JP2023510676A

JP2023510676A - 光遺伝学的な用途のためのオプシン・シグナル伝達寿命の調節

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Publication number: JP2023510676A
Application number: JP2022522339A
Authority: JP
Inventors: ルーカスロバート; ロジャースジェシカ; レイモンドバリスターエドワード
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・マンチェスター
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2023-03-15
Also published as: EP4045529A1; WO2021074606A1; US20230165938A1; WO2021074606A9; GB201914826D0

Abstract

本開示は、オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドを含む組成物、並びにそれらの使用、を提供する。例示的な実施形態は、オプシン・ポリペプチド、又はオプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチド、を含む組成物を提供する、ここで、前記オプシン・ポリペプチド又は前記アレスチン・ポリペプチドのうちの少なくとも1つは、光に対する前記オプシン・ポリペプチドの応答の時間分解能を増加させる、少なくとも1つの変異、を含む。前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドは、作動可能に連結している、又は分離している、ことがある。更に、網膜の光感受性を回復させるための、又は網膜変性の症状を治療するための、前記組成物の使用も提供される。【選択図】図１ａ

Description

本発明は、オプシン及び変異アレスチン；変異オプシン及びアレスチン；オプシン及びアレスチンの融合タンパク質、又はオプシン及びアレスチンの一方若しくは両方の変異体の融合タンパク質；又はオプシンのメタ-II崩壊の変異体、をコードする1種以上の核酸配列、を含む1種以上のベクター、を含む組成物に関する。本発明は、また、オプシン及び変異アレスチン；変異オプシン及びアレスチン；オプシン及びアレスチンの融合タンパク質、又はオプシン及びアレスチンの一方若しくは両方の変異体の融合タンパク質；又はオプシンのメタ-II崩壊の変異体を含む組成物にも関する。また、オプシンの不活性化を増加させる、オプシンの時間分解能を増加させる、細胞に光レセプター機能を提供する、及び／又は細胞を光活性化され得るようにする、方法も提供される、ここで、前記方法は、本出願に記載するようなベクターを、細胞中で発現させることを含む。また、本出願で開示されるような1種以上のベクターを含む組換え細胞、及び本発明を実施するためのキットも提供される。

光遺伝学は、光感受性タンパク質を異所性に発現させることによって、光を用いて細胞の活動をコントロールするプロセスである。光遺伝学的にコントロールするための光色素の1つのクラスは、レチンアルデヒド-結合オプシンである。オプシンには、2つの主要なクラスがある：光感受性イオン・チャネルを含むI型の微生物オプシン、及びG-タンパク質共役レセプター(G protein coupled receptors (GPCR))を含むII型の動物オプシン。微生物オプシンは、短寿命の光応答性を有し、高い時間分解能で光遺伝学的なコントロールを可能にする。対照的に、動物オプシンは、自身の自然な環境以外で発現したときに、長く持続する光応答性を駆動するので、光遺伝学的なコントロールの時空間分解能には限界がある。ロドプシンを光活性化すると、ロドプシンは生理的に活性なメタ-II(R*)状態に変換し、それにより桿体の光応答（rod light response）を誘発する。メタIIは、G-タンパク質レセプター・キナーゼ(G-protein receptor kinase (Grk1))がC-末端残基をリン酸化し、それに続いてアレスチンが結合することによって、急速に不活性化される。これらの色素は、動物界全体にわたる種において、高度に鋭敏な視力を提供するが、動物オプシンを用いて達成される光遺伝学的なコントロールの時間分解能を改善することに対するニーズが存在する。

オプシンと組み合わせたアレスチンの変異体
オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組成物、が本出願で開示される。オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物、もまた、本出願で開示される。

オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、任意の種由来の、野生型オプシン・ポリペプチド、その均等物、又はその相同体若しくは変異体、をコードする核酸であることがある。変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、任意の種由来の、変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸であることがある。いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸はヒト・オプシン・ポリペプチドをコードする、及び／又はアレスチン変異体をコードする核酸はヒト・アレスチン変異体をコードする核酸である。

いくつかの実施形態では、前記組成物は、眼球又は網膜下投与に好適である。

いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ウイルス・ベクターである。いくつかの実施形態では、前記ウイルス・ベクターは、アデノ随伴ウイルス・ベクター又は改変AAVである。一実施形態では、好適なAAVベクターは、AAV2である。第1及び第2のベクターが提供される場合、それらは、同じタイプのベクターであってもよく、又は異なっていてもよい。例えば、第1のベクターはウイルス・ベクターであってもよく、及び第2のベクターは非-ウイルス・ベクターであってもよい、又はその逆であってもよい。第1のベクターはAAVであってもよく、及び第2のベクターは非-ウイルス・ベクター又はAAV以外のウイルス・ベクターであってもよい。前記第1及び第2のベクターは、両方がAAVであることがあり、同一又は異なった血清型のAAVであることがある。一実施形態では、前記ベクターは、AAV2である。

好適な実施形態では、ベクターは、前記核酸配列が発現する前記オプシンとアレスチン・ポリペプチドとが、作動可能に連結するためのリンカーをコードする核酸配列、を更に含むことがある。リンカーをコードする核酸配列は、前記オプシン及び／又はアレスチンをコードする核酸配列に作動可能に連結することがある。前記核酸配列は、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、からなる群より選択されるリンカーをコードすることがある。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。リンカーは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、分離しているオプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドをコードする。リンカーは、長さが、5-250アミノ酸、より好適には8から150、より好適には8-100アミノ酸、最も好適には10-100であることがある。最も好適なリンカーは、長さが、8-12、好適には10アミノ酸であることがある。好適なリンカーは、10nm ER/K準-可撓性リンカーであることがある。

いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼによるリン酸化が減少する又は最小限になるように、改変したオプシン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、C-末端リン酸化部位に関連する変異、を有するオプシン・ポリペプチドをコードする核酸である。一実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を有するオプシン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、C-末端リン酸化部位に関連する変異及びメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を有するオプシン・ポリペプチドをコードする核酸である。

C末端リン酸化部位に関連する変異は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、若しくはS343A、又はそれらの任意の組み合わせ、であることがある。いくつかの実施形態では、前記核酸は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異、を含むヒト・オプシン・ポリペプチド（本出願では、ロッド・オプシン6A (rod opsin 6A)と呼ぶ）をコードする。いくつかの実施形態では、前記変異により、メタ-II崩壊の速度が増加する。いくつかの実施形態では、前記核酸は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択されるメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。好適な実施形態では、前記核酸は、E122Qである変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、i)C末端リン酸化部位に関連する変異、及びii)メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、の組み合わせを含むオプシン・ポリペプチドをコードする。好適には、前記変異又は変異の組み合わせは、本出願で記載の通りである。

いくつかの実施形態では、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を有するアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、若しくはQ332K、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、L337A、V378A、F379A、及びそれらの任意の組み合わせ、から選択される変異、を有するアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、及びそれらの任意の組み合わせ、から選択される変異、を有するアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、変異L337A、V378A、及びF379Aを有するアレスチン・ポリペプチド（「アレスチン3A」又は「3A」と呼ぶ）をコードする核酸である。いくつかの実施形態では、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、変異L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332Kを含むアレスチン・ポリペプチド（「アレスチンKEQ3A」又は「KEQ3A」と呼ぶ）をコードする核酸である。

いくつかの実施形態では、オプシンをコードする核酸は、C末端リン酸化部位に関連する変異、及び／又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を有するオプシン・ポリペプチドをコードする核酸である、並びに前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を有するアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、C末端リン酸化部位に関連する変異(例えば、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343A、又はそれらの任意の組み合わせ)から選択される変異、及び／又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異(例えば、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される)、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする核酸である；並びに前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含むアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、前記核酸がコードする変異の組み合わせは、a)及び／若しくはb)、並びに／又はc)から選択される変異、を含むことがある、ここで、a)は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343Aを含む；b)は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F又はそれらの組み合わせを含む、及びc)は、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K又はそれらの組み合わせを含む。好適な実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、E122Q変異、を有するオプシン・ポリペプチドをコードする核酸であることがある、及び前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、野生型アレスチンをコードする核酸である。好適な実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、E122Q変異、を有するオプシン・ポリペプチドをコードする核酸であることがある、並びに前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、L337A、V378A及びF379Aに変異、を有するアレスチン・ポリペプチド（本出願では3Aと呼ぶ）をコードする核酸である。好適な実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、E122Q、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、及びS343Aに変異、を有するオプシン・ポリペプチドをコードする核酸であることがある、並びにアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、L337A、V378A、及びF379Aに変異、を有するアレスチン・ポリペプチド（3A）をコードする核酸である。好適な実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、E122Q、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、及びS343Aに変異、を有するヒト・オプシン・ポリペプチド（E122Qロッド6A (E122Q rod 6A)）をコードする核酸であることがある、並びに前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、L337A、V378A、及びF379Aに変異、を有するアレスチン・ポリペプチド（3A）をコードする核酸である。

好適な実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、C末端リン酸化部位に関連する変異又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含まない野生型オプシン・ポリペプチド又はそのバリアントをコードすることがある。このような変異は、本出願に記載されている。

オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組換え細胞、が本出願で開示される。オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組換え細胞、もまた、本出願で開示される。好適には、前記ベクターは、本出願に記載される通りである。

オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含む組換え細胞、もまた、本出願で開示される。好適には、その核酸配列は、本出願で記載される通りである。好適な実施形態では、前記第1及び／又は第2の核酸は、前記細胞のゲノムの中に組み込まれることがある。

本出願で定義される発現される核酸配列、を含む本出願で定義される組換え細胞、もまた、本出願で開示される、

いくつかの実施形態では、前記細胞は神経細胞である、好適には神経幹細胞である。好適には、前記細胞は網膜細胞である。好適な実施形態では、前記細胞は内側網膜である。好適な実施形態では、前記細胞はオン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。好適には、前記細胞はヒト細胞である。

オプシン・ポリペプチド及び変異体アレスチン・ポリペプチドを含む組成物、が本出願で開示される。前記オプシン・ポリペプチドは、任意の種由来の、野生型オプシン・ポリペプチド、その均等物、又はそれらの相同体若しくは変異体であることがある。前記変異体アレスチン・ポリペプチドは、任意の種由来の、変異体アレスチン・ポリペプチドであることがある。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドはヒト・オプシンである、及び／又は前記アレスチンはヒト・アレスチンである。

いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、非リン酸化オプシンに対するその結合親和性を増加させることを促進する1つ以上の変異、を有する。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、C末端リン酸化部位に関連する1つ以上の変異、を有する。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、メタ-II崩壊の速度を増加させる1つ以上の変異、を有する。

前記オプシン・ポリペプチドは、リンカーを介して、前記アレスチン・ポリペプチドに作動可能に連結することがある、又は前記オプシン・ポリペプチドは、前記アレスチン・ポリペプチドから分離していることがある。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。リンカーは、ER/K準-可撓性リンカーであることがある。リンカーは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドと前記アレスチン・ポリペプチドとは分離している。リンカーは、長さが、5-250アミノ酸、より好適には8から150、より好適には8-100アミノ酸、最も好適には10-100であることがある。最も好適なリンカーは、長さが、8-12、好適には10アミノ酸であることがある。好適なリンカーは、10nm ER/K準-可撓性リンカーであることがある。

いくつかの実施形態では、前記オプシンは、C末端リン酸化部位に関連する1つ以上の変異、を有する、及び／又は前記オプシン・ポリペプチドは、メタ-II崩壊の速度を増加させる1つ以上の変異、を有する、並びに前記アレスチン・ポリペプチドは、非リン酸化オプシンに対するその結合親和性を増加させることを促進する1つ以上の変異、を有する。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、非リン酸化オプシンに対するその結合親和性を増加させることを促進する1つ以上の変異、を有する、及び前記オプシン・ポリペプチドは、C末端リン酸化部位に関連する変異又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含まない野生型オプシン又はそのバリアントである。

いくつかの実施形態では、前記オプシンを、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼによるリン酸化が減少する又は最小限になるように、改変する。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、C-末端リン酸化部位に関連する変異、を含む。C末端リン酸化部位に関連する変異は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343A、又はそれらの任意の組み合わせ、であることがある。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、ヒト・ロッド・オプシン(human rod opsin)である、並びにS333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異、を含む（本出願では、ロッド・オプシン6A(rod opsin 6A)と呼ぶ）。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含む。メタ-II崩壊の速度を増加させる変異は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択されることがある。いくつかの実施形態では、前記変異は、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される。好適な実施形態では、オプシン変異はE122Qである。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、i)C末端リン酸化部位に関連する変異、及びii)メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、前記アレスチンは、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L337A、V378A、F379A、及びそれらの任意の組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、及びそれらの任意の組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、変異L337A、V378A、及びF379A、を含む(3Aと呼ぶ)。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、変異L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、を含む(KEQ3Aと呼ぶ)。

いくつかの実施形態では、前記オプシンは、C-末端リン酸化部位に関連する変異及び／又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含む、並びに前記アレスチンは、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、C末端リン酸化部位に関連する変異（例えば、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343A、又はそれらの任意の組み合わせ）、及び／又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異（例えば、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ）、から選択される変異、を含む；並びに前記アレスチンは、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、変異の組み合わせは、a)及び／若しくはb)、並びに／又はc)から選択される変異、を含むことがある、ここで、a)は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343Aを含む；b)は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F又はそれらの組み合わせを含む、及びc)は、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K又はそれらの組み合わせを含む。好適な実施形態では、オプシン変異は、野生型アレスチンと組み合わせた、E122Qである。好適な実施形態では、オプシン変異は、L337A、V378A及びF379Aでのアレスチン変異（本出願では3Aと呼ぶ）と組み合わせた、E122Qである。好適な実施形態では、前記オプシン変異は、L337A、V378A、及びF379Aでのアレスチン変異(3A)と組み合わせた、E122Q、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、及びS343Aである。好適な実施形態では、前記オプシンはヒト・ロッド・オプシンである、並びに前記変異は、L337A、V378A、及びF379Aでのアレスチン変異(3A)と組み合わせた、E122Q、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、及びS343Aである（E122Qロッド6A (E122Q rod 6A)）。

好適な実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、C末端リン酸化部位に関連する変異、又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含まない野生型オプシン・ポリペプチド又はそのバリアントであることがある。このような変異は、本出願で記載されている。

i)オプシン・ポリペプチドをコードする核酸配列、ii)リン酸化非依存性アレスチン変異体をコードする核酸配列、及び任意選択的にii)細胞外マトリックス分解酵素、を含むキット、が本出願で開示される。好適には、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン変異体は上記の通りである。いくつかの実施形態では、前記キットは、使用説明書、投薬レジメン、1つ以上の細針、1つ以上のシリンジ、及び溶媒、を更に含む。

アレスチンと組み合わせたオプシンの変異体
変異体オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組成物、が本出願で開示される。変異体オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物、もまた、本出願で開示される。

前記オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、任意の種由来の変異体オプシン・ポリペプチドをコードする核酸であることがある。前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、任意の種由来の、野生型アレスチン・ポリペプチド、相同体又は均等物をコードする核酸であることがある。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、ヒト変異体オプシン・ポリペプチドをコードする、及び／又は前記アレスチンをコードする核酸は、ヒト・アレスチンをコードする核酸である。好適な実施形態では、前記核酸は、ヒト野生型アレスチン・ポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ウイルス・ベクターである。いくつかの実施形態では、前記ウイルス・ベクターは、アデノ随伴ウイルス・ベクター、又は改変AAVである。一実施形態では、好適なAAVベクターは、AAV2である。第1及び第2のベクターが提供される場合、それらは、同じタイプのベクターであってもよく、又は異なっていてもよい。例えば、第1のベクターはウイルス・ベクターであってもよく、及び第2のベクターは非-ウイルス・ベクターであってもよい、又はその逆であってもよい。第1のベクターはAAVであってもよく、及び第2のベクターは非-ウイルス・ベクター、又はAAV以外のウイルス・ベクターであってもよい。前記第1及び第2のベクターは、両方がAAVであることがあり、同一又は異なった血清型のAAVであることがある。一実施形態では、前記ベクターは、AAV2である。

好適な実施形態では、ベクターは、前記オプシンとアレスチン・ポリペプチドとが、作動可能に連結するためのリンカーをコードする核酸配列、を更に含むことがある。リンカーをコードする核酸配列は、前記オプシン及び／又はアレスチンをコードする核酸配列に、作動可能に連結することがある。前記核酸配列は、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、からなる群より選択されるリンカーをコードすることがある。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。リンカーは、ER/K準-可撓性リンカーであることがある。リンカーは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドと前記アレスチン・ポリペプチドとは分離している。リンカーは、長さが、5-250アミノ酸、より好適には8から150、より好適には8-100アミノ酸、最も好適には10-100であることがある。最も好適なリンカーは、長さが、8-12、好適には10アミノ酸であることがある。好適なリンカーは、10nm ER/K準-可撓性リンカーであることがある。

C末端リン酸化部位に関連する変異は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、若しくはS343A、又はそれらの任意の組み合わせ、であることがある。いくつかの実施形態では、前記核酸は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異、を含むヒト・オプシン・ポリペプチド(本出願では、ロッド・オプシン6A (rod opsin 6A)と呼ぶ)をコードする。いくつかの実施形態では、前記変異は、メタ-II崩壊の速度を増加させる。いくつかの実施形態では、前記核酸は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択されるメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。好適な実施形態では、前記核酸は、E122Qである変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、i)C末端リン酸化部位に関連する変異、及びii)メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、の組み合わせを含むオプシン・ポリペプチドをコードする。好適には、前記変異、又は変異の組み合わせは、本出願で記載の通りである。

好適な実施形態では、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を含まない野生型アレスチン・ポリペプチド又はそのバリアントをコードすることがある。このような変異は、本出願で記載されている。

変異体オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組換え細胞、が本出願で開示される。変異体オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物、もまた、本出願で開示される。好適には、前記変異体オプシン及び野生型アレスチンは、本出願で記載の通りである。

変異体オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含む組換え細胞、もまた、本出願で開示される。好適には、変異体オプシン及び野生型アレスチンをコードする核酸は、本出願で記載の通りである。好適な実施形態では、前記第1及び／又は第2の核酸は、前記細胞のゲノムの中に組み込まれることがある。

変異体オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドを含む組成物、が本出願で開示される。前記変異体オプシン・ポリペプチドは、任意の種に由来することがある。前記アレスチン・ポリペプチドは、任意の種由来の、野生型アレスチン・ポリペプチドであることがある。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドはヒト・オプシンである、及び／又は前記アレスチンはヒト・アレスチンである、好適にはヒト野生型アレスチンである。

いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、C末端リン酸化部位に関連する1つ以上の変異、を有する。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、メタ-II崩壊の速度を増加させる1つ以上の変異、を有する。好適な変異、及び変異の好適な組み合わせは、本出願で記載の通りである。

i)変異体オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター；又は変異体オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を含むベクター；並びに任意選択的にii)細胞外マトリックス分解酵素、を含むキット、が本出願で開示される。好適には、前記核酸は上記の通りである。いくつかの実施形態では、前記キットは、使用説明書、投薬レジメン、1つ以上の細針、1つ以上のシリンジ、及び溶媒、を更に含む。

オプシン及びアレスチンを含む融合タンパク質
いくつかの実施形態では、以下を含む光活性化可能なキメラ・ポリペプチドが、本出願で開示される：(a)オプシン・ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変異体を含むオプシン・セグメント、及び(b)前記オプシン・セグメントの光活性を変化させることができる調節セグメント。

いくつかの実施形態では、前記オプシン・セグメントは、全長オプシン・ポリペプチドを含む。前記オプシン・ポリペプチドは、野生型ポリペプチド若しくはそのフラグメントであることがある、又はその変異体であることがある。いくつかの実施形態では、前記オプシン・セグメントは、ロッド・オプシン・ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシン・セグメントは、ロッド・オプシン6Aポリペプチド又はそのフラグメント若しくは改変体を含む、ここで、前記ロッド・オプシン6Aは、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼによるリン酸化が最小限になるように、設計されたロッド・オプシン(rod opsin)の変異体を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシン・セグメントは、前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドに関する光活性を調節する少なくとも1つの変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシン・セグメントは、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシン・セグメントは、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異(本出願では、ロッド・オプシン6Aと呼ぶ)、及びメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、好適にはE122Q、を含む。好適には、前記オプシン・セグメントの変異体は、本出願で記載の通りである。

いくつかの実施形態では、前記調節セグメントは、アレスチン・ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは改変体、を含む。前記アレスチン・ポリペプチドは、野生型ポリペプチド若しくはそのフラグメントであることがある、又はその変異体であることがある。いくつかの実施形態では、前記調節セグメントは、本出願で好適に記載されるように、前記オプシン・セグメントのリン酸化-非依存性の結合を可能にする少なくとも1つの変異を更に含むアレスチン・ポリペプチド、を含む。いくつかの実施形態では、前記調節セグメントは、ヒト・ロッド・アレスチン・ポリペプチド(human rod arrestin polypeptide)又はそのフラグメント若しくは改変体を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシン・セグメントは、ポリぺプチド・リンカーによって、前記調節セグメントに融合する。好適な実施形態では、前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドは、ロッド・オプシン(rod opsin)・ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは改変体、及びヒト・ロッド・アレスチン・ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは改変体、を含む、好適にはここで、前記オプシン・セグメントは、ポリペプチド・リンカーによって、前記調節セグメントに融合する。

いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。リンカーは、ER/K準-可撓性リンカーであることがある。リンカーは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。リンカーは、長さが、5-250アミノ酸、より好適には8から150、より好適には8-100アミノ酸、最も好適には10-100であることがある。最も好適なリンカーは、長さが、8-12、好適には10アミノ酸であることがある。好適なリンカーは、10nm ER/K準-可撓性リンカーであることがある。

オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、を含む組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドは、ペプチド・リンカーによって、作動可能に連結する、が本出願で開示される。好適には、前記オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、本出願で記載される通りである。前記核酸は、好適には単一のポリペプチド配列として、オプシン・ポリペプチド-リンカー-アレスチン・ポリペプチド、又はアレスチン・ポリペプチド-リンカー-オプシン・ポリペプチド、をコードすることがある。前記リンカーは、本出願で記載される好適なリンカーをコードする核酸であることがある。好適には、前記ベクターは、上記のような光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

好適には、前記オプシン・ポリペプチド及び／又は前記アレスチン・ポリペプチドは、野生型ポリペプチドであることがある。好適には、前記オプシン・ポリペプチド及び／又は前記アレスチン・ポリペプチドは、野生型核酸配列によってコードされていることがある。好適には、前記オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、野生型ポリペプチドをコードすることがある、及び前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸配列は、変異体アレスチン・ポリペプチドをコードすることがある。好適には、前記アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸は、野生型アレスチン・ポリペプチドをコードすることがある、及び前記オプシン・ポリペプチドをコードする核酸配列は、変異体オプシン・ポリペプチドをコードすることがある。

いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ウイルス・ベクターである。いくつかの実施形態では、前記ウイルス・ベクターは、アデノ随伴ウイルス・ベクター又は改変AAVである。一実施形態では、好適なAAVベクターは、AAV2である。第1及び第2のベクターが提供される場合、それらは、同じタイプのベクターであってもよく、又は異なっていてもよい。例えば、第1のベクターはウイルス・ベクターであってもよく、及び第2のベクターは非-ウイルス・ベクターであってもよい、又はその逆であってもよい。第1のベクターはAAVであってもよく、及び第2のベクターは非-ウイルス・ベクター、又はAAV以外のウイルス・ベクターであってもよい。前記第1及び第2のベクターは、両方がAAVであることがあり、同一又は異なった血清型のAAVであることがある。一実施形態では、前記ベクターは、AAV2である。

光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドも提供される。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド発現ベクターである。

いくつかの実施形態では、以下を含む組成物が、本出願で開示される：(a)前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。前記組成物は、遺伝子デリバリー・ベクターを更に含むことがある。いくつかの実施形態では、前記遺伝子デリバリー・ベクターは、ウイルス・ベクター、物理的なデリバリー・ベクター、又は化学的なデリバリー・ベクターである。いくつかの実施形態では、前記組成物は、更に以下を含む：(c)GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、を含む組換え細胞、ここで、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドは、ペプチド・リンカーによって、作動可能に連結する、が本出願で開示される。好適には、前記オプシン及びアレスチンは、本出願で記載の通りである。

好適な実施形態では、前記核酸は、前記細胞のゲノムの中に組み込まれることがある。オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸を発現する組換え細胞、もまた、本出願で開示される。

いくつかの場合では、光活性化可能なキメラ・ポリペプチドを含む細胞、が本出願で開示される。いくつかの場合では、前記細胞は、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼを更に含む。

いくつかの実施形態では、前記細胞は神経細胞である、好適には神経幹細胞である。好適には、前記細胞は網膜細胞である。好適な実施形態では、前記細胞は内側網膜である。好適な実施形態では、前記細胞は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。好適には、前記細胞はヒト細胞である。

いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸に、作動可能に連結する。

以下を含むキット、i)オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸、ここで、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドは、ペプチド・リンカーによって、作動可能に連結する；及び任意選択的にii)細胞外マトリクス分解酵素、が本出願で開示される。好適には、前記核酸は、上記の通りである。好適には、前記核酸は、上記のような光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記キットは、使用説明書、投薬レジメン、1つ以上の細針、1つ以上のシリンジ、及び溶媒、を更に含む。

以下を含む組成物を含むキット、(a)本明細書に定義される光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、及び(b)許容可能な遺伝子デリバリー・ベクター、が、本出願で開示される。いくつかの実施形態では、前記許容可能な遺伝子デリバリー・ベクターは、ウイルス・ベクター、物理的なデリバリー・ベクター、又は化学的なデリバリー・ベクター、である。いくつかの実施形態では、前記組成物は更に以下を含む：(c)GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、前記キットは、使用説明書、投薬レジメン、1つ以上の細針、1つ以上のシリンジ、及び溶媒、を更に含む。

オプシンのメタ II崩壊の変異体
メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、を含む組換え細胞、が本出願で開示される。好適には、前記オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、本出願で記載される通りである。好適には、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異は、本出願で記載される通りである。

