WO2020145491A1

WO2020145491A1 - 내재성 세포를 이용한 근골격계 손상과 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: WO2020145491A1
Application number: PCT/KR2019/013906
Authority: WO
Inventors: 조현철; 이승연
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2020-07-16
Also published as: KR20200087452A; US20220088153A1; KR102207694B1

Abstract

본 발명은 골수 내 내재성 세포 증식 효과를 갖는 근골격계의 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명의 약학 조성물은 골수 내에서 내재성 세포를 증식시키고 기능을 강화시킴으로써 근골격계 질환의 치료용도로 사용될 수 있다.

Description

내재성 세포를 이용한 근골격계 손상과 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

본 발명은 골수 내 내재성 세포 증식 효과를 갖는 근골격계 손상과 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명의 약학 조성물은 골수 내에서 내재성 세포를 증식시키고 기능을 강화시킴으로써 근골격계 손상과 질환을 예방하거나 치료하는 용도로 사용될 수 있다.

근골격계는 신경, 건(힘줄), 근육, 골, 인대, 연골판(물렁뼈) 등을 통틀어 일컫는 것으로, 반복적인 동작, 부적절한 작업자세, 무리한 힘의 사용, 날카로운 면과의 신체접촉, 진동 및 온도, 과사용, 외상 및 연령의 증가 등의 요인으로 인해 손상, 퇴행 및 변형으로 목, 어깨, 허리, 팔·다리의 신경·근육 및 그 주변 신체조직 등에 질환이 나타나게 된다.

이 중에서 건(tendon)이나 인대(ligament)는 섬유성 연부조직으로, 콜라겐을 주요 구성성분으로 하며, 각각 뼈와 뼈, 뼈와 근육으로 부착점만 다를 뿐 기계적 물성뿐만 아니라 구조적인 면이 매우 흡사하다.

상기 건(힘줄)과 인대는 혈류의 공급이 인체의 다른 조직보다 상대적으로 부족하며, 기질 대비 세포의 수가 적고 기질 세포 또한 매우 분화된 세포로, 한번 손상되면 재생되는데 상당한 시간이 소요되고, 설사 재생된다고 하더라도 손상되기 이전과 같이 기능이 완전히 회복되지 못하는 것으로 보고되고 있다.

미국에서는 어깨부위의 건(힘줄) 손상과 이와 관련된 질환으로 인해, 약 70조($7 billion)의 사회 경제적 비용이 소모되고 있다. 이 중에서도 회전근개 질환이 가장 흔한 원인으로, 연간 450만회의 병원 방문과 약 300,000회의 수술이 행하여지고 있으며, 수술로 인한 비용만 30조($3 billion)에 도달하였다. 회전근개 질환 중에서도 가장 대표적인 수술은 견봉 성형술(subacromial decompression)인데, 이는 무릎 반월상 연골 수술(meniscal surgery), 무릎 인공 관절 치환술(TKR) 보다 더 많이 행해지고 있으며, 근골격계 전체 수술 중 2위로, 2010년대에는 더 크게 증가할 것으로 예상되고 있다.

현재 회전근개 질환을 비롯한 근골격계 질환을 치료하는 방법들은 대부분, 원인은 그대로 두고 드러난 증상만을 치료하는 대증적 치료들이다. 즉 초기에 휴식, 소염제 및 스테로이드제 등을 이용하여 염증을 가라앉히는 데에 초점을 맞추고, 추후 파열이 발생하면 수술적 치료를 진행한다.

이러한 치료방법은 최소한 4가지 이상의 명확한 문제점을 갖는다. 우선 건 질환에서는 흔히 말하는 '건염'이라는 말에도 불구하고, 통상적인 염증 세포가 거의 발견되지 않는다. 따라서, 소염제나 스테로이드제의 처방이 효과가 거의 없을 수 있다. 또한, 대증적 치료 방법은 아직도 명확하지 않은 건 질환의 근본적 원인을 해결하지 못하기에, 만성적인 건 질환에서는 거의 효과를 나타내지 못하고 있다는 것이다. 추후 파열이 발생하여 수술을 한다고 해도, 이 역시 근본 원인에 대한 치료가 아닌 임시적 방편에 불과하다는 것이다. 최종적으로 회전근개 복원술은 임상결과는 비교적 양호하지만, 수술 1-2년이 경과한 후에는 약 27~94%의 재파열을 나타난다는 것이다.

