WO2021049634A1 - キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト - Google Patents
キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト Download PDFInfo
- Publication number
- WO2021049634A1 WO2021049634A1 PCT/JP2020/034543 JP2020034543W WO2021049634A1 WO 2021049634 A1 WO2021049634 A1 WO 2021049634A1 JP 2020034543 W JP2020034543 W JP 2020034543W WO 2021049634 A1 WO2021049634 A1 WO 2021049634A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid sequence
- seq
- rhodopsin
- polypeptide
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/10—Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
Description
(項目X1)
イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸。
(項目X2)
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目X1に記載の核酸。
(項目X3)
前記核酸は、配列番号1または26に示す核酸配列を含む、項目X1または2に記載の核酸。
(項目X4)
FLAGタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目X1~3のいずれか一項に記載の核酸。
(項目X5)
前記核酸は、配列番号3に示す核酸配列を含む、項目X1~4のいずれか一項に記載の核酸。
(項目X6)
前記核酸は、配列番号26に示す核酸配列である、項目X1~3のいずれか一項に記載の核酸。
(項目X7)
イオン輸送型受容体ロドプシンと、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる、ポリペプチド。
(項目X8)
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目X7に記載のポリペプチド。
(項目X9)
前記ポリペプチドは、配列番号2または配列番号26に示すアミノ酸配列である、項目X8または9に記載のポリペプチド。
(項目X10)
項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目X1に記載の核酸。
(項目X11)
FLAGタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目X10に記載の核酸。
(項目X12)
配列番号4に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目X10または11に記載の核酸。
(項目X13)
イオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸。
(項目X14)
前記核酸は、配列番号7に示す核酸配列を含む、項目X13に記載の核酸。
(項目X15)
イオンチャネル型受容体ロドプシンの一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部とのキメラタンパク質を含む、ポリペプチド。
(項目X16)
前記ポリペプチドは、配列番号8に示すアミノ酸配列である、項目X15に記載のポリペプチド。
(項目X17)
項目X15または16に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目X13に記載の核酸。
(項目X18)
配列番号8に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目X17に記載の核酸。
(項目X19)
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸ならびに/または項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸ならびに該核酸に作動可能に連結された、細胞における発現を可能にする核酸を含む、核酸コンストラクト。
(項目X20)
ベクターをさらに含む、項目X19に記載の核酸コンストラクト。
(項目X21)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目X20に記載の核酸コンストラクト。
(項目X22)
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、項目X20または21に記載の核酸コンストラクト。
(項目X23)
前記ベクターがAAVベクターである、項目X20~22のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目X24)
前記AAVベクターがAAV-DJ、AAV-2またはAAV-6である、項目X23に記載の核酸コンストラクト。
(項目X25)
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、または項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子導入用組成物。
(項目X26)
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、または項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトのうちの1つまたは複数を含む、細胞。
(項目X27)
前記細胞が網膜細胞である、項目X26に記載の細胞。
(項目X28)
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数を含む、医薬組成物。
(項目X29)
網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、項目X28に記載の医薬組成物。
(項目X30)
視覚認知行動機能の改善のための、項目X28に記載の医薬組成物。
(項目X31)
視覚機能を強化するための、項目X28に記載の医薬組成物。
(項目X32)
物体認識機能を強化するための、項目X31に記載の医薬組成物。
(項目A1)
被験体における網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制する方法であって、
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目A2)
被験体における視覚認知行動機能の改善する方法であって、
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目A3)
被験体における視覚機能を強化する方法であって、
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目A4)
被験体における物体認識機能を強化する方法であって、
項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目B1)
網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための医薬の製造における、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の使用。
(項目B2)
視覚認知行動機能の改善するための医薬の製造における、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の使用。
(項目B3)
視覚機能を強化するための医薬の製造における、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の使用。
(項目B4)
物体認識機能を強化するための医薬の製造における、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数の使用。
(項目B5)
遺伝子を導入するための医薬の製造における、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトの遺伝子、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞の使用。
(項目C1)
網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞。
(項目C2)
視覚認知行動機能の改善するための、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞。
(項目C3)
視覚機能を強化するための、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目X25に記載の遺伝子導入用組成物、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞。
(項目C4)
物体認識機能を強化するための、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、項目X15~16に記載のポリペプチド、項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または項目X26~27のいずれか一項に記載の細胞。
(項目C5)
遺伝子を導入するための、項目X1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、項目X13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、または項目X19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目1)
イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸。
(項目2)
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目1に記載の核酸。
(項目3)
前記核酸は、配列番号1に示す核酸配列を含む、項目1または2に記載の核酸。
(項目4)
FLAGタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目1~3のいずれか一項に記載の核酸。
(項目5)
前記核酸は、配列番号3に示す核酸配列を含む、項目1~4のいずれか一項に記載の核酸。
(項目6)
イオン輸送型受容体ロドプシンと、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる、ポリペプチド。
(項目7)
前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、項目6に記載のポリペプチド。
(項目8)
前記ポリペプチドは、配列番号2に示すアミノ酸配列である、項目7または8に記載のポリペプチド。
(項目9)
項目6~8のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目1に記載の核酸。
(項目10)
FLAGタグをコードする核酸配列をさらに含む、項目9に記載の核酸。
(項目11)
配列番号4に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目9または10に記載の核酸。
(項目12)
イオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸。
(項目13)
前記核酸は、配列番号7に示す核酸配列を含む、項目12に記載の核酸。
(項目14)
イオンチャネル型受容体ロドプシンの一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部とのキメラタンパク質を含む、ポリペプチド。
(項目15)
前記ポリペプチドは、配列番号8に示すアミノ酸配列である、項目14に記載のポリペプチド。
(項目16)
項目14または15に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目12に記載の核酸。
(項目17)
配列番号8に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項目16に記載の核酸。
(項目18)
項目1~5および9~11のいずれか一項に記載の核酸ならびに/または項目12~13および16~17のいずれか一項に記載の核酸ならびに該核酸に作動可能に連結された、細胞における発現を可能にする核酸を含む、核酸コンストラクト。
(項目19)
ベクターをさらに含む、項目18に記載の核酸コンストラクト。
(項目20)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目19に記載の核酸コンストラクト。
(項目21)
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、項目19または20に記載の核酸コンストラクト。
(項目22)
前記ベクターがAAVベクターである、項目19~21のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目23)
前記AAVベクターがAAV-DJ、AAV-2またはAAV-6である、項目22に記載の核酸コンストラクト。
(項目24)
項目1~5および9~11のいずれか一項に記載の核酸、項目12~13および16~17のいずれか一項に記載の核酸、または項目18~23のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子導入用組成物。
(項目25)
項目1~5および9~11のいずれか一項に記載の核酸、項目6~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目12~13および16~17のいずれか一項に記載の核酸、項目14~15に記載のポリペプチド、または項目18~23のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトのうちの1つまたは複数を含む、細胞。
(項目26)
前記細胞が網膜細胞である、項目25に記載の細胞。
(項目27)
