WO2020155222A1 - 一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗及其应用 - Google Patents

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马磊磊
李文伟
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Definitions

  • Figure 2 is a schematic diagram of ELISA IgM antibody titer results of compounds 1, 2, 3, 4 of the present invention.
  • Step 3 Preparation of p-tolylthio 3,4,6-tris-oxy-acetyl-2-deoxy-2-phthalamido-1-thio- ⁇ -D-glucoside (compound 27)
  • Step 9 Azidoethyl 4-oxo-p-methoxybenzyl-6-oxo-propargyl-2-deoxy-2-phthalamido-3-oxo-tert-butyldimethyl Preparation of silyl- ⁇ -D-glucoside (compound 9)
  • step 18 in Example 1 the reaction of compound 22 (10.0 mg), palladium on carbon (45.0 mg) and hydrogen was completed to obtain compound 2 (8.2 mg, 95%) as a white solid.
  • Step 3 [3-R-(tetradecanoic acid ester) tetradecamido] ethyl 4-oxo-phosphoryl-6-oxo-6- ⁇ [(ethyl 2-deoxy-acetyl- ⁇ -D-Galactosyl)-1-hydro-1,2,3-triazolyl-4]methylene ⁇ -2-deoxy-2-[(R)-3-(tetradecanoic acid Preparation of ester group) tetradecamido]-3-oxo-[(R)-3-(tetradecanoic acid ester group) tetradecamido]- ⁇ -D-glucoside (compound 3)
  • step 18 in Example 1 the reaction of compound 23 (10.0 mg), palladium on carbon (45.0 mg) and hydrogen was completed to obtain compound 3 (8.5 mg, 93%) as a white solid.
  • Step 1 [3-R-(tetradecyloxy)tetradecamido]ethyl 4-oxo-(di-oxo-benzylphosphoryl)-6-oxo-propargyl-2-deoxy- 2-[(R)-3-(tetradecanoic acid ester) tetradecamido]-3-oxo-[(R)-3-(tetradecanoic acid ester) tetradecamido]- ⁇ - Preparation of D-glucoside (Compound 20)
  • Step 2 [3-R-(tetradecyloxy)tetradecamido]ethyl 4-oxo-(di-oxo-benzylphosphoryl)-6-oxo-6-[(ethyl 2-to Oxy-acetyl- ⁇ -D-galactosidyl)-1-hydro-1,2,3-triazolyl-4]methylene-2-deoxy-2-[(R)-3- (Tetradecanoic acid ester group) tetradecanoic acid amide group)-3-oxo-[(R)-3-(tetradecanoic acid ester group) tetradecanoic acid amide group]- ⁇ -D-glucoside (compound 24) preparation

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Abstract

本发明提供了一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗，其是通式为(I)的化合物：Y-L-X(I)。本发明是以第二代全新结构的TLR4配体式I的化合物来代替MPLA与具有临床开发潜力的式Ⅱ化合物(Tn)偶联获得具有结构明确、能产生更强抗肿瘤作用的两组分疫苗，具有较好的抗肿瘤应用前景。

Description

一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗及其应用 技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗及其应用。
背景技术
癌症防治已成为我国的重要公共卫生问题，随着我国环境污染的加剧和人们生活方式的改变，癌症的发病率和死亡率都迅速增加，严重地威胁我国人们的生命安全，同时也增加了社会及个人的经济负担。虽然近年来小分子靶向药物、单抗药物及抗体药物缀合物(ADCs)等靶向抗肿瘤药物，和针对程序性细胞死亡分子及其激动剂(PD-1，PD-L1)等肿瘤免疫治疗，都取得了较大的进展，但均有一定的局限性，目前仍不能克服肿瘤药物毒副作用大、易产生耐药性、复发风险高等缺点。
目前肿瘤疫苗主要有蛋白、核酸和糖疫苗等，其中糖蛋白疫苗已成为国内外研究的热点之一，其原因是这些与肿瘤相关糖抗原(Tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs)，通常在肿瘤细胞表面有异常过量的表达，在肿瘤细胞的转移及信号转导等方面起关键作用。因此，糖肿瘤疫苗具有特异性高、副作用小、有改善或者治愈肿瘤的潜力等优点，是治疗性抗肿瘤疫苗的理想靶点。
TACAs属于非T细胞依赖性抗原，免疫原差，不能诱导T细胞应答，只能活化B细胞，只能产生一种低亲和力IgM抗体，不能产生高亲和力的IgG抗体。为了解决这一难点，传统策略是将糖抗原与含有T细胞表位的载体蛋白共价连接制备成糖蛋白疫苗，当这种疫苗进入体内，抗原提呈细胞(APCs)对其进行吞噬和水解，并呈递给T细胞，使T细胞活化，诱导B细胞增殖并产生IgG抗体，同时产生具有免疫记忆的B细胞。
其中Tn抗原(α-D-GalNAc-Ser/Thr)是一种常见的癌症相关的糖类抗原，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等恶性细胞表面以簇状的形式过量表达。
作为乙酰氨基半乳糖衍生物，Tn抗原在正常细胞中能进一步延长糖链形成复合的低聚糖，所以对于正常细胞而言，它是隐性的；而在大多数癌细胞中，由于其糖链延伸受阻，Tn抗原就暴露在细胞表面。因此Tn抗原的过量表达对于某些癌细胞有高度的专一性，在癌症的早期诊断方面是重要的参考依据。在设计合成抗癌疫苗的研究中，Tn抗原也是免疫疗法中非常有吸引力的研究对象。含有Tn抗原作为单一肿瘤抗原或作为多价疫苗成分的肿瘤疫苗已进展到I期和II期临床试验。研究者在Tn相关肿瘤疫苗研究方面做了大量工作,下面就对有关研究进行简单的整理和概述。
Singhal,A.等人研究发现，去唾液酸羊颌下腺粘蛋白(A-OSM)与Tn抗原耦合的抗原疫苗能显著表达Tn抗原；蛋白质载体(KLH或者绵羊的血清蛋白)与二聚体Tn耦合的抗原疫苗也能有效地阻止TA3HA小鼠乳腺癌的转移，显示出TN抗原的强表达。而且合成了二聚体Tn抗原与三棕榈酰-s-甘油半胱氨酰丝氨酸(P3CS)偶联疫苗，是一种完全合成的、低分子量、无载体的免疫原，引发针对表达Tn的糖蛋白的免疫应答。这是第一个合成的小的碳水化合物抗原在不使用大分子载体或佐剂的情况下可以产生针对肿瘤相关糖抗原的免疫应答的先例。
综合上述分析，以TLR4(Toll样受体4)激动剂MPLA(Monophosphoryl lipid A)为载体，合成出许多结合肿瘤相关糖抗原(TACAs)的二组分肿瘤蛋白疫苗，具有一定的可行性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗，具有较好的抗肿瘤应用前景。
本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗，是通式为(I)的化合物：
Y-L-X (I)
或通式为(I)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
其中：
Y选自具有以下结构的基团：
Figure PCTCN2019075561-appb-000001
R 1选自-CH 2-CH(-OR 4)(CH 2) mCH 3，R 4是-C(O)-(CH 2) nCH 3，m、n是6-18的整数；
R 2选自-CH 2-CH(-OR 5)(CH 2) PCH 3，R 5是-C(O)-(CH 2) qCH 3，p、q是6-18的整数；
R 3选自-CH 2-CH(-OR 6)(CH 2) rCH 3，R 6是-(CH 2) sCH 3或-C(O)-(CH 2) tCH 3，r、s、t是6-18的整数；
L选自式-(CH 2) 2-NHC(O)-(CH 2) a-C(O)NH-(CH 2) b-或结构
Figure PCTCN2019075561-appb-000002
的连接臂；其中a、b、c是选自2-6的整数；
X选自具有以下结构的基团：
Figure PCTCN2019075561-appb-000003
优选地，所述Y选自具有以下结构的基团：
Figure PCTCN2019075561-appb-000004
R 1是-CH 2-CH(-OR 4)(CH 2) 10CH 3，R 4是-C(O)-(CH 2) 12CH 3；
R 2是-CH 2-CH(-OR 5)(CH 2) 10CH 3，R 5是-C(O)-(CH 2) 12CH 3；