상술한 문제점과 한계점을 극복하기 위하여, 다양한 생물학적 치료 방법이 개발되고 있고, 그 중 외재(exogenous) 또는 내재성(endogenous) 줄기세포를 이용한 치료법도 많은 연구자들에 의하여 연구되고 있다. 하지만, 외재성 또는 내재성 줄기세포를 이용한 치료법의 공통적인 문제 중 하나는 병변에 충분한 숫자의 줄기세포를 공급하기가 어렵다는 것이다. 즉, 신체내 자연적인 상태에서 골수내에 존재하는 줄기세포의 수가 현저히 작기 때문에 효율적인 치료가 이루어질 수 없으며, 다발성 채널링(multiple channeling)이나 미세골절술(microfracture) 과 같은 골수 자극 시술법(bone marrow stimulation procedure)을 시행하더라도 병변으로 이동하는 줄기세포의 수가 역시 매우 낮아 치료 효과가 크지 않을 수 있으며, 이는 현재로서는 극복하기 매우 어려운 문제점이다.

게다가 근골격계 질환이 주로 발생하는 고령에서는 줄기세포와 같은 내재성 세포의 숫자가 더욱 감소되고, 골관절염 등의 만성질환일 경우에는 특히나 내재성 세포의 증식력이 현저히 낮기 때문에, 기존의 근골격계 치료가 제대로 효과를 발휘하지 못한다는 단점이 있다.

이러한 문제점과 단점을 보완하기 위하여, 병변에 줄기세포를 더 유지하고자 미세골절술과 같은 수술을 시행한 후, 히알루론산을 처리하거나, 콜라겐 III/I 막을 추가하여 미세골절부위로 줄기세포가 손실되거나 흩어지지 않도록(autologous matrix induced chondrogenesis, AMIC)하는 치료법들이 개발된바 있다. 그러나 아직까지 이렇다 할 결과를 나타내지 못하고 있고, 오히려 염증반응이 유발되는 문제점이 발견되었다.

이외에도 성장인자가 함유된 콜라겐막이나 중층 지지체를 사용하여 건 또는 인대 질환을 치료하는 방법이 공지되었지만, 실질적으로 줄기세포의 손실이나 유실을 얼마나 억제할지 입증되지 않았으며, 가능하다고 하더라도 원래 병변 부위의 골수에서는 줄기세포의 수가 너무 작기 때문에, 그 효과가 크지 않다는 단점이 있다. 따라서 새로운 치료법의 발굴의 필요성이 대두되었다.

상기와 같은 문제점을 해결하고, 근골격계 질환을 치료하기 위한 새로운 치료제를 개발하기 위해서는 우선 내재성 세포 자체를 증가시켜야하는데, 종래 치료법들은 내재성 세포를 활용하거나, 내재성 세포의 유실을 방지하기 위한 조성물들이 대부분이므로, 병변에서는 줄기세포와 같은 내재성 세포의 수가 거의 없다는 점을 고려한다면 치료효과 또는 적용 질환이 매우 제한적이기 때문에 기존에 사용해오던 치료전략으로는 한계가 있다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 혈소판풍부혈장(PRP)을 유효성분으로 하는 새로운 근골격계 질환 치료제를 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 약학 조성물을 고안하였고, 이를 환부에 주입시 내재성 세포가 증식되고 환자로부터 증상이 완화 및 치료됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계 질환 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 상기 조성물을 투여하는 근골격계 질환 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 근골격계 질환용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 신규 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하고, 근골격계에서 내재성 세포의 내성장을 증식시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 근골격계 질환 치료 전처리용 조성물과 보조제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 근골격계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산의 혼합 중량비가 10-20 : 1-4 : 1 : 1-3일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혈소판풍부혈장(PRP)은 자가 또는 동종유래일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혈소판풍부혈장(PRP)는 200~5,000 × 10³platelets/㎖ 농도일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 약학 조성물은 환부에 주사되는 겔형의 주사제일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 환부가 골-건 접합부 또는 골-인대 접합부일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 환부가 다발성 채널링을 통해 형성된 골내 통로일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 근골격계 질환은 근육 질환, 건 질환, 연골질환, 관절 질환, 인대 질환, 신경, 근육, 건, 인대, 골, 연골, 연골판(물렁뼈), 관절의 손상과 변성으로 인해 유도된 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 근골격계 질환은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염 , 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상, 건 좌상, 건 파열, 건 열상, 건 박리, 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상, 인대 파열, 인대 염좌, 연골연화증, 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 약학 조성물은 내재성 세포의 증식을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계 질환 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물을 투여하는 근골격계 질환 치료방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 근골격계 질환용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 신규 용도를 제공한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하고, 근골격계의 골수내에 내재성 세포를 증식시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 근골격계 복원술 전처리용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하고, 근골격계의 골수내에 내재성 세포를 증식시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 근골격계 복원술 보조제를 제공한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 혼합하는 단계를 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산은 10-20 : 1-4 : 1 : 1-3의 중량비로 혼합되는 것일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

