WO2020149598A1 - 약물을 포함하는 나노입자의 제조방법 - Google Patents

약물을 포함하는 나노입자의 제조방법 Download PDF

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dspe
peg
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cancer
dolastatin
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노승권
김진수
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(주)한돌바이오텍
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing nanoparticles containing a drug.
  • the drug delivery system using nanotechnology improves solubilization and absorption of drugs through small particles of nano-scale, improves the efficiency of drugs acting on diseased areas, and reduces side effects, so it can reduce many side effects, including anticancer drugs. It is applied to the development of soluble drugs.
  • the nanoparticles When delivered into a blood vessel, the nanoparticles are not removed by renal filtration or removed by the mononuclear phagocyte system (MPS) or reticuloendothelial system (RES), more efficiently. Can be delivered.
  • MPS mononuclear phagocyte system
  • RES reticuloendothelial system
  • Drug delivery systems to which such nanotechnology is applied include organic nanoparticles such as polymers and dendrimers, inorganic nanoparticles such as iron oxide or gold nanoparticles, fullerene or carbon nanotubes based on carbon, and liposomes, micelles, and the like. And nanoparticles made of the same phospholipid.
  • biodegradable polymers are mainly used rather than non-biodegradable polymers.
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid), poly(lactic-co-glycolic acid)
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid), poly(lactic-co-glycolic acid)
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid), poly(lactic-co-glycolic acid)
  • Dolastatin is a peptide isolated from Dolabella auricularia in the Indian Ocean and is classified into dolastatin 10 and dolastatin 15.
  • the bioactivity of dolastatin 10 is a tubulin inhibitor such as taxane and vinca alkaloid, but is a structurally different peptide (Chem. Ind., 1999, 51-55; Curr. Pharm. Des. , 1999, 5, 139-162).
  • Dolastatin 10 has been shown to show strong anticancer activity against various human tumors in cell experiments and animal model experiments through preclinical studies.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing nanoparticles containing a drug.
  • Another object of the present invention is to provide a nanoparticle containing a drug prepared by the above manufacturing method.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising nanoparticles containing a drug prepared by the above-described preparation method as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preparing nanoparticles comprising a drug comprising the following steps: 1) an oily solution comprising a drug and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Preparing a; 2) preparing a water-phase solution comprising lecithin, DSPE-PEG (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) and DSPE-PEG attached with a cancer cell target substance; And 3) mixing the oil phase solution prepared from step 1) and the water phase solution prepared from step 2) to obtain nanoparticles.
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid)
  • the present invention provides nanoparticles comprising a drug prepared by the above manufacturing method.
  • the present invention includes nanoparticles containing a drug prepared by the above-described preparation method as an active ingredient, and the drug provides 10 pharmaceuticals for preventing or treating cancer, dolastatin 10.
  • the method for preparing nanoparticles according to the present invention comprises a drug that exhibits excellent anticancer activity against cancer cells while being less toxic to normal cells by mixing DSPE-PEG and DSPE-PEG attached with a cancer cell target substance in an optimized ratio. Since nanoparticles can be prepared, it can be usefully used as a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer.
  • FIG. 2 is a flow chart showing a process for preparing nanoparticles containing dolastatin 10.
  • Figure 5 is a result of measuring the size and dispersion of the nanoparticles according to the microfluidizer (microfludizer) pressure.
  • FIG. 7 is a diagram showing nanoparticles to which folate (FA) and RGD tripeptide, which are cancer cell target substances, are attached.
  • FA folate
  • RGD tripeptide which are cancer cell target substances
  • FIG. 11 shows the results of measuring the zeta potential and scattering intensity of nanoparticles according to the ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) to which DSPE-PEG:RGD tripeptide is attached.
  • 15 is a result of measuring the zeta potential and scattering intensity of nanoparticles according to the ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) to which DSPE-PEG:RGD tripeptide is contained and contains dolastatin 10.
  • 16 is a result of measuring the cell viability of HEK293 cells of nanoparticles according to the ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with DSPE-PEG:folate attached with dolastatin 10:
  • DSPE-PEG The ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with folic acid attached is 60:0;
  • -FA 50:10 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 50:10;
  • FA 45:15 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 45:15;
  • -FA 40:20 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 40:20.
  • DSPE-PEG The ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with folic acid attached is 60:0;
  • -FA 50:10 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 50:10;
  • FA 45:15 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 45:15;
  • -FA 40:20 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 40:20.
  • DSPE-PEG The ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with folic acid attached is 60:0;
  • -FA 50:10 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 50:10;
  • FA 45:15 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 45:15;
  • -FA 40:20 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA is 40:20.
  • -RGD 60:0 The ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) to which the DSPE-PEG:RGD tripeptide is attached is 60:0;
  • -RGD 50:10 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 50:10;
  • -RGD 48:12 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 48:12;
  • -RGD 45:15 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 45:15;
  • -RGD 40:20 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 40:20.
  • -RGD 60:0 The ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) to which the DSPE-PEG:RGD tripeptide is attached is 60:0;
  • -RGD 50:10 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 50:10;
  • -RGD 48:12 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 48:12;
  • -RGD 45:15 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 45:15;
  • -RGD 40:20 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 40:20.
  • FIG. 21 shows the results of measuring selectivity to cancer cells of nanoparticles according to the ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) to which DSPE-PEG:RGD tripeptide is contained and contains dolastatin 10:
  • -RGD 60:0 The ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) to which the DSPE-PEG:RGD tripeptide is attached is 60:0;
  • -RGD 50:10 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 50:10;
  • -RGD 48:12 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 48:12;
  • -RGD 45:15 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 45:15;
  • -RGD 40:20 The ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD is 40:20.
  • Figure 22 shows the collection efficiency of nanoparticles according to the ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with DSPE-PEG:folic acid attached to dolastatin 10.
  • FIG. 24 shows the efficiency of containing nanoparticles according to the ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA or DSPE-PEG-RGD) containing dolastatin 10 and attached to a cancer cell target material:
  • -DSPE-PEG nanoparticles without cancer cell targets attached
  • DSPE-PEG nanoparticles with a mixing ratio of 40:20 of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with folic acid attached;
  • -RGD 45:15 Nanoparticles with a mixing ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) with DSPE-PEG:RGD tripeptide attached at 45:15.
  • FIG. 25 is a photomicrograph confirming the cell permeation of nanoparticles comprising dolastatin 10 and DSPE-PEG attached to a cancer cell target material:
  • -DSPE-PEG nanoparticles without cancer cell targets attached
  • -DSPE-PEG-RGD (45:15): Nanoparticles in which the mixing ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) with DSPE-PEG:tripeptide is 45:15.
  • DSPE-PEG-FA (40:20): DSPE-PEG: Nanoparticles with a mixing ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with folic acid attached at 45:15.
  • DSPE-PEG nanoparticles with a mixing ratio of 40:20 of DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA) with folic acid attached;
  • -RGD 45:15 Nanoparticles with a mixing ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) with DSPE-PEG:RGD tripeptide attached at 45:15.
  • the present invention provides a method for producing nanoparticles comprising a drug comprising the following steps: 1) preparing an oily solution comprising a drug and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA); 2) preparing a water-phase solution comprising lecithin, DSPE-PEG (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) and DSPE-PEG attached with a cancer cell target substance; And 3) mixing the oil phase solution prepared from step 1) and the water phase solution prepared from step 2) to obtain nanoparticles.
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid)
  • the molecular weight of PLGA in step 1) may be 5,000 to 15,000, but is not limited thereto.
  • PLGA may be Resomer® RG 502 H (719897 CAS Number: 26780-50-7) purchased from Sigma-Aldrich.
  • Lecithin of step 2) may be a compound represented by the following formula (1), specifically, the molecular weight of the lecithin may be 300 to 800.
  • R or R' may be fatty acid residues such that the molecular weight of lecithin is in the range of 300 to 800.
  • DSPE-PEG (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) of step 2) may be a compound represented by the following Chemical Formula 2, n of the Chemical Formula 2 may be 41 to 50 have. Specifically, n in the following Chemical Formula 2 may be adjusted such that the molecular weight of DSPE-PEG is in the range of 1,500 to 2,500.
  • the cancer cell target material of step 2) includes folate, RGD tripeptide consisting of the amino acid sequence of Arg-Gly-Asp, NGR tripeptide consisting of the amino acid sequence of Asn-Gly-Arg, and transferrin. It may be any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the cancer cell target material may be folate or RGD tripeptide consisting of the amino acid sequence of Arg-Gly-Asp.
  • the folic acid can bind to the folate receptor on the surface of cancer cells, and the RGD tripeptide can bind to the ⁇ v ⁇ 3 integrin receptor overexpressed in tumor cells.
  • DSPE-PEG attached to folic acid, a cancer cell target material may be a compound represented by the following Chemical Formula 3
  • DSPE-PEG attached to an RGD tripeptide may be a compound represented by the following Chemical Formula 4.
  • the cancer cell target material of step 2) is folic acid, and DSPE-PEG of step 2) and DSPE-PEG with folic acid attached may be mixed in a ratio of 1 to 2.8:1, specifically It may be mixed in a ratio of 1.5 to 2.5:1.
  • the cancer cell target material in step 2) is an RGD tripeptide consisting of the amino acid sequence of Arg-Gly-Asp, and the DSPE-PEG and DSPE-PEG attached to the RGD tripeptide in step 2) are 2.2 to 3.8:1. It may be mixed in a ratio of, specifically, may be mixed in a ratio of 2.5 to 3.5:1.
  • the nanoparticles prepared in the above range of ratio conditions can exhibit excellent anti-cancer activity against cancer cells while showing little toxicity to normal cells.
  • the drug may be dolastatin 10, but is not limited thereto as long as it can be included in the nanoparticles prepared by the method.
  • the concentration of PLGA in step 1) may be 3.5 to 9 mg/ml, specifically 5 to 8 mg/ml. In the range of the concentration conditions of the PLGA, nanoparticles exhibiting a uniform and stable particle distribution can be obtained.
  • the size of the nanoparticles containing dolastatin 10 prepared according to the present invention may be 80 to 110 nm. In the range of the size conditions of the nanoparticles, the loading rate of the drug is excellent and it is possible to easily penetrate cancer cells.
  • the step of mixing the oily solution and the aqueous solution of step 3) may further include the step of treating ultrasound.
  • the ultrasonic treatment may be performed for 5 to 25 minutes, and more specifically, for 10 to 20 minutes.
  • the step of mixing the oil phase solution and the aqueous solution of step 3) may further include the step of nanoscopy with a ultrasonicizer and ultrasonic treatment.
