WO2020218412A1 - ペプチド化合物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ペプチドの高効率な製造方法を提供することを課題とする。 下記工程（１）を含む、ペプチドの製造方法： （１） 式（Ｉ）： で表されるＮ－保護ペプチドに、 式（ＩＩ）： で表される３級アミン及び酸ハロゲン化物をフローリアクター中で反応させて得られる、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、 式（ＩＩＩ）： で表されるアミノ酸又はペプチドにシリル化剤を反応させて得られるシリル化されたアミノ酸又はペプチドを、フローリアクター中で反応させる工程［式（Ｉ）～（ＩＩＩ）中、ＡＡ１、ＡＡ２、Ｐ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、本明細書及び特許請求の範囲に記載のとおりである］。
Description
本発明は、フローリアクターを用いる、ペプチドの新規な製造方法に関する。
ペプチド中のＣ末端カルボキシ基をクロロギ酸アルキルで活性化し、シリル化されたアミノ酸またはペプチドと反応させて、カルボン酸が遊離したペプチドを一段階で合成する方法が知られている（特許文献１、２）。なお、Ｎ末端をアルコキシカルボニル基で保護されたアミノ酸中のＣ末端カルボキシ基を、クロロギ酸アルキルを用いて活性化する方法では、活性化された中間体を安定に取り出すことができることが知られている（非特許文献１、２）。一方、例えばペプチドのようなＮ末端にアミド構造を有するアミノ酸中のＣ末端カルボキシ基を、クロロギ酸アルキルを用いて活性化する方法では、活性化された中間体を安定に取り出すことができず、アズラクトン(オキサゾロン)の形成が進行することが知られている（非特許文献１）。
また、バッチ式とは異なる反応形式として連続式があり、その中でもフローリアクターやマイクロリアクターと呼ばれる小型反応装置を用いて、溶液を流しながら連続的に化学合成を行う方法が知られている。フローリアクターは、従来実施されているバッチ方式と比べて、小さな反応容器を用いて反応を行うため、精密な温度制御及び反応時間制御が可能であり、混合効率も良いという利点を有することが知られている（非特許文献５）。ペプチドを合成する例としては、縮合剤としてトリホスゲンを用いてジペプチドを合成し、Ｎ末端方向へペプチド鎖を伸長する方法が知られている（非特許文献３、４）。また、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）を縮合剤として用いて、ペプチド同士を縮合する方法が知られている（特許文献３、４）。
また、バッチ式とは異なる反応形式として連続式があり、その中でもフローリアクターやマイクロリアクターと呼ばれる小型反応装置を用いて、溶液を流しながら連続的に化学合成を行う方法が知られている。フローリアクターは、従来実施されているバッチ方式と比べて、小さな反応容器を用いて反応を行うため、精密な温度制御及び反応時間制御が可能であり、混合効率も良いという利点を有することが知られている（非特許文献５）。ペプチドを合成する例としては、縮合剤としてトリホスゲンを用いてジペプチドを合成し、Ｎ末端方向へペプチド鎖を伸長する方法が知られている（非特許文献３、４）。また、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）を縮合剤として用いて、ペプチド同士を縮合する方法が知られている（特許文献３、４）。
インターナショナル ジャーナル オブ ペプチド アンド プロテイン リサーチ、１９８８年、３１巻、３３９－３４４頁
カナディアン ジャーナル オブ ケミストリー、１９８７年、６７巻、６１９－６２４
アンゲヴァンテ ケミー インターナショナル エディション、２０１４年、５３巻、８５１－８５５
ネイチャー コミュニケーションズ、２０１６年、７、１３４２９
マイクロリアクターの開発と応用、２００３年、３－９頁
本発明者らが確認したところ、特許文献１、２に記載のバッチ式では、カルボキシ基が活性化されたペプチドと、シリル化されたアミノ酸またはペプチドとの反応での発熱を制御するため、試薬の滴下に時間がかかり、副生物であるアズラクトンが生成して収率が低下し、工業的に実施するには不向きであることが見出された。
一方、非特許文献３、４に記載のフロー式では、Ｃ末端がアルキル基で保護されたアミノ酸を用いているため、Ｃ末端方向にペプチドを伸長させる場合、Ｃ末端の脱保護が必要とされる。また、カルボキシ基の活性化は、アミノ基が保護されたアミノ酸のみであり、アズラクトンが生成しやすい、アミド結合を有するペプチド末端のカルボキシ基活性化による、Ｃ末端側への伸長の検討はなされていない。
また、特許文献３、４に記載のフロー式では、得られたペプチドのＣ末端が、脱保護が難しいアルキルアミドであり、Ｃ末端側にペプチド鎖を伸長させる方法には適していない。そして、ＨＢＴＵでＣ末端カルボキシ基を活性化したペプチドと、シリル化されたアミノ酸またはペプチドとの反応を行うと、固体析出による流路の閉塞を発生させることが見出された。
さらにフロー式において、クロロギ酸アルキルでカルボキシ基を活性化する際に用いられる有機３級アミンとして、バッチ式で使用されているトリエチルアミンやジイソプロピルエチルアミンを用いた場合、反応が十分に進行しないことが見出された。
本発明は、フローリアクターを用いて、Ｃ末端側からペプチド鎖を伸長する、ペプチドの新規な製造方法を提供する。
一方、非特許文献３、４に記載のフロー式では、Ｃ末端がアルキル基で保護されたアミノ酸を用いているため、Ｃ末端方向にペプチドを伸長させる場合、Ｃ末端の脱保護が必要とされる。また、カルボキシ基の活性化は、アミノ基が保護されたアミノ酸のみであり、アズラクトンが生成しやすい、アミド結合を有するペプチド末端のカルボキシ基活性化による、Ｃ末端側への伸長の検討はなされていない。
また、特許文献３、４に記載のフロー式では、得られたペプチドのＣ末端が、脱保護が難しいアルキルアミドであり、Ｃ末端側にペプチド鎖を伸長させる方法には適していない。そして、ＨＢＴＵでＣ末端カルボキシ基を活性化したペプチドと、シリル化されたアミノ酸またはペプチドとの反応を行うと、固体析出による流路の閉塞を発生させることが見出された。
さらにフロー式において、クロロギ酸アルキルでカルボキシ基を活性化する際に用いられる有機３級アミンとして、バッチ式で使用されているトリエチルアミンやジイソプロピルエチルアミンを用いた場合、反応が十分に進行しないことが見出された。
本発明は、フローリアクターを用いて、Ｃ末端側からペプチド鎖を伸長する、ペプチドの新規な製造方法を提供する。
本発明者らは鋭意検討した結果、ペプチドのＣ末端カルボキシ基を酸ハロゲン化物と、特定の構造を有する有機３級アミンを用いてフローリアクター中で活性化し、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、シリル化されたアミノ酸又はペプチドとの反応をフローリアクター中で行うことにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下を特徴とするものである。
［１］
下記工程（１）を含む、ペプチドの製造方法：
（１）
式（Ｉ）：
［式中、ＡＡ１は２～２０個のアミノ酸からなるペプチド由来の基を表し、ＰはＮ末端保護基を表す］で表されるＮ－保護ペプチドに、
式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内、１つ又は２つがメチル基であり、残りは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基のとき、残りの２つが一緒になってＣ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６－７員環を形成してもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミン及び酸ハロゲン化物をフローリアクター中で反応させて得られる、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、
式（ＩＩＩ）：
［式中、ＡＡ2はアミノ酸又は、２～２０残基からなるペプチド由来の基を表す］で表されるアミノ酸又はペプチドにシリル化剤を反応させて得られるシリル化されたアミノ酸又はペプチドを、フローリアクター中で反応させる工程。
［２］
式（ＩＩ）で表される３級アミンの使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して０．０５モル当量乃至１モル当量であり、さらに
式（ＩＶ）
［式中、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、それぞれ置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基（ただし、メチル基を除く）であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の内２つが、Ｃ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらと結合する窒素原子と一緒になって６－７員環を形成していてもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミンを使用する、［１］に記載のペプチドの製造方法。
［３］
式（ＩＶ）で表される３級アミンと、式（ＩＩ）で表される３級アミンの合わせた使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して１．０乃至１０モル当量である、［２］に記載のペプチドの製造方法。
［４］
酸ハロゲン化物が、クロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物、スルホン酸塩化物又はリン酸塩化物である、［１］乃至［３］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［５］
酸ハロゲン化物が、クロロギ酸Ｃ１－６アルキルである、［１］乃至［４］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［６］
酸ハロゲン化物が、クロロギ酸イソブチルである、［１］乃至［５］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［７］
式（ＩＩ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、Ｎ－メチルジエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン又はＮ－メチルモルホリンである、［１］乃至［６］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［８］