(ii) 또한, 본 발명은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하고, 근골격계에서의 내재성 세포 내성장을 증식시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 근골격계 질환 치료 전처리용 조성물, 바람직하게는 근골격계 복원술 전처리용 조성물을 제공한다.

(iii) 본 발명의 조성물은 다양한 원인에 기인한 근골격계 질환에 대해 내재성 세포의 수가 거의 없음에도 효과적인 치료효과를 나타내도록 안전한 물질로, 회전근개 건이 파열된 환자를 대상으로 한 인 비보(in vivo) 실험에서 회전근개 건 치료 효능을 나타낸 바, 이를 이용하여 근골격계 손상이나 파열 등과 같은 질환 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 실시예 1로부터 제조된 조성물을 투여하기 전과, 후 환자로부터 채취한 골수의 섬유모세포-집락 형성 단위 분석(CFU-F assay)결과이다.

도 2는 실시예 1의 조성물을 투여하기 전과 투여한 후 환자로부터 채취한 골수에서 분리된 세포의 계대배양을 하기 전(P0) 섬유모세포-집락 형성 단위 분석(CFU-F assay)결과이다.

도 3은 실시예 1의 조성물을 투여하기 전과 투여한 후 환자로부터 채취한 골수에서 분리된 세포의 계대배양을 한 후(P1) 섬유모세포-집락 형성 단위 분석(CFU-F assay)결과이다.

도 4는 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술의 수술 과정을 나타낸다.

도 5a는 정상 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다.

도 5b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술하기 전, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 빨간 화살표는 회전근개 파열로 회전근개가 관찰되지 않는 부위를 나타낸 것이다.

도 5c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 직후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 빨간 화살표는 다발성 채널링으로 형성된 수술부위의 통로를 나타낸 것이다.

도 5d는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술하고 1년이 지난 후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 빨간 화살표는 재생된 회전근개를 표기한다.

도 6a는 정상 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다.

도 6b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술하기 전, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 파열로 회전근개가 관찰되지 않았다.

도 6c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개가 재생되었음을 알 수 있다.

도 7a는 수술전, 중간 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of medium size)을 갖는 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다.

도 7b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 직후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다.

도 7c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육이 재생되었음을 알 수 있다.

도 8a는 수술전, 거대한 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of massive size)을 갖는 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다.

도 8b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 직후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다.

도 8c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육이 재생되었음을 알 수 있다.

도 9a는 수술전, 거대한 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of massive size)을 갖는 환자의 회전근개 근육에 대한 자기공명영상(MRI)이다.

도9b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 근육에 대한 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육이 효과적으로 재생되었음을 확인하였다.

도 10은 보이든 챔버 분석 방법을 통해 줄기세포의 화학주성을 측정하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 11은 아가로스 화학주성 분석 방법을 통해 줄기세포의 화학주성을 측정하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 12는 각 줄기세포에 실시예 1의 조성물, 항생제, G-CSF, SDF-1α 및 IL-1β를 처리한 후, 보이든 챔버 분석법(Boyden chamber assay)으로 분석한 결과이다.