項目1~5および9~11のいずれか一項に記載の核酸、項目6~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目12~13および16~17のいずれか一項に記載の核酸、項目14~15に記載のポリペプチド、項目18~23のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、項目24に記載の遺伝子導入用組成物、または項目25~26のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数を含む、医薬組成物。
(項目28)
網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、項目27に記載の医薬組成物。
(項目29)
視覚認知行動機能の改善のための、項目27に記載の医薬組成物。
(項目30)
視覚機能を強化するための、項目27に記載の医薬組成物。
(項目31)
物体認識機能を強化するための、項目30に記載の医薬組成物。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および/または基本的技術内容を適宜説明する。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
本開示は、キメラロドプシンの新規核酸コンストラクトを提供する。本開示で用いられるキメラロドプシンは、本開示の目的を達成することができる限り、どのようなものでもよい。本開示で用いられるキメラロドプシンは、代表的には、イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質である。代表的な例を説明すると、繰り返し使用できる微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンの一部に、動物由来のGタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部を融合することで、微生物由来のイオン輸送型受容体イオンチャネル型受容体ロドプシンが持つ繰り返し活性化する機能を保持しつつ、Gタンパク質共役型受容体による内在性のGタンパク質を介した高い活性を得ることができ、これを、さらに本開示の核酸コンストラクトを生成することで、優れた網膜の疾患、障害および症状に対する治療、改善、および予防、進行抑制効果をより改良することができる。
(A)配列番号1、3または26に記載のヌクレオチド配列を含む塩基配列;
(B)(A)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(C)(A)または(B)に示す核酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(D)(A)~(C)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(E)(A)~(D)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(F)配列番号2、4または27に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド;
(G)(F)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(H)(F)または(G)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(I)(F)~(H)に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであって、かつ、該ポリヌクレオチドがコードするキメラタンパク質が生物学的活性を有する。
(a)配列番号2、4または27に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメント;
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド;
(c)(a)または(b)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド;
(d)配列番号2、4または27に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(e)(d)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;(f)(d)または(e)に示す核酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(g)(d)~(f)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド;
(h)(d)~(g)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;または
(i)(a)~(h)に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチドを含み、かつ、生物学的活性を有するか、あるいは、本開示のキメラタンパク質は、以下のいずれかに記載の核酸がコードするアミノ酸配列を含み得る:
(aa)配列番号2、4または27に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号1、3または26に記載される塩基配列を有する核酸
(bb)配列番号2、4または27記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号1、3または26に記載される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸
(cc)配列番号2、4または27に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、核酸
(dd)配列番号2、4または27に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有する核酸;あるいは
(aaa)配列番号1、3または26に記載の塩基配列またはそのフラグメント;
(bbb)(aaa)に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する核酸;
(ccc)(aaa)または(bbb)に対して1または複数のヌクレオチドが置換、付加および/または欠失を有する塩基配列;
(ddd)(aaa)~(ccc)のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
を含み、かつ、該キメラタンパク質が生物学的活性を有する核酸。
(A)配列番号17または18に記載のヌクレオチド配列を含む塩基配列;
(B)(A)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(C)(A)または(B)に示す核酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(D)(A)~(C)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(E)(A)~(D)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(F)配列番号19または25に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド;
(G)(F)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(H)(F)または(G)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(I)(F)~(H)に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド。
(ii)配列番号19または25に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸;
(iii)配列番号19または25に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸;
(iv)配列番号19または25に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸;
あるいは、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第2ループをコードする核酸が、以下のいずれかであることが好ましい。
(ii)配列番号19または25に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸;
(iii)配列番号19または25に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸;
(iv)配列番号19または25に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸:
(x)配列番号19または25に記載の塩基配列またはそのフラグメントを有する核酸;
(y)(x)に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する核酸;
(z)(x)または(y)に対して1または複数のヌクレオチドが置換、付加および/または欠失を有する核酸;
(w)(x)~(z)のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸、
を有し、かつ、該ループが生物学的活性を有する。
(A)配列番号20または21に記載のヌクレオチド配列を含む塩基配列;
(B)(A)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(C)(A)または(B)に示す核酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(D)(A)~(C)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(E)(A)~(D)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(F)配列番号22に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド;
(G)(F)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(H)(F)または(G)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(I)(F)~(H)に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド。
(l)配列番号22に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸;
(k)配列番号22に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸;
(m)配列番号22に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸;
(n)配列番号22に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸。
(l)配列番号22に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸;
(k)配列番号22に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸;
(m)配列番号22に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸;
(n)配列番号22に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸;
(xx)配列番号20に記載の塩基配列またはそのフラグメントを有する核酸;
(yy)(xx)に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する核酸;
(zz)(xx)または(yy)に対して1または複数のヌクレオチドが置換、付加および/または欠失を有する核酸;あるいは
(ww)(xx)~(zz)のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸、
を有し、かつ、該ループが生物学的活性を有する。
(A)配列番号2、4または27に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする塩基配列;
(B)配列番号1、3または26に記載の塩基配列またはそのフラグメント;
(C)(A)または(B)に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する核酸;
(D)(A)~(C)のいずれかに対して1または複数のヌクレオチドが置換、付加および/または欠失を有する塩基配列;
(E)(A)~(D)のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
のうちの1つを有する核酸であって、該核酸がコードするタンパク質が生物学的活性を有する、核酸をも提供する。
(B)(A)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(C)(A)または(B)に示す核酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(D)(A)~(C)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(E)(A)~(D)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(F)配列番号8に示すアミノ酸配を含むポリペプチドによってコードされる、ポリヌクレオチド;
(G)(F)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(H)(F)または(G)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(I)(F)~(H)に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであって、かつ、該ポリヌクレオチドがコードするキメラタンパク質が生物学的活性を有する。
(a)配列番号8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメント;