式（ＩＶ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン又はトリ－ｎ－プロピルアミンである、［２］乃至［７］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［９］
アミノ酸又はペプチドがα－アミノ酸で構成される、［１］乃至［８］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［１０］
Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、カルバメート系保護基である、［１］乃至［９］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１１］
Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基又はｔ－ブトキシカルボニル基である、［１］乃至［１０］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１２］
シリル化剤が、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである、［１］乃至［１１］のいずれか１つに記載の製造方法。
下記工程（１）を含む、ペプチドの製造方法：
（１）
式（Ｉ）：
［式中、ＡＡ１は２～２０個のアミノ酸からなるペプチド由来の基を表し、ＰはＮ末端保護基を表す］で表されるＮ－保護ペプチドに、
式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内、１つ又は２つがメチル基であり、残りは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基のとき、残りの２つが一緒になってＣ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６－７員環を形成してもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミン及び酸ハロゲン化物をフローリアクター中で反応させて得られる、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、
式（ＩＩＩ）：
［式中、ＡＡ2はアミノ酸又は、２～２０残基からなるペプチド由来の基を表す］で表されるアミノ酸又はペプチドにシリル化剤を反応させて得られるシリル化されたアミノ酸又はペプチドを、フローリアクター中で反応させる工程。
［２］
式（ＩＩ）で表される３級アミンの使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して０．０５モル当量乃至１モル当量であり、さらに
式（ＩＶ）
［式中、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、それぞれ置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基（ただし、メチル基を除く）であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の内２つが、Ｃ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらと結合する窒素原子と一緒になって６－７員環を形成していてもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミンを使用する、［１］に記載のペプチドの製造方法。
［３］
式（ＩＶ）で表される３級アミンと、式（ＩＩ）で表される３級アミンの合わせた使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して１．０乃至１０モル当量である、［２］に記載のペプチドの製造方法。
［４］
酸ハロゲン化物が、クロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物、スルホン酸塩化物又はリン酸塩化物である、［１］乃至［３］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［５］
酸ハロゲン化物が、クロロギ酸Ｃ１－６アルキルである、［１］乃至［４］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［６］
酸ハロゲン化物が、クロロギ酸イソブチルである、［１］乃至［５］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［７］
式（ＩＩ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、Ｎ－メチルジエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン又はＮ－メチルモルホリンである、［１］乃至［６］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［８］
式（ＩＶ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン又はトリ－ｎ－プロピルアミンである、［２］乃至［７］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［９］
アミノ酸又はペプチドがα－アミノ酸で構成される、［１］乃至［８］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［１０］
Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、カルバメート系保護基である、［１］乃至［９］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１１］
Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基又はｔ－ブトキシカルボニル基である、［１］乃至［１０］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１２］
シリル化剤が、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである、［１］乃至［１１］のいずれか１つに記載の製造方法。
本発明により、フローリアクターによるペプチドの新規な製造方法を提供することができた。
本明細書における「ｎ－」はノルマル、「ｉ－」はイソ、「ｓ－」及び「ｓｅｃ－」はセカンダリー、「ｔ－」及び「ｔｅｒｔ－」はターシャリー、「ｃ－」はシクロ、「ｐ－」はパラ、「Ｍｅ」はメチル、「Ｂｕ」はブチル、「Ｐｒ」はプロピル、「Ｂｎ」はベンジル、「Ｐｈ」はフェニル、「Ｂｏｃ」はｔ－ブトキシカルボニル、「Ｃｂｚ」はベンジルオキシカルボニル、「Ｆｍｏｃ」は９－フルオレニルメトキシカルボニル、「Ｔｒｔ」はトリチル、「Ａｃ」はアセチルを意味する。
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
「Ｃ１－６アルキル基」とは、炭素数が１乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などが挙げられる。
「脂肪族炭化水素基」とは、直鎖、分岐鎖状又は環状の、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基であり、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基等が挙げられ、具体例としては、Ｃ１－１０アルキル基、Ｃ３－６シクロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６アルキニル基、Ｃ７－１４アラルキル基等が挙げられる。
「Ｃ１－１０アルキル基」とは、炭素数が１乃至１０個である直鎖又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、オクチル基、デシル基などが挙げられる。
「Ｃ２－６アルキル基」とは、炭素数が２乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体例としては、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などが挙げられる。
「Ｃ２－６アルケニル基」とは、炭素数が２乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルケニル基を意味し、具体例としては、ビニル基、１－プロペニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基などが挙げられる。
「Ｃ２－６アルキニル基」とは、炭素数が２乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルキニル基を意味し、具体例としては、エチニル基、１－プロピニル基などが挙げられる。
「Ｃ３－６シクロアルキル基」とは、炭素数が３乃至６個であるシクロアルキル基を意味し、具体例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
「Ｃ７－１４アラルキル基」とは、炭素数が７乃至１４個であるアラルキル基を意味し、具体例としては、ベンジル基、１－フェニルエチル基、２－フェニルエチル基、１－フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、１－ナフチルエチル基、１－ナフチルプロピル基などが挙げられる。
「トリＣ１－６アルキルシリル基」とは、同一又は異なる３個の前記「Ｃ１－６アルキル基」がシリル基に結合した基を意味し、具体例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基などが挙げられる。
「トリＣ１－６アルキルシリルオキシ基」とは、同一又は異なる３個の前記「Ｃ１－６アルキル基」がシリルオキシ基に結合した基を意味し、具体例としては、トリメチルシリルオキシ基、トリエチルシリルオキシ基、トリイソプロピルシリルオキシ基、ｔ－ブチルジメチルシリルオキシ基などが挙げられる。