R 3是-CH 2-CH(-OR 6)(CH 2) 10CH 3或-CH 2-CH(-OR 6)(CH 2) 12CH 3，R6是-(CH 2) 11CH 3、-C(O)-(CH 2) 10CH 3或-C(O)-(CH 2) 12CH 3。
优选地，所述L是结构为
Figure PCTCN2019075561-appb-000005
的连接臂。
优选地，所述通式(I)为：
Figure PCTCN2019075561-appb-000006
或通式(I)的化合物的可药用盐。
本发明还提供上述化合物在在制备治疗癌症的药物中的应用。
优选地，所述药物还包含医学上可用辅料。
优选地，所述癌症为乳腺癌、前列腺癌、肠癌、黑素瘤、肝癌、肺癌、肾细胞癌、子宫癌、卵巢癌、细胞性淋巴癌、脑癌、胃癌、胰腺癌、甲腺癌或白血病。
本发明是以第二代全新结构的TLR4激动剂式I的化合物来来作为疫苗载体，与具有临床开发潜力的式Ⅱ化合物(Tn)偶联获得具有结构明确、能产生抗肿瘤作用的两组分疫苗，具有较好的抗肿瘤应用前景。
附图说明
图1是本发明化合物1、2、3、4ELISA IgG抗体滴度结果示意图。
图2是本发明化合物1、2、3、4ELISA IgM抗体滴度结果示意图。
[根据细则91更正 29.05.2019]　
图3是本发明化合物1、2、3抗体介导的补体依赖细胞毒性试验细胞裂解率示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。
本发明的疫苗(式I的化合物)可以使用本领域现有已知的合成方法和如下所述的合成方法(合成路线1-3)进行制备：
合成路线1：化合物10的合成
Figure PCTCN2019075561-appb-000007
化合物10的合成如合成路线1所示：由市售的葡萄糖胺通过用邻苯二甲酰基保护二位氨基，乙酰化，一位接对甲苯硫基，去乙酰化，四、六位保护，得到单糖分子5。使用叔丁基二甲基氯硅烷，在咪唑的作用下，保护三位羟基。然后用硼烷四氢呋喃和三氟甲磺酸银选择性断开六位。接着，将六位羟基在氢化钠、四丁基溴化铵催化作用下与溴丙炔反应得到8。然后，使用N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)和三氟甲磺酸(TfOH)作为催化剂，与自制叠氮乙醇对接，得到化合物9。在回流甲醇中用乙二胺去除邻苯二甲酰基，得到化合物10。
合成路线2：化合物15的合成
Figure PCTCN2019075561-appb-000008
化合物15的合成如合成路线2所示：使用三乙胺三氢氟酸盐脱去三位叔丁基二甲基硅烷基。在4-二甲氨基吡啶，1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘盐存在的条件下，用一锅法用脂肪酸12酰化游离的氨基和羟基。接着用5％三氟乙酸脱去四位对甲氧基苄基。使用四氮唑、二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺和过氧叔丁醇以二步-一锅法方式，将14磷酸化，得到合成化合物15。
合成路线3：本发明目标产物化合物1、2、3、4的合成
Figure PCTCN2019075561-appb-000009
Lipid A:
Figure PCTCN2019075561-appb-000010
化合物1、2、3、4的合成如合成路线3所示：在酸性条件下，用Zn还原15的叠氮基。在N,N-二异丙基乙胺的存在下，分别与四种脂肪酸(Lipid A-1、2、3、4)缩合。然后，在N,N-二异丙基乙胺和催化量的碘化亚铜的作用下与抗原Tn通过共价键三氮唑相连。最后，用氢气和钯碳脱去苄基，得到化合物1、2、3、4。
下面通过具体实施例实现化合物1、2、3、4的合成：
实施例1：化合物1的制备
[3-R-(十二羧酸酯基)十二酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物1)的合成
步骤1：2-去氧-2-(2-羧基苯甲酰基)-D-葡萄糖(化合物25)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000011
将D-葡萄糖胺盐酸盐(80.00g,0.37mol)加入到水(350.0mL)和甲醇(150.0mL)的混合溶液中，混合液降至0℃，搅拌条件下加入氢氧化钠(15.60g，0.39mol)，冰浴搅拌1小时后，再加入邻苯二甲酸酐(63.20g，0.43mol)，混合液缓慢恢复室温，继续搅拌过夜,反应液逐渐有白色固体析出，用硅胶薄层色谱(TLC)检测反应过程，检测原料完全消失后，停止搅拌并在冰浴下冷却1小时，混合液分层，减压抽滤得到微黄色固体，用少量水冲洗3次，真空干燥得到化合物25(67.35g,55％)。
步骤2：1,3,4,6-四-氧-乙酰基-2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-β-D-葡萄糖(化合物26)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000012
取化合物25(20.00g,0.06mol)和无水乙酸钠(13.50g,2.69mol)加入到270.0mL乙酸酐中，在198℃的条件下搅拌回流，反应10个小时后，薄层色谱检测反应(乙酸乙酯：石油醚＝1：4)，检测原料反应完全，停止加热，反应液恢复至室温，减压蒸馏除去部分乙酸酐后，加入100.0mL冰水，搅拌30分钟，用200.0mL二氯甲烷萃取3次，收集有机层，用饱和碳酸氢钠溶液反复冲洗至液体基本无气泡产生，收集有机相，用无水硫酸钠干燥除水后，减压蒸馏除去二氯甲烷，得粗品黑色粘稠物质，粗品快速柱色谱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1:2)，除去大部分杂质，得到不纯物，再用乙酸乙酯和正己烷(1:3)重结晶，得到黄色固体化合物26(14.83g,52％)。
步骤3：对甲苯硫基3,4,6-三-氧-乙酰基-2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(化合物27)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000013
将化合物26(13.35g,0.03mol)和对甲基苯硫酚(4.50g,0.04mol)溶于干燥无水的二氯甲烷(45.0mL)中，将混合液降温至0℃后，在氮气的保护下，缓慢逐滴滴加催化剂三氟化硼乙醚复合物(5.30mL，0.04mol)，混合液缓慢升至室温，反应液颜色由黄色逐渐变为黑色，持续反应48小时，薄层色谱(TLC)监测反应(乙酸乙酯:甲苯＝1:3)，检测原料完全消失后，在冰浴条件下，用二氯甲烷稀释反应液，再用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反复冲洗3次至无气泡产生，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品为黄色固体，经柱色谱(乙酸乙酯:石油醚＝1：5，1：4，1：3，1:2)分离纯化后得到淡黄色固体化合物27(12.87g，85％)。
步骤4：对甲苯硫基2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(化合物28)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000014
用无水二氯甲烷溶解化合物27(226.00g，0.42mol)，然后制备甲醇钠/甲醇溶液(0.4M)，称取1.47g金属钠，分批加入到160.0mL甲醇溶液中，冷却至室温后，在冰浴的条件下加入到含有27的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下，搅拌90分钟，反应液慢慢有固体析出，变为黄色混悬液，TLC监测反应过程(甲醇:二氯甲烷＝1:9)，检测原料完全消失后，将反应瓶放入冰浴中两个小时，使产物尽量析出，减压过滤得到白色固体，收集过滤液用冰乙酸中和后，除去有机溶剂，得粗品，粗品用甲醇和二氯甲烷重结晶后，减压抽滤，得白色固体化合物28(130.00g，74％)。
步骤5：对甲苯硫基4，6-氧-对甲氧基亚苄基-2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(化合物5)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000015
将化合物28(1.00g，2.40mmol)和对甲苯磺酸一水合物(0.02g，0.12mmol)溶于4.6mL的无水N，N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下，滴加对甲氧基苯甲醛二甲缩醛(0.7mL，3.60mmol)搅拌反应，偶尔抽真空，除去产生的甲醇，使反应向正方向进行，反应3小时后，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)，检测原料完全消失后，用乙酸乙酯30.0mL稀释反应液，再用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，用水冲洗2次(30.0mL×2)，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去全部溶剂，得到白色固体粗品，粗品经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)分离纯化后得到白色固体化合物5(1.00g，80％)。
步骤6：对甲苯硫基4，6-氧-对甲氧基亚苄基-2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-3-氧-叔丁基二甲基硅基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(化合物6)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000016