도 13은 각 줄기세포에 실시예 1의 조성물, 항생제, G-CSF, SDF-1α 및 IL-1β를 처리한 후, 아가로스 화학주성 분석법(Agarose chemotaxis assay)으로 분석한 결과이다.

도 14는 수술 2, 4주 후, 수확된 2 그룹과 3 그룹의 손상 부위를 촬영한 사진이다.

도 15는 각 그룹으로부터 수확한 조직 표면을 Safranin-O/Fast green 염색하고 광학현미경으로 촬영한 사진이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 다양한 원인에 기인한 근골격계의 손상이나 질환에 대해 내재성 세포의 수가 거의 없음에도 효과적인 치료효과를 나타내도록 안전하게 처방할 수 있는 물질을 찾고자 노력한 결과 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 함으로써, 병변부위에 존재하는 세포의 손실이나 유실없이 내재성 세포의 증식과 기능을 회복시켜 근골격계 질환을 치료하는데 그 효과가 매우 우수함을 확인하였다.

본 명세서에서, 용어 "내재성 세포"는 병변부위의 골수 내에 존재하는 세포들을 통틀어 의미하는 것으로, 줄기세포, 분화된 세포, 줄기세포와 분화된 세포 사이의 세포 등을 포함하며, 바람직하게는 주로 골수 내에 내재되어 있는 줄기세포들을 의미하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "근골격계 질환"의 예방 또는 치료 활성은 근골격계의 손상이나 다침으로부터 유발된 근골격계의 질환을 예방, 개선 또는 치료의 활성을 의미한다. 구체적으로 개체가 치료되는 병상을 완화, 그 진행을 지연, 그 치유를 가속, 그 치유 반응을 개선하거나 병상을 회복시키거나, 손상된 근골격계와 관련된 통증의 완화, 이환된 관절의 동작 범위의 증가, 및 복구 부위에 존재하는 내재성 세포 특히 줄기세포의 증식 및 기능을 회복시키는 등의 바람직한 임상 또는 치료 효과를 유발하는 것을 의미한다.

상기 근골격계 질환은 신경, 근육, 건, 인대, 골, 연골, 연골판(물렁뼈), 관절 및 그 주변 신체 조직 등에 나타내는 손상이나, 이들의 손상이나 변성으로 인해 유도된 퇴행성 혹은 난치성 질환을 포함하는 것으로, 특별히 이에 한정되지 않는다.

이러한 근골격계 질환은 경제활동의 주역인 청, 장년층에서 반복적인 활동과 부자연스러운 자세의 지속에 따라 발생되기도 하지만, 대부분 노령화에 따른 퇴행성 질환의 성격이 강하다. 그리고 상기 질환은 상태에 따라 작업 중 또는 휴식 시에 통증을 동반하는 경우가 많다.

상기 근육 질환은 근위축성 질환일 수 있으며, 예를 들면 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 피부 근육염(dermatomyositis), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 신경 손상(nerve injury), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 악액질(cachexia), 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 건 질환은 근육과 뼈를 연결하는 섬유성 조직인 건이 상해나 과도한 운동 또는 세균에 의해 감염되거나 다른 질환들에 의해 손상되어 유발된 질환을 통칭하는 의미한다.

상기 건(힘줄)은 슬개건, 전경골근건, 아킬레스건, 햄스트링 건, 반건양근 건, 박근 건, 외전근 건, 내전근 건, 극상근 건, 극하근 건, 견갑하근건, 소원근건 (회전근개 복합체), 장 및 단요수근신근 건과 요 및 척 수근굴근 건 등을 포함하는 사지 및 사지 관절의 각종 굴근 건 및 신전 건, 대퇴사두근 건, 및 후경골근 건으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 일부 실시예에 따르면 상기 건은 슬개건, 전경골근 건, 아킬레스건, 햄스트링 건, 반건양근 건, 박근 건, 외전근 건, 및 내전근 건으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 또한 또 다른 실시예에 따르면 상기 건은 극상근 건, 극하근 건, 견갑하근 건, 소원근건(회전근개 복합체), 굴근 건, 대퇴직근 건, 후경골근 건, 및 대퇴 사두근 건으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