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド;
(c)(a)または(b)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド;
(d)配列番号8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(e)(d)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;(f)(d)または(e)に示す核酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(g)(d)~(f)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド;
(h)(d)~(g)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;または
(i)(a)~(h)に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチドを含み、かつ、生物学的活性を有するか、あるいは、本開示のキメラタンパク質は、以下のいずれかに記載の核酸がコードするアミノ酸配列を含み得る:
(aa)配列番号8に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号7に記載される塩基配列を有する核酸
(bb)配列番号8に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列または配列番号7に記載される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸
(cc)配列番号8に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、核酸
(dd)配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有する核酸;あるいは
(aaa)配列番号7に記載の塩基配列またはそのフラグメント;
(bbb)(aaa)に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する核酸;
(ccc)(aaa)または(bbb)に対して1または複数のヌクレオチドが置換、付加および/または欠失を有する塩基配列;
(ddd)(aaa)~(ccc)のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
を含み、かつ、該キメラタンパク質が生物学的活性を有する核酸。
(A)配列番号8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする塩基配列;(B)配列番号7に記載の塩基配列またはそのフラグメント;
(C)(A)または(B)に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する核酸;
(D)(A)~(C)のいずれかに対して1または複数のヌクレオチドが置換、付加および/または欠失を有する塩基配列;
(E)(A)~(D)のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列、
のうちの1つを有する核酸であって、該核酸がコードするタンパク質が生物学的活性を有する、核酸をも提供する。
視覚認知行動機能(例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および/または危機回避機能)の改善などの機能は、本開示において実験モデルを以て検証されており、顕著な効果を奏するといえる。視覚認知行動機能(例えば、明暗判定機能の改善、明所忌避機能の改善および/または危機回避機能)の効果は、実施例5で実証した、明暗箱選択試験(LDT)による試験の結果、実証されたものである。視覚認知行動機能は、視覚器官の光感受性の確認のみならず、実際に動物モデルなどで行動として現れるかを検証することによって確認することができる機能である。実施例5のような実験での検証ができたことが本開示の成果の一つであるといえる。視覚認知行動機能の改善は、視力、コントラスト感度、明暗順応、色覚等の改善、強化または増強等を含む。
視力改善の機能は、本開示において実験モデルを以て検証されており、顕著な効果を奏するといえる。視力改善などの視覚機能強化については、実施例4に代表される視覚誘発電位VEPの実験により実証されたことにより確認されたものである。
物体認識機能の改善などの機能は、本開示において実験モデルを以て検証されており、顕著な効果を発するといえる。物体認識機能の改善などの機能については、実施例6に代表される物体認識試験ORTの実験により実証されたことにより確認されたものである。視覚誘発電位VEPの実験では、光刺激の入力が中枢(脳)まで届いていること、LDTではそれが忌避反応として行動に出力されることはわかるものの、物体を認識できるレベルの視力が回復しているかどうかまではわからなかった。実施例6に示す結果において、物体を認識できるレベルの視力の回復が確認できたことは非常に臨床的な意義が高い。
(一般技術)
キメラタンパク(GR/BvRh)をコードするDNAは以下のように作製した。Gloeobacter violaceus Rhodopsin(GR)(配列番号14)の細胞質側の第2ループに相当するN末端より137-145番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシン(BvRh)(配列番号12)の137-145番目のアミノ酸相当配列に置換し、また、GRの細胞質側の第3ループに相当するN末端より198-206番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシンの225-252番目のアミノ酸相当配列に置換し、さらにGRの132番目のアミノ酸であるグルタミン酸をグルタミンに置換したキメラタンパク質をコードするDNAをpCDNA3.1ベクターに挿入した。あるいは、配列番号23に記載の塩基配列を有する核酸を生成し、これをキメラタンパク質をコードするDNAとして、pCDNA3.1ベクターHindIII/XbaIサイトに挿入した。配列番号23に記載の塩基配列は、以下のようにして生成された:Gloeobacter violaceus Rhodopsin(GR)(配列番号14)の細胞質側の第2ループに相当するN末端より137-145番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシン(BvRh)(配列番号12)の第2ループに相当する配列番号18に示す塩基配列(配列番号19に示すアミノ酸配列をコードする)に置換し、また、GRの細胞質側の第3ループに相当するN末端より198-206番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシンの第3ループに相当する配列番号20に示す塩基配列(配列番号22に示すアミノ酸配列をコードする)に置換して作製した。さらに、コードするアミノ酸を変更させずに、一部の塩基を変更することで、配列番号3に記載の塩基配列を作製した。具体的には、6、9~13、15、16、18~22、27~29、31~36、39、40、43、45、48、50、51、53~55、58、59、61、65~73、75~84、86、88、89、93、97、98、100、101、104、106~108、110、112、114、115、122、123、125、128、131、133、139、143、145、146、155、157、162、165、167、169~171、174、176、179、182、183、186~189、193~198、204、205、207、209、212、215、216、218~220、224、225、227、228、230、231、233~235、238、240、242、243、246、247、249、251、253~255、257~259、261~264、266~270、272、273、275、276、279、281~287、289~291、296~299、302~305、307~316、318、319、321~330番目のアミノ酸をコードする核酸を、コードするアミノ酸を変えずに変異させることで作製した。変異体の作製はクイックチェンジ法により行った。なお、ウシロドプシンにおいて採用した配列部分は、ヒトロドプシンのアミノ酸配列と完全一致するため、ヒトロドプシンと称しても問題ない。
本開示の核酸コンストラクトが光応答に与える影響を測定した。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用した。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入した。
(多電極アレー)
ここで、多電極アレーとは、模式的には、多数の電極を有する素子の上に神経細胞を配置し、神経細胞の電気応答を細胞外から記録し、電気応答の波形を解析することによって、活動した細胞の種類やその活動のタイミングおよび大きさ等を調べる手法である。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、AAV DJ-CAGGS- Chimeric rhodopsin (GR/BvRh)-WPRE-pAベクター(第1の核酸コンストラクト)またはシグナル配列付与を行った、AAV DJ-CAGGS- Chimeric rhodopsin-sm (GR/BvRh-sm)-WPRE-pA(本開示の核酸コンストラクト)を1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与した。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にマウスの光応答を測定した。多電極アレー(Multielectrode array: MEA)試験により、ex vivoで網膜神経節細胞の光応答を、白色LEDの光刺激強度を変えて測定した。
1×1017 photons/cm2/s、1×1016 photons/cm2/s、1×1015 photons/cm2/s、1×1014 photons/cm2/sおよび1×1013 photons/cm2/sの光強度により、他電極アレイを実施した結果を示す。図2および3の上部に、網膜神経節細胞の発火のラスタープロット表示を示し、各グラフにおいて縦軸に1秒間あたりの発火頻度をとったヒストグラムを示す。グラフの横軸に、時間(秒)を示す。各グラフの下部に導入したキメラタンパク質のコンストラクト、および光強度を示す。なお、1×1013 photons/cm2/sの光強度は街灯のある夜道や夜の自宅の廊下の光強度に対応し、1×1014 photons/cm2/sの光強度は自宅室内の光強度に対応し、1×1015 photons/cm2/sの光強度は商店内の光強度に対応し、1×1016 photons/cm2/sの光強度は曇天時の屋外の光強度に対応し、1×1017 photons/cm2/sの光強度は晴天時の屋外の光強度に対応するものである。第1の核酸コンストラクトでは1x1014 photons/cm2/s刺激までの光強度でしか応答を得られなかったが(図2)、本開示の核酸コンストラクトは1x1013 photons/cm2/sの光強度まで応答が得られた(図3)。網膜色素変性症モデルマウスに、第1の核酸コンストラクトを発現させると、1×1015 photons/cm2/sの光強度まで、陰性対照よりも高い頻度で電気信号を発したのに対し、本開示の核酸コンストラクトを発現させると、1×1013 photons/cm2/sの光強度まで、陰性対照よりも高い頻度で神経節細胞の発火が得られた。さらに、各光強度において、本開示の核酸コンストラクトを導入した場合の網膜神経節細胞は、第1の核酸コンストラクトを導入した場合よりも発火頻度が高い傾向が認められ、特に1×1015 photons/cm2/sの光強度では、本開示の核酸コンストラクトは、第1の核酸コンストラクトよりも約3倍も発火頻度が高いことが見出された。加えて、1×1013 photons/cm2/sの光強度では、第1の核酸コンストラクトはほとんど発火を示さなかったのに対し、本開示の核酸コンストラクトでは網膜神経節細胞の発火が得られた。したがって、本開示の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現は、第1の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現よりも予想し得ない顕著に優れた光感度をもたらすことが実証された。
さらに、1x1014~16 photons/cm2/sの刺激強度範囲において、本開示の核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高かった(図4)。また、1×1015 photons/cm2/sにおける単位面積あたりの多電極アレイを実施した結果を示す。1x1015 photons/cm2/sの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高かった(図5)。グラフの縦軸は、2.6mm2あたりで発火した網膜神経節細胞の数を示している。
第1の核酸コンストラクトを導入した網膜神経節細胞は、1×1015 photons/cm2/sの強度の光に対して、約2.7個の細胞しか発火しなかったのに対し、本開示の核酸コンストラクトを導入した網膜神経節細胞は約33個の細胞が発火した。したがって、本開示の核酸コンストラクトは、第1の核酸コンストラクトの12倍以上もの予想外に優れた光感度をもたらすことが実証された。
本開示の核酸コンストラクトの注射7週後の、生後11週齢の雄のrd1マウスの各波長の比視感度を測定した。波長特異的なLEDで光刺激を行い、反応が得られた25細胞のピーク発火頻度(Peak Firing Rate(spikes/sec))を各波長で測定した。全波長中、最も反応の高かった値を1として比にし、平均を測定した。1x1014 photons/cm2/sの光刺激強度にて測定を行った。測定の結果、本開示の核酸コンストラクトを注射したマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かった(図6)。タンパク発現量と発火細胞数は比例するため、キメラロドプシンタンパク質の発現量も、発火細胞数と同程度増加していると考えられた。タンパク質発現量の増加に伴い、感度も上昇すると考えられた。
本開示の核酸コンストラクトが視覚誘発電位(Visual Evoked Potential:VEP)に与える影響を測定した。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用した。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入した。