前記核酸配列を、好適には本出願で記載されるように、ベクターで提供することがある。好適な実施形態では、前記核酸は、前記細胞のゲノムの中に組み込まれることがある。

いくつかの実施形態では、前記細胞を、前記核酸を発現するように、改変する。いくつかの実施形態では、前記細胞は網膜細胞である。好適な実施形態では、前記細胞は内側網膜である。好適な実施形態では、前記細胞は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。

以下を含むキット、i)メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシン・ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター；及び任意選択的にii)細胞外マトリクス分解酵素、が本出願で開示される。好適には、前記核酸は、上記の通りである。好適には、前記オプシン・ポリペプチドをコードする核酸は、本出願で記載される通りである。好適には、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異は、本出願で記載される通りである。いくつかの実施形態では、前記キットは、使用説明書、投薬レジメン、1つ以上の細針、1つ以上のシリンジ、及び溶媒、を更に含む。

GRK1を含む組成物
いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチド及びG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチド、を含む組成物、が本出願で開示される。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、リンカーを介して、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドに、作動可能に連結する。

好適な実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、本出願で記載される通りである。好適な実施形態では、前記組成物は、アレスチン・ポリペプチドを更に含むことがある。前記アレスチン・ポリペプチドは、前記オプシン又はGRK1ポリペプチドに、作動可能に連結することがある。前記アレスチン・ポリペプチドは、本出願で記載される通りであることがある。

いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。リンカーは、ER/K準-可撓性リンカーであることがある。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドとG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドとは分離している。リンカーは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。リンカーは、長さが、5-250アミノ酸、より好適には8から150、より好適には8-100アミノ酸、最も好適には10-100であることがある。最も好適なリンカーは、長さが、8-12、好適には10アミノ酸であることがある。好適なリンカーは、10nm ER/K準-可撓性リンカーであることがある。

いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする核酸を有する第1のベクター、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする核酸を有する第2のベクター、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸を含む第3のベクター、を含む組成物、が、本出願で開示される。いくつかの実施形態では、オプシン・ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第3の核酸、を含む組成物、ここで、第1、第2、及び第3のポリヌクレオチドのうちの2つ以上は、同じベクター上にあることがある、又は異なるベクター上にあることがある、が本出願で開示される。好適には、前記オプシン・ポリペプチド、アレスチン・ポリペプチド及びGRK1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本出願で記載される通りであることがある。

以下を含むキット、i)オプシン・ポリペプチドをコードする核酸配列、ii)G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1をコードする核酸配列、iii)アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸、及び任意選択的に、iv)細胞外マトリックス分解酵素、が本出願で開示される。

不活性化の方法
いくつかの実施形態では、細胞の中で、オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、前記オプシンをリン酸化非依存性アレスチン変異体に接触させることを含む、が本出願で開示される。

オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組成物の有効量を、前記細胞に投与することを含む、もまた、いくつかの実施形態では開示される。細胞の中で、オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物の有効量を、前記細胞に投与することを含む、もまた、いくつかの実施形態では開示される。

オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、もまた、本出願で開示される。前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。好適な実施形態では、前記核酸配列は、E122Q変異、を有するオプシンをコードすることがある。好適には、前記核酸配列は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A及びS343Aに変異（本出願では、ロッド・オプシン6Aと呼ぶ）、を更に含むオプシン・メタ-II崩壊の変異体オプシン・メタをコードすることがある。前記核酸配列を、好適には本出願で記載されるように、ベクターで提供することがある。

オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、細胞に投与することを含む、が本出願で開示される。好適な変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。いくつかの実施形態では、前記変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。好適な実施形態では、前記変異はE122Qであることがある。

好適には、前記方法は、前記オプシンを含む細胞を、本出願で記載される本発明の好適な組成物に接触させること、を含む。

好適には、オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、は、更に、アレスチンをコードする核酸配列を、前記細胞に投与することを含むことがある。好適には、前記核酸は、野生型アレスチンをコードする。

好適には、オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、細胞に投与することを含む、及び更に、野生型アレスチンを、前記細胞に投与することを含む、もまた、提供される。

オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、本出願で開示されるような光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、もまた、本出願で開示される。

オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、前記オプシンを、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1に、又はGRK1及びアレスチンに、接触させることを含む、が本出願で開示される。

好適には、細胞は、本出願で記載の通りである。

時間分解能を増加させる方法
オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組成物の有効量を、前記細胞に投与することを含む、もまた、いくつかの実施形態では開示される。

細胞の中でのオプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物の有効量を、細胞に投与することを含む、もまた、いくつかの実施形態では開示される。

オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、細胞に投与することを含む、が本出願で開示される。好適な変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。いくつかの実施形態では、前記変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。好適な実施形態では、前記変異はE122Qであることがある。

オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、もまた、本出願で開示される。前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。好適な実施形態では、前記核酸配列は、E122Q変異、を有するオプシンをコードすることがある。前記核酸配列を、好適には本出願で記載されるように、ベクターで提供することがある。

好適には、前記細胞は神経細胞である、好適には神経幹細胞である。好適には、前記細胞は網膜細胞である。好適には、前記細胞は内側網膜細胞(inner retinal cell)、例えばオン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。好適には、前記細胞はヒト細胞である。

好適には、前記オプシンは、前記細胞に対して本来のもの(native)である。或いは、前記オプシンは、前記細胞に対して異種性であることがある、即ち、前記オプシンは、前記細胞において天然に発現していないが、例えば、組換え遺伝子工学によって、前記細胞に導入されている。

いくつかの実施形態では、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、以下を含む：(a)光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを、前記細胞に送達すること、及び(b)光活性化可能なキメラ・ポリペプチドを、前記細胞中で発現させること、が本出願で開示される。いくつかの実施形態では、(a)のポリヌクレオチドは、前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド発現ベクターを送達すること、を含む。いくつかの実施形態では、前記方法(a)は、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを送達することを更に含む、及び(b)は、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼを発現させることを更に含む。いくつかの実施形態では、(a)は、前記ポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムの中に組み込ませること、を含む。いくつかの実施形態では、(b)は、前記ポリヌクレオチドを構成的に発現させること、を含む。いくつかの実施形態では、(b)は、前記ポリヌクレオチドを一過的に発現させること、を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は神経幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は内側網膜細胞(inner retinal cell)である。いくつかの実施形態では、前記内側網膜細胞(inner retinal cell)は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。

いくつかの実施形態では、前記細胞は、網膜変性の症状を含む細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター機能の喪失に起因する症状、である。

好適には、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、は、更に、アレスチンをコードする核酸配列を、前記細胞に投与することを含むことがある。好適には、前記核酸は、野生型アレスチンをコードする。

好適には、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、細胞に投与することを含む、及び更に、野生型アレスチンを、前記細胞に投与することを含む、も提供される。

オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、本出願に記載されるような光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、もまた、本出願で開示される。

オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、前記オプシンを、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1に、又はGRK1及びアレスチンに、接触させることを含む、が本出願で開示される。

細胞に光レセプター機能を提供する方法
光レセプター機能を内側網膜細胞(inner retinal cell)に提供する方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及び変異アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、もまた、開示される。いくつかの実施形態では、光レセプター機能を内側網膜細胞(inner retinal cell)に提供する方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、もまた開示される。ベクターを含む組成物は、本出願で記載されている通りであることがある。

いくつかの実施形態では、光レセプター機能を内側網膜細胞(inner retinal cell)に提供する方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチド及びリン酸化非依存性の変異体アレスチン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、が、開示される。

好適には、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸は、本出願で好適に記載されるように、メタ-II崩壊の変異体オプシン・ポリペプチドをコードする。

好適には、前記オプシンは、前記細胞に対して異種性であることがある、即ち、前記オプシンは、前記細胞において天然に発現していないが、例えば、組換え遺伝子工学によって、前記細胞に導入されている。

光レセプター機能を内側網膜細胞(inner retinal cell)に提供する方法、ここで、前記方法は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、前記細胞に投与することを含む、が本出願で開示される。好適な変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。いくつかの実施形態では、前記変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。好適な実施形態では、前記変異はE122Qであることがある。

光レセプター機能を内側網膜細胞(inner retinal cell)に提供する方法、ここで、前記方法は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、もまた、本出願で開示される。前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。好適な実施形態では、前記核酸配列は、E122Q変異、を有するオプシンをコードすることがある。前記核酸配列を、好適には本出願で記載されるように、ベクターで提供することがある。

いくつかの実施形態では、前記細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は神経幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は内側網膜細胞(inner retinal cell)である。いくつかの実施形態では、前記内側網膜細胞(inner retinal cell)は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。好適には、前記細胞はヒト細胞である。

好適には、光レセプター機能を細胞に提供する方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、細胞に投与することを含む、は、更に、アレスチンをコードする核酸配列を、前記細胞に投与することを含むことがある。好適には、前記核酸は、野生型アレスチンをコードする。

好適には、光レセプター機能を細胞に提供する方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、細胞に投与することを含む、及び更に、野生型アレスチンを、前記細胞に投与することを含む、もまた、提供される。

いくつかの実施形態では、以下を含む光活性化可能な細胞を作成するための方法：(a)前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを、前記細胞に送達すること、(b)前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドを発現させること、が本出願で開示される。いくつかの実施形態では、(a)のポリヌクレオチドは、前記光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記方法(a)は、GRK1 G-タンパク質キナーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを送達することを更に含む、及び(b)は、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼを発現させることを更に含む。いくつかの実施形態では、(a)は、前記ポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムの中に組み込ませることを含む。いくつかの実施形態では、(b)は、前記ポリヌクレオチドを構成的に発現させることを含む。いくつかの実施形態では、(b)は、前記ポリヌクレオチドを一過的に発現させることを含む。

いくつかの実施形態では、前記細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は神経幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は内側網膜細胞(inner retinal cell)である。いくつかの実施形態では、前記内側網膜細胞(inner retinal cell)は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。

治療方法
対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、もまた、開示される。対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、もまた、いくつかの実施形態で開示される。

いくつかの実施形態では、対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチド、及びリン酸化非依存性の変異体アレスチン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、が、開示される。対象において、網膜変性の症状を治療する際に使用するための、オプシン・ポリペプチド、及びリン酸化非依存性の変異体アレスチン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、もまた、いくつかの実施形態で開示される。

対象において、網膜変性の症状を治療する際に使用するための、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する第1のベクター、及び変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を有する第2のベクター、を含む組成物の有効量、もまた、開示される。対象において、網膜変性の症状を治療する際に使用するための、オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチド変異体をコードする第2の核酸、を含むベクター、を含む組成物の有効量、もまた、開示される。ベクターを含む組成物は、本明細書に記載されている通りであることがある。

好適には、ベクターは、発現を内側網膜細胞(inner retinal cell)（最も好適には、オン又はオフ-双極細胞）にターゲティングさせることに好適であることがある。

対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、対象に投与することを含む、が本出願で開示される。好適な変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。いくつかの実施形態では、前記変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択することがある。好適な実施形態では、前記変異はE122Qであることがある。

対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、本メタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、前記対象に投与することを含む、もまた、本出願で開示される。前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を有するオプシンをコードすることがある。好適な実施形態では、前記核酸配列は、E122Q変異、を有するオプシンをコードすることがある。前記核酸配列を、好適には本出願で記載されるように、ベクターで提供することがある。

いくつかの実施形態では、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、及び黄斑ジストロフィー；他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター能の喪失に起因する症状、である。

いくつかの実施形態では、前記組成物は注射投与可能な液体である。いくつかの実施形態では、前記組成物を、注射投与によって、好ましくは眼内注射投与によって、好ましくは網膜下注射投与又は硝子体内注射投与によって、投与する。

好適には、対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンをコードする核酸配列を、前記対象に投与することを含む、は、更に、アレスチンをコードする核酸配列を、前記対象に投与することを含むことがある。好適には、前記核酸は、野生型アレスチンをコードする。

好適には、対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、上記のようなメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含むオプシンを、前記対象に投与することを含む、及び更に、野生型アレスチンを、前記対象に投与することを含む、もまた、提供される。

好適には、前記方法は、前記対象における細胞を、本出願で記載される本発明の好適な組成物に接触させること、を含む。

対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、が、開示される。好適には、前記方法は、本出願で記載されるように、光活性化可能な細胞を作成すること、及び／又は細胞の中でのオプシンの光応答の時間分解能を増加させること、を含む。

対象において、網膜変性の症状を治療する際に使用するための、光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、を含む組成物の有効量、もまた、開示される。前記治療は、本出願で記載されるように、光活性化可能な細胞を作成すること、及び／又は細胞の中でのオプシンの光応答の時間分解能を増加させること、を含むことがある。

いくつかの実施形態では、前記網膜変性の症状、又は網膜変性は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、及び黄斑ジストロフィー；他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター能の喪失に起因する症状、である。

対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、オプシン・ポリペプチド、及びG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、が本出願で開示される。対象において、網膜変性の症状を治療する際に使用するための、オプシン・ポリペプチド、及びG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチド、を含む組成物の有効量、もまた、いくつかの実施形態で開示される。対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、オプシン・ペプチドをコードする核酸を有する第1のベクター、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする核酸を有する第2のベクター、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸を含む第3のベクター、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、が本出願で開示される。対象において、網膜変性の症状を治療する際に使用するための、オプシン・ペプチドをコードする核酸を有する第1のベクター、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする核酸を有する第2のベクター、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする核酸を含む第3のベクター、を含む組成物の有効量、もまた、いくつかの実施形態で開示される。いくつかの実施形態では、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、及び黄斑ジストロフィー；他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター能の喪失に起因する症状、である。

いくつかの場合では、以下を含む光活性化可能な細胞を作成するための方法：(a)光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを送達すること、(b)光活性化可能なキメラ・ポリペプチドを発現させること、を含む、が本出願で開示される。いくつかの場合では、(a)のポリヌクレオチドは、光活性化可能なキメラ・ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド発現ベクターを含む。いくつかの場合では、前記 (a)は、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを送達することを更に含む、及び(b)は、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼを発現させることを更に含む。いくつかの場合では、(a)は、前記細胞のゲノムの中に組み込まれる。いくつかの場合では、(b)を、構成的に発現させる。いくつかの場合では、(b)を、一過的に発現させる。いくつかの場合では、前記細胞は、神経細胞を含む。いくつかの場合では、前記細胞は、神経幹細胞を含む。いくつかの場合では、前記細胞は、内側網膜細胞(inner retinal cell)を含む。いくつかの場合では、前記内側網膜細胞(inner retinal cell)は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞、である。いくつかの場合では、前記細胞は、網膜変性の症状を含む細胞を含む。いくつかの場合では、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター機能の喪失に起因する症状、である。

参照により取り込まれること
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により取り込まれるように具体的且つ個々に示されたかのように、同じ程度まで、参照により本出願に取り込まれる。参照により取り込まれた刊行物及び特許又は特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲に対して、任意のそのような矛盾する事項を、本明細書が、取って代わる及び／又は優先する、ことが意図される。

本発明の新規な特徴を、添付した特許請求の範囲に詳細に記載する。本発明の特徴及び利点は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及びその添付した図面(本出願では、「図(figure)」及び「図(FIG)」、とも呼ぶ)、を参照することによって、より良く理解されるであろう:
図１ａ-１ｇは、桿体の光レセプター（rod photoreceptor）の不活性化メカニズムが存在する下で、オプシン駆動の光応答の動態を評価するために、G-タンパク質活性化のバイオルミネッセンス共鳴エネルギー移動(Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET))アッセイを使用することを示す：図１ａは、G-タンパク質活性化に関する、レシオメトリックBRETアッセイ(ratiometric BRET assay)を示す；図１ｂは、G-タンパク質活性化に関する、BRETアッセイ(BRET Go-Black)を使用した、ロッド-オプシン駆動の光応答の時間分解能は、セカンド・メッセンジャー Glosensor Gso アッセイ(Glo + Gso- Grey)に関するものよりも速いこと、を示す；図１ｃは、G-タンパク質レセプター・キナーゼ1(GRK1)及び／又は視覚アレスチン(Arr)の何れかの存在下での応答、を示す；図１ｄは、G-タンパク質レセプター・キナーゼ1(GRK1)及び／又は視覚アレスチン(Arr)の何れかの存在下でのリン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン6A変異体(Rod 6A-塗りつぶされていないマーカー)、を示す；図１ｅは、ベースライン標準化したBRET応答を、スケーリング因子(scaling factor)(A)、1相指数関数結合曲線(one-phase exponential association curve)(R_on)、及び1相指数関数減衰曲線(one-phase exponential decay curve )(R_off)、からなる、単純な二重指数関数モデル(左側の図)を用いて、モデル化すること、を示す。図１ｆは、相対的な応答強度を示す；及び、図１ｇは、それぞれの条件に対する最良適合T_off(s)を、ロッド・オプシン(rod opsin)ポジティブ・コントロールの最良適合T_off(T_{off _RodWT})で割ったものとして測定された、相対的な応答減衰を示す。図２ａ-２ｄは、GRK1の抑制的な効果が無くても、リン酸化非依存性アレスチン変異体が、ロッド・オプシン活性の寿命を短縮することを示す：図２ａは、野生型ロッド・オプシン(RodWT)についてのBRET光応答の経時変化(time course)を示す、及び、図２ｂは、野生型視覚アレスチン(Ar rWT)の、又は非リン酸化の活性化ロッド・オプシンに対して、アレスチン変異体Arr3A若しくはArrKEQ3Aの、何れかと共-トランスフェクト(co-transfect)した場合における、リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン6A変異体(Rod 6A)、についてのBRET光応答の経時変化(time course)を示す；図２ｃは、RodWT及びRod6Aの両方の応答減衰(最良適合T_offの倍数変化として測定した、s)を示す；図２ｄは、RodWT及びRod6Aの両方の応答強度は、ArrWT及びArr3Aの存在下では部分的に増加するが、ArrKEQ3Aの存在下では増加しない、ことを示す。図３ａ及び３ｂは、ロッド・オプシン(rod opsin)-アレスチン融合体が、正常な細胞内局在となることを示す。図３ａは、ロッド・オプシン-アレスチン3Aのバイシストロニックな(bicistronic)及び融合した構築物の図を示す。図３ｂは、野生型ロッド・オプシン(Rod opsin)(Rod WT)のみ、リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(Rod opsin)6A(Rod 6A)のみ、アレスチン3Aと共-発現したロッド・オプシン(Rod opsin)6A (P2A)、又はリンカーによってアレスチン3Aにつながれたロッド・オプシン(Rod opsin)6A、の、抗-ロドプシン4D2抗体で標識した、Hek293T細胞における、異種性発現を示す。図４ａ-４ｄは、ロッド・オプシン6A-アレスチン3A融合体は、共-発現と比較して、時間分解能を改善するが、応答強度を減少させることを示す：図４ａは、リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン変異体(Rod6A)及び中間的な親和性のアレスチン変異体3A(Arr3A)についての、共-発現又は融合体に対する、BRET光応答の経時変化(time course)を示す；図４ｂは、応答強度を示す；図４ｃは、応答減衰を示す；及び、図４ｄは、Rod6A-Arr3A融合体の応答強度及び応答減衰を比較したものである。図５ａ-５ｄは、メタ-II崩壊が増加したロッド・オプシン変異体が、可変的な応答強度を有する、及びG-タンパク質を不活性化する、ことを示す：図５ａは、ロッド・オプシン野生型(Rod WT)及び変異体についてのBRET光応答の経時変化(time course)を示す；図５ｂは、応答強度を示す；図５ｃは、応答減衰を示す、及び図５ｄは、ロッド・オプシン(Rod opsin)変異体の相対的な応答強度及び応答減衰を比較すると、2つのパラメータは強く相関していないことが示される、ことを示す。図６ａ-６ｅは、ロッド・オプシン(rod opsin)野生型(Rod WT) の応答特性とリン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(rod opsin)(Rod6A) の応答特性との比較を示す：図6ａは、BRET応答の時間経過を示す；図６ｂは、応答強度を示す；図６ｃは、最良適合Toffとして測定した応答減衰を示す；図６ｄは、Log EC50（Rod6A及びRodWTに対して、Glosensor Gsoアッセイを用いてlog 光子/cm2/s）として測定した感度を示す；図６ｅは、Rod WT又はRod 6A-駆動の応答に適合させた放射照度応答曲線(irradiance response curves (IRC))を示す。図７ａ-７ｆは、様々な光強度に対するロッド・オプシン(rod opsin)-駆動のBRET応答のモデリングを示す：図７ａは、応答減衰速度(T_offとして測定した)を示す；図７ｂは、前記応答減衰が応答強度と有意に相関しないことを示す；図７ｃは、応答開始も、強度全体にわたって一致することを示す；図７ｄは、前記応答減衰が応答強度と有意に相関しないことを示す；図７ｅは、前記応答強度が放射照度依存性であり、より高い強度では、G-タンパク質活性レベルの増加と一致することを示す；及び図７ｆは、2つのパラメータ、T_on及びT_offが、より長い寿命の応答はより短い応答開始を示し、有意に負に相関することを示す。図８ａ-８ｄは、ロッド・オプシン6A-アレスチンWT融合体が、共-発現と比較して、応答強度は減少するが、時間分解能はより速いことを示す：図８ａは、リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン変異体(Rod6A)及び野生型アレスチン(ArrWT)についての、共-発現又は融合体に対する、BRET光応答の経時変化を示す；図８ｂは、応答強度を示す；図８ｃは、応答減衰速度を示す；図８ｄは、Rod6A-ArrWT融合体、Rod6A-Arr3A融合体、及びRod6A-10nm-Arr3Aの、応答強度と応答減衰との比較を示す。図９は、抗-ロッド・オプシン(rod opsin)1D4抗体を用いて標識したHek293T細胞において、ロッド・オプシン(rod opsin)メタII崩壊の変異体が正常な細胞内局在を有することを示す。図１０ａ-１０ｃは、ロッド・オプシン(rod opsin)メタ-II崩壊の変異体をリン酸化非依存性アレスチン変異体と組み合わせた場合に、検出可能な利点が無いことを示す。図１０ａは、1s 470 nm光(14.1 log光子)に対するBRET光応答の時間経過を示す；図１０ｂは、応答強度を示す；図１０ｃは、応答減衰速度を示す。図１１は、光遺伝学的なウイルス導入遺伝子の模式図を示す。AAV2 Quad-YF A) Rod6A-10nm-Arr3A、B) Rod Opsin E122Q及びC) Rod Opsin 野生型。B)及びC)を、T2Aペプチドを介して蛍光mCherryレポーターと共-発現させる。図１２は、Rod6A-10nm-Arr3A AAVで形質導入した網膜からの光応答を示す。A) 光応答ユニット全体にわたる平均の発火速度(スパイク／秒)。B) 個々のユニットからの代表的な応答。全ての代表的なトレースは、ペリイベント・ラスタ(perievent raster)(上部の最初の試行)、及び関連するペリイベント発火率ヒストグラム(associated perievent firing rate histograms)（ビン・サイズ(Bin size) = 50ms）、を示す。光刺激のタイミングを、水平方向の黒いバーで示す。エラー・バーは、平均の標準誤差を示す。刺激の強さを、log桿体の有効な光子/cm²/s (rod effective photons/cm²/s)で示す。図１３．ロッド・オプシン(Rod opsin) E122Q AAVで形質導入した網膜からの光応答。A)光応答ユニット全体にわたる平均の発火(スパイク／秒)。B)様々な個々のユニットからの代表的な応答。全ての代表的なトレースは、ペリイベント・ラスタ(perievent raster)(上部の最初の試行)、及び関連するペリイベント発火率ヒストグラム(associated perievent firing rate histograms)（ビン・サイズ(Bin size) = 50ms）、を示す。光刺激のタイミングを、水平方向の黒いバーで示す。エラー・バーは、平均の標準誤差を示す。刺激の強さを、log桿体の有効な光子/cm²/s (rod effective photons/cm²/s)で示す。図１４．ロッド・オプシン(Rod opsin) E122Q-P2A-mCherry AAVで形質導入した網膜内のmCherry レポーターの発現。網膜を、双極細胞側を上にして表示する－小さな明るいドットは、形質導入した双極細胞を個々に表す。図１５．ロッド・オプシン(rod opsin)バリアントは、本来の(native)ロッド・オプシン(rod opsin)と比較して、光に対して、より大きい、及びより持続性の低い、応答を示す。光応答を示す、電極部位での発火における変化(ベースライン平均からの標準偏差で表される－ z-スコア)を、ロッド・オプシン(Rod opsin)E122Q (A、n = 6ユニット、1網膜)及びRod6A-10nm-Arr3(B, 6103, n = 15ユニット、3網膜)を駆動するウイルスで処理した網膜について、示した。比較するために、本来の(native)ロッド・オプシンで処理した網膜(n = 21、網膜4個)における応答を、各プロットにおいて、黒色で示した。全ての場合で、時間分解能について最適化されたバリアントにおいて、野生型コントロールにおけるよりも、より急激な、及びより短い時間持続する、光応答が存在することに留意されたい。光刺激のタイミングを、水平方向の黒いバーで示す、データは平均的な発火を示す。白色の光刺激は、15 log桿体の有効な光子/cm²/s (rod effective photons/cm²/s)である。

詳細な説明
動物オプシンは、光活性G-タンパク質共役レセプターであり、高い光感受性を有するG-タンパク質シグナル伝達を、光遺伝学的にコントロールすることに適している。光活性化したレセプターの寿命により、時空間分解能は制限されるが、このことは、それらの本来の(native)環境外で発現した場合に、より遅い応答が駆動されることが典型である動物オプシンに関して、特に問題である。細胞における異種性発現のもとで、原型的な後生動物オプシン(ヒト・ロッド・オプシン(rod opsin))についての光応答持続時間を減少させる方法が、光遺伝学的なコントロールに関するこの側面を改善するためのステップとして、達成されてきている。G-タンパク質活性化のBRETベースのレポーターを使用して、メタ-IIシグナル伝達状態の減衰を加速させるか、又はより効果的には、アレスチン結合を増強するか、の何れかによって、ロッド・オプシン(rod opsin)の光応答寿命を短縮することができることが示されてきている。予期しなかったことに、リン酸化非依存性アレスチン変異体は、GRK1の発現に関連した強度を減弱させること無く、シグナル伝達の終結を改善する。オプシン-アレスチン融合体を使用して、応答寿命を更に減少させることが可能である。ピークの応答強度に依存すること無く応答寿命を低下させることが可能であり、これは、動物オプシンを光遺伝学的な用途を目的として改善することにおける、重要な進歩である。