바람직하게 상기 건 질환은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염 , 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상, 건 좌상, 건 파열, 건 열상 및 건 박리로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물이 적용 가능한 인대는 당해 분야에서 통상적인 범주라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들면 오구쇄골 및 오구견봉인대, 견갑와상완인대, 전방 십자인대, 외측 측부 인대, 후방 십자인대, 내측 측부 인대, 전십자인대, 꼬리 십자인대, 윤상갑상 인대, 치주 인대, 수정체의 현수 인대, 전방 천장 인대, 후방 천장 인대, 엉치결절 인대, 엉치가시 인대, 하방 치골 인대, 사지 관절의 내외측 측부인대, 상방치골 인대, 현수 인대(예를 들어, 음경 또는 유방), 장측 요수근 인대, 배측 요수근 인대, 척골측 측부 인대 및 요골측 측부 인대, 삼각인대 및 전거비인대 등의 족근관절부 인대 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 연골 질환은 연골 조직의 손상으로부터 유래한 연골 질환일 수 있고, 구체적으로 연골연화증, 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 관절 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 근골격계 질환은 이외 신경, 근육, 건, 인대, 골, 연골, 연골판(물렁뼈), 관절의 손상과 변성으로 인해 유도된 질환을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 회전근개 건이 파열된 환자를 대상으로 한 인 비보(in vivo) 실험에서 회전근개 건 치료 효능을 나타내고, 상기 조성물을 투여하고 1년이 지난 후, (1) 동통이 감소하고 (2) 관절 운동 범위가 개선되었으며, (3) 근력, 그리고 (4) 6종류의 흔하게 사용되는 견관절의 기능 점수가 유의하게 증가하는, 치료 효과를 나타내었다(실험예 7).

본 발명의 상기 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산의 혼합 중량비가 10-20 : 1-4 : 1 : 1-3인 것이 바람직하다. 본 발명의 4가지 구성요소 중 일부를 포함하지 않을 경우에는 겔화 또는 수축에 소요되는 시간이 길어지게 되는 문제가 발생할 수 있다. 상술한 문제를 갖는 조성물을 생체 내에 주입할 경우 내재 줄기 세포의 동원(recruitment or homing) 및 증식(proliferation)을 유도할 수 없고, 오히려 내재성 세포 특히 줄기세포의 유실을 촉진할 염려가 있으므로, 상기 조성물은 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 필수적으로 포함하는 것이 가장 바람직하다.

구체적으로 본 발명에 따른 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 하는 조성물은 겔화, 수축여부 뿐만 아니라, 혈소판 유래 성장인자의 분비기간을 비롯하여 내재성 세포의 증식 및 기능회복 정도 등의 다양한 치료효과들을 살펴본 결과, 선택된 것으로 후술하는 실험예에서 혈소판 유래 성장 인자를 장기간(1~14일)동안 분비하였고, 그 이후로도 상대적으로 높은 농도의 혈소판 유래 성장 인자를 분비하였으나, 바트록소빈과 트라넥사믹산이 혼합되지 않을 경우에는 현저히 작은 양의 혈소판 유래 성장 인자를 분비하였으며, 7일부터 분비량이 급격히 감소하여, 10일부터는 측정이 불가하거나 매우 미량의 농도만이 검출되는 것을 확인하였다. 즉 본 발명의 4가지 구성요소 중 일부를 포함하지 않을 경우에는 혈소판 유래 성장 인자의 분비기간이 2배 이상 현저히 짧아지므로 충분한 치료효과를 달성하기 어렵다는 단점이 있을 수 있다.

예를 들어, 바트록소빈과 트라넥사믹산이 포함되지 않은 경우, 나머지 구성요소가 본 발명의 조성물과 동일한 혼합비율로 혼합될지라도, 혈소판 유래 성장인자의 분비 농도가 낮고, 단기간 동안만 분비되는 것을 확인하였다(실험예 3).

