WO2020221970A1 - Methode de production de peptides ou proteines ou peptidomimetiques - Google Patents

Methode de production de peptides ou proteines ou peptidomimetiques Download PDF

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Jean-Jacques YOUTE TENDOUNG
Audrey SERRE
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Strainchem
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to the chemistry of peptides or proteins or peptidomimetics, and more particularly their syntheses by chemical means from bifunctional molecules, and in particular from a, b or g-amino acids and / or a, b or g- acids. hydroxylated and / or a, b or g-mercapto acids.
  • the invention relates to a process for producing peptides or proteins or peptidomimetics in solution.
  • This process does not use conventional protective groups such as te / f-butoxycarbonyl (Boc) or fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) on the amine function of the a, b, or g-amino acid.
  • Boc te / f-butoxycarbonyl
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • This process is based on the use of a, b, or g-amino acids or a, b, or g-hydroxy acids or a, b, or g-mercapto acids activated in the form, respectively, of 2,2 - bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin-5-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazinan-6-one, or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazepan -7-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxolan-4-one, or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxan-4-one, or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxepan-4-one, or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxathiolan-5-one, or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3- oxathian- 6-one
  • the anchor molecule is linked to a molecule having at least two electrophilic and / or nucleophilic functional groups, and in particular to a first acid a, b, or g-amino or acid a, b, or g-hydroxylated or a, b , or g-mercapto acid, which will then be the subject of successive elongation / iteration steps to lead to peptides or proteins or peptidomimetics.
  • This process makes it possible to obtain peptides or proteins or peptidomimetics in a more efficient way (that is to say with a reduced number of steps), faster, purer or easier to purify than the methods on solid support or in current solution. It is easy to automate.
  • the most frequently used peptide or protein or peptidomimetic synthesis routes involve temporary protection of the amine (Na) function of amino acids.
  • the main protective groups used are the te / f-butoxycarbonyl group, this approach is commonly called the “Boc” strategy, and the fluorenylmethoxycarbonyl group, this approach is commonly called the “Fmoc” strategy.
  • These two peptide synthesis routes are known to those skilled in the art (see Section 7-5 of the “Biochemistry” manual by D. Voet and J .G. Voet, 2 nd edition, Brussels 2005).
  • the amino acids are supplied in the protected state on the amine function (Na) by the Fmoc or Boc group, and are involved directly in the activation / coupling reactions.
  • Amino acids can be used in liquid phase or on a solid support; in the latter case, the amino acid protected on the amine function (Na) is fixed on a resin insoluble in organic solvents, this is the synthesis of Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149- 2154). It is a well-controlled process, which however has some drawbacks such as: the cost of reagents used in excess and the lack of homogeneity of the peptides synthesized. The system is said to be degenerate, which generates additional costs of purifications by preparative high performance liquid chromatography.
  • NCAs N-carboxyanhydrides
  • the problem that the present application proposes to solve is the design of a new methodology for synthesizing peptides or proteins or peptidomimetics making it possible to remove the locks linked to their access or production left in the prior art.
  • the problem is solved by a method of synthesizing peptides or proteins or peptidomimetics in liquid phase which comprises the combination of two essential characteristics which are detailed below.
  • the first object of the present invention is a process for the synthesis of peptides or proteins or peptidomimetics by successive elongation of the second end of a molecule of type Q a - E - Q b , where Q a and Q b can be identical or different. and represent an electrophilic and / or nucleophilic function, and E represents a spacer.
  • Said second end may in particular be a primary or secondary amine, a hydroxyl or a thiol, of an a, b, g or d-amino acid or a, b, g or d-hydroxyl acid or a, b, g or d -mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic, characterized in that said units are selected from the group formed by: acids a, b, g or d- amino or acids a, b, g or d-hydroxylated or a, b , g or d-mercapto acids (natural or unnatural or synthetic).
  • the first end of said Q a - E - Q b type molecule (for example of said a, b, g or d-amino acid or a, b, g or d-hydroxy acid or a, b, g or d-mercapto acid) or of said peptide or protein or peptidomimetic is attached to an anchoring molecule soluble in organic solvents such as halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydrofuran, 2 -methyletetrahydrofuran, isooctane, cyclohexane, hexane (s), methylcyclohexane, methyl tert-butyl ether or aromatic solvents such as benzene or toluene or any other suitable solvent.
  • organic solvents such as halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydr
  • the first essential feature is the use of a family of specific anchor molecules.
  • the anchoring molecules are polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes.
  • the method according to the invention provides access to high purity peptides or proteins or peptidomimetics (natural or unnatural or synthetic). This process generates savings of steps and atoms due to the absence of the use of protective groups (on the amine, hydroxyl or thiol functions of the main chain) and of coupling agents and therefore, financial savings. In the end, the process is more respectful of the environment.
  • the second essential feature is the use of bifunctional molecules of type Q a - E - Q b in which the groups Q a and Q b may be the same or different, and are selected from the electrophilic groups and / or the nucleophilic groups, and E represents a spacer.
  • Q a and Q b are selected from the group formed by chemical functions such as: alcohols, aldehydes, primary amines, secondary amines, azides, ethynils, halogens, thiols, vinyls, and / or the spacer E is selected from the group formed by structural units such as: aromatic, heteroaromatic, saturated alkyl chains (branched or not), unsaturated alkyl chains (branched or not), glycols (and preferably polyethylene glycol).
  • Figure 1 shows the structure of these activated forms.
  • the latter are prepared from a, b or g-amino acids (this expression meaning here: a-amino acids, b-amino acids or g-amino acids), or a, b or g-hydroxyl acids (this expression meaning here: a-hydroxy acids, b-hydroxy acids or g-hydroxy acids), or a, b or g-mercapto acids (this expression meaning here: a-mercapto acids, b-mercapto acids or g-mercapto acids) corresponding.
  • a, b or g-amino acids this expression meaning here: a-amino acids, b-amino acids or g-amino acids
  • a, b or g-hydroxyl acids this expression meaning here: a-hydroxy acids, b-hydroxy acids or g-hydroxy acids
  • a, b or g-mercapto acids this expression meaning here: a-mercapto acids, b
  • the method for synthesizing peptides or proteins or peptidomimetics proceeds by successive elongation of the second end (primary or secondary amine, hydroxyl or thiol) of a peptide or protein or peptidomimetic chain whose first end is attached to a molecule anchor soluble in an organic solvent.
  • Said anchor molecule comprises a polyolefin or polyolefin or polyalkene oligomer chain having at least 10 monomer units, and preferably between 15 and 350 monomer units.
  • said polyolefin chain is a polyisobutene (PIB) chain.
  • said anchoring molecule can be a polyolefin.
  • the polyolefin chain can be functionalized at at least one of its ends.
  • the polyolefin or polyolefin or polyalkene oligomer chain can comprise a number of unsaturated carbon-carbon bonds not exceeding 5%, and preferably not exceeding 3%, and / or the anchor molecule can exhibit a number of unsaturated carbon-carbon bonds. mass average molecular weight between 600 and 20,000, and preferably between 700 and 15,000.
  • ⁇ Y is O, S, CH2 or absent
  • ⁇ X b is selected from the group formed by: -OH, -IMH2, -NHR a , -SH, - CX a R a R b , -C 6 H 3 R c (CR a X a ),
  • R b is selected from the group consisting of -H, -Aryl, - Heteroaryl, -Alkyl, and
  • R c is selected from the group consisting of -H, -Alkyl, -O-Alkyl, -Aryl, -O-Aryl, -Heteroaryl, -O-Heteroaryl;
  • X a can be a primary or secondary amine function, an alcohol, a thiol or a phenol.
  • Certain GDP derivatives used in the context of the present invention are commercially available as ligands for homogeneous catalysis.
  • 2-methyl-3- [polyisobutyl (12)] propanol (mass average molecular weight 757, including terminal functionalization) or 4- [polyisobutyl (18)] phenol (mass weight average molecular weight 1104, including terminal functionalization) which are distributed, respectively, under the references 06-1037 and 06-1048 by the company Strem Chemicals.
  • an anchoring molecule soluble in an organic solvent as described above is capable also of acting as a liquid support or a group.
  • an anchoring molecule soluble in an organic solvent as described above facilitates the purification of a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxy acids or a, b or g-mercapto acids or peptides or proteins or peptidomimetics anchored by simple extraction (washing) or simple filtration on silica.
  • a simple extraction or a simple filtration makes it possible to obtain the anchored peptides or proteins or peptidomimetics with high chemical purity.
  • anchoring molecules are used, or anchoring molecules which can be synthesized simply and directly from commercially available precursors, in particular certain polyisobutenes derivatives ( GDP).
  • the a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids are reacted in their activated forms, respectively of, 2, 2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin-5-one or 2,2- bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxolan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxathiolan -5-one or (2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazinan-6-one, 2,2-bis (trifluoroméhyl) -1, 3-dioxan-4-one, 2,2- bis ( trifluoromethyl) -1, 3-oxathian-6-one, 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazepan-7-one, 2,2- bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxepan-4-one
  • the reaction is carried out in any inert liquid solvent (or mixture) capable of to dissolve the reagents.
  • Applicable solvents include, but are not limited to halogenated and non-halogenated hydrocarbons.
  • the preferred solvents are tetrahydrofuran, ethyl acetate, 2-methyltetrahydrofuran, propylene carbonate, or any other solvent or mixture of solvents capable of dissolving these two chemical species.
  • the reactions between the GDP derivatives and the activated a, b or g-amino acids or activated a, b or g-hydroxylated acids or activated a, b or g-mercapto acids take place in batch chemistry (especially in a flask or cistern), but preferably, they are carried out in flow chemistry (also called continuous flow chemistry).
  • the a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids having side chains incompatible with the conditions of the reaction of anchoring / elongation or iteration can be temporarily masked by an appropriate protective group. It can in particular be chosen from the group formed by:
  • Boc te / f-butoxycarbonyle
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • Trt trityl
  • Mtr 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulphonyl
  • said anchoring molecule reacts with a first acid a, b, or g-amino or acid a, b, or g-hydroxylated or a, b, or y-mercapto acid activated ( here abbreviated AAA1), resulting in a covalent bond between the acid a, b, or g-amino or acid a, b, or g-hydroxylated or a, b, or g-mercapto acid and the anchor molecule.
  • AAA1 a first acid a, b, or g-amino or acid a, b, or g-hydroxylated or a, b, or y-mercapto acid activated
  • said peptide or protein or peptidomimetic chain is formed of n units of a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxyl acids or a, b or g-mercapto acids ; its second end is another unit of a, b or g-amino acid or a, b or g-hydroxyl acid or a, b or g-mercapto acid, here abbreviated AAAn.
  • AAA g-amino acid or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or g-mercapto acid
  • Z NH, N-alkyl, N-aryl, O, S
  • R 1 , R 2, 3 , R 4 H and / or alkyl and or aryl
  • Reaction scheme No. 2 General process for obtaining a peptide
  • a, b or g-amino acids and / or acids it is possible to use in said peptide or protein or peptidomimetic chain, a, b or g-amino acids and / or acids. a, b or g-hydroxylated and / or a, b or g-mercapto natural and / or unnatural and / or synthetic acids.
  • the spacer E can be an entity selected from the group formed by:
  • the molecules of the Q a - E - Q b type carry a terminal function selected from the group formed by the primary amine function, the secondary amine function, the hydroxyl function or the thiol function.
  • said a, b or g-amino acids, said a, b or g-hydroxylated acids and said a, b or g-mercapto acids represent particular cases of bifunctional molecules of the type Q a - E - Q b . It is the same for said d-amino acids, said d-hydroxy acids and said d-mercapto acids, which however are not necessarily involved in the reaction in their activated form, like other bifunctional molecules which are not a, b or g-amino acids, acids a, b or g-hydroxylated or a, b or g-mercapto acids.
  • the bifunctional molecule Q a - E - Q b can have a molecular structure, selected in particular from epoxides, aziridines, thiiranes.
  • peptidomimetics comprising an epoxy-succinate group, like the E-64 peptide, or even azirido peptides, like Miraziridine, can be prepared according to the invention.
  • bifunctional molecules of type Q a - E - Q b which can be used in the context of the present invention: sarcosine, 2- (1-aminoethyl) -1, 3-oxazole- acid. 4-carboxylic and (2R, 3R, 4R) -3-hydroxy-2,4,6-trimethyl-heptanoic acid.
  • Said bifunctional molecule Q a - E - Q b can in particular be an amino acid according to the definition which is given below. It can also be a peptide, for example a dipeptide, a tripeptide, a tetrapeptide, a pentapeptide, a hexapeptide, a heptapeptide, an octapeptide, a nonapeptide, a decapeptide, or an even longer peptide.
  • bifunctional molecules can be introduced into the peptide or protein or peptidomimetic chain by known chemical reactions. They do not bear a protective group on a terminal function selected from the group formed by the primary amine function, the secondary amine function, the hydroxyl function or the thiol function.
  • a protective group on a terminal function selected from the group formed by the primary amine function, the secondary amine function, the hydroxyl function or the thiol function For example, if said bifunctional molecule is an amino acid or a peptide, it does not bear N-terminal protection; it is possible to protect its side chains or side functions, which are not modified during the elongation of the peptide.
  • said a, b or g-amino acids, said a, b or g-hydroxy acids and said a, b or g-mercapto acids are preferentially used in their activated forms.