本来の(native)光レセプターでは、光活性オプシンのシグナル伝達は、主にアレスチンとの相互作用によってクエンチ(quenched)する。アレスチンの結合にはレセプターのリン酸化が必要であるので、この不活性化の様式には、アレスチン及び好適なG-タンパク質レセプター・キナーゼの両方が必要である。光遺伝学的な用途に際しては、一方又は両方が宿主細胞に存在しないか、又は十分に存在しないことがある。いくつかのオプシンにはまた、アゴニスト（全トランス型のレチナール）をオプシン・アポタンパク質に結合させるシッフ塩基結合を加水分解する形態である、固有の部分的な不活性化メカニズム、がある。これによって、オプシンのシグナル伝達活性がある「メタII」状態が崩壊するようになる。異種性発現下で光活性化した動物オプシンのシグナル伝達活性化の寿命を最小限化することによって（例えば、シッフ塩基加水分解の速度を増加させる、又はアレスチン結合の増強を可能にする、などによって）、オプシンの光応答持続時間を減少させることができる。

本発明は、部分的には、アレスチン-オプシン相互作用、又はシグナル伝達-活性化メタ-IIオプシン状態の崩壊速度、の何れかを増強するように設計した操作をすることで、オプシン駆動の応答をより時間的に区切ることができる、という発見に基づく。非リン酸化活性レセプターに対する親和性が増強したアレスチン変異体を適用すると、GRK1非存在下で、応答寿命が効果的に減少し、GRK1の発現が応答強度を抑制する作用を回避する。前記アレスチン変異体を適用すると、簡便性という利点が更にもたらされる。ベクターのパッケージング・サイズに制限がしばしばある光遺伝学的な用途のために、2つのタンパク質(オプシン+アレスチン)を導入することは、3つ(オプシン+アレスチン+キナーゼ)を導入することよりも、はるかに現実的である。

変異体アレスチン(例えば、Arr3A)をオプシン・タンパク質に繋ぐことにより、応答強度に実質的に影響を及ぼすことなく（即ち、野生型と比較して、減少させることなく）、応答減衰をより速くすることが可能になったことは驚くべきことであった。この繋ぐという方策により、リン酸化非依存性アレスチン変異体を用いることに関連する潜在的な問題を軽減することもできる。アレスチンをオプシンに繋いでも、オプシンの機能が失われなかったことは、驚くべきことであった。実際、アレスチンをオプシンに繋ぐと、これらの導入したアレスチンによって、本来の(native)G-タンパク質共役レセプター及びそれらとは別のシグナル伝達カスケードが妨害される可能性を、減少させるのに役立つ。更に、ロッド・オプシン(rod opsin)のようなオプシンにアレスチンを繋ぐと、アレスチン(例えば、arr3A)のオフ-ターゲット効果が制限される、及び細胞毒性の可能性が改善することがある。マウスの桿体においてArr3A変異体を過剰発現させると、それが細胞毒性であることがあることを示す光レセプターの変性が引き起こされた；光レセプターにおけるこの変異体の有害な作用は、Arr3Aの自己会合が低下し、アポトーシスを引き起こし得るシグナル伝達経路と相互作用する単量体ユニットが高濃度になることによる、と考えられている。これらの変異体の細胞毒性は、特有の形態及びタンパク質発現(1000-10000倍より多くのシグナル伝達タンパク質を有する)を有する桿体の光レセプター（rod photoreceptor）に、特有であることがある。変異体アレスチン(例えば、Arr3A)をオプシンに繋ぐことは、細胞毒性を防ぐ又は低減させるのに役立つことがある。

メタII崩壊の速度を増加させるためにオプシン・タンパク質を改変することは、応答寿命を短縮させるのに役立つ。本出願で記載される実験によって、メタ-II崩壊の速度が増加することを、光フラッシュに対するG-タンパク質の応答をより速く終結させることに置き換える、という驚くべき結果が示された。レチンアルデヒド発色団をオプシン・タンパク質の部分構造に連結させるシッフ塩基を不安定化する、及びG-タンパク質シグナル伝達のメタ-II状態におけるシッフ塩基加水分解の速度を増加させる、と考えられる種々のロッド・オプシン変異体を、適用することがある。一連のオプシン変異体は、分光学的な方法を用いて、特性評価が既になされてきている。そして、Y74F、Y136F及びY306Fについての比較的小さな1.2-5倍の増加から、A132L、E122Q及びY223Fについてのより劇的な4-8倍の変化に到るまで、Rod WTメタ-II崩壊の速度に、様々な変化が引き起こされることが報告された。生きた細胞の環境における動物オプシンのシグナル伝達寿命を調節する場合、アレスチン相互作用及びメタ-II崩壊の両方が、調節のための好適なターゲットである。

光遺伝学的な用途を目的として動物オプシンを適用することを、本出願で使用することがある。ロッド・オプシン(rod opsin)は、全てのオプシンの中で最も良く特性評価がなされている、及びキナーゼ／アレスチン及びシッフ塩基加水分解メカニズムの両方によるその不活性化は非常によく確立されている。ヒト・ロッド・オプシンもまた、重要な光遺伝学的なツールになる可能性があり、時空間分解能が特に重要である用途に適している。それは、異所的に十分に発現し、高度に感受性である、及び本来の(native) Gi/o/t経路と共役することが可能である、ヒト・タンパク質である。ロッド・オプシン(rod opsin)を、生理的な光強度での基本的なイメージ-形成をする視覚を回復させるために、網膜変性マウスの生存細胞で発現させることがある。この低減した時間分解能はまた、頭部及び目の動きによるぼやけ、動きの検出問題、及び光レベルの変化に適応する問題を引き起こす空間分解能に影響を及ぼす可能性もある。

光活性化したオプシンの寿命を測定する方法、もまた、本出願に記載される。これを、精製したタンパク質をin vitroで調製することによって行うこともあるが、本出願では、ロッド・オプシン(rod opsin)を、光遺伝学的な用途により直接的に関連する生きた細胞の環境において、評価する。この目的のために、我々は、［Masuho et al, Science Signaling 01 Dec 2015: Vol. 8, Issue 405, pp. ra123］（これは、図１ａに示されるようなG-タンパク質活性化のレシオメトリックBRETアッセイ(ratiometric BRET assay)の概略図を含む）に記載されるように、BRETに基づくアッセイを用いて、G-タンパク質活性化を、ほぼリアル-タイムで読み取った。アレスチン結合を増強するか、又はシッフ塩基加水分解を加速するか、の何れかを目的とする、広範な介入方法(interventions)によって、光応答の寿命を短縮することができる。このような操作はまた、ピーク応答強度を減少させる傾向もあるが、これらの2つの効果の大きさの間に単純な関係はないので、これらは少なくとも部分的に分離可能な現象であるように見える。応答強度への影響を最小限に抑えながら、異種性発現下でのロッド・オプシンの光応答の時間的な信頼度を増大させるための方策を、本出願で記載する。ヒト光活性GPCR分子を、改良した光遺伝学的な用途を開発をするために利用することができるように、ヒト光活性GPCR分子を改変するための、組成物、システム、及び方法、に対する必要性が、本出願で認識される。本開示は、光活性GPCRシグナル伝達を、効率的に時空間的に活性化することを可能にする、改変した光活性キメラ・ポリペプチド及び組成物を提供する。本開示は、高感度を生成し、応答強度が損失(減衰)することなく、G-タンパク質シグナル伝達を効率的に活性化することによって、効率的な時空間的な活性化をもたらす組成物、システム、及び方法を提供する。本開示はまた、高い時空間分解能をもたらすようにG-タンパク質シグナル伝達の活性化の寿命を短縮することによって、効率的な時空間的な活性化をもたらす、組成物、システム、及び方法、を提供する。更に、本開示は、オプシン・シグナル伝達を時空間的に調節することを、ヒト・オプシン・ポリペプチドにおいて達成する、組成物、システム、及び方法、を提供する。

本発明者らは、本出願で記載される組成物、キット及び方法により、変性網膜において、一般に遭遇する光レベル(13.5-15.5 log光子/cm2/s)での光応答を検出することができるようになることを示した。

本発明の様々な実施形態を本出願で示し、説明してきたが、そのような実施形態が単なる例として提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者は、多数の変形、変化、及び置換を想起し得る。本出願に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替を採用することができることを理解されたい。

本出願では、本発明の態様に関連して説明した実施形態を、任意の本発明の他の態様に準用することができる。

値を範囲として記載する場合、そのような開示は、そのような範囲内の全ての可能なサブ-範囲（sub-ranges）、並びにそのような範囲内に入る具体的な数値の開示を、具体的な数値又は特定のサブ-範囲（sub-range）が明示的に記載されているかどうかに関わらず、含むことが、理解されるであろう。

定義
本出願で使用される「対象」は、ヒト又は非-ヒト哺乳動物(例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)、非-ヒト霊長類又は鳥(例えば、ニワトリ)、並びに任意の他の脊椎動物又は無脊椎動物、を意味する。

本出願で使用される「有効量」又は「治療有効量」は、疾患又は症状の1つ以上の兆候(symptom)を軽減する、ある程度軽減する、又は発症の可能性を低減するのに有効であり、疾患又は症状を治癒することを含む、治療薬剤の量を指す。「治癒する(Curing)」は、病気の兆候(symptom)又は症状が無くなることを意味する；しかしながら、治癒が得られた後でも、ある一定の長期的又は永続的な影響が存在することがある（例えば、広範な組織損傷）。

「治療する(Treat)」、「治療(treatment)」、又は「治療すること(treating)」とは、本出願で使用される場合、予防及び／又は治療目的のために、医薬組成物を投与することを指す。用語「予防的治療(prophylactic treatment)」とは、疾患又は症状の兆候(symptom)を未だ示さないが、特定の疾患又は症状に感受性であるか、又はそうではない場合に特定の疾患又は症状のリスクがある、対象を治療すること指す、ここで、前記治療により、前記患者が疾患又は症状を発症する可能性が減少する。用語「治療的治療(therapeutic treatment)」は、疾患又は症状に既に罹患している対象に、治療を施すことを指す。

「作動可能に連結する(operably linked)」は、核酸配列又はポリぺプチドが、それらが互いの発現又は機能に影響を及ぼすような様式で連結するように、それが作動可能に連結している配列と機能的に関連するということ、を意味する。例えば、ポリペプチドは、それが作動可能に連結する別のポリペプチドの活性又はシグナル伝達カスケードを変化させることがある。例えば、プロモーターに作動可能に連結した核酸配列は、前記プロモーターによって影響を受ける発現パターンを有する。ロッド・オプシン(rod opsin)及びアレスチン・ポリペプチドは、リンカーによって作動可能に連結することがある。リンカーを、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、からなる群より選択することがある。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。リンカーは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。リンカーは、長さが、5-250アミノ酸、より好適には8から150、より好適には8-100アミノ酸、最も好適には10-100であることがある。最も好適なリンカーは、長さが、8-12、好適には10アミノ酸であることがある。好適なリンカーは、10nm 可撓性ER/K準-可撓性リンカーであることがある。

プロモーターは、それが連結した核酸配列の発現を媒介する。プロモーターは構成的であっても誘導的であってもよい。プロモーターは、内側網膜細胞(inner retinal cell)におけるユビキタスな発現（ubiquitous expression）、又はニューロン特異的な発現、を指示することがある。後者のケースでは、プロモーターは、細胞型特異的な発現を、例えば、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)又はオフ-双極細胞に、指示することがある。好適なプロモーターは、当業者に公知である。例えば、本発明において使用するための好適なプロモーターを、L7、thy1、リカバリン、カルビンディン、ヒトCMV、GAD-67、ニワトリ・ベータ-アクチン、hSyn、Grm6、Grm6エンハンサー-SV40融合タンパク質、からなる群より選択することがある。ターゲティングを、細胞特異的なプロモーター(例えば、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)を選択的にターゲティングするためのGrm6-SV40)を使用して達成することがある。Grm6プロモーターは、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)特異的な代謝型グルタミン酸レセプター（mGluR6）をコードするGrm6遺伝子の200塩基対エンハンサー配列、及びSV40真核生物プロモーター、の融合体である。Grm6遺伝子の好ましい供給源は、マウス及びヒトである。ユビキタスな発現を、汎-ニューロン・プロモーターを使用して達成することがあり、その例は当該分野で公知である、及び利用可能である。そのような一例はCAGである。前記CAGプロモーターは、CMV初期エンハンサーとニワトリβ-アクチン・プロモーターの融合体である。

「オプシン」及び「オプシン・ポリペプチド」は、本出願で使用される場合、任意の種由来の天然に存在するオプシン・ポリペプチド、オプシンの生物学的に活性なフラグメント、並びにその任意のバリアント、均等物、又は相同体若しくは変異体、を指す。オプシンとしては、例えば、ロッド・オプシン(ロドプシン(rhodopsin))、青色、緑色及び赤色色素などのコーン・オプシン(cone opsin)(Nathans, J., Annu. Rev. Neurosci. 10:163-194 (1987))、及びそれらの生物学的に活性なフラグメント、が挙げられる。更に、例えば、オプシンとしては、メラノプシン(Provencio et al., J. Neurosci. 20:600-605(2000))、エンセファロプシン又はパノプシン(Blackshaw and Snyder J. Neurosci. 19:3681-3690 (1999); Halford et al., Genomics 72:203-208 (2001))及びペロプシン(Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9893-9898 (1997))、ニューロプシン(Opn5)、(Opn3)、パラピニアル・オプシン(parapineal opsin)、VAopsin、パラピノプシン；パリエトプシン(parietopsin)、ピノプシン、TMTオプシン、ジェリー・フィッシュ・オプシン(Jelly fish opsin)、C-オプシン、並びに任意の無脊椎動物の網膜オプシン及び／又は動物における網膜外光感受性を正常に支えるオプシン、が挙げられる。変異体オプシンは、本出願で記載されるような任意の1種以上の変異、を有することがある。本出願で言及される野生型オプシンは、NCBI参照配列NM_000539バージョン3の配列を有することがある、又はそのバリアントであることがある（本出願で記載されるようなオプシン変異のうちの如何なる1種以上も含まない）。本出願で、ロッド・オプシン(rod opsin)としては、C-末端リン酸化部位を除去するために変異を加えたロッド・オプシン(rod opsin)を挙げることができる。好適には、前記変異は、ヒト・ロッド・オプシンのS333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343Aである(Rod6Aと呼ぶ)。本出願では、オプシン・セグメントとしては、本出願で定義されるオプシン、又はその任意の生物学的に活性なフラグメント、が挙げられる。

本出願で使用される「アレスチン」又は「アレスチン・ポリペプチド」は、任意の種由来の天然に存在するアレスチン・ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、並びにその任意のバリアント、均等物、又は相同体若しくは変異形体、を指す。アレスチンの例としては、限定されるものではないが、視覚アレスチン(時に、アレスチン1と呼ぶことがある)、βアレスチン1(時に、アレスチン2と呼ぶことがある)、βアレスチン2(時に、アレスチン3と呼ぶことがある)、及びコーン・アレスチン(cone arrestin)、が挙げられる。変異体アレスチンは、本出願に記載されるような任意の1種以上の変異、を有することがある。本出願に記載されるような野生型アレスチンは、NCBI参照配列NM_000541の配列を有することがある、又はそのバリアントであることがある（本出願で記載されるようなアレスチン変異のうちの如何なる1種以上も含まない）。変異体アレスチンとしては、リン酸化非依存性アレスチン（これは、非リン酸化オプシンに対する親和性が増加することと関連する変異、を有することを意味する）が挙げられる。本出願で定義されるアレスチン点変異の残基番号付けは、ヌクレオチド1をNCBI参照配列NM_000541の236として呼ぶ。

「G-タンパク質共役レセプター・キナーゼ」は、任意の種由来の天然に存在するG-タンパク質共役レセプター・キナーゼ、生物学的に活性なフラグメント、並びにその任意のバリアント、均等物、又は相同体、をいう。好適な例としては、GRK1(G-タンパク質共役レセプター・キナーゼ1、又はロドプシン・キナーゼ)が挙げられる。

「ポリペプチド組成物」：
本出願で記載される組成物は、G-タンパク質シグナル伝達の時空間的な活性化及び不活性化を調節するために有用であることがある。本出願で記載される組成物はまた、光遺伝学的な用途、システム、及び技術における時空間的な活性化を調節するために有用であることがある。記載する組成物は、光活性の寿命を調節することを含むメカニズムを介して、時空間的な調節を達成することができる。GPCRの固有の光活性を調節することによって、又は光活性状態を阻害する及び／又はクエンチする(quench)GPCR-結合分子を介して光活性を調節することによって、GPCRの時空間的な活性化及び不活性化を調節することができる組成物を、本出願で記載する。

本出願で記載される組成物は、GPCR-結合ポリペプチドを利用して、光に対する応答における光活性GPCRの時空間的な活性化を調節することがある。GPCR-結合ポリペプチドは、GPCRシグナルの強度を調節することによって、及び応答の寿命を変化させることによって、活性化したGPCRシグナル伝達をクエンチする(quench)ことができる、及び続いて光活性GPCRシグナル伝達を調節することができる。GPCR-結合ポリペプチドによる調節は、典型的には、G-タンパク質特異的なプロテアーゼの存在及び部位特異的なGPCRのリン酸化の存在、を必要とする。本出願で記載される組成物は、光活性GPCRを、並びにGPCRリン酸化とは無関係にGPCRに結合することができる、及びGPCR活性を調節することができる、GPCR-結合ポリペプチドを、含むことがある。本出願で記載される組成物はまた、光活性GPCR内の変異を利用して、光に対する応答におけるG-タンパク質シグナル伝達の時空間的な活性化を調節することもある。GPCR変異は、GPCRシグナルの強度を調節することによって、及び応答の寿命を変化させることによって、光活性GPCRシグナル伝達を調節することがある。光活性GPCR内の変異は、GPCRシグナルの強度を調節することがある、及び不活性化状態の安定化又は活性化状態の不安定化、を通して、応答の寿命を変化させることを調節することがある。いくつかの場合では、前記光活性GPCRはオプシンである、及び前記GPCR-結合ポリペプチドはアレスチンである。

いくつかの場合では、前記オプシンは、C-末端リン酸化部位に関連する変異、を含む。いくつかの場合では、前記アレスチンは、非リン酸化オプシンに対する親和性が増加することと関連する変異、を含む。いくつかの場合では、前記変異を、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、から選択する。いくつかの場合では、変異は、L337A、V378A、及びF379Aを含む。いくつかの場合では、前記変異は、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H及びQ332Kを含む。いくつかの場合では、前記オプシンは、前記オプシン・ポリペプチドの時空間的な活性化を調節する少なくとも1つの変異、を含む。いくつかの場合では、前記変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択する。いくつかの場合では、前記変異を、L59Q、Y74F、E122Q、A132S、Y136F、I189P、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択する。いくつかの実施形態では、前記アレスチンは、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L337A、V378A、F379A、及びそれらの任意の組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、及びそれらの任意の組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、C-末端リン酸化部位に関連する変異、を含む、及び前記アレスチンは、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含む；及び前記アレスチンは、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、変異の組み合わせは、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306Fから選択される任意の1つ以上の変異、及びL337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332Kから選択される任意の1つ以上の変異、を含むことがある。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、C-末端リン酸化部位に関連する変異、及び／又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異、を含む、並びに前記アレスチンは、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記オプシンは、C末端リン酸化部位に関連する変異（例えば、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343A、又はそれらの任意の組み合わせ）、及び／又はメタ-II崩壊の速度を増加させる変異（例えば、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異）、を含む；並びに前記アレスチンは、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、から選択される変異、を含む。いくつかの実施形態では、変異の組み合わせは、a)及び／若しくはb)、並びに／又はc)から選択される変異、を含むことがある、ここで、a)は、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343Aを含む；b)は、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F又はそれらの組み合わせを含む、及びc)は、L337A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K又はそれらの組み合わせを含む。好適な実施形態では、オプシン変異は、野生型アレスチンと組み合わせた、E122Qである。好適な実施形態では、オプシン変異は、L337A、V378A及びF379A(本出願では3Aと呼ぶ)でのアレスチン変異と組み合わせた、E122Qである。好適な実施形態では、前記オプシン変異は、L337A、V378A、及びF379A(3A)でのアレスチン変異と組み合わせたE122Q、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、及びS343Aである。好適な実施形態では、前記オプシンは、ヒト・ロッド・オプシンである、並びに前記変異は、L337A、V378A、及びF379A(3A)でのアレスチン変異と組み合わせた、E122Q、S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、及びS343A(E122Q rod 6A)である。

いくつかの場合では、前記オプシンは、動物オプシンである。ある場合には、前記オプシンは、ヒト・ロッド・オプシン(rod opsin)である。いくつかの場合では、前記組成物は、眼球又は網膜下投与に好適である。

本出願で記載される組成物は、G-タンパク質共役レセプター特異的キナーゼを利用して、光に対する光活性化応答の強度及び持続時間を調節する。G-タンパク質共役レセプター・キナーゼは、GPCR上の特異的な残基をリン酸化することがあり、その結果、GPCRシグナル強度を減少させることがある、及び応答の寿命を変化させることがある。次いで、前記組成物は、光活性化可能なGPCR、及びG-タンパク質特異的キナーゼを含むことがある。

いくつかの場合では、オプシン・ポリペプチド及びG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドを含む組成物が、本出願で開示される。いくつかの場合では、前記オプシン・ポリペプチドは、リンカーを介して、変異体G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドに,
作動可能に連結する。いくつかの場合では、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。いくつかの場合では、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。リンカーは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。いくつかの場合では、前記オプシン・ポリペプチドと前記変異体G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドとは分離している。リンカーは、長さが、5-250アミノ酸、より好適には8から150、より好適には8-100アミノ酸、最も好適には10-100であることがある。最も好適なリンカーは、長さが、8-12、好適には10アミノ酸であることがある。好適なリンカーは、10nm ER/K準-可撓性リンカーであることがある。

組成物は、例えば、細胞への投与のために、1種以上の好適な媒体又は賦形剤と共に、本出願で記載されるようなベクター又はポリぺプチドを含むことがある。いくつかの場合では、組成物は注射投与可能な液体である。いくつかの場合では、前記組成物を、注射投与によって、好ましくは眼内注射投与によって、好ましくは網膜下注射投与又は硝子体内注射投与によって、投与する。

時間分解能を増加させることは、非-形質転換の細胞と比較して、光に対する細胞の応答性を改善することを意味する。例えば、時間分解能が増加した細胞は、本来の(native)又は非-形質転換の細胞と比較して、より速いオプシン活性化、及び／又はより速いオプシン非活性化、を示すことがある。

光レセプター機能を提供することは、以前に光レセプター能を有さなかった細胞、又はその光レセプター能が変性した細胞、が、その中で、光感受性タンパク質をコードする外来の核酸配列を発現して、完全に又は部分的に、光-レセプター性になることを意味する。好ましくは、形質転換した網膜細胞は、本来の(native)光レセプター性細胞の光レセプター能の一部又は全部を示す。好ましくは、形質転換した細胞は、本来の(native)網膜光レセプター細胞と、少なくとも同じ、又は実質的に同じ、光レセプター能を示す。好ましくは、形質転換した細胞は、疾患の又は変性している本来の(native)網膜光レセプター細胞よりも、高い光レセプター能を示す。従って、形質転換した細胞は、好ましくは、同じ条件下で、処置を受けることなく、維持した、同じ供給源に由来する、変性した又は疾患細胞と比較して、光レセプターが増加する。形質転換した細胞を、その中で、外因性核酸が存在することによって、本来の(native)細胞と区別することができる。「光レセプター機能を回復させる(restoring photoreceptor function)」とは、いくつかの実施形態では、変性網膜において、一般に遭遇する光レベル(例えば、13.5-15.5 log光子/cm2/s)での光応答を検出し得ることを、意味することがある。

網膜変性又は網膜変性症状若しくは網膜変性疾患は、前記網膜の細胞における光レセプター機能の喪失、又は前記網膜における細胞の喪失、をもたらす、あらゆる症状を意味する。網膜変性によって、視力を、部分的に、又は完全に、喪失することがある。

本出願の組換え細胞は、本出願で記載されるようなベクター又は核酸を、投与した及び細胞が取り込んだ、細胞である。そのような細胞を、それがその中に非-本来の(non-native)核酸を含むので、本明細書では、形質転換細胞と呼ぶことがある。前記ベクター又は核酸を、前記細胞に対して、外来性である、非-本来である(non-native)、又は異種性である、と記載することがある。

いくつかの場合では、オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで前記方法は、前記オプシンをG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1に接触させること、前記オプシンをアレスチンに接触させること、又は前記オプシンをG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1及びアレスチンに接触させること、を含む、が本出願で開示される。いくつかの場合では、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで前記方法は、前記オプシンをG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1に接触させること、前記オプシンをアレスチンに接触させること、又は前記オプシンをG-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1及びアレスチンに接触させること、を含む、が本出願で開示される。いくつかの場合では、光レセプター機能を内側網膜細胞(inner retinal cell)に提供する方法、ここで前記方法は、オプシン、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1、及びアレスチン、を含む組成物の有効量を、内側網膜細胞(inner retinal cell)に投与することを含む、が本出願で開示される。

不活性化が増加すると、G-タンパク質シグナル伝達の全持続時間はより短くなる、及びその応答の減衰は、光刺激を止めた後、未改変の細胞又はシステムよりも、速く生じる。

光活性ポリペプチド：
本出願で記載される光活性ポリペプチドは、G-タンパク質シグナル伝達の時空間的な活性化及び不活性化を調節するために有用であることがある。本出願で記載される光活性ポリペプチドはまた、光遺伝学的な用途、システム、及び技術における時空間的な活性化を調節するために有用であることがある。記載される光活性ポリペプチドは、光活性寿命を調節することを含むメカニズムを介して、時空間的な調節を達成することがある。GPCRの固有の光活性を調節することによって、又は光活性化状態を阻害する及び／若しくはクエンチする(quench)GPCR-結合分子を介して光活性を調節することによって、GPCRの時空間的な活性化及び不活性化を調節することができる光活性ポリペプチドが、本明細書に記載される。前記光活性ポリペプチドは、オプシン、好適には動物オプシン、最も好適にはヒト・オプシンであることがある。前記オプシンは、ロッド・オプシン(rod opsin)、好適にはロッド・オプシン(rod opsin)6Aであることがある、又は本出願で記載されるようなメタII崩壊の変異体であることがある。いくつかの実施形態では、前記光活性ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるような、キメラ・ポリペプチドであることがある。