종래 겔 제제에서와 같이, 혈소판풍부혈장과 히알루론산 또는 트롬빈이 혼합되어 조성물을 형성하는 경우에는, 칼슘이 존재한다고 하더라도 본원발명의 조성물에 비해 내재성 세포의 증식능이 현저히 낮고, 충분한 내재성 세포의 증식능을 확보하는데 소요되는 시간이 14일 이상 오래 소요된다는 문제점이 있었다(실험예 4).

또한 본 발명의 조성물은 칼슘과 바트록소빈 또는 트라넥사믹산의 혼합부피비가 1:2인 것이 가장 바람직한데, 이는 칼슘과 바트록소빈을 1:2, 2:2, 1:4로 혼합한 것 중에서 1:2인 조성물이 줄기세포 등을 포함하는 내재성 세포 증식에서 가장 우수한 효과를 나타내는 결과를 통해서 확인할 수 있다(실험예 4).

본 발명의 약학 조성물의 유효성분인 혈소판풍부혈장(PRP)은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 방식으로 제조된 것이라면 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명에서는 표준적이고, 일관성있는 방법인 혈소판 성분 채집 시스템 (plateletpheresis system with a leukoreduction set; COBE Spectra LRS Turbo, Caridian BCT, Lakewood, Colorado)를 이용하여 분리하였다.

구체적으로 상기 혈소판풍부혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)은 자가 또는 동종유래인 것일 수 있고, 구체적으로 혈소판풍부혈장은 혈장 내에 혈소판이 많이 함유된 혈장으로 원심분리를 이용하여 전혈로부터 분리된 혈장 하단부의 혈소판이 가장 풍부하게 함유된 것이다. 상기 혈소판풍부혈장은 자가 또는 동종으로부터 전혈을 채취한 후, 초고속 원심분리기로 1차 원심분리하고, 이의 상층액을 회수하여 얻을 수 있다. 상기 혈소판풍부혈장의 필요한 농도에 따라 추가적으로 원심분리를 행할 수 있다. 상기 혈소판풍부혈장(PRP)는 200~5,000 x 10³platelets/microL 농도인 것을 사용하는 것이 바람직하므로, 농축된 혈소판풍부혈장을 사용할 경우에는 상기 농도의 범주에 속하도록 희석하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 추출한 혈소판풍부혈장은 물리적으로 혈소판을 농축시킨 것으로, 실질적으로 내재성 세포의 증식 및 기능 회복을 증진시키는 혈소판 유래 치유 성장인자들은 활성화되지 않은 것이다. 혈소판 내에 존재하는 다량의 혈소판 유래 성장인자들의 활성화 및 분비를 위해서는 혈소판의 활성화가 선행되어야 한다. 일반적으로 혈소판풍부혈장의 혈소판을 활성화시키기 위해서는 염화칼슘, 트롬빈, 콜라겐, 세로토닌, 아데노신 이인산염(ADP) 및 아세틸콜린(ACH) 등과 같은 활성인자들이 사용되어 왔으나, 앞서 설명한 바와 같이 본 발명의 조성물은 상기 칼슘을 제외한 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 반드시 포함하고 있어야 하며, 상기 구성성분 중에서 어느 하나라도 생략하거나 단독으로 사용될 경우에는 겔화 또는 수축되지 않거나, 겔화 또는 수축에 소요되는 시간이 길어지게 되는 문제가 발생할 수 있다. 상술한 문제를 갖는 조성물을 생체 내에 주입할 경우 내재 줄기 세포의 동원(recruitment or homing) 및 증식(proliferation)을 유도할 수 없고, 오히려 내재성 세포의 유실을 촉진할 염려가 있다.

본 발명의 조성물의 제제 형태는 겔형이고, 환부에 주사되는 겔형의 주사제일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물은 주사기 및 바늘 또는 삽입관을 통해 목적하는 부위에 적용될 수 있고, 상기 본 발명의 조성물은 환부에 적용함에 있어서 상기 환부는 골-건 접합부 또는 골-인대 접합부일 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물이 투여되는 위치는 외과적으로 준비되어야 하며, 상기 환부에 관통, 파쇄 또는 뚫기와 같은 과정을 통해 수행된 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 환부에 다발성 채널링을 통해 형성된 골내 구멍 또는 통로일 수 있다.