(視覚誘発電位の評価方法)
網膜から発せられた電気信号は、脳の一次視覚野(V1野)へと伝達され、この領域において神経細胞を活動させることから、中枢レベルでの視覚再生効果を確認するために、脳に電極を埋め込んで神経活動を細胞外から記録する実験も実施した。具体的には、作製したベクターを、網膜色素変性症モデルマウス(rd1)マウスに硝子体内注射し、麻酔を施した後、眼前3cmに設置したWhite LEDより0.1cds/m2のフラッシュ刺激(この光強度はおよそ街灯のある夜道や夜の自宅の廊下の光強度に対応する)に対する誘発電位を、PuREC acquisition system(有限会社メイヨー社製)を使用して測定した。0.1cds/m2のフラッシュ刺激を測定した。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは本開示の核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与した。コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与した。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にVEPを測定した。測定の1週間前にマウスに3種混合麻酔(midazolam, medetomidine, butorphanol tartrate をそれぞれ4 mg/kg, 0.75 mg/kg and 5 mg/kg body weightで投与)を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨(ラムダ縫合より1.5mm前方かつ1.5mm側方)に埋入した。再度3種混合麻酔で鎮静させた後、眼前3cmに設置した白色LEDより0.1cds/m2のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定した。測定機器はPuREC acquisition system (Mayo, Inazawa, Japan)を使用した。
図7において、縦軸に光刺激によって視覚野から得られた視覚誘発電位の振幅(μV)を示す。グラフの下部に導入したキメラタンパク質のコンストラクトを示す。コントロール(17.86±3.37μV)、第1の核酸コンストラクト治療マウス(22.13±8.38μV)に対して、本開示の核酸コンストラクト治療マウス(56.4±14.0μV)では有意な振幅の増加を認めた。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められた(図7)。したがって、本開示の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現は、第1の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現よりも顕著に優れた光感度をもたらすことが実証された。
本開示の核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定した。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用した。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入した。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは本開示の核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降に明暗箱移動試験(Light-Dark
transition test:LDT)を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱(アクリルケース 幅:415mm 高さ:300mm 奥行:250mmが仕切りで2分割されており、片方は20luxの光が入り、片方は暗室となっており5x5mmの窓で接続されている。)にマウスを入れ10分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス(コントロール)では滞在時間比はおよそ半々の0.5となった。さらに、本開示の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第1の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
本開示の核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定した。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用した。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入した。
(物体認識機能の評価方法)
物体認識機能を評価するために、作製したベクターを、網膜色素変性症モデルマウス(rd1)マウスに硝子体内注射し、動画再生の有無による行動の相違を観察した。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、10luxの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流した。マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測した。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から15分間とした。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、本開示の核酸コンストラクト(AAV (2/6/DJ)-CAGGS- Chimeric rhodopsin (GR/BvRh)-WPRE-pAベクター)を1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与した。失明コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与した。さらに比較群として感度の低い微生物型ロドプシン、AAV DJ-C1V1を投与した群も用意した。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、10luxの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流した。実験のために設計した空間を図8に示す。
マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測した。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から15分間とした。
失明コントロール群(EGFP)が物体動画側滞在時間比(マウスの動画を流すエリアに滞在した時間/計測時間)が、0.495±0.019であったのに対し、DJ型AAVキメラ注射では0.555±0.06、6型AAVキメラ注射では0.538±0.015であり有意に高かった(図9)。
図9の実験結果において、縦軸は、物体動画側滞在時間比(マウスの動画を流すエリアに滞在した時間/計測時間)を示す。物体動画側滞在時間比が0.5ではマウスの動きがないことを示し、0.5から離れるにつれて、視覚能と直結する物体認識機能を有するものと解釈される。
失明コントロール群(EGFP)では、物体動画側滞在時間比が0.495±0.019であったのに対し、DJ型AAVキメラ注射では0.555±0.06、6型AAVキメラ注射では0.538±0.015であり、有意に高い結果が得られた。なお、AAV2に組み込んだベクター(2-Chimera)では、動画を再生したケージの滞在時間が減少する傾向が認められたが、この結果は、ベクターの変化により通常とは見え方が異なることに起因して、天敵などの忌避する対象と錯覚している可能性が考えられた。
以上の結果から、本開示のコンストラクトを発現させることによって、物体を認識できるレベルまで視力が回復されることが実証された。
DJ型や6型では、物体を認識できるレベルの視力の回復が確認できたと考えられる。2型では、目的の双極細胞での発現量が低く物体が見えていない可能性と、視覚再生は起きているが、発現パターンが異なるため、見え方が異なり、マウスの動画を忌避している可能性が考えられます。
イオンチャネル型ロドプシンと、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質(GtACR2/BvRh)は、実施例1と同様の方法を用いて作製した。Guillardia theta(GT)(配列番号15)の細胞質側の第2ループに相当するアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシン(BvRh)(配列番号12)のアミノ酸相当配列に置換し、また、GTの細胞質側の第3ループに相当するアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシンのアミノ酸相当配列に置換したキメラタンパク質をコードするDNAをpCDNA3.1ベクターに挿入した。あるいは、配列番号6に記載の塩基配列を有する核酸を生成し、これをキメラタンパク質をコードするDNAとして、pCDNA3.1ベクターHindIII/XbaIサイトに挿入した。作製した核酸配列に特定の変異を加えることで配列番号7に記載の核酸配列を作製した。具体的には、1、2、4~9、11~17、21、22、27~30、33、34、36~41、43、45、48、49、51、54、56~58、60、63、65、68、70、71~75、77~78、81、83、84、86、89、90、92、93、95、97~99、102、103、111、113、114、123、125、130、131~137、139、142、143、146、148~153、156、160、161、165、167、168、170、171、174~176、180、182、183、187、188、190、191、196、197、199、200、202、204、208、212~214、217、219、226、229、232、236~238、240、242、243、247、248、251、252、258、263~265、267、269、271、272、274、276~280、282~284、289、290、291、294、297~299、302、304、307、310番目のアミノ酸をコードする塩基を、コードするアミノ酸を変えないように変更した。
GPCR活性を、細胞内cAMP濃度の指標として用いられるGloSensor(商標) (Promega) の蛍光を観察することにより測定した。
(材料)
ND7/23細胞を培養し、本開示の核酸コンストラクトにVenusを挿入したGR/BvRh-double-EQ-linker-Venus-ER2ベクターおよびpGloSensor(商標) (Promega) ベクターを遺伝子導入した。コントロール群には、pcDNA3.1 (空ベクター)およびpGloSensor (Promega) ベクターを同量遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を培養し、PBSで洗浄した後、トリプシンおよびEDTAを用いて細胞を剥がして遠沈管中に収集した。遠心分離により細胞を沈殿させ、新たなDMEM培養液を加えて懸濁した。細胞濃度をもとに、蛍光顕微鏡観察に適した濃度で細胞を播きなおした。
(Gタンパク質共役受容体(GPCR)活性の測定)
細胞内における、光刺激によるシグナル伝達を解析する実験系を構築した。シグナル伝達経路の詳細は、以下のとおりである。すなわち、視細胞は、細胞膜上にGタンパク質共役型受容体(GPCR)の1種であるロドプシンを発現しており、ロドプシンはレチナールと結合している。視細胞に光が当たるとレチナールの構造が変化し、これによりロドプシンが活性化する。活性化したロドプシンは、細胞膜近傍に分布するGタンパク質(網膜においてはGt)を活性化し、このGtは、cGMPホスホジエステラーゼを活性化する。cGMPホスホジエステラーゼは細胞内のcGMPを分解する酵素であるので、その活性化は細胞内のcGMP濃度を減少させる。
ここで視細胞は、その細胞膜上にcGMP依存性のイオンチャネルを有する。細胞内cGMP濃度が低下すると、このcGMP依存性イオンチャネルのイオン透過性が変化し、視細胞の膜電位が変化し、電気信号が生じる。このようにして、視細胞は光信号を電気信号に変換している。
ここで、Gt型Gタンパク質を介した経路におけるcGMP濃度は測定が困難であるため、本開示においては、同じGタンパク質ファミリーであるGi型Gタンパク質を介した経路により生じる細胞内cAMP濃度の変化を測定することによって、Gタンパク質の活性化を測定する。Gt型Gタンパク質とGi型Gタンパク質は交差性を有する(例えば、Xiang Li et al.、「Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin」、PNAS、2005年12月6日、102巻、49号、17816~17821頁の第17817頁左欄第4段落には、「脊椎動物ロドプシンは、Gタンパク質トランスデューシンであり、Giサブファミリーに属するαサブユニットとカップリングし(15)、したがって、哺乳動物ロドプシンが他のGi/oファミリーメンバーとカップリングする可能性が高まる」と記載されている)ことが、当業者には周知であるため、網膜におけるGtの活性化を測定するために、Gi型Gタンパク質を介した細胞内cAMP濃度の変化を測定することは、一般に行われていた。補足すると、Gタンパク質には複数の種類が存在し、視細胞に存在するGタンパク質はGt(Gαt)であることが知られている。Gt型Gタンパク質は、視細胞などの一部の細胞にのみ存在し、一般的な神経細胞にはGs、GiおよびGq型のGタンパク質が存在する。中でも、Gs型Gタンパク質はアデニル酸シクラーゼを活性化させて細胞内cAMP濃度を上昇させ、これに対し、Gi型Gタンパク質はアデニル酸シクラーゼを抑制して細胞内cAMP濃度を減少させる。
本実験においては、光刺激に応答した細胞内のシグナル伝達経路を解析するために、Gi型Gタンパク質を介した細胞内cAMP濃度の変化を測定した。具体的な実験手法は、以下のとおりである。
Lipofectamine(R)2000を使用して、HEK293T細胞にGR/BvRh-double-EQ-linker-Venus-ER2ベクターおよび対照ベクターを、製造者の指示どおりに発現させた。ベクターを、HEK293T細胞に導入する実験も並行して実施した。これらの培養細胞において525nmの1016 photons/cm2/sの光強度で1分間光刺激を与え、cAMP Gi kit(Cisbio社)を使用して、製造者の指示にしたがって、細胞内cAMP濃度の測定を行った。