  • the units derived from bifunctional molecules which are not selected from among the a, b or g-amino acids, the a, b or g-hydroxyl acids and the a, b or g-mercapto acids, can advantageously be attached to the end C-terminal of said peptidomimetic, or on the terminal end (in particular by functionalization of the primary or secondary amine, hydroxyl or thiol function), or else on the side chain (of at least an a, b or g-amino acid or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or g-mercapto acid), or between two units selected from among the a, b or g-amino acids, the a acids, b or g-hydroxy and a, b or g-ercapto acids.
  • the number of units resulting from bifunctional molecules which are not selected from among the a, b or g-amino acids, the a, b or g-hydroxyl acids and the a, b or g-mercapto acids does not exceed 50% by number, and preferably does not exceed 25% by number.
  • an organic solvent such as cyclohexane, l heptane (s) or any other suitable solvent
  • peptides or proteins or peptidometics of high purity, after deprotection of the side chains (if necessary), then detachment of their anchoring molecule after the last iteration step. , to be used according to their destination, for example as an active principle for preclinical trials, clinical care or any other applications.
  • the anchor molecules can be reused (recycled) in the process according to the invention.
  • a second object of the present invention is a molecule which can be obtained by the process according to the invention.
  • Said molecule comprises an a, b or g-amino acid or a, b or g-hydroxy acid or a, b or g-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic attached to an anchor molecule.
  • amino acid in the context of the present invention, we mean: natural amino acids and unnatural or synthetic amino acids.
  • Natural amino acids include the L form of so-called standard proteinogenic amino acids which can be found in proteins of natural origin, ie: alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn) , aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gin), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr) and valine (Val). They also include other proteinogenic amino acids, and in particular pyrrolysine and selenocysteine.
  • Unnatural amino acids include the D-form of the natural amino acids defined above, the homo forms of certain natural amino acids (such as: arginine, lysine, phenylalanine and serine), and the nor forms of leucine and valine.
  • Unnatural amino acids also include all synthetic amino acids. They also include unnatural amino acids, such as:
  • iPr isopropyl-lysine (CH 3 ) 2C-NH- (CH 2 ) 4-CH (COOH) (NH 2 );
  • Aib 2-aminoisobutyric acid
  • F-trp N-formyl-tryptophan
  • Orn ornithine
  • Nal (2 ’) 2-naphthylalanine.
  • activated amino acid is used herein to denote activated a, b, or g-amino acids respectively in the form of 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin -5-one or (2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazinan-6-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazepan-7-one, and their derivatives, with the possibility or not of a protective group on the side chain.
  • the present invention is also applicable to the synthesis of peptidomimetics.
  • the precursors used for this synthesis are defined as follows:
  • a, b or g-hydroxyl acid is used herein according to the rules of terminology of IUPAC, known to those skilled in the art. Examples are compounds such as lactic acid, malic acid, tartaric acid, salicylic acid or g-hydroxybutyric acid, which are found in nature. In the context of the present invention, it is also possible to use all the “unnatural” a, b or g-hydroxylated acids which also include all the synthetic a, b or g-hydroxylated acids.
  • activated a, b or g-hydroxy acid denotes all natural and / or unnatural and / or synthetic a, b or g-hydroxy acids, which have been activated respectively in the form of 2,2-bis ( trifluoromethyl) -1, 3-dioxolan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3- dioxan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxepan-4-one , and their derivatives, with the possibility or not of a protective group on the side chain.
  • a, b or g-mercapto acid is used here according to the rules of terminology of IUPAC, known to those skilled in the art.
  • Examples are compounds such as thioglycolic acid, 3-mercaptopropionic acid, mercaptobutanoic acid.
  • activated a, b or g-mercapto acid denotes all compounds resulting from the activation of a, b or g-mercapto acids (natural, unnatural or synthetic) in the form of 2,2-bis ( trifluoromethyl) -1, 3-oxathiolan-5-one or 2,2- bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxathian-6-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxathiepan-7-one , and their derivatives, with the possibility or not of a protective group on the side chain.
  • a, b, g and d refers to the position of the carbon substituted by the amine (primary or secondary) or hydroxyl or thiol function with respect to the carbon of the carboxylic acid function. (C-terminal).
  • peptidomimetic is used according to the state of the art as a functional term for a molecule capable of mimicking or blocking a peptide with respect to its interaction with a specific receptor.
  • a peptidomimetic can comprise units which are not amino acids.
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • a first essential characteristic of the process according to the invention is the use of a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids activated in the form of 2, respectively, 2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin-5-one or (2,2-bis (trifluoro-methyl) -1, 3-oxazinan-6-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazepan-7-one or 2,2-bis (tri-fluoromethyl) -1, 3-dioxolan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxan-4-one or 2, 2-bis (tri-fluoromethyl) -1, 3-dioxepan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3- oxathiolan-5-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3 -oxathian-6
  • A, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids activated in the form of 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin-5- respectively one or (2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazinan-6-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazepan-7- one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxolan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-dioxan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1 , 3-dioxepan-4-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3- oxathiolan-5-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxathian-6-one or 2,2 -bis (trifluoromethyl) - 1, 3-ox
  • X NH, N-alkyl, N-aryl, O, S,
  • the anchoring molecules are polyolefins or more precisely oligomers of polyolefins (polyolefins also being called polyalkenes) and their derivatives, that is to say they are functionalized.
  • this method of synthesizing peptides or proteins or peptidomimetics (protected or not on their side chains), in the liquid phase is characterized in that one starts from an anchoring molecule and an a, b or g-amino acid or a, b or g-hydroxyl acid or a, b or g-mercapto acid activated respectively in the form of 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin- 5-one or (2,2- bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazinan-6-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazepan-7-one or
  • the elongation / iteration step consists in adding or condensing the following a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids, which are possibly protected on their side chain (in the form of ester, ether, thioester, thioether or any other functions chemicals compatible with this process).
  • the anchoring molecule plays a role of protective group of the carboxylic acid function (C-terminal) of the first acid a, b or g-amino or acid a, b or g-hydroxylated or a, b or g-mercapto acid.
  • this method of peptide or protein or peptidomimetic synthesis can be carried out using a fragment of a suitably protected peptide or protein or peptidomimetic and an a, b or g-amino acid or a, b or g acid. -hydroxylated or a, b or g-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic, anchored on a GDP molecule, allowing after coupling to obtain a longer peptide or protein or peptidomimetic.
  • this method of peptide or protein or peptidomimetic synthesis can be carried out using molecules Q a - E - Q b having at least two functional groups Q a and Q b , which are identical or different, and which are selected from the electrophilic and / or nucleophilic chemical functions.
  • Examples of such structures are styrene oxide, aminothiophenoles or 1-azido-4- (bromomethyl) benzene.
  • These molecules can be directly attached to the anchor molecule or introduced during synthesis on the amine function (primary or secondary) or hydroxyl or thiol, a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids or peptides or anchored proteins or peptidomimetics.
  • the process according to the invention can be carried out in any inert liquid solvent (or mixture) capable of dissolving the reactants (halogenated or not), at a temperature typically between about -20 ° C and about 150 ° C, in a reactor ( in batch or in flow).
  • the a, b or g-amino acid or a, b or y-hydroxylated acid or a, b or g-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic anchored on a GDP molecule is characterized in that the terminal function of said a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic or any other molecule having at least two functional groups is linked by a covalent bond (ester, ether, amide, thioester or any other chemical functions), thus giving a very low solubility in water ( ⁇ 30 mg / ml). It is in this sense that the GDP derivative acts as a liquid carrier or solubilizing molecule for the synthesis of peptides or proteins or peptidomimetics.
  • Reaction Scheme No. 4 shows the reaction of an activated amino acid in the form of 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin-5-one with a derivative of polyisobutene (abbreviated PIB) which is terminated by a phenol function.
  • PIB polyisobutene
  • the ⁇ -amino acid is L-phenylalanine (Phe).
  • the first ⁇ -amino acid of the future peptide is attached to the anchor molecule via an ester-type covalent bond.
  • Reaction diagram 5 shows the elongation or iteration step, i.e. the attachment of a second unit of amino acid, to the first amino acid attached to the anchor molecule.
  • second ⁇ -amino acid is L-tryptophan (Trp).
  • this process allows, by successive iterations, to add units of a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids on the last acid a, b or g-qhi ⁇ h ⁇ or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or g-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic fixed on the derivative of PIB, during synthesis, to obtain a peptide or protein or peptidomimetic having the desired sequence.
  • the peptide or protein or peptidomimetic being chemically linked to the anchor molecule, it can be separated at any time, and in particular after the last iteration step, of all polar products by extraction in an organic solvent such as hexane (s) or cyclohexane and water or in a water / ethanol or water / acetonitrile mixture.
  • an organic solvent such as hexane (s) or cyclohexane and water or in a water / ethanol or water / acetonitrile mixture.
  • the peptide or protein or peptidomimetic can be detached from the anchor molecule; thus the peptide or the protein or the peptidomimetic loses its solubility in an apolar solvent, and it can be separated from the anchor molecule, for use according to its purpose.
  • the derivation (or anchoring) of an a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic (protected or not on its side chain (s)) with a derivative of PIB in fact causes a significant increase in the solubility of said a, b or y-amino acid or a, b acid or g-hydroxylated or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic anchored in organic liquid phase.
  • these a, b or y-amino acids or a, b or g-hydroxy acids or a, b or y-mercapto acids or peptides or proteins or peptidomimetics anchored on a derivative of PIB become soluble in organic solvents, such as than halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydrofuran, 2-methyletetrahydrofuran, isooctane, cyclohexane, hexane (s), methylcyclohexane, methyl tert-butyl ether propylene carbonate or aromatic solvents such as benzene or toluene or any other suitable solvent.
  • organic solvents such as than halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydrofuran, 2-methyletetrahydrofuran, isooctane, cycl
  • a, b or y-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or y-mercapto acids or peptides or proteins or peptidomimetics anchored on a GDP derivative have a high partition coefficient for the phase organic during extraction / decantation, thus allowing simple and rapid purification.
  • their solubility in solvents such as water or a mixture of water / ethanol or water / acetonitrile is very low.
  • the reaction between a derivative of PIB and the first acid a, b or y-amino or acid a, b or g-hydroxylated or a, b or y-mercapto acid activated leads to a product whose solubility in water is low ( ⁇ 30 mg / ml).
  • FIG. 6 shows an example of the step of detaching an octapeptide having the sequence Phe-Tpr-Cys (Bzl) -Trp-Cys (Bzl) -Trp-Trp-Cys (Bzl) -NH2, from anchor molecule (derivative of PIB terminated by a phenol function), on which the peptide is anchored by the carboxylic acid function (C-terminal) of L-phenylalanine.
  • the side chains of L-cysteine residues are protected by a benzyl group (Bzl).
  • the free peptide is insoluble in apolar solvents (ie cyclohexane, hexane (s)), which allows it to be easily separated from the anchor molecule.
  • the anchor molecule can be recovered for reuse in the process.
  • Reaction scheme 6 Detachment of an octapeptide from the anchor molecule The peptide precipitates in solvents such as: ethyl ether, cyclohexane or any other suitable solvent. It can then be used according to its intended purpose.
  • solvents such as: ethyl ether, cyclohexane or any other suitable solvent. It can then be used according to its intended purpose.
  • the process according to the invention uses polyolefins or more precisely oligomers of polyolefins (polyolefins also being called polyalkenes), and their derivatives as anchoring molecules or liquid support or protective group, whether for the carboxylic acid function ( C-terminal) of the a, p or y-amino acid or a, b or g-hydroxy acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic, or of the side chain of said a, b acid or y- amino or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic (in the form of ester, amide, ether, thioester, thioether or any other suitable chemical functions) in liquid phase.
  • polyolefins also being called polyalkenes
  • their derivatives as anchoring molecules or liquid support or protective group,
  • Polyolefin molecules consist of a chain of carbon atoms linked together by single bonds. They can include branches made up of alkyl groups identical or different, but preferably identical. Preferably, the polymers consist of a number of monomer units of at least 10 and preferably between 15 and 350. Homopolymers are preferred, but copolymers (saturated or not) can be used. In the case of unsaturated polymers or copolymers, the number of unsaturated bonds in the chain of carbon atoms advantageously does not exceed 5%, and preferably does not exceed 3%.
  • PIB polyisobutenes
  • ⁇ Ar is an aromatic or heteroaromatic group, substituted or not;
  • A is either absent or a group selected from the group formed by: CH2, CH2-CH2, S;
  • R f is a group selected from the group formed by H, aryl, hetero-aryl, alkyl, O-alkyl, O-aryl, O-hetero-aryl;
  • R q is a group selected from the group consisting of H, alkyl, O-alkyl, aryl, hetero-aryl, O-aryl, O-hetero-aryl;
  • n is an integer which is typically greater than 10, and advantageously between 15 and 350.
  • the number m is either 0 or 1.
  • the group X e can be a function in a primary or secondary amine, an alcohol, a thiol or a phenol.
  • these anchoring molecules are linked to the carboxylic acid function of an a, b or g-amino acid or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or g-mercapto acid (C-terminal ) or all chemical functions of a molecule having at least two functional groups via a covalent bond.