「ジＣ１－６アルキルアミノ基」とは、同一又は異なる２個の前記「Ｃ１－６アルキル基」がアミノ基に結合した基を意味し、具体例としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジ－ｎ－プロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジ－ｎ－ブチルアミノ基、ジイソブチルアミノ基、ジ－ｔ－ブチルアミノ基、ジ－ｎ－ペンチルアミノ基、ジ－ｎ－ヘキシルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアミノ基、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－ｎ－ブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－イソブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－t－ブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－ペンチルアミノ基、Ｎ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－プロピルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルアミノ基、Ｎ－ｎ－ブチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－イソブチルアミノ基、Ｎ－t－ブチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－ペンチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－ヘキシルアミノ基などが挙げられる。
「５－１０員複素環基」とは、環を構成する原子の数が５乃至１０個であり、かつ環を構成する原子中に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群より独立して選ばれる１乃至４個のヘテロ原子を含有する単環系又は縮合多環系の複素環基を意味する。この複素環基は飽和、部分不飽和、不飽和のいずれであってもよく、具体例としては、ピロリジニル基、テトラヒドロフリル基、テトラヒドロチエニル基、ピペリジル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル基、ピロリル基、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、アゼパニル基、オキセパニル基、チエパニル基、アゼピニル基、オキセピニル基、チエピニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、イミダゾリニル基、ピラジニル基、モルホリニル基、チアジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、プリニル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、クロメニル基、イソクロメニル基などが挙げられる。
「Ｃ６－１４アリール基」とは、炭素数が６乃至１４個である芳香族炭化水素基を意味し、その具体例としては、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－アントラセニル基、２－アントラセニル基、９－アントラセニル基、ビフェニル基などが挙げられる。
「Ｃ６－１４アリールオキシ基」とは、炭素数が６乃至１４個であるアリールオキシ基を意味し、具体例としては、フェノキシ基、１－ナフチルオキシ基、２－ナフチルオキシ基、１－アントラセニルオキシ基、２－アントラセニルオキシ基、９－アントラセニルオキシ基、ビフェニルオキシ基などが挙げられる。
「Ｃ１－６アルコキシ基」とは、炭素数が１乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルコキシ基を意味し、具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基などが挙げられる。
「Ｃ３－６シクロアルコキシ基」とは、炭素数が３乃至６個であるシクロアルコキシ基を意味し、具体例としては、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基などが挙げられる。
「Ｃ１－６アルコキシカルボニル基」とは、炭素数が１乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルコキシカルボニル基を意味し、具体例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ｎ－ペンチルオキシカルボニル基、ｎ－ヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。
「置換基を有していてもよい」とは、無置換であるか、又は任意の数の任意の置換基で置換されていることを意味する。
上記の「任意の置換基」は、本発明が対象とする反応に悪影響を与えない置換基であれば特に種類は限定されない。
「置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基」における「置換基」としては、例えば、Ｃ６－１４アリール基、Ｃ６－１４アリールオキシ基、５－１０員複素環基、ヒドロキシ基、Ｃ１－６アルコキシ基、Ｃ３－６シクロアルコキシ基、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基、アミノ基、Ｎ－アセチルアミノ基、ジＣ１－６アルキルアミノ基、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシカルボニル基、フェノキシカルボニル基、Ｎ－メチルカルバモイル基、Ｎ－フェニルカルバモイル基、トリＣ１－６アルキルシリル基、トリＣ１－６アルキルシリルオキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基等が挙げられ、好ましくは、Ｃ６－１４アリール基、Ｃ１－６アルコキシ基、ジＣ１－６アルキルアミノ基、トリＣ１－６アルキルシリル基、トリＣ１－６アルキルシリルオキシ基であり、より好ましくは、Ｃ６－１４アリール基、Ｃ１－６アルコキシ基、トリＣ１－６アルキルシリル基である。
「Ｎ－保護ペプチド」とは、Ｎ末端のアミノ基が保護されており、Ｃ末端のカルボキシル基が無保護のペプチドを意味する。
本明細書における、「Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基のとき、残りの２つが一緒になってＣ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６－７員環を形成してもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す。）に置き換えられてもよい」の表記の具体例としては、ピペリジン、アゼパン、モルホリン、Ｎ－メチルピペラジン等が挙げられる。
本発明で使用されるアミノ酸は、アミノ基とカルボキシ基の両方の官能基を持つ有機化合物であり、好ましくはα－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸又はδ－アミノ酸であり、より好ましくはα－アミノ酸又はβ－アミノ酸であり、更に好ましくはα－アミノ酸である。
本発明で使用されるアミノ酸のアミノ基は置換されていてもよく、好ましくは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基で置換されていてもよく、より好ましくはＣ１－６アルキル基又はＣ７－１４アラルキル基で置換されていてもよく、更に好ましくはメチル基で置換されていてもよい。
本発明で使用されるペプチドを構成するアミノ酸は、上述のアミノ酸である。
α－アミノ酸の立体構造は特に限定されないが、好ましくはＬ体である。
本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
（本発明のペプチドの製造法の具体的な説明）
以下に本発明のペプチドの製造法について説明する。
本具体的な説明は以下に基づき説明される。
（ａ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記と同義である。
（ｂ）反応の具体的な条件は、本発明のペプチドの製造が達成される限りにおいて特に制限されない。各反応における好ましい条件は適宜詳述される。
（ｃ）各反応で記載される溶媒は、単独で用いても、２種類以上を混合して用いても良い。
以下に本発明のペプチドの製造法について説明する。
本具体的な説明は以下に基づき説明される。
（ａ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記と同義である。
（ｂ）反応の具体的な条件は、本発明のペプチドの製造が達成される限りにおいて特に制限されない。各反応における好ましい条件は適宜詳述される。
（ｃ）各反応で記載される溶媒は、単独で用いても、２種類以上を混合して用いても良い。
本発明は、Ｎ－保護ペプチドのＣ末端のカルボキシ基を特定の構造を有する有機３級アミンを用いてフローリアクター中で活性化させ、これにシリル化されたアミノ酸またはペプチドをフローリアクター中で反応させて、Ｃ末端が伸長されたペプチドを得る製造法である。
特定の構造を有する有機３級アミンを用いたＮ－保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基の活性化反応は、酸塩化物の存在下で実施することができる。また特定の構造を有する有機３級アミンを触媒として用いて実施する場合は、その他の塩基を共存させて実施することができる。
本明細書中、「特定の構造を有する有機３級アミン」とは、上記式（ＩＩ）で表されるアミン化合物であり、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内、１つ又は２つがメチル基であり、残りが置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基であるアミン、又はＲ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基であり、残りの２つが一緒になってＣ５のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６員環を形成し、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏに置き換えられてもよいアミンであり、より好ましくは、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、Ｎ－メチルジエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン又はＮ－メチルモルホリンである。
本発明で使用する酸ハロゲン化物は、好ましくはクロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物、スルホン酸塩化物、リン酸塩化物であり、より好ましくはクロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物であり、さらに好ましくはクロロギ酸Ｃ１－６アルキルであり、特に好ましくはクロロギ酸イソブチルである。