遺伝子導入した細胞を、レチナールを含むCO2-independent 培養液 (10% FBS, 2% GloSensor(商標) stock solutionを含む) 中に移した。GloSensor(商標)の蛍光輝度の変化を記録することにより、細胞内cAMP濃度変化を測定した。測定は、光照射装置を有するプレートリーダーを用いて、標準的なGloSensor(商標)アッセイのプロトコルに従って行った。アデニリルシクラーゼを活性化するForskolin (終濃度3.5μM)を投与して、あらかじめ細胞内cAMP濃度を上昇させた。GloSensor(商標)の輝度が定常に達したことを確認し、Forskolin投与の約35分後から2分間に渡り510nmの波長 (約0.27mW)の光を照射した。さらに、Forskolin投与の約50分時後から2分間に渡り464nmの波長(約2.8mW) の光を照射した。この実験を2回行い、それぞれの実験におけるGloSensor(商標)の輝度変化をグラフにした(図10)。
コントロール群では、光照射ありと光照射なしとで輝度の違いは見られなかった(図10A)。一方で、GR/BvRh-double-EQ-linker-Venus-ER2ベクターを投与した群では、光を照射しなかった場合と比較して、464nmの光照射後にGloSensor(商標)の輝度減少が見られた(図10B)。GloSensor(商標)の輝度は、細胞内cAMP濃度低下に対応することが知られており、このことから、GR/BvRh-double-EQ-linker-Venus-ER2ベクターを投与した群では、光刺激により細胞内cAMP濃度が低下したことが示された。したがって、本開示の核酸コンストラクトにVenusを挿入したGR/BvRh-double-EQ-linker-Venus-ER2がGPCR活性を有し、網膜の疾患、障害または症状の処置、予防またはその進行の抑制、視覚認知行動機能の改善、視覚機能の強化をもたらし得ることがわかる。
図13において、HEK293T細胞にリポフェクション法を用いて各遺伝子を強制発現させ、光刺激の有無でそのcAMP濃度変化を測定した実験データを示す。縦軸にΔHTRF ratio、横軸には各遺伝子での結果を示す。HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence: 均一系時間分解螢光) は、cAMPの蛍光抗体を用いて測定した外来性の基準cAMPと内在性のcAMPの比(HTRF ratio)であり、内在性のcAMPが増えるほどHTRF ratioは低下し、cAMP濃度と反比例する関係にある。ΔHTRF ratioは光照射有無での、HTRF ratioの差であり、これが大きいほど、光刺激でcAMPが減少している、つまりGタンパク質(Gi)が活性化していることを示す。
図13では11個体を使用して実験を行った結果、陰性対照4.6±11.5に対し、第1の核酸コンストラクトのキメラタンパク質を発現させると31.1±21.4、本開示の核酸コンストラクトのキメラタンパク質を発現させると156.9±24.2であった。
したがって、本開示の核酸コンストラクトの発現は、第1の核酸コンストラクトのキメラタンパク質の発現よりも顕著に優れた光感度をもたらすことが実証された。
GPCR活性を、細胞内cAMP濃度の指標として用いられるGloSensor(商標) (Promega) の蛍光を観察することにより測定した。
(材料)
ND7/23細胞を培養し、GtACR2tr/BvRh-doubleベクターおよびpGloSensor(商標) (Promega) ベクターを遺伝子導入した。コントロール群には、pcDNA3.1 (空ベクター) およびpGloSensor (Promega) ベクターを同量遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を培養し、PBSで洗浄した後、トリプシンおよびEDTAを用いて細胞を剥がして遠沈管中に収集した。遠心分離により細胞を沈殿させ、新たなDMEM培養液を加えて懸濁した。細胞濃度をもとに、蛍光顕微鏡観察に適した濃度で細胞を播きなおした。
遺伝子導入した細胞を、レチナールを含むCO2-independent 培養液 (10% FBS, 2% GloSensor(商標) stock solutionを含む) 中に移した。GloSensor(商標)の蛍光輝度の変化を記録することにより、細胞内cAMP濃度変化を測定した。測定は、光照射装置を有するプレートリーダーを用いて、標準的なGloSensor(商標)アッセイのプロトコルに従って行った。アデニリルシクラーゼを活性化するForskolin (終濃度3.5μM)を投与して、あらかじめ細胞内cAMP濃度を上昇させた。GloSensor(商標)の輝度が定常に達したことを確認し、Forskolin投与の約35分後から2分間に渡り510nmの波長 (約0.27mW)の光を照射した。さらに、Forskolin投与の約50分時後から2分間に渡り464nmの波長(約2.8mW) の光を照射した。この実験を2回行い、それぞれの実験におけるGloSensor(商標)の輝度変化をグラフにした(図11)。
コントロールでは、光照射ありと光照射なしとでは、輝度の違いは見られなかった(図11A)。一方で、GtACR2tr/BvRh-doubleベクターを投与した群では、光を照射しなかった場合と比較して、464nmの光照射後にGloSensor(商標)の輝度減少が見られた(図11B)。GloSensor(商標)の輝度は、細胞内cAMP濃度低下に対応することが知られており、このことから、GtACR2tr/BvRh-doubleベクターを投与した群では、光刺激により細胞内cAMP濃度が低下したことが示された。したがって、本開示の核酸コンストラクトにVenusを挿入したGtACR2tr/BvRh-doubleがGPCR活性を有し、網膜の疾患、障害または症状の処置、予防またはその進行の抑制、視覚認知行動機能の改善、視覚機能の強化をもたらし得ることがわかる。
イオン輸送能を、パッチクランプ法により測定した。
ND7/23細胞を培養し、イオンチャネル型ロドプシンと、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質をコードするGtACR2tr/BvRh-doubleベクターを遺伝子導入した。コントロール群には、野生型グィラルディア・セータ(Guillardia theta)アニオンチャネルロドプシンをコードするGtACR1ベクターベクターを同量遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を、レチナールを含む培養液中で培養した。
パッチクランプ装置、微小ガラス電極、標準的な細胞外液および電極内液を用いて、ホールセルパッチクランプ記録を行った。光照射は、顕微鏡に設置した光照射装置により、500nmまたは480nmの光を約400ms照射することで行い、光照射の際の電流応答を光電流として記録した。測定に際しては、膜電位を-80mVから20mVまで (20mV間隔) の電位に固定して記録を行った。
コントロール群では、光照射により光電流が生じた((図12)。この光電流は、光照射の終了後、約2000msかけて減衰した。GtACR2tr/BvRh-doubleベクターを遺伝子導入した群では、光照射により大きな光電流が生じた。この光電流は、1000msほどで減衰した。これらの結果から、さらに、GtACR2tr/BvRh-doubleが、コントロール群より大きなイオン輸送能と速いキネティクスを有することが分かった。
実施例1で作製したキメラタンパク質をコードする核酸配列に、実施例2で挿入した小胞体輸出シグナルとは異なる小胞体輸出シグナルを挿入するキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを作製する。
実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが光応答に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、AAV DJ-CAGGS- Chimeric rhodopsin (GR/BvRh)-WPRE-pAベクター(第1の核酸コンストラクト)または実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にマウスの光応答を測定する。多電極アレー(Multielectrode array: MEA)試験により、ex vivoで網膜神経節細胞の光応答を、白色LEDの光刺激強度を変えて測定する。
第1の核酸コンストラクトでは1x1014 photons/cm2/s刺激までの光強度でしか応答を得られないが、実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは改善した応答が得られる。さらに、1x1014~16 photons/cm2/sの刺激強度範囲において、実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高い。また、1x1015
photons/cm2/sの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高い。
実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの波長感度を評価する。
実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの注射7週後の、生後11週齢の雄のrd1マウスの各波長の比視感度を測定する。波長特異的なLEDで光刺激を行い、反応が得られた25細胞のピーク発火頻度(Peak Firing Rate(spikes/sec))を各波長で測定する。全波長中、最も反応の高かった値を1として比にし、平均を測定する。1x1014 photons/cm2/sの光刺激強度にて測定を行う。測定の結果、実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射するマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かる。
実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが視覚誘発電位(Visual Evoked Potential:VEP)に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にVEPを測定する。測定の1週間前にマウスに3種混合麻酔(midazolam, medetomidine, butorphanol tartrate をそれぞれ4 mg/kg, 0.75 mg/kg
and 5 mg/kg body weightで投与)を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨(ラムダ縫合より1.5mm前方かつ1.5mm側方)に埋入する。再度3種混合麻酔で鎮静させた後、眼前3cmに設置した白色LEDより0.1cds/m2のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定する。測定機器はPuREC acquisition system (Mayo, Inazawa, Japan)を使用する。
コントロール、第1の核酸コンストラクト治療マウスに対して、実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクト治療マウスでは有意な振幅の増加を認められる。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められる。
実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降に明暗箱移動試験(Light-Dark
transition test:LDT)を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱(アクリルケース 幅:415mm 高さ:300mm 奥行:250mmが仕切りで2分割されており、片方は20luxの光が入り、片方は暗室となっており5x5mmの窓で接続されている。)にマウスを入れ10分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス(コントロール)では滞在時間比はおよそ半々の0.5となる。さらに、実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第1の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。失明コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、10luxの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流す。実験のために設計した空間を図8に示す。
マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測する。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から15分間とする。
失明コントロール群(EGFP)が物体動画側滞在時間比(マウスの動画を流すエリアに滞在した時間/計測時間)が、約0.5であるのに対し、実施例11のシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは有意に高い。
実施例1で作製したキメラタンパク質をコードする核酸配列に、小胞体移行シグナルを挿入するキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを作製する。
実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが光応答に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、AAV DJ-CAGGS- Chimeric rhodopsin (GR/BvRh)-WPRE-pAベクター(第1の核酸コンストラクト)または実施例19の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にマウスの光応答を測定する。多電極アレー(Multielectrode array: MEA)試験により、ex vivoで網膜神経節細胞の光応答を、白色LEDの光刺激強度を変えて測定する。