  • GDP derivatives a suitably functionalized form
  • This term also encompasses here the derivatives of anchoring molecules which are not derivatives of polyisobutene, but which are derivatives of other polyolefins according to the definition which is given above; it includes in particular the derivatives of polyolefin oligomers.
  • This functionalization of the anchor molecule is in general a terminal functionalization, preferably at one of the ends of the chain of carbon atoms; it is described below.
  • the a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxy acids or a, b or g-mercapto acids or peptides or proteins or peptidomimetics can be functionalized on their side chains with derivatives of PIB , in the form of ester, ether, thioether, thioester or any other chemical functions compatible with the present process.
  • the chains of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes used as anchoring molecules are typically characterized by an average molecular mass by mass, but it is also possible to use chains of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes called "homogeneous" which comprise identical molecules of a given chain length.
  • the process for the synthesis of peptides or proteins or peptidomimetics, optionally protected on their side chains, in liquid phase (solution) according to the invention is characterized by the fact that an acid a, b or y- is solubilized.
  • the PIB derivative acts as an anchoring molecule (also referred to here as a “liquid carrier” or “solubilizing molecule”) of the a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxyl acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic or any other molecule having at least two functional groups.
  • an anchoring molecule also referred to here as a “liquid carrier” or “solubilizing molecule” of the a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxyl acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic or any other molecule having at least two functional groups.
  • Said peptide or protein or peptidomimetic attached to this anchoring molecule is synthesized by successive attachment of a, b or y-amino acids or a, b or g-hydroxyl acids or a, b or y-mercapto acids or any other molecules having at least two functional groups on the last a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxy acid or a, b or y-mercapto acid or any other molecule having at least two functional groups.
  • the anchor molecule also serves as a protective group for the carboxylic acid function (C-terminal) during the synthesis of the peptide or protein or peptidomimetic during successive iterations.
  • the carboxylic acid function (C-terminal) of said a, b or y-amino acid or a, b or y-hydroxylated acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic, optionally protected on its chain (s) (s) lateral (s), is linked by a covalent bond of ester, amide, thioester, or any other covalent chemical bond type, to a derivative of lipophilic PIB, giving a very low solubility in water ( ⁇ 30 mg / ml). It is in this sense that the GDP derivative acts as a liquid carrier or solubilizing molecule for the synthesis of peptides or proteins or peptidomimetics.
  • This derivative of the a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or y-mercapto acid or peptide or protein or peptidomimetic (protected or not on its side chains) with a derivative of PIB significantly increases the solubility of said a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxy acid or a, b or y-mercapto acid or anchored peptide or protein or peptidomimetic, in organic liquid phase.
  • these a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxy acids or a, b or g-mercapto acids or peptides or proteins or peptidomimetics anchored on the derivative of PIB become soluble in organic solvents such as : halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydrofuran, 2-methyletetrahydrofuran, isooctane, cyclohexane, hexane (s), methylcyclohexane, methyl tert-butyl ether or aromatic solvents such as benzene or toluene or any other suitable solvent.
  • organic solvents such as : halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydrofuran, 2-methyletetrahydrofuran, isooctane, cyclohexane
  • a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxy acids or a, b or g-mercapto acids or peptides or proteins or peptidomimetics attached to a derivative of PIB have a high partition coefficient for the organic phase during extraction / decantation in the presence of cyclohexane or hexane (s) and water or a water / ethanol mixture or else water / acetonitrile, thus allowing their simple and rapid purification.
  • the starting point is a molecule having at least two functional groups or an acid a, b, or g-amino or a, b, or g-hydroxy acid or a, b, or g-mercapto acid activated respectively in the form of 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazolidin-5 -one or (2,2- bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazinan-6-one or 2,2-bis (trifluoromethyl) -1, 3-oxazepan-7-one or
  • the method for synthesizing peptide or protein or peptidomimetic according to the invention can be carried out using a fragment of peptide or protein or peptidomimetic suitably protected on its side chains and a peptide or protein or peptidomimetic sequence anchored on a GDP molecule allowing, afterwards coupling, to obtain a longer peptide or protein or peptidomimetic.
  • the method for synthesizing a peptide or protein or peptidomimetic according to the invention can be carried out using molecules having at least two groups functional, namely a group Q a and Q b group, which may be identical or different and which are selected from the electrophilic groups and / or nucleophilic groups.
  • Q a can be an electrophilic group
  • Q b can be a nucleophilic group
  • Q a can be a first electrophilic group and Q b a second electrophilic group
  • Q a can be a first nucleophilic group and Q b a second nucleophilic group
  • Q a and Q b can also denote the same electrophilic group, or even the same nucleophilic group.
  • These molecules having at least two functional groups can be directly anchored on the anchor molecule or introduced during synthesis on the amine (primary or secondary) or hydroxyl or thiol function, of a, b or g-amino acids or a acids , p or y-hydroxy or a, b or y-mercapto acids or anchored peptides or proteins or peptidomimetics.
  • a slight stoichiometric excess of the a, b or y-amino acid or a, b or g-hydroxylated acid or a, b or y-mercapto acid activated, during each anchoring step, is used. elongation and / or iteration.
  • bifunctional molecules can be introduced into the peptide or protein or peptidomimetic chain by known chemical reactions. If necessary, they can be protected or masked (on its nucleophilic function or any other chemical functions requiring it, by means of known reactions) and activated by known techniques.
  • the units derived from bifunctional molecules which are not selected from among a, b or y-amino acids or a, b or g-hydroxy acids or a, b or y-mercapto acids can advantageously be attached to the C-terminus of said peptide or protein or peptidomimetic, or on the N, O or S-terminal end (in particular by functionalization of the amine, hydroxyl or thiol function), or else on the side chain, or alternatively between two units selected from the acids a , b or y-amino or a, b or g-hydroxy acids or a, b or y-mercapto acids.
  • the number of units derived from bifunctional molecules which are not selected from among a, b or y-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or y-mercapto acids does not not exceed 50% in number of units, and preferably does not exceed 25% in number of units, and even more preferably does not exceed 10% in number of units.
  • semaglutide a peptidomimetic comprising on a side chain an ⁇ -aminobutyric acid unit, can be prepared using the process according to the invention.
  • a list of molecules of the a, b, g or d-amino acid type is given here which can be used as units within the framework of the process according to the invention, in addition to the amino acids already mentioned above: the acid d -amino levulinic acid, g-aminobutyric acid, b-aminobutyric acid (also known by the acronym BABA), b-alanine, b-lysine, b-aminoisobutyric acid, bN-Methylamino-L- alanine, (2S, 3S, 8S, 9S) -3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acid (also known as ADDA), G (2R) -2- (methylamino) butanedioic acid (also known as NMDA) and 4-amino-3-hydroxybutanoic acid.
  • BABA acid d -amino levulinic acid
  • a list of molecules of the a, b, g or d-hydroxylated acid type is given here which can be used as units in the context of the process according to the invention: 4-hydroxybutanoic acid, 2- (hydroxymethyl) acid -3-methylbutanoic and (2R, 3R, 4R) - 3-hyd roxy-2, 4, 6-tri m éthy I heptanoic acid.
  • a list of molecules of type a, b, y or d-mercapto acid is given here which can be used as units in the context of the process according to the invention: 4-sulfanylbutanoic acid, 2-cyclopropyl-3 acid -sulfanylpropanoic acid, 2-cyclobutyl-3- sulfanylpropanoic acid and 2- (2-sulfanylphenyl) butanoic acid
  • the method according to the invention has many advantages.
  • a first advantage is that it allows the production of peptides or proteins or peptidomimetics (protected or not on their side chains) linked to the anchor molecule in the organic liquid phase.
  • a second advantage is that it makes it possible to obtain peptides or proteins or peptidomimetics (protected or not on their side chains) anchored of high purity by a simple washing (extraction) in an apolar organic solvent and with water or a water / ethanol or even water / acetonitrile mixture or by filtration, thus causing the elimination of by-products (salts, acids or any other molecular species) which are not linked to the derivative of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes such as excess reagents.
  • Organic solvents such as cyclohexane, heptane, hexane (s) which have flash points ⁇ 15 ° C, are suitable for solubilizing the derivatives of polyolefins or of oligomers of polyolefins or polyalkenes during extraction or processing. washing.
  • the process according to the invention therefore makes it possible to limit the purification steps which are necessary in the processes of the state of the art.
  • a third advantage, which is particularly important, is that the process according to the invention makes it possible to synthesize peptides or proteins or peptidomimetics, by adjusting the length of the derivative of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes, that is to say by making them more lipophilic.
  • a fourth advantage is the possibility of controlling the purity of the peptide or protein or peptidomimetic during synthesis, at any time, by taking an aliquot followed by analysis by the various techniques known to those skilled in the art (such as than mass spectrometry, high performance liquid chromatography, proton or carbon-13 nuclear magnetic resonance).
  • a fifth advantage lies in the fact that it is not necessary to use a protective group for the amine function (primary or secondary) or hydroxyl or thiol, respectively, a, b or g-amino acids or a acids, b or g-hydroxy or a, b or g-mercapto acids which generally costs two steps (protection and deprotection). More generally, the process according to the invention allows an optimal economy of atoms because it does not involve either protective groups for the amine (primary or secondary) or hydroxyl or thiol function of the corresponding acids, or coupling agents. . This economy of atoms and of process steps according to the invention generates, in industrial reality, financial savings while reducing the generation of waste, which is a favorable environmental factor unlike current methods.
  • a sixth advantage of the invention lies in the fact that the activation of the carboxylic acid function (C-terminal) is concomitant with the protection of the amine (primary or secondary) or hydroxyl or thiol function, therefore reducing the number of steps.
  • a seventh particularly interesting advantage of the invention lies in the production of high purity peptides or proteins or peptidomimetics after the cleavage of the protective groups of the side chains, then of the anchor molecule. This avoids purifying the peptide or protein or peptidomimetic synthesized. As a result, additional savings are generated over known methods. This further limits the environmental impact of the production of peptides or proteins or peptidomimetics.
  • An eighth advantage of the invention lies in the possibility of accessing peptides or proteins or peptidomimetics of larger sizes, either by modulating the size of the liquid carrier or by introducing it on one or more side chains of a, b or g-amino acids or a, b or g-hydroxylated acids or a, b or g-mercapto acids activated.
  • the peptides or proteins or peptidomimetics produced by this process can be used as pharmaceutical products (drugs and vaccines), cosmetics, phytosanitary products, agrifood products or as intermediates to synthesize such products.
  • An octapeptide was prepared using the method according to the invention.
  • AAA1 activated L-phenylalanine
  • AAA2 activated L-tryptophan
  • AAA3 activated L-cysteine (protected by a benzyl (Bzl) protecting group)
  • This reaction corresponds to Reaction Scheme # 3 above.
  • an activated amino acid (activated L-phenylalanine referred to herein as AAA1) is coupled to the anchor molecule, in this case a derivative of PIB.
  • AAA1 activated L-phenylalanine
  • This reaction corresponds to Reaction Scheme # 4 above.
  • the peptide is extended by attaching another activated amino acid (here AAA2).
  • AAA2 another activated amino acid

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Abstract

Procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques par élongation successive de la deuxième extrémité (fonction amine primaire ou secondaire, hydroxyle ou thiol) d'une chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique par des unités, caractérisé en ce que : lesdites unités sont sélectionnées dans le groupe formé par : les acides α, β ou γ- aminés, les acides α, β ou γ-hydroxylés, les a, β ou γ-mercapto acides (naturels ou non naturels ou synthétiques), les molécules ayant au moins deux groupements fonctionnels; - la première extrémité dudit peptide ou protéine ou peptidomimétique est fixée par une liaison covalente à une molécule d'ancrage soluble dans des solvants organiques tels que les solvants halogénés (chlorure de méthylène, chloroforme), l'acétate d'éthyle, le tétrahydrofurane, le 2-méthyletétrahydrofurane, l'isooctane, le cyclohexane, l'hexane(s), le méthylcyclohexane, le méthyl tert-butyl éther ou des solvants aromatiques tels que le benzène ou le toluène ou tout autre solvant adéquat.

Description

METHODE DE PRODUCTION DE PEPTIDES OU PROTEINES OU
PEPTIDOMIMETIQUES
Domaine technique de l’invention
La présente invention concerne la chimie des peptides ou protéines ou peptidomimétiques, et plus particulièrement leurs synthèses par voie chimique à partir de molécules bifonctionnelles, et en particulier d’acides a, b ou g-aminés et/ou acides a, b ou g-hydroxylés et/ou a, b ou g-mercapto acides.
Plus précisément, l’invention concerne un procédé de production de peptides ou protéines ou peptidomimétiques en solution. Ce procédé n’utilise pas de groupements protecteurs classiques tels que le te/f-butoxycarbonyle (Boc) ou le fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) sur la fonction amine de l’acide a, b, ou g-aminé. De même, il n’est pas nécessaire d’utiliser des groupements protecteurs sur la fonction hydroxyle de l’acide a, b, ou g- hydroxylé, ou sur la fonction thiol de l’a, b, ou g-mercapto acide.