本発明で使用する「その他の塩基」とは、上記式（ＩＶ）で表されるアミン化合物であり、好ましくはＲ４、Ｒ５及びＲ６が、独立して、置換基を有していてもよいＣ２－６アルキル基であるアミン、又はＲ４、Ｒ５及びＲ６の内２つが、一緒になってＣ５のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６員環を形成し、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏに置き換えられてもよいアミンであり、より好ましくは、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、独立して、Ｃ２－６アルキル基であるアミンであり、さらに好ましくは、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン又はトリ－ｎ－プロピルアミンである。
本発明で使用する「特定の構造を有する有機３級アミン」の使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは０.０１当量乃至５０当量、より好ましくは０．１当量乃至２０当量、さらに好ましくは０．２当量乃至５当量である。
本発明で使用する「特定の構造を有する有機３級アミン」の使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して１当量未満である場合は、「その他の塩基」と合わせた使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは０.９当量乃至５０当量、より好ましくは０．９５当量乃至２０当量、さらに好ましくは１．０当量乃至５当量である。
本発明で使用する酸塩化物の使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは０.９当量乃至５０当量、より好ましくは０．９５当量乃至２０当量、さらに好ましくは１．０当量乃至５当量である。
本発明で使用するシリル化されたアミノ酸又はペプチドは、反応を妨げない限り特に限定されないが、例えば特許文献１、２に記載の方法で、アミノ酸またはペプチドとシリル化剤により調製される。
本発明で使用するシリル化剤は、反応を妨げない限り特に限定されないが、例えばＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ヘキサメチルジシラザン、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルアセトアミド（ＭＳＡ）、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド、Ｎ－（トリメチルシリル）アセトアミド、Ｎ－（トリメチルシリル）ジエチルアミン、Ｎ－（トリメチルシリル）ジメチルアミン、１－（トリメチルシリル）イミダゾール、３－（トリメチルシリル）－２－オキサゾリドン、トリメチルシリルシアニド、クロロトリメリルシラン、臭化トリメチルシラン、ヨウ化トリメチルシラン、トリメチルシリルトリフラートであり、好ましくはＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである。
本発明で使用する溶媒は、反応を妨げない限り特に限定されないが、その例としては、含ハロゲン炭化水素溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム）、芳香族炭化水素溶媒（例えば、トルエン、キシレン）、エーテル溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、メチル－ｔ－ブチルエーテル）、アミド溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン）、ニトリル溶媒（例えば、アセトニトリル）等が挙げられる。好ましくはニトリル溶媒、アミド溶媒、又はエーテル溶媒であり、より好ましくはアセトニトリル、テトラヒドロフラン、又はＮ－メチルピロリドンである。
本発明で使用する溶媒の使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは１００質量倍以下であり、より好ましくは１質量倍乃至５０質量倍であり、さらに好ましくは５質量倍乃至２０質量倍である。
本発明で使用するフローリアクターとは、連続的にリアクターへ試剤を送入し連続的に反応物を取り出せるようにした装置であり、通常内径１０μｍから３ｃｍ程度の細長い流通路を用いる。一般にマイクロリアタクーと呼ばれる装置は、フローリアクターの一種である。
本発明において、ミキサーおよび流通路の形状、材質は特に限定されるものではない。たとえばミキサーとしては、Ｔ字管、（株）テクノアプリケーションズ製スタティック型ミキサー（商品名ＣоｍｅｔＸ－０１）、ノリタケ製スタティックミキサー（商品名Ｃタイプ、Ｔタイプ）などのスタティック型ミキサー、（株）ワイエムシィ製へリックス型ミキサー（商品名スピカ）などのヘリックス型ミキサー等を用いることができ、好ましくは（株）テクノアプリケーションズ製スタティック型ミキサー（商品名ＣоｍｅｔＸ－０１）である。
本発明で使用するミキサーの材質としてはステンレス、ガラス、ポリテトラフルオロエチレン樹脂が好ましい。
本発明で使用する流通路としては、特に限定されないが、断面積８０μｍ２から７ｃｍ２、長さ１ｃｍから３００ｍのチューブが好ましく、より好ましくは断面積０.２ｍｍ２から８０ｍｍ２、長さ０．１ｍから１０ｍのチューブである。
本発明で使用する流通路の材質としてはガラス、ステンレス、ポリテトラフルオロエチレン樹脂が好ましい。
本発明で使用する流速は、特に限定されないが、たとえば毎分０．１ｍＬから１Ｌであり、好ましくは毎分５ｍＬから５００ｍＬである。
本発明における反応温度は、特に限定されないが、－４０℃から使用する溶媒の沸点まで可能であるが、好ましくは０～４０℃の範囲で行うのがよい。除熱効率を上げるために、ミキサー部をそれ以降の部分よりも低温に設定してもよい。
本発明で得られる、「Ｃ末端が伸長されたペプチド」は、式（Ｖ）：
［式中、各記号は上記と同義である。］で表される化合物である。
［式中、各記号は上記と同義である。］で表される化合物である。
各反応において、反応基質がヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基又はカルボニル基を有する場合（特にアミノ酸又はペプチドの側鎖に官能基を有する場合）、これらの基にペプチド化学等で一般的に用いられるような保護基が導入されていてもよく、反応後に必要に応じて保護基を除去することにより目的化合物を得ることができる。
保護及び脱保護は、一般的に知られている保護基を用いて、保護・脱保護反応（例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第４版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．）（２００６年）など参照）を行うことにより実施することができる。
以下に参考合成例、合成例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、各表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。
実施例のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）は、特に記述が無い場合は、日本電子（ＪＥＯＬ）社製ＪＮＭ－ＥＣＰ３００、又は日本電子（ＪＥＯＬ）社製ＪＮＭ－ＥＣＸ３００、又は、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社製ＡｓｃｅｎｄＴＭ５００を用いて重クロロホルム又は重ジメチルスルホキシド溶媒中で測定し、化学シフトは、テトラメチルシランを内部標準（０．０ｐｐｍ）としたときのδ値（ｐｐｍ）で示した。
ＮＭＲスペクトルの記載において、「ｓ」はシングレット、「ｄ」はダブレット、「ｔ」はトリプレット、「ｑ」はカルテット、「ｄｄ」はダブレット オブ ダブレット、「ｄｔ」はダブレット オブ トリプレット、「ｍ」はマルチプレット、「ｂｒ」はブロード、「Ｊ」はカップリング定数、「Ｈｚ」はヘルツ、「ＣＤＣｌ３」は重クロロホルムを意味する。
高速液体クロマトグラフィー／質量分析は、特に記載が無い場合は、Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＱＤａ、Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＳＱＤ２、又は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製ＬＣ－２０ＡＤ／Ｔｒｉｐｌｅ Ｔｏｆ５６００のいずれかを用いて測定した。
高速液体クロマトグラフィー／質量分析の記載において、ＥＳＩ＋はエレクトロスプレーイオン化法のポジティブモードであり、Ｍ＋Ｈはプロトン付加体、Ｍ＋Ｎａはナトリウム付加体を意味する。
高速液体クロマトグラフィー／質量分析の記載において、ＥＳＩ－はエレクトロスプレーイオン化法のネガティブモードであり、Ｍ－Ｈはプロトン欠損体を意味する。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーでの精製は、特に記述がない場合は、山善製Ｈｉ－Ｆｌａｓｈカラム、バイオタージ製ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、メルク製シリカゲル６０又は富士シリシア化学製ＰＳＱ６０Ｂのいずれかを用いた。
なお、本実施例中で用いられるミキサーは、断りが無い場合は、（株）テクノアプリケーションズ製スタティック型ミキサー（商品名ＣоｍｅｔＸ－０１）である。
参考合成例１：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
フェニルアラニン（１２．８ ｇ、 ７８．５ ｍｍоｌ）をテトラヒドロフラン（７５．０ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３１．５ ｇ、１５７ ｍｍоｌ）を加えた後、４０℃で１時間撹拌し、０℃に冷却した（シリル化アミノ酸溶液）。Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２５．０ ｇ、６４．５ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（７．８３ ｇ、７８．５ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１２５ ｇ）と混合させ、０℃に冷却して、クロロギ酸イソブチル（９．７０ ｇ、７１．０ ｍｍｏｌ）を一括で加えた後、２分攪拌して、シリルアミノ酸溶液を加え、１時間撹拌した。得られた反応液へ、水（５０ ｇ）を加え、減圧濃縮した。濃縮した液を酢酸エチル（１３０ｇ）で２回抽出して、得られた有機層の水での洗浄を３回実施した。得られた有機層を減圧濃縮してアセトニトリル（１５０ ｇ）を加え再度減圧濃縮し、アセトニトリル（１３０ ｇ）を加えて０．５時間撹拌した後、ろ過を行い、白色固体を得た。得られた固体にアセトニトリル（１５０ ｇ）を加えて０．５時間撹拌した後、ろ過で固体を得た後、減圧乾燥を行い、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２６．７ ｇ、収率７８％、ジアステレオマー過剰率９９．７％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５３５．３４（Ｍ＋Ｈ）＋
