WO2020152089A1 - Verfahren und vorrichtung zum optischen erfassen einer länge eines makromoleküls - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum optischen erfassen einer länge eines makromoleküls Download PDF

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WO2020152089A1
WO2020152089A1 PCT/EP2020/051256 EP2020051256W WO2020152089A1 WO 2020152089 A1 WO2020152089 A1 WO 2020152089A1 EP 2020051256 W EP2020051256 W EP 2020051256W WO 2020152089 A1 WO2020152089 A1 WO 2020152089A1
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pore
signal
macromolecule
marked
detection
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PCT/EP2020/051256
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Inventor
Jochen Hoffmann
Original Assignee
Robert Bosch Gmbh
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the invention is based on a method or a device according to the type of the independent claims.
  • the present invention also relates to a computer program.
  • Nanopores can be used to determine a base sequence of a nucleic acid.
  • the base sequence can be determined electrically when a molecule passes through the nanopore.
  • a length of the nucleic acid can be detected over the duration of an attenuation of an electrical signal when the molecule passes through the pore.
  • the measurement technology can be part of a nanopore chip. A high voltage may be required to thread the nucleic acid into the nanopore, as a result of which the nucleic acid can migrate through the pore at high speed after threading.
  • the measuring technology must have a high sampling rate and at the same time dissolve currents in the picoampere range in order to be able to resolve small changes in the current flow when a pore is blocked when a molecule passes through.
  • the approach presented here becomes a method for optically detecting a length of a macromolecule, a device using this method, and finally a
  • the approach presented here is based on the knowledge that it is possible to optically detect a length of a macromolecule, in particular a nucleic acid.
  • a light characteristic of a pore can be recorded, through which the macromolecule migrates.
  • a time of entry and a time of exit can be determined by detecting a change in the light characteristic when entering the pore and exiting the macromolecule from the pore.
  • the length of the macromolecule can be determined from the difference between the time of entry and the time of exit and a known correlation of a length with a time of passage. Electrical measurement technology can thus advantageously be dispensed with, which enables a compact design and is inexpensive.
  • a method for the optical detection of a length of a macromolecule, in particular a nucleic acid, using a pore in a microfluidic system has at least one step of reading in, one step of detecting and one step of determining. In the reading step, a detection signal is read in via an interface to an optical detection device.
  • Detection device has one aligned with the pore
  • the detection signal represents a light characteristic.
  • the first signal change represents an entry of the macromolecule into the pore.
  • a second point in time of a second signal change of the detection signal is detected in the detection step.
  • the second signal change represents an exit of the macromolecule from the pore.
  • the length of the macromolecule is determined using that of the first point in time and the second point in time.
  • the microfluidic system can be, for example, a chip laboratory, also called a lab-on-a-chip system.
  • a chip laboratory can do one Functionality of a macroscopic laboratory on a credit card-sized plastic substrate, for example, on which complex biological, diagnostic, chemical or physical processes can run miniaturized.
  • the pore can be a nanopore, which is a microfluidic
  • the pore can have a diameter of a few nanometers, for example a diameter of less than
  • the diameter of the pore can reach one
  • the diameter of the macromolecule must be adjusted so that not several
  • Macromolecules can pass through a pore at the same time.
  • the pore can be a biological pore or a pore made of synthetic material, a so-called “solid-state pore”.
  • Nucleic acid can be determined using a singer's dideoxy method, a base sequence of the nucleic acid.
  • the detection device can be, for example, a fluorescence camera or an image sensor.
  • the light from a region of the pore can be reflected or emitted light that, depending on whether a macromolecule is in the pore or not, comes from the macromolecule or a substance in the pore or the edge of the pore .
  • the area of the pore can be generated by means of a
  • Excitation light source to be irradiated The light can be generated using chemiluminescence.
  • the light can be emitted from the macromolecule or part of the macromolecule.
  • the area of the pore from which the light is detected can comprise at least one opening of the pore facing the detection device.
  • Detection signal represents the light characteristic, for example a
  • the first and second signal changes can indicate a change in the light characteristic caused by the
  • Macromolecule can be made in the pore area.
  • the first signal change can mark the first point in time and thus the point in time at which the macromolecule enters the pore.
  • the second signal change can indicate the second point in time, a point in time at which the macromolecule exits the pore.
  • the second signal change can be a Have characteristic that is known and that occurs when a macromolecule leaves the detection area of the detection device.
  • the detection signal can be compared continuously with known reference signal changes or with at least one or more threshold values. Known methods for signal evaluation can be used here. The length of the
  • Macromolecule can be made using a known
  • Migration rate of the macromolecule can be determined through the pore.
  • the length of the macromolecule can be determined using a
  • Calibration table are determined in which the length and a passage time determined from the first and the second point in time are correlated.
  • the method can also include a marking step.
  • a marking step a free end of the macromolecule can be marked with a signal material.
  • Signal material can be a molecular signal generator or
  • Act signal amplifiers for example a peroxidase or a
  • the first signal change in this case can represent an entry of the marked end of the macromolecule into the pore, or the second signal change can represent an exit of the marked end of the macromolecule out of the pore.
  • the detection signal and the first and second signal changes can advantageously be detected more easily by marking the macromolecule, as a result of which no signal amplification, for example by the optical detection device, is required during detection.
  • the first signal change can cause one of the marked ends of the
  • Macromolecule in the pore and the second signal change represent an exit of another of the marked ends of the macromolecule from the pore.
  • the further free end of the macromolecule can be marked with the further signal material in the marking step.
  • the method can then include a step of recognizing. In the recognition step, a passage of the macromolecule through the pore with the end marked with the signal material can be recognized when the first signal change represents the entry of the end marked with the signal material into the pore.
  • a passage of the macromolecule through the pore with the end marked with the further signal material in front can be recognized if the first signal change represents the entry of the end marked with the further signal material into the pore.
  • a direction of passage of the macromolecule through the pore can also be recognized.
  • the further signal material can, according to one embodiment, be designed to emit the light in a wavelength that differs from the signal material.
  • a distinction can be made in the recognition step between the wavelength emitted by the signal material and the wavelength emitted by the further signal material.
  • the light characteristic can thus be changed easily, which is advantageous with regard to detection. For example, if the one free end of the
  • the entry and exit of the macromolecule can be detected and distinguished more easily, as a result of which the first and the second point in time can be recorded more easily.
  • the method can also include a step of detecting the light from the area of the pore using the optical detection device.
  • the detection signal can also be provided.
  • the method can comprise a step of sending an excitation signal into the area of the pore.
  • the excitation signal can be, for example, using a
  • Excitation light source are emitted to the area of the pore illuminate or stimulate the emission of light from the area of the pore.
  • the excitation signal can be emitted through a pore
  • the excitation signal can be an electromagnetic signal.
  • the excitation signal is evanescent waves or an evanescent field which is introduced, for example, into a layer comprising the pore and / or through which the layer comprising the pore is guided to the pore and thus to a macromolecule located in the region of the pore . If at least one end of the macromolecule is marked with a signal material, the excitation signal can be designed to excite the signal material.
  • a substance of the microfluidic device in which the pore is embedded can also be excited by means of the excitation signal.
  • the excitation signal advantageously facilitates a
  • the method can also include a step of applying an electrical voltage.
  • the electrical voltage can be arranged on two opposite sides of the pore
  • This method can be implemented, for example, in software or hardware or in a mixed form of software and hardware, for example in a device.
  • This embodiment variant of the invention in the form of a device can also achieve the object on which the invention is based quickly and efficiently.
  • a device can be understood to mean an electrical device that processes sensor signals and, depending on this, controls and / or outputs data signals.
  • the device can have an interface that can be designed in terms of hardware and / or software.
  • the interfaces can be part of a so-called system ASIC, for example, which contains a wide variety of functions of the device.
  • the interfaces are separate, integrated circuits or at least partially consist of discrete components.
  • the interfaces can be software modules which are present, for example, on a microcontroller in addition to other software modules.
  • a computer program product or computer program with program code which can be stored on a machine-readable carrier or storage medium such as a semiconductor memory, a hard disk memory or an optical memory and for carrying out, implementing and / or controlling the steps of the method according to one of the above
  • Fig. 1 is a schematic representation of an optical device
  • Fig. 2 shows a characteristic of a detection signal according to a
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of a microfluidic system with a pore according to an exemplary embodiment
  • Macromolecule through a pore according to an embodiment 5 shows a schematic representation of a macromolecule with labeled free ends according to an exemplary embodiment
  • FIG. 6 shows a schematic illustration of a macromolecule and a pore according to an exemplary embodiment
  • FIG. 7 shows a flowchart of a method for optically detecting a length of a macromolecule according to an exemplary embodiment.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a device 100 for optically detecting a length of a macromolecule 105 according to one
  • a microfluidic system 110 is shown, in which a pore 115, for example a biological nanopore or a synthetically produced “solid-state nanopore”, is embedded.
  • the device 100 shown here can be part of the microfluidic system 110 or can be completely or partially separate from the microfluidic system 110.
  • the microfluidic system 110 is implemented as a chip laboratory.
  • a chip laboratory has, for example, a thickness of less than two centimeters or one centimeter and a length and width of less than 20 centimeters or less than 15 centimeters.
  • the device 100 comprises a reading device 120, a
  • Reading device 120 is designed to read in a detection signal 140 via an interface to an optical detection device 135.
  • the optical detection device 135 has one aligned with the pore 115
  • Detection area 145 to detect light from an area of the pore 115.
  • the detection signal 140 represents a light characteristic of the light, for example an intensity or wavelength of the light.
  • Detection signal 140 is, for example, an analog or digital electrical signal.
  • the detection device 125 is designed to detect a first point in time of a first signal change of the detection signal 140.
  • the first signal change represents an entry of the
  • the detection device 125 is designed to detect a second point in time of a second signal change of the detection signal 140.