Ce procédé est basé sur l’utilisation d’acides a, b, ou g-aminés ou acides a, b, ou g- hydroxylés ou a, b, ou g-mercapto acides activés sous la forme, respectivement, de 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one, ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one, ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan-4-one, ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4- one, ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5-one, ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxathian-6-one, ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiépan-7-one ou leurs dérivés et d’une famille de molécules d’ancrage, à savoir des dérivés de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes. La molécule d’ancrage est liée à une molécule ayant au moins deux groupement fonctionnels électrophile et/ou nucléophile, et notamment à un premier acide a, b, ou g-aminé ou acide a, b, ou g-hydroxylé ou a, b, ou g-mercapto acide, qui fera ensuite l’objet d’étapes d’élongation/itération successives pour conduire aux peptides ou protéines ou peptidomimétiques.
Ce procédé permet d’obtenir des peptides ou protéines ou peptidomimétiques de façon plus efficiente (c’est-à-dire avec un nombre d’étapes réduit), plus rapide, plus purs ou plus faciles à purifier que les procédés sur support solide ou en solution actuels. Il est facile à automatiser.
Etat de la technique
La croissance remarquable du développement des peptides ou protéines ou peptidomimétiques thérapeutiques au cours de la dernière décennie a conduit à un grand nombre d’approbations de nouvelles molécules sur le marché (voir les publications de J. Med. Chem., 2018, 22, 1382-1414, Bioorg. Med. Chem., 2018, 26, 2700-2707) ; ainsi la thérapie à base de peptides ou protéines ou peptidomimétiques est devenue l’un des segments les plus dynamiques dans l’industrie pharmaceutique. Les cancers, les maladies métaboliques et les maladies du système nerveux central sont les principales aires thérapeutiques accélérant la demande en nouveaux peptides ou protéines ou peptidomimétiques thérapeutiques.
Cependant, un certain nombre de verrous empêchent l’adoption généralisée des peptides, ou protéines ou peptidomimétiques en thérapie. On peut citer par exemple leur courte demi-vie métabolique et leur nature hydrophile. Un autre facteur clé, et de loin le plus important, retardant la croissance des applications thérapeutiques des peptides ou protéines ou peptidomimétiques est leur mode de production.
La toute première synthèse peptidique en phase liquide a été réalisée il y a plus d’un siècle par E. Fisher et E. Fourneau (Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1901 , 34, 2868-2879). Dès lors, de nombreux chimistes ont apporté des améliorations ; c’est le cas de Bodansky et du Vigneaud (J. Am. Chem. Soc., 1959, 51 , 5688-5691), de Beyerman et al. (Rec. Trav. Chim., Pays Bas 1973, 92, 481-492), de R. K. Sharma et R. Jain (Synlett 2007, 603-606), de Nodal et al. (Nature Chemistry 2017, 9, 571-577), de Liu et al. (Org. Lett. , 2018, 20, 612-615) et de Muramatsu et al. (ACS Catal., 2018, 8, 2181-2187).
Les voies de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques les plus fréquemment utilisées font intervenir une protection temporaire de la fonction amine (Na) des acides aminés. Aujourd’hui, les principaux groupements protecteurs utilisés sont le groupement te/f-butoxycarbonyle, cette approche est appelée couramment la stratégie « Boc », et le groupement fluorénylméthoxycarbonyle, cette approche est appelée couramment la stratégie « Fmoc ». Ces deux voies de synthèse de peptides sont connues de l’homme du métier (voir la Section 7-5 du manuel « Biochimie » de D. Voet et J .G. Voet, 2ème édition, Bruxelles 2005). En pratique, les acides aminés sont approvisionnés à l’état protégé sur la fonction amine (Na) par le groupement Fmoc ou Boc, et sont engagés directement dans les réactions d’activation/couplage.
Les acides aminés peuvent être mis en œuvre en phase liquide ou sur support solide ; dans ce dernier cas l’acide aminé protégé sur la fonction amine (Na) est fixé sur une résine insoluble dans les solvants organiques, c’est la synthèse de Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154). C’est un procédé bien maîtrisé, qui présente cependant quelques inconvénients tels que : le coût des réactifs utilisés en excès et le manque d’homogénéité des peptides synthétisés. On dit que le système est dégénéré, ce qui engendre des surcoûts de purifications par chromatographie en phase liquide à haute performance préparative.
Lors de la Synthèse Peptidique en Phase Liquide (SPPL), toutes les réactions ont lieu en solution homogène. Cette méthodologie a été décrite par Bodansky et du Vigneaud (J. Am. Chem. Soc., 1959, 51 , 5688-5691). La fonction acide carboxylique (C-terminal) de l’acide aminé de départ est protégée sous forme d’un ester méthylique, et les acides aminés suivants sont condensés successivement après la protection de leur fonction amine (Na) par un groupement carboxybenzyle (abrégé Cbz) puis l’activation de leur fonction acide carboxylique (C-terminal) par un ester nitrophénylique. Tous les intermédiaires synthétiques sont purifiés par précipitation ou lavage à l’eau (extraction). Cette méthodologie de synthèse peptidique est longue, fastidieuse et génère des peptides avec de faibles rendements. A titre d’exemple, on peut citer la synthèse de l’ACTH avec un rendement global d’environ 7 %, décrite par Schwyzer et Sieber (Helv. Chim. Acta 1966, 49, 134-158).
Une modification de cette méthodologie a été rapportée par Beyerman et al. (Rec. Trav. Chim. Pays Bas 1973, 92, 481-492). Elle consiste à protéger la fonction acide carboxylique (C-terminal) d’un acide aminé ou d’un peptide sous la forme d’un ester benzylique et de réaliser la réaction de couplage (ou condensation) en présence d’un excès d’anhydride d’acide aminé Na-protégé, dans l’optique d’améliorer les rendements. Finalement, bien que les rendements des réactions de couplage soient augmentés, on constate une perte de solubilité du peptide en phase organique lorsque celui-ci atteint environ cinq acides aminés.
D’autres stratégies permettant la solubilisation des acides aminés, afin de faciliter la synthèse peptidique, ont été développées. On peut citer les travaux de Narita (Bull. Chem. Soc. Jap., 1978, 51 , 1477-1480), les travaux de Bayer et Mutter (Nature 1972, 237, 512-513) sur le polyéthylèneglycol comme adjuvant de solubilisation, et les brevets EP 0 017 536 (Sanofi) et EP 2 612 845 A1 et US 2014/0296483 (Ajinomoto Co., Inc.) sur des molécules d’ancrage solubilisantes.
On connaît également des stratégies de synthèse de peptides faisant appel à des groupements bifonctionnels, c’est-à-dire des groupements qui sont capables simultanément d’activer la fonction acide carboxylique (C-terminal) et de protéger la fonction amine (Na) de l’acide aminé, en formant des structures cycliques intermédiaires hautement réactives. C’est le cas des N-carboxyanhydrides (abrégés NCAs) (voir Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1906, 39, 857-861 ; Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1907, 40, 3235-3249; Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1908, 41 , 1721-172; J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 2153-2159; J. Am. Chem. Soc., 1947, 69, 1551-1552). Des intermédiaires réactifs ont été synthétisés à partir d’acides aminés et de dérivés de dichlorodiméthylsilanes (voir S. H. van Leeuwen et al., Tetrahedron Letters 2002, 43, 9203-9207 et le brevet WO 00/37484 A1). Des dérivés d’acides aminés activés par le trifluorure de bore éthérate ont été inventés pour la synthèse de peptides (voir S. H. van Leeuwen et al., Tetrahedron Letters 2005, 46, 653- 656). L’activation des acides aminés en présence d’hexafluoroacétone a aussi été décrite (voir Chem. Ztg., 1990, 114, 249-251 et J. Spengler et al., Chem. Rev., 2006, 106, 4728- 4746).
Toutes ces méthodes de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques, en solution ou sur support solide, ont au moins un ou plusieurs désavantages parmi les suivants : l’utilisation de groupements protecteurs, l’utilisation de réactifs en excès, la possibilité de racémisation, la faible solubilité des peptides en cours de synthèse dans les solvants organiques, la limitation de la taille du peptide, des purifications onéreuses et polluantes, des protocoles expérimentaux complexes ou la possibilité de polymérisation. D’une manière globale, l’examen de l’abondante littérature disponible dans le domaine de la synthèse peptidique montre que des difficultés persistent pour produire des peptides ou protéines ou peptidomimétiques de haute pureté, avec de bons rendements, à faible coût et avec une moindre empreinte écologique.
Le problème que la présente demande se propose de résoudre est la conception d’une nouvelle méthodologie de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques permettant de lever les verrous liés à leur accès ou production laissés dans l’art antérieur.
Objet de l’invention
Selon l’invention, le problème est résolu par un procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques en phase liquide qui comporte la combinaison de deux caractéristiques essentielles qui sont détaillées ci-dessous.
Le premier objet de la présente invention est un procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques par élongation successive de la deuxième extrémité d’une molécule de type Qa - E - Qb, où Qa et Qb peuvent être identiques ou différents et représentent une fonction électrophile et/ou nucléophile, et E représente un espaceur. Ladite deuxième extrémité peut notamment être une amine primaire ou secondaire, un hydroxyle ou un thiol, d’un acide a, b, g ou d-aminé ou acide a, b, g ou d-hydroxylé ou a, b, g ou d-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique, caractérisé en ce que lesdites unités sont sélectionnées dans le groupe formé par : les acides a, b, g ou d- aminés ou acides a, b, g ou d-hydroxylés ou a, b, g ou d-mercapto acides (naturels ou non naturels ou synthétiques). De plus, la première extrémité de ladite molécule de type Qa - E - Qb (par exemple dudit acide a, b, g ou d-aminé ou acide a, b, g ou d-hydroxylé ou a, b, g ou d-mercapto acide) ou dudit peptide ou protéine ou peptidomimétique est fixée sur une molécule d’ancrage soluble dans des solvants organiques tels que les solvants halogénés (chlorure de méthylène, chloroforme), l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le 2-méthyletétrahydrofurane, l’isooctane, le cyclohexane, l’hexane(s), le méthylcyclohexane, le méthyl tert-butyl éther ou des solvants aromatiques tels que le benzène ou le toluène ou tout autre solvant adéquat.
La première caractéristique essentielle est l’utilisation d’une famille de molécules d’ancrage spécifique. Selon l’invention les molécules d'ancrage sont des polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes. Le procédé selon l’invention permet d’accéder à des peptides ou protéines ou peptidomimétiques (naturels ou non naturels ou synthétiques) de haute pureté. Ce procédé engendre des économies d’étapes et d’atomes du fait de l’absence de l’usage de groupements protecteurs (sur les fonctions amines, hydroxyles ou thiols de la chaîne principale) et d’agents de couplage et de ce fait, des économies financières. Au final, le procédé est plus respectueux de l’environnement.
La deuxième caractéristique essentielle est l’utilisation de molécules bifonctionnelles de type Qa - E - Qb dans lesquelles les groupes Qa et Qb peuvent être identiques ou différents, et sont sélectionnés parmi les groupes électrophiles et/ou les groupes nucléophiles, et E représente un espaceur. De manière avantageuse, Qa et Qb sont sélectionnés dans le groupe formé par les fonctions chimiques telles que : alcools, aldéhydes, amines primaires, amines secondaires, azides, éthyniles, halogènes, thiols, vinyles, et/ou l’espaceur E est sélectionné dans le groupe formé par les motifs structuraux tels que : aromatiques, hétéroaromatiques, chaînes alkyles saturées (ramifiées ou non), chaînes alkyles insaturées (ramifiées ou non), les glycols (et de préférence le polyéthylène glycol).
Dans le cas avantageux où l’on utilise comme molécule bifonctionnelle de type Qa - E - Qb, un acide a, b ou g-aminé ou un acide a, b ou g-hydroxylé ou un a, b ou g- mercapto acide, ces composés sont utilisés sous leurs formes activés, à savoir, de 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4- ones ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan- 4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiépan-7-one ou leurs dérivés.
Le schéma n° 1 montre la structure de ces formes activées. Ces derniers sont préparés à partir des acides a, b ou g-aminés (cette expression signifiant ici : acides a-aminés, acides b-aminés ou acides g-aminés), ou acides a, b ou g-hydroxylés (cette expression signifiant ici : acides a-hydroxylés, acides b-hydroxylés ou acides g-hydroxylés), ou a, b ou g- mercapto acides (cette expression signifiant ici : a-mercapto acides, b-mercapto acides ou g-mercapto acides) correspondants. [Chem 1]
Figure imgf000007_0001
X= NH, N-alkyle, N-aryle S
R1 , R2, R3, R4, R5, R6 AIRy|e ou Ary|e
Schéma n° 1 : Structures des formes activées
A ce jour, il n’a jamais été démontré la possibilité de préparer aisément en solution, des peptides constitués de plus de quatre acides aminés différents ou non, en utilisant des dérivés d’acides aminés activés sous la forme de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5- one.
C’est justement l’objet de l’invention qui propose l’utilisation des acides activés sous la forme de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxazinan-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)- 1 ,3-dioxolan-4-ones ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan-4-one ou 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiépan-7- one ou leurs dérivés en présence d’une molécule d’ancrage permettant la production de peptides ou protéines ou peptidomimétiques de haute pureté, en phase liquide (ou solution).
Le procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques selon l’invention procède par élongation successive de la deuxième extrémité (amine primaire ou secondaire, hydroxyle ou thiol) d’une chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique dont la première extrémité est fixée sur une molécule d’ancrage soluble dans un solvant organique. Ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes ayant au moins 10 unités de monomères, et de préférence entre 15 et 350 unités de monomères.