  • the pressure of the microfluidizer may be 5,000 to 15,000 psi, specifically 8,000 to 12,000 psi. In the range of the pressure condition of the microfluidizer, small and stable nanoparticles can be obtained.
  • the method may further include the step of treating and diluting ultrasonic waves after mixing the oil phase solution and the water phase solution of step 3).
  • the diluting step may be to dilute so that the final concentration of dolastatin 10 is 10 to 90 ng/ml, specifically 20 to 80 ng/ml.
  • Dolastatin 10 in the concentration range may exhibit excellent anti-cancer activity against cancer cells with little toxicity to normal cells.
  • 200 ⁇ g/ml of dolastatin 10 stock solution is added to a PLGA oil solution at a concentration of 20/3 mg/ml, and mixed with an aqueous solution to form nano containing dolastatin 10
  • the collection efficiency of dolastatin 10 in the prepared nanoparticles was measured, and the concentration of dolastatin 10 was diluted to 25, 50, and 75 ng/ml.
  • the nanoparticles prepared in the range of the concentration condition of dolastatin 10 may exhibit excellent anti-cancer activity against cancer cells with little toxicity to normal cells.
  • the present inventors measured the cytotoxicity and anticancer activity of free dolastatin 10 itself, and as a result, exhibited excellent anticancer activity against skin cancer cells while having less cytotoxicity against normal cells. Determining the content of dolastatin 10 (75 ng/ml or less) (see FIG. 1), and observing the properties of the nanoparticles prepared according to the PLGA concentration, it has a small nanoparticle size, uniform particle distribution and stable particles The content of PLGA (6.67 mg/ml) that could be characterized was determined (see Figures 3 and 4).
  • the present inventors adjusted the ratio of DSPE-PEG to which DSPE-PEG and cancer cell target material (folic acid and/or RGD tripeptide) are attached when preparing nanoparticles, and the nanoparticles of the present invention are small regardless of the ratio. While maintaining the size, it was confirmed that it exhibits uniform particle distribution and stable particle characteristics (see FIGS. 7 to 11 ).
  • the present inventors adjusted the ratio of DSPE-PEG to which the DSPE-PEG and cancer cell target material (folic acid or RGD tripeptide) were attached when preparing the nanoparticles of the present invention, DSPE-PEG: DSPE- attached to folic acid
  • DSPE-PEG: DSPE- attached to folic acid When the ratio of PEG (DSPE-PEG-FA) is 40:20 and the ratio of DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD) with DSPE-PEG:RGD tripeptide is 45:15, normal cells It was confirmed that it has excellent anti-cancer activity against skin cancer cells while being less toxic and is absorbed into the cells (see FIGS. 12 to 21, 25 and 26).
  • the nanoparticles produced by the production method of the present invention can be usefully used as a composition for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides nanoparticles comprising a drug prepared by the method of the present invention.
  • the nanoparticles can be prepared according to the method as described above.
  • the nanoparticles containing the drug comprises: 1) preparing an oil phase solution containing the drug and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA); 2) preparing a water-phase solution comprising lecithin, DSPE-PEG (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) and DSPE-PEG attached with a cancer cell target substance; And 3) mixing the oil phase solution prepared from step 1) and the water phase solution prepared from step 2) to obtain nanoparticles.
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid)
  • the cancer cell target material is composed of folate, RGD tripeptide consisting of the amino acid sequence of Arg-Gly-Asp, NGR tripeptide consisting of the amino acid sequence of Asn-Gly-Arg, and transferrin. It may be any one or more selected from the group, but is not limited thereto. More specifically, the cancer cell target material may be folate or RGD tripeptide consisting of the amino acid sequence of Arg-Gly-Asp.
  • the DSPE-PEG and DSPE-PEG with folic acid attached may be mixed in a ratio of 1 to 2.8:1, specifically 1.5 to 2.5:1.
  • the DSPE-PEG and the DSPE-PEG to which the RGD tripeptide is attached may be mixed in a ratio of 2.2 to 3.8:1, and specifically 2.5 to 3.5:1.
  • the nanoparticles prepared in the above range of ratio conditions can exhibit excellent anti-cancer activity while exhibiting little toxicity to normal cells.
  • the drug may be dolastatin 10, but is not limited thereto as long as it can be included in the nanoparticles prepared by the method.
  • the concentration of PLGA in step 1) may be 3.5 to 9 mg/ml, specifically 5 to 8 mg/ml. In the range of the concentration conditions of the PLGA, nanoparticles exhibiting a uniform and stable particle distribution can be obtained.
  • the size of the nanoparticles containing dolastatin 10 prepared according to the present invention may be 80 to 110 nm. In the range of the size conditions of the nanoparticles, the loading rate of the drug is excellent and it is possible to easily penetrate cancer cells.
  • the step of mixing the oily solution and the aqueous solution of step 3) may further include the step of treating ultrasound.
  • the ultrasonic treatment may be performed for 5 to 25 minutes, and more specifically, for 10 to 20 minutes.
  • the step of mixing the oil phase solution and the aqueous solution of step 3) may further include the step of nanoscopy with a ultrasonicizer and ultrasonic treatment.
  • the pressure of the microfluidizer may be 5,000 to 15,000 psi, specifically 8,000 to 12,000 psi. In the range of the pressure condition of the microfluidizer, small and stable nanoparticles can be obtained.
  • the method may further include the step of treating and diluting ultrasonic waves after mixing the oil phase solution and the water phase solution of step 3).
  • the diluting step may be to dilute so that the final concentration of dolastatin 10 is 10 to 90 ng/ml, specifically 20 to 80 ng/ml.
  • Dolastatin 10 in the concentration range may exhibit excellent anti-cancer activity against cancer cells with little toxicity to normal cells.
  • 200 ⁇ g/ml of dolastatin 10 stock solution is added to a PLGA oil solution at a concentration of 20/3 mg/ml, and mixed with an aqueous solution to form nano containing dolastatin 10
  • the collection efficiency of dolastatin 10 in the prepared nanoparticles was measured, and the concentration of dolastatin 10 was diluted to 25, 50, and 75 ng/ml.
  • the present invention includes the nanoparticles prepared by the production method of the present invention as an active ingredient, the drug is dolastatin 10, provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • the nanoparticles can be prepared according to the method as described above.
  • the cancer may be skin cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, cervical cancer, bladder cancer or blood cancer, but is not limited thereto as long as it is a kind of cancer that can be treated with dolastatin 10.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain 10 to 95% by weight of nanoparticles as an active ingredient relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more active ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the active ingredients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a carrier, diluent, excipient, or mixture thereof conventionally used in biological agents.
  • a carrier Any pharmaceutically acceptable carrier can be used as long as it is suitable for delivering the composition in vivo.
  • the carrier is Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc., a saline solution, sterile water, Ringer's solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, or a mixture thereof.
  • conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents and the like can be added as necessary.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are usually used may be added.
  • composition of the present invention may be formulated as an oral preparation or parenteral preparation.
  • Oral formulations may include solid and liquid formulations.
  • the solid preparation may be a tablet, pill, powder, granule, capsule or troche, and the solid preparation may be prepared by adding at least one excipient to the composition.
  • the excipient may be starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin or a mixture thereof.
  • the solid formulation may include a lubricant, for example, magnesium stearate, talc, and the like.
  • the liquid formulation may be a suspending agent, an intravenous solution, an emulsion, or a syrup.
  • the liquid formulation may include excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives.
  • the parenteral preparation may include injections, suppositories, respiratory inhalation powders, spray aerosols, powders and creams.
  • the injection may include a sterilized aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension solvent, an emulsion, and the like.
  • a non-aqueous solvent or a suspension solvent vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol, and olive oil, or injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally depending on the desired method.
  • Parenteral administration can include intraperitoneal, rectal, subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrathoracic injection.
  • the composition can be administered in a pharmaceutically effective amount. This may vary depending on the type of disease, severity, drug activity, patient sensitivity to the drug, administration time, route of administration, duration of treatment, and drugs used simultaneously. However, for a desired effect, the amount of active ingredient contained in the pharmaceutical composition according to the present invention may be 0.0001 to 1,000 mg/kg, specifically 0.001 to 500 mg/kg. The administration can be several times a day.
  • composition of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents.
  • administration can be sequential or simultaneous.
  • HEK293 cells obtained from the Korean Cell Line Bank were inoculated into Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) medium supplemented with 1% penicillin-streptomycin and 10% inactivated FBS, and the Korean Cell Line Bank.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the obtained B16F10 cells were inoculated in MEM (Minimum Essential Medium) to which 1% penicillin-streptomycin and 10% inactivated FBS were added, and then cultured in an incubator at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity. .
  • MEM Minimum Essential Medium
  • Attached cells were treated with 0.25% trypsin-EDTA, and the cells were each collected and centrifuged at 1,000 rpm for 3 minutes to obtain cell pellets. 3-4 ml of medium was added to the cell pellet from which the supernatant was removed, resuspended, and then dispensed into a 75 cm 2 T-flask. After 48 hours of incubation, the cells were replaced with fresh medium and suspended cells not attached to the flask surface were removed.
  • HEK293 cells cultured according to Example 1-1 were diluted to a concentration of 5.5 ⁇ 10 4 cells/ml, and cultured by dispensing 180 ⁇ l in 96-well plates. After 24 hours, the cultured cells were treated with free dolastatin 10 by concentration (0 to 250 ng/ml) and incubated for 24 hours, followed by treatment with MTT reagent. After 4 hours, the supernatant was removed by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, and DMSO was treated to solubilize formazan, and absorbance was measured at 540 nm. Cell viability was calculated compared to the control group not treated with dolastatin 10.
  • Dolastatin 10 when treated with 100 ng/ml, showed a cell viability of 69%, and showed cytotoxicity in a concentration-dependent manner (FIG. 1 ).
  • Dolastatin 10 when treated with 75 ng/ml, exhibited a skin cancer cell inhibition rate of about 25% and was confirmed to be able to inhibit cell proliferation depending on concentration. Synthesizing with the results of Examples 1-2, it was determined that the final concentration of dolastatin 10 of PLGA nanoparticles was 75 ng/ml or less with relatively low cytotoxicity and high anticancer activity (FIG. 1).
  • oil solution and lecithin (Lecithin from soybean, CAS NO.8002-43-5 5081-4405, Daejung (DAEJUNG) dissolving PLGA (Resomer®RG 502 H, 719897 CAS Number: 26780-50-7, Sigma Aldrich) )
  • DSPE-PEG DSPE-PEG-NH 2 , DSPE-PEG-Amine CatalogID: 10455 Cat.No LP096005-2K, Biochempeg scientific inc.