  • the second signal change represents an exit of the macromolecule 105 from the pore 115
  • Detection device 125 is also designed to provide a first time signal 150 that represents the first point in time and a second time signal 155 that represents the second point in time.
  • the determination device 130 is designed to use the first point in time and the second point in time, that is to say the first time signal 150 and the second time signal 155, to determine a length of the macromolecule 105 and to provide a determination signal 160 representing the length.
  • An optical reading for the length measurement of macromolecules 105, in particular nucleic acids, by means of nanopores 115 is thus advantageously made possible.
  • the device 100 comprises the optical detection device 135.
  • the optical detection device 135 is designed to detect the light from the area of the pore 115.
  • the optical detection device 135 is depending on what is used
  • Signal generation mechanism can be implemented, for example, as a fluorescence camera.
  • the reading device 120, the detection device 125 and optionally the determination device 130 are integrated in the detection device 135.
  • the microfluidic system 110 can optionally be implemented as a sequencing chip, with an array of pores 115, in order to use a multiplexing strategy to simultaneously query several measuring cells and carry out several measurements.
  • the microfluidic system 110 can thus have at least one further pore and a further detection device, with a further detection signal of the further detection device corresponding to the above Detection signal is evaluated in order to determine a length of a macromolecule migrating through the further pore.
  • Upstream sample preparation steps can also be implemented in the microfluidic system 110.
  • the microfluidic system 110 has a marking device for marking at least one free end of the macromolecule 105 with a signal material.
  • the optical length measurement can advantageously be integrated cost-effectively and in a space-saving manner.
  • the macromolecule 105 in particular the nucleic acid, has a signal material at a free end.
  • the signal material is a molecular signal generator or a signal amplifier, for example flurophor, a horseradish peroxidase, which generates, for example, chemiluminescent signals, in combination with one or more of the following signaling substances: TMB
  • the device 100 or the microfluidic system 110 comprises a marking device for marking at least one free end of the macromolecule 105 with the signal material .
  • the detection device 125 is designed to be the entry of the marked end of the macromolecule 105 into the pore 115 as the first signal change detect, or as the second signal change to detect an exit of the marked end of the macromolecule 105 from the pore 115 n.
  • Another free end of the macromolecule 105 is optional with the
  • the further signal material is, for example, one of the named
  • the detection device 125 is designed as the first signal change as an entry of one of the marked ends of the macromolecule 105 into the pore 115 and as the second
  • the detection device 125 is designed to detect the
  • Detection device 135 provided detection signal 140 to evaluate and / or process, for example, to detect the passage of the macromolecule 105 through the pore 115.
  • the detection device 125 is optionally designed to detect an alignment of the macromolecule 105 when the macromolecule 105 passes through the pore 115 using the detection signal 140.
  • the detection device 125 according to an exemplary embodiment has a detection device 165, which is designed, for example, as a software or hardware module of the detection device 125. If the further free end of the macromolecule 105 with the other
  • Signal change represents the entry of the end of the macromolecule 105 marked with the signal material into the pore 115.
  • Detection device 165 designed to recognize the passage of the macromolecule 105 through the pore 115 with the end marked with the further signal material in advance when the first signal change represents the entry of the end of the macromolecule 105 marked with the further signal material into the pore 115.
  • the detection device 165 is thus advantageously designed to detect a direction of the passage of the macromolecule 105 through the pore 115.
  • the recognition device 165 can provide a recognition signal indicating the orientation of the macromolecule 105 when it passes through.
  • the recognition device 165 is designed to distinguish between the wavelength emitted by the signal material and the wavelength emitted by the further signal material.
  • the device 100 it is thus possible to use at least one end of the macromolecule 105, for example the nucleic acid, with either
  • Signal generator or the molecular signal amplifier such as peroxidase, to mark and in combination with the optical
  • Detection device 135 for optically detecting the entry and exit of the macromolecule 105 on an underside of the pore 115.
  • the length of the macromolecule 105, in particular the nucleic acids can be determined from the difference between the two times, the entry time and the exit time, which can be detected with the first and the second time of the signal change of the detection signal 140, and a known relationship with the length.
  • An array of such length measuring cells can be used to determine the base sequence of nucleic acids using the Sanger sequencing method.
  • optical measurement of the length of the macromolecule 105 offers several advantages. This makes it possible to reduce the complexity of the sequencing chip, since the electrical length measurement technology is no longer part of the
  • a reduction in the manufacturing costs of a microfluidic system 110 is also advantageous, since the chip can be implemented as a passive component without an electrical readout.
  • a standard fluorescence camera can also be used as the optical detection device 135 for detecting the detection signal 140 in the form of fluorescence signals. This also enables such a sequencing chip to be implemented in an existing lab-on-chip system that is equipped with a Fluorescence camera is equipped. Because no electrical
  • Temperature change which can be between 20 ° C and 95 ° C, is required.
  • the detection signal 140 is shown in a coordinate system in which a time is plotted on the abscissa and a signal strength is plotted on the ordinate.
  • a course of the detection signal 140 during migration of a macromolecule through a pore is shown purely schematically, as is described with reference to FIG. 1.
  • the course of the detection signal 140 exhibits a change which can be detected as a first signal change 210 and which represents the entry of the macromolecule into the pore.
  • the course of the detection signal 140 exhibits a further change that can be detected as a second signal change 215 that signals the exit of the
  • Macromolecule represented from the pore.
  • the signal changes 210, 215 have mutually corresponding characteristics or have the
  • Signal changes 210, 215 different characteristics.
  • only one of the ends of the macromolecule has a
  • Macromolecule are marked with different signal materials, the signal changes 210, 215 can have different characteristics.
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of a microfluidic system 110 with a pore 115 according to an exemplary embodiment.
  • the microfluidic system 110 shown here in cross section is similar to that with reference to FIG. 1
  • the microfluidic system 110 comprises the pore 115, which is embodied here as a nanopore and is embedded in a microfluidic environment.
  • the microfluidic system 110 comprises an upper substrate 305, which represents a fluidic limitation upwards, and an lower substrate 310, which represents a fluidic downward limitation.
  • the pore 115 is arranged between the upper substrate 305 and the lower substrate 310.
  • a microfluidic gap 315 is arranged in a space between an upper side of the pore 115 and a lower side of the upper substrate 305, through which nucleic acids such as the macromolecule 105 and
  • pore 115 Reagents to which pore 115 can be transported.
  • the pore 115 is also arranged, for example, in a depression, a cavity.
  • a further microfluidic gap 320 is arranged in a space between an underside of the pore 115 and an upper side of the lower substrate 310, through which it is possible to migrate nucleic acids such as the macromolecule 105 after passing through the pore 115, due to another in the microfluidic To transport gap 320 adjustable fluid flow.
  • the microfluidic system 110 also comprises the optical detection device 135 and one
  • Excitation device 325 which is designed here as an excitation light source.
  • the excitation device 325 is designed to emit an excitation signal in the area of the pore 115.
  • the area of the pore 115 can be illuminated, for example, by means of the excitation signal. Alternatively, one with one
  • Signal material 330 marked free end of macromolecule 105 can be excited by means of the excitation signal.
  • the excitation device 325 can also be implemented as part of the device described above.
  • the microfluidic system 110 comprises a voltage source 335.
  • the voltage source 335 is designed to apply an electrical voltage to two regions 340, 341 arranged on opposite sides of the pore 115 in order to allow the macromolecule 105 to pass through the pore 115 cause.
  • the two regions 340, 341 each have an electrode in order to enable the application of a DC field and additionally or alternatively an AC field for the transport of the macromolecule 105 through the pore 115 by means of the voltage source 335.
  • the first region 340 is on the underside of the upper substrate 305
  • the arrangement of the shown here Voltage source 335 with the two regions 340, 341 and the electrodes in the regions 340, 341 can be implemented as part of the device 100.
  • the microfluidic system 110 has a substrate, for example a plastic substrate, in which the microfluidic gaps 315, 320 are formed.
  • Columns 315, 320 are according to one
  • Embodiment part of a system of channels and chambers which is formed in the substrate of the microfluidic system 110.
  • a section of such a gap 315, 320 can, for example, form a channel or a chamber.
  • the gaps 315, 320 are separated from one another at least at one point by a thin layer 350.
  • the layer 350 for example made of a thin-film material, has a thickness of less than 200 nanometers, less than 100 nanometers, less than 50 nanometers or less than 10 nanometers, for example.
  • a length of the pore 115 corresponds to a thickness of the layer 350.
  • an amount of liquid comprising the macromolecules 105 to be measured can be stored by a few picoliters or a few microliters.
  • macromolecules 105 in the amount of liquid can be present
  • the microfluidic system 110 comprises a reaction chamber in which the macromolecules 105 can be labeled.
  • a signal material can be fed into the reaction chamber. Such marking can take place before the macromolecules reach layer 350.
  • Figures 4 a to 4 e show a schematic representation of a passage of a macromolecule 105 through a pore 115 according to one
  • Embodiment. can be a pore as described with reference to the previous figures.
  • One stage of the passage of the macromolecule 105 through the pore 115 is shown as an example.
  • the macromolecule 105 is a nucleic acid, which is marked with the signal material 330, here a fluorophore (FITY, ATTO dyes, HEX, CY dyes, but also quantum dots).
  • the area of the pore 115 is illuminated with the excitation light source. Excitation light filters can be used so that the signal transmitter used, the signal material 330, is excited with the corresponding wavelength.
  • the electrical voltage is applied between the electrodes, which are located on the two regions arranged on opposite sides of the pore 115, as shown, for example, with reference to FIG. 3, in order to cause the macromolecule 105 to be threaded.
  • the signal material 330 here the fluorophore
  • the detection device for example the fluorescence camera
  • this point in time is stored.
