, 71-75, 77-78, 81, 83, 84, 86, 89, 90, 92, 93, 95, 97-99, 102, 103, 111, 113, 114, 123, 125, 130, 131-137, 139, 142, 143, 146, 148 to 153, 156, 160, 161, 165, 167, 168, 170
  • the nucleic acid constructs and the like of the present disclosure may encode a polypeptide comprising the following amino acid sequence: (A) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or a fragment thereof; (B) A polypeptide having biological activity, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, additions, deletions or combinations thereof in the amino acid sequence of (a); (C) A polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in (a) or (b) and having biological activity; (D) A polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; (E) In the nucleic acid sequence shown in (d), a polypeptide having biological activity encoded by a nucleic acid sequence containing one or more nucleotides of substitution, addition, deletion or a combination thereof; (f) (d) or A polypeptide having biological activity encoded by a nucleic acid sequence having at least 70%, at
  • Polypeptide with (H) A polypeptide having biological activity encoded by an allelic variant of the nucleic acid sequence of any one of (d) to (g); or the amino acid sequence shown in (i) (a)-(h).
  • the chimeric protein of the present disclosure which comprises a polypeptide and has biological activity, which comprises a fragment of, may comprise an amino acid sequence encoded by a nucleic acid according to any of the following: (Aa) Nucleic acid having the base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 (bb) Base sequence encoding the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 7 Nucleic acid having a base sequence complementary to the described base sequence and a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions (cc) One or more amino acids are substituted, deleted and / in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • nucleic acid (dd) SEQ ID NO: 8 encodes an amino acid sequence having a base sequence encoding the added amino acid sequence and having biological activity and having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in nucleic acid (dd) SEQ ID NO: 8.
  • Bbb Nucleic acid having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% identity to (aaa);
  • Ccc A base sequence in which one or more nucleotides are substituted, added and / or deleted with respect to (aaa) or (bbbb);
  • a nucleic acid containing, and the chimeric protein has biological activity.
  • This disclosure also includes: (A) Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or a fragment thereof; (B) Nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a fragment thereof; (C) Nucleic acid having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% identity to (A) or (B); (D) Nucleotide sequence in which one or more nucleotides are substituted, added and / or deleted with respect to any one of (A) to (C); (E) A base sequence that hybridizes to any of (A) to (D) under stringent conditions. Also provided is a nucleic acid having one of the above, wherein the protein encoded by the nucleic acid has biological activity.
  • biological activity in the present specification, the function of the G protein-coupled receptor of the loop (for example, membrane translocation efficiency) can be mentioned, and in addition, retinal diseases (for example, retina) can be mentioned.
  • Retinitis pigmentosa) prevention and progression suppression, visual cognitive-behavioral function (eg, improvement of photopic vision function, improvement of photopic vision avoidance function and / or crisis avoidance function), and function capable of exerting effects of visual acuity enhancement Can be mentioned.
  • Biological activity in the case of loops can include, but is not limited to, functions such as three-dimensional structural compatibility and membrane transfer efficiency.
  • the function of the loop may be evaluated by the function of the entire incorporated protein (here, rhodopsin).
  • the chimeric protein of the present disclosure and the nucleic acid encoding the same are used for preventing or suppressing the progression of retinal diseases, disorders or symptoms, visual cognitive behavior function (for example, improvement of light / darkness determination function, avoidance of bright spots).
  • visual cognitive behavior function for example, improvement of light / darkness determination function, avoidance of bright spots.
  • Applications have been found to improve function (and / or crisis avoidance function) or object recognition function, and to bring about visual function enhancing effects such as visual acuity improvement.
  • retinitis pigmentosa One of the eye diseases for which there is no cure to date is retinitis pigmentosa, atrophic age-related macular degeneration, and other retinal degenerative diseases. There is. It is said that the total number of patients worldwide is over 130 million. In Japan, retinitis pigmentosa is the third leading cause of premature blindness, and age-related macular degeneration is the fourth leading cause.
  • the development of a therapeutic method has been greatly desired due to the large number of patients and the severity of visual impairment, but this disclosure may solve the problem.
  • the photoreceptor cells which are the primary neurons of vision, cannot be regenerated once they are lost, but in retinitis pigmentosa and atrophic age-related yellow spot degeneration, they are bipolar, which are the secondary and tertiary neurons of vision. Since the cells and retinal ganglion cells are preserved, it is considered that this disclosure contributes to the effectiveness.
  • the present disclosure is a gene transfer therapy using optogenetics, which is expected to have a safe and long-term visual regeneration effect with less invasiveness. Efficient and safe visual reproduction is achieved by using the intrinsic G protein signal cascade and the original more physiological phototransmission pathway that utilizes the channel, which is completely different from the conventional method of introducing photoactivated ion channels. It has become possible.
  • the conventional method of introducing photoactivated ion channels has been regeneration for patients with already advanced retinal degeneration, but this method uses a retinal metabolic regeneration system called VisualCycle, which is necessary for normal light transmission. Since it is not required, it can be expected to have an effect of suppressing the progression of retinal degeneration. This proved that it can be applied not only to patients with advanced retinal degeneration but also to prevention of progression in patients in the early stage.
  • VisualCycle retinal metabolic regeneration system
  • the disclosure provides a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein of an ion transport receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin and a nucleic acid sequence encoding a signal sequence.
  • the signal sequence is an endoplasmic reticulum translocation signal sequence or an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • the signal sequence is an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • the endoplasmic reticulum export signal is an ER2 signal.
  • the nucleic acids of the present disclosure comprise or consist of the nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1 or 26. In some embodiments, the nucleic acids of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 relative to the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 26. Containing or consisting of nucleic acid sequences having%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity.
  • the nucleic acids of the present disclosure may further comprise a nucleic acid sequence encoding a FLAG tag.
  • the nucleic acids of the present disclosure include the nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the nucleic acids of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, relative to the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Includes nucleic acid sequences with 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity.
  • the disclosure provides a polypeptide comprising a chimeric protein and signal sequence of an ion transport receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the polypeptide of the present disclosure comprises a chimeric protein and signal sequence of an ion transport receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the signal sequence is an endoplasmic reticulum translocation signal sequence or an endoplasmic reticulum export signal sequence. In certain embodiments, the signal sequence is an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • the polynucleotides of the present disclosure comprise or consist of a sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 27. In certain embodiments, the polynucleotides of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 27. , 96%, 97%, 98% or 99% of polynucleotides containing or consisting of sequence identity.
  • the disclosure comprises or consists of a polypeptide encoded by the polynucleotide of the disclosure.
  • the polypeptides of the present disclosure comprise or consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 27.
  • the polypeptides encoded by the polynucleotides of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 27. Contains or consists of sequences having 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity.
  • the disclosure comprises or consists of the nucleotide sequences of the present disclosure.
  • the nucleic acids of the present disclosure comprise or consist of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleic acids of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. , Contains or consists of nucleic acids having 97%, 98% or 99% sequence identity.
  • the disclosure provides a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein of an ion channel receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the nucleic acids of the present disclosure may comprise a nucleic acid sequence encoding a signal sequence.
  • the signal sequence is an endoplasmic reticulum translocation signal sequence or an endoplasmic reticulum export signal sequence. In certain embodiments, the signal sequence is an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • the nucleic acid of the present disclosure comprises or consists of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleic acids of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, relative to the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7. Containing or consisting of nucleic acid sequences having 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity.
  • the nucleic acids of the present disclosure may comprise a nucleic acid sequence encoding any FLAG tag.
  • the disclosure provides a polypeptide comprising an ion channel receptor rhodopsin and a chimeric protein and signal sequence of a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the polypeptides of the disclosure consist of a chimeric protein and signal sequence of an ion channel receptor rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin.
  • the signal sequence is an endoplasmic reticulum translocation signal sequence or an endoplasmic reticulum export signal sequence. In certain embodiments, the signal sequence is an endoplasmic reticulum export signal sequence.
  • the polypeptide of the present disclosure comprises or consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. In certain embodiments, the polypeptides of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. Contains or consists of polypeptides having%, 97%, 98% or 99% sequence identity.
  • the disclosure comprises or comprises a nucleic acid encoding a polypeptide of the present disclosure.
  • the nucleic acids of the present disclosure comprise or consist of a nucleic acid encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleic acids of the present disclosure are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. , Contains or consists of nucleic acids encoding polypeptides having 97%, 98% or 99% sequence identity.
  • the disclosure provides a nucleic acid construct comprising the nucleic acids of the present disclosure and nucleic acids operably linked to the nucleic acids to enable expression in cells.
  • the nucleic acid constructs of the present disclosure further comprise a vector.
  • the vector is selected from the group consisting of viral vectors, plasmid vectors, cosmid vectors, artificial chromosome vectors and phosmid vectors.
  • the vector is a viral vector.
  • the viral vector is selected from the group consisting of an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector (AAV), a retroviral vector and a lentiviral vector.
  • the viral vector is an adeno-associated virus vector (AAV).
  • the AAV is AAV-DJ, AAV-2 or AAV-6.
  • the AAV can be AAV-DJ, or AAV-6.
  • the efficiency of infection of bipolar cells is higher in DJ type and 6 type than in type 2 AAV.
  • the present disclosure is a composition for gene transfer comprising the nucleic acid or nucleic acid construct of the present disclosure.
  • the compositions for gene transfer of the present disclosure are administered by injection.
  • the composition for gene transfer of the present disclosure is administered intravitreally.
  • the compositions for gene transfer of the present disclosure may be provided with a preservation solution, in some embodiments the preservation solution may be a buffer solution.
  • the compositions for gene transfer of the present disclosure may be provided in a container.
  • the container containing the composition for gene transfer of the present disclosure can be a syringe.
  • the disclosure provides cells comprising the nucleic acids, polypeptides, or nucleic acid constructs of the present disclosure.
  • the cells of the present disclosure can be retinal cells.
  • the cells of the present disclosure can be provided as a cell preparation.
  • Cell preparations include cells and cell preservation solutions.
  • the cell preservation solution can be a culture medium or a buffer solution.
  • the cells of the present disclosure may be provided in a container.
  • the container containing the cells of the present disclosure can be a syringe.
  • the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the nucleic acids, polypeptides, nucleic acid constructs, gene transfer compositions or cells of the present disclosure.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can be a pharmaceutical composition for treating, preventing or suppressing the progression of a disease, disorder or symptom of the retina.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can be a pharmaceutical composition for improving visual cognitive behavioral function.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can be a pharmaceutical composition for enhancing visual function.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can be a pharmaceutical composition for improving an object recognition function.
  • prevention or suppression of retinal diseases, disorders or symptoms represented by suppression of progression of retinitis pigmentosa has been confirmed by demonstrating by the experiments shown in Examples 1 to 10. Is.
  • Visual cognitive-behavioral function for example, improvement of photopic vision function, improvement of photopic repellent function and / or crisis avoidance function
  • LDT photopic box selection test
  • the visual cognitive-behavioral function is a function that can be confirmed not only by confirming the photosensitivity of visual organs but also by verifying whether or not it actually appears as an action in an animal model or the like. It can be said that one of the results of the present disclosure is that the verification in the experiment as in Example 5 was possible. Improvements in visual cognitive-behavioral function include improvement, enhancement or enhancement of visual acuity, contrast sensitivity, light-dark adaptation, color vision and the like.
  • the present disclosure is a method of treating, preventing or suppressing the progression of a subject's eye disease, disorder or symptom, in a therapeutically effective amount of the nucleic acid, polypeptide, nucleic acid construct, of the present disclosure.
  • a method comprising the step of administering a gene transfer composition, a cell or a pharmaceutical composition to a subject.
  • the disease, disorder or symptom is a retinal degenerative disease
  • the retinal degenerative disease is preferably, for example, retinitis pigmentosa or age-related macular degeneration, and more preferably retinitis pigmentosa. Is advantageous.
  • the retinitis pigmentosa targeted by the present disclosure is autosomal dominant, preferably RHO autosomal preferred heredity.
  • the present disclosure is used for the purpose of preventing or suppressing the progression of retinitis pigmentosa.
  • the present disclosure discloses within 1 year, preferably within 6 months, within 3 months, 1 from the onset of the disease, disorder or symptom, eg, from the onset (eg, subjective symptoms appear). It is preferably, but not limited to, administered to the subject within a month.
  • compositions or vectors of the present disclosure are administered once. It has been confirmed that this disclosure is effective when administered once, and it is considered that compliance with patients is also good.
  • the amount of the vectors of the present disclosure is a unit dose of 0.1 ⁇ 10 11 ⁇ 10 ⁇ 10 11 vg / eye
  • the lower limit is, 0.01 ⁇ 10 11 vg / Eyes, 0.02 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.03 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.04 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.05 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.06 ⁇ 10 11 vg / eye Eyes, 0.07 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.08 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.09 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.1 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.2 ⁇ 10 11 vg / eye It can be eye, 0.3 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.4 ⁇ 10 11 vg / eye, 0.5 ⁇ 10 11 vg / eye, etc., and the upper limit is 2 ⁇ 10 11 vg / eye
  • the present disclosure is a method of improving visual cognitive-behavioral function, in which a therapeutically effective amount of a nucleic acid, polypeptide, nucleic acid construct, gene transfer composition, cell or pharmaceutical composition of the present disclosure is tested.
  • a method comprising the step of administering to the body.
  • the present disclosure is a method of enhancing visual function, subjecting a therapeutically effective amount of a nucleic acid, polypeptide, nucleic acid construct, gene transfer composition, cell or pharmaceutical composition of the present disclosure.
  • a method comprising the step of administering to.
  • the present disclosure is a method of improving object recognition function, subjecting a therapeutically effective amount of a nucleic acid, polypeptide, nucleic acid construct, gene transfer composition, cell or pharmaceutical composition of the present disclosure.
  • a method comprising the step of administering to.
  • the present disclosure is for the nucleic acids, polypeptides, nucleic acid constructs, gene transfer of the present disclosure in the manufacture of a medicament for treating, preventing or suppressing the progression of a subject's eye disease, disorder or symptom.
  • the use of a composition, cell or pharmaceutical composition is provided.
  • the disclosure provides the use of the nucleic acids, polypeptides, nucleic acid constructs, gene transfer compositions, cells or pharmaceutical compositions of the present disclosure in the manufacture of medicaments for improving visual cognitive behavioral function. ..
  • the disclosure provides the use of the nucleic acids, polypeptides, nucleic acid constructs, gene transfer compositions, cells or pharmaceutical compositions of the present disclosure in the manufacture of a medicament for enhancing visual function.
  • the present disclosure provides the use of the nucleic acids, polypeptides, nucleic acid constructs, gene transfer compositions, cells or pharmaceutical compositions of the present disclosure in the manufacture of a medicament for improving object recognition function. (General technology)
  • Example 1 Vector preparation
  • the DNA encoding the chimeric protein (GR / BvRh) was prepared as follows.
  • the sequence corresponding to the 137-145th amino acid from the N-terminal corresponding to the second loop on the cytoplasmic side of Gloeobacter violaceus Rhodopsin (GR) (SEQ ID NO: 14) is 137-145 of boylodopsin (BvRh) (SEQ ID NO: 12).
  • Substitute the sequence corresponding to the second amino acid and replace the sequence corresponding to the 198-206th amino acid from the N-terminal corresponding to the third loop on the cytoplasmic side of GR with the sequence corresponding to the 225-252th amino acid of boylodopsin.
  • DNA encoding a chimeric protein in which glutamic acid, which is the 132nd amino acid of GR, was replaced with glutamine was inserted into the pCDNA3.1 vector.
  • a nucleic acid having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23 was generated and inserted into the pCDNA3.1 vector HindIII / XbaI site as DNA encoding a chimeric protein.
  • the base sequence set forth in SEQ ID NO: 23 was generated as follows: Amino acid 137-145 from the N-terminal corresponding to the second loop on the cytoplasmic side of Gloeobacter violacesin (GR) (SEQ ID NO: 14).
  • the corresponding sequence is replaced with the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 (encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19) corresponding to the second loop of boylodopsin (BvRh) (SEQ ID NO: 12), and the cytoplasm of GR.
  • the sequence corresponding to the 198th to 206th amino acids from the N-terminal corresponding to the third loop on the side is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 corresponding to the third loop of boylodopsin (the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22). ) was replaced with.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 was prepared by changing a part of the bases without changing the encoding amino acid.
  • Nucleic acids were made by mutating the encoding amino acids unchanged.
  • the mutant was prepared by the quick change method. Since the sequence portion adopted for bovine rhodopsin completely matches the amino acid sequence of human rhodopsin, there is no problem even if it is called human rhodopsin.
  • EGFP or GR / BvRh gene is subcloned into the AAV2 shuttle plasmid, and AAV2-CAGGS-EGFP-WPRE-pA (vector for expression of EGFP) and AAV2-CAGGS-GR / BvRh-WPRE are used as virus expression constructs.
  • -PA vector for chimeric protein expression
  • the viral vector was packaged by transfecting HEK293 cells with three types of plasmids, a vector plasmid, an AAV vector plasmid, and an adenovirus helper plasmid, and the cesium chloride method was used to purify the viral vector.
  • ITR Inverted Thermal Repeat
  • CAGGS is a sequence of regions of the CAG promoter.
  • WPRE is an abbreviation for "woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory election”.
  • PA means peptide tag.
  • EGFP is an abbreviation for "enhanced green fluorescent protein”.
  • FIG. 1 shows the configuration of a nucleic acid construct encoding chimeric rhodopsin (hereinafter, first nucleic acid construct) and a nucleic acid construct encoding chimeric rhodopsin to which a signal sequence has been added (hereinafter, the nucleic acid construct of the present disclosure).
  • ER2 shown in FIG. 1 is one of the endoplasmic reticulum export signals.
  • Example 2 Multi-electrode array (MEA) test using the nucleic acid construct of the present disclosure
  • MEA Multi-electrode array
  • GR / BvRh AAV DJ-CAGGS-Chemical rhodopsin
  • WPRE-pA vector first nucleic acid construct
  • the photoresponse of the mice was measured 4 weeks after the injection when the gene expression peaked.
  • the light response of retinal ganglion cells was measured ex vivo by changing the light stimulation intensity of white LEDs by a multi-electrode array (MEA) test.
  • MEA multi-electrode array
  • the construct of the chimeric protein introduced at the bottom of each graph and the light intensity are shown.
  • the light intensity of 1 ⁇ 10 13 photos / cm 2 / s corresponds to the light intensity of the night road with street lights and the light intensity of the corridor at home at night, and the light intensity of 1 ⁇ 10 14 photos / cm 2 / s is in the home room.
  • the light intensity of 1 ⁇ 10 15 photos / cm 2 / s corresponds to the light intensity in the store
  • the light intensity of 1 ⁇ 10 16 photos / cm 2 / s corresponds to the light intensity of the outdoors in cloudy weather.
  • the light intensity of 1 ⁇ 10 17 feet / cm 2 / s corresponds to the outdoor light intensity in fine weather.
  • the first nucleic acid construct gave a response only at light intensity up to 1x10 14 photons / cm 2 / s stimulation (Fig. 2), whereas the nucleic acid construct of the present disclosure has a light intensity of 1x10 13 photons / cm 2 / s. Response was obtained (Fig. 3).
  • the first nucleic acid construct was expressed in a mouse model of retinitis pigmentosa, it emitted an electrical signal more frequently than a negative control up to a light intensity of 1 ⁇ 10 15 photons / cm 2 / s.