  • PLGA 1, 10, 20 or 30 mg was dissolved in 3 ml of acetonitrile to prepare an oil phase solution, and 9 mg of lecithin was added to 4% ethanol and stirred (700 rpm) at 65° C. for sufficient After dissolution, 6 mg of DSPE-PEG was added to prepare a water phase solution.
  • nanoemulsion For the preparation of the nanoemulsion, 3 ml of an oil-phase solution and 10 ml of an aqueous-phase solution were mixed and reacted for 10 minutes, followed by ultrasonic treatment for 15 minutes in a low-temperature water bath (30% of amplitude, 2 minutes after 30 seconds of ultrasonic treatment). VC 505, Vibracell Sonics, Newton, USA). Immediately after sonication, nanofluidize using a microfluidizer (LM20 Microfluidizer High shear fluid processor, Microfluidicscorp, USA), stabilize for 2 hours at room temperature by stirring (600 rpm), and then stir at 65°C for 45 minutes (600 rpm) ) To remove the organic solvent.
  • LM20 Microfluidizer High shear fluid processor Microfluidicscorp, USA
  • nanoparticle size nanoparticle size
  • particle dispersity polydispersity index, PDI
  • scattering intensity using a nanoparticle size analyzer (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Worcestershire, UK). (derived count rate, DCR) and zeta potential.
  • the particle size was in the range of 112 to 136 nm, and there was no significant difference according to the PLGA content.
  • PDI which shows the degree of dispersion of the particle size, is judged to show a uniform particle distribution as it is lowered based on 0.3. All particles showed stable values of 0.3 or less, and there was no significant difference according to the PLGA content.
  • the zeta potential is a value representing the electric charge of the electrical double layer on the surface of the nanoparticle, and is generally determined to be stable as the absolute value is larger based on the absolute value of 30 mV.
  • the zeta potential of the prepared nanoparticles showed a tendency to decrease in absolute value as the PLGA content increased, but it was confirmed that all the particles showed high values of 45 mV or higher in absolute value to form stable particles. In addition, all particles exhibited a negative charge, which is presumed to be due to the carboxyl group of PLGA.
  • the scattering intensity (DCR) of the nanoparticles is a value indicating the intensity of light scattered from the nanoparticles, and is influenced by the number and size of the manufactured nanoparticles. The scattering intensity of the nanoparticles is significantly different according to the PLGA content. Appeared to be missing.
  • PLGA (mg/ml) Particle size (nm) PDI Zeta potential (mV) DCR (kcps) 1/3 128.7 ⁇ 39.6 0.282 ⁇ 0.045 -72.4 ⁇ 1.1 78,489 ⁇ 10,505 10/3 136.2 ⁇ 40.2 0.275 ⁇ 0.036 -60.0 ⁇ 5.6 92,753 ⁇ 8,854 20/3 114.7 ⁇ 8.0 0.299 ⁇ 0.075 -46.8 ⁇ 2.9 81,698 ⁇ 6,100 30/3 111.8 ⁇ 17.3 0.285 ⁇ 0.026 -44.7 ⁇ 1.7 87,221 ⁇ 3,820
  • Nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 2-1-1, except that an oil phase solution was prepared with PLGA at a concentration of 20/3 mg/ml, and the pressure of the microfluidizer was applied at 10,000, 20,000, or 30,000 psi during the nanonization process.
  • an oil phase solution was prepared with PLGA at a concentration of 20/3 mg/ml, and the pressure of the microfluidizer was applied at 10,000, 20,000, or 30,000 psi during the nanonization process. was prepared.
  • the size of the nanoparticles showed a tendency to increase significantly as the pressure increased, and the PDI and zeta potentials were 0.2 or less and an absolute value of 30, respectively. It showed stable value over mV and there was no significant difference according to pressure.
  • the scattering intensity (DCR) tended to increase with increasing pressure, presumably due to the increased particle size.
  • the optimum pressure of the microfluidizer was determined to be 10,000 psi capable of forming small-sized nanoparticles of 70 nm (Tables 2, 5 and 6).
  • Example 2-3 Nanoparticle characterization according to the content of DSPE-PEG-FA or DSPE-PEG-RGD with cancer cell target substance attached
  • Nanoparticles were prepared by varying the content of -PEG (FIG. 7).
  • An oil phase solution was prepared with PLGA at a concentration of 20/3 mg/ml, and DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA (DSPE-PEG-Folic Acid CatalogID: 10462 Cat.No LP096057-2K, Biochempeg scientific inc. ) Is added by adjusting the ratio of 60:0, 50:10, 48:12, 45:15 or 40:20, except that a microfluidizer pressure of 10,000 psi is applied during the nanonization process. Nanoparticles were prepared in the same manner as in 1-1.
  • the size of the nanoparticles increased significantly as the proportion of DSPE-PEG-FA added increased, but 71 to 77 nm Relatively small size was maintained in the range of.
  • the PDI showed a uniform particle distribution of about 0.2, and the zeta potential did not show a significant difference according to the DSPE-PEG-FA ratio condition, and showed a stable particle state.
  • the scattering intensity showed a significant decrease as the DSPE-PEG-FA ratio increased, but did not show a clear tendency (Table 3, FIGS. 8 and 9).
  • Nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 2-1-1.
  • the size of the nanoparticles differed somewhat depending on the proportion of DSEP-PEG-RGD added, but in the range of 67 to 76 nm overall The size of was maintained.
  • the PDI showed a uniform particle distribution of 0.3 or less, and the zeta potential also showed a stable value of 43 mV or more.
  • the scattering intensity shows a tendency to decrease as the DSPE-PEG-RGD ratio increases, and it is estimated that the number of particles formed decreases (Table 4, FIGS. 10 and 11).
  • the mixing ratio of DSPE-PEG-FA and DSPE-PEG-RGD did not show a distinct change in nanoparticle properties. Under all conditions, a particle size of about 80 nm or less and a uniform particle distribution of PDI 0.3 or less were exhibited, and the zeta potential also exhibited stable particle characteristics with an absolute value of 30 mV or more.
  • dolastatin 10 trifluoroacetate (dolastatin-10 trifluoroacetate, Cat.No. 3375, TOCRIS) was added to 100% acetonitrile to prepare a 200 ⁇ g/ml stock solution, which was 20/3 It was added to the PLGA oil solution at a concentration of mg/ml. Nanoparticles containing dolastatin 10 were prepared in the same manner as in Example 2-3-1 except for this process.
  • the size of the nanoparticles containing dolastatin 10 is generally in the range of 88 to 101 nm in all DSPE-PEG-FA ratio conditions, nanoparticles not containing dolastatin 10 (Example 2-3-1 ), an increase of about 20 nm was observed.
  • the PDI and zeta potentials were not significantly different according to the DSPE-PEG-FA ratio, and all the DSPE-PEG-FA ratios showed stable particle characteristics of PCI 0.3 or less and zeta potential of 30 or more.
  • the scattering intensity showed a tendency to increase significantly as the DSPE-PEG-FA ratio increased (Table 5, Figures 12 and 13).
  • Nanoparticles including DSPE-PEG and dolastatin 10 with RDG were prepared in the same manner as in Example 3-1, except that DSPE-PEG-RDG was used instead of DSPE-PEG-FA.
  • the size of the nanoparticles containing dolastatin 10 is generally in the range of 88 to 99 nm in all DSPE-PEG-RGD ratio conditions, nanoparticles not containing dolastatin 10 (Example 2-3-2 ) Compared to about 20 nm.
  • PDI showed a tendency to increase significantly according to the DSPE-PEG-RGD ratio, but showed stable values below PDI 0.3 under all conditions.
  • the zeta potential did not show a clear trend according to the DSPE-PEG-RGD ratio, but showed stable interest characteristics with an absolute value of 30 or more.
  • the scattering intensity also showed no obvious trend according to the DSPE-PEG-RGD ratio (Table 6, FIGS. 14 and 15).
  • nanoparticles containing dolastatin 10 do not show a distinct change in particle characteristics according to the mixing ratio of DSPE-PEG-FA and DSPE-PEG-RGD, respectively, and under all conditions, small particle size and PDI of about 100 nm or less It showed a uniform particle distribution of 0.3 or less.
  • the zeta potential also exhibited stable particle properties with an absolute value of 30 mV or higher.
  • nanoparticles having a mixing ratio of DSPE-PEG and DSPE-PEG-FA of 60:10, 50:10, 48:12, 45:15 and 40:20, respectively, were prepared.
  • concentration of dolastatin 10 in the prepared nanoparticles was diluted to be 25, 50 or 75 ng/ml. Cytotoxicity of each diluted nanoparticle was evaluated in the same manner as in Example 1-2.
  • each nanoparticle prepared in 3-3-1 was evaluated in the same manner as in Example 1-3.
  • the ratio of cytotoxicity to HEK293 cells and anti-cancer activity against B16F10 cancer cells of the nanoparticles containing DSPE-PEG and dolastatin 10 with FA was calculated. The ratio was measured for nanoparticles having final concentrations of 25 and 50 ng/ml of dolastatin 10, which showed a cell viability of 80% or more for normal cells.
  • nanoparticles having a final concentration of dolastatin 10 of 25 ng/ml increased selectivity to cancer cells by adding FA, and the ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA was 40:20 days.
  • the ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA was 40:20 days.
  • the final concentration of dolastatin 10 was 25 ng/ml, and the nanoparticles prepared with a ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG:FA of 40:20 had the least toxicity to normal cells and showed the best anti-cancer activity. Presents excellence.
  • the cell viability of HEK293 cells was found to decrease with concentration of dolastatin 10, but the survival rate tended to increase significantly as RGD was mixed at all concentrations. Cell viability was found to be at least about 79% at all concentrations, confirming that there was no cytotoxicity, and no significant effect was observed according to the ratio of DSPE-PEG-RGD (FIG. 19).
  • each nanoparticle prepared in 3-4-1 was evaluated in the same manner as in Example 1-3.
  • the ratio of cytotoxicity to HEK293 cells and anti-cancer activity against B16F10 cancer cells of nanoparticles including DSPE-PEG and dolastatine 10 with RGD was calculated. The ratio was measured for nanoparticles having final concentrations of 25 and 50 ng/ml of dolastatin 10, which showed a cell viability of 80% or more for normal cells.
  • nanoparticles having a final concentration of dolastatin 10 of 25 ng/ml increased selectivity to cancer cells by adding RGD, and the ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD was 45:15 days. When, it showed the best selectivity for cancer cells (Fig. 21). Nanoparticles with a final concentration of dolastatin 10 of 50 ng/ml also showed the best selectivity for cancer cells when the ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD was 45:15, but rather than 25 ng/ml dolastatin. It was found that the selectivity was relatively low.