将化合物5(1.00g，1.87mmol)，咪唑(0.77g，11.25mmol)溶解在无水的N，N-二甲基甲酰胺中，将混合液降温至0℃，再加入叔丁基二甲基氯硅烷(0.56g，3.75mmol)，在氮气保护下，反应搅拌过夜，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1：4)，检测原料完全消失后(反应液为白色混悬体系)，用130.0mL乙酸乙酯稀释溶解，再加100.0mL饱和碳酸氢钠溶液冲洗2次，最后用100.0mL饱和食盐水冲洗1次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去有机溶剂，得粗品。粗品经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1：20，1:15，1:10)分离纯化后，得到白色固体化合物6(0.80g，66％)。 1HNMR(400MHz，CDCl 3)，δ(ppm)：7.87(dd，J＝21.1，5.6Hz，2H，Ar-H)，7.80–7.67(m，2H，Ar-H)，7.39(d，J＝8.7Hz，2H，Ar-H)，7.26(d，J＝8.0Hz，2H，Ar-H)，7.05(d，J＝8.0Hz，2H，Ar-H)，6.89(d，J＝8.9Hz，2H，Ar-H)，5.58(d，J＝10.7Hz，1H，H-1)，5.48(s，1H，CH)，4.62(t，J＝9.2Hz，1H)，4.33(m，2H)，3.80(s，3H，Ac-CH 3)，3.79(t，J＝10.03，1H)，3.67(td，J＝9.6，4.8Hz，1H)，3.54(t，J＝9.0Hz，1H)，2.30(s，3H，Ar-CH 3)，0.57(s，9H，Si-(CH3)3-0.14(s， 3H，Si-CH 3)，-0.31(s，3H，Si-CH 3)。 13CNMR(100MHz，CDCl 3)，δ(ppm)：168.39，167.44，160.06，138.25，134.29，134.21，133.04，131.73，129.70，129.63，128.22，127.68，123.67，123.25，113.50，101.90，84.63，82.43，70.70，70.59，68.66，56.77，55.27，25.54，25.41，21.18，17.74，-4.10，-5.34。ESI-TOFHRMSm/z:calcdforC 35H 41NO 7SSiNa[M+Na] +670.2265，found 670.2257。
步骤7：对甲苯硫基4-氧-对甲氧基苄基-2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-3-氧-叔丁基二甲基硅基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(化合物7)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000017
将化合物6(1.00g，1.54mmol)，硼烷四氢呋喃复合物(7.70mL，7.70mmol)加入到无水级别的二氯甲烷(30.0mL)中，密闭搅拌15分钟，然后将催化剂三氟甲磺酸银(0.06g，0.23mmol)加入到反应溶液中，搅拌反应30分钟左右，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1：4)，检测原料完全消失后，在冰浴的条件下，加入三乙胺和甲醇混合液(1：10)2.2mL，淬灭反应，然后过滤除去灰色不溶物，减压蒸馏除去有机溶剂，得灰色固体粗品，经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1：21，1：14，1：7)分离纯化后，得到白色固体化合物7(0.92g，92％)。 1H NMR(400MHz，CDCl 3)，δ(ppm)：7.96–7.63(m，4H，Ar-H)，7.30–7.15(m，4H，Ar-H)，7.05(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H)，6.88(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H)，5.57(d，J＝10.6Hz，1H，H-1)，4.77(d，J＝11.1Hz，1H，CH 2-H)，4.58(d，J＝11.2Hz，1H，CH 2-H)，4.49(t，J＝8.9Hz，1H，H-3)，4.23(t，J＝10.2Hz，1H，H-2)，3.88(d，J＝11.9Hz，1H，H-6)，3.80(s，3H，-O-CH 3)，3.68(dd，J＝12.0，4.0Hz，1H，H-6)，3.62–3.43(m，2H，H-4，H-5)，2.30(s，3H，Ar-CH 3)，0.74(s，9H，Si-(CH3)3)，-0.00(s，3H，Si-CH 3)，-0.41(s，3H，Si-CH 3)。 13CNMR(100MHz，CDCl 3)，δ(ppm)：168.67，167.44，159.15，138.23，134.28，133.00，132.02，131.74，130.14，129.73，128.97，128.24，123.63，123.25，113.80，83.64，79.59，79.41，74.53，73.36，62.08，56.90，55.27，25.70，21.16，17.66，-4.05，-4.60。ESI-TOF HRMS m/z:calcd for C 35H 43NO 7SSiNa[M+Na] +672.2422，found 672.2424。
步骤8：对甲苯硫基4-氧-对甲氧基苄基-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-3-氧-叔丁基二甲基硅基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(化合物8)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000018
将真空干燥后的化合物7(1.00g，1.16mmol)和真空高温干燥过的分子筛加入到16.0mL的无水N，N-二甲基甲酰胺中，在氮气的保护下，搅拌2个小时后，将混合物温度降至0℃，快速加入氢化钠(0.23g，5.78mmol)，继续在0℃条件下搅拌15分钟，然后再缓慢加入溴丙炔(1.0mL，11.56mmol)和催化剂量的四丁基溴化铵到反应液中，混合液缓慢升至室温，继续搅拌反应3个小时，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1：4)，检测原料完全消失后，在冰浴条件下，加入2.0mL的异丙醇淬灭反应并搅拌30分钟，再用30.0mL二氯甲烷稀释反应液，再加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应，有机相用水冲洗3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得粗品(黑色油状物)，粗品经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:30，1:20，1:10，1:6)分离纯化后得到黄色固体化合物8(0.79g，75％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.82(t，J＝21.9Hz，2H，Ar-H)，7.77–7.61(m，2H，Ar-H)，7.26(t，J＝8.7Hz，4H，Ar-H)，7.03(d，J＝8.0Hz，2H，Ar-H)，6.86(d，J＝8.6Hz，2H，Ar-H)，5.50(d，J＝10.5Hz，1H，H-1)，4.74(d，J＝11.1Hz，1H，-CH2-H)，4.65(d，J＝11.1Hz，1H，-CH2-)，4.46(dd，J＝9.6，8.5Hz，1H，H-3)，4.33–4.04(m，3H，H-2，-O-CH2-)，3.86–3.70(m，5H，-O-CH3，H-6)，3.70–3.58(m，1H，H-4)，3.58–3.45(m，1H，H-5)，2.39–2.31(m，1H，CH)，2.28(s，3H，Ar-CH3)，0.73(s，9H，Si-(CH3)3)，-0.04(s，3H，Si-CH3)，-0.44(s，3H，Si-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：168.69，167.40，159.00，138.02，134.22，133.17，132.08，131.77，130.46，129.59，128.78，128.47，123.59，123.20，113.67，83.77，79.76，79.37，79.27，74.77，74.28，73.51，68.38，58.75，56.83，55.26，25.72，21.18，17.66，-4.06，-4.59。ESI-TOFHRMSm/z:calcd for C 38H 46NO 7SSi[M+H] +407.1925，found 670.1915。
步骤9：叠氮乙基4-氧-对甲氧基苄基-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-邻苯二甲酰胺基-3-氧-叔丁基二甲基硅基 --β-D-葡萄糖苷(化合物9)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000019