  • Expression of the disclosed nucleic acid construct resulted in more frequent firing of ganglion cells than negative controls up to a light intensity of 1 ⁇ 10 13 photons / cm 2 / s.
  • the retinal ganglion cells when the nucleic acid construct of the present disclosure was introduced tended to ignite more frequently than when the first nucleic acid construct was introduced, and in particular, 1 ⁇ 10 15 photons /.
  • the nucleic acid constructs of the present disclosure were found to ignite about three times more frequently than the first nucleic acid constructs.
  • the first nucleic acid construct showed almost no firing, whereas the nucleic acid construct of the present disclosure gave firing of retinal ganglion cells. ..
  • the expression of the chimeric protein of the nucleic acid construct of the present disclosure results in unexpectedly significantly better photosensitivity than the expression of the chimeric protein of the first nucleic acid construct.
  • the nucleic acid construct of the present disclosure had a significantly higher firing frequency (Fig. 4).
  • the result of carrying out the multi-electrode array per unit area at 1 ⁇ 10 15 photons / cm 2 / s is shown.
  • the number of firing cells per unit area was also significantly higher at a stimulus intensity of 1x10 15 photons / cm 2 / s (Fig. 5).
  • the vertical axis of the graph shows the number of retinal ganglion cells that fired around 2.6 mm 2.
  • Retinal ganglion cells into which the first nucleic acid construct was introduced fired only about 2.7 cells in light with an intensity of 1 ⁇ 10 15 feet / cm 2 / s, whereas the present disclosure
  • About 33 cells of the retinal ganglion cells into which the nucleic acid construct was introduced were fired. Therefore, it has been demonstrated that the nucleic acid constructs of the present disclosure provide unexpectedly superior photosensitivity, which is more than 12 times that of the first nucleic acid construct.
  • Example 3 Wavelength sensitivity evaluation
  • Luminous efficiency of each wavelength of 11-week-old male rd1 mice was measured 7 weeks after injection of the nucleic acid construct of the present disclosure.
  • Light stimulation was performed with a wavelength-specific LED, and the peak firing frequency (Peak Filling Rate (spires / sec)) of the 25 cells obtained with the reaction was measured at each wavelength. The most responsive value of all wavelengths was set to 1 and the average was measured.
  • the measurement was performed with a light stimulation intensity of 1x10 14 photons / cm 2 / s. As a result of the measurement, it was found that the mice injected with the nucleic acid construct of the present disclosure exhibited the expected wavelength sensitivity (Fig. 6).
  • the protein expression level is proportional to the number of firing cells, it is considered that the expression level of the chimeric rhodopsin protein is also increased to the same extent as the number of firing cells. It was considered that the sensitivity increased as the protein expression level increased.
  • Example 4 Evaluation of visual evoked potential
  • VEP visual evoked potential
  • the prepared vector was injected intravitreally into a retinitis pigmentosa model mouse (rd1) mouse, anesthetized, and then a flash stimulus of 0.1 cds / m 2 was performed from a White LED installed 3 cm in front of the eye.
  • This light intensity corresponds to the light intensity of a night road with a street light or a corridor at home at night), and the evoked potential was measured using a PuREC injection system (manufactured by Mayo Co., Ltd.).
  • a flash stimulus of 0.1 cds / m 2 was measured.
  • mice after 10 weeks of age were administered 1 ⁇ l of the first nucleic acid construct or the nucleic acid construct of the present disclosure at a concentration of 1.0 ⁇ 10 9 vg / ⁇ l by intravitreal injection.
  • the control group received the same dose of AAV DJ-CAGGS-EGFP-WPRE-pA vector.
  • VEP was measured 4 weeks after injection, when gene expression peaked.
  • mice were sedated by administering triple anesthesia (midazolam, medetomidine, and butorphanol tarrate at 4 mg / kg and 0.75 mg / kg and 5 mg / kg body weight, respectively).
  • triple anesthesia midazolam, medetomidine, and butorphanol tarrate at 4 mg / kg and 0.75 mg / kg and 5 mg / kg body weight, respectively.
  • the measurement electrode was implanted in the skull near the visual field (1.5 mm anterior and 1.5 mm lateral to the Lambdoid suture). After sedation with three-kind mixed anesthesia again, the evoked potential for a flash stimulus of 0.1 cds / m 2 was measured from a white LED placed 3 cm in front of the eye.
  • the measuring instrument used was the PuREC acquisition system (Mayo, Inazawa, Japan).
  • the vertical axis shows the amplitude ( ⁇ V) of the visual evoked potential obtained from the visual cortex by light stimulation.
  • the construct of the introduced chimeric protein is shown at the bottom of the graph.
  • the first nucleic acid construct-treated mouse 22.13 ⁇ 8.38 ⁇ V.
  • An increase in amplitude was observed.
  • Treatment with the improved construct also showed a visually significant regenerative effect at the central level (Fig. 7). Therefore, it was demonstrated that the expression of the chimeric protein of the nucleic acid construct of the present disclosure results in significantly better photosensitivity than the expression of the chimeric protein of the first nucleic acid construct.
  • Example 5 Evaluation of light / dark recognition function
  • mice after 10 weeks of age are administered 1 ⁇ l of the first nucleic acid construct or the nucleic acid construct of the present disclosure at a concentration of 1.0 ⁇ 10 9 vg / ⁇ l by intravitreal injection.
  • the control group receives the same amount of AAV DJ-CAGGS-EGFP-WPRE-pA vector.
  • Light-dark box movement test (Light-Dark) 4 weeks after injection when gene expression peaks
  • the translation test (LDT) is performed to evaluate the light / dark recognition function.
  • a light / dark box (acrylic case width: 415 mm, height: 300 mm, depth: 250 mm, divided into two by a partition, one receives 20 lux light and the other is a dark room and is connected by a 5 x 5 mm window). Put the mouse in and shoot a video of the action for 10 minutes. Measure and compare the ratio of staying time in bright and dark places.
  • mice treated by injecting the nucleic acid construct of the present disclosure have a significantly shorter stay time than the mice treated by injecting the first nucleic acid construct.
  • Tablet terminals were installed on both sides of the space in which the mouse was placed, and a video of the mouse was played on one side and an empty mouse cage was played on the other side at a brightness of 10 lux.
  • the staying time in the area where the mouse video was played and the area where the video of the empty mouse cage was played was measured.
  • the measurement target time was 15 minutes immediately after the central partition was removed.
  • Vector administration 1.0 ⁇ 10 9 vg of the nucleic acid construct (AAV (2/6 / DJ) -CAGGS-Chemical rhodopsin (GR / BvRh) -WPRE-pA vector) of the present disclosure was applied to rd1 mice blinded after 10 weeks of age. 1 ⁇ l at a / ⁇ l concentration was administered by intravitreal injection. The blindness control group received the same amount of AAV DJ-CAGGS-EGFP-WPRE-pA vector. Furthermore, as a comparative group, a group to which the less sensitive microbial rhodopsin, AAV DJ-C1V1, was administered was also prepared. Tablet terminals were installed on both sides of the space in which the mouse was placed, and a video of the mouse was played on one side and an empty mouse cage was played on the other side at a brightness of 10 lux. The space designed for the experiment is shown in FIG.
  • the blindness control group (EGFP) had a staying time ratio on the object moving side (time / measured time in the area where the mouse moving image was played) of 0.495 ⁇ 0.019, whereas the DJ type AAV chimera injection 0.555 ⁇ 0.06, 0.538 ⁇ 0.015 for type 6 AAV chimera injection, which was significantly higher (Fig. 9).
  • the vertical axis indicates the object moving image side staying time ratio (time staying in the area where the mouse moving image is played / measurement time).
  • An object moving time ratio of 0.5 indicates that the mouse does not move, and as the distance from 0.5 increases, it is interpreted as having an object recognition function that is directly linked to visual ability.
  • the dwell time ratio on the moving object side was 0.495 ⁇ 0.019, whereas it was 0.555 ⁇ 0.06 for DJ type AAV chimera injection and 0 for type 6 AAV chimera injection. It was .538 ⁇ 0.015, and significantly higher results were obtained.
  • the staying time of the cage in which the moving image was played tended to decrease, but this result was due to the difference in appearance due to the change in the vector. Then, it was considered that there was a possibility that it was an illusion of a natural enemy or other object to be repelled. From the above results, it was demonstrated that the visual acuity is restored to a level at which an object can be recognized by expressing the construct of the present disclosure.
  • Example 7 Method for producing chimeric protein (GtACR2 / BvRh) of ion channel type rhodopsin and G protein-coupled receptor rhodopsin)
  • a chimeric protein (GtACR2 / BvRh) of an ion channel type rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin was prepared by the same method as in Example 1.
  • the sequence corresponding to the amino acid corresponding to the second loop on the cytoplasmic side of Guillardia theta (GT) (SEQ ID NO: 15) is replaced with the amino acid equivalent sequence of boylodopsin (BvRh) (SEQ ID NO: 12), and the cytoplasm of GT.
  • GT Guillardia theta
  • a DNA encoding a chimeric protein in which the sequence corresponding to the amino acid corresponding to the third loop on the side was replaced with the amino acid corresponding sequence of boylodopsin was inserted into the pCDNA 3.1 vector.
  • a nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 was generated and inserted into the pCDNA3.1 vector HindIII / XbaI site as DNA encoding a chimeric protein.
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 was prepared by adding a specific mutation to the prepared nucleic acid sequence.
  • Example 8 Measurement of GPCR activity of the nucleic acid construct of the present disclosure
  • GPCR activity was measured by observing the fluorescence of GloSenser TM (Promega), which is used as an indicator of intracellular cAMP concentration.
  • the cells were resown at a concentration suitable for fluorescence microscope observation.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • Activated rhodopsin activates a G protein (Gt in the retina) distributed near the cell membrane, which activates cGMP phosphodiesterase. Since cGMP phosphodiesterase is an enzyme that degrades intracellular cGMP, its activation reduces intracellular cGMP concentration.
  • photoreceptor cells have cGMP-dependent ion channels on their cell membranes. When the intracellular cGMP concentration decreases, the ion permeability of this cGMP-dependent ion channel changes, the membrane potential of the photoreceptor cells changes, and an electric signal is generated. In this way, photoreceptor cells convert optical signals into electrical signals.
  • Gt-type G protein and Gi-type G protein are cross-reactive (for example, Xiang Li et al., "Fast non-innovative activation and inhibition of neural and network activity bi-vertebrate" Sun, Vol. 102, No. 49, pp. 17816-17821, p.
  • Rhodopsin is a G protein transducin and couples with the ⁇ -subunit belonging to the Gi subfamily. (15) Therefore, it is more likely that mammalian rhodopsin will couple with other Gi / o family members. " It has been common practice to measure changes in intracellular cAMP concentration via Gi-type G protein in order to measure. Supplementally, it is known that there are a plurality of types of G proteins, and the G protein present in photoreceptor cells is Gt (G ⁇ t). Gt-type G proteins are present only in some cells such as photoreceptor cells, and general nerve cells include Gs, Gi, and Gq-type G proteins.
  • the Gs-type G protein activates adenylate cyclase to increase the intracellular cAMP concentration, whereas the Gi-type G protein suppresses adenylate cyclase to decrease the intracellular cAMP concentration.
  • changes in intracellular cAMP concentration mediated by Gi-type G protein were measured in order to analyze intracellular signal transduction pathways in response to light stimulation.
  • the specific experimental method is as follows. Lipofectamine (R) 2000 was used to express GR / BvRh-dable-EQ-linker-Venus-ER2 and control vectors in HEK293T cells as directed by the manufacturer. An experiment in which the vector was introduced into HEK293T cells was also performed in parallel.
  • the transgenic cells were transferred into a CO2-independent culture medium containing retinal (containing 10% FBS, 2% GloSensor TM stock solution).
  • the change in intracellular cAMP concentration was measured by recording the change in fluorescence brightness of GloSensor TM. Measurements were performed using a plate reader with a light irradiator and according to the standard GloSensor TM assay protocol. Forskolin (final concentration 3.5 ⁇ M) that activates adenylyl cyclase was administered to increase the intracellular cAMP concentration in advance.
  • FIG. 13 shows experimental data in which each gene was forcibly expressed in HEK293T cells by the lipofection method, and the change in cAMP concentration was measured with and without light stimulation.
  • the vertical axis shows the ⁇ HTRF ratio, and the horizontal axis shows the results for each gene.
  • HTRF Homeogeneus Time-Resolved Fluorescence
  • HTRF ratio the ratio of exogenous standard cAMP to endogenous cAMP measured using a fluorescent antibody of cAMP
  • the endogenous cAMP is As the number increases, the HTRF ratio decreases, which is inversely proportional to the cAMP concentration.
  • ⁇ HTRF ratio is the difference in HTRF ratio with and without light irradiation, and the larger this is, the more cAMP is decreased by light stimulation, that is, the G protein (Gi) is activated.
  • Example 9 Measurement of GPCR activity of a nucleic acid construct encoding a chimeric protein of an ion channel type rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin
  • GPCR activity was measured by observing the fluorescence of GloSenser TM (Promega), which is used as an indicator of intracellular cAMP concentration.
  • ND7 / 23 cells were cultured and gene-introduced into the GtACR2tr / BvRh-dable vector and the pGloSensor TM (Promega) vector. Equal amounts of pcDNA3.1 (empty vector) and pGloSensor (Promega) vector were introduced into the control group.
  • the transgenic cells were cultured, washed with PBS, and then the cells were peeled off using trypsin and EDTA and collected in a centrifuge tube. The cells were precipitated by centrifugation, and fresh DMEM culture medium was added and suspended. Based on the cell concentration, the cells were resown at a concentration suitable for fluorescence microscope observation.
  • the transgenic cells were transferred into a CO2-independent culture medium containing retinal (containing 10% FBS, 2% GloSensor TM stock solution).
  • the change in intracellular cAMP concentration was measured by recording the change in fluorescence brightness of GloSensor TM. Measurements were performed using a plate reader with a light irradiator and according to the standard GloSensor TM assay protocol. Forskolin (final concentration 3.5 ⁇ M) that activates adenylyl cyclase was administered to increase the intracellular cAMP concentration in advance.
  • GtACR2tr / BvRh-duble with Venus inserted into the nucleic acid construct of the present disclosure has GPCR activity, and treats, prevents or suppresses the progression of retinal diseases, disorders or symptoms, improves visual cognitive-behavioral function, and visual function. It turns out that it can bring about the enhancement of.
  • Example 10 Measurement of ion transport capacity of a nucleic acid construct encoding a chimeric protein of an ion channel type rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin
  • the ion transport capacity was measured by the patch clamp method.
  • ND7 / 23 cells were cultured and a GtACR2tr / BvRh-dable vector encoding a chimeric protein of ion channel rhodopsin and a G protein-coupled receptor rhodopsin was gene-introduced.
  • the same amount of GtACR1 vector vector encoding wild-type Guillardia theta anion channel rhodopsin was introduced.
  • the transgenic cells were cultured in a culture medium containing retinal.
  • GtACR2tr / BvRh-dable can hyperpolarize the membrane potential by photostimulation and treat, prevent or prevent retinal diseases, disorders or symptoms. It can suppress its progression, improve visual cognitive-behavioral function, and enhance visual function.
  • Example 11 Preparation of a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein in which an endoplasmic reticulum export signal different from the endoplasmic reticulum export signal inserted in Example 2 is inserted into the nucleic acid sequence encoding the chimeric protein prepared in Example 1 is prepared.
  • Example 12 Multi-electrode array (MEA) test using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • MEA Multi-electrode array
  • mice after 10 weeks of age contain an AAV DJ-CAGGS-Chemical rhodopsin (GR / BvRh) -WPRE-pA vector (first nucleic acid construct) or a nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11. 1 ⁇ l of the nucleic acid construct is administered by intravitreal injection at a concentration of 1.0 ⁇ 10 9 vg / ⁇ l.
  • mice The photoresponse of mice is measured 4 weeks after injection when gene expression peaks.
  • the light response of retinal ganglion cells is measured ex vivo by varying the light stimulation intensity of a white LED by a multi-electrode array (MEA) test.
  • MEA multi-electrode array
  • the first nucleic acid construct gives a response only at light intensity up to 1x10 14 photons / cm 2 / s stimulation, whereas the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11 gives an improved response. .. Furthermore, in the stimulation intensity range of 1x10 14 to 16 photos / cm 2 / s, the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11 has a significantly higher firing frequency. Also, 1x10 15 The number of firing cells per unit area is also significantly higher at the stimulation intensity of photons / cm 2 / s.
  • Example 13 Evaluation of wavelength sensitivity using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • the wavelength sensitivity of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11 is evaluated. Luminous efficiency of each wavelength of 11-week-old male rd1 mice is measured 7 weeks after injection of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11. Light stimulation is performed with a wavelength-specific LED, and the peak firing frequency (Peek Filling Rate (spix / sec)) of the 25 cells obtained with the reaction is measured at each wavelength. The most responsive value of all wavelengths is set to 1 and the average is measured.
  • the measurement is performed with a light stimulation intensity of 1x10 14 photons / cm 2 / s.
  • a light stimulation intensity of 1x10 14 photons / cm 2 / s.
  • Example 14 Evaluation of visual evoked potential using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • VEP visual evoked potential
  • VEP is measured 4 weeks after injection when gene expression peaks.
  • mice were given 3 types of mixed anesthesia (midazolam, medetomidine, and butorphanol tarrate) at 4 mg / kg and 0.75 mg / kg, respectively. And 5 mg / kg body weight) is administered to sedate, and the measurement electrode is placed in the skull near the visual cortex (1.5 mm anterior and 1.5 mm lateral to the Lambdoid suture).
  • the evoked potential for a flash stimulus of 0.1 cds / m 2 is measured from a white LED placed 3 cm in front of the eye.
  • a PuREC accuracy system Mayo, Inazawa, Japan is used as the measuring device.
  • Example 15 Evaluation of light-dark recognition function using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • the effect of a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11 on the light-dark recognition function is measured. This will be described below.
  • Light-dark box movement test (Light-Dark) 4 weeks after injection when gene expression peaks
  • the translation test (LDT) is performed to evaluate the light / dark recognition function.
  • a light / dark box (acrylic case width: 415 mm, height: 300 mm, depth: 250 mm, divided into two by a partition, one receives 20 lux light and the other is a dark room and is connected by a 5 x 5 mm window). Put the mouse in and shoot a video of the action for 10 minutes. Measure and compare the ratio of staying time in bright and dark places.
  • mice treated by injecting a nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11 have a significantly longer dwell time than the mice treated by injecting the first nucleic acid construct. Can be seen to be shortened.
  • Example 16 Evaluation of object recognition function using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • mice after 10 weeks of age are administered 1 ⁇ l of a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding the signal sequence of Example 11 at a concentration of 1.0 ⁇ 10 9 vg / ⁇ l by intravitreal injection.
  • the blindness control group receives the same amount of AAV DJ-CAGGS-EGFP-WPRE-pA vector.
  • Tablet terminals are installed on both sides of the space where the mouse is placed, and a video of the mouse is played on one side and an empty mouse cage is played on the other side at a brightness of 10 lux.
  • the space designed for the experiment is shown in FIG.
  • Measurement Measure the staying time in the area where the mouse video is played and the area where the video of the empty mouse cage is played.
  • the measurement target time is 15 minutes immediately after the central partition is removed.