Dans un mode de réalisation avantageux, ladite chaîne polyoléfine est une chaîne de polyisobutène (PIB). En particulier, ladite molécule d’ancrage peut être une polyoléfine. La chaîne de polyoléfine peut être fonctionnalisée à, au moins, l’une de ses extrémités. Dans une variante, la chaîne de polyoléfine ou oligomère de polyoléfine ou polyalcène peut comprendre un nombre de liaisons carbone-carbone insaturées ne dépassant pas 5 %, et de préférence ne dépassant pas 3 %, et/ou la molécule d’ancrage peut présenter une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine (ou est une chaîne polyoléfine) terminée par au moins un groupement sélectionné dans le groupe formé par : o une fonction -Xa, où Xa est sélectionné dans le groupe formé par : -OH, -IMH2, - NHRa (Ra= alkyle ou aryle), -SH ;
o une fonction -Y-C6H4Xb, où
■ Y est O, S, CH2 ou absent,
■ Xb est sélectionné dans le groupe formé par : -OH, -IMH2, -NHRa, -SH, - CXaRaRb, -C6H3Rc(CRaXa),
où : Rb est sélectionnée dans le groupe formé par -H, -Aryle, - Hétéroaryle, -Alkyle, et
Rc est sélectionné dans le groupe formé par -H, -Alkyle, -O-Alkyle, -Aryle, -O-Aryle, -Hétéroaryle, -O-Hétéroaryle ;
o une fonction -CRd=CH-CHXa ou une fonction -CRdH-CH=CH-CHXa, où Xa a la signification définie ci-dessus, et Rd est méthyle ou éthyle.
En particulier, Xa peut être une fonction amine primaire ou secondaire, un alcool, un thiol ou un phénol.
Dans un mode de réalisation avantageux, la masse moléculaire moyenne en masse des molécules d’ancrage, hormis la fonctionnalisation terminale (par exemple -Xa, -Z-CeH4Xb ou -CRd=CH-CHXa comme définis ci-dessus), est comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000. Au-delà d’une masse moléculaire moyenne en masse d’environ 20 000, ces molécules peuvent présenter une viscosité trop grande, ce qui risquerait de limiter leur solubilité dans les solvants organiques utilisés pour l’étape de couplage/élongation ou itération.
Certains dérivés de PIB utilisés dans le cadre de la présente invention sont disponibles dans le commerce, en tant que ligands pour la catalyse homogène. A titre d’exemple, on peut utiliser le 2-méthyl-3-[polyisobutyl (12)]propanol (masse moléculaire moyenne en masse 757, y compris la fonctionnalisation terminale) ou le 4-[polyisobutyl(18)]phénol (masse moléculaire moyenne en masse 1104, y compris la fonctionnalisation terminale) qui sont distribués, respectivement, sous les références 06-1037 et 06-1048 par la société Strem Chemicals. Ces deux molécules sont des dérivés de polyisobutènes dont la chaîne est terminée, respectivement, par un groupement -CH2-C(CH3)(H)-CH2-OH (i.e. isopropanol) et par un groupement -CH2-C(CH3)2-C6H4-OH (i.e. phénol).
Selon une caractéristique de l’invention, l’utilisation d’une molécule d’ancrage soluble dans un solvant organique comme décrit ci-dessus (et plus particulièrement l’utilisation de polyoléfines), est susceptible d’agir aussi comme support liquide ou groupement protecteur de la fonction acide carboxylique (C-terminal) ou de toute autre fonction chimique (chaîne(s) latérale(s)) d’un acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide, ou de toute autre molécule ayant au moins deux groupements fonctionnels. Elle permet également la solubilisation des peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés et leurs synthèses en solution organique (solvants halogénés et/ou non halogénés).
Selon une autre caractéristique de l’invention, l’utilisation d’une molécule d’ancrage soluble dans un solvant organique comme décrit ci-dessus (et plus particulièrement l’utilisation de polyoléfines), et insoluble dans certains solvants polaires (tels que l’eau et/ou l’éthanol et/ou l’acétonitrile), facilite la purification des acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés par simple extraction (lavage) ou simple filtration sur silice. Ainsi, une simple extraction ou une simple filtration permet d’obtenir les peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés avec une haute pureté chimique.
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, on utilise des molécules d’ancrage disponibles dans le commerce, ou encore des molécules d’ancrage synthétisables de façon simple et directe à partir de précurseurs disponibles dans le commerce, notamment certains dérivés de polyisobutènes (PIB).
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, on fait réagir les acides a, b ou g- aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides sous leurs formes activées, respectivement de, 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5-one ou (2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one, 2,2-bis(trifluoroméhyl)-1 ,3-dioxan-4-one, 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathian-6-one, 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one, 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4-one, 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiépan-7-one et leurs dérivés, en présence de la molécule d’ancrage dans un solvant approprié (ou un mélange de solvants), à une température comprise entre -20°C et 150°C. Dans un mode de réalisation, la réaction s’effectue dans tout solvant (ou mélange) liquide inerte capable de dissoudre les réactifs. Les solvants applicables comprennent, sans s’y limiter, les hydrocarbures halogénés ou non. Les solvants préférés sont le tétrahydrofurane, l’acétate d’éthyle, le 2-méthyltétrahydrofurane, le carbonate de propylène, ou tout autre solvant ou mélange de solvants capable de solubiliser ces deux espèces chimiques.
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, les réactions entre les dérivés de PIB et les acides a, b ou g-aminés activés ou acides a, b ou g-hydroxylés activés ou a, b ou g-mercapto acides activés se font en chimie de lot (notamment en ballon ou citerne), mais de préférence, elles sont réalisées en chimie de flux (appelée aussi chimie en flux continu).
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, les acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides ayant des chaînes latérales incompatibles avec les conditions de la réaction d’ancrage/élongation ou itération, peuvent être temporairement masquées par un groupement protecteur approprié. Il peut notamment être choisi dans le groupe formé par :
le te/f-butoxycarbonyle (abrégé Boc),
le fluorénylméthoxycarbonyle (abrégé Fmoc),
le benzyle (abrégé Bzl),
le trityle (abrégé Trt),
le carboxybenzyle (abrégé Cbz),
le 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (abrégé Pbf),
le 4-méthoxy-2,3,6-triméthylbenzènesulphonyl (abrégé Mtr).
On peut aussi utiliser tout autre groupement protecteur compatible avec le présent procédé.
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, ladite molécule d’ancrage réagit avec un premier acide a, b, ou g-aminé ou acide a, b, ou g-hydroxylé ou a, b, ou y- mercapto acide activé (abrégé ici AAA1), conduisant à une liaison covalente entre l’acide a, b, ou g-aminé ou acide a, b, ou g-hydroxylé ou a, b, ou g-mercapto acide et la molécule d’ancrage.
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, ladite chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique est formée de n unités d’acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides; sa deuxième extrémité est une autre unité d’acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide, abrégé ici AAAn. Lors du déroulement du procédé, la chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique s’allonge par élongation ou itération successive, et pendant chacune de ces étapes on ajoute une autre unité d’acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide activé, abrégé ici AAA(n+1), à ladite deuxième extrémité (amine primaire ou secondaire, alcool ou thiol libre). Cette séquence réactionnelle est représentée sur le Schéma réactionnel n° 2 ci-dessous.
[Chem 2]
eptide
Figure imgf000011_0001
Z= NH, N-alkyle, N-aryle, O, S
R1, R2, 3, R4= H et/ou alkyle et ou aryle
n= 0,1
Schéma réactionnel n° 2 : Procédé général d’obtention d’un peptide Selon encore une autre caractéristique de l’invention, on peut utiliser dans ladite chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique, des acides a, b ou g-aminés et/ou acides a, b ou g-hydroxylés et/ou a, b ou g-mercapto acides naturels et/ou non naturels et/ou synthétiques. Selon encore une autre caractéristique de l’invention, on peut utiliser dans la ladite chaîne peptidomimétique une ou plusieurs unités des molécules de type Qa - E - Qb, ayant au moins deux groupements fonctionnels, qui sont identiques ou différents, et qui sont sélectionnés parmi les groupes électrophiles et/ou les groupes nucléophiles, et qui sont séparés par une unité espaceur E. Les groupes Qa et/ou Qb peuvent être des groupes terminaux ou non. L’espaceur E peut être une entité sélectionné dans le groupe formé par :
- les chaînes aliphatiques (ramifiées ou non et insaturées ou non) ;
- les aryles ou hétéroaryles (substitués ou non).
Avantageusement, les molécules de type Qa - E - Qb, portent une fonction terminale sélectionnée dans le groupe formé par la fonction amine primaire, la fonction amine secondaire, la fonction hydroxyle ou la fonction thiol.
On voit aisément que lesdits acides a, b ou g-aminés, lesdits acides a, b ou g-hydroxylés et lesdits a, b ou g-mercapto acides représentent des cas particuliers de molécules bifonctionnelles de type Qa - E - Qb. Il en est de même desdits acides d-aminés, desdits acides d-hydroxylés et desdits d-mercapto acides, qui cependant ne sont pas obligatoirement engagés dans la réaction sous leur forme activée, à l’instar des autres molécules bifonctionnelles qui ne sont pas des acides a, b ou g-aminés, des acides a, b ou g-hydroxylés ou des a, b ou g-mercapto acides.
La molécule bifonctionnelle Qa - E - Qb peut avoir une structure moléculaire, sélectionnée notamment parmi les époxides, les aziridines, les thiiranes. Ainsi on peut préparer selon l’invention des peptidomimétiques comportant un groupe époxy-succinate, à l’instar du peptide E-64, ou encore des azirido peptides, à l’instar du Miraziridine.
On donne ici quelques exemples pour des molécules bifonctionnelles de type Qa - E - Qb qui peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention : la sarcosine, l’acide 2- (1-aminoéthyl)-1 ,3-oxazole-4-carboxylique et l’acide (2R,3R,4R)-3-hydroxy-2,4,6- triméthyl-heptanoïque.
Ladite molécule bifonctionnelle Qa - E - Qb peut en particulier être un acide aminé selon la définition qui en est donnée ci-dessous. Elle peut aussi être un peptide, par exemple un dipeptide, un tripeptide, un tétrapeptide, un pentapeptide, un hexapeptide, un heptapeptide, un octapeptide, un nonapeptide, un décapeptide, ou un peptide encore plus long.
Ces molécules bifonctionnelles peuvent être introduites dans la chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique par des réactions chimiques connues. Elles ne portent pas de groupe protecteur sur une fonction terminale sélectionnée dans le groupe formé par la fonction amine primaire, la fonction amine secondaire, la fonction hydroxyle ou la fonction thiol. A titre d’exemple, si ladite molécule bifonctionnelle est un acide aminé ou un peptide, elle ne porte pas de protection N-terminale ; il est possible de protéger ses chaînes latérales ou ses fonctions latérales, qui ne sont pas modifiées lors de l’élongation du peptide.
Comme décrit ci-dessus, lesdits acides a, b ou g-aminés, lesdits acides a, b ou g- hydroxylés et lesdits a, b ou g-mercapto acides sont engagés préférentiellement sous leurs formes activés.
Les unités issues de molécules bifonctionnelles qui ne sont pas sélectionnées parmi les acides a, b ou g-aminés, les acides a, b ou g-hydroxylés et les a, b ou g-mercapto acides, peuvent avantageusement être fixées sur l’extrémité C-terminale dudit peptidomimétique, ou sur l’extrémité terminale (notamment par fonctionnalisation de la fonction amine primaire ou secondaire, hydroxyle ou thiol), ou encore sur la chaîne latérale (d’au moins un acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide), ou encore entre deux unités sélectionnées parmi les acides a, b ou g-aminés, les acides a, b ou g-hydroxylés et les a, b ou g- ercapto acides.
Selon un mode de réalisation avantageux, le nombre d’unité issue de molécules bifonctionnelles qui ne sont pas sélectionnées parmi les acides a, b ou g-aminés, les acides a, b ou g-hydroxylés et les a, b ou g-mercapto acides ne dépasse pas 50 % en nombre, et de préférence ne dépasse pas 25 % en nombre.
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, au moins une étape dans laquelle ladite chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique est fixée sur ladite molécule d’ancrage et est purifiée du milieu réactionnel par extraction dans un solvant organique (tel que le cyclohexane, l’heptane(s) ou tout autre solvant adéquat) non miscible à l’eau (ou un mélange eau/éthanol ou un mélange eau/acétonitrile) ou par filtration sur silice.
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, elle permet d’obtenir des peptides ou protéines ou peptidométiques de haute pureté, après déprotection des chaînes latérales (si nécessaires), puis décrochage de leur molécule d’ancrage après la dernière étape d’itération, pour être utilisés selon leur destination, par exemple en tant que principe actif pour des essais précliniques, des soins cliniques ou toutes autres applications.
Selon encore une autre caractéristique de l’invention, les molécules d’ancrage peuvent être réutilisées (recyclées) dans le procédé selon l’invention.
Un deuxième objet de la présente invention est une molécule susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’invention. Ladite molécule comprend un acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique accroché sur une molécule d’ancrage.
Description
1. Définitions
Dans le cadre de la présente invention, nous entendons par « acide aminé » : les acides aminés naturels et les acides aminés non naturels ou synthétiques. Les acides aminés « naturels » comprennent la forme L des acides aminés protéinogènes dit standards qui peuvent être trouvés dans des protéines d’origine naturelle, c’est-à-dire : alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gin), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), proline (Pro), sérine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr) et valine (Val). Ils comprennent également les autres acides aminés protéinogènes, et notamment la pyrrolysine et la sélénocystéine.