将真空干燥过的化合物8(0.20g，0.29mmol)，叠氮乙醇(0.05g，0.58mmol)和高温干燥后的分子筛(0.65g)加入到5.0mL无水级别的二氯甲烷中，在氮气的保护下密封搅拌4个小时。将混合液从室温降至-30℃后，快速加入N-碘代丁二酰亚胺(0.19g，0.87mmol)，并在-30℃搅拌反应1小时后，再将反应液降温至-40℃，快速加入三氟甲磺酸(6.4uL，0.87mmol)并搅拌反应15分钟，反应液颜色变为酒红色，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1：3)，检测原料完全消失后，反应液用二氯甲烷稀释，再加入饱和碳酸氢钠溶液中和，再加入硫代硫酸钠至反应液红色褪去。取有机层，用水冲洗2次，饱和食盐水冲洗1次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去有机溶液，得粗品，经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:18，1：12，1:6)分离纯化后得到无色粘稠物质化合物9(0.16g，85％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.82(dd，J＝18.8，15.9Hz，2H，Ar-H)，7.78-7.64(m，2H，Ar-H)，7.27(d，J＝6.9Hz，2H，Ar-H)，6.87(d，J＝8.5Hz，2H，Ar-H)，5.25(d，J＝8.5Hz，1H，H-1)，4.75(t，J＝11.8Hz，1H-CH2-)，4.66(d，J＝11.1Hz，1H，-CH2-)，4.43(dd，J＝10.1，8.3Hz，1H，H-3)，4.34–4.08(m，3H，H-2，-O-CH2-)，4.02–3.89(m，1H，-CH2-)，3.88–3.70(m，5H，Ar-CH3，H-6)，3.68–3.48(m，3H，H-4，H-5，-CH2-)，3.34(ddd，J＝12.1，8.2，3.5Hz，1H，-CH2-)，3.15(dt，J＝13.2，4.1Hz，1H，-CH2-)2.33(dd，J＝14.7，12.7Hz，1H，≡CH)，0.74(s，9HSi-(CH3)3)，-0.02(d，J＝9.0Hz，4H，Si-CH3)，-0.42(s，3H，Si-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：159.08，134.06，132.05，130.46，128.82，123.45，113.67，98.14，79.56，74.33，72.34，68.25，68.16，58.70，57.36，55.26，50.49，25.69，17.64，-4.11，-4.60。
步骤10：叠氮乙基4-氧-对甲氧基苄基-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-氨基-3-氧-叔丁基二甲基硅基-β-D-葡萄糖苷(化合物10)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000020
将化合物9(0.50g，0.76mmol)，乙二胺(5.0mL)加入到30.0mL甲醇中，搅拌至完全溶解，然后再将反应液加热到80℃，回流过夜，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1：2)，检测原料完全消失后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去大部分溶剂后，再加入甲苯(4.0mL)，减压蒸馏3次除去多余的乙二胺，得到粗品(黄色油状液体)，粗品经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1：12，1：8，1：4)分离纯化得到白色固体化合物10(0.28g，70％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.33–7.12(m，2H，Ar-H)，6.78(d，J＝8.6Hz，2H，Ar-H)，4.65(d，J＝11.1Hz，1H，Ar-H)，4.51(d，J＝11.1Hz，1HAr-H)，4.20–4.06(m，3H，-O-CH2-，H-1)，4.03–3.94(m，1H，-CH2-)，3.71(s，3H，-O-CH3，)，3.66–3.56(m，3H，H-6，-CH2-)，3.51–3.40(m，2H，-CH2-，H-3)，3.40–3.32(m，2H，H-4，H-5)，3.21(ddd，J＝13.2，4.8，3.5Hz，1H，-CH2-)，2.72(dd，J＝9.0，8.1Hz，1H，H-2)，2.25(t，J＝2.3Hz，1H，≡CH)，0.86(s，9H，Si-(CH3)3)，0.07(s，3H，Si-CH3)，-0.01(d，J＝5.8Hz，3H，Si-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：159.04，130.43，128.97，113.67，103.71，79.56，78.17，77.50，75.03，74.88，74.26，68.70，68.48，58.64，58.14，55.26，50.80，29.71，26.04，18.17，-3.74，-3.91.ESI-TOF，HRMS m/z:calcd for C 25H 41N 4O 6Si[M+H] +521.2793，found 521.2790。
步骤11：叠氮乙基4-氧-对甲氧基苄基-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-氨基-β-D-葡萄糖苷(化合物11)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000021
取化合物10(0.20g，0.38mmol)，溶解于1.5mL四氢呋喃溶液中，再滴加三乙胺三氢氟酸盐(1.50mL，9.20mmol)室温搅拌反应40个小时，TLC监测反应过程(乙酸乙酯100％)，检测原料完全消失后，用二氯甲烷稀释反应液，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应至无气泡产生为止，再用乙酸乙酯萃取3次每次30.0mL，收集有机层，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去有机溶剂得粗品，经柱色谱(甲醇：二氯甲烷＝1:100， 1：50，1：33)分离纯化后得白色固体化合物11(0.10g，60％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.31–7.13(m，2H，Ar-H)，6.81(d，J＝8.5Hz，2H，Ar-H)，4.71–4.55(m，2H，Ar-CH2-)，4.28–4.07(m，3H，-CH2-，H-1)，4.00(dt，J＝10.4，4.2Hz，1H，-CH2-)，3.82–3.65(m，4H，-O-CH3，H-6)，3.60(tt，J＝15.4，7.7Hz，1H，-CH2-)，3.45(ddd，J＝14.5，9.0，5.0Hz，1H，-CH2-)，3.41–3.31(m，3H，H-3，H-4，H-5)，3.27–3.17(m，1H，-CH2-)，2.63(t，J＝8.7Hz，1H，H-2)，2.36(t，J＝2.3Hz，1H，≡CH)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：159.45，130.42，129.76，113.99，104.13，79.58，77.53，74.90，74.84，74.29，68.65，68.46，58.69，57.30，55.29，50.77。
步骤12：叠氮乙基4-氧-对甲氧基苄基-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物13)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000022
将化合物11(0.20g，0.49mmol)，化合物12(0.62g，1.37mmol)和4-二甲氨基吡啶(1.8mg，0.014mmol)全部溶于无水处理的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下搅拌反应，然后把反应液降温至0℃，加入催化剂1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘盐(0.73g，2.46mmol)，在搅拌反应30分钟后，将反应液缓慢升温至10℃，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1:2.5)，检测原料完全消失后，用20.0mL二氯甲烷稀释反应液，再用30.0mL饱和食盐水冲洗3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏除去有机溶液，得到粗品，经过柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:12，1:8，1：4)分离纯化得到白色固体化合物13(0.41g，65％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.20(d，J＝8.3Hz，2H，Ar-2H)，6.85(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-2H)，6.05(d，J＝8.7Hz，1H，-NH-)，5.24–5.02(m，3H，H-3，-OCOCH-，-OCOCH-)，4.63(t，J＝10.6Hz，1H，H-1)，4.56(s，2H，PMPCH2-)，4.35–4.09(m，2H，-OCH2C-)，4.03–3.91(m，1H，-OCH2CH2-)，3.87–3.60(m，8H，-OCH3，H-2，H-6，H-4，-OCH2CH2-)，3.59–3.38(m，2H，H-5，-OCH2CH2-)，3.29(dt，J＝13.2，4.2Hz，1H，-CH2N3)，2.53–2.26(m，7H，-COCH2-6H，≡CH)，2.21(t，J＝7.5Hz，2H，-NHCOCH2-)，1.58(d，J＝17.9Hz，8H)，1.25(s，76H，-CH2-)，，0.95–0.75(m，12H，-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：73.83，173.26，170.31，169.92，159.38，129.94，129.58，113.84，100.75，79.49，75.09，74.92，74.81，74.06，70.86，69.83，68.02，67.64，58.73，55.23，54.38，50.64，41.84，39.09，34.53，34.42，34.20，31.95，29.73，29.71，29.69，29.64，29.58，29.47，29.39，29.25，29.20，25.27，25.15，25.02，22.71，14.13。ESI-TOFLRMSm/z:calcd for C 75H 131N 4O 12[M+H] +1278.9，found 1279.9。