  • the separated solution was centrifuged to treat the separated solution as free dolastatin 10, and the separated solution was pretreated using a Compa-Able TM protein assay precipitation reagent set. Then, free dolastatin 10 was measured using a BCA (Bicinchoninic acid) method. The collection efficiency was calculated by the following calculation formula.
  • the nanoparticles containing DSPE-PEG-FA showed a capture efficiency of about 73-82%, and the nanoparticles containing DSPE-PEG-RGD showed about 77-85% capture efficiency. There was no significant difference according to the ratio of -PEG-FA and DSPE-PEG-RGD (Figs. 22 and 23).
  • dolastatin 10 was dispersed in acetonitrile and stirred for 48 hours (37°C, 300 rpm), followed by centrifugation. The supernatant was separated and the content of dolastatin 10 in the supernatant was analyzed by the BCA method. The content efficiency of dolastatin 10 was calculated by the following formula.
  • the efficiency of containing nanoparticles containing FA or RGD was higher than that of nanoparticles not containing FA or RGD, and DSPE was higher than nanoparticles having a ratio of DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA of 40:20.
  • the content efficiency of nanoparticles with a ratio of -PEG:DSPE-PEG-RGD of 45:15 was better (FIG. 24).
  • Nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 5, except that coumarin-6 was used instead of dolastatin 10. Cell permeability of each prepared nanoparticle was analyzed.
  • each nanoparticle was treated with B16F10 cells, and the cell nuclei were stained with PI to visually confirm the degree of standard absorption in the cells, and the state absorbed in the cytoplasm was observed with a confocal laser scanning microscope (CLSM).
  • CLSM confocal laser scanning microscope
  • 1.6 ⁇ 10 5 cell number/mL of B16F10 cells per well of each 6-well plate with cover glass was dispensed, and cultured in an incubator at 37° C., 5% CO 2 and 95% humidity. The medium was replaced at 48 hour intervals, and when the cell confluency reached 75 to 80%, forming a cell monolayer, the medium was removed.
  • Each well was treated with a standard nanoparticle dispersion labeled with coumarin-6 or 0.5 ml of each nanoparticle, and 2 ml of medium and cultured. After 2 hours of culture, the treated sample was removed and the cells were washed twice with PBS, and then treated with 70% ethanol (pH 7.1, PBS) to fix the cells. After 15 minutes, ethanol was removed and washed with PBS, PI was treated and cultured for 20 minutes to stain the nuclei of B16F10 cells. After completion of staining, PI was removed and cells were washed with PBS. The cover glass was removed from the plate, and the mounting solution was dropped onto the slide glass and dried for 1 hour.
  • emission and excitation were measured at 505 nm and 420 nm, respectively, using a confocal laser scanning microscope (CLSM), and the fluorescence intensity was image software. system (NIH, Bethesda, MD, USA).
  • the method for preparing nanoparticles according to the present invention can be used to prepare a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer.

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Abstract

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 약물을 포함하는 나노입자의 제조방법에 관한 것으로, 1) 약물 및 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))을 포함하는 유상 용액을 제조하는 단계; 2) 레시틴(lecithin), DSPE-PEG(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG를 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계; 3) 상기 단계 1)로부터 제조된 유상 용액 및 상기 단계 2)로부터 제조된 수상 용액을 혼합하여 나노입자를 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 DSPE-PEG 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG을 최적화된 비율로 혼합함으로써 정상 세포에 대한 독성이 적으면서 암세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타내는 약물을 포함하는 나노입자를 제조할 수 있으므로, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

약물을 포함하는 나노입자의 제조방법
본 발명은 약물을 포함하는 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
나노 기술을 이용한 약물 전달 시스템(drug delivery system)은 나노 단위의 작은 입자를 통해 약물의 가용화 및 흡수 개선, 질병 부위에 작용하는 약물의 효율을 증진시키고, 부작용은 감소시킬 수 있어 항암제를 비롯한 여러 난용성 약물의 개발에 적용되고 있다. 나노입자는 혈관 내로 전달되었을 때, 신장 여과작용(renal filtration)에 의해 빠져나가거나, 단핵포식세포계(mononuclear phagocyte system, MPS) 또는 세망내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의해 제거되지 않고 보다 효율적으로 전달될 수 있다. 이러한 나노기술이 적용된 약물전달 시스템에는 폴리머(polymer)나 덴드리머(dendrimer)와 같은 유기나노입자, 산화철이나 금 나노입자 같은 무기나노입자, 탄소를 기본형으로 하는 플러렌 또는 탄소나노튜브, 및 리포좀, 마이셀과 같은 인지질로 이루어진 나노입자 등이 있다. 폴리머를 이용한 나노입자는 비생분해성 폴리머보다 생분해성 폴리머가 주로 이용된다. 생분해성 폴리머 중에서도 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid), 폴리(락틱-코-글리콜산))는 FDA 승인된 물질로, 신체 내의 환경에서 에스터(ester) 주사슬의 비효소 가수분해에 의해 젖산(lactic aicd)과 글리콜산(glycolic acid)으로 분해되며 입자, 알약, 필름, 약물전달, 조직공학 등 다양한 분야에서 사용되고 있다.
돌라스타틴(dolastatin)은 인도해의 돌라벨라 오리큘라리아(Dolabella auricularia)에서 분리된 펩타이드로, 돌라스타틴 10과 돌라스타틴 15로 분류된다. 돌라스타틴 10의 생리활성은 탁산(taxane)과 빈카알칼로이드(vinca alkaloid)와 같은 튜불린(tubulin) 저해제이지만 구조적으로 상이한 펩타이드이다 (Chem. Ind., 1999, 51-55; Curr. Pharm. Des., 1999, 5, 139-162). 돌라스타틴 10은 전임상 연구를 통해 세포 실험 및 동물모델 실험에서 다양한 인간 종양에 대한 강한 항암 활성을 나타냄이 밝혀지고 있다.
본 발명의 목적은 약물을 포함하는 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 약물을 포함하는 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 약물을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 약물을 포함하는 나노입자의 제조방법을 제공한다: 1) 약물 및 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))을 포함하는 유상 용액을 제조하는 단계; 2) 레시틴(lecithin), DSPE-PEG(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG를 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계; 및 3) 상기 단계 1)로부터 제조된 유상 용액 및 상기 단계 2)로부터 제조된 수상 용액을 혼합하여 나노입자를 수득하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 약물을 포함하는 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 약물을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하고, 상기 약물은 돌라스타틴 10인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 DSPE-PEG 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG을 최적화된 비율로 혼합함으로써 정상 세포에 대한 독성이 적으면서 암세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타내는 약물을 포함하는 나노입자를 제조할 수 있으므로, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 유리(free) 돌라스타틴 10의 처리 농도에 따른 HEK293 세포의 세포 생존율과 B16F10 세포의 세포 억제율을 측정한 결과이다.
도 2는 돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자를 제조하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 3은 PLGA 농도에 따른 나노입자의 크기(Particle size) 및 분산도(PDI)를 측정한 결과이다.
도 4는 PLGA 농도에 따른 나노입자의 제타전위(zeta potential) 및 산란강도(DCR)를 측정한 결과이다.
도 5는 마이크로플루다이저(microfludizer) 압력에 따른 나노입자의 크기 및 분산도를 측정한 결과이다.
도 6은 마이크로플루다이저(microfludizer) 압력에 따른 나노입자의 제타전위 및 산란강도를 측정한 결과이다.
도 7은 암세포 표적물질인 엽산(folate, FA) 및 RGD 트리펩타이드가 부착된 나노입자를 나타낸 도이다.
도 8은 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 크기 및 분산도를 측정한 결과이다.
도 9는 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 제타전위 및 산란강도를 측정한 결과이다.
도 10은 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 크기 및 분산도를 측정한 결과이다.
도 11은 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 제타전위 및 산란강도를 측정한 결과이다.
도 12는 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 크기 및 분산도를 측정한 결과이다.
도 13은 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 제타전위 및 산란강도를 측정한 결과이다.
도 14는 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 크기 및 분산도를 측정한 결과이다.
도 15는 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 제타전위 및 산란강도를 측정한 결과이다.
도 16은 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 HEK293 세포에 대한 세포 생존율을 측정한 결과이다:
- FA 60:0: DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율이 60:0;
- FA 50:10: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 50:10;
- FA 48:12: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 48:12;
- FA 45:15: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 45:15;
- FA 40:20: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20.
도 17은 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 B16F10 피부암 세포에 대한 세포 억제율을 측정한 결과이다:
- FA 60:0: DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율이 60:0;
- FA 50:10: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 50:10;
- FA 48:12: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 48:12;
- FA 45:15: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 45:15;
- FA 40:20: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20.
도 18은 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 암세포에 대한 선택성(selectivity)을 측정한 결과이다:
- FA 60:0: DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율이 60:0;
- FA 50:10: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 50:10;
- FA 48:12: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 48:12;
- FA 45:15: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 45:15;
- FA 40:20: DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20.
도 19은 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 HEK293 세포에 대한 세포 생존율을 측정한 결과이다:
- RGD 60:0: DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율이 60:0;
- RGD 50:10: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 50:10;
- RGD 48:12: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 48:12;
- RGD 45:15: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 45:15;
- RGD 40:20: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 40:20.
도 20는 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 B16F10 피부암 세포에 대한 세포 억제율을 측정한 결과이다:
- RGD 60:0: DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율이 60:0;
- RGD 50:10: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 50:10;
- RGD 48:12: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 48:12;
- RGD 45:15: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 45:15;
- RGD 40:20: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 40:20.
도 21은 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG (DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 암세포에 대한 선택성(selectivity)을 측정한 결과이다:
- RGD 60:0: DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율이 60:0;
- RGD 50:10: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 50:10;
- RGD 48:12: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 48:12;
- RGD 45:15: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 45:15;
- RGD 40:20: DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 40:20.
도 22는 돌라스타틴 10을 포함하고 DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율에 따른 나노입자의 포집 효율을 나타낸 것이다.
도 23은 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 포집 효율을 나타낸 것이다.
도 24는 돌라스타틴 10을 포함하고 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG (DSPE-PEG-FA 또는 DSPE-PEG-RGD)의 비율에 따른 나노입자의 함유 효율을 나타낸 것이다:
- DSPE-PEG: 암세포 표적물질이 부착되지 않은 나노입자;
- FA 40:20: DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 혼합 비율이 40:20인 나노입자;
- RGD 45:15: DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 혼합 비율이 45:15인 나노입자.