  • the signal is measured using the detection device in order to detect the first and second signal changes. Due to the fact that a fluid flows through the microfluidic gap below the pore 115 during the migration phase, the part of the
  • Macromolecule 105 transported in the flow direction until the macromolecule 105 has completely crossed the pore 115.
  • the macromolecule 105 is now entrained by the fluid and no signal is detected in the area of the pore 115. Due to the time difference between entry and
  • the time of exit can be determined using a calibration table in which the length and passage time are correlated, the length of the migrated macromolecule 105.
  • 4c shows the passage of a first part of the macromolecule 105 through the pore 115.
  • a fluid flow is present below the pore 115 in the microfluidic gap, which transports the macromolecule 105 with the signal material 330 away from the pore 115 or linearizes it in the direction of flow.
  • 4d shows the macromolecule 105 shortly before it emerges from the pore 115.
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of a macromolecule 105 with labeled free ends according to one exemplary embodiment.
  • the macromolecule 105 is also a nucleic acid here. At one free end, this indicates
  • the macromolecule here has the signal material 330, and the macromolecule 105 has a further signal material 505 at a further free end.
  • the macromolecule 105 shown here is labeled with a signal generator at both ends.
  • This has the advantage that the entry of the free end with the signal material 330, for example fluorophore, or the further signal material 505 is detected, regardless of the end with which the macromolecule 105 first threads into the pore 115.
  • the signal transmitters in the form of the signal material 330 and the further signal material 505 emit in the same or in different wavelength ranges. If the macromolecule has the signal material 330 at one free end and the other signal material 505 which differs from the signal material 330 at the other free end, the direction of the passage of the macromolecule 105 through the pore 115 can thus be determined.
  • no signal amplification mechanism is required for this on the detection side.
  • the use of an additional signal amplification mechanism is possible.
  • the signal transmitter that is to say the signal material 330 or the further signal material 505
  • the signal transmitter is not a fluorophore but a molecular one
  • Signal booster for example a horseradish peroxidase in combination with one or more of the following signaling substances: TMB
  • Signaling substances Fast Red TR, Naphtol-AS-MX-Phosphate, BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), NBT (Nitroblue Tetrazolium).
  • the signal material 330 or the further signal material 505 is an enzyme that catalyzes a signal-generating reaction.
  • the macromolecule 105 ie a nucleic acid labeled in this way, passes through the pore 115 and the fluid flowing through the region below the pore 115 is one signaling substance such as one of the signaling substances mentioned above
  • the molecular signal amplifier catalyzes the
  • Signal material 330 or the further signal material 505 the mass conversion of the signaling substance, which leads to an optically detectable signal.
  • the excitation light source can be dispensed with, since luminol leads to chemiluminescence. This reduces the complexity of one
  • Reading device using signal amplifiers as the signal material 330 or the further signal material 505 leads to the use of fluorophores as the signal material 330 or the other
  • Signal material 505 to more detectable signals, which reduces requirements for a sensitivity of the detection system.
  • FIG. 6 shows a schematic illustration of a macromolecule 105 and a pore 115 according to an exemplary embodiment.
  • the pore 115 is formed in a thin-layer material 605.
  • the thin layer material 605 is designed to transport evanescent waves.
  • the thin-layer material 605 is, for example, platinum with a layer thickness between one and two hundred nanometers,
  • the excitation of the signal material 330 takes place locally through the interaction of the evanescent field with the signal generator, the signal material 330
  • FIG. 7 shows a flowchart of a method 700 for optically detecting a length of a macromolecule, in particular a nucleic acid, according to an exemplary embodiment.
  • Method 700 is performed using a pore in a microfluidic system.
  • the method 700 has at least a step 705 of reading in, a step 710 of detection and a step 715 of determination.
  • a detection signal is read in via an interface to an optical detection device.
  • the optical detection device has a detection area aligned with the pore in order to detect light from an area of the pore.
  • the detection signal represents a light characteristic of the light.
  • a first point in time becomes a first point in time
  • the first signal change represents an entry of the macromolecule into the pore.
  • a second point in time of a second signal change of the detection signal is detected in the detection step.
  • the second signal change represents an exit of the macromolecule from the pore.
  • the length of the macromolecule is determined using that of the first point in time and the second point in time.
  • the method also includes a step 720 of marking.
  • step 720 of the marking a free end of the macromolecule is marked with a signal material.
  • step 710 of the marking a signal material
  • Detecting the first signal change then represents an entry of the marked end of the macromolecule into the pore or the second
  • the marking step 720 is optionally before the reading step 705 or before the detection step 710
  • a further free end of the macromolecule is additionally marked with the signal material or a further signal material according to an exemplary embodiment.
  • the first represents
  • the method 700 also includes a step 725 of recognition.
  • step 725 of recognition a passage of the macromolecule through the pore with the end marked with the signal material in front is recognized if the first signal change represents the entry of the end marked with the signal material into the pore, or a passage of the macromolecule through the pore recognized in advance with the end marked with the further signal material when the first signal change represents the entry of the end marked with the further signal material into the pore.
  • the step 725 of the recognition can optionally be carried out after the step 720 of the marking.
  • the method 700 also has a step 730 of detecting.
  • step 730 of the detection the light from the area of the pore is detected using the optical detection device.
  • Step 730 is optionally executable before step 705 of reading in.
  • the method 700 comprises a further step which can optionally be carried out before the step 705 of reading in: the step 735 of sending out.
  • step 735 of sending out a further step which can optionally be carried out before the step 705 of reading in: the step 735 of sending out.
  • Excitation signal emitted into the area of the pore, for example in order to illuminate the area of the pore or to excite a signal material of a macromolecule migrating through the pore.
  • the method 700 has a step 740 of creating.
  • step 740 of application an electrical voltage is applied to two regions arranged on opposite sides of the pore in order to cause the macromolecule to pass through the pore.
  • Step 740 of creating can also be carried out before step 705 of reading in.
  • the method 700 can be carried out using an exemplary embodiment of the above-mentioned device.
  • an exemplary embodiment includes a “and / or” link between a first feature and a second feature, it should be read in such a way that the
  • Embodiment according to one embodiment has both the first feature and the second feature and according to a further embodiment either only the first feature or only the second feature.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zumoptischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls (105), insbesondere einer Nukleinsäure. Das Verfahren wird unter Verwendung einer Pore (115) in einem mikrofluidischen System (110) durchgeführt. Das Verfahren umfasst zumindest einen Schritt des Einlesens, einen Schritt des Detektierens und einen Schritt des Bestimmens. Im Schritt des Einlesens wird ein Detektionssignal (140) über eine Schnittstelle zu einer optischen Erfassungseinrichtung (135) eingelesen. Die optische Erfassungseinrichtung (135) weist einen auf die Pore (115) ausgerichteten Erfassungsbereich (145) auf, um Licht aus einem Bereich der Pore (115) zu erfassen. Das Detektionssignal (140) repräsentiert eine Lichtcharakteristik des Lichts. Im Schritt des Detektierens wird ein erster Zeitpunkt einer ersten Signaländerung des Detektionssignals (140) detektiert. Die erste Signaländerung repräsentiert einen Eintritt des Makromoleküls (105) in die Pore (115). Zudem wird im Schritt des Detektierens ein zweiter Zeitpunkt einer zweiten Signaländerung des Detektionssignals (140) detektiert. Die zweite Signaländerung repräsentiert einen Austritt des Makromoleküls (105) aus der Pore (115). Im Schritt des Bestimmens wird unter Verwendung des ersten Zeitpunkts und des zweiten Zeitpunkts die Länge des Makromoleküls (105) bestimmt.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren und Vorrichtung zum optischen Erfassen einer Länge eines
Makromoleküls
Stand der Technik
Die Erfindung geht von einem Verfahren oder einer Vorrichtung nach Gattung der unabhängigen Ansprüche aus. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Computerprogramm.
Nanoporen können dazu verwendet werden, um eine Basenabfolge einer Nukleinsäure zu bestimmen. Die Basenabfolge kann beim Durchtritt eines Moleküls durch die Nanopore elektrisch bestimmt werden. Dabei kann eine Länge der Nukleinsäure über eine Dauer einer Abschwächung eines elektrischen Signals beim Durchlauf des Moleküls durch die Pore detektiert werden. Die Messtechnik kann dabei Teil eines Nanoporenchips sein. Für ein Einfädeln der Nukleinsäure in die Nanopore kann eine hohe Spannung erforderlich sein, wodurch die Nukleinsäure nach dem Einfädeln mit hoher Geschwindigkeit durch die Pore migrieren kann. Die Messtechnik muss hierbei eine hohe Abtastrate aufweisen und gleichzeitig Ströme im picoampere Bereich auflösen, um geringe Veränderungen im Stromfluss beim Blockieren einer Pore beim Durchtritt eines Moleküls auflösen zu können.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund werden mit dem hier vorgestellten Ansatz ein Verfahren zum optischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls, weiterhin eine Vorrichtung, die dieses Verfahren verwendet, sowie schließlich ein
entsprechendes Computerprogramm gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Durch die in den abhängigen Ansprüchen aufgeführten Maßnahmen sind vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen der im unabhängigen
Anspruch angegebenen Vorrichtung möglich.
Der hier vorgestellte Ansatz beruht auf der Erkenntnis, dass es möglich ist, eine Länge eines Makromoleküls, insbesondere einer Nukleinsäure, optisch zu erfassen. Dazu kann eine Lichtcharakteristik einer Pore erfasst werden, durch die das Makromolekül migriert. Mittels einer Detektion einer Veränderung der Lichtcharakteristik beim Eintreten in die Pore und Austreten des Makromoleküls aus der Pore können ein Eintrittszeitpunkt und ein Austrittszeitpunkt bestimmt werden. Aus der Differenz des Eintrittszeitpunkts und des Austrittzeitpunkts und einer bekannten Korrelation von einer Länge mit einer Durchtrittszeit kann die Länge des Makromoleküls bestimmt werden. Vorteilhafterweise kann somit auf eine elektrische Messtechnik verzichtet werden, was eine kompakte Bauweise ermöglicht und kostengünstig ist.