步骤13：叠氮乙基6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物14)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000023
取0.3mL的三氟乙酸，用2.5mL的无水二氯甲烷稀释后，然后滴加几滴1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯搅拌反应30分钟。然后将化合物13(0.20g，0.16mmol)溶于2.6mL无水级别的二氯甲烷中，降温至0℃，把稀释后的三氟乙酸溶液缓慢滴加到反应液中，缓慢升至室温，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1:2.5)，检测原料完全消失后，用20.0mL二氯甲烷稀释反应液，用30.0mL饱和碳酸氢钠溶液冲洗3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏除去有机溶液得到粗品，再经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:18，1:12，1:6)分离纯化得到白色固体化合物14(0.09g，50％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：6.04(d，J＝8.5Hz，1H-NH-)5.20–5.00(m，3H，H-3，-OCOCH-)，4.67(d，J＝8.3Hz，1H，H-1)，4.22(s，2H，-OCH2CCH)，4.06–3.93(m，1H，-OCH2CH2-)，3.92–3.73(m，3H，H-2，H-6)，3.75–3.51(m，3H，H-4，H-5，-OCH2CH2-)，3.52–3.38(m，1H，-CH2N3)，3.28(d，J＝13.2Hz，1H，-CH2N3)，2.62–2.20(m，9H，≡CH，-COCH2-)，1.58(s，8H，-CH2-)，1.25(s，76H，-CH2-)，0.87(t，J＝6.6Hz，12H，-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：174.48，173.69，171.56，169.98，100.71，79.43，76.06，74.87，74.80，71.13，70.99，69.50，69.04，67.74，58.87，53.91，50.64，41.83，40.27，34.81，34.52，34.50，34.26，31.94，29.73，29.70，29.68，29.63，29.60，29.56，29.48，29.38，29.35，29.32，29.24，29.18，25.30，25.17，25.02，24.96， 22.70，14.13。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 67H 123N 4O 11[M+H] +1158.9，found 1160.1。
步骤14：叠氮乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物15)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000024
将化合物14(0.20g，0.17mmol)溶于重蒸的无水二氯甲烷中，加入二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(0.2mL，0.52mmol)和三氮唑(0.45M，1.9mL，0.86mmol)，在氮气的保护下搅拌反应3个小时，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1:2.5)，检测到原料完全消失并且在原料点上方有一个新点生成后，将反应液降温至0℃，缓慢滴加过氧化叔丁醇(5.5M，0.1mL，0.69mmol)，反应缓慢升至室温，1小时后TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1:2.5)，检测原料完全消失后，减压蒸馏除去溶剂，得到粗品，经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:12，1:8，1:4)分离纯化后得到白色固体化合物15(0.12g，50％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.30(dd，J＝19.4，8.8Hz，10H，Ar-H)，6.22(d，J＝7.6Hz，1H，-NH-)，5.55–5.42(m，1H，H-3)，5.16(d，J＝5.2Hz，2H，-OCOCH-)，5.07(d，J＝8.2Hz，1H，H-1)，5.04–4.85(m，4H，ArCH2-)，4.46–4.32(m，1H，H-4)，4.10(q，J＝15.8Hz，2H，-OCH2CCH)，3.98(dd，J＝18.2，13.0Hz，1H，-OCH2CH2-)，3.89(t，J＝13.0Hz，1H，H-6)，3.65(ddd，J＝15.8，14.5，6.3Hz，3H，H-6，H-5，-OCH2CH2-)，3.56–3.39(m，2H，H-2，-OCH2CH2-)，3.29(d，J＝13.3Hz，1H，-CH2N3)，2.57–2.16(m，9H，≡CH，-CH2-)，1.71–1.39(m，8H)，1.25(s，76H，-CH2-)，0.88(t，J＝6.3Hz，12H，-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：173.63，173.56，170.42，170.05，135.60，135.54，135.47，128.63，128.59，128.11，128.03，99.77，79.43，74.76，74.12，74.06，73.80，73.74，72.43，70.64，70.29，69.74，69.68，69.62，68.24，68.08，58.72，55.88，50.60，41.45，39.79，34.59，34.50，34.33，31.94，29.69，29.63，29.59，29.50，29.39，29.28，29.22，25.26，25.15，25.05，25.01，22.7114.13。31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-2.28。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 81H 137N 4O 14P[M+H] +1419.9，found 1420.3。
步骤15、氨基乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物16)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000025
将化合物15(0.10g，0.07mmol)溶解于6.0mL二氯甲烷中，加入用盐酸活化的锌粉(0.23g，3.50mmol)，再加入冰乙酸50uL，常温搅拌反应1个小时，TLC监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1:2)，检测原料完全消失，用二氯甲烷稀释反应液，用饱和碳酸氢钠溶液中和反应液，再用水和饱和食盐水各洗一次，收集有机层，无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物16，不经过柱色谱分离纯化，直接进行下一步。
步骤16：[3-R-(十二羧酸酯基)十二酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物17)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000026
取化合物16(0.10g，0.07mmol)，与Lipid A-3(0.05g，0.10mmol)加入到10.0mL无水处理的二氯甲烷中，再滴加N，N-二异丙基乙胺(15.3uL，0.09mmol)，调整PH值在8左右，在氮气的保护下搅拌反应3小时。用薄层硅胶板监测反应过程(甲醇:二氯甲烷＝1：10，乙酸乙酯：石油醚＝1:1)，检测原料完全消失，常温减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱分离纯化后得到化合物17(乙酸乙酯：石油醚＝1:12，1:8，1:4，1:3， 1:2，0.06g，47％)： 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.44–7.21(m，10H，Ar-H)，6.63(d，J＝30.1Hz，1H，-NH-)，6.34(s，1H，-NH-)，5.40–5.27(m，1H，H-3)，5.27–5.05(m，3H-OCOCH-)，5.04–4.89(m，4H，Ar-CH2-)，4.83(s，1H，H-1)，4.44–4.30(m，1H，H-4)，4.10(q，J＝15.5Hz，2H，-OCH2CCH)，3.72(ddd，J＝30.8，24.7，9.0Hz 6H，H-6-AH-6-B，H-2，H-5，-OCH2CH2-)，3.39(d，J＝27.9Hz，2H-CH2N3)，2.56–2.14(m，13H，≡CH，-OCH2，-COCH2-)，1.52(d，J＝60.7Hz，12H)，1.25(s，102H)，0.87(d，J＝6.6Hz，18H，-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：173.58，170.53，170.12，169.95，135.48，128.71，128.65，128.62，128.15，128.04，100.57，79.19，75.15，75.07，74.99，74.38，74.01，71.94，71.36，71.23，70.25，69.75，69.43，68.36，58.68，55.34，52.82，41.40，39.66，34.62，34.49，34.43，31.94，29.69，29.60，29.39，29.34，29.28，29.22，25.33，25.15，25.10，25.05，22.70，14.13。 31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-1.91。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 105H 182N 2O 17P[M+H] +1774.3，found 1774.7。