本出願で記載される光活性ポリペプチドは、GPCR-結合ポリペプチドを利用して、光に対する応答における光活性GPCRの時空間的な活性化を調節する。GPCR-結合ポリペプチドは、GPCRシグナルの強度を調節することによって、及び応答の寿命を変化させることによって、活性化したGPCRシグナル伝達をクエンチする(quench)、及び続いて光活性GPCRシグナル伝達を調節する、ことがある。GPCR-結合ポリペプチドによる調節は、典型的には、G-タンパク質特異的プロテアーゼの存在及び部位特異的なGPCR-リン酸化の存在、を必要とする。本出願で記載される光活性キメラ・ポリペプチドは、光活性GPCRを、並びにGPCRリン酸化とは無関係にGPCRに結合することができる、及びGPCR活性を調節することができる、GPCR-結合ポリペプチドを、含むことがある。本出願で記載される光活性キメラ・ポリペプチドはまた、光活性GPCR内の変異を利用して、光に対する応答におけるG-タンパク質シグナル伝達の時空間的な活性化を調節することがある。GPCR変異は、GPCRシグナルの強度を調節することによって、及び応答の寿命を変化させることによって、光活性GPCRシグナル伝達を調節することがある。光活性GPCR内の変異は、GPCRシグナルの強度を調節することがある、及び不活性化状態の安定化又は活性化状態の不安定化、を通して、応答の寿命を変化させることを調節することがある。

調節セグメントとは、オプシンの活性を調節することができる、より好適にはトランスデューシンを介して下流のシグナル伝達カスケードを開始するオプシンの作用能を調節することができる、任意のポリぺポリペプチド若しくはフラグメント、バリアント又はその変異体を意味する。最も好適には、調節セグメントは、G-タンパク質を活性化するオプシンの作用能を、不活性化することができる、又は阻害することができる。

光感受性ポリペプチドは、化学的な又は物理的な変化を受けることによって、光に対して反応するポリペプチドである。光レセプター性とは、光感受性である、又は1種以上の光感受性タンパク質を含む、細胞を意味する。光レセプター性又は光レセプター及び光感受性という用語を、互換的に使用することがある。本発明において使用するための核酸配列は、任意の光感受性ポリペプチドをコードすることがある。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物の又は非-哺乳動物の光感受性タンパク質をコードする。それは、哺乳動物の、非-哺乳動物の、植物の、バクテリアの、又は古細菌の(archeabacterial)起源であることがある。哺乳動物の場合、それは、ヒト・タンパク質をコードすることが好ましい。本発明において使用するための核酸配列を、ロドプシン、メラノプシン、コーン・オプシン(cone opsin)(特にLWSオプシン、MWオプシン、及びSWSオプシン)、ニューロプシン(Opn5)、エンカファロプシン(Opn3)、パラピニアル・オプシン(parapineal opsin)、VAオプシン、パラピノプシン；パリエトプシン(parietopsin)、ピノプシン、TMTオプシン、ジェリー・フィッシュ・オプシン(Jelly fish opsin)、C-オプシン、並びに任意の無脊椎動物の網膜オプシン及び／又は動物における網膜外光感受性を正常に支えるオプシン、からなる群より選択することがある。

光活性とは、光に対する応答において、光感受性ポリペプチドによって駆動される活性、を意味する。「光活性化可能」とは、細胞が、光に対する応答において、活性を生成することができること、を意味する。これらの用語を、光に対して応答するという一般的な意味の下で、光感受性又は光レセプター性と互換的に使用することがある。

遺伝子治療及びベクター：
光レセプター性又は光レセプター及び光感受性という用語を、互換的に使用することがある。本発明において使用するための核酸配列は、任意の光感受性タンパク質をコードすることがある。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物の又は非-哺乳動物の光感受性タンパク質をコードする。それは、哺乳動物の、非-哺乳動物の、植物の、バクテリアの、又は古細菌の(archeabacterial)起源であることがある。哺乳動物の場合、それは、ヒト・タンパク質をコードすることが好ましい。本発明におけるオプシンのための核酸配列を、ロドプシン、メラノプシン、コーン・オプシン(cone opsin)(特にLWSオプシン、MWオプシン、及びSWSオプシン)、ニューロプシン(Opn5)、エンカファロプシン(Opn3)、パラピニアル・オプシン(parapineal opsin)、VAオプシン、パラピノプシン；パリエトプシン(parietopsin)、ピノプシン、TMTオプシン、ジェリー・フィッシュ・オプシン(Jelly fish opsin)、C-オプシン、並びに任意の無脊椎動物の網膜オプシン及び／又は動物における網膜外光感受性を正常に支えるオプシン、からなる群より選択することがある。本発明におけるアレスチンの核酸配列を、アレスチン-1、アレスチン-2、アレスチン-3、及びアレスチン-4、からなる群より選択することがある。

本発明において使用するための核酸配列を、前記核酸配列が、治療するべき対象の網膜に対して本来的な(native)光感受性タンパク質をコードするように、治療するべき対象に応じて選択することがある。従って、例えば、前記対象がヒトである場合、核酸配列は、好ましくは、ヒト光感受性タンパク質、例えばロドプシンをコードする。しかし、ある特定の実施形態では、前記治療するべき対象に対して本来的(native)ではないが、好ましくも前記対象において免疫反応を引き起こさない、光感受性タンパク質をコードする核酸配列が提供され得ること、が想定される。

多くの光感受性タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列が、当該分野で公知である。例えば、好ましい光感受性タンパク質の核酸配列は、以下のように提供される：
メラノプシン：ホモ・サピエンス・オプシン4(OPN4)、mRNA (cDNAクローン MGC: 142118 IMAGE:8322610), GenBank: BC113558, バージョン BC1 13558.1 ；
ロドプシン：ホモ・サピエンス・ロドプシン(RHO), GenBank: BC1 11451.3, アクセッション(Accession) NM_000539, バージョン NM_000539.3 Gl: 169808383；
コーン・ホモ・サピエンス・オプシン1（Cone homo sapiens opsin 1） : ホモ・サピエンス・オプシン1 , 長波長感受性, OPN1 LW - NCBI参照配列: アクセッション(Accession): NM_020061 , バージョン NM_020061.5；
ホモ・サピエンス・オプシン1 , 中波長感受性 OPN1 MW - NM_000513, バージョンNM_000513.2；
ホモ・サピエンス・オプシン1 短波長感受性 (OPN1SW) NM_001708, バージョン NM_001708.2.
パラピノプシン(Parapinopsin) (Genbank アクセッション(Accession) NM_001200073, バージョンNM_001200073.1 Gl:318056020)；
パリエトプシン(Parietopsin) (Genbank アクセッション(Accession) DQ100320, バージョン DQ100320.1 Gl:73666459)；ピノプシン(Pinopsin) (Genbank アクセッション(Accession) AF487546, バージョン AF487546.1 Gl:20805654)； VAオプシン (Genbank アクセッション(Accession) AF233520, バージョン AF233520.1 Gl:8272567);
TMT オプシン (Genbank アクセッション(Accessions) AH011520 AF349943 AF349944 AF349945, バージョンAH011520.2 Gl:33951 1123);
ジェリー・フィッシュ・オプシン(Jelly fish opsin) (Genbank アクセッション(Accession) AB435549, バージョン AB435549.1 G 1:210049957)； OPN3 (Genbank アクセッション(Accession) NM_014322, バージョン NM_014322.2 Gl:71999130)；
OPN5 (Genbank アクセッション(Accession) AY377391 , バージョン AY377391.1 Gl:38482095)；
C-オプシン (Genbank アクセッション(Accession) HF566407, バージョン HF566407.1 Gl: 543581059)；及びクリプトクロム(Cryptochrome) (Genbank アクセッション(Accession) NM_169852, バージョン NM_169852.1 Gl:24648151).

本出願で言及される光活性又は光感受性タンパク質は、ヒト・タンパク質であることがある。ヒト光活性又は光感受性タンパク質は、ヒト・ロドプシン（Rh1、OPN2、RHOとも呼ばれる）又はフォトプシン(photopsin)、であることがある。フォトプシンを、長波長感受性(OPN1 LW)オプシン、中波長感受性(OPN1 MW)オプシン、及び短波長感受性(OPN1 SW)オプシンからなる群より選択することがある。長波長感受性(OPN1 LW)オプシンは、電磁スペクトルの黄色-緑色領域において、560 nmのAmaxを有する。それをまた、「赤オプシン」、「Lオプシン」又は「LWSオプシン」とも呼ぶ。中波長感受性(OPN1 MW)オプシンは、電磁スペクトルの緑色領域において、530 nmのAmaxを有する。それをまた、「緑色オプシン」、「Mオプシン」又は「MWSオプシン」とも呼ぶ。短波長感受性(OPN1 SW)オプシンは、電磁スペクトルの青色領域において、430 nmのAmaxを有する。それをまた、「青色オプシン」、「Sオプシン」又は「SWSオプシン」とも呼ぶ。

ヒト光活性又は光感受性タンパク質をコードする核酸配列は、ホモ・サピエンス・ロドプシン(RHO)遺伝子(GenBank: BC1 11451.3、アクセッション(Accession)NM_000539、バージョンNM_000539.3 Gl: 169808383)、又はそのフラグメント若しくは誘導体であることがある。

ヒト光活性又は光感受性タンパク質をコードする核酸配列は、コーン・ホモ・サピエンス・オプシン1（Cone homo sapiens opsin 1）、長波長感受性OPN1 LW(NCBI 参照配列: アクセッション(Accession): NM_020061、バージョン NM_020061.5)、又はそのフラグメント若しくは誘導体であることがある。ヒト光活性又は光感受性タンパク質をコードする核酸配列は、コーン・ホモ・サピエンス・オプシン1（Cone homo sapiens opsin 1）：中波長感受性OPN1 MW（NCBI参照配列：アクセッション： NM_000513.2;［Science 232(4747)、193-202(1986)］）、又はそのフラグメント若しくは誘導体であることがある。ヒト光活性又は光感受性タンパク質をコードする核酸配列は、コーン・ホモ・サピエンス・オプシン1（Cone homo sapiens opsin 1）：短波長感受性(OPN1 SW)NM_001708、バージョンNM_001708.2、又はそのフラグメント若しくは誘導体であることがある。光感受性タンパク質をコードする核酸配列への言及は、本出願で記載される配列の誘導体である核酸配列、又は光感受性タンパク質のより短い型若しくはフラグメントをコードする核酸配列、を含む、ここで、前記誘導体又はフラグメントは、本来の(native)光感受性タンパク質と実質的に同じ光感受性機能を保持する。実質的に同じとは、本来の(native)タンパク質の光感受性機能の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%、を意味する。フラグメントは、本来の(native)タンパク質の配列の70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%、を含むことがある。

好ましくは、核酸配列のフラグメント又は誘導体は、参照核酸配列の長さの50%、60%、70%、80%、90%、又は少なくとも95%にわたって、参照核酸配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、又は90%、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は少なくとも99%の配列同一性を共有する。誘導体は、好ましくは、活性があり、本来の(native)配列と比較して、置換及び／又は欠失及び／又は付加、を含むことがある。誘導体はまた、光感受性タンパク質に対して、所望の活性又は機能を提供する、他の遺伝子配列の部分を含むこともある。誘導体をまた、その参照配列の変異体又はバリアントと呼ぶこともある。

配列同一性を、所定の比較ウィンドウ（参照ヌクレオチド配列又はタンパク質の長さの50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は100%であることがある）全体にわたり、2つの配列を並べて比較することによって、及び残基が同一である位置の数を測定することによって、決定する。典型的には、これを、パーセンテージとして表す。ヌクレオチド配列の配列同一性を測定することは、当業者に周知の方法であり、コンピュータで実行する数学的なアルゴリズム（例えば、ALIGN (バージョン2.0), GAP, BESTFIT, BLAST ［Altschul et al J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)］, FASTA 及び TFASTA ［Wisconsin Genetic Software Package バージョン8, Genetics Computer Groupから出されている, Accelrys Inc. San Diego, California］, 並びに CLUSTAL ［Higgins et al, Gene 73: 237-244 (1998)］など）を使用し、デフォルトのパラメータを使用する。

核酸配列は、DNA、RNA、cDNA、又はPNAであることがある。それは、ゲノム、組換え、又は合成であることがある。核酸配列は、単離されたもの又は精製されたもの、であることがある。それは、一本鎖であることがある、又は二本鎖であることがある。好ましくは、核酸配列は、本出願で記載されるように、光感受性タンパク質をコードする。核酸配列を、例えば、Sambrook et al; Molecular Cloning: A laboratory manual、Cold Spring Harbour laboratory Pressに記載されているように、標準的な分子クローニング技術（例えば、制限酵素切断、ライゲーション(ligation)、ゲル電気泳動など）を用いてクローニングすることによって、得ることがある。核酸配列を、例えば、PCR技術を使用して、単離することがある。そのような技術は、増幅するべき核酸配列の配列に基づいたプライマーを使用することがある。単離するとは、前記核酸配列を、任意の不純物から、並びにその供給源中の前記核酸配列に伴って天然に見出される他の核酸配列及び／又はタンパク質から、分離することを意味する。従って、それを、隣接する核酸配列から、又は染色体物質若しくは配列から、分離することがある。好ましくは、それはまた、精製／産生のプロセスに由来する、細胞物質、培養培地、又は他の化学物質も含まない。核酸配列は、合成であることがあり、例えば、直接的な化学合成により（例えば、ホスホトリエステル方法［Narang et al Meth Enzymol 68: 109-151 1979］を使用して）産生されることがある。核酸配列を、そのままの(naked)核酸として提供することがある、又はタンパク質若しくは脂質と複合体化して提供することがある。前記配列を、改変して発現効率を改善させることがある(例えば、C末端を短くすることによる、若しくはターゲティング・モチーフ(targeting motif)を導入することによる)、又は光応答の特性を改変することがある (例えば、シグナル伝達を終結させるプロセスの一部としてロドプシン・キナーゼがターゲットとする残基を、除去すること、若しくは付加すること、による)。提供された配列情報を用いて、当業者は、利用可能なクローニング技術を使用して、細胞への形質導入に適した核酸配列又はベクターを産生することがある。

好ましくは、核酸配列を、ベクターとして、好ましくは発現ベクターとして、提供する。好ましくは、それを、遺伝子治療ベクター（好ましくは、これはターゲットの網膜細胞における形質導入及び発現に適している）として、提供することがある。ベクターは、ウイルス性であることがある、又は非-ウイルス性であることがある(例えば、プラスミド)。ウイルス・ベクターとしては、アデノウイルス、変異体を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペス・ウイルス、ワクシニア・ウイルス、MMLV、GaLV、サル免疫不全ウイルス(SIV)、HIV、痘瘡ウイルス、及びSV40に由来するもの、が挙げられる。ウイルス・ベクターは、複製欠損（replication deficient）、複製コンピテント（replication competent）又はコンディショナル(conditional)であることがあると、想定されるが、好ましくは、複製に欠陥がある。ウイルス・ベクターは、典型的には、ターゲットの網膜細胞のゲノムの中に組み込まれることなく、染色体外の状態で存続することがある。光感受性タンパク質をコードする核酸配列を、網膜のターゲット細胞に導入するための、好ましいウイルス・ベクターは、AAVベクター、例えば、自己-相補性アデノ随伴ウイルス（self-complementary adenoassociated virus (scAAV)）である。選択的なターゲティングを、特定のAAV血清型(AAV血清型1からAAV血清型12)、特にAAV2、又はAAV2の改変バージョン等を含むこれらの血清型の何れかの改変バージョン（例えば、AAV 4YFベクター及びAAV 7m8ベクターなど）、を用いて、達成することがある。前記ベクターを硝子体内投与によって提供する本発明の態様では、前記ベクターは、それがECMの1種以上のタンパク質に結合しないように改変したベクターであることがある。例えば、好ましいベクターは、改変したヘパリン硫酸塩結合部位を含むことがあり、その結果、それは、ヘペラン硫酸塩への結合が減少している、又は結合することができない（例えば、AAV 7m8 (Dalkara D et al Sci Transl Med 2013; 5: 189ra76)）。いくつかの実施形態では、前記AAVベクターを、AAV1-AAV10から選択する。好ましくは、前記AAVベクターは、AAV2である。

ベクターは、本出願で記載されるように、ロッド・オプシン(rod opsin)又はアレスチンをコードする核酸配列から選択される1種の核酸配列、を含むことがある。本出願で記載されるように、ベクターは、バイシストロニック(bicistronic)であることがある、これは、それが2つ以上の遺伝子をコードすること、並びに従って、ロッド・オプシン(rod opsin)及びアレスチンをコードする核酸配列を含むことがあること、を意味する。ロッド・オプシン(rod opsin)及びアレスチンを、別々のコーディング配列として、又は融合タンパク質として発現する単一の配列として、提供することがある。

ウイルス・ベクターは、細胞に入る作用能を有する。しかしながら、プラスミドのような非-ウイルス・ベクターは、薬剤と複合体化して、ターゲット細胞によるその取り込みが促進されることがある。このような薬剤としては、ポリカチオン性薬剤が挙げられる。或いは、デリバリー・システム(例えば、リポソーム・ベースのデリバリー・システム)を使用することがある。

本発明において使用するためのベクターは、好ましくは、in vivo又はin vitroでの使用に適している、及び好ましくは、ヒトでの使用に適している。

ベクターは、好ましくは、ターゲット網膜細胞における核酸配列の発現を指示するための1種以上の調節配列を含む。調節配列としては、前記核酸配列に作動可能に連結したプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列(例えば、SV$)後期ポリA、複製起点、逆方向末端反復配列(inverted terminal repeat sequence)、核酸の制限酵素部位、及び／又は相同組換え部位、を挙げることができる。一実施形態では、ベクターは、ウッドチャーチ肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント(Woodchurch Hepatitis Virus post-translational regulatory element (WRPE))を含むことがある(PMID: 10515449 DOI: 10.1089/10430349950016942)。ベクターはまた、例えば、増殖システム（例えば、バクテリア細胞）又はターゲット網膜細胞において、前記ベクターの発現を判定するために、選択可能なマーカーを含むことがある。

好適には、ベクターは、AAVベクター（例えば、AAV血清型［AAV血清型1からAAV血清型12］、又はこれらの血清型の何れかの改変型［例えば、AAV 4YF及びAAV 7m8ベクターをなど］など）であり、核酸配列を発現するように内側網膜細胞(inner retinal cell)に指示する調節配列（例えば、本出願で記載されるプロモーター［例えば、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)を選択的にターゲット化するためのGrm6-SV40など］）を含む。

投与：
本発明は、網膜の光レセプター能を回復させるために、細胞（好適には、網膜）に、核酸配列を投与することを提供する。いくつかの実施形態では、その組成物を、注射投与によって、好ましくは眼内注射投与によって、好ましくは網膜下注射投与又は硝子体内注射投与によって、投与する。

本発明が、2種以上のベクター又はポリペプチドを投与することを含む場合、本方法は、前記ベクター／ポリペプチドを硝子体腔の中に、別々に、同時に、又は連続して、注射投与することを含むことがある。好ましい実施形態において、本発明の方法は、単回用量を注射投与することを含む。好ましくは、方法は、i)オプシン・ポリペプチドをコードする核酸配列、及びii)アレスチン・ポリペプチド、を眼の硝子体腔の中に注射投与することを含む。好ましくは、本発明は、細胞に光レセプター機能を提供するために、例えば、視力を回復させるために、好ましくは、網膜変性症状（例えば、網膜ジストロフィー［例えば、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー及び黄斑ジストロフィーなど］；他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎及び光レセプター能の喪失から生じる任意の他の疾患）を治療するために、眼の硝子体腔の中に導入するための、i)ロッド・オプシン(rod opsin)をコードする核酸配列；及びii)アレスチン変異体をコードする核酸、を含む、単回注射投与が可能な用量、を提供する。

調節及び治療の方法：
本出願で記載される方法は、G-タンパク質シグナル伝達の時空間的な活性化及び非活性化を調節するために有用であることがある。本出願で記載される方法はまた、光遺伝学的な用途、システム、及び技術における時空間的な活性化を調節するために有用であることがある。記載される方法により、細胞及び生理的なシステムにおける光活性GPCRの光活性化寿命を調節することを含むメカニズムを介して、時空間的な調節が達成されることがある。GPCRの固有の光活性を調節することによって、又は細胞及び生理的なシステムにおける光活性状態を阻害する、及び／若しくはクエンチする(quench)、GPCR-結合分子を介して、光活性を調節することによって、GPCRの時空間的な活性化及び不活性化を調節することができる方法、を本出願に記載する。本出願で記載される方法をまた利用して、光活性GPCRを生来発現しない細胞における用途のために、光活性GPCRを時空間的に調節することもある。本出願で記載される方法を更に利用して、光活性オプシンの機能が存在しない、又は減少している、疾患状態又は異常な状態を特徴とする細胞における治療用途のために、光活性GPCRを時空間的に調節することもある。

本出願で記載される方法は、GPCR-結合ポリペプチドを利用して、光に対する応答における光活性GPCRの時空間的な活性化を調節することがある。GPCR-結合ポリペプチドは、GPCRシグナルの強度を調節することによって、及び応答の寿命を変化させることによって、活性化したGPCRシグナル伝達をクエンチする(quench)ことがある、及び続いて光活性GPCRシグナル伝達を調節することがある。GPCR-結合ポリペプチドによる調節は、典型的には、G-タンパク質特異的なプロテアーゼの存在、及び部位特異的なGPCRリン酸化存在、を必要とする。本出願で記載される方法は、光活性GPCRを、並びにGPCRリン酸化とは無関係にGPCRに結合することができる、及びGPCR活性を調節することができる、GPCR-結合ポリペプチドを、含むことがある。本出願で記載される組成物はまた、光活性GPCR内の変異を利用して、光に対する応答におけるG-タンパク質シグナル伝達の時空間的な活性化を調節することもある。GPCR変異は、GPCRシグナルの強度を調節することによって、及び応答の寿命を変化させることによって、光活性GPCRシグナル伝達を調節することがある。光活性GPCR内の変異は、GPCRシグナルの強度を調節することがある、及び不活性化状態の安定化又は活性化状態の不安定化、を通して、応答の寿命を変化させることを調節することがある。いくつかの場合では、前記光活性GPCRはオプシンである、及び前記GPCR-結合ポリペプチドはアレスチンである。

前記ロッド・オプシン(rod opsin)結合タンパク質アレスチンは、オプシン活性化シグナルの強度を調節することによって、及びシグナル伝達応答の寿命を変えることによって、活性化したロッド・オプシン(rod opsin)分子をクエンチする(quench)ことができる、及び続いてオプシン・シグナル伝達を調節することができる。いくつかの場合では、オプシンの不活性化を増加させる方法、ここで前記方法は、前記オプシンをリン酸化非依存性アレスチン変異体に接触させることを含む、が本出願で開示される。いくつかの実施形態では、図２の実施例で示すように、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法は、オプシン及びリン酸化非依存性アレスチン変異体を、共-トランスフェクトすること(co-transfecting)を含む。いくつかの実施形態では、図３の実施例で示すように、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法は、オプシン及びリン酸化非依存性アレスチン変異体を含む融合タンパク質をトランスフェクトすることを含む。

いくつかの場合では、光活性を欠く細胞に、光レセプター機能を提供する方法が開示される。いくつかの実施形態は、オプシン・ポリペプチドの不活性化を増加させる方法、ここで前記方法は、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含むオプシン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、に関する。いくつかの実施形態は、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで前記方法は、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含むオプシン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、に関する。

本出願で記載される方法において使用されるオプシン・ポリペプチドは、1つ以上のリン酸化部位に関連する少なくとも1つの変異、を含むことがある。いくつかの実施形態では、前記変異は、C-末端リン酸化部位と関連している。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記変異は、オプシン・ポリペプチドの1つ以上のリン酸化部位に、アミノ酸の置換、欠失、又は付加を生じる。いくつかの実施形態では、前記オプシン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)4に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態は、オプシン・ポリペプチドの不活性化を増加させる方法、ここで前記方法は、前記オプシン・ポリペプチドを、アレスチン・ポリペプチドと非リン酸化オプシンとの間の結合を増加させる変異、を有するアレスチン・ポリペプチドに接触させることを含む、に関する。いくつかの実施形態は、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで前記方法は、アレスチン・ポリペプチドと非リン酸化オプシンとの間の結合を増加させる変異、を有するアレスチン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む、に関する。

いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)1に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)2に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。いくつかの実施形態では、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。

いくつかの実施形態は、内側網膜細胞(inner retinal cell)に光レセプター機能を提供する方法、ここで前記方法は、本出願で記載される組成物の有効量、を投与することを含む、に関する。いくつかの実施形態は、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで前記方法は、本出願で記載される組成物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを投与することを含む、に関する。いくつかの実施形態は、対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで前記方法は、本出願で記載される組成物の有効量、を投与することを含む、に関する。

いくつかの実施形態では、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー及び黄斑ジストロフィー；他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター能の喪失に起因する症状、である。

いくつかの実施形態は、本出願で記載される組成物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを投与することを含む、光活性化可能な細胞を作成するための方法、に関する。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド発現ベクターを更に含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼをコードする核酸配列を更に含む。

いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムの中に組み込む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムの中に組み込む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、構成的に発現する。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、一過的に発現する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、神経幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、内側網膜細胞(inner retinal cell)を含む。いくつかの実施形態では、前記内側網膜細胞(inner retinal cell)は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。