フェニルアラニン（１２．８ ｇ、 ７８．５ ｍｍоｌ）をテトラヒドロフラン（７５．０ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３１．５ ｇ、１５７ ｍｍоｌ）を加えた後、４０℃で１時間撹拌し、０℃に冷却した（シリル化アミノ酸溶液）。Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２５．０ ｇ、６４．５ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（７．８３ ｇ、７８．５ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１２５ ｇ）と混合させ、０℃に冷却して、クロロギ酸イソブチル（９．７０ ｇ、７１．０ ｍｍｏｌ）を一括で加えた後、２分攪拌して、シリルアミノ酸溶液を加え、１時間撹拌した。得られた反応液へ、水（５０ ｇ）を加え、減圧濃縮した。濃縮した液を酢酸エチル（１３０ｇ）で２回抽出して、得られた有機層の水での洗浄を３回実施した。得られた有機層を減圧濃縮してアセトニトリル（１５０ ｇ）を加え再度減圧濃縮し、アセトニトリル（１３０ ｇ）を加えて０．５時間撹拌した後、ろ過を行い、白色固体を得た。得られた固体にアセトニトリル（１５０ ｇ）を加えて０．５時間撹拌した後、ろ過で固体を得た後、減圧乾燥を行い、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２６．７ ｇ、収率７８％、ジアステレオマー過剰率９９．７％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５３５．３４（Ｍ＋Ｈ）＋
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ａ＞によって算出した。
＜分析条件Ａ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
４５：５５（０－１５分）、４５：５５－９５：５（１５－１８分）、９５：５（１８－２２分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．８ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
＜分析条件Ａ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
４５：５５（０－１５分）、４５：５５－９５：５（１５－１８分）、９５：５（１８－２２分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．８ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
合成例１：Ｎ－メチルモルホリンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００ ｇ、３．７４ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．４５ ｇ、４．４９ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９ ｇ）及びアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．５６ ｇ、４．１１ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．７４ ｇ、 ４．４９ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（１．８３ ｇ、８．９８ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．１ ｍＬ、溶液２を毎分５．８０ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．１４ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（１．０ ｍＬ）を加えた容器に１．５分間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９７．６％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．８％ｄｅであった。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６８２．５（Ｍ＋Ｈ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６８２．５（Ｍ＋Ｈ）＋
定量収率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｂ＞による定量分析法にて算出した。
＜分析条件Ｂ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７ μｍ、３．０×１００ ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
１０：９０（０分）、１０：９０－９５：５（０－１１分）、９５：５（１１－１５分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．７ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
＜分析条件Ｂ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７ μｍ、３．０×１００ ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
１０：９０（０分）、１０：９０－９５：５（０－１１分）、９５：５（１１－１５分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．７ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｃ＞によって算出した。
＜分析条件Ｃ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
５０：５０（０－１５分）、５０：５０－９５：５（１５－１８分）、９５：５（１８－２２分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．７ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
＜分析条件Ｃ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
５０：５０（０－１５分）、５０：５０－９５：５（１５－１８分）、９５：５（１８－２２分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．７ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
定量分析は、以下の手順で合成したＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨを標準物質とした絶対検量線法にて、定量分析を行った。
反応で得られたＮ－メチルピロリドン溶液を一部抜き取り、減圧濃縮して塩化メチレン（１０．０ ｇ）に希釈し、水（５．０ ｇ）で２回洗浄した。得られた有機層を減圧濃縮し、アセトニトリル（５．０ ｇ）を加えて撹拌し、ろ過で固体を得た。次いで、減圧乾燥を行い白色固体としてＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．４１ ｇ）を得た。
標準物質のＮＭＲを示す。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ１２．８（１Ｈ，ｓ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５２－７．６２（２Ｈ，ｍ），７．１１－７．４２（２０Ｈ，ｍ），４．４２－７．６２（２Ｈ，ｍ），３．９２－４．２２（４Ｈ，ｍ），２．６２－３．１０（６Ｈ，ｍ），
反応で得られたＮ－メチルピロリドン溶液を一部抜き取り、減圧濃縮して塩化メチレン（１０．０ ｇ）に希釈し、水（５．０ ｇ）で２回洗浄した。得られた有機層を減圧濃縮し、アセトニトリル（５．０ ｇ）を加えて撹拌し、ろ過で固体を得た。次いで、減圧乾燥を行い白色固体としてＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．４１ ｇ）を得た。
標準物質のＮＭＲを示す。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ１２．８（１Ｈ，ｓ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５２－７．６２（２Ｈ，ｍ），７．１１－７．４２（２０Ｈ，ｍ），４．４２－７．６２（２Ｈ，ｍ），３．９２－４．２２（４Ｈ，ｍ），２．６２－３．１０（６Ｈ，ｍ），
参考合成例２：Ｎ－エチルモルホリンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチルモルホリン（０．１２９ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は１９．３％であった。
合成例２：Ｎ－メチルピペリジンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルピペリジン（０．１１２ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９３．０％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．６％ｄｅであった。
参考合成例３：Ｎ－エチルピペリジンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチルピペリジン（０．１２７ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は１９．３％であった。
合成例３：Ｎ－メチルジエチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルジエチルアミン（０．０９８ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９５．４％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．７％ｄｅであった。