步骤17：[3-R-(十二羧酸酯基)十二酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-6-[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1，2，3-三氮唑基-4]亚甲基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物21)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000027
取化合物17(0.06g，0.03mmol)，Tn(11.7mg，0.04mmol)，碘化亚铜(0.06g，0.44mmol)加入到四氢呋喃(1.2mL)和甲醇(2.4mL)混合溶液中溶解，混合液再加入N，N-二异丙基乙胺(56.0uL，0.44mmol)室温搅拌反应过夜。用薄层硅胶板监测反应过程(乙酸乙酯：石油醚＝1:2，甲醇:二氯甲烷＝1:10)，检测原料完全消失，反应混合物经过硅藻土过滤掉不溶物后，常温减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱分离纯化得到化合物21(甲醇:二氯甲烷＝1:60，1:40，1:25，1:20，30mg，43％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.52–7.10(m，11H，Ar-H，＝CH)，5.40–5.24(m，1H)，5.10(m，3H，-OCOCH-)，5.06–3.12(m，H’s of sugar and linker)，2.57–1.94(m，12H of lipid，3H of-NHAc)，1.70-1.07(m，-CH2-of lipid)，0.89(dt，J＝18.2，10.3Hz，18H，-CH3 of lipid)。 31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-2.02。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 115H 199N 6O 22PNa[M+Na] +2086.4，found 2086.8。
步骤18：[3-R-(十二羧酸酯基)十二酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1，2，3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物1)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000028
将化合物21(9.0mg)加入到20mL二氯甲烷/甲醇/水(6:3:1)，加入钯碳(45.0mg)并通入氢气，密封搅拌40小时，用硅藻土滤过不溶物，用30mL二氯甲烷/甲醇(1:1)冲洗，减压蒸馏除去溶剂，得到白色固体化合物1(7.4mg，95％)。1H NMR(400MHz，CDCl3/MeOD＝1：1)。 31P NMR(162MHz，CDCl3/MeOD＝1:1)，δ(ppm)：-1.15。ESI-TOF HRMS m/z:calcd for C 100H 186N 6O 24P[M-H]-1882.3312，found 1882.3235。
实施例2：化合物2的制备
[3-R-(十二羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物2)的合成
步骤1：[3-R-(十二羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物18)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000029
按实施例1中步骤16的合成方法，将化合物16(0.10g，0.07mmol)与Lipid A-2(0.05g，0.10mmol)，N,N-二异丙基乙胺(15.3uL，0.09mmol)反应完毕，得粗品，经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:12，1:8，1:4，1:3，1:2)分离纯化后得到化合物18(0.07g，50％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.42–7.27(m，10H，Ar-H)，6.67(s，1H，-NH-)，6.35(d，J＝7.8Hz，1H，-NH-)，5.34(t，J＝9.4Hz，1H，H-3)，5.14(dt，J＝55.0，17.5Hz，3H，-OCOCH-)，5.06–4.87(m，4H，Ar-CH2-)，4.83(d，J＝8.1Hz，1H，H-1)，4.35(dd，J＝17.9，8.6Hz，1H，H-4)，4.10(q，J＝15.8Hz，2H，-OCH2CCH)，3.88(d，J＝10.6Hz，1H，H-6-A)，3.83–3.53(m，5H，H-6-B，H-2，H-5，-OCH2CH2-)，3.39(d，J＝26.8Hz，2H，-CH2N3)，2.53–2.14(m，13H，≡CH，-OCH2，-COCH2-)，1.73–1.38(m，12H)，1.25(s，102H)，0.88(t，J＝6.3Hz，18H，-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：172.57，172.57，172.41，169.51，169.32，168.93，134.46，134.39，127.69，127.63，127.60，127.13，127.02，99.68，78.17，74.04，72.99，72.63，71.55，70.33，69.94，69.22，68.78，68.73，68.67，68.28，67.32，57.63，54.32，52.40，40.66，40.36，38.69，33.59，33.48，33.41，30.92，28.69，28.67，28.65，28.58，28.51，28.48，28.36，28.26，28.20，24.32，24.13，24.07，24.02，21.68，21.60，13.10。 31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-2.00。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 107H 187N 2O 17P[M+H] +1802.3,found 1802.7。
步骤2：[3-R-(十二羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-6-[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物22)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000030
按实施例1中步骤17的合成方法，将化合物18(0.07g，0.04mmol)，Tn(0.01g，0.05mmol)，碘化亚铜(0.07g，0.37mmol)和N,N-二异丙基乙胺(60.0uL，0.37mmol)反应完毕，得粗品，经柱色谱(甲醇:二氯甲烷＝1:60，1:40，1:25，1:20)分离纯化得到化合物22(0.04g，52％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.31(m，11H，Ar-H，＝CH)，5.31(m，1H)，5.12(m，3H，-OCOCH-)，5.03–3.12(m，H’s of sugar and linker)，2.66–1.91(m，15H，12H of lipid，3H of-NHAc)，1.83-1.04(m，-CH2-of lipid)，0.88(m，18H，-CH3 of lipid)。 31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-2.02。ESI-TOF LRMS m/z:calcd forC 117H 205N 6O 22P[M+2H]2 +1046.8，found 1047.2。
步骤3：[3-R-(十二羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物2)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000031
按实施例1中步骤18的合成方法，将化合物22(10.0mg)，钯碳(45.0mg)和氢气反应完毕，得到白色固体化合物2(8.2mg，95％)。 1H NMR(400MHz,CDCl3/MeOD＝1：1)，31P NMR(162MHz,CDCl3/MeOD＝1:1),δ(ppm)：-1.13。MALDI-TOF MS m/z:calcd for C 103H 190N 6O 23P[M-H]-1910.369,found 1910.307。
实施例3：化合物3的制备
[3-R-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物3)的合成