「細胞外マトリックス分解酵素」：
細胞外マトリックス分解タンパク質を、コラゲナーゼ、ヒアルロナン・リアーゼ(hyaluronan lyase)、ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼII、ヘパリナーゼIII、コンドロイチンABCリアーゼ、コンドロイチンACリアーゼ、メタロプロテイナーゼ、ADAMTS、プラスミン（セリン・プロテアーゼ・プラスミン、又はその切断型マイクロプラスミン［オクリプラスミン(Ocriplasmin)］）、好中球エラスターゼ及びカテプシンG、ノイラミニダーゼ、N-グリカナーゼ、O-グリカナーゼ、及びプロナーゼ、からなる群より選択することがある。特に好ましい酵素を、Streptomyces hyalurolyticus由来のヒアルロナン・リアーゼ(EC 4.2.2.1; Genbank アクセッション(accession) CP003990内に含まれる)；ウシ精巣由来のヒアルロニダーゼ(EC 3.2.1.35)；プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）由来のコンドロイチンABCリアーゼ(EC 4.2.2.4)及びフラボバクテリウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）由来のヘパリナーゼIII(EC 4.2.2.8; Genbank アクセッション(accession) L12534、好ましくはバージョンL12534.1)、からなる群より選択することがある。本発明において使用するための酵素は、市販供給元、例えば、シグマ-アルドリッチ（Sigma Aldritch）、から入手可能である。

「分解する」又は「分解酵素」とは、タンパク質又は糖(carbohydrate)を分解することができる酵素を意味する。タンパク質は、例えば、そのペプチド結合の加水分解によって、ペプチド配列又はアミノ酸に分解されることがある。糖(carbohydrate)は、オリゴ糖又は単糖単位に分解されることがある。タンパク質及び／又は糖(carbohydrate)は、完全に又は部分的に分解されることがある、これはその一部がより小さなフラグメントに分解されることがあり、一方で、前記タンパク質及び／又は糖(carbohydrate)の残りは、その本来の(native)形態であることがある、ということを意味する。好ましくは、分解を受けた細胞外マトリックス・タンパク質又は糖(carbohydrate)は、細胞に対する構造的な及び／又は生化学的な保持体を提供するための作用能をいくらか失っていて、その結果、硝子体の中に導入された核酸配列は、網膜細胞により良好にアクセスできるようになる。特に、分解を受けた細胞外マトリックス・タンパク質は、核酸配列(例えば、ウイルス・ベクターなどの遺伝子デリバリー・ベクター)が、硝子体内で、並びに網膜の中に向かって及び網膜を横切って、動くことを、妨げるためのその機能の一部又は全部を、失っている。細胞外マトリックス機能のいかなる喪失も、眼又は視覚に何ら重大な悪影響を及ぼさない程度に、十分に最小限である。

本出願で、細胞外マトリックス分解酵素とは、その活性フラグメントを含む。活性フラグメントは、本来の(native)酵素の一部又はより短い型であることがある、そしてそれは、細胞外マトリックス分解酵素として機能する作用能を保持する、即ち、それは、本出願で定義されるように、細胞外マトリックス・タンパク質又は糖(carbohydrate)を分解する作用能を保持する。活性化フラグメントは、本来の(native)酵素の配列の70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%を含むことがある。

本出願で、酵素とは、1種以上の酵素を含む。従って、本発明は、単一の酵素を、又は2種以上の酵素の組み合わせを、同時に投与することを提供する。好ましくは、2種以上の酵素が提供される場合、それらをそれぞれ、上記で定義された群から選択する。2種以上の酵素を投与する場合、それらを、別々に、連続して提供することがある、又は2種以上を、組み合わせて、提供することがある。好ましくは、2種の酵素を、組み合わせて、投与する。2種以上の別々の用量の酵素を提供する場合、これらのうちの任意の1種以上を、前記核酸配列と組み合わせて、提供することがある。

本発明において使用するための酵素は、任意の好適な供給源に由来することがある。前記供給源は、哺乳動物であっても非-哺乳動物であってもよい。それは、動物の、植物の、バクテリアの、又は古細菌の(archeabacterial)供給源に由来することがある。哺乳動物の場合、それは、ヒト酵素であることが好ましい。それを、そのような供給源から単離する、又は精製することがある。それを、組換えタンパク質として産生することがある。或いは、それを合成的に作成することがある。

本発明において使用するための酵素の、核酸配列及びアミノ酸配列は、当該分野で公知である。

本出願で、酵素には、本来の(native)酵素の、フラグメント及び誘導体、が含まれる。好ましくは、フラグメント又は誘導体は、本来の(native)酵素の50%、60%、70%、80%、90%、又は少なくとも95%の長さにわたって、本来の(native)酵素と少なくとも70%、75%、80%、85%、若しくは90%、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は少なくとも99%の配列同一性を共有する。

本発明において使用するための酵素を、乾燥形態で提供することがある、これは、脱水形態又は凍結乾燥形態のどちらも含む。典型的には、酵素を、凍結乾燥形態で提供する。或いは、酵素を水溶液として、例えば、所定の濃度及び容量で、水に予め溶解して、提供することがある。本発明の製品又はキットは、乾燥形態の酵素を提供することに適合していることがある、任意選択的に溶解するための指示書を伴っていることがある、ということが想定されるが、投与するためには、水性形態が好ましい。従って、本発明の方法は、乾燥した酵素を使用して酵素液を作成することを含むことがある。好ましくは、これを、水性の又は非-水性の溶媒中に、前記酵素を溶解するによって、又は再構成することによって、達成する。好適な溶媒は、非-毒性である溶媒である、及びヒト又は動物での使用に好適なものである。好ましくは、好適な溶媒は、滅菌したものである。好適な溶媒の例は、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水である。乾燥したタンパク質を溶解するための方法は、当該技術分野において公知である。

酵素を同時に投与することには、同じ治療中に、別々に、連続的に、又は配合して投与することが含まれる)。酵素を投与することを、硝子体液に限定することがある。酵素は、網膜細胞をターゲットとする必要はない。細胞外マトリクス分解酵素の投与を含む本発明の態様においては、酵素を、本発明のベクター、ポリペプチド又は組成物と、別々に、又は配合して（即ち、単一の組成物として）提供することがある。別々に提供する場合、それらを、同じ賦形剤で、又は異なった賦形剤で、提供することがある。そのような実施形態では、それらを、例えば、別々のマイクロカプセル内に、別々に保持してもよい。従って、好ましい実施形態では、前記酵素を、別々に注射投与することが可能な液体として、好適にはカプセル又はシリンジなどの別々の容器に入れて、提供することがある。

図１．桿体の光レセプター（rod photoreceptor）の不活性化メカニズムが存在する下で、オプシン-駆動の光応答の動態を評価するために、G-タンパク質活性化に関する、BRETアッセイを使用する：図１ａ）G-タンパク質活性化のレシオメトリックBRETアッセイ(ratiometric BRET assay)。BRETが、黄色蛍光タンパク質（ビーナス(Venus)）で標識した遊離Gβγ-二量体と、ナノルシフェラーゼ(Nanoluciferase)に融合した膜局在GRK3-フラグメント(470nmの光を連続的に放出する)との間で起こり、その結果535nmの光の放出がもたらされた場合に、G-タンパク質ヘテロ三量体の解離が検出される。G-タンパク質ヘテロ三量体が再会合することにつれて、GRK3フラグメントの結合部位は、Gαサブユニットによって遮断され、535nmの蛍光の放出は減少する。BRET比を、535nmで放出された光/470nmで放出された光、として計算する；図１ｂ）G-タンパク質活性化に関する、BRETアッセイ(BRET Go-Black)によるロッド-オプシン駆動の光応答の時間分解能は、セカンド・メッセンジャー Glosensor Gsoアッセイ(Glo + Gso- Grey)よりも速い；図１ｃ-１ｄ）フラッシュ前のベースライン(=0)及び野生型ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの最大応答(=1)、に対して標準化した1s 470nm光(14.1 log光子)に対するBRET応答の経時変化。応答は、G-タンパク質レセプター・キナーゼ1(GRK1)及び／又は視覚アレスチン(Arr)の何れかの存在下における、ｃ）野生型ロッド・オプシン(rod opsin)(Rod WT-塗り潰したマーカー)、又はｄ）リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(rod opsin)6A変異体(ロッド6A-塗り潰していないマーカー)、を示す；図１ｅ）ベースライン標準化したBRET応答を、スケーリング因子(scaling factor)(A)、1相指数関数結合曲線(one-phase exponential association curve)(R_on)、及び1相指数関数減衰曲線(one-phase exponential decay curve)(R_off)、からなる、単純な二重指数関数モデル(simple dual exponential model)(左側のパネル)を用いて、モデル化する。このモデルを規定する3 つのパラメータ、A、T_on、及びT_off、を調整して、非-線形回帰を使用しながら、モデルをデータに適合させる(右側のパネル)。最良適合パラメータAを応答強度の尺度として使用する、及びT_offを応答減衰速度の尺度として使用する。図１ｆ）相対的な応答強度、それぞれの条件に対する、最良適合スケーリング因子(best fit scaling factor) (A)を、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)の最良適合スケーリング因子(best fit scaling factor) (A_{rod_WT})で割ったものとして測定する。図１ｇ）それぞれの条件に対する最良適合T_off(s)を、ロッド・オプシン(rod opsin)ポジティブ・コントロールの最良適合T_offで割ったものとして測定された、相対的な応答減衰を示す(T_{off _RodWT})。

ｂ，ｅ）に示されるGlosensor及びBRETデータは、n = 3の再現(replicate)についての、平均±平均の標準誤差、である。ｃ，ｄ，ｆ－ｇ）に示すBRETデータは、3つの別々のトランスフェクションから求めた、n=8-9の再現(replicate)の、平均±平均の標準誤差、である。統計的な解析をするために、両側ウィルコクソン符号順位検定を用いて、それぞれの条件をロッド・コントロールと比較した(理論上の中央値=1)。** p < 0.01； * p < 0.05；星印が表示されていない場合は有意ではない。灰色の星印=未補正アルファ(0.05)で有意、黒色の星印=Sidak補正アルファで有意(Aについては0.007、T_offについては0.009)。

図２．GRK1の抑制作用が無くても、リン酸化非依存性アレスチン変異体は、ロッド・オプシン活性の寿命を短縮する：図２ａ－２ｂ）野生型視覚アレスチン(ArrWT)の、又は非リン酸化活性化ロッド・オプシン(rod opsin)に対して、中間の親和性(Arr3A)、若しくは強い親和性(ArrKEQ3A)を有するアレスチン変異体の、何れかと共-トランスフェクト(co-transfect)した場合における、ａ）野生型ロッド・オプシン(RodWT)、及びｂ）リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(rod opsin)6A変異体(Rod6A)、についてのBRET光応答の経時変化。応答は、1s 470nm光(14.1log光子)に対するものである。データを、フラッシュ前のベースライン(=0)及びRod WTの最大応答(=1)、に対して標準化する。図２ｃ）アレスチン変異体Arr3A及びArrKEQ3Aを添加した場合、RodWT及びRod6Aの両方の応答減衰(最良適合T_offにおける倍数変化として測定した、s)は、減少する。図２ｄ）RodWT及びRod6Aの両方の応答強度(最良適合スケーリング因子Aにおけるスケーリング因子変化として測定)は、ArrWT及びArr3Aの存在下では部分的に増加するが、ArrKEQ3Aの存在下では増加しない。

データは、3つの別々のトランスフェクションから求めた、n=9の再現(replicate)の、平均±平均の標準誤差、である。

図２ｃ－２ｄ）では、両側ウィルコクソン符号順位検定を用いて、それぞれの条件をロッド・コントロールと比較した(理論上の中央値=1)。* p < 0.05；** p < 0.01；星印が表示されていない場合は有意ではない。灰色の星印=未補正アルファで有意(0.05)、黒色の星印=Sidak補正アルファで有意(A及びT_offについては0.007)。

図３．ロッド・オプシン(rod opsin)-アレスチン融合体は、正常な細胞内局在を示す。図３ａ）ロッド・オプシン-アレスチン3Aのバイシストロニックな(bicistronic)及び融合した構築物の図。種々の生物物理学的な特性及び長さを有するリンカーを使用して、13種の融合した構築物を作製した。ロッド・オプシン(rod opsin)、アレスチン及びリンカーの長さはスケール通りであり、構築物のサイズをキロ・ベース・ペア(kilo base pairs)で右側に示す。図３ｂ）野生型ロッド・オプシン(rod opsin)(Rod WT)のみ、リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(Rod opsin)6Aのみ、アレスチン3Aと共-発現したロッド・オプシン(rod opsin)6A (P2A)、又はリンカーによってアレスチン3Aにつながれたロッド・オプシン(rod opsin)6A、の異種性発現（抗-ロドプシン4D2で標識した、Hek293T細胞中における）。スケール・バーは10μm。

図４．ロッド・オプシン(Rod opsin)6A-アレスチン3A融合体は、共-発現と比較して、時間分解能を改善したが、応答強度を減少させた：図４ａ）リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(rod opsin)変異体(Rod6A)及び中間的な親和性のアレスチン変異体3A(Arr3A)についての、共-発現又は融合体に対する、BRET光応答の経時変化。応答は、1s 470nm光(14.1log光子)に対するものである。データを、フラッシュ前のベースライン(=0)及びロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)の最大応答(=1)、に対して標準化する；図４ｂ）応答強度（最良適合スケーリング因子（best fit scaling factor）Aの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定）は、バイシストロニック(bicistronic)P2Aベクターを使った共-発現(破線)と比較して、融合した構築物では、減少する、リンカー長又は組成物と強度との間には明白な関係はなかった。図４ｃ）応答減衰（最良適合T_off, sの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定）は、P2Aを使った共-発現(破線)と比較して、ほとんどの融合した構築物では、より速い。リンカーR3は、特に非常に遅く不活性化した。図４ｄ）Rod6A-Arr3A融合体の応答強度及び応答減衰（スケーリング因子(scaling factor)A及びT_offとして、それぞれ、測定）を比較すると、ほとんどのリンカー長及び組成物は、同様の応答特性を生じる、ことを示す。全ての融合した構築物の中で、ERK 10nmリンカーは、速い応答減衰を維持しながら、最大の応答強度となった。

示したデータは、4つの別々のトランスフェクションから求めた、P2A及び融合体についてはn=10-13の再現(replicate)の、及びRodWTについてはn = 20の再現(replicate)の、平均±平均の標準誤差、である。

図５．メタ-II崩壊が増加したロッド・オプシン(rod opsin)変異体は、可変的な応答強度を有する、及びG-タンパク質を不活性化する：図５ａ）ロッド・オプシン(rod opsin)野生型(RodWT)、及びより速いメタ-II崩壊を有すると報告されている変異体、についてのBRET光応答の経時変化。応答は、1s 470nm光(14.1 log光子)に対するものである。データを、フラッシュ前のベースライン(=0)及びロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)の最大応答(=1)、に対して標準化する。図５ｂ）応答強度（最良適合スケーリング因子（best fit scaling factor）Aの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定）は、RodWTと比較して、メタ-II崩壊の変異体については、一般的により小さいが、Y74F及びY306Fは、それぞれ、同等な強度及びより大きな強度、を有する。図５ｃ）応答減衰（最良適合T_off, sの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定）は、ロッド・オプシン(rod opsin)メタ-II崩壊の変異体にわたって変化し、E122Q、Y136F及びY306Fはより速い応答を示す、並びにL59Q及びI189Pはより遅い応答に向かう傾向を示す。図５ｄ）ロッド・オプシン(rod opsin)変異体の相対的な応答強度及び応答減衰を比較すると、2つのパラメータは強く相関していないことが示される。

示したデータは、3つの別々のトランスフェクションから求めた、n=9-11の再現(replicate)の、平均±平均の標準誤差、である。図５ｃ－５ｄ）では、両側ウィルコクソン符号順位検定を用いて、それぞれの条件をロッド・コントロールと比較した(理論上の中央値=1)。* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001、星印が表示されていない場合は有意ではない。灰色の星印=未補正アルファで有意(0.05)、黒色の星印=Sidak補正アルファで有意(A及びT_offについては0.007)。

図６ａ－６ｅ．ロッド・オプシン(rod opsin)野生型(Rod WT)の応答特性とリン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(rod opsin)(Rod6A)の応答特性との比較：図６ａ）1s 470nm光(14.1 log光子)に対するBRET応答の時間経過。データを、フラッシュ前のベースライン(=0)及びロッド・オプシンの最大応答(=1)、に対して標準化する。図６ｂ）RodWTに対して標準化した最良適合スケーリング因子(A)として測定した場合、応答強度は、Rod6AとRodWTとの間で類似している、両側マン-ホイットニーU-検定、p = 0.694。図６ｃ）最良適合Toff(s)として測定した応答減衰は、RodWTと比較して、Rod6Aにおいてより遅い、両側マン-ホイットニーU-検定、p = 0.007。図６ｄ）感度（Log EC50、Glosensor Gsoアッセイを用いてlog 光子/cm2/s、として測定）は、Rod6AとRodWTとの間で、同等である。図６ｅ）Glosensor Gsoアッセイを用いて測定した、強さを増加させた470nm光 (11-15 log光子)に対する、Rod WT又はRod 6A駆動の応答に適合させた放射照度応答曲線(irradiance response curves (IRC))。

データは、平均±平均の標準誤差、である。BRETデータは、4つの別々のトランスフェクションから求めた、n=11-12の再現(replicate)の、平均、である。Glo Gsoデータは、3回の独立した実験の平均である。** p > 0.01、星印が表示されない場合p > 0.05。

図７．様々な光強度に対するロッド・オプシン(rod opsin)-駆動のBRET応答のモデリング：強さを変えた470nm光 (12.3~14.6 log光子/cm2/s)の1sフラッシュに対する、ロッド・オプシン(rod opsin)-駆動のBRET応答を、BRETアッセイを用いて測定し、非-線形回帰を用いて、単純な3-パラメータ・モデル(A、Ton及びToff)に適合させた。種々のレベルに活性化した同じオプシンは、応答開始及び応答減衰について同様の速度を有するはずである、図７ａ）応答減衰速度（Toffとして測定した）は、種々の強さのフラッシュ（即ち、異なるレベルのG-タンパク質活性）に対する応答全体にわたって、一致している。図７ｂ）応答減衰は、応答強度と有意に相関しない(ピアソンの積率相関係数(Pearson’s product-moment correlation)、r= -0.23、R2 = 0.05、p = 0.097)。図７ｃ）応答開始(Tonとして測定した)もまた、強度全体にわたって一致する、及び図７ｄ）は、応答強度と有意に相関しない（ピアソンの積率相関係数(Pearson’s product-moment correlation)、r = 0.15、R2 = 0.02、p = 0.275)。図７ｅ）応答強度は、放射照度依存性であり、より高い強度で、G-タンパク質活性レベルの増加と一致する。これらのデータを、log EC50 = 13.31、R2 = 0.74の放射照度応答曲線(irradiance response curves (IRC))に、適合させることができる。図７ｆ）2つのパラメータ、Ton及びToff、は、より長い寿命の応答はより短い応答開始を示し、有意に負に相関する(ピアソンの積率相関係数(Pearson’s product-moment correlation)、r=-0.66、R2 = 0.43、p<0.0001)。

図７ａ、７ｃ、７ｅについて、モデル比較(F-検定)を実施して、データが、水平直線（帰無仮説）によって、又は非-線形回帰を使用してS字状の放射照度応答曲線(IRC、代替仮説)によって、より良好に適合したかどうかを判定した。帰無仮説が棄却されたデータ（例えば、応答強度(response amplitude) vs 強さ(intensity)、（F(2,50)=7086、p<0.0001））については、最良適合IRCを表示する、応答減衰及び応答開始 vs 強さについては、帰無仮説は棄却されなかった(p >0.05)。エラー・バーは、平均の標準誤差を示す。

図７ｂ，７ｄ，７ｆについては、最良適合の線形トレンド直線（trendline）を表示する(有意な相関については実線、有意でない相関については破線)。データは、3回の独立した実験（それぞれ3回の技術的な再現）からのものである。

図８．ロッド・オプシン(rod opsin)6A-アレスチンWT融合体は、共-発現と比較して、応答強度は減少するが、時間分解能はより速い。図８ａ）リン酸化欠損(phosphonull)ロッド・オプシン(rod opsin)(Rod6A)と野生型アレスチン(ArrWT)についての、共-発現又は融合体に対する、BRET光応答の経時変化。応答は、1s 470nm光(14.1 log光子)に対するものである。データを、フラッシュ前のベースライン(=0)及びロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)の最大応答(=1)、に対して標準化する。図８ｂ）応答強度(最良適合スケーリング因子（best fit scaling factor）Aの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定)は、バイシストロニック(bicistronic)P2Aベクターを使った共-発現(破線)と比較して、融合した構築物について、減少する、リンカー長又は組成物と強度との間に明白な関係はなかった。ほとんどの融合体についての応答強度は、最も良い成績である10nmリンカーを使ったRod6A-Arr3A融合体(点線)と、同等である。図８ｃ）応答減衰（最良適合T_off, sの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定）は、P2Aを使った共-発現(破線)と比較して、全ての融合した構築物について、より速い。R6-ArrWT融合体の応答減衰は、最も良い成績であるRod6A-10nm-Arr3A融合体(点線)よりも遅い。図８ｄ）Rod6A-ArrWT融合体の応答強度及び応答減衰(それぞれ、スケーリング因子A及びToffとして測定)を比較すると、Rod6A-ArWT融合体は全て、最も良い成績であるRod6A-Arr3A融合体、Rod6A-10nm-Arr3Aに対して、より遅い減衰及び同様の応答強度を有することが示される。

示したデータは、4つの別々のトランスフェクションから求めた、Rod6A-ArrWT融合体についてはn=12-13の再現(replicate)の、及びRodWTについてはn = 17の再現(replicate)の、平均±標準偏差、である。

図９．ロッド・オプシン(rod opsin)メタ-II崩壊の変異体は、正常な細胞内局在を有する。野生型ロッド・オプシン(rod opsin)(Rod WT)又はロッド・オプシン(rod opsin)メタ-II崩壊の変異体の、異種性発現（抗-ロドプシン1D4抗体を用いて標識した Hek293T細胞における）。スケール・バーは10μm。図１０において、ロッド・オプシン(rod opsin)メタ-II崩壊の変異体をリン酸化非依存性アレスチン変異体と組み合わせた場合に、検出可能な利点が無いことを示す：図１０ａ）1s 470nm光(14.1 log光子)に対するBRET光応答の時間経過。データを、フラッシュ前のベースライン(=0)及びロッド・オプシン・コントロール(rod opsin control)の最大応答(=1)、に対して標準化する。Rod WTに適用したメタ-II崩壊の変異体を塗り潰した円で示し、Rod6A-10nm-Arr3A融合体(6103)に適用したメタ-II崩壊の変異体を塗り潰していない円で示した。図１０ｂ）応答強度（最良適合スケーリング因子（best fit scaling factor）Aの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定）は、メタ-II崩壊の変異、を有する全てのRod6A-10nm-Arr3A融合体について有意に減衰し、メタ-II崩壊変異を有さないRod6A-10nm-Arr3Aの相対的な強度と同等である。モデルを、E122Q R6-10nm-Arr3Aについての4/11の再現(replicates)に正確に適合させることができず、平均がより大きな強度の再現(replicate)の方向に偏ってしまうことを避けるために、欠損値には、ゼロの応答強度値を与えた。図１０ｃ）応答減衰（最良適合T_off, sの、ロッド・オプシン・ポジティブ・コントロール(rod opsin positive control)からの倍数変化として測定）もまた、メタ-II崩壊の変異、を有する全てのRod6A-10nm-Arr3A融合体について、同等である。3-パラメータ・モデルを用いて適合させることができたE122Q Rod6A-10nm-Arr3Aの応答について、相対的なToffを示す（7/11再現(replicate)）。

示したデータは、3つの別々のトランスフェクションから求めた、n=8-12の再現(replicate)の、平均±平均の標準誤差、である。ｂ－ｃ）において、両側ウィルコクソン符号順位検定を用いて、それぞれの条件をロッド・コントロールと比較した(理論上の中央値=1)。* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001、星印が表示されていない場合は有意ではない。灰色の星印=未補正アルファで有意(0.05)、黒色の星印=Sidak補正アルファで有意(A及びT_offについては0.006)。

図１１は、光遺伝学的なウイルス導入遺伝子の模式図を示す。AAV2 Quad-YF Ａ）Rod6A-10nm-Arr3A、Ｂ）ロッド・オプシンE122Q、及びＣ）ロッド・オプシン野生型。Ｂ）及びＣ）を、T2Aペプチドを介して、蛍光mCherryレポーターと共-発現させる。

図１２は、Rod6A-10nm-Arr3A AAVで形質導入した網膜からの光応答を示す。Ａ）光応答ユニット全体にわたる平均的な発火速度(スパイク／秒)。Ｂ）個々のユニットからの代表的な応答。全ての代表的なトレースは、ペリイベント・ラスタ(perievent raster)(上部の最初の試行)、及び関連するペリイベント発火率ヒストグラム(perievent firing rate histograms)(ビン・サイズ(Bin size)=50ms)、を示す。光刺激のタイミングを、水平方向の黒いバーで示す。エラー・バーは、平均の標準誤差を示す。刺激の強さを、log 桿体の有効な光子/cm²/s (rod effective photons/cm²/s)で示す。

図１３．ロッド・オプシンE122Q AAVで形質導入した網膜からの光応答。Ａ）光応答ユニット全体にわたる平均的な発火(スパイク／秒)。Ｂ）異なる個々のユニットからの代表的な応答。全ての代表的なトレースは、ペリイベント・ラスタ(perievent raster)(上部の最初の試行)、及び関連するペリイベント発火率ヒストグラム(perievent firing rate histograms)(ビン・サイズ(Bin size)=50ms)、を示す。光刺激のタイミングを、水平方向の黒いバーで示す。エラー・バーは、平均の標準誤差を示す。刺激の強さを、log 桿体の有効な光子/cm²/s (rod effective photons/cm²/s)で示す。

図１４．ロッド・オプシン(Rod opsin) E122Q-P2A-mCherry AAVで形質導入した網膜内でのmCherryレポーターの発現。網膜を、双極細胞側を上にして表示する－小さな明るいドットは、形質導入された双極細胞を個々に表す。