Les acides aminés « non naturels » comprennent la forme D des acides aminés naturels définis ci-dessus, les formes homo de certains acides aminés naturels (tels que : arginine, lysine, phénylalanine et sérine), et les formes nor de la leucine et de la valine.
Les acides aminés « non naturels » comprennent aussi tous les acides aminés synthétiques. Ils comprennent aussi des acides aminés non naturels, tels que :
Abu = acide 2-aminobutyrique CH3-CH2-CH(COOH)(NH2) ;
iPr = isopropyl-lysine (CH3)2C-NH-(CH2)4-CH(COOH)(NH2) ;
Aib = acide 2-aminoisobutyrique ;
F-trp = N-formyl-tryptophane ;
Orn = ornithine ;
Nal(2’) = 2-naphthylalanine.
Cette énumération n’est bien évidemment pas exhaustive.
On peut également utiliser des acides aminés a et b insaturés, naturels ou non.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « acide aminé activé » est utilisé ici pour désigner des acides a, b, ou g-aminés activés respectivement sous la forme de 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou (2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one, et leurs dérivés, avec la possibilité ou non d’un groupement protecteur sur la chaîne latérale.
La présente invention s’applique également à la synthèse de peptidomimétiques. Les précurseurs utilisés pour cette synthèse sont définis comme suit :
Le terme « acide a, b ou g-hydroxylé » est utilisé ici selon les règles de terminologie de l’IUPAC, connues de l’homme du métier. Des exemples sont des composés tels que l’acide lactique, l’acide malique, l’acide tartrique, l’acide salicylique ou encore l’acide g- hydroxybutyrique, qui se trouvent dans la nature. Dans le cadre de la présente invention on peut aussi utiliser tous les acides a, b ou g-hydroxylés « non naturels » qui comprennent aussi tous les acides a, b ou g-hydroxylés synthétiques.
Le terme « acide a, b ou g-hydroxylé activé » désigne tous les acides a, b ou g-hydroxylés naturels et/ou non naturels et/ou synthétiques, qui ont été activés respectivement sous la forme de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- dioxan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4-one, et leurs dérivés, avec la possibilité ou non d’un groupement protecteur sur la chaîne latérale. Le terme « a, b ou g-mercapto acide » est utilisé ici selon les règles de terminologie de l’IUPAC, connues de l’homme du métier. Des exemples sont des composés tels que l’acide thioglycolique, l’acide 3-mercaptopropionique, l'acide mercaptobutanoique. Dans le cadre de la présente invention on peut utiliser aussi tous les a, b ou g-mercapto acides « non naturels » qui comprennent aussi tous les a, b ou g-mercapto acides synthétiques. Le terme « a, b ou g-mercapto acide activé » désigne tous les composés provenant de l’activation des a, b ou g-mercapto acides (naturels, non naturels ou synthétiques) sous la forme respectivement de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5-one ou 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiépan-7-one, et leurs dérivés, avec la possibilité ou non d’un groupement protecteur sur la chaîne latérale.
L’homme du métier sait que dans ce contexte, la désignation a, b, g et d se réfère à la position du carbone substitué par la fonction amine (primaire ou secondaire) ou hydroxyle ou thiol par rapport au carbone de la fonction acide carboxylique (C-terminal).
Le terme « peptidomimétique » est utilisé selon l’état de la technique en tant que terme fonctionnel pour une molécule capable de mimer ou bloquer un peptide quant à son interaction avec un récepteur spécifique. En particulier, un peptidomimétique peut comprendre des unités qui ne sont pas des acides aminés.
Les abréviations « DMF », « DMSO », et « THF », bien connu des chimistes, désignent, respectivement, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le tétrahydrofurane.
2. Description détaillée
Une première caractéristique essentielle du procédé selon l’invention est l’utilisation d’acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides activés sous la forme respectivement de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou (2,2-bis(trifluoro-méthyl)-1 ,3-oxazinan-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7- one ou 2,2-bis(tri-fluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan- 4-one ou 2,2-bis(tri-fluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxathiolan-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)- 1 ,3-oxathiépan-7-one et leurs dérivés, en présence d’une molécule d’ancrage soluble dans un solvant organique. On entend ici par « solvant organique » tout solvant (ou mélange) liquide inerte capable de dissoudre (à chaud et/ou à froid) les réactifs. Les solvants applicables comprennent, sans s’y limiter, les hydrocarbures halogénés ou non.
Les acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides activés sous la forme respectivement de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou (2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7- one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan-4- one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxathiolan-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)- 1 ,3-oxa-thiépan-7-one et leurs dérivés, sont préparés selon des méthodes connues, à partir d’acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides, naturels ou non naturels (ayant une chaîne latérale (protégée ou non)) et d’hexafluoroacétone. Le schéma réactionnel n° 3 représente l’activation des différents acides, c’est une réaction connue en tant que telle :
[Chem 3]
Figure imgf000016_0001
X= NH, N-alkyle, N-aryle, O, S ,
1 , , . c K =A ky e ou Ary e
R1 , R2, R3, R4, R5, R6
Schéma réactionnel n° 3 : Activation des acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g- hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides. Selon une caractéristique de l’invention, qui sera décrite en plus grand détail ci-dessous, les molécules d’ancrage (ou groupements protecteurs ou molécules solubilisantes) sont des polyoléfines ou plus précisément des oligomères de polyoléfines (les polyoléfines étant appelées aussi polyalcènes) et leurs dérivés, c’est-à-dire qu’elles sont fonctionnalisées.
Selon une autre caractéristique de l’invention, ce procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques (protégés ou non sur leurs chaînes latérales), en phase liquide, est caractérisé en ce que l’on part d’une molécule d’ancrage et d’un acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide activé respectivement sous la forme de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou (2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one ou
2.2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan-4-one ou
2.2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5- one ou 2,2-bis(trifluoro-méthyl)-1 ,3-oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxathiépan-7-one ou leurs dérivés. Une liaison covalente est alors formée entre ces deux espèces moléculaires. L’étape d’élongation/itération consiste en ce que l’on additionne ou condense les acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g- mercapto acides activés suivants, qui sont éventuellement protégés sur leur chaîne latérale (sous forme d’ester, d’éther, de thioester, de thioéther ou toutes autres fonctions chimiques compatibles avec le présent procédé). Ainsi, la molécule d’ancrage joue un rôle de groupement protecteur de la fonction acide carboxylique (C-terminal) du premier acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide.
Selon une autre caractéristique de l’invention, ce procédé de synthèse peptidique ou protéique ou peptidomimétique peut être réalisé en utilisant un fragment de peptide ou protéine ou peptidomimétique convenablement protégé et un acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique, ancrée sur une molécule de PIB, permettant après couplage d’obtenir un peptide ou protéine ou peptidomimétique plus long.
Selon une autre caractéristique de l’invention, ce procédé de synthèse peptidique ou protéique ou peptidomimétique peut être réalisé en utilisant des molécules Qa - E - Qb ayant au moins deux groupements fonctionnels Qa et Qb, qui sont identiques ou différents, et qui sont sélectionnés parmi les fonctions chimiques électrophile et/ou nucléophiles. Des exemples de ces structures sont l’oxyde de styrène, les aminothiophénoles ou le 1-azido- 4-(bromométhyl)benzène. Ces molécules peuvent directement être fixées sur la molécule d’ancrage ou introduites en cours de synthèse sur la fonction amine (primaire ou secondaire) ou hydroxyle ou thiol, des acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g- hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés.
Le procédé selon l’invention peut être réalisé dans tout solvant (ou mélange) liquide inerte capable de dissoudre les réactifs (halogéné ou non), à une température typiquement comprise entre environ -20°C et environ 150°C, dans un réacteur (en lot ou en flux).
Selon une autre caractéristique de l’invention l’acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou y- hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique ancré sur une molécule de PIB est caractérisé en ce que la fonction terminale dudit acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique ou toute autre molécule ayant au moins deux groupements fonctionnels est lié par une liaison covalente (ester, éther, amide, thioester ou toutes autres fonctions chimiques), donnant ainsi une solubilité dans l’eau très faible (< 30 mg/ml). C’est en ce sens que le dérivé de PIB agit comme un support liquide ou une molécule solubilisante pour la synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques.
A titre d’illustration, le schéma réactionnel n° 4 montre la réaction d’un acide aminé activé sous la forme de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one avec un dérivé de polyisobutène (abrégé PIB) qui est terminé par une fonction phénol. En l’occurrence, l’acide a-aminé est la L-phénylalanine (Phe).
[Chem 4]
Figure imgf000018_0001
Schéma réactionnel n° 4 : Ancrage au support liquide
Ainsi, le premier acide a-aminé du futur peptide est fixé sur la molécule d’ancrage par l’intermédiaire d’une liaison covalente de type ester.
Le schéma réactionnel n° 5 montre l’étape d’élongation ou d’itération, i.e. l’accrochage d’une deuxième unité d’acide aminé, au premier acide aminé fixé sur la molécule d’ancrage. En l’occurrence, ce deuxième acide a-aminé est le L-tryptophane (Trp).
[Chem 5]
Figure imgf000018_0002
Schéma réactionnel n °5 : Elongation
On voit aisément que ce procédé permet, par des itérations successives, d’ajouter des unités d’acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides sur le dernier acide a, b ou g-qhiίhέ ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g- mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique fixé sur le dérivé de PIB, en cours de synthèse, pour obtenir un peptide ou protéine ou peptidomimétique ayant la séquence souhaitée. Le peptide ou protéine ou peptidomimétique étant chimiquement lié à la molécule d’ancrage, il peut être séparé à tout moment, et notamment après la dernière étape d’itération, de tous produits polaires par extraction dans un solvant organique tel que l’hexane(s) ou le cyclohexane et de l’eau ou dans un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile. A la fin de cette séquence d’itération, et après éventuellement la déprotection des chaînes latérales, on peut décrocher le peptide ou protéine ou peptidomimétique de la molécule d’ancrage ; ainsi le peptide ou la protéine ou le peptidomimétique perd sa solubilité dans un solvant apolaire, et on peut le séparer de la molécule d’ancrage, pour l’utiliser conformément à sa destination.
Selon une autre caractéristique de l’invention, la dérivation (ou ancrage) d’un acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique (protégé(s) ou non sur sa/ses chaîne(s) latérale(s)) avec un dérivé de PIB entraîne de fait une augmentation de manière significative de la solubilité dudit acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique ancré en phase liquide organique. Plus précisément, ces acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y- mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés sur un dérivé de PIB deviennent solubles dans des solvants organiques, tels que les solvants halogénés (chlorure de méthylène, chloroforme), l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le 2- méthyletétrahydrofurane, l’isooctane, le cyclohexane, l’hexane(s), le méthylcyclohexane, le méthyl tert-butyl éther le carbonate de propylène ou des solvants aromatiques tels que le benzène ou le toluène ou tout autre solvant adéquat. Ainsi, les acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés sur un dérivé de PIB ont un haut coefficient de partage pour la phase organique lors d’une extraction/décantation, permettant ainsi une purification simple et rapide. En même temps, leur solubilité dans des solvants tels que l’eau ou un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile est très faible.
Selon une autre caractéristique de l’invention, la réaction entre un dérivé de PIB et le premier acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide activé, ayant éventuellement une chaîne latérale protégée ou non (ester, amide, thioester ou toutes autres fonctions chimiques), conduit à un produit dont la solubilité dans l’eau est faible (< 30 mg/ml).
Ainsi, lorsqu’un acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique est fixé sur un dérivé de PIB, ce dernier agit comme un support liquide (ou molécule d’ancrage ou molécule solubilisante) car le produit de cette réaction devient soluble dans des solvants organiques mais reste insoluble dans des solvants tels que l’eau ou un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile ; cela permet sa séparation du mélange réactionnel par séparation des phases. Le schéma réactionnel n° 6 montre un exemple d’étape de décrochage d’un octapeptide ayant la séquence Phe-Tpr-Cys(Bzl)-Trp-Cys(Bzl)-Trp-Trp-Cys(Bzl)-NH2, de la molécule d’ancrage (dérivé de PIB terminé par une fonction phénol), sur laquelle le peptide est ancré par la fonction acide carboxylique (C-terminal) de la L-phénylalanine. Les chaînes latérales des résidus L-cystéines sont protégées par un groupement benzyle (Bzl). Le peptide libre est insoluble dans les solvants apolaires (i.e. cyclohexane, hexane(s)), ce qui permet de le séparer facilement de la molécule d’ancrage. On peut récupérer la molécule d’ancrage en vue de sa réutilisation dans le procédé.
[Chem 6]
Figure imgf000020_0001
Schéma réactionnel n° 6 : Décrochage d’un octapeptide de la molécule d’ancrage Le peptide précipite dans des solvants tels que : l’éther éthylique, le cyclohexane ou tout autre solvant approprié. Il peut ensuite être utilisé conformément à sa destination.