도 25는 돌라스타틴 10 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG를 포함하는 나노입자의 세포 투과를 확인한 현미경 사진이다:
- DSPE-PEG: 암세포 표적물질이 부착되지 않은 나노입자;
- DSPE-PEG-RGD (45:15): DSPE-PEG:트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 혼합 비율이 45:15인 나노입자.
- DSPE-PEG-FA (40:20): DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 혼합 비율이 45:15인 나노입자.
도 26은 돌라스타틴 10을 포함하고 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG를 포함하는 나노입자의 세포 투과 정도를 수치화한 결과이다:
- DSPE-PEG-NH2: 암세포 표적물질이 부착되지 않은 나노입자;
- FA 40:20: DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 혼합 비율이 40:20인 나노입자;
- RGD 45:15: DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 혼합 비율이 45:15인 나노입자.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 약물을 포함하는 나노입자의 제조방법을 제공한다: 1) 약물 및 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))을 포함하는 유상 용액을 제조하는 단계; 2) 레시틴(lecithin), DSPE-PEG(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG를 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계; 및 3) 상기 단계 1)로부터 제조된 유상 용액 및 상기 단계 2)로부터 제조된 수상 용액을 혼합하여 나노입자를 수득하는 단계.
상기 단계 1)의 PLGA의 분자량은 5,000 내지 15,000일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, PLGA는 시그마알드리치 사로부터 구입한 Resomer® RG 502 H(719897 CAS Number: 26780-50-7)일 수 있다.
상기 단계 2)의 레시틴은 하기 화학식 1에 의해 표시되는 화합물일 수 있고, 구체적으로 상기 레시틴의 분자량은 300 내지 800일 수 있다. 하기 화학식 1에서, R 또는 R'은 레시틴의 분자량이 300 내지 800의 범위 내에 있도록 하는 지방산 잔기(fatty acid residues)일 수 있다.
Figure PCTKR2020000615-appb-C000001
상기 단계 2)의 DSPE-PEG(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol)는 하기 화학식 2에 의해 표시되는 화합물일 수 있고, 상기 화학식 2의 n은 41 내지 50일 수 있다. 구체적으로, 하기 화학식 2의 n은 DSPE-PEG의 분자량이 1,500 내지 2,500의 범위 내에 있도록 조절될 수 있다.
Figure PCTKR2020000615-appb-C000002
상기 단계 2)의 암세포 표적물질은 엽산(folate), Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열로 이루어진 RGD 트리펩타이드(tripeptide), Asn-Gly-Arg의 아미노산 서열로 이루어진 NGR 트리펩타이드 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 암세포 표적물질은 엽산(folate) 또는 Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열로 이루어진 RGD 트리펩타이드(tripeptide)일 수 있다. 상기 엽산은 암세포 표면의 엽산 수용체(folate receptor)에 결합할 수 있고, RGD 트리펩타이드는 종양세포에서 과발현되는 αvβ3 인테그린 수용체에 결합할 수 있다. 구체적으로, 암세포 표적물질인 엽산이 부착된 DSPE-PEG는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있고, RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2020000615-appb-C000003
Figure PCTKR2020000615-appb-C000004
상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 2)의 암세포 표적물질은 엽산이고, 상기 단계 2)의 DSPE-PEG 및 엽산이 부착된 DSPE-PEG는 1 내지 2.8:1의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1.5 내지 2.5:1의 비율로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 단계 2)의 암세포 표적물질은 Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열로 이루어진 RGD 트리펩타이드이고, 상기 단계 2)의 DSPE-PEG 및 RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG는 2.2 내지 3.8:1의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 2.5 내지 3.5:1의 비율로 혼합될 수 있다. 상기 비율 조건의 범위로 제조된 나노입자는 정상 세포에 대해 독성을 거의 나타내지 않으면서 암세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있다.
상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 약물은 돌라스타틴 10일 수 있으나, 상기 방법으로 제조되는 나노입자에 포함될 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 1)의 PLGA의 농도는 3.5 내지 9 mg/㎖, 구체적으로 5 내지 8 mg/㎖ 일 수 있다. 상기 PLGA의 농도 조건의 범위에서는 입자 분포가 균일하고 안정적인 상태를 나타내는 나노입자를 얻을 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자의 크기는 80 내지 110 nm일 수 있다. 상기 나노입자의 크기 조건의 범위에서는 약물의 로딩률이 우수하고 암세포를 용이하게 투과할 수 있다.
상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 액을 혼합한 후 초음파를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 초음파 처리는 5 내지 25분 동안 수행될 수 있고, 더 구체적으로 10 내지 20분 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 액을 혼합한 후 초음파를 처리하고 마이클로다이저로 나노화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 마이크로플루다이저의 압력은 5,000 내지 15,000 psi일 수 있고, 구체적으로 8,000 내지 12,000 psi 일 수 있다. 상기 마이크로플루다이저의 압력 조건의 범위에서는 작고 안정적인 나노입자를 얻을 수 있다.
상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 용액을 혼합한 후 초음파를 처리하고 희석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 희석하는 단계는 돌라스타틴 10의 최종 농도가 10 내지 90 ng/㎖, 구체적으로 20 내지 80 ng/㎖ 이 되도록 희석하는 것일 수 있다. 상기 농도 범위의 돌라스타틴 10은 정상 세포에 대해 독성을 거의 나타내지 않으면서 암세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 200 ㎍/㎖의 돌라스타틴 10 스탁(stock) 용액을 20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA 유상 용액에 첨가하고, 이를 수상 용액과 혼합하여 돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자를 제조한 후, 제조한 나노입자 내 돌라스타틴 10의 포집 효율을 측정하여 돌라스타틴 10의 농도가 25, 50, 75 ng/㎖가 되도록 희석하였다. 상기 돌라스타틴 10의 농도 조건의 범위로 제조된 나노입자는 정상 세포에 대해 독성을 거의 나타내지 않으면서 암세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 유리(free) 돌라스타틴 10 자체의 세포독성 및 항암 활성을 측정한 결과, 정상 세포에 대한 세포 독성이 적으면서 피부암 세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있는 돌라스타틴 10의 함량(75 ng/㎖ 이하)로 결정하고 (도 1 참조), PLGA 농도에 따라 제조된 나노입자의 특성을 관측한 결과, 작은 나노 입자 크기를 가지며 균일한 입자 분포와 안정적인 입자 특성을 나타낼 수 있는 PLGA의 함량(6.67 mg/㎖)을 결정하였다 (도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 나노입자 제조 시, DSPE-PEG와 암세포 표적물질(엽산 및/또는 RGD 트리펩타이드)이 부착된 DSPE-PEG의 비율을 조절한 결과, 비율에 관계없이 본 발명의 나노입자는 작은 크기를 유지하면서, 균일한 입자 분포, 안정적인 입자 특성을 나타냄을 확인하였다 (도 7 내지 도 11 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 나노입자 제조 시, DSPE-PEG와 암세포 표적물질(엽산 또는 RGD 트리펩타이드)이 부착된 DSPE-PEG의 비율을 조절한 결과, DSPE-PEG:엽산이 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-FA)의 비율이 40:20인 경우와 DSPE-PEG:RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG(DSPE-PEG-RGD)의 비율이 45:15인 경우, 정상 세포에 대한 독성이 적으면서 피부암 세포에 대한 항암 활성이 우수하고, 세포 내로 흡수됨을 확인하였다 (도 12 내지 도 21, 도 25 및 도 26 참조).
따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 나노입자는 암 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 약물을 포함하는 나노입자를 제공한다.
상기 나노입자는 상술한 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 약물을 포함하는 나노입자는 1) 약물 및 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))을 포함하는 유상 용액을 제조하는 단계; 2) 레시틴(lecithin), DSPE-PEG(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG를 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계; 및 3) 상기 단계 1)로부터 제조된 유상 용액 및 상기 단계 2)로부터 제조된 수상 용액을 혼합하여 나노입자를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 약물, PLGA, 레시틴, DSPE-PEG 및 암세포 표적물질은 상기 서술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 암세포 표적물질은 엽산(folate), Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열로 이루어진 RGD 트리펩타이드(tripeptide), Asn-Gly-Arg의 아미노산 서열로 이루어진 NGR 트리펩타이드 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 암세포 표적물질은 엽산(folate) 또는 Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열로 이루어진 RGD 트리펩타이드(tripeptide)일 수 있다.
상기 나노입자의 제조 시, 상기 DSPE-PEG 및 엽산이 부착된 DSPE-PEG는 1 내지 2.8:1의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1.5 내지 2.5:1의 비율로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 DSPE-PEG 및 RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG는 2.2 내지 3.8:1의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 2.5 내지 3.5:1의 비율로 혼합될 수 있다. 상기 비율 조건의 범위에서 제조된 나노입자는 정상 세포에 독성을 거의 나타내지 않으면서 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있다.
상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 약물은 돌라스타틴 10일 수 있으나, 상기 방법으로 제조되는 나노입자에 포함될 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 1)의 PLGA의 농도는 3.5 내지 9 mg/㎖, 구체적으로 5 내지 8 mg/㎖ 일 수 있다. 상기 PLGA의 농도 조건의 범위에서는 입자 분포가 균일하고 안정적인 상태를 나타내는 나노입자를 얻을 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자의 크기는 80 내지 110 nm일 수 있다. 상기 나노입자의 크기 조건의 범위에서는 약물의 로딩률이 우수하고 암세포를 용이하게 투과할 수 있다.
상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 액을 혼합한 후 초음파를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 초음파 처리는 5 내지 25분 동안 수행될 수 있고, 더 구체적으로 10 내지 20분 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 액을 혼합한 후 초음파를 처리하고 마이클로다이저로 나노화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 마이크로플루다이저의 압력은 5,000 내지 15,000 psi일 수 있고, 구체적으로 8,000 내지 12,000 psi 일 수 있다. 상기 마이크로플루다이저의 압력 조건의 범위에서는 작고 안정적인 나노입자를 얻을 수 있다.