  • nucleic acid encoding the signal sequence of Example 11 while the blindness control group (EGFP) has a staying time ratio on the moving object side is about 0.5.
  • EGFP blindness control group
  • Example 17 Preparation of a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a chimeric protein for inserting an endoplasmic reticulum transfer signal into the nucleic acid sequence encoding the chimeric protein prepared in Example 1 is prepared.
  • Example 18 Multi-electrode array (MEA) test using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding an endoplasmic reticulum translocation signal
  • MEA Multi-electrode array
  • nucleic acid sequence encoding the AAV DJ-CAGGS-Chemical rhodopsin (GR / BvRh) -WPRE-pA vector (first nucleic acid construct) or the endoplasmic reticulum translocation signal of Example 19 in rd1 mice blinded after 10 weeks of age.
  • 1 ⁇ l of the nucleic acid construct containing the above is administered by intravitreal injection at a concentration of 1.0 ⁇ 10 9 vg / ⁇ l.
  • mice The photoresponse of mice is measured 4 weeks after injection when gene expression peaks.
  • the light response of retinal ganglion cells is measured ex vivo by varying the light stimulation intensity of a white LED by a multi-electrode array (MEA) test.
  • MEA multi-electrode array
  • the first nucleic acid construct gave a response only at light intensities up to 1x10 14 photons / cm 2 / s stimulation, whereas the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum translocation signal of Example 17 gave an improved response. can get.
  • 1x10 14-16 In the stimulus intensity range of photons / cm 2 / s, the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum translocation signal of Example 17 had a significantly higher firing frequency. The number of firing cells per unit area is also significantly higher at a stimulus intensity of 1x10 15 photons / cm 2 / s.
  • Example 19 Wavelength sensitivity evaluation using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding an endoplasmic reticulum translocation signal
  • the wavelength sensitivity of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum translocation signal of Example 17 is evaluated.
  • Luminous efficiency of each wavelength of 11-week-old male rd1 mice is measured 7 weeks after injection of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum transfer signal of Example 17.
  • Light stimulation is performed with a wavelength-specific LED, and the peak firing frequency (Peek Filling Rate (spix / sec)) of the 25 cells obtained with the reaction is measured at each wavelength.
  • the most responsive value of all wavelengths is set to 1 and the average is measured.
  • the measurement is performed with a light stimulation intensity of 1x10 14 photons / cm 2 / s.
  • a light stimulation intensity 1x10 14 photons / cm 2 / s.
  • Example 20 Evaluation of visual evoked potential using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding an endoplasmic reticulum translocation signal
  • VEP visual evoked potential
  • VEP is measured 4 weeks after injection when gene expression peaks.
  • mice were given 3 types of mixed anesthesia (midazolam, medetomidine, and butorphanol tarrate) at 4 mg / kg and 0.75 mg / kg, respectively. And 5 mg / kg body weight) is administered to sedate, and the measurement electrode is placed in the skull near the visual cortex (1.5 mm anterior and 1.5 mm lateral to the Lambdoid suture).
  • the evoked potential for a flash stimulus of 0.1 cds / m 2 is measured from a white LED placed 3 cm in front of the eye.
  • a PuREC accuracy system Mayo, Inazawa, Japan is used as the measuring device.
  • Example 21 Evaluation of light-dark recognition function using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding an endoplasmic reticulum translocation signal
  • the effect of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum transfer signal of Example 17 on the light-dark recognition function is measured. This will be described below.
  • a light-dark box movement test (LDT) is performed 4 weeks after the injection when the gene expression reaches its peak, and the light-dark recognition function is evaluated.
  • LDT light-dark box movement test
  • a light / dark box (acrylic case width: 415 mm, height: 300 mm, depth: 250 mm, divided into two by a partition, one receives 20 lux light and the other is a dark room and is connected by a 5 x 5 mm window). Put the mouse in and shoot a video of the action for 10 minutes. Measure and compare the ratio of staying time in bright and dark places.
  • the staying time in the bright place is shortened in order to avoid the bright place, while in the blind mouse (control), the staying time ratio is about half, 0.5. Furthermore, the mice treated by injecting the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum transfer signal of Example 17 were significantly compared with the mice treated by injecting the first nucleic acid construct. It can be seen that the staying time is shortened.
  • Example 22 Evaluation of object recognition function using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding an endoplasmic reticulum translocation signal
  • the effect of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum transfer signal of Example 17 on the object recognition function is measured. This will be described below.
  • a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding the endoplasmic reticulum translocation signal of Example 17 is administered to rd1 mice blinded after 10 weeks of age by intravitreal injection at a concentration of 1.0 ⁇ 10 9 vg / ⁇ l. ..
  • the blindness control group receives the same amount of AAV DJ-CAGGS-EGFP-WPRE-pA vector. Tablet terminals are installed on both sides of the space where the mouse is placed, and a video of the mouse is played on one side and an empty mouse cage is played on the other side at a brightness of 10 lux.
  • the space designed for the experiment is shown in FIG.
  • Measurement Measure the staying time in the area where the mouse video is played and the area where the video of the empty mouse cage is played.
  • the measurement target time is 15 minutes immediately after the central partition is removed.
  • the blindness control group While the blindness control group (EGFP) has a staying time ratio on the object moving side (time spent in the area where the mouse moving image is played / measurement time) of about 0.5, it encodes the endoplasmic reticulum migration signal of Example 17. It is significantly higher in the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence.
  • Example 23 Comparative example of GPCR activity measurement
  • a base sequence encoding the amino acid shown in the discontinued sequence number, which is different from the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, is prepared.
  • the nucleic acid construct containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the nucleic acid construct containing the nucleotide sequence prepared in this example are gene-introduced into ND7 / 23 cells.
  • the cells into which the nucleic acid construct containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 was gene-introduced were more than the cells into which the nucleic acid construct prepared in this example was gene-introduced.
  • the cAMP concentration is decreasing. From this, it can be seen that the chimeric rhodopsin encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 has stronger GPCR activity than the chimeric rhodopsin encoded by the nucleotide sequence prepared in this example.
  • Example 24 Comparative example of ion transport capacity
  • a base sequence encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 8, which is different from the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, is prepared.
  • the nucleic acid construct containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the nucleic acid construct containing the nucleotide sequence prepared in this example are gene-introduced into ND7 / 23 cells.
  • Example 25 Vector culture in adhesive culture system and suspension culture system
  • HEK293T cells or (adhesive) HEK293 cells are cultured.
  • suspension culture system (suspension) HEK293 cells or CHO cells are cultured. After culturing, the following plasmids are mixed and transfected into cells (PEI: Polyethylenimine, if necessary, calcium phosphate method, DEAE-dextran method is used).
  • pAAV-RC rep and cap genes
  • pHelper pAAV-GOI a gene of interest
  • a few days after transfection the cells are harvested and the cells are lysed with a detergent to give the drug substance. Then, affinity chromatography, ultracentrifugation, and filter purification are performed to purify the product to obtain the final product. Purification was performed by Nathalie Cand Joshua C.I. , Methods & Clinical Development (2016) 3, 16002.
  • Example 26 Multi-electrode array (MEA) test using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • the effect of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 (encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27) on the optical response is measured. This will be described below.
  • AAV 6-CAGGS-Chemical rhodopsin (GR / BvRh) -WPRE-pA vector (first nucleic acid construct) or a nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 was applied to rd1 mice blinded after 10 weeks of age. 1 ⁇ l at a concentration of 1.0 ⁇ 10 8 vg / ⁇ l is administered by intravitreal injection.
  • mice The photoresponse of mice is measured 4 weeks after injection when gene expression peaks.
  • the light response of retinal ganglion cells is measured ex vivo by varying the light stimulation intensity of a white LED by a multi-electrode array (MEA) test.
  • MEA multi-electrode array
  • the first nucleic acid construct gives a response only at light intensities up to 1x10 14 photons / cm 2 / s stimulation, whereas the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 gives an improved response. Furthermore, in the stimulation intensity range of 1x10 14 to 16 photos / cm 2 / s, the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 has a significantly higher firing frequency. The number of firing cells per unit area is also significantly higher at a stimulus intensity of 1x10 15 photons / cm 2 / s.
  • Example 27 Wavelength sensitivity evaluation using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • the wavelength sensitivity of a nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 is evaluated.
  • Luminous efficiency of each wavelength of 11-week-old male rd1 mice is measured 7 weeks after injection of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
  • Light stimulation is performed with a wavelength-specific LED, and the peak firing frequency (Peek Filling Rate (spix / sec)) of the 25 cells obtained with the reaction is measured at each wavelength.
  • the most responsive value of all wavelengths is set to 1 and the average is measured.
  • the measurement is performed with a light stimulation intensity of 1x10 14 photons / cm 2 / s.
  • a light stimulation intensity of 1x10 14 photons / cm 2 / s.
  • Example 28 Evaluation of visual evoked potential using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • VEP visual evoked potential
  • Vector administration To blindness was rd1 old mouse 10 weeks of age, administration of 1 ⁇ l at 1.0 ⁇ 10 8 vg / ⁇ l concentration nucleic acid construct comprising a nucleic acid sequence according to the first nucleic acid construct or SEQ ID NO: 26 at intravitreal injection To do.
  • the control group receives the same amount of AAV 6-CAGGS-EGFP-WPRE-pA vector.
  • VEP is measured 4 weeks after injection when gene expression peaks.
  • mice were sedated by administering triple anesthesia (midazolam, medetomidine, and butorphanol tarrate at 4 mg / kg, 0.75 mg / kg, and 5 mg / kg body weight, respectively).
  • triple anesthesia midazolam, medetomidine, and butorphanol tarrate at 4 mg / kg, 0.75 mg / kg, and 5 mg / kg body weight, respectively.
  • the measurement electrode is placed in the skull near the visual field (1.5 mm anterior and 1.5 mm lateral to the Lambdoid suture).
  • the evoked potential for a flash stimulus of 0.1 cds / m 2 is measured from a white LED placed 3 cm in front of the eye.
  • a PuREC accuracy system Mayo, Inazawa, Japan is used as the measuring device.
  • Example 29 Evaluation of light-dark recognition function using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • the effect of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 on the light-dark recognition function is measured. This will be described below.
  • Vector administration To blindness was rd1 old mouse 10 weeks of age, administration of 1 ⁇ l at 1.0 ⁇ 10 8 vg / ⁇ l concentration nucleic acid construct comprising a nucleic acid sequence according to the first nucleic acid construct or SEQ ID NO: 26 at intravitreal injection To do.
  • the control group receives the same amount of AAV 6-CAGGS-EGFP-WPRE-pA vector.
  • a light-dark box movement test (LDT) is performed 4 weeks after the injection when the gene expression reaches its peak, and the light-dark recognition function is evaluated.
  • LDT light-dark box movement test
  • a light / dark box (acrylic case width: 415 mm, height: 300 mm, depth: 250 mm, divided into two by a partition, one receives 10 lux light and the other is a dark room and is connected by a 5 x 5 mm window). Put the mouse in and shoot a video of the action for 10 minutes. Measure and compare the ratio of staying time in bright and dark places.
  • mice treated by injecting the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 have a significantly shorter stay time than the mice treated by injecting the first nucleic acid construct. You can see that.
  • Example 30 Evaluation of object recognition function using a nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence
  • the effect of the nucleic acid construct containing the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 on the object recognition function is measured. This will be described below.
  • Measurement Measure the staying time in the area where the mouse video is played and the area where the video of the empty mouse cage is played.
  • the measurement target time is 15 minutes immediately after the central partition is removed.
  • the blindness control group (result) has a residence time ratio on the moving object side (time / measurement time in the area where the mouse moving image is played) of about 0.5, whereas the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is included. Significantly higher in nucleic acid constructs.
  • visual cognitive behavioral function eg, improvement of photopic vision function, improvement of photopic vision avoidance function and / or crisis avoidance function
  • object recognition function e.g., object recognition function, etc.
  • SEQ ID NO: 1 Example of nucleic acid sequence consisting of chimeric rhodopsin (GR / BvRh) and vesicle export signal
  • SEQ ID NO: 2 Example of amino acid sequence consisting of chimeric rhodopsin (GR / BvRh) and vesicle export signal
  • SEQ ID NO: 3 Chimera rhodopsin (GR / BvRh)
  • SEQ ID NO: 4 Example of Amino Acid Sequence Consisting of Chimera Rhodopsin (GR / BvRh), Cellular Export Signal and FLAG Tag
  • SEQ ID NO: 5 Chimera Rhodopsin
  • SEQ ID NO: 6 Example of nucleic acid sequence of chimeric rhodopsin (GtACR2 / BvRh)
  • SEQ ID NO: 7 Example of nucleic acid sequence consisting of chimeric rho
  • SEQ ID NO: 24 An example of the nucleic acid sequence of the second loop on the cytoplasmic side of the G protein-coupled receptor rhodopsin
  • SEQ ID NO: 25 An example of the amino acid sequence of the second loop on the cytoplasmic side of the G protein-coupled receptor rhodopsin (SEQ ID NO: 24)
  • SEQ ID NO: 26 Example of nucleic acid sequence consisting of chimeric rhodopsin (GR / BvRh) and endoplasmic reticulum export signal
  • SEQ ID NO: 27 Example of amino acid sequence consisting of chimeric rhodopsin (GR / BvRh) and endoplasmic reticulum export signal

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Abstract

イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸およびイオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸およびこれらを含む核酸コンストラクトが提供される。この核酸または核酸コンストラクトを用いることで、網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能、視覚機能増強がもたらされる。