Nous décrivons maintenant une deuxième caractéristique essentielle du procédé de préparation de peptides ou protéines ou peptidomimétiques selon l’invention, à savoir l’utilisation de molécules d’ancrage solubles dans certains solvants organiques tels que : l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le 2-méthyletétrahydrofurane, l’isooctane, le cyclohexane, l’hexane(s), le méthylcyclohexane, le méthyl tert-butyl éther ou les solvants halogénés.
Avantageusement, le procédé selon l’invention utilise des polyoléfines ou plus précisément des oligomères de polyoléfines (les polyoléfines étant appelées aussi polyalcènes), et leurs dérivés comme molécules d’ancrage ou support liquide ou groupement protecteur que ce soit de la fonction acide carboxylique (C-terminal) de l’acide a, p ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique, ou de la chaîne latérale dudit acide a, b ou y- aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique (sous forme de liaison ester, amide, éther, thioester, thioéther ou toutes autres fonctions chimiques adéquates) en phase liquide. Les molécules de polyoléfines comprennent une chaîne d’atomes de carbone reliés entre eux par des liaisons simples. Elles peuvent comprendre des ramifications constituées de groupements alkyles identiques ou différents, mais de préférence identiques. De préférence, les polymères sont constitués d’un nombre d’unités de monomères d’au moins 10 et de préférence compris entre 15 et 350. Les homopolymères sont préférés mais, des copolymères (saturés ou non) peuvent être utilisés. Dans le cas de polymères ou copolymères insaturés le nombre de liaisons insaturées dans la chaîne d’atomes de carbone ne dépasse avantageusement pas 5 %, et préférentiellement ne dépasse pas 3 %.
De préférence, il s’agit de dérivés de polyisobutènes (PIB), une classe de polymères connue depuis les années 30 du siècle dernier, mais on peut également utiliser des dérivés de polypropylènes.
Ces molécules d’ancrage sont de préférence employées dans le procédé selon l’invention sous la forme de dérivés fonctionnalisés, comme cela sera expliqué en plus grand détail par la suite. Le schéma n° 7 montre un certain nombre de dérivés de PIB avec leurs fonctionnalisations qui conviennent en tant que support liquide pour exécuter la présente invention.
[Chem 7]
Figure imgf000021_0001
Schéma n° 7 : Structures générales des molécules d’ancrage Dans ces formules :
• Xe est un groupement sélectionné dans le groupe formé par -OH, -NH2, -NHRa (Ra= alkyle ou aryle), -SH ;
· Ar est un groupement aromatique ou hétéro-aromatique, substitué ou non ;
• A est soit absent, soit un groupement sélectionné dans le groupe formé par : CH2, CH2-CH2, S ;
• Rf est un groupement sélectionné dans le groupe formé par H, aryle, hétéro-aryle, alkyle, O-alkyle, O-aryle, O-hétéro-aryle ;
· Rq est un groupement sélectionné dans le groupe formé par H, alkyle, O-alkyle, aryle, hétéro-aryle, O-aryle, O-hétéro-aryle ;
• le nombre n est un nombre entier qui est typiquement supérieur à 10, et avantageusement compris entre 15 et 350.
Le nombre m est soit 0 soit 1. En particulier, le groupement Xe peut être une fonction dans une amine primaire ou secondaire, un alcool, un thiol ou un phénol.
Selon l’invention, ces molécules d’ancrage sont liées à la fonction acide carboxylique d’un acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide (C- terminal) ou toutes fonctions chimiques d’une molécule ayant au moins deux groupements fonctionnels par une liaison covalente. Cela suppose que les molécules d’ancrage soient engagées sous une forme convenablement fonctionnalisée, qui est appelée dans la présente description « dérivés de PIB ». Ce terme englobe ici aussi les dérivés de molécules d’ancrage qui ne sont pas des dérivés du polyisobutène, mais qui sont des dérivés d’autres polyoléfines selon la définition qui est donnée ci-dessus ; il englobe notamment les dérivés d’oligomères de polyoléfine. Cette fonctionnalisation de la molécule d’ancrage est en règle générale une fonctionnalisation terminale, de préférence à l’une des extrémités de la chaîne d’atomes de carbone ; elle est décrite ci-dessous. Selon l’invention, les acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g- mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques peuvent être fonctionnalisés sur leurs chaînes latérales avec des dérivés de PIB, sous la forme d’ester, d’éther, de thioéther, de thioester ou toutes autres fonctions chimiques compatibles avec le présent procédé. Cela revient à conférer aux dérivés de PIB un rôle de groupement protecteur de(s) la(les) chaîne(s) latérale(s) desdits acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques. Les chaînes de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes utilisés comme molécules d’ancrage sont typiquement caractérisés par une masse moléculaire moyenne en masse, mais on peut aussi également utiliser des chaînes de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes dits « homogènes » qui comportent des molécules identiques d’une longueur de chaîne donnée.
Plus précisément, le procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques, éventuellement protégés sur leurs chaînes latérales, en phase liquide (solution) selon l’invention, est caractérisé par le fait que l’on solubilise un acide a, b ou y- aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique en milieu organique par un dérivé de PIB lié à la fonction acide carboxylique de l’acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique ou toute autre molécule ayant au moins deux groupements fonctionnels. Le dérivé de PIB agit comme une molécule d’ancrage (appelé ici aussi « support liquide » ou « molécule solubilisante ») de l’acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique ou toute autre molécule ayant au moins deux groupements fonctionnels. Ledit peptide ou protéine ou peptidomimétique fixé sur cette molécule d’ancrage est synthétisé par accrochage successif d’acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides ou toutes autres molécules ayant au moins deux groupements fonctionnels sur le dernier acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou toute autre molécule ayant au moins deux groupements fonctionnels. Ainsi, la molécule d’ancrage sert également de groupement protecteur de la fonction acide carboxylique (C-terminal) pendant la synthèse du peptide ou protéine ou peptidomimétique au cours d’itérations successives.
La fonction acide carboxylique (C-terminal) dudit acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou y- hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique, éventuellement protégé sur sa/ses chaîne(s) latérale(s), est liée par une liaison covalente de type ester, amide, thioester, ou toutes autres liaisons chimiques covalentes, à un dérivé de PIB lipophile, donnant une solubilité dans l’eau très faible (< 30 mg/ml). C’est en ce sens que le dérivé de PIB agit comme un support liquide ou une molécule solubilisante pour la synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques.
Cette dérivation de l’acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y- mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique (protégé ou non sur ses chaînes latérales) avec un dérivé de PIB augmente de manière significative la solubilité dudit acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide ou peptide ou protéine ou peptidomimétique ancré, en phase liquide organique. Plus précisément, ces acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g- mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés sur le dérivé de PIB deviennent solubles dans des solvants organiques tels que : les solvants halogénés (chlorure de méthylène, chloroforme), l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le 2- méthyletétrahydrofurane, l’isooctane, le cyclohexane, l’hexane(s), le méthylcyclohexane, le méthyl tert-butyl éther ou des solvants aromatiques tels que le benzène ou le toluène ou tout autre solvant adéquat. En conséquence, les acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques accrochés à un dérivé de PIB ont un haut coefficient de partage pour la phase organique lors d’une extraction/décantation en présence de cyclohexane ou d’hexane(s) et d’eau ou d’un mélange eau/éthanol ou encore eau/acétonitrile, permettant ainsi leur purification simple et rapide.
Dans un mode de réalisation du procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques (protégés ou non sur leurs chaînes latérales), en phase liquide selon l’invention, on part d’une molécule ayant au moins deux groupements fonctionnels ou d’un acide a, b, ou g-aminé ou acide a, b, ou g-hydroxylé ou a, b, ou g-mercapto acide activé respectivement sous la forme de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-one ou (2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one ou
2.2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan-4-one ou
2.2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5- one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluoro-méthyl)-1 ,3- oxathiépan-7-one ou leurs dérivés, qui seront liés à l’une des molécules d’ancrage tel que défini précédemment, par l’intermédiaire d’une liaison covalente, et que l’on additionne ou condense, par des itérations successives, les molécules ayant au moins deux groupements fonctionnels ou les acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides activés et éventuellement protégés sur leurs chaînes latérales.
Le procédé de synthèse de peptide ou protéine ou peptidomimétique selon l’invention peut être réalisé en utilisant un fragment de peptide ou protéine ou peptidomimétique convenablement protégé sur ses chaînes latérales et une séquence peptidique ou protéique ou peptidomimétique ancrée sur une molécule de PIB permettant, après couplage, d’obtenir un peptide ou protéine ou peptidomimétique plus long.
Le procédé de synthèse de peptide ou protéine ou peptidomimétique selon l’invention peut être réalisé en utilisant des molécules ayant au moins deux groupements fonctionnels, à savoir un groupement Qa et un groupement Qb, qui peuvent être identiques ou différents, et qui sont sélectionnés parmi les groupements électrophiles et/ou les groupements nucléophiles. A titre d’exemple, dans un premier mode de réalisation Qa peut être un groupement électrophile, et Qb peut être un groupement nucléophile, ou encore, dans un deuxième mode de réalisation, Qa peut être un premier groupement électrophile et Qb un deuxième groupe électrophile, ou encore, dans un troisième mode de réalisation, Qa peut être un premier groupe nucléophile et Qb un deuxième groupe nucléophile ; dans des variantes, Qa et Qb peuvent également désigner le même groupement électrophile, ou encore le même groupement nucléophile. Ces molécules ayant au moins deux groupements fonctionnels peuvent directement être ancrées sur la molécule d’ancrage ou introduites en cours de synthèse sur la fonction amine (primaire ou secondaire) ou hydroxyle ou thiol, des acides a, b ou g-aminés ou acides a, p ou y- hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides ou peptides ou protéines ou peptidomimétiques ancrés.
Avantageusement, on utilise un léger excès stoechiométrique de l’acide a, b ou y-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou y-mercapto acide activé, au cours de chaque étape d’ancrage, d’élongation et/ou d’itération.
Ces molécules bifonctionnelles peuvent être introduites dans la chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique par des réactions chimiques connues. En cas de besoin elles peuvent être protégées ou masquées (sur sa fonction nucléophile ou toutes autres fonctions chimiques le nécessitant, grâce à des réactions connues) et activées par des techniques connues.
Les unités issues de molécules bifonctionnelles qui ne sont pas sélectionnées parmi les acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides peuvent avantageusement être fixées sur l’extrémité C-terminale dudit peptide ou protéine ou peptidomimétique, ou sur l’extrémité N, O ou S-terminale (notamment par fonctionnalisation de la fonction amine, hydroxyle ou thiol), ou encore sur la chaîne latérale, ou encore entre deux unités sélectionnées parmi les acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides.
Selon un mode de réalisation avantageux, le nombre d’unités issues de molécules bifonctionnelles qui ne sont pas sélectionnées parmi les acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides ne dépasse pas 50 % en nombre d’unité, et de préférence ne dépasse pas 25 % en nombre d’unité, et encore plus préférentiellement ne dépasse pas 10 % en nombre d’unité. A titre d’exemple, le semaglutide, un peptidomimétique comportant sur une chaîne latérale une unité acide a-aminobutyrique, peut être préparé en utilisant le procédé selon l’invention.
On donne ici une liste de molécules de type acide a, b, g ou d-aminé qui peuvent être utilisées comme unités dans le cadre du procédé selon l’invention, en plus des acides aminés déjà mentionnés ci-dessus : l’acide d-amino lévulinique, l’acide g-aminobutyrique, l’acide b-aminobutyrique (aussi connue sous le sigle BABA), le b-alanine, la b-lysine, l’acide b-aminoisobutyrique, le b-N-Méthylamino-L-alanine, l’acide (2S,3S,8S,9S)-3- amino-9-méthoxy-2,6,8-triméthyl-10-phényldéca-4,6-diénoïque (aussi connu sous le signe ADDA), G acide (2R)-2-(méthylamino)butanedioïque (aussi connu sous le sigle NMDA) et l’acide 4-amino-3-hydroxybutanoïque.
On donne ici une liste de molécules de type acide a, b, g ou d-hydroxylé qui peuvent être utilisées comme unités dans le cadre du procédé selon l’invention : l’acide 4- hydroxybutanoïque, l’acide 2-(hydroxyméthyl)-3-méthylbutanoïque et l’acide (2R,3R,4R)- 3-hyd roxy-2 , 4 , 6-tri m éthy I heptanoïq ue .
On donne ici une liste de molécules de type a, b, y ou d-mercapto acide qui peuvent être utilisées comme unités dans le cadre du procédé selon l’invention : l’acide 4- sulfanylbutanoïque, l’acide 2-cyclopropyl-3-sulfanylpropanoïque, l’acide 2-cyclobutyl-3- sulfanylpropanoïque et l’acide 2-(2-sulfanylphényl)butanoïque
Le procédé selon l’invention présente de nombreux avantages.
Un premier avantage est qu’il permet une production de peptides ou protéines ou peptidomimétiques (protégés ou non sur leurs chaînes latérales) lié à la molécule d’ancrage en phase liquide organique.