図１５．ロッド・オプシン(rod opsin)バリアントは、本来の(native)ロッド・オプシン(rod opsin)と比較して、光に対して、より大きい、及びより持続性の低い、応答を示す。光応答を示す、電極部位での発火における変化(ベースライン平均からの標準偏差で表される－ z-スコア)を、ロッド・オプシン(Rod opsin)E122Q(A、n = 6ユニット、網膜1個)及びRod6A-10nm-Arr3(B, 6103, n = 15ユニット、網膜3個)を駆動するウイルスで処理した網膜について、示した。比較するために、本来の(native)ロッド・オプシンで処理した網膜(n = 21、網膜4個)における応答を、各プロットにおいて、黒色で示した。全ての場合で、時間分解能について最適化されたバリアントにおいて、野生型コントロールにおけるよりも、より急激な、及びより短い時間持続する、光応答が存在することに留意されたい。光刺激のタイミングを、水平方向の黒いバーで示す、データは平均的な発火を示す。白色の光刺激は、15 log桿体の有効な光子/cm²/s (rod effective photons/cm²/s)である。

実施例1
オプシン・シグナル伝達の動態を測定するための、G-タンパク質活性化の生細胞アッセイ。本目的は、異種性発現下でのロッド・オプシン(rod opsin)光応答の時間分解能を改善すること、であった。これを達成するために、我々は、生きている細胞の環境において、多数の可能性のある介入方法(potential interventions)をスクリーニングするのに適した、ロッド・オプシン(rod opsin)活性の寿命（それがどのくらい速く不活性化するか）を評価するためのハイ-スループットなアプローチを必要とした。我々は、バイオルミネッセンス共鳴エネルギー移動(bioluminescence resonance energy transfer (BRET))に基づく、G-タンパク質活性化のレポーターを、ロッド・オプシン(rod opsin)を発現するHEK293細胞に適用することを、選択した。このアッセイでは、蛍光Venus標識Gβγ二量体(sVβγ)を、ナノルシフェラーゼで標識したGRK3フラグメント(nLuc-GRK3、図１ａ)と一緒に使用することによって、G-タンパク質ヘテロ三量体の解離を検出する。nLuc-GRK3フラグメントは、遊離Gβγに対して高い親和性を有し、Venusによって放出される光：ナノルシフェラーゼによって放出される光、の比率、が増大すること、として検出されるBRETが生じる。Gαサブユニットが外因性に発現すると、このアッセイは、単一のG-タンパク質シグナル伝達経路に対して、特異的になる。ロッド・オプシン(Rod opsin)は、HEK293細胞において、Gαi/o/tクラスのG-タンパク質を、効率良く、活性化することがある[Ballister et al, 2018, BMC Biology 16, 10]。このケースにおいて、我々は、Gαoに焦点を当てた、なぜなら、これが、中枢神経系において広く発現するGアルファ・サブユニットであるからである、及びこれが、視力回復のために、光遺伝学的な療法がターゲットとする網膜双極細胞で発現するGアルファ・サブユニットであるからである。

このレポーター系の構成要素と一緒に、ロッド・オプシン(rod opsin)を共-発現するHEK293細胞において、フラッシュの光により、BRETは増大した(図１ｂ)。Gαi/o/t経路が影響を及ぼすセカンド・メッセンジャーcAMPについてのルミネッセンスのレポーターであるGlosensorを使用して、ロッド-オプシン駆動の光応答は、生細胞において、既に検出されている[Bailes et al, 2012, PLoS ONE 7, e30774; 2013, Proc Biol Sci 280]。並べて比較すると、我々は、BRETシグナルは、Glosensor応答の場合よりも、はるかに早く上昇する、及びはるかに早く低下する、ことを見出した(図１ｂ)。これは、BRETシグナルによって、光伝達カスケードにおけるより早い段階（G-タンパク質の活性化）を測定することができること、及びBRETシグナルが、オプシン活性化の時間枠を探索するのに優れていること、と合致する。

実施例2
視覚アレスチンを用いて、ロッド・オプシン(rod opsin)応答のクエンチング（quenching）を試験した。我々は最初に、桿体の光レセプター（rod photoreceptor）の中に通常存在する、ロッド・オプシン(rod opsin)を不活性化するための構成要素を導入することによって、異種性に発現しているロッド・オプシン(rod opsin)の時間分解能を改善することを試みた。視覚アレスチン(Arr)をロッド・オプシン(rod opsin)と共-発現させても、それ自体による、ロッド・オプシン(rod opsin)光応答への劇的な効果は無かった(図１ｃ)。しかし、ロッド・オプシン(rod opsin)の本来の(native)G-タンパク質共役レセプター・キナーゼ(GRK1)を、Arrと一緒に、更に含めると、光フラッシュに対する応答強度と寿命が、大きく変化した(図１ｃ)。強度の減少は、Arrを発現させること無く、GRK1を適用した場合にも観察されたので、主に、アレスチン非依存性の効果であるようであった(図１ｃ)。BRET光応答に対するこれらの効果が、ロッド・オプシン(rod opsin)シグナル伝達に関する、2段階のアレスチン依存性のクエンチング(quenching)を導入したことによるものであることを確認するために、我々は、C-末端リン酸化部位を除去するための変異を導入したロッド・オプシン(rod opsin) (Rod6A)を用いた実験を繰り返した。この変異を導入したオプシンは、GRK1によってリン酸化されないので、GRK1及びArrの発現による影響を受けないはずである。これは実際にそうように表れた。なぜなら、GRK1及びGRK1+Arrの発現の主要な効果は、Rod6A駆動の光応答に欠けていたからである(図１ｄ)。我々は、Rod6Aにおけるより遅い応答減衰は別として、野生型ロッド・オプシン(rod opsin)(Rod WT)及びRod6A変異体の応答特性に差異を観察しなかった (図６)。

これらのデータを定量的に解析することを容易にするために、非-線形回帰を用いて適合させる、単純な3-パラメータ・モデルを用いて(図１ｅ)、BRET応答のプロフィールをパラメーター化した。このモデルは、応答開始(Ron)についての指数関数結合曲線（exponential association curve）；応答減衰(Roff)についての指数関数減衰曲線（exponential decay curve）；及びスケーリング因子（応答強度の尺度、A）、から構成された。このモデルの構成要素を規定する3つのパラメータは、Ton、Toff、及びAである。Tonは、BRETシグナルが蓄積する速度によって規定される、及び、光によるオプシン活性化は、事実上瞬時であるため、BRETアッセイ応答の潜時(latency)によって主に規定される。Toffは、BRETシグナル伝達の減衰速度によって規定される、並びにオプシン不活性化の速度、及び更なるG-タンパク質活性化がない場合において、BRETシグナル伝達がベースラインにまで回復する速度、の両方の影響を受ける、と先験的に、予想される。Aは、BRET応答のピーク強度を反映する。時間分解能を高めるという我々の目的を満たすために、我々は、(オプシンG-タンパク質シグナル伝達効率のアッセイとして)ピークのシグナル強度に影響を与えること無く、光活性化したオプシンの寿命を最小化する介入方法(interventions)を同定すること(Toffの減少に反映される)、を目的とした。従って、応答強度自体が変わると、このアッセイにおけるToffの変化が誘導されるかどうか、ということが、重要な検討事項である。我々は、フラッシュ強度の変動を使用して、ある範囲の応答強度を生成することによって、この可能性を試験し、実際に、A及びToffは、有意に相関しないことを見出した。

このアプローチを適用することにより、RodWTの応答強度(A)は、GRK1（RodWTと比較したウィルコクソン符号順位検定、p = 0.004）、又はGRK1+Arr（p = 0.008、図１ｆ）、の何れかと一緒に共-発現することによって、RodWT強度の約25%にまで、有意に減少すること、が確認された。この解析によれば、Rod WTにアレスチン単独を添加することに関連して、応答強度がわずかに増大し(p = 0.012)、それぞれ、Aは、0.57(SEM = 0.04)から0.71(SEM = 0.05)までであった。比較として、リン酸化欠損(phosphonull)Rod6Aの応答強度は、Arr(p = 0.496)又はGRK1+Arr(p = 0.164)、の何れかの存在下では、RodWTと同様のままであり(p = 0.301)、GRK1のみの存在下では、0.42のA(SEM = 0.04)へと、わずかに低下した(p = 0.008)。

Rod WT応答の減衰(T_off)がわずかに低下することが、アレスチンを添加した場合に見出され(p = 0.129)（Rod WTレベルの90%まで）、非リン酸化ロッド・オプシン(rod opsin)に対してアレスチンが低親和性であることと一致した（図１ｇ）。GRK1 + ArrをRodWTに添加した場合(p = 0.008)、減衰速度は2.5倍より速くなり（T_offは、166.16(SEM = 10.06)から65.57(SEM = 11.18)となる）、ロッド・オプシン(rod opsin)不活性化メカニズムがうまく回復することと一致した。興味深いことに、Rod+GRK1の光応答を、単一の指数関数結合関数(single exponential association function)を使用して、適合させることができ、これは、減衰の速度が、これらの条件下では本質的に検出不可能であるほどに十分に遅い、ということを示している。Arr(p = 0.004)又はGRK1(p = 0.008)を添加した場合に、Rod6Aの応答減衰は、RodWTよりも遅いままである。アレスチンによるオプシン不活性化がリン酸化依存性であることを考えると予想されるように(Vishnivetskiy et al., 2007)、GRK1のみをRod6Aと共-発現させた場合、T_offは、RodWTと同等であった(p = 0.820)。

実施例3
アレスチンのリン酸化非依存性変異体を試験した。これらの最初のセットの実験の顕著な結果は、GRK1の添加によって、応答強度の実質的な減少が引き起こされることであった(図１ｃ及び１ｆ)。この効果は、Rod6Aには存在しなかったが、Arrの発現を必要としなかったためにアレスチンとは無関係であった。このことから、この効果は、オプシンのリン酸化に大きく起因すると思われた。従って、GRK1を除くことは、応答強度を最適化することにとって好ましいと思われる。しかしながら、逆に、アレスチンは、応答寿命を短縮するために、GRK1-駆動のリン酸化を必要とする。この難問を解決することができそうな方策は、リン酸化非依存性アレスチン変異体を用いることである。これらのアレスチン変異体は、その「リン酸化センサー」が除去されていて、光活性化されているが非リン酸化であるオプシンに対する親和性が増加している。これらがロッド・オプシン(rod opsin)の時間分解能を改善することができれば、GRK1リン酸化の必要性を排除し、より大きな強度の応答を可能にする可能性があると、我々は推論した。

我々は、野生型アレスチン(ArrWT)又はアレスチン変異体のうちの1種（Arr3A及びArrKEQ3A、これらは、それぞれ、非リン酸化ロッド・オプシン(Rod opsin)に対して中間的な及び高い親和性を有する[Vishnivestkiy et al, 2007, J. Biol. Chem. 282, 32075-32083] ）と共-トランスフェクト(co-transfected)させたロッド・オプシン(rod opsin)を試験した(図２ａ)。高い親和性のアレスチンKEQ3A変異体は、野生型アレスチンがリン酸化活性化ロッド・オプシン(rod opsin)(P-R*)に対して有するのと同様のR*に対する親和性、を有することが報告されている。我々はまた、リン酸化欠損(phosphonull)Rod6Aを用いてアレスチン変異体を試験し、あらゆる効果が真にリン酸化非依存性であることを確認した(図２ｂ)。

両方のリン酸化非依存性アレスチンは、RodWTの寿命を有意に短縮した(図２ｃ；平均±SEM Toff = RodWTについては240.64 ±24.13、+Arr3Aについては69.07±8.03、及びRodWT+ArrKEQ3Aについては68.07±8.03；ウィルコクソン符号順位検定、RodWTと比較してArr3A及びArrKEQ3Aの両方についてはp = 0.004)。以前と同様に、RodWTの応答減衰は、ArrWTと共-トランスフェクト(co-transfected)した場合にわずかに減少した、及びより少ない程度のRod6A（平均±SEM Toff = RodWTについては160.19±21.2、Rod6Aについては299.32±53.7）。アレスチン変異体のR*に対する親和性がより高いほど、より速い不活性化に寄与するようであり、Rod6A + Arr3A又はArrKEQ3AについてのT_offは、RodWTよりも2.87倍及び3.23倍短い応答減衰を示す。

2種のアレスチン変異体間の顕著な差異は、応答強度に対するそれらの影響であり(図２ｄ)、ArrKEQ3AがRodWT及びRod6Aを、それぞれRodWTレベルの68%及び56%に、抑制する傾向があった(RodWTについてはp = 0.128、Rod6Aについてはp = 0.012)。一方、Arr3Aは、RodWTの応答強度(p = 0.004)及びRod6Aの応答強度(p = 0.008)を、それぞれ、野生型コントロール強度の162%及び146%にまで増加させ、ArrWTの効果と同等であった(Rod WTについてはp = 0.004、p = 0.008 Rod6A)。

実施例4
オプシン-アレスチン融合体を、オプシン不活性化の効率を改善するために、試験した。Rod6AとArr3Aの組み合わせは、応答強度に影響を及ぼすことなく、ロッド・オプシン(rod opsin)の時間分解能を改善した。我々は次に、これら2種のタンパク質を物理的に繋ぎ、融合体を作り出すことにより、更により効率的な不活性化が可能になるかどうかを検討した。この目的のために、我々は、種々のリンカーを有する一連の融合した構築物を設計し、どれがRod6AとArr3Aとの間の最適な相互作用を可能にするかを決定した(図３ａ)。これらには、高度な回転自由度を有する可撓性グリシン-セリン・リンカー；剛性α-ヘリックス形成リンカー、これは、2種のタンパク質の相互作用を制限する；準-可撓性リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーからなる、及びER/Kリンカー、これは交互に変わる電荷を有し、端部のどちらかにあるタンパク質ドメインとの相互作用をしにくくする、が挙げられる。我々はまた、種々のリンカーの長さも変えたが、これは、増加すると相互作用の頻度は減少する。

各々のRod6A-Arr3A融合体を、物理的に結合していない2種のタンパク質の共-発現と比較した。1:1の化学量論比を確保するために、我々は、図２のデータを生成するために使用した2つの構成要素についての発現ベクターを単純に共-トランスフェクトすること（co-transfecting expression vectors）から、自己切断P2A配列を使用する単一のバイシストロニックなベクター(single bicistronic vector)(Rod6A-P2A-Arr3A)を使用して、単一のペプチドから2つのタンパク質を生成することに、切り替えた[Kim et al, 2011, PLoS ONE 6, e18556]。融合体構築物を免疫染色すると(図３ｂ)、全ての融合体が、細胞膜に正しく局在し、十分に発現すること、が明らかになった。

全てのRod6A-Arr3Aの融合した構築物は、光応答を駆動する能力を保持したが(図４ａ)、応答強度は、2種のタンパク質の共-発現と比較して、1.7倍から2.4倍、減少した(図４ｂ)。応答寿命に目を向けると、バイシストロニックなベクター(bicistronic vector)を用いてArr3Aを導入することは、共-トランスフェクション研究（co-transfection studies）において以前に観察されたよりも、Toffに及ぼす影響が小さい、ことが最初に観察された (図２)。この原因は不明であるが、1つの説明は、強制的に1:1の化学量論にすると、この効果に有害な影響が及ぼされる、ということである。標識化は、T_offの低減を強め、Rod6AとArr3Aの共-発現と比較して、応答寿命は1.9倍から5.5倍、より短くなることが、全ての融合体で示された(図４ｃ)。

様々な融合した構築物全体にわたって応答パラメータを比較すると、まず、応答強度とT_offとの間には、強い関連性が無いことが明らかになった(図４ｄ)。これらのパラメータが、このデータセットにおいて、少なくとも部分的に分離可能であることを意味し、これは、我々のアプローチが、高いシグナル伝達効率(大きなA)と短い寿命(低いT_off)とが最良に組み合わさった光応答、を提供する融合体を同定するのに好適であることを示唆する。全ての融合体のうち、Rod6A-10nm-Arr3Aは、速度と応答強度の最良のトレード-オフ（trade-off）を提供した。ほとんどの構築物が、外れ値をほとんど伴わずに、応答強度及び応答減衰について似たような値の周りにクラスター化したので(図４ｄ)、これらの条件の中で定量化した性能は、リンカーの長さ又は組成物に応じて、系統的に変化しなかった。

これらの融合タンパク質において、非リン酸化オプシンに対するArr3A変異体の親和性を増強させることを決定的に検討する、最終的な試験として、我々は、Rod6AとArrWTとの融合体を利用したデータセットを並行して収集した(図８)。これらの融合体は、Rod6AとArrWTを共-発現させるよりも速い減衰を示したが、それらは、Rod6A-10nm-Arr3AのようなRod6A-Arr3A融合体よりも、依然として遅かった。Arr3Aと比較して、ArrWTがより遅い減衰を示すことは、図２に示されるRod6AとArrWT及びArr3Aとを共-トランスフェクションしたことに関する我々の知見と一致し、R*に対するArr3Aの親和性の増加が、Rod6A-Arr3A融合体において、より速いT_offが観察されたことに寄与していることを示唆する。我々はまた、Rod6A-ArrWTが、2種のタンパク質の共-発現と比較して、1.7-2.4倍、応答強度を同様に減少させることを、見出した。

実施例5
メタ-II崩壊がより速くなっているロッド・オプシン(rod opsin)変異体を、光応答寿命を減少させるために、試験した。我々は、シッフ塩基加水分解の速度の増加を利用してロッド・オプシン(rod opsin)応答の寿命を減少させることができるかどうか、及びこれが応答強度にどのような影響を及ぼすか、を調べた。メタ-II崩壊がより速くなっているいくつかのロッド・オプシン(rod opsin)変異体を記載してきた。E122Q及びI189Pは、メタ-II崩壊速度が生来異なるオプシン（例えば、コーン・オプシン及びロッド・オプシンなど）を比較することによって同定された[Kuwayama et al, 2002, Biochemistry 41, 15245-15252]。Y74F及びL59Qは、高い高度の種のオプシンに保存された構造的な改変であり、ここで、選択圧は、熱安定性が減少したオプシンに進化が収束するように、働いた[Castiglione et al, 2008, Evolution 72, 170-186]。最終的に、網膜結合ポケット内の3つの保存されたチロシン(Y136F、Y223F、Y306F)及びアラニン(A132S、A132L)によって、メタ-II構造(meta-II confirmation)が安定化することが、独立して示されている[Goncalves et al, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19861-19866]。これら変異体のメタ-II崩壊の速度が増加していることは、精製したタンパク質をin vitro分光アッセイすることで明らかになった。そしてほとんどの場合、G-タンパク質活性化に対するこれらの変異体の影響は記載されていない。

免疫組織化学を用いて、我々は、全てのロッド・オプシン(rod opsin)変異体が、Hek293T細胞の細胞膜に正しく局在することを確認した(図９)。しかしながら、生細胞アッセイを用いて、我々は、2種のロッド・オプシン(rod opsin)変異体（Y223F及びA132L）が非-機能的であり、光に曝露した時に、BRET比率において、検出可能な変化を引き起こすことができないことを見出した(図５ａ)。残りのオプシン変異体は機能的であり、ほとんどにおいて、応答強度は野生型コントロールの24-41%まで弱くなり(図５ｂ)、例えば、L59Q（RodWTと比較したウィルコクソン符号順位検定、p = 0.002）、E122Q（p = 0.001）、A132S（p = 0.002）、Y136F（p = 0.002）及びI189p（p = 0.004）であった。Y74Fは、RodWTと同等な応答強度を有し(p = 0.999)、一方で、Y306Fには、RodWTの応答強度の1.13倍に向かう傾向があった(p = 0.032)。

ロッド・オプシン(rod opsin)変異体全体にわたる応答不活性化のパターンは、より複雑であった(図５ｃ)。小さな強度の応答を示す5つの変異体のうち、E122Q (p = 0.006)及びY136F (p = 0.014)は、ロッド・オプシンWTと比較して、2.03倍及び1.72倍より速く不活性化し、Y74F (p = 0.084)は、より短い応答寿命に向かう弱い傾向を示した。L59Q (p = 0.921)及びA132S (p = 0.232)は、より可変的な応答を有していたが、ロッド・オプシン WTと広く同等であるようであり、一方、I189P (p = 0.074)は、野生型コントロールに対して1.5倍遅い応答減衰の傾向を有していた。

予期しなかったことに、最大の応答強度を有するロッド・オプシン(rod opsin)変異体（Y306F）は、より速い不活性化を示し(p =0.014)、RodWTレベルの70%のT_offであった。実際、ロッド・オプシン(rod opsin)変異体のパネル全体にわたって、応答強度と減衰との間に相関はなく(ピアソンのR (Pearson's R) = -0.182、p = 0.1153) (図５ｄ)、自発的なオプシン不活性化をターゲットとすることは、時間分解能及び応答強度の両方を改善するための実行可能なアプローチを表している可能性を示唆している。

アレスチン結合をターゲットとすることとメタ-II崩壊とを組み合わせることが、時間分解能を更に増強させるのに役立つかどうかを調べるために、我々は、Rod6A-10nm-Arr3A構築物にE122Q、Y74F、Y136F又はY306F変異を適用することにより、それら（アレスチン結合をターゲットとすることとメタ-II崩壊）を組み合わせることを試みた(図１０)。我々は、どの変異を用いたかにかかわらず、応答パラメータA及びT_offは、それぞれ、メタ-II変異の有無にかかわらず、Rod6A-10nm-Arr3Aに類似することを、見出した。

実施例6
我々は、G-タンパク質活性化に関する生細胞BRETアッセイを用いて、原型的な動物オプシン（prototypical animal opsin）によって生じるエクストピックな(extopic)光応答の時間分解能をモデル化した。我々は、アレスチン-オプシン相互作用又はシグナル伝達-活性化メタ-IIオプシン状態の減衰速度、の何れかを増強するように設計した操作によって、オプシン-駆動の応答をより時間的に区切ることができることを見出した。重要なことに、ピーク応答強度も減少させる我々の操作の全てに一般的な傾向はあるものの、強度と応答減衰の速度との間には単純な相関は無かった。

本出願で適用されるBRETアッセイは、以前に、非-光感受性GPCRからのシグナル伝達を測定するために使用した。我々は、種々のアッセイ構成要素の比率を改変することによって、BRETアッセイを、そのダイナミック・レンジを改善するように適合させた。それは、シグナル・カスケードの最初のステップ(ヘテロ三量体G-タンパク質の解離)を測定するので、下流の応答構成要素（例えば、セカンド・メッセンジャーなど）を測定する別の方法よりも、オプシン・シグナル伝達の現在の程度を、より詳しく測定することができる。しかし、それは、依然として、オプシン活性の間接的な尺度（その時間経過は、遊離Gbyの蓄積及び低下の遅延によってフィルターリングされたオプシン活性の指標を提供する）である。この文脈において、我々の操作によって引き起こされたT_offの変化を見る必要がある。T_offとシグナル伝達活性化オプシンの減衰速度との間には、単純な直線関係がある必要はないので、本出願で収集したデータからシグナル伝達オプシンの寿命を定量的に外挿することは不可能である。それにもかかわらず、我々が観察した差異によって、本アッセイが、活性化したオプシンの寿命の変化を（少なくとも本出願で調査した範囲にわたって）明らかにすることができること、並びに、それらをお互いに及び好適なコントロールと比較して、大きさの順に配置することができること、が確認される。

光遺伝学的な目的のために最適なオプシンは、G-タンパク質を非常に効率的に活性化するが（高い感度及び応答強度を確保する）、活性化寿命は短いものである（高い時空間分解能を確保する）。これらの実験を始めたときの合理的な懸念点は、これらの2つのパラメータが、それらを分離することができない位に密接に相関することであった。活性化したオプシンの寿命が非常に短くなると、このパラメータが、合理的な積分時定数を有する任意の応答についてのピーク強度に影響を与えること、は合理的である。従って、我々は、本出願で採用した操作が、シグナル伝達の寿命を減少させ、ピークの応答強度にも影響を与える、強い全体的な傾向を見出した。しかしながら、同様のToffを有する（及びその逆）条件に対しての強度は実質的に変動し、この関係が決定論的ではないことを示す。減弱したT_offとAに向かう傾向に関する別の解釈は、本来の(native)タンパク質をどのように操作してもAを減少させる可能性が高いということ、及びT_offとの関連が生じるということである（なぜならば、我々は、その効果を達成することをターゲットとして操作をしたのであるから）。いずれにせよ、介入方法全体にわたって比較することにより、最適な、高いA及び低いT_off、に多かれ少なかれ近づく選択肢を特定することができる、ということは確かである。

動物オプシンのシグナル伝達寿命を制限する、コンセプト的に最も直接的な方法は、アレスチンとの相互作用を増強することである。全てのGPCRと同様に、オプシンは、2ステップの過程（リン酸化がアレスチンへの結合を促進し、それがシグナル伝達を阻害する）で不活性化される。我々は、この方策を異種性発現したオプシンに適用する際の重要な課題は、リン酸化に必要なキナーゼ(GRK1)を発現させたとき、ピークの光応答強度を強く抑制する効果が現れることである、と特定した。これは、ロッド・オプシン(rod opsin)活性に対するGRK1の既知の抑制効果（これは、GRK1-/-マウスにおいて、応答がより大きな強度となること[Chen et al, 2019, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 3718-3722.]、及び野生型の視覚的に無傷の動物において、二相性の応答［大きな初期応答があって、これは、続いてリン酸化された後に、より持続的なより低いレベルに急速に低下する］が見られること[Imai et al, 2007, J Biol Chem 282, 6677-6684]、として明らかにされた）と一致する。

本来の(native)光レセプターは、光子の補足を最大化するためにオプシン密度を増大させる、特殊な構造を有する。比較すると、オプシン光感受性は、光遺伝学的な用途では強く低下する。なぜならば、これらの形態的な適応を、ターゲット細胞は欠いているからであり、応答強度がGRK1誘発性に低下することは、望ましくないようになる。幸いなことに、我々は、非リン酸化活性レセプターに対する親和性が増強したアレスチン変異体を適用することで、この問題を克服することができた。これらは、GRK1の非存在下で、応答寿命を効果的に減少させ、GRK1発現が応答強度に抑制的な効果を与えることを、回避した。アレスチン変異体を適用すると、簡便性という利点が更にもたらされた。光遺伝学的な用途（ベクターのパッケージング・サイズが制限されることが多い）では、3種類(オプシン+アレスチン+キナーゼ)を導入するよりも、2種類のタンパク質(オプシン+アレスチン)を導入する方がはるかに実現可能である。