Description

キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト
　本開示は、網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能の改善、および視覚機能強化に関する。
　ロドプシンは、ヒトの動物の網膜中に７回膜貫通型構造を有する光感受性の受容体であり、医療にも応用がされている。
　本発明者らは、イオン輸送型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンという２種類のロドプシンのキメラタンパク質が、網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能の改善、および視覚機能強化の効果を有することを見出した。本発明者らは小胞体輸送シグナルを導入した、キメラロドプシンをコードする新規核酸コンストラクトの発現効率が顕著に高く、臨床応用に有効であることを見出した。
　したがって、本開示は以下を提供する。
(項目Ｘ１)
イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸。
(項目Ｘ２)
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目Ｘ１に記載の核酸。
(項目Ｘ３)
前記核酸は、配列番号１または２６に示す核酸配列を含む、項目Ｘ１または２に記載の核酸。
(項目Ｘ４)
ＦＬＡＧタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目Ｘ１～３のいずれか一項に記載の核酸。
(項目Ｘ５)
前記核酸は、配列番号３に示す核酸配列を含む、項目Ｘ１～４のいずれか一項に記載の核酸。
(項目Ｘ６)
前記核酸は、配列番号２６に示す核酸配列である、項目Ｘ１～３のいずれか一項に記載の核酸。
(項目Ｘ７)
イオン輸送型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる、ポリペプチド。
(項目Ｘ８)
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目Ｘ７に記載のポリペプチド。
(項目Ｘ９)
前記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号２６に示すアミノ酸配列である、項目Ｘ８または９に記載のポリペプチド。
(項目Ｘ１０)
項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目Ｘ１に記載の核酸。
(項目Ｘ１１)
ＦＬＡＧタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目Ｘ１０に記載の核酸。
(項目Ｘ１２)
配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目Ｘ１０または１１に記載の核酸。
(項目Ｘ１３)
イオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸。
(項目Ｘ１４)
前記核酸は、配列番号７に示す核酸配列を含む、項目Ｘ１３に記載の核酸。
(項目Ｘ１５)
イオンチャネル型受容体ロドプシンの一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部とのキメラタンパク質を含む、ポリペプチド。
(項目Ｘ１６)
前記ポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列である、項目Ｘ１５に記載のポリペプチド。
(項目Ｘ１７)
項目Ｘ１５または１６に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目Ｘ１３に記載の核酸。
(項目Ｘ１８)
配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目Ｘ１７に記載の核酸。
(項目Ｘ１９)
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸ならびに／または項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸ならびに該核酸に作動可能に連結された、細胞における発現を可能にする核酸を含む、核酸コンストラクト。
(項目Ｘ２０)
ベクターをさらに含む、項目Ｘ１９に記載の核酸コンストラクト。
(項目Ｘ２１)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目Ｘ２０に記載の核酸コンストラクト。
(項目Ｘ２２)
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目Ｘ２０または２１に記載の核酸コンストラクト。
(項目Ｘ２３)
前記ベクターがＡＡＶベクターである、項目Ｘ２０～２２のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目Ｘ２４)
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－２またはＡＡＶ－６である、項目Ｘ２３に記載の核酸コンストラクト。
(項目Ｘ２５)
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、または項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子導入用組成物。
(項目Ｘ２６)
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、または項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトのうちの１つまたは複数を含む、細胞。
(項目Ｘ２７)
前記細胞が網膜細胞である、項目Ｘ２６に記載の細胞。
(項目Ｘ２８)
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数を含む、医薬組成物。
(項目Ｘ２９)
網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、項目Ｘ２８に記載の医薬組成物。
(項目Ｘ３０)
視覚認知行動機能の改善のための、項目Ｘ２８に記載の医薬組成物。
(項目Ｘ３１)
視覚機能を強化するための、項目Ｘ２８に記載の医薬組成物。
(項目Ｘ３２)
物体認識機能を強化するための、項目Ｘ３１に記載の医薬組成物。
(項目Ａ１)
　被験体における網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制する方法であって、
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目Ａ２)
　被験体における視覚認知行動機能の改善する方法であって、
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目Ａ３)
　被験体における視覚機能を強化する方法であって、
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目Ａ４)
　被験体における物体認識機能を強化する方法であって、
項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目Ｂ１)
　網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための医薬の製造における、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の使用。
(項目Ｂ２)
　視覚認知行動機能の改善するための医薬の製造における、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の使用。
(項目Ｂ３)
　視覚機能を強化するための医薬の製造における、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の使用。
(項目Ｂ４)
　物体認識機能を強化するための医薬の製造における、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数の使用。
(項目Ｂ５)
　遺伝子を導入するための医薬の製造における、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトの遺伝子、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞の使用。
(項目Ｃ１)
　網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞。
(項目Ｃ２)
　視覚認知行動機能の改善するための、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞。
(項目Ｃ３)
　視覚機能を強化するための、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目Ｘ２５に記載の遺伝子導入用組成物、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞。
(項目Ｃ４)
　物体認識機能を強化するための、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１５～１６に記載のポリペプチド、項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または項目Ｘ２６～２７のいずれか一項に記載の細胞。
(項目Ｃ５)
遺伝子を導入するための、項目Ｘ１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、項目Ｘ１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、または項目Ｘ１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１）
イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸。
（項目２）
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目１に記載の核酸。
（項目３）
前記核酸は、配列番号１に示す核酸配列を含む、項目１または２に記載の核酸。
（項目４）
ＦＬＡＧタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目１～３のいずれか一項に記載の核酸。
（項目５）
前記核酸は、配列番号３に示す核酸配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の核酸。
（項目６）
イオン輸送型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる、ポリペプチド。
（項目７）
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列である、項目７または８に記載のポリペプチド。
（項目９）
項目６～８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目１に記載の核酸。
（項目１０）
ＦＬＡＧタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目９に記載の核酸。
（項目１１）
配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目９または１０に記載の核酸。
（項目１２）
イオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸。
（項目１３）
前記核酸は、配列番号７に示す核酸配列を含む、項目１２に記載の核酸。
（項目１４）
イオンチャネル型受容体ロドプシンの一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部とのキメラタンパク質を含む、ポリペプチド。
（項目１５）
前記ポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列である、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
項目１４または１５に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目１２に記載の核酸。
（項目１７）
配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目１６に記載の核酸。
（項目１８）
項目１～５および９～１１のいずれか一項に記載の核酸ならびに／または項目１２～１３および１６～１７のいずれか一項に記載の核酸ならびに該核酸に作動可能に連結された、細胞における発現を可能にする核酸を含む、核酸コンストラクト。
（項目１９）
ベクターをさらに含む、項目１８に記載の核酸コンストラクト。
（項目２０）
前記ベクターがウイルスベクターである、項目１９に記載の核酸コンストラクト。
（項目２１）
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目１９または２０に記載の核酸コンストラクト。
（項目２２）
前記ベクターがＡＡＶベクターである、項目１９～２１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目２３）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－２またはＡＡＶ－６である、項目２２に記載の核酸コンストラクト。
（項目２４）
項目１～５および９～１１のいずれか一項に記載の核酸、項目１２～１３および１６～１７のいずれか一項に記載の核酸、または項目１８～２３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子導入用組成物。
（項目２５）
項目１～５および９～１１のいずれか一項に記載の核酸、項目６～８のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目１２～１３および１６～１７のいずれか一項に記載の核酸、項目１４～１５に記載のポリペプチド、または項目１８～２３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトのうちの１つまたは複数を含む、細胞。
（項目２６）
前記細胞が網膜細胞である、項目２５に記載の細胞。
（項目２７）
項目１～５および９～１１のいずれか一項に記載の核酸、項目６～８のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目１２～１３および１６～１７のいずれか一項に記載の核酸、項目１４～１５に記載のポリペプチド、項目１８～２３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目２４に記載の遺伝子導入用組成物、または項目２５～２６のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数を含む、医薬組成物。
（項目２８）
網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目２９）
視覚認知行動機能の改善のための、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目３０）
視覚機能を強化するための、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目３１）
物体認識機能を強化するための、項目３０に記載の医薬組成物。
　本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本開示により、キメラタンパク質の遺伝子発現が効率・感度共により高く、より効率的に機能することを実証した。本開示により、より優れた視覚再生効果を得ることができる。本開示により、ＭＥＡで従来コンストラクトを超える発現量や光感度の増加が得られただけでなく、ＶＥＰで有意な中枢での光応答の再生が確認された。これは、ヒトの網膜疾患に対する視覚再生遺伝子治療に応用した場合、より暗い場所での視覚再生、また視野の拡大効果が予想される。さらには、明暗判定機能・視覚認知行動機能の再生・改善効果、物体認識機能の再生効果、疾患の進行抑制効果などが達成される。
図１は、キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト（第１の核酸コンストラクト）と、シグナル配列付与を行ったキメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト（本開示の核酸コンストラクト）の構成を示す図である。 図２は、第１の核酸コンストラクトを注したマウスにおける多電極アレー試験の結果を示す図である。 図３は、本開示の核酸コンストラクトを注したマウスにおける多電極アレー試験の結果を示す図である。 図４は、図２および図３の結果を定量した図である。１ｘ１０１４～１６　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度範囲において、本開示の核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高い。 図５は、図２および図３の結果を定量した図である。１ｘ１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度において、本開示の核酸コンストラクトの方が単位面積当たりの発火細胞数は有意に高い。 図６は、本開示の核酸コンストラクトを注射したマウスの波長感度を評価した図である。 図７は、第１の核酸コンストラクトを注射したマウスと、本開示の核酸コンストラクトを注射したマウスとの、視覚誘発電位の総体評価の結果を示す図である。 図８は、物体認識機能の評価実験のために設計した空間を示す図である。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、１０ｌｕｘの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流すよう設計した。 図９は、物体認識機能の評価試験結果を示す図である。 図１０は、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）を用いて、本開示の核酸コンストラクトがコードするタンパク質のＧＰＣＲ活性を測定した図である。 図１１は、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）を用いて、イオンチャネル型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質のＧＰＣＲ活性を測定した図である。 図１２は、パッチクランプ法により、イオンチャネル型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質のイオン輸送能を測定した結果である。 図１３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリポフェクション法を用いて各遺伝子を強制発現させ、光刺激の有無でそのｃＡＭＰ濃度変化を測定した実験データを示す。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　（定義等）
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「ロドプシン」は、レチナールという色素を内部に有するタンパク質であり、これが光を受けることで活性化して、視覚シグナルが脳へと伝えられる。微生物由来に代表されるイオン輸送型受容体ロドプシンは、光を照射してもレチナールが外れることがないため、光を吸収することで繰り返し活性化させることができるが、動物由来に代表されるＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのように、Ｇタンパク質を活性化することができない。これに対し、本開示で提供される、イオン輸送型受容体ロドプシンとＧタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラロドプシンは、従来型のロドプシンに比べて機能が亢進しているものと考えられ、特に、イオン輸送型受容体ロドプシンとして、好ましくは、微生物由来のものであり得、繰り返し使用できることができるものを利用し、また、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとして、動物由来、好ましくは哺乳動物由来のものを利用する場合、繰り返し活性化する機能を保持しつつ、内在性のＧタンパク質を介した高い活性を得ることができる。理論に束縛されることは望まないが、本開示で利用されるキメラタンパク質は、動物モデルで実証されるように、げっ歯類、霊長類などの哺乳動物において十分に活性を保持して発現されることから、網膜の疾患、障害または症状の予防および進行抑制効果、特に、網膜色素変性症の予防または進行抑制を達成でき、あるいは視覚認知行動機能（例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および／または危機回避機能）の改善がもたらされ、あるいは、視力改善などの視覚機能の増強効果が奏される。
　本明細書において「イオン輸送型受容体ロドプシン」とは、イオンを輸送する機能を有する任意のロドプシンを指し、イオンポンプ型受容体ロドプシン、イオンチャネル型受容体ロドプシンを挙げることができる。
　イオン輸送型受容体ロドプシンについて、Ｇタンパク質活性化ループとの立体構造的相性と膜移行効率が重要であると考えられ、特に、藻類または微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンは、Ｇタンパク質活性化ループとの立体構造的相性と膜移行効率が良好であり、その中でもグロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属またはグィラルディア（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ）属のものが好ましい。特に、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物のグロエオバクター・ビオラセウス、グィラルディア属のグィラルディア・セータが好ましい。また、グロエオバクター属に属する微生物のロドプシン（例えば、配列番号１４）またはグィラルディア属に属する微生物のロドプシン（例えば、配列番号１６）は、動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのうち、哺乳動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシン、好ましくは、ウシ等の偶蹄類（例えば、配列番号１２）、ヒトなど（例えば、配列番号１０）の霊長類のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンと組み合わせて利用されることが好ましい。また、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属、およびグィラルディア属等の藻類は、真正細菌である大腸菌でも真核生物であるヒトの細胞でもよく発現するという重要な性質を有する点においても好ましい。
　本明細書において「イオンポンプ型受容体ロドプシン」とは、イオンを輸送する機能を有する任意のポンプ型のロドプシンを指す。光を感受すると、水素イオン、塩化物イオンまたはナトリウムイオン等のイオンを能動輸送することにより機能する。
　本明細書において「イオンチャネル型受容体ロドプシン」とは、イオンを輸送する機能を有する任意のチャネル型のロドプシンを指す。光を感受すると、細胞内に水素イオン、塩化物イオンまたはナトリウムイオン等のイオンを流入させることにより機能する。
　本明細書において「Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシン」とは、真核細胞の細胞質膜上もしくは、細胞内部の構成膜上に存在する受容体の一種であるＧタンパク質共役型受容体に分類されるロドプシンを指す。Ｇタンパク質共役型受容体は細胞質膜を貫通する７つのαへリックス構造をもち、Ｎ末端側が細胞外にＣ末端側が細胞内に存在し、３つの細胞外ループ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｏｐ；　ＥＣＬ１／２／３）と３つの細胞内ループ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｏｐ；　ＩＣＬ１／２／３）を持つといわれている。ロドプシンはアポタンパク質と発色団レチナールより構成されており、レチナールが光を吸収することによって異性化しタンパク質部分の構造変化を起こし、Ｇタンパク質を介して細胞内シグナル伝達系を駆動する。
　本明細書において、「網膜の疾患、障害または症状」とは、網膜に関する任意の疾患、障害または症状をいい、網膜変性疾患（網膜色素変性症、加齢黄斑変性など）や、網膜症（例えば、糖尿病網膜症、増殖網膜症、単純網膜症など）、飛蚊症、網膜裂孔、網膜剥離（例えば、裂孔原性網膜剥離、非裂孔原性網膜剥離など）等を挙げることができ、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、近視性黄斑症、黄斑ジストロフィ、糖尿病網膜症、網膜剥離等を予防、治療または進行抑制を行うことができる。障害、または症状には、視力、コントラスト感度、明暗順応、色覚等の障害およびそれらに関連する症状を挙げることができる。
　本明細書において「視覚認知行動機能」とは、視覚器官（眼など）によって認知された視覚情報が、対象となる生物の行動となって機能することをいい、例えば、明暗判定機能、明所忌避機能、危機回避機能などの実際の行動となって表れることをいう。光感受性の確認のみならず、実際に動物モデルなどで検証することによって確認することができる機能である。
　本明細書において、「明暗判定機能」とは、明暗を判定することができる能力または機能をいう。その改善とは、明暗判定機能に何らかの改善があればよく、例えば、明暗判定ができなかったものができるようになることの他、ようやく明暗を弁ずることができる程度のものが、改善することなども包含される。
　本明細書において「明所忌避機能」とは、光源から遠ざかったり、明るい光を避けることができる能力または機能をいう。その改善とは、明所を忌避する能力が回復することまたは高まることをいう。
　本明細書において、「危機回避機能」とは、視覚機能に基づき、危機を回避する機能または能力を言う。その改善とは、危機回避能力が再生することのほか、レベルが高くなることも包含される。
　本明細書において「視覚機能」の「強化」または「増強」は、任意の視覚機能（例えば、視力、色覚、コントラスト感度、明暗順応等）の改善、強化または増強を指す。
　本明細書において、「視力改善」とは、視力が改善または回復することをいう。視力は、例えば、ヒトであればランドルト環を用いた視力検査の他、スネレン視標やＥチャートで測定し、小数視力や分数視力で表すことができる。これらは、ｌｏｇＭＡＲ視力でも表示することができる。マウスの場合は、明暗縞模様の空間周波数を操作した視覚刺激を用いて測定することができる。実験的には、視覚誘発電位を測定することで判定することもできる。
　本明細書において、「物体認識機能」とは、視覚により物体を認識する機能または能力をいう。「物体認識機能」には、「明暗判定機能」だけでなく、一定以上の「視力」も必要となる。その改善とは、物体認識機能に何らかの改善があればよく、例えば、物体認識機能ができなかったものができるようになることの他、ようやく物体を認識することができる程度のものが、改善することなども包含される。
　本明細書において、「網膜変性疾患」は、網膜が変性することによって生じる任意の疾患をいい、例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性などを挙げることができる。
　本明細書において「網膜色素変性症」は、網膜に異常がみられる遺伝性疾患であり、網膜の視細胞および色素上皮細胞が広範に変性する疾患である。夜盲（暗いところでものが見えにくい）、視野狭窄（視野が狭い）、視力低下の３つの症状が現れる。視細胞のうち桿体細胞のみの変性を桿体ジストロフィ、桿体細胞と錐体細胞両者の変性を桿体錐体ジストロフィと称する。遺伝子治療、人工網膜、網膜再生、視細胞保護治療などについて研究が推進されているが治療法が確立されていない。両眼性進行性で、早いものでは小児期に社会的失明状態になることも多いことから、進行抑制が実現することは、非常に意義が高い。
　本明細書において「網膜色素変性症」は、常染色体劣性遺伝性のもののほか、常染色体優性遺伝性やＸ染色体劣性遺伝性のものもある。最も多いのは常染色体劣性遺伝を示すタイプでこれが全体の３５％程度、次に多いのが常染色体優性遺伝を示すタイプでこれが全体の１０％、最も少ないのがＸ連鎖性遺伝（Ｘ染色体劣性遺伝）を示すタイプでこれが全体の５％程度となっている。
　本明細書において「進行抑制」はある疾患（例えば、網膜色素変性症）の進行が抑制されることを言い、抑制には、治療がなかった場合との比較で悪化の速度が減少していることのほか、疾患レベルが維持されることや改善されることも包含される。ある疾患が発症していない場合は、「発症予防」に該当することとなる。本明細書において「発症」とは、疾患の自覚症状が現れていない状態から自覚症状が現れることをいい、例えば、夜盲、視野狭窄、羞明、視力の低下や色覚異常などの症状が自覚症状として挙げることができる。
　本明細書において「発症」「直後」とは、患者に自覚症状が現れた時点から、一定程度の期間以内を指し、例えば、１年以内、６カ月以内、３カ月以内等を指すが、これらに限定されない。
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本開示の実施形態に係る抗体が「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が塩、または溶媒和物を形成していてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸がＬ型、またはＤ型であってもよい。それらのような場合でも、本開示の実施形態に係るタンパク質は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。タンパク質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えば、Ｎ末端修飾（例えば、アセチル化、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、または側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。本開示の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「キメラ」（タンパク質、ロドプシン）とは、同一の実体（この場合タンパク質、ロドプシンなど）において、異なる生物に由来する遺伝情報が混合している状態のものをいう。キメラタンパク質は、例えば、２つ、あるいは３つ以上の生物に由来する遺伝子配列が混在している。キメラタンパク質に含まれる配列情報は、混合する生物に由来する配列以外の別の配列を含んでいてもよい。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ－５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の塩基配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。なお、核酸の配列は、塩基配列というほか、核酸配列、ヌクレオチド配列などとも称するが、いずれも同じ意味である。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１－９８（１９９４））。文脈に応じて本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。本明細書において核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
　本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
　本明細書において、「核酸コンストラクト」、「コンストラクト」または「遺伝子コンストラクト」は互換可能に使用され、天然に存在する遺伝子から単離されるか、または天然には存在しない様式で組み合わせ、並置した核酸と、ベクターとを含む核酸分子である。
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。「同一性」は、同一のアミノ酸の配列の相当する程度をいい、「類似性」は、同一のアミノ酸のほか、性質が類似するアミノ酸を含め、配列の相当する程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本開示の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。
　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．２．２８（２０１３．４．２発行）を用いて行うことができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３－５８７７，１９９３）。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓまたはＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴによって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３－４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
　本開示で使用される核酸またはタンパク質は、対象となるアミノ酸または塩基配列において１もしくは複数のアミノ酸またはヌクレオチドが置換、欠失および／または付加された配列を含み得る。ここで、キメラタンパク質全長アミノ酸配列において「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。また、ドメインのアミノ酸配列において、「１もしくは複数」とは、通常、６アミノ酸以内であり、好ましくは５アミノ酸以内であり、更に好ましくは４アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。キメラタンパク質の本開示の生物学的活性を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらは本明細書において「保存的置換」ともいう。なお、あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することは公知である（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２－５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆　Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７－６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４，１４３１－１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ－ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９－６４１３）。したがって、本開示の一実施形態において「数個」は、例えば、１０、８、６、５、４、３、または２個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。欠失等がなされたキメラタンパク質は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、または抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（ＴＯＹＯＢＯ　ＣＯ．，　ＬＴＤ．）を使用できる。欠失等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、ＦＡＣＳ解析やＥＬＩＳＡ等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