步骤1：[3-R-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物19)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000032
按实施例1中步骤16的合成方法，将化合物16(0.10mg，0.07mmol)、Lipid A-1(0.05mg，0.09mmol)和滴加N,N-二异丙基乙胺(15.0uL，0.09mmol)反应完毕，得粗品，经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:12，1:8，1:4，1:3，1:2)分离纯化得到化合物19(0.07mg，50％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.42–7.25(m,10H,Ar-H),6.63(s,1H,-NH-),,6.31(d,J＝7.3Hz,1H,-NH-),5.34(t,J＝9.4Hz,1H,H-3),5.26–5.05(m,3H,-OCOCH-),5.07–4.88(m,4H,Bn-),4.84(d,J＝7.9Hz,1H,H-1),4.35(q,J＝9.1Hz,1H,H-4),4.10(q,J＝15.9Hz,2H,-OCH2C CH),3.88(d,J＝10.4Hz,1H,H-6),3.83–3.54(m,5H,H-6,H-2,H-5,-OCH2CH2-),3.39(d,J＝21.2Hz,2H,-CH2N3),2.54–2.15(m，13H，≡CH)，1.74–1.37(m，12H)，1.25(s，106H)，0.88(t，J＝6.1Hz，18H，-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：172.57，172.43，169.51，169.33，168.94，134.50，134.45，134.38，129.89，127.82，127.69，127.63，127.60，127.13，127.03，99.69，78.16，74.05，73.04，72.62，71.55，70.33，69.94，69.21，68.79，68.73，68.67，68.31，67.3，64.55，57.63，54.29，40.67，40.38，38.71，38.62，33.59，33.48，33.46，33.41，30.92，29.55，28.70，28.67，28.57，28.51，28.48，28.37，28.26，28.21，24.32，24.12，24.07，24.02，21.68，18.17，13.11，12.72。31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-1.90。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 109H 191N 2O 17P[M+H] +1830.3，found 1830.7。
步骤2：[3-R-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-6-[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物23)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000033
按实施例1中步骤17的合成方法，将化合物19(0.09mg，0.0499mmol)、Tn(0.02g，0.0599mmol)，碘化亚铜(0.10mg，0.50mmol)和N,N-二异丙基乙胺(82.6uL，0.488mmol)反应完毕，得粗品，经柱色谱(甲醇:二氯甲烷＝1:60，1:40，1:25)分离纯化得到化合物23(0.06g，57％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.49–7.14(m，11H，Ar-H，＝CH)，5.35(m，1H，H'-3)，5.10(m，3H，-OCOCH-)，5.08–3.14(m，H’sof sugarandlinker)，2.58-1.88(m，15H，12H of lipid，3H of-NHAc)，1.70-1.07(m，-CH2-of lipid)，0.87(m，18H，-CH3 of lipid)。 31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-1.98。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C119H211N6O23P[M+2H]2+1060.8，found 1061.5。
步骤3：[3-R-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1，2，3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物3)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000034
按实施例1中步骤18的合成方法，将化合物23(10.0mg)，钯碳(45.0mg)和氢气反应完毕，得到白色固体化合物3(8.5mg，93％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3/MeOD＝1：1)， 31P NMR(162MHz，CDCl3/MeOD＝1:1)，δ(ppm)：-1.18。MALDI-TOF MS m/z:calcd forC 105H 194N 6O 23PH]-1938.401，found1938.401。
实施例4：化合物4的制备
[3-R-(十四烷氧基)十四酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物4)的合成
步骤1：[3-R-(十四烷氧基)十四酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-炔丙基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物20)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000035
按实施例1中步骤16的合成方法，将化合物16(0.10g，0.07mmol)，Lipid A-4(0.05g，0.10mmol)和N,N-二异丙基乙胺(15.0uL，0.09mmol)反应完毕，得粗品，经柱色谱(乙酸乙酯：石油醚＝1:12，1:8，1:4，1:3，1:2)分离纯化后得到化合物20(0.07g，52％)： 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.49–7.18(m，10H，Ar-H)，6.76(s，1H，-NH-)，6.30(d，J＝7.4Hz，1H，-NH-)，5.33(t，J＝9.5Hz，1H，H-3)，5.14(s，2H，-OCOCH-)，5.07–4.88(m，4H，Ar-CH2-)，4.84(d，J＝8.1Hz，1H，H-1)，4.35(dd，J＝17.8，8.9Hz，1H， H-4)，4.11(dd，J＝33.8，15.8Hz，2H，-OCH2CCH)，3.86(t，J＝15.7Hz，1H，H-6-A)，3.83–3.54(m，5H，H-2，H-5，H-6-B，-OCH2CH2-)，3.43(d，J＝5.9Hz，3H，-CH2NH-，-OCH-)，2.52–2.14(m，9H，≡CH，-OCH2，-COCH2-)1.69–1.14(m，124H)，0.87(d，J＝6.6Hz，18H，-CH3)。 13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：173.59，173.53，171.73，170.46，170.34，135.56，135.49，130.92，128.85，28.69，28.64，128.62，128.14，128.04，100.46，79.29，74.97，74.09，72.70，70.89，70.24，69.73，69.67，69.62，69.27，68.26，65.58，58.64，55.35，41.91，41.60，39.66，39.39，34.62，34.57，34.50，34.41，31.95，30.58，30.20，29.72，29.70，29.60，29.55，29.43，29.39，29.29，29.22，26.22，25.42，25.31，25.15，25.03，22.71，19.20，14.13，13.74。 31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-1.98。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 109H 192N 2O 17P[M+H] +1816.4，found 1816.8。
步骤2：[3-R-(十四烷氧基)十四酰胺基]乙基4-氧-(二-氧-苄基磷酰基)-6-氧-6-[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1,2,3-三氮唑基-4]亚甲基-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物24)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000036
按实施例1中步骤17的合成方法，将化合物20(0.08g，0.04mmol)，Tn(15.3mg，0.05mmol)，碘化亚铜(0.06g，0.44mmol)和N，N-二异丙基乙胺(56.0uL，0.44mmol)反应完毕，得粗品，经柱色谱(甲醇:二氯甲烷＝1:60，1:40，1:25，1:20)分离纯化得到化合物24(0.04g，43％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.44–7.14(m，1H，Ar-H，＝CH)，5.335.33(m，1H，H-3)，5.12(m，2H-OCOCH-)，5.06–3.22(m，H’s of sugar and linker)，2.53–1.96(m，15H，12H of lipid，3H of-NHAc)，1.71–1.07(m，-CH2-of lipid)，0.87(t，J＝7.0Hz，18H，-CH3 of lipid)。 31P NMR(162MHz，CDCl3)，δ(ppm)：-2.04。ESI-TOF LRMS m/z:calcd for C 119H 211N 6O 22P[M+2H] 2+1053.8，found 1054.4。