Un second avantage est qu’il permet d’obtenir des peptides ou protéines ou peptidomimétiques (protégés ou non sur leurs chaînes latérales) ancrés de haute pureté par un simple lavage (extraction) dans un solvant organique apolaire et à l’eau ou d’un mélange eau/éthanol ou encore eau/acétonitrile ou par filtration, engendrant ainsi l’élimination des sous-produits (sels, acides ou toutes autres espèces moléculaires) qui ne sont pas liés au dérivé de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes tels que les réactifs en excès. Des solvants organiques tels que le cyclohexane, l’heptane, l’hexane(s) qui ont des points éclairs < 15°C, sont appropriés pour solubiliser les dérivés de polyoléfines ou d’oligomères de polyoléfines ou polyalcènes pendant l’extraction ou le lavage. Le procédé selon l’invention permet donc de limiter les étapes de purification qui sont nécessaires dans les procédés de l’état de la technique. Un troisième avantage, particulièrement important, est que le procédé selon l’invention permet de synthétiser des peptides ou protéines ou peptidomimétiques, en ajustant la longueur du dérivé de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes, c’est-à- dire en les rendant plus lipophiles.
Un quatrième avantage est la possibilité de contrôler la pureté du peptide ou protéine ou peptidomimétique en cours de synthèse, à tout instant, par le prélèvement d’un aliquote suivi d’une analyse par les différentes techniques connues de l’homme du métier (telles que la spectrométrie de masse, la chromatographie en phase liquide à haute performance, la résonance magnétique nucléaire du proton ou du carbone-13).
Un cinquième avantage réside dans le fait qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser de groupement protecteur de la fonction amine (primaire ou secondaire) ou hydroxyle ou thiol, respectivement, des acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides qui, généralement, coûte deux étapes (protection et déprotection). D’une manière plus générale, le procédé selon l’invention permet une économie optimale d’atomes car il ne fait intervenir, ni groupements protecteurs de la fonction amine (primaire ou secondaire) ou hydroxyle ou thiol des acides correspondants, ni agents de couplage. Cette économie d’atomes et d’étapes du procédé selon l’invention engendre, dans la réalité industrielle, des économies financières tout en diminuant la génération de déchets, soit un facteur environnemental favorable contrairement aux méthodes actuelles.
Un sixième avantage de l’invention réside dans le fait que l’activation de la fonction acide carboxylique (C-terminal) est concomitante à la protection de la fonction amine (primaire ou secondaire) ou hydroxyle ou thiol, diminuant donc le nombre d’étapes.
Un septième avantage particulièrement intéressant de l’invention réside dans l’obtention de peptides ou protéines ou peptidomimétiques de haute pureté après le clivage des groupements protecteurs des chaînes latérales, puis de la molécule d’ancrage. Ceci évite de purifier le peptide ou protéine ou peptidomimétique synthétisé. En conséquence, des économies supplémentaires sont engendrées par rapport aux procédés connus. Ceci limite encore plus l’impact environnemental de la production des peptides ou protéines ou peptidomimétiques.
Un huitième avantage de l’invention réside dans la possibilité d’accéder à des peptides ou protéines ou peptidomimétiques de plus grandes tailles, soit en modulant la taille du support liquide ou en l’introduisant sur une ou plusieurs chaînes latérales d’acides a, b ou g-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou g-mercapto acides activés.
D’autres avantages sont la possibilité d’automatiser le procédé selon l’invention et la possibilité de recycler les solvants d’extraction et les molécules d’ancrage (polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes). En effet, lorsque la série d’itérations pour obtenir la séquence du peptide ou protéine ou peptidomimétique cible est achevée, ce dernier est déprotégé de ses groupements protecteurs des chaînes latérales et finalement, de la molécule d’ancrage par une des réactions habituellement utilisées en synthèse peptidique, telles que l’hydrolyse, la saponification, l’hydrogénolyse ou toute autre réaction compatible avec le présent procédé.
Grâce à leur haute pureté, les peptides ou protéines ou peptidomimétiques produits par ce procédé peuvent être utilisés en tant que produits pharmaceutiques (médicaments et vaccins), produits cosmétiques, produits phytosanitaires, produits agroalimentaires ou comme intermédiaires pour synthétiser de tels produits.
Exemple
Un octapeptide a été préparé en utilisant le procédé selon l’invention.
Dans une première étape les acides aminés suivants ont été activés : L-phénylalanine activée (désignée ici comme AAA1), L-tryptophane activé (désigné ici comme AAA2) et L- cystéine activée (protégée par un groupe protecteur benzyle (Bzl)) (désignée ici comme AAA3). Cette réaction correspond au schéma réactionnel n° 3 ci-dessus.
A une solution de l’acide aminé (10 mmol) dans le N-N-diméthylformamide (5 ml_), à température ambiante, équipé d’un condenseur de gaz à glace carbonique et d’un bulleur, a été condensé de l’hexafluoroacétone en excès (> 2 équivalents). Après seize heures d’agitation à température ambiante, le mélange réactionnel a été concentré à sec, et le résidu a été lyophilisé. Le brut obtenu a été dissout dans le dichlorométhane, filtré puis le solvant a été éliminé sous pression réduite et lyophilisé (trois fois). Les 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazolidin-5-ones ou acides aminés activés ont été obtenus sous forme d’huile ou de solide avec des rendements compris entre 80-95 %. Leurs formules sont données ci-dessous sur le schéma n° 8.
[Chem 8] Schéma n°8 : Structures des acides aminés activés
Dans une deuxième étape, on couple un acide aminé activé (la L-phénylalanine activée désignée ici comme AAA1) sur la molécule d’ancrage, en l’occurrence un dérivé de PIB. Cette réaction correspond au schéma réactionnel n° 4 ci-dessus.
Une solution de dérivé de PIB (31 , 1 mg, 0,028 mmol) et de l’acide aminé activé (ici AAA1) (9,8 mg, 0,031 mmol) dans un mélange tétrahydrofurane/hexafluoroisopropanol (2 ml_) a été chauffée à 50°C pendant 2 heures puis refroidie à température ambiante. Une solution aqueuse saturée d’hydrogénocarbonate de sodium (2 ml) a été ajoutée au milieu réactionnel et le mélange a été agité à température ambiante pendant trente minutes. Le milieu réactionnel a été extrait trois fois au cyclohexane, lavé à la saumure, séché sur sulfate de sodium, filtré et concentré sous pression réduite pour conduire au dérivé de H2N-Phe-PIB.
Dans une troisième étape on procède à l’élongation du peptide par accrochage d’un autre acide aminé activé (ici AAA2). Cette réaction correspond au schéma réactionnel n° 5 ci- dessus.
Une solution du dérivé de hhN-Phe-PIB (1 équivalent) et l’acide aminé activé suivant (AAA2) (1 , 1 équivalent) dans le tétrahydrofurane/hexafluoroisopropanol (2 mL, 9/1) a été chauffée à 50°C pendant 2 heures puis refroidie à température ambiante. Le mélange réactionnel a été traité comme précédemment, pour conduire au dipeptide ancré correspondant (hhN-Trp-Phe-PIB), et ainsi de suite. En l’occurrence, l’itération a été répétée avec l’acide aminé activé AAA3 dans les mêmes conditions pour obtenir le tripeptide ancré correspondant (H2N-Cys(Bzl)-Trp-Phe-PIB).
On a ensuite procédé à d’autres itérations jusqu’à obtenir un octapeptide ancré de séquence H2N-Cys(Bzl)-T rp-T rp-Cys(Bzl)-T rp-Cys(Bzl)-T rp-Phe-PI B.
Dans une dernière étape, le peptide est décroché de la molécule d’ancrage. Cette réaction correspond au schéma réactionnel n° 6 ci-dessus.
A une solution de l’octapeptide ancré (H2N-Cys(Bzl)-Trp-Trp-Cys(Bzl)-Trp-Cys(Bzl)-Trp- Phe-PIB) (8 mg) dans un mélange tétrahydrofurane/eau (8:2) (2 mL), à température ambiante, a été additionnée une solution d’hydroxyde de lithium (1 M, 2 ml_). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 16 heures. Le milieu réactionnel a été dilué avec une solution de dioxane/HCI et le précipité a été lavé avec du cyclohexane.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de synthèse de peptides ou protéines ou peptidomimétiques par élongation successive de la deuxième extrémité, qui présente une fonction amine primaire ou secondaire, une fonction hydroxyle ou une fonction thiol, d’une chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique par des unités, caractérisé en ce que :
lesdites unités sont sélectionnées dans le groupe formé par les molécules de type Qa - E - Qb, où Qa et Qb peuvent être identiques ou différents, et sont sélectionnés parmi les groupes électrophiles et les groupes nucléophiles, et E représente un espaceur ;
la première extrémité dudit peptide ou protéine ou peptidomimétique est fixée par une liaison covalente à une molécule d’ancrage soluble dans des solvants organiques tels que les solvants halogénés (de préférence le chlorure de méthylène ou le chloroforme), l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le 2- méthyletétrahydrofurane, l’isooctane, le cyclohexane, l’hexane(s), le méthylcyclohexane, le méthyl tert-butyl éther ou des solvants aromatiques tels que le benzène ou le toluène ;
ledit procédé ne fait pas intervenir de groupements protecteurs de la fonction amine primaire ou amine secondaire ou hydroxyle ou thiol.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les groupes Qa et Qb sont sélectionnés dans le groupe formé par : les alcools, les aldéhydes, les amines primaires, les amines secondaires, les azides, les éthyniles, les halogènes, les thiols, les vinyles, et/ou en ce que l’espaceur E est sélectionné dans le groupe formé par les aromatiques, les hétéroaromatiques, les chaînes alkyles saturées (ramifiées ou non), les chaiînes alkyles insaturées ramifiées ou non), les glycols (et de préférence le polyéthylène glycol).
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites unités Qa - E - Qb Qa-E-Qb sont sélectionnées dans le groupe formé par : les acides a, b, g ou d- aminés naturels ou non naturels ou synthétiques, les acides a, b, y ou d-hydroxylés naturels ou non naturels ou synthétiques, les a, b, y ou d-mercapto acides naturels ou non naturels ou synthétiques.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdites unités d’acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides sont mises en œuvre sous une formé activée.
5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que lesdites unités d’acides a, b ou y-aminés ou acides a, b ou g-hydroxylés ou a, b ou y-mercapto acides sont mises en œuvre respectivement sous la forme de 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxazolidin-5-one ou (2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazinan-6-one ou 2,2- bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxazépan-7-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxolan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxan-4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-dioxépan- 4-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiolan-5-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3- oxathian-6-one ou 2,2-bis(trifluorométhyl)-1 ,3-oxathiépan-7-one ou leurs dérivés.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine ou est une chaîne polyoléfine ou un oligomère de polyoléfine ou polyalcène, avec au moins 10 unités de monomères, et de préférence entre 15 et 350 unités de monomères et est de préférence une chaîne de polyisobutène.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite chaîne polyoléfine ou oligomère de polyoléfine ou polyalcène est fonctionnalisée à au moins l’une de ses extrémités.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que ladite chaîne polyoléfine ou oligomère de polyoléfine ou polyalcène comprend un nombre de liaisons carbone-carbone insaturées ne dépassant pas 5 %, et de préférence ne dépassant pas 3 %.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage présente une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine (ou est une chaîne polyoléfine) ou oligomère de polyoléfine ou polyalcène terminée par au moins un groupement sélectionné dans le groupe formé par :
o une fonction -Xa, où Xa est sélectionné dans le groupe formé par : -OH, - NH2, -NHRa (Ra = alkyle ou aryle), -SH;
o une fonction -Y-C6H4Xb, où
■ Y est O, S, CH2 OU absent,
■ Xb est sélectionné dans le groupe formé par : -OH, -NH2, -NHRa , - SH, -CXaRaRb, -C6H3Rc(CRaXa),
où Rb est sélectionné dans le groupe formé par -H, -Aryle,
-Hétéroaryle, -Alkyle, et Rc est sélectionné dans le groupe formé par -H, -Alkyle, -O-Alkyle, -Aryle, -O-Aryle, -Hétéroaryle, -O-Hétéroaryle, o une fonction -CRd=CH-CHXa ou une fonction -CRdH-CH=CH-CHXa, où Xa est défini comme ci-dessus, et Rd est méthyle ou éthyle.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que :
ladite première extrémité de ladite chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique est une première unité d’acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide, ladite chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique est formée de n unités d’acide a, b ou g-aminé et/ou acide a, b ou g-hydroxylé et/ou a, b ou g- mercapto acide, et
la deuxième extrémité de ladite chaîne peptidique est une autre unité d’acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide.
12. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que lors de ladite élongation on ajoute une autre unité d’acide a, b ou g-aminé ou acide a, b ou g-hydroxylé ou a, b ou g-mercapto acide à ladite deuxième extrémité à partir de leurs formes activées respectives.
13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit peptide ou ladite protéine ou ledit peptidomimétique est obtenu par condensation d’un peptide ou protéine ou peptidomimétique ancré sur une molécule d’ancrage et d’un fragment de peptide ou protéine ou peptidomimétique convenablement protégé sur ses chaînes latérales.
14. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant au moins une étape dans laquelle ladite chaîne peptidique ou protéique ou peptidomimétique fixée sur ladite molécule d’ancrage est séparée du milieu réactionnel par extraction dans un solvant organique (tels que : le cyclohexane, l’heptane, l’hexane(s)) par extraction ou lavage à l’eau ou un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile ou par simple filtration.
15. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, comprenant une étape dans lequel ledit peptide ou ladite protéine ou ledit peptidomimétique est décroché de ladite molécule d’ancrage.
16. Molécule susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14.
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