　本明細書において、「シグナル配列」とは、タンパク質またはペプチドに機能的に連結される時、連結されたタンパク質またはペプチドの機能する位置への輸送を促進するアミノ酸配列をいう。シグナル配列が連結されたタンパク質が膜タンパク質である場合、小胞体移行シグナルペプチドまたは小胞体輸出シグナルペプチドを連結してもよい。
　本明細書において、「小胞体移行シグナルペプチド」とは、小胞体への移行を促進するタンパク質のアミノ末端に付与される５～１０アミノ酸程度の疎水性アミノ酸を中心とするアミノ酸である。小胞体へ移行することが知られているタンパク質中の特定のアミノ酸配列を欠失または変異させたとき、小胞体への移行が顕著に低下する場合、その特定のアミノ酸配列が小胞体移行シグナルであると判断することができる。
　本明細書において、「小胞体輸出シグナルペプチド」とは、タンパク質の、小胞体からゴルジ体などの他のオルガネラへの輸送を促進するアミノ酸である。ＥＲ２配列などが知られている。小胞体にとどまることが知られているタンパク質に特定のアミノ酸配列を付与したとき、付与しないタンパク質と比較して顕著に小胞体から輸送される場合、その特定のアミノ酸配列を小胞体輸出シグナルペプチドであると判断することができる。
　本開示の一実施形態において、本開示のキメラタンパク質のアミノ酸配列および核酸配列は、基準となる配列の、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の同一性または類似性を有していてもよい。本明細書において、アミノ酸配列または塩基配列について、「７０％以上」は、例えば、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％以上などであってもよく「８０％以上」は、例えば、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％以上であってもよく「９０％以上」は、例えば、９０、９５、９６、９７、９８、９９％以上であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。「相同性」は、２つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＧＥＮＥＴＹＸ等）。「同一性」の場合は、同一のアミノ酸の割合、「類似性」の場合は、類似するアミノ酸の割合を算出する。類似なアミノ酸としては、保存的置換が可能なアミノ酸を挙げることができるがこれらに限定されない。
　本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本開示のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。（１）洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる（例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、または（３）２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベーションし、次に約３７－５０℃で１×ＳＳＣでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は５０％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、５、１５、３０、６０、もしくは１２０分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はＡｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５～６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第３番、Ｖｏｌ．１、７．４２－７．４５　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０－５０°Ｃでの、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ－６×ＳＳＣ（または約４２°Ｃでの約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０°Ｃ、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本開示において使用されるポリペプチドには、本開示で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
　本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。
　本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸あるいは部分とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ロドプシン）において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドあるいは部分と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいい、複合分子にあっては対応する部分（例えば、ヘパラン硫酸等）をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ－Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。このような対応する領域またはドメインは、本開示において複合分子を設計する場合に有用である。
　本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、ヒトのロドプシンは、それぞれ、他の動物（特に哺乳動物）において、対応するロドプシンを見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ロドプシン等）は、配列番号９～１６等の配列をクエリ配列として用いてその動物の配列を含むデータベースを検索することによって見出すことができる。
　本明細書において「一部」、「フラグメント」または「断片」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１～ｎ－１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーまたは標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーまたは標的分子としての機能を有する限り、本開示の範囲内に入ることが理解される。
　本開示に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書では、「生物学的活性」は、光反応の活性化などを含む。
　本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「ロドプシン」またはそのキメラの機能的等価物は、ロドプシンまたはそのキメラ自体ではないが、ロドプシンまたはそのキメラの変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、ロドプシンまたはそのキメラの持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、ロドプシンまたはその抗体自体またはこのロドプシンまたはそのキメラの変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ロドプシンまたはそのキメラまたはロドプシンまたはそのキメラ変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本開示の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換および／もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換および／もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ロドプシンのアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
　非経口投与の場合、単位投与量アンプルもしくは多投与量容器またはチューブ内に収容された状態に製剤化してもよく、また、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤も含有させてもよい。また、非経口投与の場合における製剤は、使用時に、適当な担体（滅菌水等）で再溶解可能な粉体に製剤化されてもよい。
　非経口投与としては、硝子体内投与、結膜下投与、前房内投与、点眼投与等が挙げられ、硝子体内投与であることが好ましい。本開示の組成物などは、上記で述べたような方法で、ヒトに投与することにより、治療、予防、進行抑制などに用いることができる。
　本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、網膜変性疾患）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う１つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。本開示は、遺伝子疾患を対象とするため、事前に遺伝子を検査して、患者を治療してもよい。
　本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、網膜変性疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。本開示の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される１つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。
　本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、網膜変性疾患）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本開示の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本開示の薬剤を用いて例えば、網膜変性疾患等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、網膜変性疾患等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、核酸、核酸コンストラクト、目的の核酸を遺伝子導入された細胞、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、核酸、核酸コンストラクト、目的の核酸を遺伝子導入された細胞、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
　本明細書における「有効成分」は、本開示の組成物などが目的とする治療、予防または進行抑制などの効果を得るために必要な量で含有される成分を指し、効果が所望のレベル未満にまで損なわれない限りにおいて、他の成分も含有されてよい。また、本開示の医薬、組成物などは製剤化されたものであってもよい。また、本開示の医薬、組成物などの投与経路は、経口または非経口のいずれであってもよく、製剤の形態等に応じて適宜設定することができる。
　本明細書において「指示書」（添付文書や米国ＦＤＡが利用するラベルなどを含む）は、本開示を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本開示の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、網膜への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本開示が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ　ｉｎｓｅｒｔ）やラベル（ｌａｂｅｌ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
（キメラロドプシンの新規コンストラクト）
　本開示は、キメラロドプシンの新規核酸コンストラクトを提供する。本開示で用いられるキメラロドプシンは、本開示の目的を達成することができる限り、どのようなものでもよい。本開示で用いられるキメラロドプシンは、代表的には、イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質である。代表的な例を説明すると、繰り返し使用できる微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンの一部に、動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部を融合することで、微生物由来のイオン輸送型受容体イオンチャネル型受容体ロドプシンが持つ繰り返し活性化する機能を保持しつつ、Ｇタンパク質共役型受容体による内在性のＧタンパク質を介した高い活性を得ることができ、これを、さらに本開示の核酸コンストラクトを生成することで、優れた網膜の疾患、障害および症状に対する治療、改善、および予防、進行抑制効果をより改良することができる。
１つの局面において、本開示は、イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラロドプシンおよびシグナル配列をコードする核酸コンストラクトを提供する。別の局面において、本開示は、イオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラロドプシンの核酸コンストラクトを提供する。イオンチャネル型受容体ロドプシンとしては、藻類のロドプシンを使用することができる。藻類はグィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ　ｔｈｅｔａ）であってもよい。好ましい実施形態において、本開示のキメラロドプシンは、グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ　ｔｈｅｔａ）のロドプシンのアミノ酸配列のうち、細胞質側の第２ループおよび／または細胞質側の第３ループのアミノ酸配列が、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループおよび／または細胞質側の第３ループのアミノ酸配列に置き換えられたものである。
　１つの実施形態では、本開示のキメラタンパク質において用いられるイオン輸送型受容体ロドプシンとしては、イオンポンプ型受容体ロドプシン、イオンチャネル型受容体ロドプシンを使用することができる。好ましい実施形態では、イオン輸送型受容体ロドプシンとしては微生物由来のものが好ましく、例えば、例えば、シアノバクテリア（藍色細菌）のものが代表的であり、例えば、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属等の真正細菌、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、グィラルディア（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ）属等の真核生物等に属する微生物由来のロドプシンが挙げられる。グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属としては、グロエオバクター・ビオラセウス（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）等が挙げられる。ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属としては、ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ　ｃａｒｔｅｒｉ）等が挙げられる。クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属としては、クラミドモナス・ラインハーティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）等が挙げられる。グィラルディア（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ）属としては、グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ　ｔｈｅｔａ）等が挙げられる。
　１つの実施形態では、本開示のキメラタンパク質において用いられるＧタンパク質共役型受容体ロドプシンとしては、動物由来のものが代表的であり、げっ歯類、偶蹄類、奇蹄類、霊長類、食肉類などに由来するロドプシンが好ましく、より好ましくは偶蹄類または霊長類が好ましくさらに好ましくは霊長類のロドプシンが好ましい。また、好ましいＧタンパク質共役型受容体ロドプシンとしては、例えば、ウシ、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ等由来のロドプシンが挙げられる。これらのうち、ウシまたはヒト由来のロドプシンが、特に好ましい。
　特定の実施形態では、本開示の核酸コンストラクト等がコードするキメラタンパク質は、イオン輸送型受容体ロドプシンの一部とＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部を含むキメラタンパク質であり、７回膜貫通型構造を有する。本開示において、イオン輸送型受容体ロドプシンの一部とＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部とを含むキメラタンパク質は、イオン輸送型受容体ロドプシンを繰り返し活性化させる機能とＧタンパク質共役型受容体ロドプシンによるＧタンパク活性の両方を高く有するように設計されることが好ましい。この観点で、両者の活性を高く維持し、特に、高い視覚機能再生能を奏することから、本開示の核酸コンストラクトがコードするキメラタンパク質は、イオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列のうち、細胞質側の第２ループおよび／または細胞質側の第３ループのアミノ酸配列が、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループおよび／または細胞質側の第３ループのアミノ酸配列に置き換えられたものであることが好ましい。なお、「細胞質側の第２ループ」、「細胞質側の第３ループ」とは、それぞれが７つのループのうちＮ末端側から２番目、Ｎ末端側から３番目に位置するループのことを指す。
　１つの実施形態では、本開示の核酸コンストラクトがコードするキメラタンパク質は、配列番号１４（ＧＲ）のアミノ酸配列の１３２番目に相当するグルタミン酸がグルタミンに置換されたアミノ酸配列を有することが有利である。グルタミン置換されたアミノ酸配列の例は、配列番号５に示すアミノ酸配列等を挙げることができるがそれらに限定されない。
　本開示のＤＮＡ等の核酸を取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調製する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）が挙げられる。
　本明細書において、本開示の核酸コンストラクトがコードするキメラタンパク質の調製は、例えば、本開示の核酸コンストラクト等を含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで行うことができる。例えば、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、本開示の核酸コンストラクト等がコードするキメラタンパク質を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体または培養液から回収することにより、本開示のキメラタンパク質を得ることができる。
　より具体的に説明すると、適当な発現ベクターに上述の本開示の核酸コンストラクト等を挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物および／または真核生物の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、本開示の核酸コンストラクト等の核酸を大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチド（キメラタンパク質）を取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１－２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
　また、発現ベクターは、キメラタンパク質を合成するのみならず、本開示の組成物などにおいても利用することができる。すなわち、本開示の組成物などは、上述の本開示の核酸コンストラクト等が組み込まれた発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよい。かかる発現ベクターをヒトに直接導入することで、網膜の疾患、障害または症状の治療、予防および進行抑制などに用いることができる。この場合におけるベクターは、ヒトの細胞内に導入可能なベクターを用いる。かかるベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、レンチウイルスベクターが好適である。
　ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できる。その具体例としては、特に限定されないが、例えば、細菌を宿主とした場合、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）が挙げられる。また、発現ベクターを本開示の視覚機能再生剤または視覚機能低下予防剤の有効成分として用いる場合、例えば、上述のＡＡＶベクター等を眼内に注射することで導入することができる。
　発現ベクターを導入する宿主は、発現ベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１－２９５９９号公報参照）、あるいは、ヒト、マウス等の動物が挙げられる。形質転換体の培養は、キメラタンパク質が大量にかつ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）。
　キメラタンパク質の単離方法および精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）が挙げられる。
　１つの実施形態では、本開示の核酸コンストラクト等は、以下のいずれかを含み得る：
（Ａ）配列番号１、３または２６に記載のヌクレオチド配列を含む塩基配列；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示す核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｆ）配列番号２、４または２７に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｉ）（Ｆ）～（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであって、かつ、該ポリヌクレオチドがコードするキメラタンパク質が生物学的活性を有する。
　具体的な実施形態では、本開示の核酸コンストラクト等は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドコードしうる：
（ａ）配列番号２、４または２７に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４または２７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；（ｆ）（ｄ）または（ｅ）に示す核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）～（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）～（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）～（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチドを含み、かつ、生物学的活性を有するか、あるいは、本開示のキメラタンパク質は、以下のいずれかに記載の核酸がコードするアミノ酸配列を含み得る：
　（ａａ）配列番号２、４または２７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号１、３または２６に記載される塩基配列を有する核酸
　（ｂｂ）配列番号２、４または２７記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号１、３または２６に記載される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸
　（ｃｃ）配列番号２、４または２７に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、核酸
　（ｄｄ）配列番号２、４または２７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有する核酸；あるいは
（ａａａ）配列番号１、３または２６に記載の塩基配列またはそのフラグメント；
（ｂｂｂ）（ａａａ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する核酸；
（ｃｃｃ）（ａａａ）または（ｂｂｂ）に対して１または複数のヌクレオチドが置換、付加および／または欠失を有する塩基配列；
（ｄｄｄ）（ａａａ）～（ｃｃｃ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
を含み、かつ、該キメラタンパク質が生物学的活性を有する核酸。
　特定の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号１、３または２６に示される核酸配列と少なくとも６個以上トリプレットが共通する核酸配列であってもよい。別の実施形態において、本開示の核酸コンストラクトは、配列番号１、３または２６と同一のアミノ酸をコードする核酸配列のうち、配列番号１、３または２６に示される核酸配列と、６、９～１３、１５、１６、１８～２２、２７～２９、３１～３６、３９、４０、４３、４５、４８、５０、５１、５３～５５、５８、５９、６１、６５～７３、７５～８４、８６、８８、８９、９３、９７、９８、１００、１０１、１０４、１０６～１０８、１１０、１１２、１１４、１１５、１２２、１２３、１２５、１２８、１３１、１３３、１３９、１４３、１４５、１４６、１５５、１５７、１６２、１６５、１６７、１６９～１７１、１７４、１７６、１７９、１８２、１８３、１８６～１８９、１９３～１９８、２０４、２０５、２０７、２０９、２１２、２１５、２１６、２１８～２２０、２２４、２２５、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３～２３５、２３８、２４０、２４２、２４３、２４６、２４７、２４９、２５１、２５３～２５５、２５７～２５９、２６１～２６４、２６６～２７０、２７２、２７３、２７５、２７６、２７９、２８１～２８７、２８９～２９１、２９６～２９９、３０２～３０５、３０７～３１６、３１８、３１９、３２１～３３０番目のアミノ酸をコードするトリプレットのうちの少なくとも１つが共通する核酸配列を含み得る。
　上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループをコードする核酸配列としては以下の核酸配列を有するものが好ましい。
（Ａ）配列番号１７または１８に記載のヌクレオチド配列を含む塩基配列；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示す核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｆ）配列番号１９または２５に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｉ）（Ｆ）～（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド。
　特定の実施形態において、上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループをコードする核酸配列は、配列番号１７に示される核酸配列と少なくとも２つトリプレットが共通する核酸配列が好ましい。
　あるいは、上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループとしては、以下に記載の核酸がコードするアミノ酸配列を有するものが好ましい。
　（ｉ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｉｉ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸；
　（ｉｉｉ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｉｖ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸；
　　あるいは、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループをコードする核酸が、以下のいずれかであることが好ましい。
　特定の実施形態において、上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループをコードする核酸配列は、配列番号１９または２５に示される核酸配列と少なくとも１つトリプレットが共通する核酸配列が好ましい。
　（ｉ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｉｉ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸；
　（ｉｉｉ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｉｖ）配列番号１９または２５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸：
　（ｘ）配列番号１９または２５に記載の塩基配列またはそのフラグメントを有する核酸；
　（ｙ）（ｘ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する核酸；
　（ｚ）（ｘ）または（ｙ）に対して１または複数のヌクレオチドが置換、付加および／または欠失を有する核酸；
　（ｗ）（ｘ）～（ｚ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸、
を有し、かつ、該ループが生物学的活性を有する。
　上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループをコードする核酸配列としては以下の核酸配列を有するものが好ましい。
（Ａ）配列番号２０または２１に記載のヌクレオチド配列を含む塩基配列；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示す核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｆ）配列番号２２に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｉ）（Ｆ）～（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド。
　上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループとしては、以下のいずれかに記載の核酸がコードするアミノ酸配列を有するものが好ましい：
　（ｌ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｋ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸；
　（ｍ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｎ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸。
　　あるいは、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループをコードする核酸が、以下のいずれかであることが好ましい：
　（ｌ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｋ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸；
　（ｍ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸；
　（ｎ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸；
（ｘｘ）配列番号２０に記載の塩基配列またはそのフラグメントを有する核酸；
（ｙｙ）（ｘｘ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する核酸；
（ｚｚ）（ｘｘ）または（ｙｙ）に対して１または複数のヌクレオチドが置換、付加および／または欠失を有する核酸；あるいは
（ｗｗ）（ｘｘ）～（ｚｚ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸、
を有し、かつ、該ループが生物学的活性を有する。
　本開示はまた、以下：
（Ａ）配列番号２、４または２７に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号１、３または２６に記載の塩基配列またはそのフラグメント；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する核酸；
（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）のいずれかに対して１または複数のヌクレオチドが置換、付加および／または欠失を有する塩基配列；
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
のうちの１つを有する核酸であって、該核酸がコードするタンパク質が生物学的活性を有する、核酸をも提供する。
　１つの局面において、本開示は、イオンチャネル型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸を提供する。イオンチャネル型受容体ロドプシンとしては、これに限定されないが、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、グィラルディア（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ）属等の真核生物等に属する微生物由来のロドプシンが挙げられる。好ましい実施形態において、イオンチャネル型受容体ロドプシンはグィラルディア（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ）属としては、グィラルディア・セータのロドプシンであり、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンはウシロドプシンである。