第1の核酸コンストラクトでは1x1014 photons/cm2/s刺激までの光強度でしか応答を得られないが、実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは改善した応答が得られる。さらに、1x1014~16
photons/cm2/sの刺激強度範囲において、実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高い。また、1x1015 photons/cm2/sの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高い。
実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの波長感度を評価する。
実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトの注射7週後の、生後11週齢の雄のrd1マウスの各波長の比視感度を測定する。波長特異的なLEDで光刺激を行い、反応が得られた25細胞のピーク発火頻度(Peak Firing Rate(spikes/sec))を各波長で測定する。全波長中、最も反応の高かった値を1として比にし、平均を測定する。1x1014 photons/cm2/sの光刺激強度にて測定を行う。測定の結果、実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射するマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かる。
実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが視覚誘発電位(Visual Evoked Potential:VEP)に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にVEPを測定する。測定の1週間前にマウスに3種混合麻酔(midazolam, medetomidine, butorphanol tartrate をそれぞれ4 mg/kg, 0.75 mg/kg
and 5 mg/kg body weightで投与)を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨(ラムダ縫合より1.5mm前方かつ1.5mm側方)に埋入する。再度3種混合麻酔で鎮静させた後、眼前3cmに設置した白色LEDより0.1cds/m2のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定する。測定機器はPuREC acquisition system (Mayo, Inazawa, Japan)を使用する。
コントロール、第1の核酸コンストラクト治療マウスに対して、実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクト治療マウスでは有意な振幅の増加を認められる。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められる。
実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降に明暗箱移動試験(Light-Dark transition test:LDT)を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱(アクリルケース 幅:415mm 高さ:300mm 奥行:250mmが仕切りで2分割されており、片方は20luxの光が入り、片方は暗室となっており5x5mmの窓で接続されている。)にマウスを入れ10分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス(コントロール)では滞在時間比はおよそ半々の0.5となる。さらに、実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第1の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×109 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。失明コントロール群には、AAV DJ-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、10luxの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流す。実験のために設計した空間を図8に示す。
マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測する。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から15分間とする。
失明コントロール群(EGFP)が物体動画側滞在時間比(マウスの動画を流すエリアに滞在した時間/計測時間)が、約0.5であるのに対し、実施例17の小胞体移行シグナルをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトでは有意に高い。
配列番号7に示される塩基配列とは異なる、廃列番号に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を作製する。配列番号7に示される塩基配列を含む核酸コンストラクトと、本実施例で作製する塩基配列を含む核酸コンストラクトとを、ND7/23細胞に遺伝子導入する。
配列番号7に示される塩基配列とは異なる、配列番号8に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を作製する。配列番号7に示される塩基配列を含む核酸コンストラクトと、本実施例で作製する塩基配列を含む核酸コンストラクトとを、ND7/23細胞に遺伝子導入する。
接着培養系として、HEK293T細胞または(接着性)HEK293細胞を培養する。浮遊培養系として、(浮遊性)HEK293細胞またはCHO細胞を培養する。培養後に、下記のプラスミドを混合し、細胞にトランスフェクションする(PEI:Polyethylenimine、必要に応じて、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法を使用)。
pAAV-RC (rep and cap genes)
pHelper
pAAV-GOI(a gene of interest)
トランスフェクションの数日後に細胞を回収し、界面活性剤を用いて細胞を溶解し、原薬を得る。その後、アフィニティークロマトグラフィー、超遠心、フィルター精製を実施して精製を行い最終産物を得る。精製は、Nathalie C and Joshua C., Methods & Clinical Development (2016) 3, 16002に記載の方法に基づいて実施することができる。
配列番号26に示す塩基配列(配列番号27に示すアミノ酸配列をコードする)が光応答に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、AAV 6-CAGGS- Chimeric rhodopsin (GR/BvRh)-WPRE-pAベクター(第1の核酸コンストラクト)または配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×108 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にマウスの光応答を測定する。多電極アレー(Multielectrode array: MEA)試験により、ex vivoで網膜神経節細胞の光応答を、白色LEDの光刺激強度を変えて測定する。
第1の核酸コンストラクトでは1x1014 photons/cm2/s刺激までの光強度でしか応答を得られないが、配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトでは改善した応答が得られる。さらに、1x1014~16 photons/cm2/sの刺激強度範囲において、配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトの方が発火頻度は有意に高い。また、1x1015 photons/cm2/sの刺激強度において単位面積当たりの発火細胞数も有意に高い。
配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトの波長感度を評価する。
配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトの注射7週後の、生後11週齢の雄のrd1マウスの各波長の比視感度を測定する。波長特異的なLEDで光刺激を行い、反応が得られた25細胞のピーク発火頻度(Peak Firing Rate(spikes/sec))を各波長で測定する。全波長中、最も反応の高かった値を1として比にし、平均を測定する。1x1014 photons/cm2/sの光刺激強度にて測定を行う。測定の結果、配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射するマウスは、想定された通りの波長感度を示すことが分かる。
配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトが視覚誘発電位(Visual Evoked Potential:VEP)に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×108 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、AAV 6-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降にVEPを測定する。測定の1週間前にマウスに3種混合麻酔(midazolam, medetomidine, butorphanol tartrate をそれぞれ4 mg/kg, 0.75 mg/kgおよび5 mg/kg body weightで投与)を投与して鎮静化させ、測定電極を視覚野付近の頭蓋骨(ラムダ縫合より1.5mm前方かつ1.5mm側方)に埋入する。再度3種混合麻酔で鎮静させた後、眼前3cmに設置した白色LEDより0.1cds/m2のフラッシュ刺激に対する誘発電位を測定する。測定機器はPuREC acquisition system (Mayo, Inazawa, Japan)を使用する。
コントロール、第1の核酸コンストラクト治療マウスに対して、配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト治療マウスでは有意な振幅の増加を認められる。改良コンストラクトでの治療により中枢レベルでの視覚有意な再生効果も認められる。
配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトが明暗認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、第1の核酸コンストラクトまたは配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×108 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。コントロール群には、AAV 6-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。
遺伝子発現がピークを迎える注射後4週以降に明暗箱移動試験(Light-Dark transition test:LDT)を行い、明暗認識機能を評価する。明暗箱(アクリルケース 幅:415mm 高さ:300mm 奥行:250mmが仕切りで2分割されており、片方は10luxの光が入り、片方は暗室となっており5x5mmの窓で接続されている。)にマウスを入れ10分間の行動をビデオで撮影する。明所暗所の滞在時間比を測定比較する。
健常なマウスでは、明所を忌避するため、明所滞在時間は短くなるが、一方失明しているマウス(コントロール)では滞在時間比はおよそ半々の0.5となる。さらに、配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスでは、第1の核酸コンストラクトを注射して治療を行ったマウスと比較して有意に滞在時間が短縮されることがわかる。
配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトが物体認識機能に与える影響を測定する。以下に説明する。
(動物)
網膜色素変性症モデルであるrd1マウス(Pde6brd1/rd1)を使用する。上記変異を持つ、C3H/HeJ Jclマウスを日本クレア株式会社より購入する。
生後10週齢以降の失明したrd1マウスに、配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトを1.0×108 vg/μl濃度で1μlを硝子体内注射にて投与する。失明コントロール群には、AAV 6-CAGGS- EGFP-WPRE-pAベクターを同量投与する。マウスを入れた空間の両側にタブレット端末を設置し、10luxの明るさで、片方はマウスの動画、他方は空のマウスケージを流す。実験のために設計した空間を図8に示す。
マウスの動画を流すエリアおよび空のマウスケージの動画を流すエリアの滞在時間をそれぞれ計測する。計測対象時間は、中央の仕切りを外した直後から15分間とする。
失明コントロール群(EGFP)が物体動画側滞在時間比(マウスの動画を流すエリアに滞在した時間/計測時間)が、約0.5であるのに対し、配列番号26に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクトでは有意に高い。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に出願された、特願2019-167553(2019年9月13日出願)に対して優先権主張をするものであり、同出願の内容はそのすべてが本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用される。
配列番号2:キメラロドプシン(GR/BvRh)および小胞体輸出シグナルからなるアミノ酸配列の一例
配列番号3:キメラロドプシン(GR/BvRh)、小胞体輸出シグナルおよびFLAGタグからなる核酸配列の一例
配列番号4:キメラロドプシン(GR/BvRh)、小胞体輸出シグナルおよびFLAGタグからなるアミノ酸配列の一例
配列番号5:キメラロドプシン(GR/BvRh)のアミノ酸配列の一例
配列番号6:キメラロドプシン(GtACR2/BvRh)の核酸配列の一例