상기 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 용액을 혼합한 후 초음파를 처리하고 희석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 희석하는 단계는 돌라스타틴 10의 최종 농도가 10 내지 90 ng/㎖, 구체적으로 20 내지 80 ng/㎖ 이 되도록 희석하는 것일 수 있다. 상기 농도 범위의 돌라스타틴 10은 정상 세포에 대해 독성을 거의 나타내지 않으면서 암세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 200 ㎍/㎖의 돌라스타틴 10 스탁(stock) 용액을 20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA 유상 용액에 첨가하고, 이를 수상 용액과 혼합하여 돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자를 제조한 후, 제조한 나노입자 내 돌라스타틴 10의 포집 효율을 측정하여 돌라스타틴 10의 농도가 25, 50, 75 ng/㎖가 되도록 희석하였다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 나노입자를 유효성분으로 포함하고, 상기 약물은 돌라스타틴 10인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 나노입자는 상술한 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 암은 피부암, 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 자궁경부암, 방광암 또는 혈액암 등일 수 있으나, 돌라스타틴 10으로 치료할 수 있는 암의 종류인 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 나노입자를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 나노입자 내 돌라스타틴 10의 농도 결정
PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid), 폴리(락틱-코-글리콜산)) 나노입자 내에 로딩할 돌라스타틴 10의 농도를 결정하기 위해, 신장 유래 HEK293 세포에서 유리(free) 돌라스타틴 10의 세포 독성을 측정하고, 피부암 세포 B16F10 세포에서 유리 돌라스타틴 10의 항암 활성을 측정하였다.
<1-1> 세포의 계대 배양
한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 입수한 HEK293 세포는 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 불활성화된 FBS(inactivated FBS)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 접종하고, 한국세포주은행에서 입수한 B16F10 세포는 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 불활성화된 FBS가 첨가된 MEM(Minimum Essential Medium)에 접종한 후, 37℃, 5% CO2 및 95% 습도 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 각 세포의 컨플루언시(confluency)가 75 내지 80%에 도달하면 배지를 제거하고, 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다. 부착된 세포에 0.25%의 트립신-EDTA를 처리하고 세포를 각각 수거, 1,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득하였다. 상층액을 제거한 세포 펠렛에 배지 3 내지 4 ㎖을 첨가하여 재현탁시킨 후, 75 cm2 T-플라스크에 분주하였다. 배양한 지 48시간 후, 새로운 배지로 교체하고 플라스크 표면에 부착되지 않은 부유 세포를 제거하였다.
<1-2> 정상세포에 대한 세포 독성
실시예 1-1에 따라 배양된 HEK293 세포를 5.5×104 개/㎖의 농도로 희석하고, 96-웰 플레이트에 180 ㎕씩 분주하여 배양하였다. 24시간 후 배양된 세포에 유리(free) 돌라스타틴 10을 농도별(0 내지 250 ng/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, MTT 시약을 처리하였다. 4시간 후, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, DMSO를 처리하여 포르마잔(formazan)을 가용화한 다음, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(cell viability)은 돌라스타틴 10을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 계산하였다.
돌라스타틴 10은 100 ng/㎖로 처리 시, 69%의 세포 생존율을 나타내었으며, 농도 의존적으로 세포 독성을 나타내었다 (도 1).
<1-3> 암세포에 대한 항암 활성
HEK293 세포 대신 B16F10 세포를 이용한 것을 제외하고, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. 세포 억제율(cell inhibition rate)은 돌라스타틴 10을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 계산하였다.
돌라스타틴 10은 75 ng/㎖로 처리 시, 약 25%의 피부암 세포 억제율을 나타내었으며, 농도 의존적으로 세포 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다. 실시예 1-2의 결과와 종합하여, 상대적으로 세포 독성이 적으면서 항암 활성이 높은 75 ng/㎖ 이하를 PLGA 나노입자의 돌라스타틴 10 최종 농도로 결정하였다 (도 1).
<실시예 2> 돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자 제조
돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자의 제조에 있어서, PLGA 함량, 마이크로플루다이저 압력, 엽산(folate) 및 RGD(Arg-Gly-Asp) 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG 함량에 따른 나노입자의 특성을 분석하였다.
<2-1> PLGA 함량에 따른 나노입자 특성 분석
<2-1-1> PLGA 함량을 달리한 다양한 나노입자의 제조
돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자를 제조하기 위해 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), 레시틴(lecithin) 및 DSPE-PEG(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol)를 기본 피복 물질로 이용하였다 (도 7).
먼저, PLGA(Resomer®RG 502 H, 719897 CAS Number: 26780-50-7, 시그마 알드리치)를 용해시킨 유상 용액과 레시틴(Lecithin from soybean, CAS NO.8002-43-5 5081-4405, 대정(DAEJUNG)) 및 DSPE-PEG(DSPE-PEG-NH2, DSPE-PEG-Amine CatalogID: 10455 Cat.No LP096005-2K, Biochempeg scientific inc.)를 용해시킨 수상 용액을 제조하였다. 구체적으로, PLGA 1, 10, 20 또는 30 ㎎을 3 ㎖의 아세토니트릴(acetonitrile)에 용해시켜 유상 용액을 제조하고, 레시틴 9 mg을 4% 에탄올에 첨가하고 65℃에서 교반(700 rpm)시켜 충분히 용해시킨 후, DSPE-PEG를 6 mg를 첨가하여 수상 용액을 제조하였다.
나노에멀젼 제조를 위해서 유상 용액 3 ㎖와 수상 용액 10 ㎖를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후, 저온수조에서 15분 초음파 처리(진폭(amplitude) 30%, 30초 초음파 처리 후 2분 멈춤)하였다(VC 505, Vibracell Sonics, Newton, USA). 초음파 처리 후 바로 마이크로플루다이저(microfluidizer, LM20 Microfluidizer High shear fluid processor, Microfluidicscorp, USA)를 이용하여 나노화하고 상온에서 2시간 교반(600 rpm) 하여 안정화시킨 후, 65℃에서 45분 교반(600 rpm)하여 유기용매를 제거하였다. 제조된 에멀젼 용액에서 포집되지 않은 소재들을 제거하고 나노입자를 선별하기 위하여, Amicon Ultra-15 (10K, Millipore Co., MA, USA)에 넣고 원심분리하였다(2,486 g force, 15분, 25℃). 분리된 나노입자를 증류수로 2회 반복 세척한 후 증류수를 첨가하여 최종 부피가 13 ㎖이 되도록 하였다 (도 2).
<2-1-2> PLGA 함량에 따른 나노입자 특성 분석
나노입자 제조 시 첨가되는 PLGA 함량을 달리한 상기 실시예 2-1-1에서 제조한 각 나노입자의 입자 특성을 분석하였다. 나노입자의 특성은 나노 입도 분석기(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Worcestershire, UK)를 이용하여 나노입자의 크기(particle size), 입자의 분산도(polydispersity index, PDI), 산란강도 (derived count rate, DCR) 및 제타전위(zeta potential)를 이용하여 측정하였다.
각 입자 특성을 확인한 결과, 입자 크기는 112 내지 136 nm의 범위로 나타났으며, PLGA 함량에 따른 유의적인 차이는 없었다. 입자크기의 분산도를 나타내는 PDI는 0.3을 기준으로 낮을수록 균일한 입자 분포를 보인다고 판단하는데, 모든 입자가 0.3 이하의 안정된 값을 나타냈으며, PLGA 함량에 따른 유의적 차이는 없었다. 제타전위는 나노입자 표면의 전기적 이중층의 전하를 나타내는 값으로, 일반적으로 절대값 30 mV를 기준으로 절대값이 클수록 안정하다고 판단한다. 제조한 나노입자의 제타전위는 PLGA 함량이 증가됨에 따라 절대값이 감소하는 경향을 보이긴 하나, 모든 입자가 절대값 45 mV 이상의 높은 수치를 보여 안정된 입자를 형성함을 확인하였다. 또한 모든 입자는 음전하를 나타내었는데 이는 PLGA의 카르복실기에 의한 것으로 추정된다. 나노입자의 산란강도(DCR)는 나노입자로부터 산란된 빛의 강도를 나타내는 값으로, 제조된 나노입자의 수와 크기에 의해 영향을 받는데, 나노입자의 산란강도는 PLGA 함량에 따른 유의적 차이는 없는 것으로 나타났다.
최종적으로, 나노입자 크기가 115 nm로 비교적 적으면서 균일한 입자분포와 안정적인 제타전위를 나타내는 6.67(20/3) ㎎/㎖을 최적 PLGA 농도로 결정하였다 (표 1, 도 3 및 도 4).
PLGA(㎎/㎖) 입자 크기(nm) PDI 제타전위(mV) DCR(kcps)
1/3 128.7±39.6 0.282±0.045 -72.4±1.1 78,489±10,505
10/3 136.2±40.2 0.275±0.036 -60.0±5.6 92,753±8,854
20/3 114.7±8.0 0.299±0.075 -46.8±2.9 81,698±6,100
30/3 111.8±17.3 0.285±0.026 -44.7±1.7 87,221±3,820
<2-2> 마이크로플루다이저 압력에 따른 나노입자 특성 분석
20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA로 유상 용액을 제조하고, 나노화 과정에서 마이크로플루다이저의 압력을 10,000, 20,000 또는 30,000 psi로 가하는 것을 제외하고, 실시예 2-1-1와 동일한 방법으로 나노입자를 제조하였다.
마이크로플루다이저의 압력에 따라 제조한 나노입자의 특성을 분석한 결과, 나노입자의 크기는 압력이 증가함에 따라 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈고, PDI와 제타전위는 각각 0.2 이하와 절대값 30 mV 이상의 안정적인 값을 나타냈으며 압력에 따른 유의적인 차이는 없었다. 산란강도(DCR)는 압력이 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였는데, 이는 입자의 크기가 증가했기 때문인 것으로 추정된다.
상기로부터 마이크로플루다이저의 최적 압력은 70 nm의 작은 크기의 나노입자를 형성할 수 있는 10,000 psi로 결정하였다 (표 2, 도 5 및 도 6).
마이크로플루다이저 압력(psi) 입자 크기(nm) PDI 제타전위(mV) DCR(kcps)
10,000 70.8±1.6 0.161±0.003 -60.5±0.4 71,306±18,754
20,000 73.2±0.5 0.164±0.003 -74.1±20.8 82,748±16,045
30,000 76.5±1.1 0.163±0.009 -70.9±21.5 84,574±21,363
<실시예 2-3> 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG-FA 또는 DSPE-PEG-RGD의 함량에 따른 나노입자 특성 분석
암세포 표면에 발현되는 엽산 수용체(folate receptor)와 결합할 수 있는 엽산(folate, FA), 또는 암세포에서 과발현된 αvβ3 인테그린 수용체와 결합할 수 있는 RGD(Arg-Gly-Asp) 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG의 함량을 달리하여 나노입자를 제조하였다 (도 7).
<2-3-1> 엽산이 부착된 DSPE-PEG 함량을 달리한 나노입자의 제조 및 특성 분석
20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA로 유상 용액을 제조하고, 수상 용액 제조시 DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA(DSPE-PEG-Folic Acid CatalogID: 10462 Cat.No LP096057-2K, Biochempeg scientific inc.)의 비율을 60:0, 50:10, 48:12, 45:15 또는 40:20으로 조절하여 첨가하며, 나노화 과정에서 10,000 psi의 마이크로플루다이저 압력을 가하는 것을 제외하고, 실시예 2-1-1와 동일한 방법으로 나노입자를 제조하였다.