Es wird ein Verfahren zum optischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls, insbesondere einer Nukleinsäure, unter Verwendung einer Pore in einem mikrofluidischen System vorgestellt. Das Verfahren weist zumindest einen Schritt des Einlesens, einen Schritt des Detektierens und einen Schritt des Bestimmens auf. Im Schritt des Einlesens wird über eine Schnittstelle zu einer optischen Erfassungseinrichtung ein Detektionssignal eingelesen. Die optische
Erfassungseinrichtung weist einen auf die Pore ausgerichteten
Erfassungsbereich auf, um Licht aus einem Bereich der Pore zu erfassen. Das Detektionssignal repräsentiert eine Lichtcharakteristik. Im Schritt des
Detektierens wird ein erster Zeitpunkt einer ersten Signaländerung des
Detektionssignals detektiert. Die erste Signaländerung repräsentiert einen Eintritt des Makromoleküls in die Pore. Zudem wird im Schritt des Detektierens ein zweiter Zeitpunkt einer zweiten Signaländerung des Detektionssignals detektiert. Die zweite Signaländerung repräsentiert einen Austritt des Makromoleküls aus der Pore. Im Schritt des Bestimmens wird unter Verwendung der des ersten Zeitpunkts und des zweiten Zeitpunkts die Länge des Makromoleküls bestimmt.
Bei dem mikrofluidischen System kann es sich beispielsweise um ein Chiplabor, auch Lab-on-a-Chip-System genannt, handeln. Ein Chiplabor kann eine Funktionalität eines makroskopischen Labors auf einem beispielsweise kreditkartengroßen Kunststoffsubstrat aufweisen, auf dem komplexe biologische, diagnostische, chemische oder physikalische Prozesse miniaturisiert ablaufen können. Die Pore kann eine Nanopore sein, die in eine mikrofluidische
Umgebung eingebettet ist. Die Pore kann einen Durchmesser von einigen Nanometern, beispielsweise einen Durchmesser von weniger als
100 Nanometern, von weniger als 10 Nanometern oder weniger als
5 Nanometern aufweisen. Der Durchmesser der Pore kann an einen
Durchmesser des Makromoleküls angepasst sein, sodass nicht mehrere
Makromoleküle gleichzeitig eine Pore passieren können. Die Pore kann eine biologische oder eine aus synthetischem Material hergestellte Pore, eine sogenannte„solid-state-Pore“ sein. Mittels dem Erfassen der Länge der
Nukleinsäure kann unter Verwendung einer Didesoxymethode nach Sänger eine Basenabfolge der Nukleinsäure bestimmt werden. Die optische
Erfassungseinrichtung kann beispielsweise eine Fluoreszenz-Kamera oder ein Bildsensor sein. Bei dem Licht aus einem Bereich der Pore kann es sich um reflektiertes oder emittiertes Licht handeln, dass abhängig davon, ob sich ein Makromolekül in der Pore befindet oder nicht, von dem Makromolekül oder einer sich in der Pore befindlichen Substanz oder dem Rand der Pore stammt. Zum Erzeugen des Lichts kann der Bereich der Pore mittels einer
Anregungslichtquelle bestrahlt werden. Das Licht kann mittels Chemoluminiszenz erzeugt werden. Wenn ein Makromolekül durch die Pore migriert, kann das Licht von dem Makromolekül oder einem Teil des Makromoleküls ausgestrahlt werden. Der Bereich der Pore, aus dem das Licht erfasst wird, kann zumindest eine der Erfassungseinrichtung zugewandte Öffnung der Pore umfassen. Das
Detektionssignal repräsentiert die Lichtcharakteristik, beispielsweise eine
Intensität und/oder Wellenlänge des Lichts. Die erste und zweite Signaländerung können eine Änderung der Lichtcharakteristik anzeigen, die durch das
Makromolekül im Bereich der Pore erfolgen kann. Die erste Signaländerung kann den ersten Zeitpunkt und damit einen Eintrittszeitpunkt des Makromoleküls in die Pore markieren. Die zweite Signaländerung kann den zweiten Zeitpunkt, einen Austrittszeitpunkt des Makromoleküls aus der Pore, anzeigen. Die erste
Signaländerung kann eine Charakteristik aufweisen, die vorbekannt ist und die dann auftritt, wenn eine Makromolekül in den Erfassungsbereich der
Erfassungseinrichtung eintritt. Die zweite Signaländerung kann eine Charakteristik aufweisen, die vorbekannt ist und die dann auftritt, wenn eine Makromolekül den Erfassungsbereich der Erfassungseinrichtung verlässt. Um die Zeitpunkte zu bestimmen, kann das Detektionssignals fortlaufend mit vorbekannten Referenzsignaländerungen oder mit zumindest einem oder mehreren Schwellenwerten verglichen werden. Dabei kann auf bekannte Verfahren zur Signalauswertung zurückgegriffen werden. Die Länge des
Makromoleküls kann unter Verwendung einer bekannten
Migrationsgeschwindigkeit des Makromoleküls durch die Pore bestimmt werden. Beispielsweise kann die Länge des Makromoleküls mittels einer
Kalibrationstabelle bestimmt werden, in der die Länge und eine aus dem ersten und dem zweiten Zeitpunkt ermittelte Durchtrittszeit korreliert werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann das Verfahren zudem einen Schritt des Markierens umfassen. Im Schritt des Markierens kann ein freies Ende des Makromoleküls mit einem Signalmaterial markiert werden. Bei dem
Signalmaterial kann es sich um einen molekularen Signalgeber oder
Signalverstärker handeln, beispielsweise um eine Peroxidase oder ein
Fluorophor. Im Schritt des Detektierens kann die erste Signaländerung in diesem Fall einen Eintritt des markierten Endes des Makromoleküls in die Pore repräsentieren, oder die zweite Signaländerung kann einen Austritt des markierten Endes des Makromoleküls aus der Pore repräsentieren.
Vorteilhafterweise können das Detektionssignal und die erste und zweite Signaländerung durch ein Markieren des Makromoleküls einfacher detektiert werden, wodurch beim Erfassen keine Signalverstärkung beispielsweise durch die optische Erfassungseinrichtung erforderlich ist.
Im Schritt des Markierens kann gemäß einer Ausführungsform ein weiteres freies Ende des Makromoleküls mit dem Signalmaterial oder einem weiteren
Signalmaterial markiert werden. In diesem Fall kann im Schritt des Detektierens die erste Signaländerung einen Eintritt eines der markierten Enden des
Makromoleküls in die Pore und die zweite Signaländerung einen Austritt eines anderen der markierten Enden des Makromoleküls aus der Pore repräsentieren. Vorteilhafterweise können der erste und der zweite Zeitpunkt dadurch einfacher detektiert werden. Zudem kann gemäß einer Ausführungsform im Schritt des Markierens das weitere freie Ende des Makromoleküls mit dem weiteren Signalmaterial markiert werden. Das Verfahren kann dann einen Schritt des Erkennens umfassen. Im Schritt des Erkennens kann ein Durchtritt des Makromoleküls durch die Pore mit dem mit dem Signalmaterial markierten Ende voran erkannt werden, wenn die erste Signaländerung den Eintritt des mit dem Signalmaterial markierten Endes in die Pore repräsentiert. Alternativ dazu kann ein Durchtritt des Makromoleküls durch die Pore mit dem mit dem weiteren Signalmaterial markierten Ende voran erkannt werden, wenn die erste Signaländerung den Eintritt des mit dem weiteren Signalmaterial markierten Endes in die Pore repräsentiert.
Vorteilhafterweise kann somit zusätzlich zur Länge des Makromoleküls auch eine Richtung des Durchtritts des Makromoleküls durch die Pore erkannt werden.
Ferner kann im Schritt des Markierens das weitere Signalmaterial gemäß einer Ausführungsform dazu ausgebildet sein, um das Licht in einer sich von dem Signalmaterial unterscheidenden Wellenlänge zu emittieren. In diesem Fall kann im Schritt des Erkennens zwischen der von dem Signalmaterial und der von dem weiteren Signalmaterial emittierten Wellenlänge unterschieden werden. Die Lichtcharakteristik kann so einfach verändert werden, was bezüglich einer Detektion vorteilhaft ist. Wenn beispielsweise das eine freie Ende des
Makromoleküls mit dem Signalmaterial und das andere freie Ende des
Makromoleküls mit dem weiteren Signalmaterial markiert ist, können der Eintritt und der Austritt des Makromoleküls einfacher detektiert und unterschieden werden, wodurch der erste und der zweite Zeitpunkt einfacher erfasst werden können.
Das Verfahren kann gemäß einer Ausführungsform zudem einen Schritt des Erfassens des Lichts aus dem Bereich der Pore unter Verwendung der optischen Erfassungseinrichtung umfassen. Im Schritt des Erfassens kann zudem das Detektionssignal bereitgestellt werden.
Außerdem kann das Verfahren gemäß einer Ausführungsform einen Schritt des Aussendens eines Anregungssignals in den Bereich der Pore umfassen. Das Anregungssignal kann beispielsweise unter Verwendung einer
Anregungslichtquelle ausgesendet werden, um den Bereich der Pore zu beleuchten oder das Aussenden des Licht aus dem Bereich der Pore anzuregen. Das Anregungssignal kann nach dem Aussenden durch eine die Pore
umfassende Schicht oder durch ein Medium, das die die Pore umfassende Schicht umgibt, beispielsweise eine Flüssigkeit, zu der Pore geleitet werden. Bei dem Anregungssignal kann es sich um ein elektromagnetisches Signal handeln. Gemäß einem Ausführungsbeispiel handelt es sich bei dem Anregungssignal um evaneszente Wellen oder ein evaneszentes Feld, das beispielsweise in eine die Pore umfassende Schicht eingeleitet und/oder durch die die Pore umfassende Schicht zu der Pore und somit einem sich im Bereich der Pore befindlichen Makromolekül geleitet wird. Wenn zumindest ein Ende des Makromoleküls mit einem Signalmaterial markiert ist, kann das Anregungssignal ausgebildet sein, um das Signalmaterial anzuregen. Auch eine Substanz der mikrofluidischen Vorrichtung, in die die Pore eingebettet ist, kann mittels des Anregungssignals angeregt werden. Das Anregungssignal erleichtert vorteilhafterweise ein
Erfassen des Bereichs der Pore und damit des Detektionssignals.