参考合成例４：トリエチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１１４ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は３３．２％であった。
合成例４：Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン（０．１１４ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９５．４％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．８％ｄｅであった。
合成例５：Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン（０．１５２ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９２．２％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．５％ｄｅであった。
合成例６：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン及びＮ－メチルモルホリンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１２１ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（０．０１９ ｇ、０．１９ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９７．３％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．８％ｄｅであった。
参考合成例５：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９４ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１４５ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びクロロホルム（３．７３ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５ ｇ、 １．１３ ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７ ｇ、２．２６ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０ ｍＬ、溶液２を毎分５．９３ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５ ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は２．０％であった。
参考合成例６：バッチ式でのＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成１
フェニルアラニン（０．０７４ ｇ、 ０．４４ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．１８３ ｇ、０．８８ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却した（シリル化アミノ酸溶液）。Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．２０ ｇ、０．３７ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．０４５ ｇ、０．４４ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．８９ ｇ）及びアセトニトリル（０．７９ ｇ）と混合させ、０℃に冷却して、クロロギ酸イソブチル（０．０６１ ｇ、０．４４ ｍｍｏｌ）を一括で加えた後、３０分攪拌して、シリルアミノ酸溶液を２時間かけて加え、３０分撹拌した。得られた反応液へ、水（１ ｇ）、Ｎ－メチルピロリドンを加えて均一化させた。得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は４２．０％であり、ジアステレオマー過剰率は９５．６％ｄｅであった。
参考合成例７：バッチ式でのＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成２
フェニルアラニン（０．０７４ ｇ、 ０．４４ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１．５８ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．１８３ ｇ、０．８８ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却した（シリル化アミノ酸溶液）。Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．２０ ｇ、０．３７ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．０４５ ｇ、０．４４ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．８９ ｇ）及びアセトニトリル（０．７９ ｇ）と混合させ、２５℃でクロロギ酸イソブチル（０．０６１ ｇ、０．４４ ｍｍｏｌ）を一括で加えた後、３０分攪拌して、シリルアミノ酸溶液を２時間かけて加え、３０分撹拌した。得られた反応液へ、水（１ ｇ）、Ｎ－メチルピロリドンを加えて均一化させて得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は２１．７％であり、ジアステレオマー過剰率は３０．１％ｄｅであった。
合成例７：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００ ｇ、３．７４ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．４５４ ｇ、４．４９ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９ ｇ）及びアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．５６２ ｇ、４．１１ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｓ－トリチルシステイン（１．６３２ ｇ、 ４．４９ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１７．３ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（１．８２７ ｇ、８．９８ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分９．４ ｍＬ、溶液２を毎分４．５ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分１１．１ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め１０％炭酸カリウム水溶液（１０ ｍＬ）を加えた容器に１２５秒間捕集した。得られた溶液を分液し、再度１０％炭酸カリウム水溶液（１５ ｇ）を加えて分液し、１０％塩化ナトリウム水溶液（１０ ｇ）で有機層を洗浄した。得られた有機層に１０％塩化ナトリウム水溶液（５ ｇ）、１０％塩化アンモニウム水溶液（５ ｇ）を加え２回分液した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフにて精製し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．７４ ｇ、収率９４％、ジアステレオマー過剰率９９．２％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；９０２．３６（Ｍ＋Ｎａ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；９０２．３６（Ｍ＋Ｎａ）＋
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｄ＞によって算出した。
＜分析条件Ｄ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
５８：４２（０－２７分）、５８：４２－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
＜分析条件Ｄ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
５８：４２（０－２７分）、５８：４２－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
合成例８：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．００ ｇ、２．２７ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．２７６ ｇ、２．７２ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９ ｇ）及びアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．３４１ ｇ、２．５０ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｏ－ｔ-Ｂｕ－チロシン（０．６４７ ｇ、 ２．７２ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（１．１１０ ｇ、５．４５ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．４ ｍＬ、溶液２を毎分５．８ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分６．８ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め１０％炭酸カリウム水溶液（１０ ｍＬ）を加えた容器に９０秒間捕集した。得られた溶液を分液し、再度１０％炭酸カリウム水溶液（１５ ｇ）を加えて分液し、１０％塩化ナトリウム水溶液（１０ ｇ）で有機層を洗浄した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフにて精製し、捕集した溶液を濃縮した後、ヘキサン（４０ ｇ）を混合し、析出した固体をろ過、乾燥し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ（１．９５ ｇ、収率９２％、ジアステレオマー過剰率９９．６％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；１１２１．６４（Ｍ＋Ｎａ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；１１２１．６４（Ｍ＋Ｎａ）＋