步骤3：[3-R-(十四烷氧基)十四酰胺基]乙基4-氧-磷酰基-6-氧-6-{[(乙基2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)-1-氢-1，2，3-三氮唑基-4]亚甲基}-2-去氧-2-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-3-氧-[(R)-3-(十四羧酸酯基)十四酰胺基]-β-D-葡萄糖苷(化合物4)的制备
Figure PCTCN2019075561-appb-000037
按实施例1中步骤18的合成方法，将化合物24(10.0mg)、钯碳(45.0mg)和氢气反应完毕，得到白色固体化合物4(8.0mg，9％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3/MeOD＝1：1)， 31P NMR(162MHz，CDCl3/MeOD＝1:1)，δ(ppm)：-1.17。MALDI-TOF MS m/z:calcd for C 105H 196N 6O 22P[M-H] -1924.421，found1924.712。
实施例1-4的化合物(1、2、3、4)NMR谱图的测定均在“Bruker 400MHz、600MHz核磁共振波谱仪”上进行。HRMS谱图的测定在安捷伦6540高分辨Q-TOF质谱仪上进行，薄层色谱(TLC)分析在HF254硅胶板上进行，以20％的浓硫酸乙醇溶液为显色剂烤板。硅胶柱色谱以甲醇、乙酸乙酯、甲苯和石油醚(bp60-90℃)、正己烷等的混合溶剂为洗脱剂。硅胶柱使用200-300目硅胶，分子筛使用前均经过高温真空干燥，然后在氮气保护下恢复至室温。糖苷化反应使用的二氯甲烷均是无水级别的。
实施例5 化合物1、2、3、4的抗癌活性
实验方法：
将24只6～8周龄雌性C57BL6/J小鼠平均分成4组，分别将化合物1、2、3、4于第0、14、21、28天分别通过腹部皮下注射100μl药物(含10μgTn抗原)；分别于第0、27、38天通过尾静脉采血，离心得到血清，使用前置于-80℃保存。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：首先用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，将Tn-BSA配置成2μg/ml溶液，以每孔100μl的量加入96孔板，放入4℃孵育过夜；第二天放入37℃培养箱孵育一小时；用PBST(PBS+0.05％吐温-20)洗板3次，每孔加入300μl洗液。然后加入blocking buffer(PBST/1％BSA)；每孔加入250μl；常温孵育一小时，用PBST洗板3次。接着取化合物1、2、3、4第38天的血清样品，分别将各组中单独的小鼠血清合并，用PBS按照对半数稀释法从1：300倍稀释至1：656100倍；将稀释好的血清以每孔100μl加入96孔板中，每个样品做3个复孔，放置在37℃培养箱孵育两个小时，洗板三次。再将HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG二抗稀释1000倍，每孔加入100μl，室温以400rpm振摇一个小时；洗板3次。再加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液，每孔加入100μl，室温以400rpm振摇0.5小时。在450nm波长处，用酶标仪检测吸光度。最后将吸光度(OD)值相对于抗血清稀释值作图，并获得最佳拟合线。使用该线的方程式来计算达到0.2的OD的稀释度值，并且在稀释值的倒数处计算抗体滴度。
实验结果：
ELISA实验结果表明，在无任何外加佐剂的情况下，目标化合物1、2、3、4均能引起特异性免疫反应，如图1、2所示；从图中可明显看出，化合物3引起的IgG和IgM抗体滴度相对较低；化合物2和4引起的IgG和IgM抗体滴度类似，均高于化合物3，而化合物1引起的IgG和IgM抗体滴度是四个化合物中最高的，抗体滴度约为化合物3的两倍，说明化合物1可以刺激小鼠产生强烈的免疫反应，可以应用于抗肿瘤疫苗。
实施例6 化合物1、2、3免疫小鼠产生的糖抗体介导的补体依赖细胞毒性(CDC)试验
实验方法：
用胰酶消化处于对数生长期的MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)，以每孔1×10 4个细胞种于96孔板，在37℃培养过夜，用不含血清的MEM培养基洗板两次。取化合物1组在38天取血的6只小鼠血清样品，每个样品取7μl，然后将6只小鼠的血清样品混合，用不含血清的MEM培养基稀释50倍，得小鼠血清稀释液。化合物2组、化合物3组以及空白对照组的小鼠血清稀释液按上述方法制备。化合物1、化合物2、化合物3以及空白对照组均设置样品最大酶活性对照组，样品对照组以及样品处理组，每个组平行做6个复孔，每孔加入100μl稀释后的小鼠血清溶液，将96孔板置于37℃培养2h。用不含血清的MEM培养基洗板两次后，在样品处理组每孔加入100μl兔补体血清溶液，最大酶活性对照组每孔加入100μl的LDH释放液，样品对照组每孔加入100μl不含血清的MEM培养基，置于37℃培养1h。
另取新的96孔板，每孔加入100μl的PBS溶液，小心吸取40μl上述96孔板的细胞上清液加至此新的96孔板中，每孔加入60μl的LDH检测液，避光孵育30min。用酶标仪在490nm处检测。
细胞裂解率(％)＝(样品处理组吸光度-样品对照组吸光度)/(最大酶活性对照组吸光度-样品对照组吸光度)×100％
实验结果
抗体介导的补体依赖细胞毒性(CDC)实验结果如图3所示，化合物1、2、3所产生抗体都有杀死肿瘤细胞能力，细胞裂解率均高于空白对照组，与空白对照组有显著性差异(P<0.001)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

  1. 一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗，其特征在于，是通式为(I)的化合物：
    Y-L-X   (I)
    或通式为(I)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
    其中：
    Y选自具有以下结构的基团：
    Figure PCTCN2019075561-appb-100001
    R 1选自-CH 2-CH(-OR 4)(CH 2) mCH 3，R 4是-C(O)-(CH 2) nCH 3，m、n是6-18的整数；
    R 2选自-CH 2-CH(-OR 5)(CH 2) PCH 3，R 5是-C(O)-(CH 2) qCH 3，p、q是6-18的整数；
    R 3选自-CH 2-CH(-OR 6)(CH 2) rCH 3，R 6是-(CH 2) sCH 3或-C(O)-(CH 2) tCH 3，r、s、t是6-18的整数；
    L选自式-(CH 2) 2-NHC(O)-(CH 2) a-C(O)NH-(CH 2) b-或结构
    Figure PCTCN2019075561-appb-100002
    的连接臂；其中a、b、c是选自2-6的整数；
    X选自具有以下结构的基团：
    Figure PCTCN2019075561-appb-100003
  2. 如权利要求1所述的单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述Y选自具有以下结构的基团，其中：
    Figure PCTCN2019075561-appb-100004
    R 1是-CH 2-CH(-OR 4)(CH 2) 10CH 3，R 4是-C(O)-(CH 2) 12CH 3；
    R 2是-CH 2-CH(-OR 5)(CH 2) 10CH 3，R 5是-C(O)-(CH 2) 12CH 3；
    R 3是-CH 2-CH(-OR 6)(CH 2) 10CH 3或-CH 2-CH(-OR 6)(CH 2) 12CH 3，R6是-(CH 2) 11CH 3、-C(O)-(CH 2) 10CH 3或-C(O)-(CH 2) 12CH 3。
  3. 如权利要求1所述的单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述L是结构为
    Figure PCTCN2019075561-appb-100005
    的连接臂。
  4. 如权利要求1所述的单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述通式(I)为：
    Figure PCTCN2019075561-appb-100006
    Figure PCTCN2019075561-appb-100007
    或通式(I)的化合物的可药用盐。
  5. 通式为(I)的单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗及其异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
  6. 如权利要求5的应用，其特征在于，所述药物还包含医学上可用辅料。
  7. 如权利要求5的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌、前列腺癌、肠癌、黑素瘤、肝癌、肺癌、肾细胞癌、子宫癌、卵巢癌、细胞性淋巴癌、脑癌、胃癌、胰腺癌、甲腺癌或白血病。
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