본 발명에서 용어 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물에 포함된 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 1회 0.001-100 ㎎/㎏이다.

또한, 본 발명은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계 질환 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 신규 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 근골격계 질환 치료방법을 제공한다.

본 발명자에 따른 조성물은 근골격계의 손상이나 질환에 대해 내재성 세포의 수가 거의 없음에도 효과적인 치료효과를 나타내도록 안전하게 처방할 수 있는 것으로, 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 함으로써, 병변부위에 존재하는 세포의 손실이나 유실없이 내재성 세포의 증식과 기능을 회복시켜 근골격계 질환을 치료 및 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기 근골격계 질환은 신경, 근육, 건, 인대, 골, 연골, 연골판(물렁뼈), 관절 및 그 주변 신체 조직 등에 나타내는 손상이나, 이들의 손상이나 변성으로 인해 유도된 퇴행성 혹은 난치성 질환을 포함하는 것으로, 특별히 이에 한정되지 않으며, 보다 구체적인 사항은 약학 조성물에 대한 설명을 참고하기로 한다.

상기 ‘의약’, ‘동물용 약학 조성물’ 또는 ‘동물용 의약’은 겔화, 수축여부 뿐만 아니라 혈소판 유래 성장인자의 분비기간을 비롯하여 내재성 세포의 증식 및 기능회복 정도 등의 다양한 치료효과들을 살펴보았고, 그 결과 선택된 것으로 본 발명의 4가지 구성요소 중 일부를 포함하지 않을 경우에는 혈소판 유래 성장 인자의 분비기간이 2배 이상 현저히 짧아지므로 충분한 치료효과를 달성하기 어렵다는 단점이 있을 수 있다.

상기 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 사용량은 환자 또는 치료대상 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 질환의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성에 의존적일 것이다.

상기 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자 또는 치료대상 동물의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1회 0.001-100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

상기 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 근골격계 질환의 치료방법은 인간, 또는 인간을 제외한 동물, 특히 포유동물에게 상기 조성물을 비경구 투여하는 것으로, 예를 들어 주사기 및 바늘 또는 삽입관을 통해 목적하는 부위에 상기 조성물을 비경구 투여하는 것이다. 상기 본 발명의 조성물은 환부에 적용함에 있어서 상기 환부는 골-건 접합부 또는 골-인대 접합부일 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물이 투여되는 위치는 외과적으로 준비되어야 하며, 상기 환부에 관통, 파쇄 또는 뚫기와 같은 과정을 통해 수행된 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 환부에 다발성 채널링을 통해 형성된 골내 구멍 또는 통로일 수 있다.

상기 치료를 위한 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수는 상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수를 참고할 수 있다.

또한, 본 발명은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하고, 근골격계에서의 내재성 세포를 증식시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 근골격계 질환 치료를 위한 치료의 전처리용 조성물과 보조제를 제공할 수 있다. 상기 '근골격계 질환 치료를 위한 치료'는 근골격계 질환을 치료하기 위한 약물투여, 시술 또는 수술을 포함하고, 상기 근골격계 질환을 치료하기 위한 치료는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 근골격계 복원을 위한 시술이나 수술일 수 있으며, 가장 바람직하게는 근골격계 복원술일 수 있다.

근골격계 질환을 치료하기 위하여 다양한 수술방법들이 개발되어 있는데, 환자가 급성기 환자이거나, 고령이거나, 고령이 아니더라도 환부에 위치한 골수 내에 존재하는 내재성 세포의 양이 너무 작다면 근골격계의 손상과 질환을 예방 또는 치료하는데 충분히 공급할 수 있는 혈소판 유래 성장 인자를 발현 및 분비하지 못하므로, 시술에 제한되거나 시술을 받더라도 치료효과가 크지 않다는 문제점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 내재성 세포 또는 혈소판풍부혈장을 투여하는 치료방법이 개발되었지만, 내재성 세포나 혈소판풍부혈장이 환부에 고정되지 못하고 체내로 흡수되거나 다른 곳으로 흘러가버리기 때문에 치료에 필요한 충분한 기간동안 혈소판 유래 성장인자를 제공하지 못하므로, 이를 통해 실질적으로 근골격계 질환을 치료하는데 성공한 사례가 없는 것으로 알려져 있다.