配列番号7:キメラロドプシン(GtACR2/BvRh)の核酸配列の一例
配列番号8:キメラロドプシン(GtACR2/BvRh)のアミノ酸配列の一例
配列番号9:ヒトロドプシン(huRh)の核酸配列
配列番号10:ヒトロドプシン(huRh)のアミノ酸配列
配列番号11:ウシロドプシン(BvRh)の核酸配列
配列番号12:ウシロドプシン(BvRh)のアミノ酸配列
配列番号13:Gloeobacter violaceus Rhodopsin(GR)の核酸配列
配列番号14:Gloeobacter violaceus Rhodopsin(GR)のアミノ酸配列
配列番号15:Guillardia theta anion channelrhodopsin2(GtACR2)の核酸配列
配列番号16:Guillardia theta anion channelrhodopsin2(GtACR2)のアミノ酸配列
配列番号17:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第2ループの核酸配列の一例
配列番号18:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第2ループの核酸配列の一例
配列番号19:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第2ループのアミノ酸配列の一例(配列番号18に対応)
配列番号20:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第3ループの核酸配列の一例
配列番号21:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第3ループの核酸配列の一例
配列番号22:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第3ループのアミノ酸配列の一例
配列番号23:キメラロドプシン(GR/BvRh)の核酸配列の例(配列番号8に対応する)。開始コドンは、ヌクレオチド43-45に相当し、終止コドンはヌクレオチド994-996に相当する。
配列番号24:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第2ループの核酸配列の一例
配列番号25:Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第2ループのアミノ酸配列の一例(配列番号24に対応)
配列番号26:キメラロドプシン(GR/BvRh)および小胞体輸出シグナルからなる核酸配列の一例
配列番号27:キメラロドプシン(GR/BvRh)および小胞体輸出シグナルからなるアミノ酸配列の一例
Claims (32)
- イオン輸送型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含む、核酸。
- 前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、請求項1に記載の核酸。
- 前記核酸は、配列番号1または26に示す核酸配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
- FLAGタグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記核酸は、配列番号3に示す核酸配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記核酸は、配列番号26に示す核酸配列である、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸。
- イオン輸送型受容体ロドプシンと、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質およびシグナル配列からなる、ポリペプチド。
- 前記シグナル配列が、小胞体輸出シグナル配列である、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、配列番号2または配列番号26に示すアミノ酸配列である、請求項8または9に記載のポリペプチド。
- 請求項7~9のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- FLAGタグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項10に記載の核酸。
- 配列番号4に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項10または11に記載の核酸。
- イオンチャネル型受容体ロドプシンの少なくとも一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの少なくとも一部とを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸。
- 前記核酸は、配列番号7に示す核酸配列を含む、請求項13に記載の核酸。
- イオンチャネル型受容体ロドプシンの一部と、Gタンパク質共役型受容体ロドプシンの一部とのキメラタンパク質を含む、ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、配列番号8に示すアミノ酸配列である、請求項15に記載のポリペプチド。
- 請求項15または16に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項13に記載の核酸。
- 配列番号8に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項17に記載の核酸。
- 請求項1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸ならびに/または請求項13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸ならびに該核酸に作動可能に連結された、細胞における発現を可能にする核酸を含む、核酸コンストラクト。
- ベクターをさらに含む、請求項19に記載の核酸コンストラクト。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項20に記載の核酸コンストラクト。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項20または21に記載の核酸コンストラクト。
- 前記ベクターがAAVベクターである、請求項20~22のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記AAVベクターがAAV-DJ、AAV-2またはAAV-6である、請求項23に記載の核酸コンストラクト。
- 請求項1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、請求項13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、または請求項19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子導入用組成物。
- 請求項1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、請求項7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、請求項15~16に記載のポリペプチド、または請求項19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトのうちの1つまたは複数を含む、細胞。
- 前記細胞が網膜細胞である、請求項26に記載の細胞。
- 請求項1~6および10~12のいずれか一項に記載の核酸、請求項7~9のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項13~14および17~18のいずれか一項に記載の核酸、請求項15~16に記載のポリペプチド、請求項19~24のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、請求項25に記載の遺伝子導入用組成物、または請求項26~27のいずれか一項に記載の細胞のうちの1つまたは複数を含む、医薬組成物。
- 網膜の疾患、障害または症状を処置、予防またはその進行を抑制するための、請求項28に記載の医薬組成物。
- 視覚認知行動機能の改善のための、請求項28に記載の医薬組成物。
- 視覚機能を強化するための、請求項28に記載の医薬組成物。
- 物体認識機能を強化するための、請求項31に記載の医薬組成物。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CA3154358A CA3154358A1 (en) | 2019-09-13 | 2020-09-11 | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
JP2021545627A JPWO2021049634A1 (ja) | 2019-09-13 | 2020-09-11 | |
EP20863196.0A EP4029521A4 (en) | 2019-09-13 | 2020-09-11 | CONSTRUCTION OF NUCLEIC ACIDS ENCODING CHIMERIC RHODOPSIN |
US17/642,923 US20220402994A1 (en) | 2019-09-13 | 2020-09-11 | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
CN202080078616.4A CN114761044A (zh) | 2019-09-13 | 2020-09-11 | 编码嵌合视紫红质的核酸构建体 |
US17/731,976 US11771741B2 (en) | 2019-09-13 | 2022-04-28 | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019167553 | 2019-09-13 | ||
JP2019-167553 | 2019-09-13 |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
US17/642,923 A-371-Of-International US20220402994A1 (en) | 2019-09-13 | 2020-09-11 | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
US17/731,976 Continuation US11771741B2 (en) | 2019-09-13 | 2022-04-28 | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2021049634A1 true WO2021049634A1 (ja) | 2021-03-18 |
Family
ID=74867039
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2020/034543 WO2021049634A1 (ja) | 2019-09-13 | 2020-09-11 | キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220402994A1 (ja) |
EP (1) | EP4029521A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2021049634A1 (ja) |
CN (1) | CN114761044A (ja) |
CA (1) | CA3154358A1 (ja) |
WO (1) | WO2021049634A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11771741B2 (en) | 2019-09-13 | 2023-10-03 | Restore Vision Inc. | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
US11932679B2 (en) | 2016-09-02 | 2024-03-19 | Keio University | Agent for restoring visual function or agent for preventing deterioration in visual function |
EP4215212A4 (en) * | 2020-09-17 | 2024-04-24 | Restore Vision Inc | COMPOSITION FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF DISEASES, DISORDERS OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH ENDOPLASTIC RETICULUM STRESS OR ALL-TRANS-RETINOAL |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1129599A (ja) | 1997-02-27 | 1999-02-02 | Japan Tobacco Inc | 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子 |
JP2014500716A (ja) * | 2010-11-05 | 2014-01-16 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 光活性化キメラオプシンおよびその使用方法 |
WO2018043707A1 (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 学校法人慶應義塾 | 視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤 |
JP2019167553A (ja) | 2018-03-22 | 2019-10-03 | Jfeスチール株式会社 | 溶融金属めっき鋼帯の製造方法及び製造装置 |