我々は、Arr3Aをオプシン・タンパク質に繋ぐことにより、応答減衰より速くすることができることを見出した。この方策によってもまた、リン酸化非依存性アレスチン変異体を使用することに関連する潜在的な問題を軽減することができる。まず第一に、オプシンに繋げることにより、これらの導入されたアレスチンが本来の(native)G-タンパク質共役レセプター及びそれらの別々のシグナル伝達カスケードを妨害する可能性を、低下させることが、期待される。第二に、マウスの桿体においてArr3A変異体を過剰発現させると、光レセプター変性が引き起こされ、それが細胞毒性である可能性が示されている[Song et al, 2013, Cell Signal, 25]。光レセプターにおけるこの変異体の有害な効果は、Arr3Aの自己会合が減少すること（これは、アポトーシスを引き起こし得るシグナル伝達経路と相互作用する単量体ユニットを高濃度にする）によるものと考えられている[Samaranayake et al, 2018, Front Mol Neurosci, 11]。これらの変異体の細胞毒性が、桿体の光レセプター（rod photoreceptor）（これは、特有の形態及びタンパク質発現［1000-10000種より多くのシグナル伝達タンパク質を有する］を有する[Pugh & Lamb, 2000, Chapter 5 in Handbook of Biological Physics, Molecular Mechanisms in Visual Transduction. North-Holland, pp. 183-255.]）にどの程度特有のものであるかは、不明である。アレスチンをロッド・オプシン(rod opsin)に繋げることは、arr3Aのオフ-ターゲット効果を制限することがある、及び細胞毒性の可能性を改善することがある。

メタ-II崩壊の速度を増加させるためにオプシン・タンパク質を変化させることも、応答寿命を減少させるための有効な方策であった。我々は、レチンアルデヒド発色団をオプシン・タンパク質の部分構造に連結させるシッフ塩基を不安定化する、及びG-タンパク質シグナル伝達のメタ-II状態におけるシッフ塩基加水分解の速度を増加させる、と考えられる種々のロッド・オプシン(rod opsin)変異体を試みた[Heck et al, 2003, J Biol Chem 278, 3162-3169]。シグナル伝達の終結メカニズムがないと、この自発的な不活性化は、数分間のオーダーで比較的遅い。我々は、分光学的な方法を使用して既に特徴付けられた、及びRod WTメタ-II崩壊の速度に対して様々な変化を引き起こすことが報告された、一連のオプシン変異体を試験した（比較的小さなY74F、Y136F及びY306Fに関する比較的小さな1.2-5倍の増加 [Goncalves et al, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19861-19866] から、A132L、E122Q及びY223Fに関するより劇的な4-8倍の変化まで[Goncalves et al, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19861-19866; Kuwayama et al, 2002, Biochemistry 41, 15245-15252; Imai et al, 2007, J Biol Chem 282, 6677-6684]）。我々は、2種のオプシン変異体（A132L及びY223F）が、BRET速度において、検出可能な変化を示さないこと、を見出した。これらの変異体の両方は、非常に速いメタ-II崩壊を有し、正常に発現するようであることが知られているので、我々は、それらによる不活性化は、G-タンパク質を効率的に活性化することには速すぎると推測した。

BRETアッセイを使用して測定された最も速いオプシンは、E122Qであり、Rod WTよりも約2倍速い不活性化であった。E122Qは、アレスチンを遺伝的に破壊したトランスジェニック・マウスの桿体の光レセプター（rod photoreceptor）で発現させると、迅速な単一光子応答を回復することが以前に示されており[Imai et al, 2007, J Biol Chem 282, 6677-6684]、このことは、この変異体を網膜で安全に発現させることができる、及び改良された光遺伝学的なツールとして他の細胞型において異所性に発現させることに適していることがある、を示唆する。いくつかの速いメタ-II崩壊の変異体（例えば、A132Lなど）が、小さな強度の比較的遅いBRET応答を示し、一方では、メタ-II崩壊がより緩やかな増加を示す変異体（例えば、Y306Fなど）は大きな強度の応答を示し、我々は、これらのオプシン変異体全体にわたって、応答強度とToffとの間には、直接的な関係を見出さなかった。我々が見出したことは、網膜放出速度とG-タンパク質活性化との間の関連は複雑であることを示唆しており、Gi/oシグナル伝達を光遺伝学的にコントロールするためにどのオプシン変異体が適切であるかを同定する予備的なスクリーニングとして、生細胞アッセイを用いることの優位性を際立たせている。

我々のデータは、生きた細胞の環境における動物オプシンのシグナル伝達寿命を操作するための、いくつかの一般的な規則を示唆する。まず第1に、アレスチン相互作用及びメタ-II崩壊の両方が、操作のための好適なターゲットである。我々の手において、我々は、Toffに与える効果の大きさは、メタ-II崩壊よりも、アレスチン相互作用をターゲットとする操作の方が、より大きいことを見出した。それにもかかわらず、メタ-II崩壊を増強すると、ブリーチ回復の速度（rate of bleach recovery）が改善し得るので、これは、少なくとも固有のブリーチ回復のメカニズムを欠くオプシンにおいて、それ自体で重要な結果であることがある。更に、我々は、メタ-II崩壊及びアレスチン相互作用の両方を増強することに関する相加的効果の可能性を十分に探求していない。第2に、リン酸化非依存性アレスチン・バリアントは、GRK1発現によって引き起こされる強度の減少を回避しながら、シグナル終結を効果的に増強する。それらはまた、発現するべき異種性タンパク質の数を減少させる。アレスチン変異体の適用を、本来の(native)キナーゼ／アレスチンと相互作用しにくいリン酸化不能オプシンと組み合わせることがあり、シグナル伝達特性をより大きくコントロールすることが可能になる。第3に、オプシンとアレスチンとの間の融合タンパク質は、アレスチン過剰発現のオフ-ターゲット効果の可能性を減少させながら、Toffを減少させる有効な方策である。最後に、ピークの応答強度とは無関係にToffを減少させる範囲があり、光遺伝学的な用途の可能性がある介入方法を注意深く解析することが重要であることを際立たせる。これらの実験で、ピーク応答を維持することと応答寿命を減少させることとの間の最適なトレード-オフ(trade-off)が、Arr3AをRod6Aに10nm リンカーを使って繋ぐ変異体により、得られた。

実施例7 - 実施例1から6の方法
発現ベクターの構築：pDNR-DUALヒト・ロドプシン・キナーゼ(NM_002929)を、DNASUプラスミド・レポジトリーから入手した（この中で、それは、ハーバード・プロテオミクス研究所によって寄託されていた）。pENTR223.1ヒト・ロッド・アレスチン(NM_000541)も、DNASUプラスミド・レポジトリーから入手した（その中で、それは、ORFeome共同研究により寄託されていた）。pcDNA3ヒト・ロッド・オプシン(rod opsin)(NM_000539.3)、pcDNA3 Glo22F及びpcDNA3 GsOプラスミドは、既述の通りとした (Bailes & Lucas, 2013; Ballister et al., 2018)。百日咳毒素耐性のCys352Ser変異、を有するヒトGalphaOA(AH002708)を、cDNAResourceセンター (www.cDNA.org)から購入した。BRET G-タンパク質活性化アッセイの構築物－ pcDNA3 splitVenus-Gbeta1(sVβ1)、pcDNA3 splitVenus-Ggamma2(sVγ2)及びpcDNA3 mGRK3-nLuc －は、既述の通りとした [Masuho et al, 2015, Sci Signal 8, ra123]、及びKiril Martemyanov 教授（スクリプス研究所(Scripps Research Institute)）の厚意により提供を受けた。適宜、ギブソン・アセンブリ（Gibson assembly）を使用して、ORFをpcDNA3ベクターの中にクローニングした。

リン酸化-非依存性マウス・アレスチン1変異体を、ヒト・アレスチン1についての [Vishnivetsky et al., 2013, J. Biol. Chem. 288, 3394-3405] から適合させた。アレスチン3A変異体を、以下のプライマー（
Arr1 3A Fwd 5’ - GTTATCAGGATGCAAATgcAgcTgcTGAGGAGTTTGCTCGCC (配列番号(SEQ ID NO.) 7) 及び
Arr1 3A Rev 5’ - GGCGAGCAAACTCCTCAgcAgcTgcATTTGCATCCTGATAAC (配列番号(SEQ ID NO.) 8）)
を備えたQuikchange Lightning部位特異的変異誘発キット(Agilent)を用いて、以下の変異（L377A、V378A及びF379A）を、pcDNA3アレスチンの中に導入することによって、作製した。アレスチンKEQ3A変異体を、以下のプライマー
（
K261Q Fwd 5’ - CGAGTGATTATTACGTCcAGCCCGTGGCTATGGAG (配列番号(SEQ ID NO.) 9), K261Q Rev 5’ - CTCCATAGCCACGGGCTgGACGTAATAATCA CTCG (配列番号(SEQ ID NO.) 10), Q332K Fwd 5’ - GAATCCTGGTGTCTTACaAGATCAAGGTGAAGCTCAC (配列番号(SEQ ID NO.) 11),
Q332K Rev 5’ GTGAGCTTCACCTTGATCTtGTAAGACACCAGGATTCC (配列番号(SEQ ID NO.) 12),
E350H Fwd 5’ - GAGAGCTCACCTCCAGTcAcGTCGCCACTGAGGTCC (配列番号(SEQ ID NO.) 13), E350H Rev 5’ - GGACCTCAGTGGCGACgTgACTGGAGGTGAGCTCTC (配列番号(SEQ ID NO.) 14
）
を用いたQuikchange Multi Site特異的変異誘発キット(Agilent)を用いて、更なる変異（K261Q、E350H及びQ332K）を、pcDNA3アレスチン3Aの中に導入することによって、作製した。

ロドプシン6A発現ベクターの構築のために： 246bpのDNAフラグメント（これは、ヒト・ロドプシン ORFの最後の196bp及びNotI部位からのpcDNA3骨格との50bpの重複、に相当する）を、Thermo Fisherによって合成してもらった。このフラグメントは、ロドプシンのC末端からリン酸化部位を除去するように設計された6つの変異(S333A、T336A、S338A、T340A、T342A、S343A)を有していた。このフラグメントを、ギブソン・アセンブリ（Gibson assembly）を使用して、AfeI及びNotIで線状化したpcDNA3ロドプシン・ベクターの中にクローニングした。

アレスチン3A又はアレスチン KEQ3Aを、以下のプライマー
（
Arr Fwd 5’ -ccaggtggccccggcTaCGCGtGCAGCCAGCGGGAAG ACCAGC ((配列番号(SEQ ID NO.) 15) 及び
Arr Rev 5’ - caggaattcgatatcaagcACCGGTTTACTCATCAACGTCATTCTTGTC TCTC ((配列番号(SEQ ID NO.) 16
）
を使用してアレスチンORFを増幅することにより、ロドプシン6Aの後に、フレームを合わせて(in-frame)でクローニングした。フォワード・プライマーによって、ロドプシン6Aとアレスチン変異体のコーディング配列の間に、6bpのMluI制限酵素部位を導入した。

Rhod6AとArr3A/ArrKEQ3Aとの間にバイシストロニック(bicistronic)なベクター又は融合した構築物を構築するために、所望のリンカー又はP2A配列に対応するDNA配列を、Thermo Fisherに合成してもらい、MluI切断によって線状化した、及び組換えシュリンプ・アルカリ・ホスファターゼ(NEB)で処理した、pcDNA3 Rhod6A-MluI-Arr3A又はpcDNA3 Rhod6A-MluI-ArrKEQ3Aの中に、ギブソン・アセンブリ（Gibson assembly）を使用して、クローニングした。

以下のリンカーを、融合した構築物において使用した：
(GGGGS)nユニット（ここで、n=1-3［それぞれ、F1-3と呼ぶ］［配列番号(SEQ ID NO)17；配列番号(SEQ ID NO)18；配列番号(SEQ ID NO)19］）からなる可撓性リンカー、
A(EAAAK)nAユニット（ここで、n=1-3［それぞれ、R1-3と呼ぶ］［配列番号(SEQ ID NO)20；配列番号(SEQ ID NO)21；配列番号(SEQ ID NO)22］）からなる剛性リンカー、
GGGGSA(EAAAK)nAGGGGS（ここで、n=1-5［それぞれ、SF1-5と呼ぶ］［配列番号(SEQ ID NO)23；配列番号(SEQ ID NO)24；配列番号(SEQ ID NO)25；配列番号(SEQ ID NO)26；配列番号(SEQ ID NO)27］）からなる準-可撓性リンカー。
我々はまた、以前に記載された10nm及び20nmのE/RK α-ヘリックス・リンカーを使用して、融合した構築物を試験した[Sivaramakrishnan & Spudich, 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20467-20472]。E/RK α-ヘリックス・リンカーについては、更なる(GSG)4モチーフ(配列番号(SEQ ID NO)28)を、E/RKリンカーの5' 末端部及び3' 末端部に含めて、回転の自由度を確保した。

変異とクローン化したORFが存在することを、サンガー・シークエンシングによって確認した。

細胞培養及びトランスフェクション

Hek293T細胞(ATCC)を、培地（4500mg/Lグルコース、Lグルタミン、ピルビン酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムを添加した、ダルベッコ改変イーグル培地、シグマから入手)並びに10%牛胎児血清(FBS)中で、37℃(5% CO2)で、インキュベートした。

トランスフェクションするために、細胞を、培養培地中で250 000細胞／ウェルの密度で、12-ウェル・プレートに播種した。48時間後、リポフェクトアミン2000(Thermo Fisher)を用いて、製造者の指示書に従って、細胞を一過的にトランスフェクトした。全てのトランスフェクションについて、条件間で、空のベクターを用いて、DNAの総量を標準化した。

図１、２、６及び７に記載したBRET G-タンパク質活性化アッセイについて、12-ウェル・プレートの各ウェルを、以下を用いて、一過的にトランスフェクトした：100ng sVβ1, 100ng sVγ2, 100ng mGRK3-nLuc, 200ng Gαo, 500ng オプシン、及び適宜500ng アレスチン（若しくは、アレスチン変異体）並びに／又は500ng ロドプシン・キナーゼ。BRETアッセイの構成要素の比率及び量は、[Masuho et al, Methods Mol Biol 1335, 107-113]に記載されている通りとした。

これらの最初の実験を完了した後、我々は、アッセイの信頼性を改善するために、各BRETアッセイ構成要素の量及び比率を最適化した。我々は、単離したmGRK3-nLucの種々のレベルに関してBRET比率を測定し、次いで、最適化したGRK3-nLucを種々の量のsVβ1及びsVγ2と組み合わせて、並びに最終的に、最適化された量のsVβ1、sVγ2及びmGRK3-nLucに対してGαoを種々の比率にして、これを行った。図４、５、S3及びS5に示されるデータを収集するために使用した、これらの最適化されたトランスフェクション条件について、12-ウェル・プレートの各ウェルを、以下を用いて、トランスフェクトした： 100ng sVβ1, 100ng sVγ2, 25ng mGRK3-nLuc, 50ng Gαo 及び 500ng オプシン、又はオプシン-アレスチン融合体。

全てのBRET実験について、一旦トランスフェクトした後の工程を、薄暗い赤色光下で行った。トランスフェクション試薬及びDNAを加えた後、細胞を、37℃で、4-6時間、インキュベートし、次に、10μMの9-cisレチナール(Sigma-Aldrich)を含む1mlの培養培地に再懸濁した。100μlの再懸濁した細胞を、白色壁で透明底の96-ウェル・プレート(Greiner Bio-One)の各ウェルに加え、一晩放置した後、BRET G-タンパク質活性化アッセイを行った。

Glosensor cAMPアッセイについて、12-ウェル・プレートの各ウェルを、以下を用いて、トランスフェクトした：500ng オプシン(若しくは、オプシン-アレスチン融合体)、500ng Glo-22F、5ng GsO、及び適宜500ng アレスチン(若しくは、アレスチン変異体)及び／又は500ng ロドプシン・キナーゼ。トランスフェクション試薬及びDNAを加えた後、細胞を、37℃で、4-6時間、インキュベートし、次に、10μMの9-cisレチナール及び125ng/ml百日咳毒素を含む1mlの培養培地に再懸濁した。100μLの再懸濁した細胞を、白色壁で白色底の96-ウェル・プレート(Greiner Bio-One)の各ウェルに加え、一晩放置した後、cAMPアッセイを行った。

実施例8
BRET G-タンパク質活性化アッセイ：BRET G-タンパク質活性化アッセイを開始する約1-2時間前に、培養培地を細胞から除去した、及び50μLのイメージング培地（フェノールレッド不含、L-グルタミン(Gibco)、1% FBS、ペニシリン(100U/ml)及びストレプトマイシン(100μG/ml)を、10μMの9-cis レチナールと共に含むL-15培地）に交換した。次いで、細胞を、室温で、暗所で、少なくとも1時間、インキュベートした。

薄暗い赤色光下で、NanoGlo生細胞基質(フリマジン誘導体、プロメガ)を、PBS中で1:40に希釈した。次いで、12.5ulの希釈したNanoGlo基質溶液を、96-ウェル・プレートの各ウェルに（NanoGlo基質の最終希釈1:200を提供するために）加え（一度に6-ウェルまでとした）、及びルミネッセンスをピークにすることを可能にするために、5分間インキュベートした後、アッセイを開始した。我々は、細胞を最初に基質で負荷した20分以上後に行った記録は、全体のBRETシグナルが減少するにつれて、ノイズがより大きくなる傾向があることを見出した。

BRET測定を、FluoStar Optimaマイクロプレート・リーダー(BMG Labtech)を用いて、行った。このプレート・リーダーは、単一の光電子増倍管を持つため、535nm(4095に設定したゲイン(gain)を有する30nm FWHM)及び470nm(3600に設定したゲイン(gain)を有する30nm FWHM)の放出フィルターを用いて、蛍光物質Venus及びバイオルミネッセンスのNanolucが放出する光を、逐次測定した。各フィルターについて、0.68秒の記録間隔を使用し、合計サイクル時間は2秒であった。

光暴露のためにリーダーからプレートを取り出すのことに伴う遅延を避けるために、我々は、プレート・リーダー底部光学系を改良して、プレート・リーダー内部で個々のウェルに光を照射できるようにした。カスタム3D-プリントしたカプラーを用いて、底部光学系をLumencor SpectraXライト・エンジン(light engine)の液体光ガイド(liquid light guide)と接続した。透明な底の96-ウェル・プレートと組み合わせれば、これにより、細胞の下に光刺激を提供することが可能になった。光刺激中にPMTがブリーチング(bleaching)することを回避するために、電動シャッターを構築して、光刺激がオンである間、上部光学系の光経路を遮断することによってPMTを保護した。このシャッターの動作を、Arduinoマイクロコントローラを用いて、光源に同期させた。隣接するウェルが光に暴露されるのを回避するために、記録する各ウェルを空のウェルで囲んだ、及び測定するウェルの並べ方の釣り合いを取った。

BRETプレート・リーダーの記録の間、Optimaスクリプト・モードを使用して、14.5秒の休止とそれに続く1秒の470nm光パルス(14.1log光子)を、実行可能ファイルによって、最初にトリガーした。次いで、記録することになっている個々のウェルについてのウェル-モード・プロトコルを即座に開始した。このプロトコルは、2つの動態ウィンドウ(kinetic window)からなる；第1のものは、5サイクルのベースライン計測(全持続時間10秒)からなる、及び第2のプロトコルは、短い3-4秒の遅延（その間、細胞を遅延させた光パルスに暴露させた)の後に始まり、その後、45サイクル(全持続時間90秒)まで継続した。プレート・リーダーの「ホーム・ポジション」からの移動に要する時間において様々な遅延があることを考慮するために、及び光フラッシュ直後に確実に記録が再開されるようにするために、記録するウェル位置に応じて、2つの動態ウィンドウの間の休止を変化させた。次いで、このプロセスを、基質を負荷した全てのウェルを測定完了するまで繰り返した。

各記録セッションにおいて、3-4回の繰り返しを、全ての条件について、行った。少なくとも3回の記録セッション(それぞれ、別々のトランスフェクション)を、それぞれの実験について行った。

Glosensor Gso cAMPアッセイ：Glosensor Gsoアッセイを、以前に記載されているように行った(Ballister et al, 2018)。簡単に述べると、アッセイを開始する1-2時間前に、細胞を、10mM HEPES pH 6.9中に再構成した2mM甲虫ルシフェリン・カリウム塩(Promega)を含む75ulイメージング培地中で、室温で、インキュベートした。FluoStar Optimaマイクロプレート・リーダーを使用して、3mmレンズ(3600に設定したゲイン)を使用して、60秒毎に1秒間、生のルミネセンスを記録した。ベースラインのルミネセンスを、5サイクル記録し、次いで記録を一時停止し、プレートを取り出した。次いで、カスタム-ビルトLEDアレイ(custom-built LED array)を用いて、各ウェルを470nm光フラッシュで刺激した。各ウェルを、5-log範囲にわたって(4×1012から1016光子まで)、8種の様々な強度のうちの1種に曝露した。各条件からの1つのウェルを、暗コントロールとして露光せずに残した。

BRET G-タンパク質活性化アッセイのために－ BRETシグナルを、Venus-Gβ1γ2が放出する535nmの光と、mGRK3-nLucが放出する470nmの光との比率を計算することによって決定した。次いで、各時点のBRETシグナルを、刺激直前のベースライン値で割ることでΔBRET比を求めることによって、前記BRETシグナルを、ベースラインに対して標準化した。次に、刺激後のΔBRET比率の経時変化の動態を、以下の3-パラメータ・モデルに、非-線形回帰を用いて適合させた:

y =e(-Toff / x)・(1- e(-Ton / x))・A

ここで、Toff = 指数関数減衰曲線の減衰速度、Ton = 指数関数結合曲線の増加速度、A = 2つの指数関数曲線のスケーリング因子、x = 時間(秒)、y =ベースライン標準化BRETシグナル。モデルを、非-線形回帰を用いて、データに適合させた。以下の制約を使用した： A >0、Ton >0.1、Toff >5、R2>0.2。あいまいであった曲線適合(curve fit)又は収束しなかった曲線適合を、解析から除外し、図で表示した経時変化には含めていない(全てのデータを表示した図S5を除く)。

スケーリング因子(A)を応答強度の尺度として使用し、Toff(s)を応答減衰の尺度として使用した。我々は、異なる記録の全体的なΔBRET比において系統的な変動があることを見出した。これを説明するために、我々は、各条件のA及びToffにおける倍数変化を、同じ反復の一部として行ったRodWTポジティブ・コントロールに対して、調べた。次いで、応答強度及び応答減衰を、ウィルコクソン符号順位検定を使用して解析し、各群を理論上の中央値=1と比較した。

免疫細胞化学： Hek293細胞を、培養培地中250,000細胞／ウェルの密度で、12-ウェル・プレートに播種した。48時間後、リポフェクトアミン2000(Thermo Fisher)を用いて、製造者の指示書に従って、500ngのオプシン又はオプシン-アレスチン融合体を用いて、細胞を一過的にトランスフェクトした。細胞を37℃で4-6時間インキュベートし、次いで薄暗い赤色光下で、10μMの9-cis レチナール(Sigma-Aldrich)を含む2mlの培養培地に再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞の全容量を、3×ポリ-D-リジンでコートしたガラス・カバースリップを含む6-ウェル・プレートのウェルに添加した。細胞を、更に24時間インキュベートし、次いでPBSで1回洗浄した後、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。次いで、細胞を、PBSで3回洗浄し、染色するまで4℃でPBS中に保存した。

染色のために、1条件あたり1つのカバースリップを取り出し、12-ウェル・プレートの各ウェルに置いた。細胞を、PBS中の0.2% Triton-X中で、5分間、透過性にし、次いで、5%血清を添加したPBS + 0.05% Tween-20中で、20-30分間、ブロッキングをした。細胞を、PBS + 0.05% Tween-20 + 1%血清で希釈した一次抗体中、室温で、1時間、インキュベートし、次いで、PBSで3回洗浄した。次いで、細胞を、PBS + 0.05% Tween-20 + 1%血清中で希釈した二次抗体中で、30分間、室温で、暗所にて、インキュベートした。細胞を、PBSで、更に3回洗浄し、次いで、各々のカバースリップを、DAPIを含むProlong Gold抗-退色媒体(anti-fade media)を用いてスライド上にマウントし、室温で少なくとも24時間乾燥させた。

以下の一次及び二次抗体を使用した：マウス・モノクローナル抗-4D2 N-末端ロッド・オプシン(rod opsin)抗体4D2(1:500、Abcam、Ab98887)とロバ抗-マウス近赤外594二次(1:500、Molecular Probes)とロバ血清；マウス・モノクローナル抗-1D4 C-末端ロッド・オプシン(rod opsin)抗体(1:500、Abcam、Ab5417)とヤギ抗-マウス赤色555二次(1:500、Molecular Probes)とヤギ血清。

Axio Imagerを用いて画像を取得した。D2 正立顕微鏡 (Zeiss)では、40Xプラン・ネオフルアー空浸対物レンズを使用し、DAPI、緑色蛍光体及び赤色蛍光体について、それぞれ、350nm、470nm及び580nmでの励起、並びに460nm、515及び650nmでの放出、を使用する。画像を、Coolsnap HQ2カメラ(Photometrics)及びCoolLED pE-300白色光源を用いて、Micromanager v1.4.23を使用して、収集した。画像は、FIJI ImageJ(Schneider et al., 2012)を用いて解析した。明度及び／又はコントラストに対する全体的な調整を、全ての画像に等しく適用した。

実施例8
以下の光遺伝学的な導入遺伝子のうちの1種を含むアデノ随伴ウイルスを用いた（図１１）：
１．Rod6A-10nm-アレスチン3A －これは、準-可撓性リンカーによって、リン酸化非依存性視覚アレスチン変異体に融合したリン酸化欠損(phosphonull)ヒト・ロッド・オプシン(rod opsin)変異体である。
２．ロッド・オプシン(Rod opsin) E122Q －これは、メタ-IIシグナル伝達の状態をより速く崩壊させる、非-同義的な点変異、を有するヒト・ロッド・オプシン(rod opsin)である。この導入遺伝子をより小さいサイズにすると、我々は、蛍光体mCherryレポーターと共-発現させることが可能になる。
３．ロッド・オプシン(rod opsin)WT －これは、野生型ヒト・ロッド・オプシン(rod opsin)であり、MEA実験のためのポジティブ・コントロールとして使用する。この導入遺伝子を、mCherry蛍光レポーターと共-発現させた。