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｅ＞によって算出した。
＜分析条件Ｅ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
７０：４３０（０－２７分）、７０：３０－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
＜分析条件Ｅ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
７０：４３０（０－２７分）、７０：３０－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
参考合成例８：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００ ｇ、５．１６ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．６２７ ｇ、６．１９ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９ ｇ）及びアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．７７６ ｇ、５．６８ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｄ－フェニルグリシン（０．９３６ ｇ、 ６．１９ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３．２５５ ｇ、１２．４ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１１．５ ｍＬ、溶液２を毎分５．６ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．８ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（２ ｍＬ）を加えた容器に１０５秒間捕集した。得られた溶液にアセトニトリル（８０ ｇ）を混合し、析出した固体をろ過、乾燥し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－ＯＨ（１．５０ ｇ、収率６２％）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５２１．３（Ｍ＋Ｎａ）＋
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００ ｇ、５．１６ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．６２７ ｇ、６．１９ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９ ｇ）及びアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．７７６ ｇ、５．６８ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｄ－フェニルグリシン（０．９３６ ｇ、 ６．１９ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３．２５５ ｇ、１２．４ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１１．５ ｍＬ、溶液２を毎分５．６ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．８ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（２ ｍＬ）を加えた容器に１０５秒間捕集した。得られた溶液にアセトニトリル（８０ ｇ）を混合し、析出した固体をろ過、乾燥し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－ＯＨ（１．５０ ｇ、収率６２％）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５２１．３（Ｍ＋Ｎａ）＋
合成例９：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－ＯＨ（０．５０ ｇ、０．９６ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．１１７ ｇ、１．１５ ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８ ｇ）及びアセトニトリル（１．９７ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１４４ ｇ、１．０６ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．９７ ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１９ ｇ、 １．０６ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１．９７ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４６９ ｇ、２．３０ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１１．９ ｍＬ、溶液２を毎分５．８ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．２ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（１ ｍＬ）を加えた容器に２０秒間捕集した。得られた溶液を減圧濃縮し、アセトニトリル（２５ ｇ）を混合し、析出した固体をろ過、乾燥し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．４５ ｇ、収率９５％）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６６８．４（Ｍ＋Ｎａ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６６８．４（Ｍ＋Ｎａ）＋
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｃ＞によって算出した。
合成例１０：Ｃｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨの合成
Ｃｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００ ｇ、４．４８ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．５９１ ｇ、５．３８ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９ ｇ）及びアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．６４１ ｇ、４．９３ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。ロイシン（０．７０５ ｇ、 ５．３８ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（２．１８７ ｇ、１０．８ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２.０ ｍＬ、溶液２を毎分５．８ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７３ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め５質量％塩酸（５ ｇ）を加えた容器に１００秒間捕集した。得られた溶液を減圧濃縮して酢酸エチル（３０ ｇ）を加え分液し、１０質量％塩化ナトリウム水溶液（５ ｇ）で有機層を２回洗浄した。得られた有機層を濃縮し、ヘキサン（４０ ｇ）を加え撹拌して析出した固体をろ過、乾燥してＣｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（２．１７ ｇ、収率９６％、ジアステレオマー過剰率１００％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５６０．４（Ｍ＋Ｈ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５６０．４（Ｍ＋Ｈ）＋
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ａ＞によって算出した。
参考合成例９：Ｈ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨの合成
Ｃｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（１．５０ ｇ、２．６８ ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１０ ｇ）及びメタノール（１０ ｇ）に加えて溶解させ、１０質量％パラジウム炭素（０．１５ ｇ、ＮＥケムキャット製、ＰＥタイプ）を加え、２１℃にて水素置換して１時間撹拌した。得られた溶液をろ過し、ろ物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０ ｇ）を加えて撹拌後、ろ過してろ液１を得た。得られたろ物に再度Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０ ｇ）を加えて撹拌後、ろ過してろ液２を得た。ろ液１とろ液２を混合して減圧濃縮し、アセトニトリル（２０ ｇ）を加えて撹拌した後、ろ過を行い、得られた固体を乾燥して、Ｈ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（１．０３ ｇ、収率９０％）を灰色固体としてを得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；４２６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；４２６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