Auch kann das Verfahren gemäß einer Ausführungsform einen Schritt des Anlegens einer elektrischen Spannung umfassen. Dazu kann die elektrische Spannung an zwei an gegenüberliegenden Seiten der Pore angeordnete
Bereiche angelegt werden, um einen Durchtritt des Makromoleküls durch die Pore zu bewirken.
Dieses Verfahren kann beispielsweise in Software oder Hardware oder in einer Mischform aus Software und Hardware beispielsweise in einer Vorrichtung implementiert sein.
Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner eine Vorrichtung, die ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in
entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden.
Unter einer Vorrichtung kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Die Vorrichtung kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen der Vorrichtung beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.
Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt oder Computerprogramm mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger oder Speichermedium wie einem Halbleiterspeicher, einem Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung, Umsetzung und/oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens nach einer der vorstehend
beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird, insbesondere wenn das Programmprodukt oder Programm auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird.
Ausführungsbeispiele des hier vorgestellten Ansatzes sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum optischen
Erfassen einer Länge eines Makromoleküls gemäß einem Ausführungsbeispiel;
Fig. 2 eine Kennlinie eines Detektionssignals gemäß einem
Ausführungsbeispiel;
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines mikrofluidischen Systems mit einer Pore gemäß einem Ausführungsbeispiel;
Fig. 4a bis 4e eine schematische Darstellung eines Durchtritts eines
Makromoleküls durch eine Pore gemäß einem Ausführungsbeispiel; Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Makromoleküls mit markierten freien Enden gemäß einem Ausführungsbeispiel;
Fig. 6 eine schematische Darstellung eines Makromoleküls und einer Pore gemäß einem Ausführungsbeispiel; und
Fig. 7 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum optischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls gemäß einem Ausführungsbeispiel.
In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren
dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche
Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 100 zum optischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls 105 gemäß einem
Ausführungsbeispiel. Zudem ist ein mikrofluidisches System 110 gezeigt, in dem eine Pore 115, beispielsweise eine biologische Nanopore oder eine synthetisch hergestellte„solid-state-Nanopore“, eingebettet ist. Die hier gezeigte Vorrichtung 100 kann Teil des mikrofluidischen Systems 110 sein oder vollständig oder teilweise separat zu dem mikrofluidischen System 110 ausgeführt sein.
Beispielsweise ist das mikrofluidische System 110 als ein Chiplabor ausgeführt. Ein solches Chiplabor weist beispielsweise eine Dicke von weniger als zwei Zentimetern oder einem Zentimeter und eine Länge und Breite von weniger als 20 Zentimetern oder weniger als 15 Zentimetern auf.
Die Vorrichtung 100 umfasst eine Einleseeinrichtung 120, eine
Detektionseinrichtung 125 und eine Bestimmungseinrichtung 130. Die
Einleseeinrichtung 120 ist ausgebildet, über eine Schnittstelle zu einer optischen Erfassungseinrichtung 135 ein Detektionssignal 140 einzulesen. Die optische Erfassungseinrichtung 135 weist einen auf die Pore 115 ausgerichteten
Erfassungsbereich 145 auf, um Licht aus einem Bereich der Pore 115 zu erfassen. Das Detektionssignal 140 repräsentiert eine Lichtcharakteristik des Lichts, beispielsweise eine Intensität oder Wellenlänge des Lichts. Bei dem Detektionssignals 140 handelt es sich beispielsweise um eine analoges oder digitales elektrisches Signal. Die Detektionseinrichtung 125 ist ausgebildet, einen ersten Zeitpunkt einer ersten Signaländerung des Detektionssignals 140 zu detektieren. Die erste Signaländerung repräsentiert einen Eintritt des
Makromoleküls 105 in die Pore 115. Zudem ist die Detektionseinrichtung 125 dazu ausgebildet, einen zweiten Zeitpunkt einer zweiten Signaländerung des Detektionssignals 140 zu detektieren. Die zweite Signaländerung repräsentiert einen Austritt des Makromoleküls 105 aus der Pore 115. Die
Detektionseinrichtung 125 ist zudem dazu ausgebildet, ein erstes Zeitsignal 150, das den ersten Zeitpunkt repräsentiert und ein zweites Zeitsignal 155, das den zweiten Zeitpunkt repräsentiert, bereitzustellen. Die Bestimmungseinrichtung 130 ist ausgebildet, unter Verwendung des ersten Zeitpunkts und des zweiten Zeitpunkts, also unter Verwendung des ersten Zeitsignals 150 und des zweiten Zeitsignal 155 eine Länge des Makromoleküls 105 zu bestimmen und ein die Länge repräsentierendes Bestimmungssignal 160 bereitzustellen.
Vorteilhafterweise wird somit eine optische Auslesung für die Längenmessung von Makromolekülen 105, insbesondere Nukleinsäuren, mittels Nanoporen 115 ermöglicht.
Gemäß dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel umfasst die Vorrichtung 100 die optische Erfassungseinrichtung 135. Die optische Erfassungseinrichtung 135 ist dazu ausgebildet, das Licht aus dem Bereich der Pore 115 zu erfassen. Die optische Erfassungseinrichtung 135 ist je nach verwendetem
Signalgenerierungsmechanismus beispielsweise als Fluoreszenz- Kamera ausführbar. Gemäß einem Ausführungsbeispiel sind die Einleseeinrichtung 120, die Detektionseinrichtung 125 und optional die Bestimmungseinrichtung 130 in der Erfassungseinrichtung 135 integriert.
Das mikrofluidische System 110 ist optional als Sequenzierchip ausführbar, mit einem Array aus Poren 115, um mittels einer Multiplexing-Strategie gleichzeitig mehrere Messzellen abzufragen und mehrere Messungen durchzuführen. Somit kann das mikrofluidische System 110 zumindest eine weitere Pore und eine weitere Erfassungseinrichtung aufweisen, wobei ein weiteres Detektionssignal der weiteren Erfassungseinrichtung entsprechend dem oben genannten Detektionssignal ausgewertet wird, um eine Länge eines durch die weitere Pore migrierenden Makromoleküls zu ermitteln.
Auch vorgeschalteten Probenvorbereitungsschritte können in das mikrofluidische System 110 implementiert sein. Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist das mikrofluidische System 110 eine Markierungseinrichtung zum Markieren zumindest einen freien Endes des Makromoleküls 105 mit einem Signalmaterial auf. Vorteilhafterweise ist die optische Längenmessung kostengünstig und platzsparend integrierbar.
Das Makromolekül 105, insbesondere die Nukleinsäure, weist gemäß einem Ausführungsbeispiel an einem freien Ende ein Signalmaterial auf. Bei dem Signalmaterial handelt es sich um einen molekularen Signalgeber oder einen Signalverstärker, beispielsweise um Flurophor, eine Meerettichperoxidase, die beispielsweise chemolumineszente Signale generiert, in Kombination mit einer oder mehrerer der folgenden signalgebenden Substanzen: TMB
(Tetramethylbenzidin), OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride), ABTS ( 2,2 - Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) oder Luminol, oder um ein alkalische Phosphatase in Kombination mit einer oder mehrerer der folgenden signalgebenden Substanzen: Fast Red TR, Naphtol-AS-MX-Phosphat, BCIP (5- Bromo- 4-Chloro-3-lndolyl Phosphate) oder NBT (Nitroblue Tetrazolium). Die Vorrichtung 100 oder das mikrofluidische System 110 umfasst gemäß einem Ausführungsbeispiel eine Markierungseinrichtung zum Markieren zumindest einen freien Endes des Makromoleküls 105 mit dem Signalmaterial. Dabei kann auf bekannte Verfahren zum Markieren von Makromolekülen zurückgegriffen werden. Die Detektionseinrichtung 125 ist gemäß einem Ausführungsbeispiel dazu ausgebildet, als die erste Signaländerung einen Eintritt des markierten Endes des Makromoleküls 105 in die Pore 115 zu detektieren, oder als die zweite Signaländerung einen Austritt des markierten Endes des Makromoleküls 105 aus der Pore 115 zu detektieren.
Optional ist ein weiteres freies Ende des Makromoleküls 105 mit dem
Signalmaterial oder einem weiteren Signalmaterial markiert. Bei dem weiteren Signalmaterial handelt es sich beispielsweise um einen der genannten
Signalgeber oder Signalverstärker, wobei sich das Signalmaterial und das weitere Signalmaterial in einer detektierbaren Eigenschaft, beispielsweise einer Intensität oder Wellenlänge von den Signalmaterialien emittierten oder reflektierten Lichts, unterscheiden. In diesem Fall ist die Detektionseinrichtung 125 ausgebildet, als die erste Signaländerung einen Eintritt eines der markierten Enden des Makromoleküls 105 in die Pore 115 und als die zweite
Signaländerung einen Austritt eines anderen der markierten Enden des
Makromoleküls 105 aus der Pore 115 zu detektieren.