前記ウイルスは、フロックス化(floxed)している、即ち、光遺伝学的な導入遺伝子は、Cre-リコンビナーゼを発現する際にのみ、発現する。我々は、Grm6Cre rd1マウスに、前記ウイルスのうちの1種を両側硝子体内注射した。これらのマウスは、網膜変性が起きる、及びGrm6プロモーターのコントロールを受けて、桿体オン-双極細胞においてのみ、Cre-リコンビナーゼを発現する。

我々は、注射投与した動物からの網膜外植片に対して、一連の強度(12.5~15.5logロッド・オプシン(rod opsin)有効な光子/cm²/s)にわたる1sの白色光に対する応答として、多電極アレイ記録を行った。網膜を切除し、神経節細胞(ganglion cell)集団からスパイクが発生する活動を記録するために、神経節細胞(ganglion cell)面を下にして多電極アレイ上に置いた。

Rod6A-10nm-Arr3Aで形質導入した網膜変性を起こした網膜は、15.5から13.5log光子/cm²/sの間の光に対して、一過的な興奮性の応答を示した(図１２)。

ロッド・オプシン(rod opsin)E122Qで形質導入した網膜において、同様の一過的な興奮性の応答が見られた(図１３)。蛍光レポーターmCherryは、網膜全体に広く発現しており、ウイルスの形質導入がうまくいっていることが示唆された(図１４)。

時間分解能を改善するように設計したロッド・オプシン(rod opsin)バリアントを使って達成された光で誘発される活動の性質には、定性的な違いがあるように思われた。重要なことに、各場合において、光フラッシュに対する応答は、未改変のロッド・オプシン(rod opsin)と比較して、ロッド・オプシン(rod opsin)E122Q又はRod6A-10nm-Arr3Aの何れかを発現する網膜において、持続性がより短くなった（光出現(light appearance)の時間により密接に関連していた）(図１５)。

ロッド・オプシン(rod opsin)E122Q及びRod6a-10nm-Arr3Aは両方とも、マウス網膜のON-双極細胞で発現したときに、光で誘発される活動を支持した。両方とも、本来の(native)ロッド・オプシン(rod opsin)と比較して、時間応答の特性が改善しているようであった。

実施例8の方法
動物
全ての実験及びケアを、UK 動物（科学的な手順）法(UK Animals (Scientific Procedures) Act (1986))に従って行った。混合型C3H×C57Bl/6バックグラウンド（mixed C3H x C57Bl/6 background）のGrm6^+/Cre(Morgan, C.W. et al, (2009). Proc Natl Acad Sci USA, 106 (45), 19174-8, doi: 10.1073/pnas.0908711106) rd1マウスを使用した。これらのマウスは、Grm6(mGlur6)プロモーターのコントロール下でCreリコンビナーゼを発現し、桿体双極細胞において、Creを限定的に発現するようになる。それらはまた、Pde6b^rd1変異を有し（Chang, et al (2002) Vision Research, 42(4), 517-525. https://doi.org/10.1016/S0042-6989(01)00146-8 及び Pittler, S. J., & Baehr, W. (1991) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88(19), 8322-8326. https://doi.org/10.1073/pnas.88.19.8322）、これによって、動物が80日齢を超えると、完全な視力喪失を伴う進行性網膜変性が引き起こされる。マウスの遺伝子型を決定し、双極細胞の機能に影響を及ぼすGRP179点変異を有しないことを確認した（Peachey et al. (2012) American Journal of Human Genetics, 90(2), 331-339. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2011.12.006）。マウスを、12:12の明暗サイクル下で飼育し、食物及び水を自由に(ad libitum)摂れるようにした。9-10週齢で、アデノ随伴ウイルスを両側眼内注射投与して、その13-15週間後に、多-電極アレイ記録を行った。

硝子体内注射投与
Grm6^Cre/+rd1マウスに、ウイルス（AAV2 4YF-ITR-DIO-CMV-ロッド・オプシン(Rod opsin) WT-T2A-mCherry -WPRE- SV40 後期ポリA -ITR、又は AAV2 4YF-ITR-DIO-CMV-ロッド・オプシン(Rod opsin) E122Q-T2A-mCherry -WPRE- SV40 後期ポリA -ITR、又はAAV2 4YF-ITR-DIO-CMV-Rod6A-10nm-Arr3A-WPRE- SV40 後期ポリ -ITR）を両側硝子体内注射投与した。前記ウイルスを、4つのチロシンからフェニルアラニンへの変異、を有するAAV2/2カプシドに、パッケージングし（Petrs-Silva et al (2011) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 19(2), 293-301. https://doi.org/10.1038/mt.2010.234）、網膜細胞（特に、双極細胞）にウイルスの形質導入が効率的に行われるようにした。ロッド・オプシン(Rod Opsin) WT及びロッド・オプシン(Rod Opsin) E122Qの導入遺伝子を、T2A配列を使用してmCherry蛍光レポーターに連結して、2つのタンパク質が、確実に1:1で共-発現するようにした。逆位にした光遺伝学的な導入遺伝子（及び、適宜蛍光レポーター）のオープン・リーディング・フレームを、2組の1対のLox部位(LoxP及びLox2272)で挟み、その結果、Creリコンビナーゼの存在下で、前記導入遺伝子は、センス方向に反転し、構成的なCMV(サイトメガロウイルス)プロモーターによる駆動を受けて発現する。導入遺伝子の発現を改善するために、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE))及びSV40後期ポリA配列を、ITRの間に含ませることもした。ウイルスを、VectorBuilderから入手した。

ケタミン(75mg/kg体重量)及びメデトミジン(1mg/kg体重量) を腹腔内注射投与することによって、マウスを麻酔した。麻酔したら、マウスをヒート・マット(heat mat)上に置いて体温が下がらないようにした。1%トロピカミド点眼薬(Bausch & Lomb)で瞳孔を拡張させ、13mmカバースリップを、角膜に適用したゲル潤滑剤(Lubrithal)上に配置した。2.2-2.5ulのウイルス(1.12×10¹³ゲノム・カウント/ml)を、外科用顕微鏡(M620 F20、ライカ)を使用して、35-ゲージ斜角針を使用して、Nanofil 10μlシリンジ(World Precision Instruments)を使用して、各々の眼の硝子体の中に注射投与した。全マウスに両側注射投与を行った。アチパメゾール(3mg/kg体重量)を腹腔内注射投与することにより、麻酔から覚めさせた。回復の過程で、0.5%塩酸ブピバカイン及び0.5%クロラムフェニコールを、その注射投与した眼に局所適用した。また、マウスに、0.25mlの温かい生理食塩水を、皮下注射投与によって投与し、回復を促進させた。

多-電極アレイ記録
マウスを、一晩、暗順応させた。以下の全てのステップは、散乱性の薄暗い赤色光下(diffuse dim red light)で行った。暗順応したマウスを、頚椎脱臼により殺処置した(承認されたスケジュール1の方法)。除核した眼を、カルボキシ化(carboxygenated)(95% O₂/ 5% CO₂)Ames' 培地(1.9g/L重炭酸ナトリウムを補充、pH 7.4、シグマ・アルドリッチ)で満たしたペトリ皿に入れ、網膜を切開し、網膜内面から硝子体を注意深く摘出した。次いで、網膜ホールマウントをガラス・コーティングした金属ハープ(ALA Scientific Instruments)上に置き、コーティングを施した256-チャネルの多-電極アレイ(MEA、Multi Channel System)上に、神経節-細胞面を下にして配置した。多-電極アレイを、最初に、ウシ胎仔血清中で、4^o Cで、一晩インキュベートし、次いでホウ酸バッファー(pH8.4)中の0.1%ポリエチレンイミン(PEI)で、1時間、室温で、コーティングした。次いで、PEIコーティングを除去し、MEAを、ddH₂0で、4-6回洗浄した。その後、PEI-コーティングしたMEAを、風乾した、及び30-45分、室温で、新しいAmes's培地中の20μg/ml ラミニンでコーティングした（Egert, U., & Meyer, T. (2005), In S. Dhein, F. W. Mohr, & M. Delmar (Eds.), Practical Methods in Cardiovascular Research (pp. 432-453). https://doi.org/10.1007/3-540-26574-0_22, 2005; Lelong, et al (1992). Journal of Neuroscience Research, 32(4), 562-568. https://doi.org/10.1002/jnr.490320411）。ラミニン溶液を除去して、網膜を前記MEA上に配置した。前記MEA上の置いた後、ペリスタポンプ(peristaltic pump)(PPS2, Multi Channel Systems)を使用して、2-3ml/分で、10μMの9-cis レチナールを含むカルボキシ化(carboxygenated)Ames' 培地を用いて、前記網膜を連続的に潅流した、並びに水浴ヒーター(36℃)、インライン潅流ヒーター(35℃)及び基板ヒーター(34℃)を使用して、34℃に維持した。配置した後、網膜を、暗所で少なくとも45分間潅流させた後、第1の光刺激を加えた。データは、MC Rackソフトウェア(Multi Channel Systems)を用いて、25kHzでサンプリングした。Butterworth 200Hzハイ・パス・フィルター（high pass filter）を生の電極データに適用し、低周波ノイズを除去した。スパイクを検知するための強度の閾値を、ベースラインからの4-4.5標準偏差とした。光刺激は、カスタマイズした光エンジン(Thorlab LEDs)を使用して提示した。LabVIEW (National Instruments)で書かれたプログラムによって、Arduino Dueマイクロコントローラをコントロールし、LED出力を変えることによって刺激の持続時間及び強度をコントロールした。

蛍光顕微鏡
多-電極アレイ上の網膜フラットマウント（retinal flatmounts）の画像については、記録が完了したら、培地をMEAチャンバーから排出した、及び金属ハープを除去した。次いで、MEAチャンバー全体を顕微鏡のステージ上に置き、網膜ホールマウント中の形質導入された細胞からのmCherry蛍光の画像を取得した。mCherry免疫染色及び蛍光の画像を、DFC365 FXカメラ(Leica)及びCoolLED-pE300-白色光源を備えたLeica DM2500顕微鏡を使用して取得した。イメージング・ソフトウェアは、Leica Application Suite Advanced Fluorescence 6000とした。画像は、Chroma ET Y3フィルター・セット(励起=545nm、放出=610nm)を用いて取得した。ImageJソフトウェアを使用して、画像の明るさ及びコントラストに対する全体的なエンハンスメント(enhanements)を行った。

表１．配列表
アレスチン3A、アレスチンKEQ3A、GRK1、Rod6A、ヒト野生型オプシン及び野生型アレスチンのオープン・リーディング・フレーム。最初のヌクレオチドを、そのORFの残基1とする。本出願では、点変異を、そのORFのヌクレオチド1を基準にして、番号付けをする。

項目化するもの：
［項１］
オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドを含む組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドのうちの少なくとも1つは、光に対する前記オプシン・ポリペプチドの応答の時間分解能を増加させる変異、を含む。
［項２］
項１に記載の組成物、ここで、前記アレスチンは、変異体である。
［項３］
項１に記載の組成物、ここで、前記アレスチンは、野生型である。
［項４］
項１～３の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシンは、野生型である。
［項５］
項１～３の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシンは、変異体である。
［項６］
項１若しくは２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４若しくは５、に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、オプシン・ポリペプチドとアレスチン・ポリペプチドとの間のリン酸化非依存性の結合、を許容する変異、を含む。
［項７］
項１～６の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、リンカーを介して、前記アレスチン・ポリペプチドに、作動可能に連結する。
［項８］
項７に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
［項９］
項７に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
［項１０］
項１～６の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドと前記アレスチン・ポリペプチドとは分離している。
［項１１］
項１～１０の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシンは、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼによって実質的にリン酸化されない。
［項１２］
項１若しくは２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４～１１、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含む。
［項１３］
項２に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項１４］
項１～３若しくは５、又は項１～３若しくは５に従属する場合の項６～１３、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、C末端のリン酸化部位に関連する変異、を含む。
［項１５］
項１～３若しくは５、又は項１～３若しくは５に従属する場合の項６～１４、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、配列番号（SEQ ID NO)４に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項１６］
項１、２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４～１５、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、Arr3A又はArrKEQ3A変異体である。
［項１７］
項１、２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４～１６、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号（SEQ ID NO)１に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項１８］
項１、２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４～１６、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号（SEQ ID NO)２に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項１９］
項１、２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４～１８、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、非リン酸化オプシンに対する親和性が増加することと関連する変異、を含む。
［項２０］
項１、２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４～１９、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項２１］
項１、２、又は項１若しくは２に従属する場合の項４～２０、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項２２］
アレスチン・ポリペプチドに作動可能に連結したオプシン・ポリペプチドを含む組成物。
［項２３］
項２２に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、野生型又は変異体である。
［項２４］
項２２又は項２３に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、野生型又は変異体である。
［項２５］
項２２から２４の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
［項２６］
項２２から２５の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
［項２７］
項２２から２６の何れか一項に記載の組成物、ここで、オプシン・ポリペプチドは、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含む。
［項２８］
項２７に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、及びその組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項２９］
項２２～２８の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、1つ以上のリン酸化部位に関連する少なくとも1つの変異、を含む。
［項３０］
項２９に記載の組成物、ここで、前記変異は、C-末端リン酸化部位に関連する。
［項３１］
項２９又は３０に記載の組成物、ここで、前記変異は、前記オプシン・ポリペプチドの1つ以上のリン酸化部位に、アミノ酸の置換、欠失、又は付加をもたらす。
［項３２］
項２９から３１の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)4に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項３３］
項２２から２８の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、前記アレスチン・ポリペプチドと非リン酸化オプシンとの間の結合を増加させる変異、を有する。
［項３４］
項３３に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)1に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項３５］
項３３に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)2に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項３６］
項３３から３５の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、及びその組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項３７］
項３３から３５の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はその組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項３８］
項１から３７の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、動物アレスチンである。
［項３９］
項１から３７の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、動物アレスチンである。
［項４０］
項１から３７の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、ヒト・アレスチンである。
［項４１］
項１から３７の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、ヒト・アレスチンである。
［項４２］
i)オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含む第1のベクター；又はii)オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を含む第1のベクター、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を含む第2のベクター、を含む組成物。
［項４３］
項４２に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、変異体又は野生型である。
［項４４］
項４２に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、変異体又は野生型である。
［項４５］
項４２に記載の組成物、ここで、前記第2の核酸は、変異体アレスチン・ポリペプチドをコードする。
［項４６］
オプシン・ポリペプチドをコードする核酸を有する第1のベクター、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする核酸を有する第2のベクター、及びアレスチンをコードする核酸を有する第3のベクター、を含む組成物。
［項４７］
オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする第2の核酸、及びアレスチンをコードする第3の核酸、を有するベクター、を含む組成物。
［項４８］
項４６又は４７に記載の組成物、ここで、前記組成物は、アレスチン・ポリペプチドをコードする核酸を更に含む。
［項４９］
項１～４８の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、C-末端リン酸化部位に関連する変異、を含む。
［項５０］
項１～４９の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記変異体アレスチン・ポリペプチドは、非リン酸化オプシンに対する親和性に関連する変異、を含む。
［項５１］
項１～５０の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記ベクターは、ウイルス・ベクターである。
［項５２］
項５１に記載の組成物、ここで、前記ウイルス・ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター又はその改変AAVである。
［項５３］
項５１又は５２に記載の組成物、ここで、前記ベクターを、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、及びAAV10からなる群より選択する。
［項５４］
項１～５３の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記組成物は、眼球又は網膜下投与に好適である。
［項５５］
オプシン・ポリペプチドの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含むオプシン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む。
［項５６］
オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含むオプシン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む。
［項５７］
項５５又は５６に記載の方法、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、及びその組み合わせ、から選択される群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項５８］
項５５又は５６に記載の方法、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、1つ以上のリン酸化部位に関連する少なくとも1つの変異、を含む。
［項５９］
項５８に記載の方法、ここで、前記変異は、C-末端リン酸化部位に関連する。
［項６０］
項５８に記載の方法、ここで、前記変異は、前記オプシン・ポリペプチドの1つ以上のリン酸化部位に、アミノ酸の置換、欠失、又は付加をもたらす。
［項６１］
項５８に記載の方法、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)4に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項６２］
オプシン・ポリペプチドの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、前記オプシン・ポリペプチドを、アレスチン・ポリペプチドと非リン酸化オプシンとの間の結合を増加させる変異、を有するアレスチン・ポリペプチドに接触させることを含む。
［項６３］
オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、アレスチン・ポリペプチドと非リン酸化オプシンとの間の結合を増加させる変異、を有するアレスチン・ポリペプチド、を含む組成物の有効量、を投与することを含む。
［項６４］
項６２又は６３に記載の方法、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)1に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項６５］
項６２又は６３に記載の方法、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO)2に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
［項６６］
項６２又は６３に記載の方法、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、及びその組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項６７］
項６２又は６３に記載の方法、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はその組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
［項６８］
内側網膜細胞(inner retinal cell)に光レセプター機能を提供する方法、ここで、前記方法は、項１～５４の何れか一項に記載の組成物の有効量、を投与することを含む。
［項６９］
項１～５４の何れか一項に記載の組成物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを投与することを含む、オプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法。
［項７０］
対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、項１～５４の何れか一項に記載の組成物の有効量、を投与することを含む。
［項７１］
項６９に記載の方法、ここで、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー及び黄斑ジストロフィー；他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター機能の喪失に起因する症状、である。
［項７２］
項５５～７１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記組成物は、注射投与可能な液体である。
［項７３］
項５５～７２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記組成物を、注射投与によって、好ましくは眼内注射投与によって、好ましくは網膜下注射投与又は硝子体内注射投与によって、投与する。
［項７４］
項１～５４の何れか一項に記載の組成物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを投与することを含む、光活性化可能な細胞を作成するための方法。
［項７５］
項７４に記載の方法、ここで、前記ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド発現ベクターを更に含む。
［項７６］
項７４又は７５に記載の方法、ここで、前記ポリヌクレオチドは、GRK1 G-タンパク質共役レセプター・キナーゼをコードする核酸配列を更に含む。
［項７７］
項７４から７６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ポリヌクレオチドは、前記細胞のゲノムの中に組み込まれる。
［項７８］
項７４～１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ポリヌクレオチドは、構成的に発現する。
［項７９］
項７４～１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ポリヌクレオチドは、一過的に発現する。
［項８０］
項７４～１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞は、神経細胞を含む。
［項８１］
項７４～１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞は、神経幹細胞を含む。
［項８２］
項７４～１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞は、内側網膜細胞(inner retinal cell)を含む。
［項８３］
項８２に記載の方法、ここで、前記内側網膜細胞(inner retinal cell)は、オン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞(ganglion cell)及び／又はアマクリン細胞である。
［項８４］
項８３に記載の方法、ここで、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター機能の喪失に起因する症状、である。
［項８５］
項５５～８４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記組成物を、注射投与によって、好ましくは眼内注射投与によって、好ましくは網膜下注射投与又は硝子体内注射投与によって、投与する。

Claims

オプシン・ポリペプチド及びアレスチン・ポリペプチドを含む組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドのうちの少なくとも1つは、光に対する前記オプシン・ポリペプチドの応答の時間分解能を増加させる変異、を含む。
請求項１に記載の組成物、ここで、前記アレスチンは、変異体である。
請求項１に記載の組成物、ここで、前記アレスチンは、野生型である。
請求項１～３の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシンは、野生型である。
請求項１～３の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシンは、変異体である。
請求項１若しくは２、又は請求項１若しくは２に従属する場合の請求項４若しくは５、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、オプシン・ポリペプチドとアレスチン・ポリペプチドとの間のリン酸化非依存性の結合、を許容する変異、を含む。
請求項１～６の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、リンカーを介して、前記アレスチン・ポリペプチドに、作動可能に連結する。
請求項７に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
請求項７に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
請求項１～６の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドと前記アレスチン・ポリペプチドとは分離している。
請求項１～１０の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシンは、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼによって最小限にリン酸化される。
請求項１～３、又は請求項１若しくは２に従属する場合の請求項５～１１、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、シッフ塩基加水分解の速度を又はメタ-II崩壊の速度を増加させる少なくとも1つの変異、を含む。
請求項１２に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、L59Q、Y74F、E122Q、A132L、A132S、Y136F、I189P、Y227F、Y306F、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
請求項１若しくは２、又は請求項１若しくは２に従属する場合の請求項４～１１、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、C末端のリン酸化部位に関連する変異、を含む。
請求項１～３若しくは５、又は請求項１～３若しくは５に従属する場合の請求項６～１３、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、C末端のリン酸化部位に関連する変異、を含む。
請求項１４に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、位置S333A、T336A、T340A、T342A若しくはS343A、又はそれらの組み合わせ、に、置換変異、を含む。
請求項１４又は１５に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、位置S333A、T336A、T340A、T342A及びS343Aに、置換変異、を含む。
請求項１～３若しくは５、又は請求項１～３若しくは５に従属する場合の請求項６～１６、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチドは、配列番号（SEQ ID NO)４に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
請求項１、２、又は請求項１若しくは２に従属する場合の請求項４～１８、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、配列番号（SEQ ID NO)１又は２に対して、少なくとも70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
請求項１、２、又は請求項１若しくは２に従属する場合の請求項４～１９、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、非リン酸化オプシンに対する親和性が増加することと関連する変異、を含む。
請求項１、２、又は請求項１若しくは２に従属する場合の請求項４～２０、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
請求項２２に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、変異377A、V378A及びF379Aを含む(Arr3A)。
請求項１、２、又は請求項１若しくは２に従属する場合の請求項４～２２、の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、L377A、V378A、F379A、K261Q、E350H、Q332K、又はそれらの組み合わせ、からなる群より選択される少なくとも1つの変異、を含む。
請求項２３に記載の組成物、ここで、前記アレスチン・ポリペプチドは、変異K261Q、E350H、及びQ332Kを含む(ArrKEQ3A)。
アレスチン・ポリペプチドに作動可能に連結したオプシン・ポリペプチドを含む組成物、好ましくは、ここで、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドは、請求項２～２０の何れか一項に定義される通りである。
請求項２５に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
請求項２５に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
i)オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸、を含む第1のベクター；又はii)オプシン・ポリペプチドをコードする第1の核酸を含む第1のベクター、及びアレスチン・ポリペプチドをコードする第2の核酸を含む第2のベクター、を含む組成物。
請求項２８に記載の組成物、ここで、前記オプシン・ポリペプチド及び前記アレスチン・ポリペプチドは、請求項２～２０の何れか一項に定義される通りである。
請求項２８又は２９に記載の組成物、ここで、i)の第1のベクターは、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする核酸を更に含む；若しくはii)の第1若しくは第2のベクターは、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする核酸を更に含む；又は前記組成物は、G-タンパク質共役レセプター・キナーゼGRK1ポリペプチドをコードする核酸を含む更なるベクターを含む。
請求項２８～３０の何れか一項に記載の組成物、ここで、ベクターは、前記オプシン・ポリペプチドと前記アレスチン・ポリペプチドとが、作動可能に連結するためのリンカーを含む。
請求項３１に記載の組成物、ここで、i)のベクターは、第1の核酸配列と第2の核酸配列との間にリンカーを含む；又はii)のベクターの核酸配列は、リンカーを含む。
請求項３２に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性リンカー、剛性リンカー、準-可撓性リンカー、ER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
請求項３３に記載の組成物、ここで、前記リンカーは、可撓性グリシン-セリン・リンカー、剛性α-ヘリックス形成リンカー、可撓性端部を有する剛性リンカーを有する準-可撓性リンカー、及びER/Kリンカー、又はそれらの組み合わせ、である。
請求項２８～３４の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記第1、第2又は更なるベクターのうちの1種以上は、ウイルス・ベクターである。
請求項２８～３５の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記第1、第2及び更なるベクターは、ウイルス・ベクターである。
請求項２８～３６の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記ウイルス・ベクターは、AAV、好ましくはAAV2である。
先行する請求項の何れか一項項に記載の組成物、ここで、前記アレスチンは、動物アレスチン又はヒト・アレスチンである。
先行する請求項の何れか一項項に記載の組成物、ここで、前記オプシンは、動物オプシン又はヒト・オプシンである。
先行する請求項の何れか一項項に記載の組成物、ここで、前記組成物は、眼球又は網膜下投与に好適である。
先行する請求項の何れか一項に記載の組成物を含む注射投与可能な液体。
内側網膜細胞(inner retinal cell)に光レセプター機能を提供する方法、ここで、前記方法は、請求項１～４１の何れか一項に記載の組成物の有効量を、前記細胞に投与することを含む。
細胞において、オプシン・ポリペプチドの不活性化を増加させる方法、ここで、前記方法は、請求項１２又は１３に記載の組成物の有効量、を投与することを含む。
細胞の中でのオプシンの光応答の時間分解能を増加させる方法、ここで、前記方法は、請求項２２に記載の組成物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを、前記細胞に投与することを含む。
対象において、網膜変性の症状を治療する（前記対象は、それを必要とする）方法、ここで、前記方法は、請求項１～４１の何れか一項に記載の組成物の有効量、を投与することを含む。
請求項４４に記載の方法、ここで、前記網膜変性の症状は、網膜ジストロフィー、桿体ジストロフィー、桿体-錐体ジストロフィー、錐体-桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー及び黄斑ジストロフィー；他の形態の網膜変性又は黄斑変性、虚血症状、ブドウ膜炎又は光レセプター能の喪失に起因する症状、である。
請求項４４又は４５に記載の方法、ここで、前記組成物を、注射投与によって、好ましくは眼球内注射投与によって、好ましくは網膜下注射投与又は硝子体内注射投与によって、投与する。
請求項３０～４１の何れか一項に記載の組成物を前記細胞に投与することを含む、光活性化可能な細胞を作成するための方法。
請求項４８に記載の方法、ここで、核酸配列は、前記細胞のゲノムの中に組み込まれる。
請求項４８又は４９に記載の方法、ここで、核酸配列は、構成的に発現する、又は一過的に発現する。
請求項４８～５０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞は、神経細胞、神経幹細胞、又はオン-双極細胞(ON-bipolar cell)、オフ-双極細胞(OFF-bipolar cell)、水平細胞(horizontal cell)、神経節細胞及び／若しくはアマクリン細胞を含む内側網膜細胞、を含む。