合成例１１：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ（０．５５ ｇ、０．５０ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．０６６ ｇ、０．６０ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２．４５ ｇ）及びアセトニトリル（２．１６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．０７５ ｇ、０．５５ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．１６ ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｈ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（０．２５５ ｇ、 ０．６０ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（２．１６ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．２４４ ｇ、１．２０ ｍｍоｌ）を加えた後、室温で撹拌し均一化させ溶液３とした。溶液１を毎分１２．３ ｍＬ、溶液２を毎分５．８ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分６．９ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（１ ｇ）を加えた容器に２０秒間捕集した。得られた溶液に水（４ ｇ）を混合して撹拌し、析出した固体をろ過、乾燥してＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（０．４３ ｇ、収率８４％、ジアステレオマー過剰率９９．４％ｄｅ）を白色固体としてを得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；１５０７（Ｍ＋Ｈ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；１５０７（Ｍ＋Ｈ）＋
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｆ＞によって算出した。
＜分析条件Ｆ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
８０：２０（０－２７分）、８０：２０－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
＜分析条件Ｆ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製 ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
８０：２０（０－２７分）、８０：２０－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９ ｍＬ／分
検出波長：２１０ ｎｍ
合成例１２：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＭｅＧｌｙ－ＯＨの合成
Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００ ｇ、３．７４ ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．４５４ ｇ、４．４９ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９ ｇ）及びアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．５６２ ｇ、４．１１ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３ ｇ）に溶解させ溶液２とした。サルコシン（０．６６７ ｇ、 ７．４８ ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６ ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３．０４ ｇ、１５．０ ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１１．７ ｍＬ、溶液２を毎分５．６ ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．７ ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１ ｍｍの長さ１．０ ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め５質量％塩酸（１０ ｇ）を加えた容器に１０７秒間捕集した。得られた溶液を減圧濃縮して酢酸エチル（３０ ｇ）を加え分液し、１０質量％塩化ナトリウム水溶液（１０ ｇ）で有機層を２回洗浄した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフにて精製してＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＭｅＧｌｙ－ＯＨ（２．０６ ｇ、収率９６％、ジアステレオマー過剰率９９．７％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６０６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６０６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ａ＞によって算出した。
本発明により、ペプチドの高効率な製造方法を提供することができる。
Claims (12)
- 下記工程（１）を含む、ペプチドの製造方法：
（１）
式（Ｉ）：
［式中、ＡＡ１は２～２０個のアミノ酸からなるペプチド由来の基を表し、ＰはＮ末端保護基を表す］で表されるＮ－保護ペプチドに、
式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内、１つ又は２つがメチル基であり、残りは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基のとき、残りの２つが一緒になってＣ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６－７員環を形成してもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミン及び酸ハロゲン化物をフローリアクター中で反応させて得られる、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、
式（ＩＩＩ）：
［式中、ＡＡ2はアミノ酸又は、２～２０残基からなるペプチド由来の基を表す］で表されるアミノ酸又はペプチドにシリル化剤を反応させて得られるシリル化されたアミノ酸又はペプチドを、フローリアクター中で反応させる工程。 - 式（ＩＩ）で表される３級アミンの使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して０．０５モル当量乃至１モル当量であり、さらに
式（ＩＶ）
［式中、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、それぞれ置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基（ただし、メチル基を除く）であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の内２つが、Ｃ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらと結合する窒素原子と一緒になって６－７員環を形成していてもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミンを使用する、請求項１に記載のペプチドの製造方法。 - 式（ＩＶ）で表される３級アミンと、式（ＩＩ）で表される３級アミンの合わせた使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して１．０乃至１０モル当量である、請求項２に記載のペプチドの製造方法。
- 酸ハロゲン化物が、クロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物、スルホン酸塩化物又はリン酸塩化物である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- 酸ハロゲン化物が、クロロギ酸Ｃ１－６アルキルである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- 酸ハロゲン化物が、クロロギ酸イソブチルである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- 式（ＩＩ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、Ｎ－メチルジエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン又はＮ－メチルモルホリンである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- 式（ＩＶ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン又はトリ－ｎ－プロピルアミンである、請求項２乃至７のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- アミノ酸又はペプチドがα－アミノ酸で構成される、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、カルバメート系保護基である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の製造方法。
- Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基又はｔ－ブトキシカルボニル基である、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の製造方法。
- シリル化剤が、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の製造方法。
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