Die Detektionseinrichtung 125 ist ausgebildet, um das von der
Erfassungseinrichtung 135 bereitgestellte Detektionssignal 140 auszuwerten und/oder zu verarbeiten, um beispielsweise das Passieren des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 zu detektieren. Optional ist die Detektionseinrichtung 125 ausgebildet, um unter Verwendung des Detektionssignals 140 eine Ausrichtung des Makromoleküls 105 bei einem Durchtritt des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 zu erkennen. Dazu weist die Detektionseinrichtung 125 gemäß einem Ausführungsbeispiel eine Erkennungseinrichtung 165 auf, die beispielsweise als ein Software- oder Hardwaremodul der Detektionseinrichtung 125 ausgeführt ist. Wenn das weitere freie Ende des Makromoleküls 105 mit dem weiteren
Signalmaterial markiert ist, ist die Erkennungseinrichtung 165 ausgebildet, den Durchtritt des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 mit dem mit dem
Signalmaterial markierten Ende voran zu erkennen, wenn die erste
Signaländerung den Eintritt des mit dem Signalmaterial markierten Endes des Makromoleküls 105 in die Pore 115 repräsentiert. Zudem ist die
Erkennungseinrichtung 165 ausgebildet, den Durchtritt des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 mit dem mit dem weiteren Signalmaterial markierten Ende voran zu erkennen, wenn die erste Signaländerung den Eintritt des mit dem weiteren Signalmaterial markierten Endes des Makromoleküls 105 in die Pore 115 repräsentiert. Vorteilhafterweise ist die Erkennungseinrichtung 165 somit ausgebildet, eine Richtung des Durchtritts des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 zu erkennen. Die Erkennungseinrichtung 165 kann ein die Ausrichtung des Makromoleküls 105 beim Durchtritt anzeigendes Erkennungssignal bereitstellen.
Wenn das weitere Signalmaterial zum Markieren des weiteren freien Endes des Makromoleküls 105 gemäß einem Ausführungsbeispiel ausgebildet ist, um das Licht in einer sich von dem Signalmaterial unterscheidenden Wellenlänge zu emittieren, ist die Erkennungseinrichtung 165 ausgebildet, zwischen der von dem Signalmaterial und der von dem weiteren Signalmaterial emittierten Wellenlänge zu unterscheiden.
Mittels der Vorrichtung 100 ist es somit möglich, mindestens ein Ende des Makromoleküls 105, beispielsweise der Nukleinsäure, entweder mit dem
Signalgeber oder dem molekularen Signalverstärker, wie beispielsweise der Peroxidase, zu markieren und in Kombination mit der optischen
Erfassungseinrichtung 135, auf einer Unterseite der Pore 115 den Ein- und Austritt des Makromoleküls 105 optisch zu erfassen. Aus der Differenz beider Zeiten, der Eintrittszeit und der Austrittszeit, die mit dem ersten und dem zweiten Zeitpunkt der Signaländerung des Detektionssignals 140 detektierbar sind, und einem bekannten Zusammenhang mit der Länge lässt sich die Länge des Makromoleküls 105, insbesondere der Nukleinsäuren bestimmen. Ein Array aus solchen Längenmesszellen kann dazu verwendet werden, nach dem Sanger- Sequenziermethode die Basenabfolge von Nukleinsäuren zu bestimmen.
Die optische Messung der Länge des Makromoleküls 105 bietet dabei mehrere Vorteile. So ist es möglich, eine Komplexität des Sequenzierchips zu reduzieren, da die elektrische Längenmesstechnik nicht mehr Bestandteil des
Nanoporenchips sein muss. Dies hat vorteilhafte Auswirkungen auf eine
Verwendung von Herstellprozessen für die Pore 115, da keine Kompatibilität mit denen für elektrische Leiterbahnen und Elektroden erforderlich ist. Dies bietet mehr Freiheit und andere Möglichkeiten bei der Herstellung der Pore 115. Zudem ist eine Integration eines solchen Chips in ein fluidisches Netzwerk des mikrofluidischen Systems 110 möglich, da es nicht erforderlich ist,
Kontaktierungsmöglichkeiten für elektrische Messtechnik zu berücksichtigen. Vorteilhaft ist auch eine Senkung der Herstellkosten eines mikrofluidischen Systems 110, da der Chip als ein passives Bauelement ohne elektrischen Readout ausführbar ist. Je nach Signalgenerierungsmechanismus ist als optische Erfassungseinrichtung 135 zudem eine Standard Fluoreszenz- Kamera für ein Erfassen des Detektionssignals 140 in Form von Fluoreszenzsignalen verwendbar. Dies ermöglicht darüber hinaus eine Implementierung eines solchen Sequenzierchips in ein bestehendes Lab-on-Chip System, das mit einer Fluoreszenzkamera ausgestattet ist. Dadurch, dass keine elektrische
Messtechnik im Chip selber vorhanden ist, ist zudem kein Passivieren des Chips gegenüber Prozessflüssigkeiten und keine Kompensation von
Temperaturänderung, die zwischen 20 °C und 95 °C liegen können, erforderlich.
Fig. 2 zeigt ein Detektionssignal 140 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das Detektionssignal 140 ist in einem Koordinatensystem gezeigt, bei dem auf der Abszisse eine Zeit und auf der Ordinate eine Signalstärke aufgetragen ist. Rein schematisch ist ein Verlauf des Detektionssignals 140 während einer Migration eines Makromoleküls durch eine Pore dargestellt, wie es anhand von Fig. 1 beschrieben ist.
Zu einem ersten Zeitpunkt 220 weist der Verlauf des Detektionssignals 140 eine Änderung auf, die als eine erste Signaländerung 210 detektierbar ist, und die den Eintritt des Makromoleküls in die Pore repräsentiert. Zu einem zweiten Zeitpunkt 225 weist der Verlauf des Detektionssignals 140 eine weitere Änderung auf, die als eine zweite Signaländerung 215 detektierbar ist, die den Austritt des
Makromoleküls aus der Pore repräsentiert.
Gemäß unterschiedlicher Ausführungsbeispiele weisen die Signaländerungen 210, 215 einander entsprechende Charakteristika auf oder weisen die
Signaländerungen 210, 215 unterschiedliche Charakteristika auf. Insbesondere für den Fall, dass nur eines der Enden des Makromoleküls mit einem
Signalmaterial markiert ist, oder für den Fall, dass beide Enden des
Makromoleküls mit unterschiedlichen Signalmaterialien markiert sind, können die Signaländerungen 210, 215 unterschiedliche Charakteristika aufweisen.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines mikrofluidischen Systems 110 mit einer Pore 115 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das hier im Querschnitt gezeigte mikrofluidische System 110 ähnelt dem anhand von Fig. 1
beschriebenen mikrofluidischem System. Gemäß dem hier gezeigten
Ausführungsbeispiel umfasst das mikrofluidische System 110 die Pore 115, die hier als Nanopore ausgeführt ist und in eine mikrofluidische Umgebung eingebettet ist. Zudem umfasst das mikrofluidische System 110 ein oberes Substrat 305, das eine fluidische Begrenzung nach oben hin darstellt, und ein unteres Substrat 310, das eine fluidische Begrenzung nach unten hin darstellt.
Die Pore 115 ist zwischen dem oberen Substrat 305 und dem unteren Substrat 310 angeordnet. Zudem ist in einem Raum zwischen einer Oberseite der Pore 115 und einer Unterseite des oberen Substrats 305 ein mikrofluidischer Spalt 315 angeordnet, durch den Nukleinsäuren wie das Makromolekül 105 und
Reagenzien zu der Pore 115 transportierbar sind. Hier ist die Pore 115 zudem beispielhaft in einer Vertiefung, einer Kavität, angeordnet. In einem Raum zwischen einer Unterseite der Pore 115 und einer Oberseite des unteren Substrats 310 ist ein weiterer mikrofluidischer Spalt 320 angeordnet, durch den es möglich ist, migrierte Nukleinsäuren wie das Makromolekül 105 nach dem Durchtritt durch die Pore 115, aufgrund eines in dem weiteren mikrofluidischem Spalt 320 einstellbaren Fluidstromes abzutransportieren.
Gemäß dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel umfasst das mikrofluidische System 110 zudem die optische Erfassungseinrichtung 135 und eine
Anregungseinrichtung 325, die hier als Anregungslichtquelle ausgeführt ist. Die Anregungseinrichtung 325 ist ausgebildet, ein Anregungssignal in den Bereich der Pore 115 auszusenden. Mittels des Anregungssignals ist beispielsweise der Bereich der Pore 115 beleuchtbar. Alternativ ist auch ein mit einem
Signalmaterial 330 markiertes freies Ende des Makromoleküls 105 mittels des Anregungssignals anregbar. Die Anregungseinrichtung 325 ist auch als Teil der obenstehend beschriebenen Vorrichtung ausführbar.