　１つの実施形態では、本開示の核酸コンストラクト等は、以下のいずれかを含み得る：（Ａ）配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含む塩基配列；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示す核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；　
（Ｆ）配列番号８に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｉ）（Ｆ）～（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであって、かつ、該ポリヌクレオチドがコードするキメラタンパク質が生物学的活性を有する。
　特定の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号７に示される核酸配列と少なくとも１４個以上トリプレットが共通する核酸配列であってもよい。別の実施形態において、本開示の核酸コンストラクトは、配列番号７と同一のアミノ酸をコードする核酸配列のうち、配列番号７に示される核酸配列と、１、２、４～９、１１～１７、２１、２２、２７～３０、３３、３４、３６～４１、４３、４５、４８、４９、５１、５４、５６～５８、６０、６３、６５、６８、７０、７１～７５、７７～７８、８１、８３、８４、８６、８９、９０、９２、９３、９５、９７～９９、１０２、１０３、１１１、１１３、１１４、１２３、１２５、１３０、１３１～１３７、１３９、１４２、１４３、１４６、１４８～１５３、１５６、１６０、１６１、１６５、１６７、１６８、１７０、１７１、１７４～１７６、１８０、１８２、１８３、１８７、１８８、１９０、１９１、１９６、１９７、１９９、２００、２０２、２０４、２０８、２１２～２１４、２１７、２１９、２２６、２２９、２３２、２３６～２３８、２４０、２４２、２４３、２４７、２４８、２５１、２５２、２５８、２６３～２６５、２６７、２６９、２７１、２７２、２７４、２７６～２８０、２８２～２８４、２８９、２９０、２９１、２９４、２９７～２９９、３０２、３０４、３０７、３１０番目のアミノ酸をコードするトリプレットのうちの少なくとも１つが共通する核酸配列を含み得る。
　具体的な実施形態では、本開示の核酸コンストラクト等は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドコードしうる：
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；（ｆ）（ｄ）または（ｅ）に示す核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）～（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）～（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）～（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチドを含み、かつ、生物学的活性を有するか、あるいは、本開示のキメラタンパク質は、以下のいずれかに記載の核酸がコードするアミノ酸配列を含み得る：
　（ａａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号７に記載される塩基配列を有する核酸
　（ｂｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号７に記載される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸
　（ｃｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、核酸
　（ｄｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有する核酸；あるいは
（ａａａ）配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント；
（ｂｂｂ）（ａａａ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する核酸；
（ｃｃｃ）（ａａａ）または（ｂｂｂ）に対して１または複数のヌクレオチドが置換、付加および／または欠失を有する塩基配列；
（ｄｄｄ）（ａａａ）～（ｃｃｃ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
を含み、かつ、該キメラタンパク質が生物学的活性を有する核酸。
　本開示はまた、以下：
（Ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する核酸；
（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）のいずれかに対して１または複数のヌクレオチドが置換、付加および／または欠失を有する塩基配列；
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
のうちの１つを有する核酸であって、該核酸がコードするタンパク質が生物学的活性を有する、核酸をも提供する。
　本明細書において「生物学的活性」の代表例としては、そのループが持つＧタンパク質共役型受容体の機能（例えば、膜移行効率）を挙げることができ、このほか、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症）の予防および進行抑制、視覚認知行動機能（例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および／または危機回避機能）、および視力増強の効果を発揮することができる機能を挙げることができる。ループの場合の生物学的活性は、立体構造的相性および膜移行効率などの機能を挙げることができるがそれらに限定されない。あるいは、ループの機能は、組み込まれたタンパク質全体（ここではロドプシン）の機能で評価してもよい。
　本開示において、本開示のキメラタンパク質およびそれをコードする核酸に、網膜の疾患、障害または症状を予防またはその進行を抑制する用途、視覚認知行動機能（例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および／または危機回避機能）または物体認識機能を改善する用途、および視力改善などの視覚機能増強効果をもたらすための用途が見いだされた。
　現在に至るまで治療法がない眼疾患の一つとして、網膜色素変性症・萎縮型加齢黄斑変性をはじめとする網膜変性疾患があるが、これらの根本治療が本開示によって提供される可能性がある。世界的には患者数は合計で１億３千万人超といわれ、我が国では網膜色素変性症は中途失明原因の第３位、加齢黄斑変性は第４位を占めており、その患者数の多さや視覚障害の重さから治療法の開発が大きく望まれていたが、本開示により解決される可能性がある。
　視覚の１次ニューロンである視細胞は中枢神経と同様、一度失われてしまうと再生することができないが、網膜色素変性症や萎縮型加齢黄斑変性では視覚の２次・３次ニューロンに当たる双極細胞や網膜神経節細胞は保たれているため、本開示が奏効する一因になるものと考えられる。本開示は、少ない侵襲で安全かつ長期的な視覚再生効果が期待できるオプトジェネティクスを利用した遺伝子導入治療である。従来の光活性化イオンチャネルを導入する手法とは全く異なり、内在性のＧタンパク質シグナルカスケードとチャネルを利用する本来のより生理的な光伝達経路を使うことで、効率が高く安全な視覚再生が可能となった。従来の光活性化イオンチャネルを導入する手法は網膜変性の既に進行してしまった患者を対象とした再生であったが、本法は通常の光伝達に必要なＶｉｓｕａｌＣｙｃｌｅというレチナールの代謝再生系を必要としないため、網膜変性の進行抑制効果も期待できる。これによって、既に網膜変性の進行した患者だけでなく、初期段階の患者の進行予防にも応用できることが実証された。
　１つの局面において、本開示は、イオン輸送型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸を提供する。１つの実施形態において、シグナル配列は、小胞体移行シグナル配列または小胞体輸出シグナル配列である。特定の実施形態において、シグナル配列は、小胞体輸出シグナル配列である。さらに特定の実施形態において、小胞体輸出シグナルは、ＥＲ２シグナルである。
　小胞体輸出シグナルは、タンパク質の膜輸送にプラスに働くことが報告されている（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２００１　Ｍａｒ　３０；４９３（２－３）：１２９－３３．）。ＥＲ２単体での評価は行っていないものの、ピーク電流は約１．７倍程度増えることが報告されている。他方で、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０　Ｊａｎ　７；４６３（７２７７）：９８－１０２ではシグナル配列の付与による電流増強効果は見出されていない。
　１つの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号１または２６に示す核酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号１または２６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
　１つの実施形態において、本開示の核酸は、ＦＬＡＧタグをコードする核酸配列をさらに含み得る。１つの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号３に示す核酸配列を含む。一部の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
　１つの局面において、本開示は、イオン輸送型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列を含む、ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、イオン輸送型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる。別の実施形態において、シグナル配列は、小胞体移行シグナル配列または小胞体輸出シグナル配列である。特定の実施形態において、シグナル配列は、小胞体輸出シグナル配列である。
　１つの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２または２７に示すアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２または２７に示すヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
　１つの実施形態において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号２または２７に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、配列番号２または２７に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
　１つの実施形態において、本開示は、本開示のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号４に示すヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸を含むか、またはそれからなる。
　１つの局面において、本開示は、イオンチャネル型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸を提供する。１つの実施形態において、本開示の核酸は、シグナル配列をコードする核酸配列を含んでもよい。特定の実施形態において、シグナル配列は、小胞体移行シグナル配列または小胞体輸出シグナル配列である。特定の実施形態において、シグナル配列は、小胞体輸出シグナル配列である。
　１つの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号７に示す核酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
　１つの実施形態において、本開示の核酸は、任意のＦＬＡＧタグをコードする核酸配列を含み得る。
　１つの局面において、本開示は、イオンチャネル型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列を含む、ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、イオンチャネル型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる。別の実施形態において、シグナル配列は、小胞体移行シグナル配列または小胞体輸出シグナル配列である。特定の実施形態において、シグナル配列は、小胞体輸出シグナル配列である。
　１つの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、またはそれからなる。
　１つの実施形態において、本開示は、本開示のポリペプチドをコードする核酸を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本開示の核酸は、配列番号８に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含むか、またはそれからなる。
　１つの局面において、本開示は、本開示の核酸および核酸に作動可能に連結された、細胞における発現を可能にする核酸を含む、核酸コンストラクトを提供する。１つの実施形態において、本開示の核酸コンストラクトは、ベクターをさらに含む。一部の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、人工染色体ベクターおよびホスミドベクターからなる群から選択される。特定の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。別の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択される。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。
　１つの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－２またはＡＡＶ－６である。好ましい実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ－ＤＪ、またはＡＡＶ－６であり得る。双極細胞への感染効率は、２型ＡＡＶに比べて、ＤＪ型や６型の方が高い。
　１つの局面において、本開示は、本開示の核酸または核酸コンストラクトを含む、遺伝子導入用組成物。１つの実施形態において、本開示の遺伝子導入用組成物は、注射により投与される。別の実施形態において、本開示の遺伝子導入用組成物は、硝子体内に投与される。特定の実施形態において、本開示の遺伝子導入用組成物は保存液と共に提供され得る、一部の実施形態において、保存液は、緩衝液であり得る。他の実施形態において、本開示の遺伝子導入用組成物は、容器に格納された状態で提供され得る。特定の実施形態において、本開示の遺伝子導入用組成物を格納する容器は、シリンジであり得る。
　別の局面において、本開示は、本開示の核酸、ポリペプチド、または核酸コンストラクトを含む、細胞を提供する。一部の実施形態において、本開示の細胞は、網膜細胞であり得る。別の実施形態において、本開示の細胞は、細胞製剤として提供され得る。細胞製剤は、細胞および細胞用保存液を含む。一部の実施形態において、細胞用保存液は、培養培地または緩衝液あり得る。他の実施形態において、本開示の細胞は、容器に格納された状態で提供され得る。特定の実施形態において、本開示の細胞を格納する容器は、シリンジであり得る。
　他の局面において、本開示は、本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物または細胞を含む、医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、本開示の医薬組成物は、網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための医薬組成物であり得る。１つの実施形態において、本開示の医薬組成物は、視覚認知行動機能の改善のための医薬組成物であり得る。１つの実施形態において、本開示の医薬組成物は、視覚機能を強化するための医薬組成物であり得る。１つの実施形態において、本開示の医薬組成物は、物体認識機能を改善するための医薬組成物であり得る。本開示において、網膜変性色素症の進行抑制に代表される、網膜の疾患、障害または症状を予防またはその進行を抑制については、実施例１～１０に示す実験によって実証したことによって確認されたものである。
　（視覚認知行動機能の改善）
　視覚認知行動機能（例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および／または危機回避機能）の改善などの機能は、本開示において実験モデルを以て検証されており、顕著な効果を奏するといえる。視覚認知行動機能（例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および／または危機回避機能）の効果は、実施例５で実証した、明暗箱選択試験（ＬＤＴ）による試験の結果、実証されたものである。視覚認知行動機能は、視覚器官の光感受性の確認のみならず、実際に動物モデルなどで行動として現れるかを検証することによって確認することができる機能である。実施例５のような実験での検証ができたことが本開示の成果の一つであるといえる。視覚認知行動機能の改善は、視力、コントラスト感度、明暗順応、色覚等の改善、強化または増強等を含む。
　（視覚機能強化および視力改善）
　視力改善の機能は、本開示において実験モデルを以て検証されており、顕著な効果を奏するといえる。視力改善などの視覚機能強化については、実施例４に代表される視覚誘発電位ＶＥＰの実験により実証されたことにより確認されたものである。
　（物体認識機能の改善）
　物体認識機能の改善などの機能は、本開示において実験モデルを以て検証されており、顕著な効果を発するといえる。物体認識機能の改善などの機能については、実施例６に代表される物体認識試験ＯＲＴの実験により実証されたことにより確認されたものである。視覚誘発電位ＶＥＰの実験では、光刺激の入力が中枢（脳）まで届いていること、ＬＤＴではそれが忌避反応として行動に出力されることはわかるものの、物体を認識できるレベルの視力が回復しているかどうかまではわからなかった。実施例６に示す結果において、物体を認識できるレベルの視力の回復が確認できたことは非常に臨床的な意義が高い。
　１つの局面において、本開示は、被験体の眼の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制する方法であって、治療上有効量の本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
　１つの実施形態では、前記疾患、障害または症状は、網膜変性疾患であり、網膜変性疾患としては、例えば、網膜色素変性症や加齢性黄斑変性などが好ましく、より好ましくは、網膜色素変性症が有利である。
　好ましい実施形態では、本開示が対象とする網膜色素変性症は、常染色体優性遺伝性であり、好ましくはＲＨＯ常染色体優先遺伝性である。
　好ましい実施形態では、本開示は網膜色素変性症の予防または進行抑制をする用途に用いられる。
　好ましい実施形態では、本開示は、疾患、障害または症状の発症前または発症直後、例えば、発症（例えば、自覚症状が現れる）から、１年以内、好ましくは、６カ月以内、３カ月以内、１カ月以内に被験体に投与されることが好ましいがこれらに限定されるものではない。
　１つの特定の実施形態では、本開示の組成物またはベクターは、１回投与される。本開示は１回投与することで、効果を奏することが確認されており、患者に対するコンプライアンスもよいと考えられる。
　１つの特定の実施形態では、本開示のベクターの使用量は、０．１×１０１１～１０×１０１１ｖｇ／眼の単位用量であり、例えば、下限は、０．０１×１０１１ｖｇ／眼、０．０２×１０１１ｖｇ／眼、０．０３×１０１１ｖｇ／眼、０．０４×１０１１ｖｇ／眼、０．０５×１０１１ｖｇ／眼、０．０６×１０１１ｖｇ／眼、０．０７×１０１１ｖｇ／眼、０．０８×１０１１ｖｇ／眼、０．０９×１０１１ｖｇ／眼、０．１×１０１１ｖｇ／眼、０．２×１０１１ｖｇ／眼、０．３×１０１１ｖｇ／眼、０．４×１０１１ｖｇ／眼、０．５×１０１１ｖｇ／眼などであり得、上限は、２×１０１１ｖｇ／眼、３×１０１１ｖｇ／眼、４×１０１１ｖｇ／眼、５×１０１１ｖｇ／眼、６×１０１１ｖｇ／眼、７×１０１１ｖｇ／眼、８×１０１１ｖｇ／眼、９×１０１１ｖｇ／眼、１０×１０１１ｖｇ／眼、１５×１０１１ｖｇ／眼、２０×１０１１ｖｇ／眼、３０×１０１１ｖｇ／眼、４０×１０１１ｖｇ／眼、５０×１０１１ｖｇ／眼、などであり得る。
　別の局面において、本開示は、視覚認知行動機能を改善する方法であって、治療上有効量の本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
　さらに別の局面において、本開示は、視覚機能を強化する方法であって、治療上有効量の本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
　特定の局面において、本開示は、物体認識機能を改善する方法であって、治療上有効量の本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
　１つの局面において、本開示は、被験体の眼の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための医薬の製造における、本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物の使用を提供する。
　別の局面において、本開示は、視覚認知行動機能を改善するための医薬の製造における、本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物の使用を提供する。
　さらに別の局面において、本開示は、視覚機能を強化するための医薬の製造における、本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物の使用を提供する。
　特定の局面において、本開示は、物体認識機能を改善するための医薬の製造における、本開示の核酸、ポリペプチド、核酸コンストラクト、遺伝子導入用組成物、細胞または医薬組成物の使用を提供する。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋ／１０．１００２／０４７１１４２７２７）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ）などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、必要な場合、慶應義塾大学その他において規定される基準および他の関連する倫理基準やガイドラインを遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
　（実施例１：ベクター調製）
　キメラタンパク（ＧＲ／ＢｖＲｈ）をコードするＤＮＡは以下のように作製した。Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ　Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（ＧＲ）（配列番号１４）の細胞質側の第２ループに相当するＮ末端より１３７－１４５番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシン（ＢｖＲｈ）（配列番号１２）の１３７－１４５番目のアミノ酸相当配列に置換し、また、ＧＲの細胞質側の第３ループに相当するＮ末端より１９８－２０６番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシンの２２５－２５２番目のアミノ酸相当配列に置換し、さらにＧＲの１３２番目のアミノ酸であるグルタミン酸をグルタミンに置換したキメラタンパク質をコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１ベクターに挿入した。あるいは、配列番号２３に記載の塩基配列を有する核酸を生成し、これをキメラタンパク質をコードするＤＮＡとして、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトに挿入した。配列番号２３に記載の塩基配列は、以下のようにして生成された：Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ　Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（ＧＲ）（配列番号１４）の細胞質側の第２ループに相当するＮ末端より１３７－１４５番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシン（ＢｖＲｈ）（配列番号１２）の第２ループに相当する配列番号１８に示す塩基配列（配列番号１９に示すアミノ酸配列をコードする）に置換し、また、ＧＲの細胞質側の第３ループに相当するＮ末端より１９８－２０６番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシンの第３ループに相当する配列番号２０に示す塩基配列（配列番号２２に示すアミノ酸配列をコードする）に置換して作製した。さらに、コードするアミノ酸を変更させずに、一部の塩基を変更することで、配列番号３に記載の塩基配列を作製した。具体的には、６、９～１３、１５、１６、１８～２２、２７～２９、３１～３６、３９、４０、４３、４５、４８、５０、５１、５３～５５、５８、５９、６１、６５～７３、７５～８４、８６、８８、８９、９３、９７、９８、１００、１０１、１０４、１０６～１０８、１１０、１１２、１１４、１１５、１２２、１２３、１２５、１２８、１３１、１３３、１３９、１４３、１４５、１４６、１５５、１５７、１６２、１６５、１６７、１６９～１７１、１７４、１７６、１７９、１８２、１８３、１８６～１８９、１９３～１９８、２０４、２０５、２０７、２０９、２１２、２１５、２１６、２１８～２２０、２２４、２２５、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３～２３５、２３８、２４０、２４２、２４３、２４６、２４７、２４９、２５１、２５３～２５５、２５７～２５９、２６１～２６４、２６６～２７０、２７２、２７３、２７５、２７６、２７９、２８１～２８７、２８９～２９１、２９６～２９９、３０２～３０５、３０７～３１６、３１８、３１９、３２１～３３０番目のアミノ酸をコードする核酸を、コードするアミノ酸を変えずに変異させることで作製した。変異体の作製はクイックチェンジ法により行った。なお、ウシロドプシンにおいて採用した配列部分は、ヒトロドプシンのアミノ酸配列と完全一致するため、ヒトロドプシンと称しても問題ない。
　ＡＡＶ２シャトルプラスミドに、ＥＧＦＰ、又はＧＲ／ＢｖＲｈ遺伝子をサブクローニングし、ウイルス発現コンストラクトとして、ＡＡＶ２－ＣＡＧＧＳ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ（ＥＧＦＰの発現用のベクター）、及び、ＡＡＶ２－ＣＡＧＧＳ－ＧＲ／ＢｖＲｈ－ＷＰＲＥ－ｐＡ（キメラタンパク質発現用のベクター）を作製した。ウイルスベクターのパッケージングはＨＥＫ２９３細胞にベクタープラスミド、ＡＡＶベクタープラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミドの３種類のプラスミドをトランスフェクションすることにより行い、ウイルスベクターの精製には塩化セシウム法を用いた。なお、ベクター中、「ＩＴＲ」は、「Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ」の略である。「ＣＡＧＧＳ」は、ＣＡＧプロモーターの領域の配列である。「ＷＰＲＥ」は、「ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ」の略である。「ｐＡ」は、ペプチド・タグを意味する。「ＥＧＦＰ」は、「ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ」の略である。
　キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト（以後、第１の核酸コンストラクト）と、シグナル配列付与を行ったキメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト（以後、本開示の核酸コンストラクト）との構成を図１に示す。図１に示すＥＲ２は、小胞体輸出シグナルの１種である。
　（実施例２：本開示の核酸コンストラクトを用いた多電極アレー（ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｌｅｃｔｏｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：ＭＥＡ）試験）
　本開示の核酸コンストラクトが光応答に与える影響を測定した。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用した。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入した。
　（多電極アレー）
　ここで、多電極アレーとは、模式的には、多数の電極を有する素子の上に神経細胞を配置し、神経細胞の電気応答を細胞外から記録し、電気応答の波形を解析することによって、活動した細胞の種類やその活動のタイミングおよび大きさ等を調べる手法である。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　（ＧＲ／ＢｖＲｈ）－ＷＰＲＥ－ｐＡベクター（第１の核酸コンストラクト）またはシグナル配列付与を行った、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－ｓｍ　（ＧＲ／ＢｖＲｈ－ｓｍ）－ＷＰＲＥ－ｐＡ（本開示の核酸コンストラクト）を１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与した。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にマウスの光応答を測定した。多電極アレー（Ｍｕｌｔｉｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：　ＭＥＡ）試験により、ｅｘ　ｖｉｖｏで網膜神経節細胞の光応答を、白色ＬＥＤの光刺激強度を変えて測定した。
　（結果）
　１×１０１７　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ、１×１０１６　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ、１×１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ、１×１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓおよび１×１０１３　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度により、他電極アレイを実施した結果を示す。図２および３の上部に、網膜神経節細胞の発火のラスタープロット表示を示し、各グラフにおいて縦軸に１秒間あたりの発火頻度をとったヒストグラムを示す。グラフの横軸に、時間(秒)を示す。各グラフの下部に導入したキメラタンパク質のコンストラクト、および光強度を示す。なお、１×１０１３　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度は街灯のある夜道や夜の自宅の廊下の光強度に対応し、１×１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度は自宅室内の光強度に対応し、１×１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度は商店内の光強度に対応し、１×１０１６　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度は曇天時の屋外の光強度に対応し、１×１０１７　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度は晴天時の屋外の光強度に対応するものである。第１の核酸コンストラクトでは１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ刺激までの光強度でしか応答を得られなかったが（図２）、本開示の核酸コンストラクトは１ｘ１０１３　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度まで応答が得られた（図３）。網膜色素変性症モデルマウスに、第１の核酸コンストラクトを発現させると、１×１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度まで、陰性対照よりも高い頻度で電気信号を発したのに対し、本開示の核酸コンストラクトを発現させると、１×１０１３　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度まで、陰性対照よりも高い頻度で神経節細胞の発火が得られた。さらに、各光強度において、本開示の核酸コンストラクトを導入した場合の網膜神経節細胞は、第１の核酸コンストラクトを導入した場合よりも発火頻度が高い傾向が認められ、特に１×１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度では、本開示の核酸コンストラクトは、第１の核酸コンストラクトよりも約３倍も発火頻度が高いことが見出された。加えて、１×１０１３　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度では、第１の核酸コンストラクトはほとんど発火を示さなかったのに対し、本開示の核酸コンストラクトでは網膜神経節細胞の発火が得られた。したがって、本開示の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現は、第１の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現よりも予想し得ない顕著に優れた光感度をもたらすことが実証された。
　さらに、１ｘ１０１４～１６　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度範囲において、本開示の核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高かった（図４）。また、１×１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓにおける単位面積あたりの多電極アレイを実施した結果を示す。１ｘ１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高かった（図５）。グラフの縦軸は、２．６ｍｍ２あたりで発火した網膜神経節細胞の数を示している。
　第1の核酸コンストラクトを導入した網膜神経節細胞は、１×１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの強度の光に対して、約２．７個の細胞しか発火しなかったのに対し、本開示の核酸コンストラクトを導入した網膜神経節細胞は約３３個の細胞が発火した。したがって、本開示の核酸コンストラクトは、第1の核酸コンストラクトの１２倍以上もの予想外に優れた光感度をもたらすことが実証された。
　（実施例３：波長感度評価）