엽산이 부착된 DSPE-PEG 비율을 조절하여 제조한 나노입자의 특성을 분석한 결과, 나노입자의 크기는 첨가하는 DSPE-PEG-FA의 비율이 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으나, 71 내지 77 nm의 범위로 비교적 작은 크기를 유지하였다. PDI는 0.2 정도로 균일한 입자 분포를 나타냈고, 제타전위는 DSPE-PEG-FA 비율 조건에 따라 유의적 차이를 나타내지 않았으며, 안정적인 입자 상태를 나타냈다. 산란 강도는 DSPE-PEG-FA 비율이 증가함에 따라 유의적인 감소를 나타냈으나, 뚜렷한 경향성은 나타내지 않았다 (표 3, 도 8 및 도 9).
DSPE-PEG-NH2:DSPE-PEG-FA 입자 크기(nm) PDI 제타전위(mV) DCR(kcps)
60:0 70.8±1.6 0.161±0.003 -60.5±3.1 59,003±4,224
50:10 77.3±1.3 0.218±0.028 -66.8±3.3 35,597±6,433
48:12 74.9±2.3 0.167±0.013 -68.5±3.6 41,109±542
45:15 75.2±4.7 0.206±0.016 -65.2±1.0 27,663±4,210
40:20 77.1±2.6 0.214±0.029 -60.4±2.2 39,253±1,407
<2-3-2> RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG 함량을 달리한 나노입자의 제조 및 특성 분석
20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA로 유상 용액을 제조하고, 수상 용액 제조시 DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD(DSPE-PEG-ARG-GLY-ASP CatalogID: 11188 Cat.No LP096074-2K, Biochempeg scientific inc.)의 비율을 60:0, 50:10, 48:12, 45:15 또는 40:20으로 조절하여 첨가하며, 나노화 과정에서 10,000 psi의 마이크로플루다이저 압력을 가하는 것을 제외하고, 실시예 2-1-1와 동일한 방법으로 나노입자를 제조하였다.
RGD가 부착된 DSPE-PEG 비율을 조절하여 제조한 나노입자의 특성을 분석한 결과, 나노입자의 크기는 첨가하는 DSEP-PEG-RGD의 비율에 따라 다소 차이는 있었으나, 전체적으로 67 내지 76 nm의 범위의 크기를 유지하였다. PDI는 0.3 이하의 균일한 입자 분포를 나타냈고, 제타전위 또한 절대값 43 mV 이상의 안정적인 값을 나타냈다. 산란강도는 DSPE-PEG-RGD 비율이 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타내어, 형성된 입자의 수가 감소되는 것으로 추정된다 (표 4, 도 10 및 도 11).
DSPE-PEG-NH2:DSPE-PEG-RGD 입자 크기(nm) PDI 제타전위(mV) DCR(kcps)
60:0 70.8±1.6 0.161±0.003 -60.5±3.1 59,003±4,224
50:10 73.2±7.2 0.189±0.018 -42.8±2.4 22,537±506
48:12 75.9±7.0 0.224±0.005 -57.4±4.4 13,766±136
45:15 66.9±4.2 0.174±0.011 -44.1±3.9 32,768±91
40:20 75.2±4.7 0.260±0.024 -55.0±4.3 11,711±224
상기 결과로부터, DSPE-PEG-FA와 DSPE-PEG-RGD 혼합 비율은 나노 입자 특성에 뚜렷한 변화를 나타내지 않았다. 모든 조건에서 약 80 nm 이하의 입자크기와 PDI 0.3 이하의 균일한 입자 분포를 나타내었으며, 제타전위 또한 절대값 30 mV 이상으로 안정적인 입자 특성을 나타내었다.
<실시예 3> 돌라스타틴 10을 포함하는 나노입자의 제조
<3-1> FA가 부착된 DSPE-PEG 및 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자의 제조
구체적으로, 돌라스타틴 10 트리플루오로아세테이트(dolastatin-10 trifluoroacetate, Cat.No. 3375, TOCRIS)를 100% 아세토니트릴에 첨가하여 200 ㎍/㎖ 의 스탁(stock) 용액을 제조하고, 이를 20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA 유상 용액에 첨가하였다. 이 과정을 제외하고 실시예 2-3-1과 동일한 방법으로 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자를 제조하였다.
그 결과, 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자의 크기는 모든 DSPE-PEG-FA 비율 조건에서 전반적으로 88 내지 101 nm의 범위로 나타나, 돌라스타틴 10을 포함하지 않은 나노입자(실시예 2-3-1)과 비교하여 약 20 nm가 증가한 것으로 나타났다. PDI 및 제타전위는 DSPE-PEG-FA 비율에 따라 유의적인 차이는 없었고, 모든 DSPE-PEG-FA 비율에서 PCI 0.3 이하, 제타전위 절대값 30 이상의 안정적인 입자 특성을 나타냈다. 산란 강도는 DSPE-PEG-FA 비율이 증가함에 따라 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈다 (표 5, 도 12 및 도 13).
DSPE-PEG-NH2:DSPE-PEG-FA 입자 크기(nm) PDI 제타전위(mV) DCR(kcps)
60:0 87.5±2.3 0.184±0.002 -96±11 70,728±5,583
50:10 96.8±2.4 0.203±0.010 -78±23 78,750±13,339
48:12 95.4±10.6 0.189±0.027 -78±22 85,790±22,191
45:15 101.1±3.9 0.188±0.014 -92±8 122,220±24,682
40:20 99.5±2.6 0.185±0.020 -86±10 112,882±44,468
<3-2> RGD가 부착된 DSPE-PEG 및 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자의 제조
DSPE-PEG-FA 대신 DSPE-PEG-RDG를 사용한 것을 제외하고, 실시예 3-1과 동일한 방법으로 RDG가 부착된 DSPE-PEG 및 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자를 제조하였다.
그 결과, 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자의 크기는 모든 DSPE-PEG-RGD 비율 조건에서 전반적으로 88 내지 99 nm의 범위로 나타나, 돌라스타틴 10을 포함하지 않은 나노입자(실시예 2-3-2)과 비교하여 약 20 nm가 증가한 것으로 나타났다. PDI는 DSPE-PEG-RGD 비율에 따라 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈으나, 모든 조건에서 PDI 0.3 이하의 안정적인 수치를 나타냈다. 제타전위는 DSPE-PEG-RGD 비율에 따른 뚜렷한 경향은 나타내지 않았으나, 절대값 30 이상의 안정적인 이자 특성을 나타냈다. 산란강도 또한 DSPE-PEG-RGD 비율에 따른 뚜렷한 경향은 보이지 않았다 (표 6, 도 14 및 도 15).
DSPE-PEG-NH2:DSPE-PEG-FA 입자 크기(nm) PDI 제타전위(mV) DCR(kcps)
60:0 87.5±2.3 0.184±0.002 -96±11 70,728±5,583
50:10 96.2±0.0 0.190±0.029 -83±12 75,359±13,311
48:12 97.0±2.5 0.204±0.008 -90±13 65,944±7,097
45:15 98.7±6.1 0.211±0.005 -92±5 64,727±7,220
40:20 97.8±9.1 0.230±0.011 -81±11 69,733±25,741
상기 결과로부터, 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자는 각각 DSPE-PEG-FA와 DSPE-PEG-RGD 혼합 비율에 따라 입자 특성에 뚜렷한 변화를 나타내지 않으며, 모든 조건에서 약 100 nm 이하의 작은 입자크기와 PDI 0.3 이하의 균일한 입자 분포를 나타냈다. 제타전위 또한 절대값 30 mV 이상의 안정적인 입자 특성을 나타냈다.
<3-3> DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA 혼합 비율에 따른 세포 독성
<3-3-1> 정상 세포 독성 평가
상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 DSPE-PEG 및 DSPE-PEG-FA의 혼합 비율이 각각 60:10, 50:10, 48:12, 45:15 및 40:20 인 나노입자를 제조하고, 제조한 나노입자 내 돌라스타틴 10의 포집 효율을 측정한 후 돌라스타틴 10의 농도가 25, 50 또는 75 ng/㎖ 가 되도록 희석하였다. 희석한 각 나노입자의 세포 독성을 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, HEK293 세포의 세포 생존율은 돌라스타틴 10의 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25 및 50 ng/㎖인 나노입자 처리 시, 약 79% 이상의 세포 생존율을 나타냈고 DSPE-PEG-FA의 비율에 따른 유의적인 영향은 나타나지 않았으나, 돌라스타틴 10의 최종 농도가 75 ng/㎖인 나노입자 처리 시, DSPE-PEG-FA의 비율이 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하는 경향을 보였다 (도 16).
<3-3-2> 항암 활성 평가
상기 3-3-1에서 제조한 각 나노입자의 항암 활성을 실시예 1-3과 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, B16F10 세포에 대한 항암 활성은 돌라스타틴 10의 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 모든 농도 범위에서 DSPE-PEG-FA의 비율이 증가함에 따라 세포 억제율이 유의적으로 증가하는 경향을 보였다. 특히, 돌라스타틴 10의 최종 농도가 75 ng/㎖인 나노입자는 DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20일 때, 가장 우수한 항암 활성을 나타냄을 확인하였다. 이는 유리 돌라스타틴 10과 비교하여 1.4 내지 1.6배 우수한 것이다 (도 17).
<3-3-3> 정상 세포에 대한 세포 독성에 대비한 암세포에 대한 항암 활성 비율
FA가 부착된 DSPE-PEG 및 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자의 HEK293 세포에 대한 세포 독성과 B16F10 암세포에 대한 항암 활성의 비율을 계산하였다. 상기 비율은 정상 세포에 대해 80% 이상의 세포 생존율을 나타냈던 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25 및 50 ng/㎖인 나노입자에 대해서 측정하였다.
그 결과, 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25 ng/㎖인 나노입자는 FA를 첨가함에 따라 암세포에 대한 선택성(selectivity)이 증가하였으며, DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20일 때, 가장 우수한 암세포에 대한 선택성을 나타냈다 (도 18). 돌라스타틴 10의 최종 농도가 50 ng/㎖인 나노입자도 DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20일 때 선택성이 가장 높았으나 25 ng/ml 돌라스타틴 10보다는 상대적으로 선택성이 낮은 것으로 나타났다.