Zudem umfasst das mikrofluidische System 110 gemäß dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel eine Spannungsquelle 335. Die Spannungsquelle 335 ist ausgebildet, an zwei an gegenüberliegenden Seiten der Pore 115 angeordnete Bereiche 340, 341 eine elektrische Spannung anzulegen, um einen Durchtritt des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 zu bewirken. Die beiden Bereiche 340, 341 weisen je eine Elektrode auf, um mittels der Spannungsquelle 335 das Anlegen eines Gleichfeldes und zusätzlich oder alternativ eines Wechselfeldes für den Transport des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 zu ermöglichen. Der erste Bereich 340 ist an der Unterseite des oberen Substrats 305
angeordnet, und der zweite Bereich 341 ist an der Oberseite des unteren Substrats 310 angeordnet. Auch die hier gezeigte Anordnung der Spannungsquelle 335 mit dem beiden Bereichen 340, 341 und den Elektroden in den Bereichen 340, 341 ist als Teil der Vorrichtung 100 ausführbar.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist das mikrofluidische System 110 ein Substrat, beispielsweise ein Kunststoffsubstrat auf, in dem die mikrofluidischen Spalte 315, 320 ausgeformt sind. Die Spalte 315, 320 sind gemäß einem
Ausführungsbeispiel Teil eines Systems aus Kanälen und Kammern, das in dem Substrat des mikrofluidischen Systems 110 ausgeformt ist. Ein Abschnitt eines solchen Spalts 315, 320 kann beispielsweise einen Kanal oder eine Kammer ausformen. Die Spalte 315, 320 sind gemäß einem Ausführungsbeispiel an zumindest einer Stelle durch eine dünne Schicht 350 voneinander getrennt. Die Schicht 350, beispielsweise aus einem Dünnschichtmaterial, weist beispielsweise eine Dicke von weniger als 200 Nanometern, weniger als 100 Nanometern, weniger als 50 Nanometern oder weniger als 10 Nanometern auf. Eine Länge der Pore 115 entspricht gemäß einem Ausführungsbeispiel einer Dicke der Schicht 350. In dem mikrofluidischen System 110 kann eine die zu vermessenden Makromoleküle 105 umfassende Flüssigkeitsmenge von wenigen Pikolitern oder wenigen Mikrolitern bevorratet sein. Während eines Analysevorgangs, während dem Makromoleküle 105 zum Erfassen der Länge durch die Pore 115 migrieren, können sich in der Flüssigkeitsmenge befindliche Makromoleküle 105
beispielsweise aufgrund eines anliegenden elektrischen Felds, aufgrund von Kapillarkräften oder aufgrund eines Druckunterschieds durch die Pore 115 bewegen. Die Schicht 350 kann die eine Pore 115 oder mehrere benachbart zueinander angeordnete Poren umfassen. Gemäß einem Ausführungsbeispiel umfasst das mikrofluidische System 110 eine Reaktionskammer in der eine Markierung der Makromoleküle 105 erfolgen kann. Dazu kann beispielsweise ein Signalmaterial in die Reaktionskammer geleitet werden. Eine solche Markierung kann erfolgen, bevor die Makromoleküle die Schicht 350 erreichen.
Die Figuren 4 a bis 4 e zeigen eine schematische Darstellung eines Durchtritts eines Makromoleküls 105 durch eine Pore 115 gemäß einem
Ausführungsbeispiel. Dabei kann es sich um eine Pore handeln, wie sie anhand der vorangegangenen Figuren beschrieben ist. Es ist je beispielhaft ein Stadium des Durchtritts des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 gezeigt. Gemäß dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel ist das Makromolekül 105 eine Nukleinsäure, die mit dem Signalmaterial 330, hier einem Fluorophor (FITY, ATTO- Farbstoffe, HEX, CY- Farbstoffe, aber auch Quantendots), markiert ist. Der Bereich der Pore 115 wird mit der Anregungslichtquelle illuminiert. Dabei sind Anregungslichtfilter verwendbar, damit der eingesetzte Signalgeber, das Signalmaterial 330, mit der entsprechenden Wellenlänge angeregt wird. Zudem ist die elektrische Spannung zwischen den Elektroden, die an den zwei an gegenüberliegenden Seiten der Pore 115 angeordnet Bereichen sind, angelegt, wie beispielsweise anhand von Fig. 3 gezeigt, um ein Einfädeln des Makromoleküls 105 zu bewirken. Sobald das Signalmaterial 330, hier das Fluorophor, mittels der optischen
Erfassungseinrichtung, beispielsweise der Fluoreszenzkamera, detektiert wird, wird dieser Zeitpunkt abgespeichert. Während der gesamten Durchtrittszeit wird unter Verwendung der Detektionseinrichtung das Signal gemessen, um die erste und zweite Signaländerung zu detektieren. Dadurch, dass der mikrofluidische Spalt unterhalb der Pore 115 während der Migrationsphase von einem Fluid durchströmt wird, wird der bereits durch die Pore 115 migrierte Teil des
Makromoleküls 105 in Flussrichtung transportiert, bis das Makromolekül 105 die Pore 115 komplett durchquert hat. Jetzt wird das Makromolekül 105 von dem Fluid mitgerissen, und es wird kein Signal mehr im Bereich der Pore 115 detektiert. Aufgrund der zeitlichen Differenz zwischen Eintritts- und
Austrittszeitpunkt lässt sich mithilfe einer Kalibrationstabelle, in der Länge und Durchtrittszeit korreliert werden, die Länge des migrierten Makromoleküls 105 bestimmen.
Fig. 4a zeigt wie bereits ausgeführt das Makromolekül 105 kurz vor dem
Einfädeln in die Pore 115.
Fig. 4b zeigt ein Stadium des Durchtritts, in dem das Signalmaterial 330 bereits durch die Pore 115 hindurchgetreten ist, das Makromolekül 105 jedoch noch nicht.
Fig. 4c zeigt den Durchtritt eines ersten Teils des Makromoleküls 105 durch die Pore 115. Dabei ist unterhalb der Pore 115 in dem mikrofluidischen Spalt ein Fluidstrom vorhanden, der das Makromolekül 105 mit dem Signalmaterial 330 von der Pore 115 wegtransportiert beziehungsweise in Flussrichtung linearisiert. Fig. 4d zeigt das Makromolekül 105 kurz vor dem Austritt aus der Pore 115.
Fig. 4e zeigt das Makromolekül 105 kurz nach dem Austritt aus der Pore 115.
Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Makromoleküls 105 mit markierten freien Enden gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das Makromolekül 105 ist auch hier eine Nukleinsäure. An einem freien Ende weist das
Makromolekül hier das Signalmaterial 330 auf, und an einem weiteren freien Ende weist das Makromolekül 105 ein weiteres Signalmaterial 505 auf.
Entsprechend ist das hier gezeigte Makromolekül 105 an beiden Enden mit einem Signalgeber gelabelt. Dies hat den Vorteil, dass der Eintritt des freien Endes mit dem Signalmaterial 330, beispielsweise Fluorophor, oder dem weiteren Signalmaterial 505 detektiert wird, unabhängig davon, mit welchem Ende das Makromolekül 105 zuerst in die Pore 115 einfädelt. Die Signalgeber in Form des Signalmaterials 330 und des weiteren Signalmaterials 505 emittieren dabei im gleichen oder in verschiedenen Wellenlängenbereichen. Wenn das Makromolekül an dem einen freien Ende das Signalmaterial 330 und an dem anderen freien Ende das sich von dem Signalmaterial 330 unterscheidende weitere Signalmaterial 505 aufweist, ist somit die Richtung des Durchtritts des Makromoleküls 105 durch die Pore 115 bestimmbar. Vorteilhafterweise ist dazu detektionsseitig kein Signalverstärkungsmechanismus erforderlich. Alternativ dazu ist die Verwendung eines zusätzlichen Signalverstärkungsmechanismus möglich. In diesem Fall ist der Signalgeber, also das Signalmaterial 330 oder das weitere Signalmaterial 505 kein Fluorophor, sondern ein molekularer
Signalverstärker, beispielsweise eine Meerettichperoxidase in Kombination mit einer oder mehrerer der folgenden signalgebenden Substanzen: TMB
(Tetramethylbenzidin), OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride), ABTS (2,2' - Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure), Luminol, oder eine alkalische Phosphatase in Kombination mit einer oder mehrerer der folgenden
signalgebenden Substanzen: Fast Red TR, Naphtol-AS-MX-Phosphat, BCIP (5- Bromo- 4-Chloro-3-lndolyl Phosphate), NBT (Nitroblue Tetrazolium). Das Signalmaterial 330 oder das weitere Signalmaterial 505 ist in diesem Fall also ein Enzym, das eine signalgebende Reaktion katalysiert. Wenn das Makromolekül 105, also eine so gelabelte Nukleinsäure, durch die Pore 115 hindurchtritt, und das den Bereich unterhalb der Pore 115 durchströmende Fluid eine signalgebende Substanz wie eine der obengenannten signalgebenden
Substanzen, dann katalysiert der molekulare Signalverstärker des
Signalmaterials 330 oder des weiteren Signalmaterials 505 den Stoffumsatz der signalgebenden Substanz, was zu einem optisch detektierbaren Signal führt. Je nach Ausführung der signalgebenden Substanz, beispielsweise bei Luminol, lässt sich dabei auf die Anregungslichtquelle verzichten werden, da Luminol zu einer Chemolumineszenz führt. Dies reduziert die Komplexität eines
Auslesegerätes. Vorteilhafterweise führt eine Verwendung von Signalverstärkern als das Signalmaterial 330 oder das weitere Signalmaterial 505 gegenüber dem Einsatz von Fluorophoren als das Signalmaterial 330 oder das weitere
Signalmaterial 505 zu stärker detektierbaren Signalen, was Anforderungen an eine Sensitivität des Detektionssystems verringert.
Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung eines Makromoleküls 105 und einer Pore 115 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Gemäß dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel ist die Pore 115 in einem Dünnschichtmaterial 605 ausgeformt. Das Dünnschichtmaterial 605 ist dazu ausgebildet, evaneszente Wellen zu transportieren. Das Dünnschichtmaterial 605 ist beispielsweise Platin mit einer Schichtdicke zwischen einem und zweihundert Nanometer,
insbesondere zwischen zwei und einhundert Nanometer. Zusätzlich ist es möglich, beispielsweise über ein Prisma, elektromagnetische Strahlung in das Dünnschichtmaterial 605 einzukoppeln, was zu einer Migration eines
evaneszenten Feldes in dem Dünnschichtmaterial 605, und damit auch zu einer Ausformung des evaneszenten Feldes im Bereich der Pore 115 führt.