WO2020148913A1 (ja) * | 2019-01-18 | 2020-07-23 | 俊英 栗原 | 網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能の改善、および視覚機能強化 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2547762B1 (en) * | 2010-03-17 | 2018-04-25 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Light-sensitive ion-passing molecules |
-
2020
- 2020-09-11 CA CA3154358A patent/CA3154358A1/en active Pending
- 2020-09-11 US US17/642,923 patent/US20220402994A1/en active Pending
- 2020-09-11 CN CN202080078616.4A patent/CN114761044A/zh active Pending
- 2020-09-11 JP JP2021545627A patent/JPWO2021049634A1/ja active Pending
- 2020-09-11 WO PCT/JP2020/034543 patent/WO2021049634A1/ja unknown
- 2020-09-11 EP EP20863196.0A patent/EP4029521A4/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1129599A (ja) | 1997-02-27 | 1999-02-02 | Japan Tobacco Inc | 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子 |
JP2014500716A (ja) * | 2010-11-05 | 2014-01-16 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 光活性化キメラオプシンおよびその使用方法 |
WO2018043707A1 (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 学校法人慶應義塾 | 視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤 |
JP2019167553A (ja) | 2018-03-22 | 2019-10-03 | Jfeスチール株式会社 | 溶融金属めっき鋼帯の製造方法及び製造装置 |
WO2020148913A1 (ja) * | 2019-01-18 | 2020-07-23 | 俊英 栗原 | 網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能の改善、および視覚機能強化 |
Non-Patent Citations (17)
Title |
---|
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410 |
AUSUBEL ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1995, WILEY INTERSCIENCE PUBLISHERS, article "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach" |
BATZER ET AL., NUCLEIC ACID RES., vol. 19, 1991, pages 5081 |
DALBADIE-MCFARLAND, G. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 79, 1982, pages 6409 - 6413 |
FEBS LETT, vol. 493, no. 2-3, 30 March 2001 (2001-03-30), pages 129 - 33 |
KATADA YUSAKU; YOSHIDA KAZUHO; KUNIMI HIROMITSU; KOBAYASHI KENTA; KANDORI HIDEKI; TSUBOTA KAZUO; KURIHARA TOSHIHIDE: "P01-071: Examination of visual reconstruction effect using chimera rhodopsin", JOURNAL OF JAPANESE OPHTHALMOLOGICAL SOCIETY, vol. 122, 9 March 2018 (2018-03-09), pages 259, XP009522560 * |
KURIHARA, TOSHIHIDE: "S14-4: Visuel restoration utilizing optogenetics for retinal degeneration", JOURNAL OF JAPANESE OPHTHALMOLOGICAL SOCIETY, vol. 123, no. Suppl., 13 March 2019 (2019-03-13), JP , pages 55, XP009535476, ISSN: 0029-0203 * |
LI ET AL.: "Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin", PNAS, vol. 102, no. 49, 6 December 2005 (2005-12-06), pages 17816 - 17821, XP009159155, DOI: 10.1073/pnas.0509030102 |
MARK, D. F. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 5662 - 5666 |
OHTSUKA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 260, 1985, pages 2605 - 2608 |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877 |
ROSSOLINI ET AL., MOL. CELL. PROBES, vol. 8, 1994, pages 91 - 98 |
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", vol. 1, 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, pages: 42 - 45 |
SASAKI, K. ET AL.: "Chimeric proton-pumping rhodopsins containing the cytoplasmic loop of bovine rhodopsin", PLOS ONE, vol. 9, no. issue 3, 2014, pages e91323, XP055584279, DOI: 10.1371/journal.pone.0091323 * |
WANG, A. ET AL., SCIENCE, vol. 224, pages 1431 - 1433 |
ZHAO, S. ET AL.: "Improved expression of halorhodopsin for light-induced silencing of neuronal activity", BRAIN CELL BIOLOGY, vol. 36, 2008, pages 141 - 154, XP019647658, DOI: 10.1007/s11068-008-9034-7 * |
ZOLLER, M. J.SMITH, M., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 10, 1982, pages 6487 - 6500 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11932679B2 (en) | 2016-09-02 | 2024-03-19 | Keio University | Agent for restoring visual function or agent for preventing deterioration in visual function |
US11771741B2 (en) | 2019-09-13 | 2023-10-03 | Restore Vision Inc. | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
EP4215212A4 (en) * | 2020-09-17 | 2024-04-24 | Restore Vision Inc | COMPOSITION FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF DISEASES, DISORDERS OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH ENDOPLASTIC RETICULUM STRESS OR ALL-TRANS-RETINOAL |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2021049634A1 (ja) | 2021-03-18 |
EP4029521A4 (en) | 2023-09-06 |
US20220402994A1 (en) | 2022-12-22 |
EP4029521A1 (en) | 2022-07-20 |
CN114761044A (zh) | 2022-07-15 |
CA3154358A1 (en) | 2021-03-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2021049634A1 (ja) | キメラロドプシンをコードする核酸コンストラクト | |
Bi et al. | Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration | |
JP6969798B2 (ja) | SynP160、桿体光受容器における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター | |
JP7042741B2 (ja) | SynP161、桿体光受容器における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター | |
EP2465931B1 (en) | Light-receiving channel rhodopsin having improved expression efficiency | |
JP7023279B2 (ja) | SynP198、方向選択性網膜神経節細胞内での遺伝子の特異的発現のためのプロモーター | |
JP7075341B2 (ja) | SynP162、桿体光受容器における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター | |
JP7058220B2 (ja) | SynP159、桿体光受容器における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター | |
Kostic et al. | Animal modelling for inherited central vision loss | |
JP7299632B2 (ja) | 網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能の改善、および視覚機能強化 | |
JP2018531004A (ja) | 光受容器のターゲッティングにより失明を治療するための新規な治療用ツールおよび方法 | |
JP2018531004A6 (ja) | 光受容器のターゲッティングにより失明を治療するための新規な治療用ツールおよび方法 | |
JP2015128440A (ja) | 失明の治療のための新規な治療用ツールおよび方法 | |
KR102008538B1 (ko) | 감광성 키메라 gpcr 단백질 | |
AU2022204884A1 (en) | Optogenetic visual restoration using Chrimson | |
US20190194294A1 (en) | Agent for restoring visual function or agent for preventing deterioration in visual function | |
CN113710805A (zh) | 用于诊断和治疗视网膜病变的组合物和方法 | |
US11771741B2 (en) | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin | |
CN112689675B (zh) | 光响应性蛋白及其应用 | |
JP2023510676A (ja) | 光遺伝学的な用途のためのオプシン・シグナル伝達寿命の調節 | |
WO2021182646A1 (ja) | 色認識のための光応答性タンパク質及びその利用 | |
WO2022059736A1 (ja) | 小胞体ストレスまたはオールトランスレチナールに関連する疾患、障害または症状を治療または予防するため、または網膜厚を保護し、または網膜厚の萎縮もしくは萎縮進行を抑制するための組成物。 | |
WO2024048688A1 (ja) | 光応答改変型オプシン類 | |
Simon et al. | Reactivating the phototransduction cascade by universally applicable gene therapy preserves retinal function in Rod-Cone dystrophy | |
WO2021193731A1 (ja) | 改変チャネルロドプシン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 20863196 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2021545627 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 3154358 Country of ref document: CA |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2020863196 Country of ref document: EP Effective date: 20220413 |