　本開示の核酸コンストラクトの注射７週後の、生後１１週齢の雄のｒｄ１マウスの各波長の比視感度を測定した。波長特異的なＬＥＤで光刺激を行い、反応が得られた２５細胞のピーク発火頻度（Ｐｅａｋ　Ｆｉｒｉｎｇ　Ｒａｔｅ（ｓｐｉｋｅｓ／ｓｅｃ））を各波長で測定した。全波長中、最も反応の高かった値を１として比にし、平均を測定した。１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光刺激強度にて測定を行った。測定の結果、本開示の核酸コンストラクトを注射したマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かった（図６）。タンパク発現量と発火細胞数は比例するため、キメラロドプシンタンパク質の発現量も、発火細胞数と同程度増加していると考えられた。タンパク質発現量の増加に伴い、感度も上昇すると考えられた。
　（実施例４：視覚誘発電位の評価）
　本開示の核酸コンストラクトが視覚誘発電位（Ｖｉｓｕａｌ　Ｅｖｏｋｅｄ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＶＥＰ）に与える影響を測定した。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用した。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入した。
　（視覚誘発電位の評価方法）
　網膜から発せられた電気信号は、脳の一次視覚野（Ｖ１野）へと伝達され、この領域において神経細胞を活動させることから、中枢レベルでの視覚再生効果を確認するために、脳に電極を埋め込んで神経活動を細胞外から記録する実験も実施した。具体的には、作製したベクターを、網膜色素変性症モデルマウス（ｒｄ１）マウスに硝子体内注射し、麻酔を施した後、眼前３ｃｍに設置したＷｈｉｔｅ　ＬＥＤより０．１ｃｄｓ／ｍ２のフラッシュ刺激（この光強度はおよそ街灯のある夜道や夜の自宅の廊下の光強度に対応する）に対する誘発電位を、ＰｕＲＥＣ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（有限会社メイヨー社製）を使用して測定した。０．１ｃｄｓ／ｍ２のフラッシュ刺激を測定した。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは本開示の核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与した。コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与した。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にＶＥＰを測定した。測定の１週間前にマウスに３種混合麻酔（ｍｉｄａｚｏｌａｍ，　ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ，　ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ　ｔａｒｔｒａｔｅ　をそれぞれ４　ｍｇ／ｋｇ，　０．７５　ｍｇ／ｋｇ　ａｎｄ　５　ｍｇ／ｋｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔで投与）を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨（ラムダ縫合より１．５ｍｍ前方かつ１．５ｍｍ側方）に埋入した。再度３種混合麻酔で鎮静させた後、眼前３ｃｍに設置した白色ＬＥＤより０．１ｃｄｓ／ｍ２のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定した。測定機器はＰｕＲＥＣ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｍａｙｏ，　Ｉｎａｚａｗａ，　Ｊａｐａｎ）を使用した。
　（結果）
　図７において、縦軸に光刺激によって視覚野から得られた視覚誘発電位の振幅(μV)を示す。グラフの下部に導入したキメラタンパク質のコンストラクトを示す。コントロール（１７．８６±３．３７μＶ）、第１の核酸コンストラクト治療マウス（２２．１３±８．３８μＶ）に対して、本開示の核酸コンストラクト治療マウス（５６．４±１４．０μＶ）では有意な振幅の増加を認めた。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められた（図７）。したがって、本開示の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現は、第１の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現よりも顕著に優れた光感度をもたらすことが実証された。
　（実施例５：明暗認識機能の評価）
　本開示の核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定した。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用した。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入した。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは本開示の核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降に明暗箱移動試験（Ｌｉｇｈｔ－Ｄａｒｋ
　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ：ＬＤＴ）を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱（アクリルケース　幅：４１５ｍｍ　高さ：３００ｍｍ　奥行：２５０ｍｍが仕切りで２分割されており、片方は２０ｌｕｘの光が入り、片方は暗室となっており５ｘ５ｍｍの窓で接続されている。）にマウスを入れ１０分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
　（結果）
　健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス（コントロール）では滞在時間比はおよそ半々の０．５となった。さらに、本開示の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第１の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
　（実施例６：物体認識機能の評価）
　本開示の核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定した。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用した。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入した。
　（物体認識機能の評価方法）
　物体認識機能を評価するために、作製したベクターを、網膜色素変性症モデルマウス（ｒｄ１）マウスに硝子体内注射し、動画再生の有無による行動の相違を観察した。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、１０ｌｕｘの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流した。マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測した。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から１５分間とした。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、本開示の核酸コンストラクト（ＡＡＶ　（２／６／ＤＪ）－ＣＡＧＧＳ－　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　（ＧＲ／ＢｖＲｈ）－ＷＰＲＥ－ｐＡベクター）を１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与した。失明コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与した。さらに比較群として感度の低い微生物型ロドプシン、ＡＡＶ　ＤＪ－Ｃ１Ｖ１を投与した群も用意した。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、１０ｌｕｘの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流した。実験のために設計した空間を図８に示す。
　（測定）
　マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測した。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から１５分間とした。
　（結果）
　失明コントロール群（ＥＧＦＰ）が物体動画側滞在時間比（マウスの動画を流すエリアに滞在した時間／計測時間）が、０．４９５±０．０１９であったのに対し、ＤＪ型ＡＡＶキメラ注射では０．５５５±０．０６、６型ＡＡＶキメラ注射では０．５３８±０．０１５であり有意に高かった（図９）。
　図９の実験結果において、縦軸は、物体動画側滞在時間比（マウスの動画を流すエリアに滞在した時間／計測時間）を示す。物体動画側滞在時間比が０．５ではマウスの動きがないことを示し、０．５から離れるにつれて、視覚能と直結する物体認識機能を有するものと解釈される。
　失明コントロール群（ＥＧＦＰ）では、物体動画側滞在時間比が０．４９５±０．０１９であったのに対し、ＤＪ型ＡＡＶキメラ注射では０．５５５±０．０６、６型ＡＡＶキメラ注射では０．５３８±０．０１５であり、有意に高い結果が得られた。なお、ＡＡＶ２に組み込んだベクター（２－Ｃｈｉｍｅｒａ）では、動画を再生したケージの滞在時間が減少する傾向が認められたが、この結果は、ベクターの変化により通常とは見え方が異なることに起因して、天敵などの忌避する対象と錯覚している可能性が考えられた。
　以上の結果から、本開示のコンストラクトを発現させることによって、物体を認識できるレベルまで視力が回復されることが実証された。
（考察）
ＤＪ型や６型では、物体を認識できるレベルの視力の回復が確認できたと考えられる。２型では、目的の双極細胞での発現量が低く物体が見えていない可能性と、視覚再生は起きているが、発現パターンが異なるため、見え方が異なり、マウスの動画を忌避している可能性が考えられます。
（実施例７：イオンチャネル型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質（ＧｔＡＣＲ２／ＢｖＲｈ）の作製方法）
　イオンチャネル型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質（ＧｔＡＣＲ２／ＢｖＲｈ）は、実施例１と同様の方法を用いて作製した。Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ　ｔｈｅｔａ（ＧＴ）（配列番号１５）の細胞質側の第２ループに相当するアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシン（ＢｖＲｈ）（配列番号１２）のアミノ酸相当配列に置換し、また、ＧＴの細胞質側の第３ループに相当するアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシンのアミノ酸相当配列に置換したキメラタンパク質をコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１ベクターに挿入した。あるいは、配列番号６に記載の塩基配列を有する核酸を生成し、これをキメラタンパク質をコードするＤＮＡとして、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトに挿入した。作製した核酸配列に特定の変異を加えることで配列番号７に記載の核酸配列を作製した。具体的には、１、２、４～９、１１～１７、２１、２２、２７～３０、３３、３４、３６～４１、４３、４５、４８、４９、５１、５４、５６～５８、６０、６３、６５、６８、７０、７１～７５、７７～７８、８１、８３、８４、８６、８９、９０、９２、９３、９５、９７～９９、１０２、１０３、１１１、１１３、１１４、１２３、１２５、１３０、１３１～１３７、１３９、１４２、１４３、１４６、１４８～１５３、１５６、１６０、１６１、１６５、１６７、１６８、１７０、１７１、１７４～１７６、１８０、１８２、１８３、１８７、１８８、１９０、１９１、１９６、１９７、１９９、２００、２０２、２０４、２０８、２１２～２１４、２１７、２１９、２２６、２２９、２３２、２３６～２３８、２４０、２４２、２４３、２４７、２４８、２５１、２５２、２５８、２６３～２６５、２６７、２６９、２７１、２７２、２７４、２７６～２８０、２８２～２８４、２８９、２９０、２９１、２９４、２９７～２９９、３０２、３０４、３０７、３１０番目のアミノ酸をコードする塩基を、コードするアミノ酸を変えないように変更した。
（実施例８：本開示の核酸コンストラクトのＧＰＣＲ活性の測定）
　ＧＰＣＲ活性を、細胞内ｃＡＭＰ濃度の指標として用いられるＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）　の蛍光を観察することにより測定した。
（方法）
（材料）
　ＮＤ７／２３細胞を培養し、本開示の核酸コンストラクトにＶｅｎｕｓを挿入したＧＲ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅ－ＥＱ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｅｎｕｓ－ＥＲ２ベクターおよびｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）　ベクターを遺伝子導入した。コントロール群には、ｐｃＤＮＡ３．１　（空ベクター）およびｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）　ベクターを同量遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を培養し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンおよびＥＤＴＡを用いて細胞を剥がして遠沈管中に収集した。遠心分離により細胞を沈殿させ、新たなＤＭＥＭ培養液を加えて懸濁した。細胞濃度をもとに、蛍光顕微鏡観察に適した濃度で細胞を播きなおした。
（Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性の測定）
　細胞内における、光刺激によるシグナル伝達を解析する実験系を構築した。シグナル伝達経路の詳細は、以下のとおりである。すなわち、視細胞は、細胞膜上にＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の１種であるロドプシンを発現しており、ロドプシンはレチナールと結合している。視細胞に光が当たるとレチナールの構造が変化し、これによりロドプシンが活性化する。活性化したロドプシンは、細胞膜近傍に分布するＧタンパク質（網膜においてはＧｔ）を活性化し、このＧｔは、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼを活性化する。ｃＧＭＰホスホジエステラーゼは細胞内のｃＧＭＰを分解する酵素であるので、その活性化は細胞内のｃＧＭＰ濃度を減少させる。
　ここで視細胞は、その細胞膜上にｃＧＭＰ依存性のイオンチャネルを有する。細胞内ｃＧＭＰ濃度が低下すると、このｃＧＭＰ依存性イオンチャネルのイオン透過性が変化し、視細胞の膜電位が変化し、電気信号が生じる。このようにして、視細胞は光信号を電気信号に変換している。
　ここで、Ｇｔ型Ｇタンパク質を介した経路におけるｃＧＭＰ濃度は測定が困難であるため、本開示においては、同じＧタンパク質ファミリーであるＧｉ型Ｇタンパク質を介した経路により生じる細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定することによって、Ｇタンパク質の活性化を測定する。Ｇｔ型Ｇタンパク質とＧｉ型Ｇタンパク質は交差性を有する（例えば、Ｘｉａｎｇ　Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．、「Ｆａｓｔ　ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ａｎｄ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　ａｎｄ　ｇｒｅｅｎ　ａｌｇａｅ　ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ」、ＰＮＡＳ、２００５年１２月６日、１０２巻、４９号、１７８１６～１７８２１頁の第１７８１７頁左欄第４段落には、「脊椎動物ロドプシンは、Ｇタンパク質トランスデューシンであり、Ｇｉサブファミリーに属するαサブユニットとカップリングし（１５）、したがって、哺乳動物ロドプシンが他のＧｉ／ｏファミリーメンバーとカップリングする可能性が高まる」と記載されている）ことが、当業者には周知であるため、網膜におけるＧｔの活性化を測定するために、Ｇｉ型Ｇタンパク質を介した細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定することは、一般に行われていた。補足すると、Ｇタンパク質には複数の種類が存在し、視細胞に存在するＧタンパク質はＧｔ（Ｇαｔ）であることが知られている。Ｇｔ型Ｇタンパク質は、視細胞などの一部の細胞にのみ存在し、一般的な神経細胞にはＧｓ、ＧｉおよびＧｑ型のＧタンパク質が存在する。中でも、Ｇｓ型Ｇタンパク質はアデニル酸シクラーゼを活性化させて細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させ、これに対し、Ｇｉ型Ｇタンパク質はアデニル酸シクラーゼを抑制して細胞内ｃＡＭＰ濃度を減少させる。
　本実験においては、光刺激に応答した細胞内のシグナル伝達経路を解析するために、Ｇi型Ｇタンパク質を介した細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定した。具体的な実験手法は、以下のとおりである。
　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）２０００を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＧＲ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅ－ＥＱ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｅｎｕｓ－ＥＲ２ベクターおよび対照ベクターを、製造者の指示どおりに発現させた。ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入する実験も並行して実施した。これらの培養細胞において５２５ｎｍの１０１６　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光強度で１分間光刺激を与え、ｃＡＭＰ　Ｇｉ　ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ社）を使用して、製造者の指示にしたがって、細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定を行った。
（測定）
　遺伝子導入した細胞を、レチナールを含むＣＯ２－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　培養液　（１０％　ＦＢＳ，　２％　ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）　ｓｔｏｃｋ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを含む）　中に移した。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の蛍光輝度の変化を記録することにより、細胞内ｃＡＭＰ濃度変化を測定した。測定は、光照射装置を有するプレートリーダーを用いて、標準的なＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）アッセイのプロトコルに従って行った。アデニリルシクラーゼを活性化するＦｏｒｓｋｏｌｉｎ　（終濃度３．５μＭ）を投与して、あらかじめ細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させた。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度が定常に達したことを確認し、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ投与の約３５分後から２分間に渡り５１０ｎｍの波長　（約０．２７ｍＷ）の光を照射した。さらに、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ投与の約５０分時後から２分間に渡り４６４ｎｍの波長（約２．８ｍＷ）　の光を照射した。この実験を２回行い、それぞれの実験におけるＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度変化をグラフにした（図１０）。
（結果）
　コントロール群では、光照射ありと光照射なしとで輝度の違いは見られなかった（図１０Ａ）。一方で、ＧＲ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅ－ＥＱ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｅｎｕｓ－ＥＲ２ベクターを投与した群では、光を照射しなかった場合と比較して、４６４ｎｍの光照射後にＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度減少が見られた（図１０Ｂ）。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度は、細胞内ｃＡＭＰ濃度低下に対応することが知られており、このことから、ＧＲ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅ－ＥＱ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｅｎｕｓ－ＥＲ２ベクターを投与した群では、光刺激により細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下したことが示された。したがって、本開示の核酸コンストラクトにＶｅｎｕｓを挿入したＧＲ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅ－ＥＱ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｅｎｕｓ－ＥＲ２がＧＰＣＲ活性を有し、網膜の疾患、障害または症状の処置、予防またはその進行の抑制、視覚認知行動機能の改善、視覚機能の強化をもたらし得ることがわかる。
図１３において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリポフェクション法を用いて各遺伝子を強制発現させ、光刺激の有無でそのｃＡＭＰ濃度変化を測定した実験データを示す。縦軸にΔＨＴＲＦ　ｒａｔｉｏ、横軸には各遺伝子での結果を示す。ＨＴＲＦ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｔｉｍｅ－Ｒｅｓｏｌｖｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：　均一系時間分解螢光）　は、ｃＡＭＰの蛍光抗体を用いて測定した外来性の基準ｃＡＭＰと内在性のｃＡＭＰの比（ＨＴＲＦ　ｒａｔｉｏ）であり、内在性のｃＡＭＰが増えるほどＨＴＲＦ　ｒａｔｉｏは低下し、ｃＡＭＰ濃度と反比例する関係にある。ΔＨＴＲＦ　ｒａｔｉｏは光照射有無での、ＨＴＲＦ　ｒａｔｉｏの差であり、これが大きいほど、光刺激でｃＡＭＰが減少している、つまりＧタンパク質（Ｇｉ）が活性化していることを示す。
図１３では１１個体を使用して実験を行った結果、陰性対照４．６±１１．５に対し、第１の核酸コンストラクトのキメラタンパク質を発現させると３１．１±２１．４、本開示の核酸コンストラクトのキメラタンパク質を発現させると１５６．９±２４．２であった。
したがって、本開示の核酸コンストラクトの発現は、第１の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現よりも顕著に優れた光感度をもたらすことが実証された。
（実施例９：イオンチャネル型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトのＧＰＣＲ活性の測定）
　ＧＰＣＲ活性を、細胞内ｃＡＭＰ濃度の指標として用いられるＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）　の蛍光を観察することにより測定した。
（方法）
（材料）
　ＮＤ７／２３細胞を培養し、ＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅベクターおよびｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）　ベクターを遺伝子導入した。コントロール群には、ｐｃＤＮＡ３．１　（空ベクター）　およびｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）　ベクターを同量遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を培養し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンおよびＥＤＴＡを用いて細胞を剥がして遠沈管中に収集した。遠心分離により細胞を沈殿させ、新たなＤＭＥＭ培養液を加えて懸濁した。細胞濃度をもとに、蛍光顕微鏡観察に適した濃度で細胞を播きなおした。
（測定）
　遺伝子導入した細胞を、レチナールを含むＣＯ２－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　培養液　（１０％　ＦＢＳ，　２％　ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）　ｓｔｏｃｋ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを含む）　中に移した。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の蛍光輝度の変化を記録することにより、細胞内ｃＡＭＰ濃度変化を測定した。測定は、光照射装置を有するプレートリーダーを用いて、標準的なＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）アッセイのプロトコルに従って行った。アデニリルシクラーゼを活性化するＦｏｒｓｋｏｌｉｎ　（終濃度３．５μＭ）を投与して、あらかじめ細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させた。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度が定常に達したことを確認し、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ投与の約３５分後から２分間に渡り５１０ｎｍの波長　（約０．２７ｍＷ）の光を照射した。さらに、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ投与の約５０分時後から２分間に渡り４６４ｎｍの波長（約２．８ｍＷ）　の光を照射した。この実験を２回行い、それぞれの実験におけるＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度変化をグラフにした（図１１）。
（結果）
　コントロールでは、光照射ありと光照射なしとでは、輝度の違いは見られなかった（図１１Ａ）。一方で、ＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅベクターを投与した群では、光を照射しなかった場合と比較して、４６４ｎｍの光照射後にＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度減少が見られた（図１１Ｂ）。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の輝度は、細胞内ｃＡＭＰ濃度低下に対応することが知られており、このことから、ＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅベクターを投与した群では、光刺激により細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下したことが示された。したがって、本開示の核酸コンストラクトにＶｅｎｕｓを挿入したＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅがＧＰＣＲ活性を有し、網膜の疾患、障害または症状の処置、予防またはその進行の抑制、視覚認知行動機能の改善、視覚機能の強化をもたらし得ることがわかる。
（実施例１０：イオンチャネル型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトのイオン輸送能の測定）
　イオン輸送能を、パッチクランプ法により測定した。
（材料）
　ＮＤ７／２３細胞を培養し、イオンチャネル型ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質をコードするＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅベクターを遺伝子導入した。コントロール群には、野生型グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ　ｔｈｅｔａ）アニオンチャネルロドプシンをコードするＧｔＡＣＲ１ベクターベクターを同量遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を、レチナールを含む培養液中で培養した。
（測定）
　パッチクランプ装置、微小ガラス電極、標準的な細胞外液および電極内液を用いて、ホールセルパッチクランプ記録を行った。光照射は、顕微鏡に設置した光照射装置により、５００ｎｍまたは４８０ｎｍの光を約４００ｍｓ照射することで行い、光照射の際の電流応答を光電流として記録した。測定に際しては、膜電位を－８０ｍＶから２０ｍＶまで　（２０ｍＶ間隔）　の電位に固定して記録を行った。
（結果）
　コントロール群では、光照射により光電流が生じた（（図１２）。この光電流は、光照射の終了後、約２０００ｍｓかけて減衰した。ＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅベクターを遺伝子導入した群では、光照射により大きな光電流が生じた。この光電流は、１０００ｍｓほどで減衰した。これらの結果から、さらに、ＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅが、コントロール群より大きなイオン輸送能と速いキネティクスを有することが分かった。
　視細胞の静止膜電位が－３０ｍＶから－５０ｍＶであるため、ＧｔＡＣＲ２ｔｒ／ＢｖＲｈ－ｄｏｕｂｌｅは、光刺激により膜電位を過分極させることが可能であり、網膜の疾患、障害または症状の処置、予防またはその進行の抑制、視覚認知行動機能の改善、視覚機能の強化をもたらし得る。
　（実施例１１：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの作製）
　実施例１で作製したキメラタンパク質をコードする核酸配列に、実施例２で挿入した小胞体輸出シグナルとは異なる小胞体輸出シグナルを挿入するキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを作製する。
　（実施例１２：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた多電極アレー（ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｌｅｃｔｏｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：ＭＥＡ）試験）
　実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが光応答に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　（ＧＲ／ＢｖＲｈ）－ＷＰＲＥ－ｐＡベクター（第１の核酸コンストラクト）または実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にマウスの光応答を測定する。多電極アレー（Ｍｕｌｔｉｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：　ＭＥＡ）試験により、ｅｘ　ｖｉｖｏで網膜神経節細胞の光応答を、白色ＬＥＤの光刺激強度を変えて測定する。
　（結果）
　第１の核酸コンストラクトでは１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ刺激までの光強度でしか応答を得られないが、実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは改善した応答が得られる。さらに、１ｘ１０１４～１６　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度範囲において、実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高い。また、１ｘ１０１５
　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高い。
　（実施例１３：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた波長感度評価）
　実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの波長感度を評価する。
　実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの注射７週後の、生後１１週齢の雄のｒｄ１マウスの各波長の比視感度を測定する。波長特異的なＬＥＤで光刺激を行い、反応が得られた２５細胞のピーク発火頻度（Ｐｅａｋ　Ｆｉｒｉｎｇ　Ｒａｔｅ（ｓｐｉｋｅｓ／ｓｅｃ））を各波長で測定する。全波長中、最も反応の高かった値を１として比にし、平均を測定する。１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光刺激強度にて測定を行う。測定の結果、実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射するマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かる。
　（実施例１４：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた視覚誘発電位の評価）
　実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが視覚誘発電位（Ｖｉｓｕａｌ　Ｅｖｏｋｅｄ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＶＥＰ）に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にＶＥＰを測定する。測定の１週間前にマウスに３種混合麻酔（ｍｉｄａｚｏｌａｍ，　ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ，　ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ　ｔａｒｔｒａｔｅ　をそれぞれ４　ｍｇ／ｋｇ，　０．７５　ｍｇ／ｋｇ