Vorteilhafterweise erfolgt die Anregung des Signalmaterials 330, hier ein Fluorophor oder ein Quantendot, durch Wechselwirkung des evaneszenten Feldes mit dem Signalgeber, dem Signalmaterial 330 lokal, wodurch
unerwünschte Streulichteffekte oder Eigenfluoreszenzsignale von Materialen des mikrofluidischen Systems minimiert werden. Dies ermöglicht eine sensitivere Detektion von Signalgebern wie dem Signalmaterial 330 an migrierenden Nukleinsäuren wie dem hier gezeigten Makromolekül 105. Somit kann das evaneszente Feld oder ein von dem Signalgeber ausgegebenes Signal als Anregungssignal aufgefasst werden. Fig. 7 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 700 zum optischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls, insbesondere einer Nukleinsäure, gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das Verfahren 700 erfolgt unter Verwendung einer Pore in einem mikrofluidischen System. Das Verfahren 700 weist zumindest einen Schritt 705 des Einlesens, einen Schritt 710 des Detektierens und einen Schritt 715 des Bestimmens auf. Im Schritt 705 des Einlesens wird über eine Schnittstelle zu einer optischen Erfassungseinrichtung ein Detektionssignal eingelesen. Die optische Erfassungseinrichtung weist einen auf die Pore ausgerichteten Erfassungsbereich auf, um Licht aus einem Bereich der Pore zu erfassen. Das Detektionssignal repräsentiert eine Lichtcharakteristik des Lichts. Im Schritt 710 des Detektierens wird ein erster Zeitpunkt einer ersten
Signaländerung des Detektionssignals detektiert. Die erste Signaländerung repräsentiert einen Eintritt des Makromoleküls in die Pore. Zudem wird im Schritt des Detektierens ein zweiter Zeitpunkt einer zweiten Signaländerung des Detektionssignals detektiert. Die zweite Signaländerung repräsentiert einen Austritt des Makromoleküls aus der Pore. Im Schritt 715 des Bestimmens wird unter Verwendung der des ersten Zeitpunkts und des zweiten Zeitpunkts die Länge des Makromoleküls bestimmt.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren zudem einen Schritt 720 des Markierens. Im Schritt 720 des Markierens wird ein freies Ende des Makromoleküls mit einem Signalmaterial markiert. Im Schritt 710 des
Detektierens repräsentiert die erste Signaländerung dann einen Eintritt des markierten Endes des Makromoleküls in die Pore oder die zweite
Signaländerung repräsentiert einen Austritt des markierten Endes des
Makromoleküls aus der Pore. Der Schritt 720 des Markierens ist optional vor dem Schritt 705 des Einlesens oder vor dem Schritt 710 des Detektierens
durchführbar.
Im Schritt 720 des Markierens wird gemäß einem Ausführungsbeispiel zudem ein weiteres freies Ende des Makromoleküls mit dem Signalmaterial oder einem weiteren Signalmaterial markiert. In diesem Fall repräsentiert die erste
Signaländerung im Schritt 710 des Detektierens einen Eintritt eines der markierten Enden des Makromoleküls in die Pore und die zweite Signaländerung repräsentiert einen Austritt eines anderen der markierten Enden des
Makromoleküls aus der Pore.
Wenn im Schritt 720 des Markierens das weitere freie Ende des Makromoleküls mit dem weiteren Signalmaterial markiert wird, umfasst das Verfahren 700 gemäß einem Ausführungsbeispiel zudem einen Schritt 725 des Erkennens. Im Schritt 725 des Erkennens wird ein Durchtritt des Makromoleküls durch die Pore mit dem mit dem Signalmaterial markierten Ende voran erkannt, wenn die erste Signaländerung den Eintritt des mit dem Signalmaterial markierten Endes in die Pore repräsentiert, oder es wird ein Durchtritt des Makromoleküls durch die Pore mit dem mit dem weiteren Signalmaterial markierten Ende voran erkannt, wenn die erste Signaländerung den Eintritt des mit dem weiteren Signalmaterial markierten Endes in die Pore repräsentiert. Der Schritt 725 des Erkennens ist optional nach dem Schritt 720 des Markierens durchführbar.
Das Verfahren 700 weist gemäß einem Ausführungsbeispiel zudem einen Schritt 730 des Erfassens auf. Im Schritt 730 des Erfassens wird unter Verwendung der optischen Erfassungseinrichtung das Licht aus dem Bereich der Pore erfasst.
Der Schritt 730 ist optional vor dem Schritt 705 des Einlesens ausführbar.
Zudem umfasst das Verfahren 700 gemäß einem Ausführungsbeispiel einen weiteren optional vor dem Schritt 705 des Einlesens durchführbaren Schritt: Den Schritt 735 des Aussendens. Im Schritt 735 des Aussendens wird ein
Anregungssignal in den Bereich der Pore ausgesendet, beispielsweise um ein Illuminieren des Bereichs der Pore zu erreichen, oder um ein Signalmaterial eines durch die Pore migrierenden Makromoleküls anzuregen.
Ferner weist das Verfahren 700 gemäß einem Ausführungsbeispiel einen Schritt 740 des Anlegens auf. Im Schritt 740 des Anlegens wird eine elektrische Spannung an zwei an gegenüberliegenden Seiten der Pore angeordnete Bereiche angelegt, um einen Durchtritt des Makromoleküls durch die Pore zu bewirken. Auch der Schritt 740 des Anlegens ist vor dem Schritt 705 des Einlesens ausführbar. Das Verfahren 700 ist unter Verwendung eines Ausführungsbeispiels der obenstehend genannten Vorrichtung ausführbar.
Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine„und/oder“-Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das
Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren (700) zum optischen Erfassen einer Länge eines
Makromoleküls (105), insbesondere einer Nukleinsäure, unter
Verwendung einer Pore (115) in einem mikrofluidischen System (110), wobei das Verfahren (700) folgende Schritte aufweist:
Einlesen (705) eines Detektionssignals (140) über eine Schnittstelle zu einer optischen Erfassungseinrichtung (135), die einen auf die Pore (115) ausgerichteten Erfassungsbereich (145) aufweist, um Licht aus einem Bereich der Pore (115) zu erfassen, wobei das Detektionssignal (140) eine Lichtcharakteristik des Lichts repräsentiert;
Detektieren (710) eines ersten Zeitpunkts (220) einer ersten
Signaländerung (210) des Detektionssignals (140), wobei die erste Signaländerung (210) einen Eintritt des Makromoleküls (105) in die Pore (115) repräsentiert, und Detektieren eines zweiten Zeitpunkts (225) einer zweiten Signaländerung (215) des Detektionssignals (140), wobei die zweite Signaländerung (215) einen Austritt des Makromoleküls (105) aus der Pore (115) repräsentiert;
Bestimmen (715) der Länge des Makromoleküls (105) unter
Verwendung des ersten Zeitpunkts (220) und des zweiten Zeitpunkts (225).
2. Verfahren (700) gemäß Anspruch 1, mit einem Schritt (720) eines
Markierens eines freien Endes des Makromoleküls (105) mit einem Signalmaterial (330), wobei im Schritt (710) des Detektierens die erste Signaländerung (210) einen Eintritt des markierten Endes des
Makromoleküls (105) in die Pore (115) oder die zweite Signaländerung (215) einen Austritt des markierten Endes des Makromoleküls (105) aus der Pore (115) repräsentiert.
3. Verfahren (700) gemäß Anspruch 2, wobei im Schritt (720) des
Markierens ein weiteres freies Ende des Makromoleküls (105) mit dem Signalmaterial (330) oder einem weiteren Signalmaterial (505) markiert wird, wobei im Schritt (710) des Detektierens die erste Signaländerung (210) einen Eintritt eines der markierten Enden des Makromoleküls (105) in die Pore (115) und die zweite Signaländerung (215) einen Austritt eines anderen der markierten Enden des Makromoleküls (105) aus der Pore (115) repräsentiert.
4. Verfahren (700) gemäß Anspruch 3, wobei im Schritt (720) des
Markierens das weitere freie Ende des Makromoleküls (105) mit dem weiteren Signalmaterial (505) markiert wird, und mit einem Schritt (725) des Erkennens eines Durchtritts des Makromoleküls (105) durch die Pore (115) mit dem mit dem Signalmaterial (330) markierten Ende voran, wenn die erste Signaländerung (210) den Eintritt des mit dem Signalmaterial (330) markierten Endes in die Pore (115) repräsentiert, oder mit dem mit dem weiteren Signalmaterial (505) markierten Ende voran, wenn die erste Signaländerung (210) den Eintritt des mit dem weiteren Signalmaterial (505) markierten Endes in die Pore (115) repräsentiert.
5. Verfahren (700) gemäß Anspruch 4, wobei im Schritt (720) des
Markierens das weitere Signalmaterial (505) ausgebildet ist, um das Licht in einer sich von dem Signalmaterial (330) unterscheidenden Wellenlänge zu emittieren, wobei im Schritt (725) des Erkennens zwischen der von dem Signalmaterial (330) und der von dem weiteren Signalmaterial (505) emittierten Wellenlänge unterschieden wird.
6. Verfahren (700) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einem Schritt (730) des Erfassens des Lichts aus dem Bereich der Pore (115) unter Verwendung der optischen Erfassungseinrichtung (135).
7. Verfahren (700) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einem Schritt (735) des Aussendens eines Anregungssignals in den Bereich der Pore (115).
8. Verfahren (700) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einem Schritt (740) des Anlegens einer elektrischen Spannung an zwei an gegenüberliegenden Seiten der Pore (115) angeordnete Bereiche (340, 341), um einen Durchtritt des Makromoleküls (105) durch die Pore (115) zu bewirken.
9. Vorrichtung (100), die eingerichtet ist, um die Schritte des Verfahrens (700) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche in
entsprechenden Einheiten (120, 125, 130) auszuführen und/oder anzusteuern.
10. Computerprogramm, das dazu eingerichtet ist, das Verfahren (700) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche auszuführen und/oder anzusteuern.
11. Maschinenlesbares Speichermedium, auf dem das Computerprogramm nach Anspruch 10 gespeichert ist.
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