상기 결과는 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25 ng/㎖이고, DSPE-PEG:DSPE-PEG:FA의 비율을 40:20으로 하여 제조한 나노입자가 정상 세포에 대한 독성이 적으면서 항암 활성이 가장 우수함을 제시한다.
<3-4> DSPE-PEG 및 DSPE-PEG-RGD의 혼합 비율에 따른 세포 독성
<3-4-1> 정상 세포 독성 평가
상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 DSPE-PEG 및 DSPE-PEG-RGD의 혼합 비율이 각각 60:10, 50:10, 48:12, 45:15 및 40:20 인 나노입자를 제조하고, 제조한 나노입자 내 돌라스타틴 10의 포집 효율을 측정한 후 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25, 50 또는 75 ng/㎖가 되도록 희석하였다.
그 결과, HEK293 세포의 세포 생존율은 돌라스타틴 10의 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났으나, 모든 농도에서 RGD가 혼합되면서 생존율이 유의적으로 증가하는 경향이 나타났다. 모든 농도에서 약 79% 이상의 세포 생존율을 나타나 세포 독성이 없음을 확인하였으며, DSPE-PEG-RGD의 비율에 따른 유의적인 영향은 나타나지 않았다 (도 19).
<3-4-2> 항암 활성 평가
상기 3-4-1에서 제조한 각 나노입자의 항암 활성을 실시예 1-3과 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, B16F10 세포에 대한 항암 활성은 돌라스타틴 10의 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 모든 농도 조건에서 DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 45:15일 때, 가장 우수한 항암 활성을 나타냈으며, 이는 유리 돌라스타틴 10과 비교하여 1.2 내지 1.5배 우수한 것이다 (도 20).
<3-4-3> 정상 세포에 대한 세포 독성 및 암세포에 대한 항암 활성의 비율
RGD가 부착된 DSPE-PEG 및 돌라스타틴 10을 포함한 나노입자의 HEK293 세포에 대한 세포 독성과 B16F10 암세포에 대한 항암 활성의 비율을 계산하였다. 상기 비율은 정상 세포에 대해 80% 이상의 세포 생존율을 나타냈던 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25 및 50 ng/㎖ 농도인 나노입자에 대해서 측정하였다.
그 결과, 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25 ng/㎖인 나노입자는 RGD를 첨가함에 따라 암세포에 대한 선택성(selectivity)이 증가하였으며, DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 45:15일 때, 가장 우수한 암세포에 대한 선택성을 나타냈다 (도 21). 돌라스타틴 10의 최종 농도가 50 ng/㎖인 나노입자도 DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 45:15일 때, 가장 우수한 암세포에 대한 선택성을 나타냈으나 25 ng/ml 돌라스타틴 보다는 상대적으로 선택성이 낮은 것으로 나타났다.
상기 결과는 돌라스타틴 10의 최종 농도가 25 ng/㎖이고, DSPE-PEG:DSPE-PEG:RGD의 비율을 45:15로 하여 나노입자를 제조하였을 때, 정상 세포에 대한 독성이 적으면서 항암 활성이 가장 우수함을 제시한다.
<실시예 4> 나노입자의 돌라스타틴 10 포집 효율
돌라스타틴 10의 스탁 용액(200 ㎍/㎖)을 20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA 유상 용액에 첨가하고, 상기 실시예 3-1 및 3-2와 동일한 방법으로 DSPE-PEG 및 DSPE-PEG-FA, 및 DSPE-PEG 및 DSPE-PEG-RGD의 혼합 비율을 각각 60:10, 50:10, 48:12, 45:15 및 40:20으로 하여 나노입자를 각각 제조하였다. 제조한 각 나노입자의 포집 효율(entrapment efficiency, EE)을 측정하였다.
구체적으로, 나노입자 제조 시 에멀젼을 원심분리하여 분리된 용액을 유리 돌라스타틴 10으로 간주하고, 분리된 용액을 Compa-AbleTM 단백질 어세이 침전 시약 세트(Protein assay preparation reagent set)를 사용하여 전처리한 후, BCA(Bicinchoninic acid) 방법을 이용하여 유리 돌라스타틴 10을 측정하였다. 포집 효율은 하기 계산식에 의해 산출되었다.
Figure PCTKR2020000615-appb-I000001
그 결과, DSPE-PEG-FA를 포함한 나노입자는 약 73 내지 82%, DSPE-PEG-RGD를 포함하는 나노입자는 약 77 내지 85%의 포집 효율을 나타냈으며, 두 가지 타입의 나노입자 모두 DSPE-PEG-FA 및 DSPE-PEG-RGD의 비율에 따른 유의적인 차이는 없었다 (도 22 및 도 23).
<실시예 5> 나노입자의 돌라스타틴 10 함유 효율
돌라스타틴 10의 스탁 용액(200 ㎍/㎖)을 20/3 ㎎/㎖ 농도의 PLGA 유상 용액에 첨가하고, 상기 실시예 3-1 및 3-2와 동일한 방법으로 DSPE-PEG 및 DSPE-PEG-FA의 혼합 비율이 40:20, 및 DSPE-PEG 및 DSPE-PEG-RGD의 혼합 비율이 45:15인 나노입자를 각각 제조하였다. 제조한 각 나노입자의 함유 효율(loading efficiency, LE)을 측정하였다.
구체적으로, 동결건조된 나노입자로부터 돌라스타틴 10을 추출한 후, 이를 아세토니트릴에 분산시키고 48시간 동안 교반(37℃, 300 rpm)한 후 원심분리하였다. 상층액을 분리하여 상층액 내 돌라스타틴 10의 함량을 BCA 방법에 의해 분석하였다. 돌라스타틴 10의 함유 효율은 아래 계산식에 의해 산출되었다.
Figure PCTKR2020000615-appb-I000002
그 결과, FA 또는 RGD를 포함하지 않은 나노입자보다 FA 또는 RGD를 포함한 나노입자의 돌라스타틴 10 함유 효율이 높았으며, DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20인 나노입자보다 DSPE-PEG:DSPE-PEG-RGD의 비율이 45:15인 나노입자의 함유효율이 더 우수하였다 (도 24).
<실시예 6> 나노입자의 세포 투과도 평가
돌라스타틴 10 대신 쿠마린-6을 이용한 것을 제외하면 실시예 5와 동일한 방법으로 나노입자를 제조하였다. 제조한 각 나노입자의 세포 투과도를 분석하였다.
구체적으로, 각 나노입자를 각각 B16F10 세포에 처리하고, 세포 내 표준물질 흡수 정도를 시각적으로 확인하기 위해 세포핵을 PI로 염색하여, 세포질에서 흡수된 상태를 CLSM(confocal laser scanning microscope)으로 관찰하였다. 구체적으로, 커버 글라스를 넣은 6-웰 플레이트의 각 웰 당 1.6×105 세포수/㎖의 B16F10 세포를 분주하고, 37℃, 5% CO2 및 95% 습도 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 48시간 간격으로 배지를 교체하고, 세포의 컨플루언시(confluency)가 75 내지 80%에 도달하여 세포 단일층(mololayer)을 형성하면 배지를 제거하였다. 각 웰에 쿠마린-6으로 표지한 표준 나노입자 분산액 또는 각 나노입자 0.5 ㎖, 및 배지 2 ㎖씩 처리하고 배양하였다. 배양 2시간 후, 처리한 시료를 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척한 후, 70% 에탄올(pH 7.1, PBS)을 처리하여 세포를 고정시켰다. 15분 후, 에탄올을 제거하고 PBS로 세척한 후, PI를 처리하고 20분간 배양하여 B16F10 세포의 핵을 염색하였다. 염색 완료 후, PI를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 플레이트에서 커버 글라스를 꺼내고 마운팅(mounting) 용액을 떨어뜨린 슬라이드 글라스 위에 올려주고 1시간 동안 건조시켰다. B16F10 세포에 대한 나노입자의 투과 정도를 측정하기 위해, CLSM(confocal laser scanning microscope)을 이용하여 방출(emission) 및 여기(excitation)를 각각 505 nm 및 420 nm에서 각각 측정하였으며, 형광 세기는 Image software system(NIH, Bethesda, MD, USA)으로 분석하였다.
그 결과, 붉게 염색된 세포핵 주변으로 초록색 형광이 관찰되어 각 나노입자가 세포 내로 흡수되었음을 확인하였다. 유리 쿠마린-6(free coumarin-6)의 경우 가장 낮은 형광 강도를 나타내었으며, 제조한 나노입자 중에서도 DSPE-PEG:DSPE-PEG-FA의 비율이 40:20인 나노입자의 형광 강도가 가장 높게 나타났다. 이는 시험관 내(in vitro) 항암 활성 결과와 일치하는 것이다 (도 25 및 도 26).
본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 하기의 단계를 포함하는 약물을 포함하는 나노입자의 제조방법:
    1) 약물 및 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))을 포함하는 유상 용액을 제조하는 단계;
    2) 레시틴(lecithin), DSPE-PEG(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-Polyethylene Glycol) 및 암세포 표적물질이 부착된 DSPE-PEG를 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계; 및
    3) 상기 단계 1)로부터 제조된 유상 용액 및 상기 단계 2)로부터 제조된 수상 용액을 혼합하여 나노입자를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 용액을 혼합한 후 초음파를 처리하는 단계를 더 포함하는, 나노입자의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 암세포 표적물질은 엽산, Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열로 이루어진 RGD 트리펩타이드, Asn-Gly-Arg의 아미노산 서열로 이루어진 NGR 트리펩타이드 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 나노입자의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 암세포 표적물질은 엽산이고,
    상기 단계 2)의 DSPE-PEG 및 엽산이 부착된 DSPE-PEG는 1.5 내지 2.5:1의 비율로 혼합되는, 나노입자의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 암세포 표적물질은 Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열로 이루어진 RGD 트리펩타이드이고,
    상기 단계 2)의 DSPE-PEG 및 RGD 트리펩타이드가 부착된 DSPE-PEG는 2.5 내지 3.5:1의 비율로 혼합되는, 나노입자의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약물은 돌라스타틴 10인, 나노입자의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단계 3)의 유상 용액 및 수상 용액을 혼합한 후 초음파를 처리하고, 상기 돌라스타틴 10의 최종 농도가 10 내지 90 ng/㎖가 되도록 희석하는 단계를 더 포함하는, 나노입자의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 PLGA의 함량은 5 내지 8 mg/㎖인, 나노입자의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약물을 포함하는 나노입자의 크기는 80 내지 110 nm인, 나노입자의 제조방법.
  10. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 약물을 포함하는 나노입자.
  11. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 약물을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하고, 상기 약물은 돌라스타틴 10인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 피부암, 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 자궁경부암, 방광암 또는 혈액암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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