　ａｎｄ　５　ｍｇ／ｋｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔで投与）を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨（ラムダ縫合より１．５ｍｍ前方かつ１．５ｍｍ側方）に埋入する。再度３種混合麻酔で鎮静させた後、眼前３ｃｍに設置した白色ＬＥＤより０．１ｃｄｓ／ｍ２のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定する。測定機器はＰｕＲＥＣ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｍａｙｏ，　Ｉｎａｚａｗａ，　Ｊａｐａｎ）を使用する。
　（結果）
　コントロール、第１の核酸コンストラクト治療マウスに対して、実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクト治療マウスでは有意な振幅の増加を認められる。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められる。
　（実施例１５：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた明暗認識機能の評価）
　実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降に明暗箱移動試験（Ｌｉｇｈｔ－Ｄａｒｋ
　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ：ＬＤＴ）を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱（アクリルケース　幅：４１５ｍｍ　高さ：３００ｍｍ　奥行：２５０ｍｍが仕切りで２分割されており、片方は２０ｌｕｘの光が入り、片方は暗室となっており５ｘ５ｍｍの窓で接続されている。）にマウスを入れ１０分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
　（結果）
　健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス（コントロール）では滞在時間比はおよそ半々の０．５となる。さらに、実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第１の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
　（実施例１６：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた物体認識機能の評価）
　実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。失明コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、１０ｌｕｘの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流す。実験のために設計した空間を図８に示す。
　（測定）
　マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測する。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から１５分間とする。
　（結果）
　失明コントロール群（ＥＧＦＰ）が物体動画側滞在時間比（マウスの動画を流すエリアに滞在した時間／計測時間）が、約０．５であるのに対し、実施例１１のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは有意に高い。
　（実施例１７：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの作製）
　実施例１で作製したキメラタンパク質をコードする核酸配列に、小胞体移行シグナルを挿入するキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを作製する。
　（実施例１８：小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた多電極アレー（ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｌｅｃｔｏｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：ＭＥＡ）試験）
　実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが光応答に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　（ＧＲ／ＢｖＲｈ）－ＷＰＲＥ－ｐＡベクター（第１の核酸コンストラクト）または実施例１９の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にマウスの光応答を測定する。多電極アレー（Ｍｕｌｔｉｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：　ＭＥＡ）試験により、ｅｘ　ｖｉｖｏで網膜神経節細胞の光応答を、白色ＬＥＤの光刺激強度を変えて測定する。
　（結果）
　第１の核酸コンストラクトでは１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ刺激までの光強度でしか応答を得られないが、実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは改善した応答が得られる。さらに、１ｘ１０１４～１６
　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度範囲において、実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高い。また、１ｘ１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高い。
　（実施例１９：小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた波長感度評価）
　実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの波長感度を評価する。
　実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの注射７週後の、生後１１週齢の雄のｒｄ１マウスの各波長の比視感度を測定する。波長特異的なＬＥＤで光刺激を行い、反応が得られた２５細胞のピーク発火頻度（Ｐｅａｋ　Ｆｉｒｉｎｇ　Ｒａｔｅ（ｓｐｉｋｅｓ／ｓｅｃ））を各波長で測定する。全波長中、最も反応の高かった値を１として比にし、平均を測定する。１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光刺激強度にて測定を行う。測定の結果、実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射するマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かる。
　（実施例２０：小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた視覚誘発電位の評価）
　実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが視覚誘発電位（Ｖｉｓｕａｌ　Ｅｖｏｋｅｄ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＶＥＰ）に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にＶＥＰを測定する。測定の１週間前にマウスに３種混合麻酔（ｍｉｄａｚｏｌａｍ，　ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ，　ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ　ｔａｒｔｒａｔｅ　をそれぞれ４　ｍｇ／ｋｇ，　０．７５　ｍｇ／ｋｇ
　ａｎｄ　５　ｍｇ／ｋｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔで投与）を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨（ラムダ縫合より１．５ｍｍ前方かつ１．５ｍｍ側方）に埋入する。再度３種混合麻酔で鎮静させた後、眼前３ｃｍに設置した白色ＬＥＤより０．１ｃｄｓ／ｍ２のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定する。測定機器はＰｕＲＥＣ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｍａｙｏ，　Ｉｎａｚａｗａ，　Ｊａｐａｎ）を使用する。
　（結果）
　コントロール、第１の核酸コンストラクト治療マウスに対して、実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクト治療マウスでは有意な振幅の増加を認められる。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められる。
　（実施例２１：小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた明暗認識機能の評価）
　実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降に明暗箱移動試験（Ｌｉｇｈｔ－Ｄａｒｋ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ：ＬＤＴ）を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱（アクリルケース　幅：４１５ｍｍ　高さ：３００ｍｍ　奥行：２５０ｍｍが仕切りで２分割されており、片方は２０ｌｕｘの光が入り、片方は暗室となっており５ｘ５ｍｍの窓で接続されている。）にマウスを入れ１０分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
　（結果）
　健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス（コントロール）では滞在時間比はおよそ半々の０．５となる。さらに、実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第１の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
　（実施例２２：小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた物体認識機能の評価）
　実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０９　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。失明コントロール群には、ＡＡＶ　ＤＪ－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、１０ｌｕｘの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流す。実験のために設計した空間を図８に示す。
　（測定）
　マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測する。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から１５分間とする。
　（結果）
　失明コントロール群（ＥＧＦＰ）が物体動画側滞在時間比（マウスの動画を流すエリアに滞在した時間／計測時間）が、約０．５であるのに対し、実施例１７の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは有意に高い。
（実施例２３：ＧＰＣＲ活性測定の比較例）
　配列番号７に示される塩基配列とは異なる、廃列番号に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を作製する。配列番号７に示される塩基配列を含む核酸コンストラクトと、本実施例で作製する塩基配列を含む核酸コンストラクトとを、ＮＤ７／２３細胞に遺伝子導入する。
　ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）を用いて細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定すると、本実施例で作製する核酸コンストラクトを遺伝子導入した細胞よりも、配列番号７に示される塩基配列を含む核酸コンストラクトを遺伝子導入した細胞の方が、ｃＡＭＰ濃度が減少していることが分かる。このことから、配列番号７に示される塩基配列がコードするキメラロドプシンの方が、本実施例で作製する塩基配列がコードするキメラロドプシンよりも強いＧＰＣＲ活性を有することが分かる。
（実施例２４：イオン輸送能の比較例）
　配列番号７に示される塩基配列とは異なる、配列番号８に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を作製する。配列番号７に示される塩基配列を含む核酸コンストラクトと、本実施例で作製する塩基配列を含む核酸コンストラクトとを、ＮＤ７／２３細胞に遺伝子導入する。
　パッチクランプ法により、各塩基配列がコードするキメラロドプシンのイオン輸送能を測定すると、本実施例で作製する核酸コンストラクトを遺伝子導入した細胞よりも、配列番号７に示される塩基配列を含む核酸コンストラクトを遺伝子導入した細胞の方が、大きなイオン輸送能を有していることが分かる。
　（実施例２５：接着培養系および浮遊培養系におけるベクター培養）
　接着培養系として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（接着性）ＨＥＫ２９３細胞を培養する。浮遊培養系として、（浮遊性）ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞を培養する。培養後に、下記のプラスミドを混合し、細胞にトランスフェクションする（ＰＥＩ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、必要に応じて、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法を使用）。
ｐＡＡＶ－ＲＣ　（ｒｅｐ　ａｎｄ　ｃａｐ　ｇｅｎｅｓ）
ｐＨｅｌｐｅｒ
ｐＡＡＶ－ＧＯＩ（ａ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ）
　トランスフェクションの数日後に細胞を回収し、界面活性剤を用いて細胞を溶解し、原薬を得る。その後、アフィニティークロマトグラフィー、超遠心、フィルター精製を実施して精製を行い最終産物を得る。精製は、Ｎａｔｈａｌｉｅ　Ｃ　ａｎｄ　Ｊｏｓｈｕａ　Ｃ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　＆　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（２０１６）　３，　１６００２に記載の方法に基づいて実施することができる。
（実施例２６：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた多電極アレー（ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｌｅｃｔｏｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：ＭＥＡ）試験）
　配列番号２６に示す塩基配列（配列番号２７に示すアミノ酸配列をコードする）が光応答に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、ＡＡＶ　６－ＣＡＧＧＳ－　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　（ＧＲ／ＢｖＲｈ）－ＷＰＲＥ－ｐＡベクター（第１の核酸コンストラクト）または配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０８　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にマウスの光応答を測定する。多電極アレー（Ｍｕｌｔｉｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ：　ＭＥＡ）試験により、ｅｘ　ｖｉｖｏで網膜神経節細胞の光応答を、白色ＬＥＤの光刺激強度を変えて測定する。
　（結果）
　第１の核酸コンストラクトでは１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ刺激までの光強度でしか応答を得られないが、配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトでは改善した応答が得られる。さらに、１ｘ１０１４～１６　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度範囲において、配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高い。また、１ｘ１０１５　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高い。
　（実施例２７：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた波長感度評価）
　配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトの波長感度を評価する。
　配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトの注射７週後の、生後１１週齢の雄のｒｄ１マウスの各波長の比視感度を測定する。波長特異的なＬＥＤで光刺激を行い、反応が得られた２５細胞のピーク発火頻度（Ｐｅａｋ　Ｆｉｒｉｎｇ　Ｒａｔｅ（ｓｐｉｋｅｓ／ｓｅｃ））を各波長で測定する。全波長中、最も反応の高かった値を１として比にし、平均を測定する。１ｘ１０１４　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの光刺激強度にて測定を行う。測定の結果、配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射するマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かる。
　（実施例２８：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた視覚誘発電位の評価）
　配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトが視覚誘発電位（Ｖｉｓｕａｌ　Ｅｖｏｋｅｄ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＶＥＰ）に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０８　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、ＡＡＶ　６－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降にＶＥＰを測定する。測定の１週間前にマウスに３種混合麻酔（ｍｉｄａｚｏｌａｍ，　ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ，　ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ　ｔａｒｔｒａｔｅ　をそれぞれ４　ｍｇ／ｋｇ，　０．７５　ｍｇ／ｋｇおよび５　ｍｇ／ｋｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔで投与）を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨（ラムダ縫合より１．５ｍｍ前方かつ１．５ｍｍ側方）に埋入する。再度３種混合麻酔で鎮静させた後、眼前３ｃｍに設置した白色ＬＥＤより０．１ｃｄｓ／ｍ２のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定する。測定機器はＰｕＲＥＣ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｍａｙｏ，　Ｉｎａｚａｗａ，　Ｊａｐａｎ）を使用する。
　（結果）
　コントロール、第１の核酸コンストラクト治療マウスに対して、配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト治療マウスでは有意な振幅の増加を認められる。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められる。
　（実施例２９：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた明暗認識機能の評価）
　配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、第１の核酸コンストラクトまたは配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０８　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、ＡＡＶ　６－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。
　（測定）
　遺伝子発現がピークを迎える注射後４週以降に明暗箱移動試験（Ｌｉｇｈｔ－Ｄａｒｋ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ：ＬＤＴ）を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱（アクリルケース　幅：４１５ｍｍ　高さ：３００ｍｍ　奥行：２５０ｍｍが仕切りで２分割されており、片方は１０ｌｕｘの光が入り、片方は暗室となっており５ｘ５ｍｍの窓で接続されている。）にマウスを入れ１０分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
　（結果）
　健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス（コントロール）では滞在時間比はおよそ半々の０．５となる。さらに、配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第１の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
　（実施例３０：シグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを用いた物体認識機能の評価）
　配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
　（材料および方法）
　（動物）
　網膜色素変性症モデルであるｒｄ１マウス（Ｐｄｅ６ｂｒｄ１／ｒｄ１）を使用する。上記変異を持つ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウスを日本クレア株式会社より購入する。
　（ベクター投与）
　生後１０週齢以降の失明したｒｄ１マウスに、配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを１．０×１０８　ｖｇ／μｌ濃度で１μｌを硝子体内注射にて投与する。失明コントロール群には、ＡＡＶ　６－ＣＡＧＧＳ－　ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡベクターを同量投与する。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、１０ｌｕｘの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流す。実験のために設計した空間を図８に示す。
　（測定）
　マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測する。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から１５分間とする。
　（結果）
　失明コントロール群（ＥＧＦＰ）が物体動画側滞在時間比（マウスの動画を流すエリアに滞在した時間／計測時間）が、約０．５であるのに対し、配列番号２６に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトでは有意に高い。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に出願された、特願２０１９－１６７５５３（２０１９年９月１３日出願）に対して優先権主張をするものであり、同出願の内容はそのすべてが本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用される。
　網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能（例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および／または危機回避機能）、物体認識機能および視力増強のための、キメラロドプシンの新規核酸コンストラクトが提供された。このような技術に基づく産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
配列番号１：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）および小胞体輸出シグナルからなる核酸配列の一例
配列番号２：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）および小胞体輸出シグナルからなるアミノ酸配列の一例
配列番号３：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）、小胞体輸出シグナルおよびＦＬＡＧタグからなる核酸配列の一例
配列番号４：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）、小胞体輸出シグナルおよびＦＬＡＧタグからなるアミノ酸配列の一例
配列番号５：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）のアミノ酸配列の一例
配列番号６：キメラロドプシン（ＧｔＡＣＲ２／ＢｖＲｈ）の核酸配列の一例
配列番号７：キメラロドプシン（ＧｔＡＣＲ２／ＢｖＲｈ）の核酸配列の一例
配列番号８：キメラロドプシン（ＧｔＡＣＲ２／ＢｖＲｈ）のアミノ酸配列の一例
配列番号９：ヒトロドプシン（ｈｕＲｈ）の核酸配列
配列番号１０：ヒトロドプシン（ｈｕＲｈ）のアミノ酸配列
配列番号１１：ウシロドプシン（ＢｖＲｈ）の核酸配列
配列番号１２：ウシロドプシン（ＢｖＲｈ）のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ　Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（ＧＲ）の核酸配列
配列番号１４：Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ　Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（ＧＲ）のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ　ｔｈｅｔａ　ａｎｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ２（ＧｔＡＣＲ２）の核酸配列
配列番号１６：Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ　ｔｈｅｔａ　ａｎｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ２（ＧｔＡＣＲ２）のアミノ酸配列
配列番号１７：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループの核酸配列の一例
配列番号１８：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループの核酸配列の一例
配列番号１９：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループのアミノ酸配列の一例（配列番号１８に対応）
配列番号２０：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループの核酸配列の一例
配列番号２１：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループの核酸配列の一例
配列番号２２：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループのアミノ酸配列の一例
配列番号２３：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）の核酸配列の例（配列番号８に対応する）。開始コドンは、ヌクレオチド４３－４５に相当し、終止コドンはヌクレオチド９９４－９９６に相当する。
配列番号２４：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループの核酸配列の一例
配列番号２５：Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループのアミノ酸配列の一例（配列番号２４に対応）
配列番号２６：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）および小胞体輸出シグナルからなる核酸配列の一例
配列番号２７：キメラロドプシン（ＧＲ／ＢｖＲｈ）および小胞体輸出シグナルからなるアミノ酸配列の一例

Claims (32)

  1. イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸。
  2. 前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記核酸は、配列番号１または２６に示す核酸配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
  4. ＦＬＡＧタグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。
  5. 前記核酸は、配列番号３に示す核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸。
  6. 前記核酸は、配列番号２６に示す核酸配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。
  7. イオン輸送型受容体ロドプシンと、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる、ポリペプチド。
  8. 前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 前記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号２６に示すアミノ酸配列である、請求項８または９に記載のポリペプチド。
  10. 請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  11. ＦＬＡＧタグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１０に記載の核酸。
  12. 配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の核酸。
  13. イオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸。
  14. 前記核酸は、配列番号７に示す核酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸。
  15. イオンチャネル型受容体ロドプシンの一部と、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部とのキメラタンパク質を含む、ポリペプチド。
  16. 前記ポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列である、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. 請求項１５または１６に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸。
  18. 配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１７に記載の核酸。
  19. 請求項１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸ならびに／または請求項１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸ならびに該核酸に作動可能に連結された、細胞における発現を可能にする核酸を含む、核酸コンストラクト。
  20. ベクターをさらに含む、請求項１９に記載の核酸コンストラクト。
  21. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２０に記載の核酸コンストラクト。
  22. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２０または２１に記載の核酸コンストラクト。
  23. 前記ベクターがＡＡＶベクターである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
  24. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－２またはＡＡＶ－６である、請求項２３に記載の核酸コンストラクト。
  25. 請求項１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子導入用組成物。
  26. 請求項１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、請求項１５～１６に記載のポリペプチド、または請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトのうちの１つまたは複数を含む、細胞。
  27. 前記細胞が網膜細胞である、請求項２６に記載の細胞。
  28. 請求項１～６および１０～１２のいずれか一項に記載の核酸、請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３～１４および１７～１８のいずれか一項に記載の核酸、請求項１５～１６に記載のポリペプチド、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、請求項２５に記載の遺伝子導入用組成物、または請求項２６～２７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つまたは複数を含む、医薬組成物。
  29. 網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 視覚認知行動機能の改善のための、請求項２８に記載の医薬組成物。
  31. 視覚機能を強化するための、請求項２８に記載の医薬組成物。
  32. 物体認識機能を強化するための、請求項３１に記載の医薬組成物。
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