상기 단점을 보완하고자 상기 내재성 세포 또는 혈소판풍부혈장에 히알루론산 또는 트롬빈 등의 담체를 첨가한 기술들이 공지되었으나, 이 역시 뚜렷한 결과를 나타내지 못하였으며, 일부는 오히려 염증반응이 유발되는 등 나쁜 예후를 나타내었다.

앞으로의 현대사회가 점차 고령화되어 감에 따라, 내재되어 있는 내재성 줄기세포의 함량이 낮아 근골격계 질환 발생시 시술이나 수술이 어렵거나, 수술을 진행하더라도 예후가 좋지않은 환자들이 증가해가고 있다. 이에 상술한 문제점들을 해결하면서도 장기간의 치료동안 충분한 농도의 혈소판 유래 성장인자를 제공함으로써, 환부로부터 내재성 세포의 증식 및 기능 회복을 도모하여, 환부에 존재하는 내재성 세포의 함량과는 상관없이 근골격계 질환에 대한 시술의 치료 효과를 증진시킬 수 있는 새로운 치료제 혹은 치료방법의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 개설할 수 있도록, 근골격계 질환 치료를 위한 수술을 수행함에 있어, 환부에 내재되어 있는 내재성 세포의 함량이 낮아도 환자의 치료효과를 최대화하거나, 치료기간을 최대한으로 줄일 수 있고, 시술 또는 수술 성공율을 높이며, 치료 후 재발가능성을 낮추도록, 근골격계 복원을 위한 시술이나 수술의 전처리용 또는 보조용 조성물에 관한 것이다. 가장 바람직하게는 건 또는 인대 복원술의 전처리용 또는 보조용 조성물일 수 있다.

상기 근골격계 질환 치료를 위한 근골격계 복원술 전처리용 조성물, 근골격계 손상 치료를 위한 근골격계 복원술 전처리용 조성물 또는 이의 보조제는 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하며, 내재성 세포의 농도가 현저히 낮은 환부(건 또는 인대, 또는 이와 뼈의 접합부)에서 내재성 세포의 증식, 기능 회복을 신속히 극대화하고, 지속적으로 유지시켜, 이의 재생기전을 이용한 치료를 안전하고, 간단하며, 효율적으로 할 수 있고, 근골격계 질환의 경우 상기 조성물을 시술 전 미리투여 하여 시술에 의한 내재성 세포의 농도를 개선하여 건 또는 인대 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 다양한 실험을 통해 확인하였다.

상기 근골격계 수술 또는 근골격계 복원술은 근육, 건, 인대, 연골, 관절 및 그 주변 신체 조직 등에 나타내는 손상이나, 이들의 손상이나 변성으로 인해 유도된 퇴행성 혹은 난치성 질환을 치료 및 복원하기 위한 통상의 수술들을 포함하며, 예를 들어 건 또는 인대의 복원술, 관절경적 복원술, 최소절개 복원술, 국소 건 전위술, 국소 건 대치술, 건 이전술, 광배근 이전술, 관절낭 이동술, 관절 대치 성형술, 반치환술, 역견관절 치환술, 인대 재건술, 견봉성형술, 고관절 반치환술 및 대퇴골 골절 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

구체적으로 상기 조성물의 환부로 적용함에 있어서, 본 발명은 근골격계 질환 치료를 위한 수술 또는 복원술을 받기 이전 또는 받은 이후 환자에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게는 근골격계 질환 치료를 위한 수술이나 복원술을 받기 이전이나 혹은 받는 중에 병용 투여될 수 있다. 상기 근골격계 질환 치료를 위한 수술 또는 복원술 또는 시술은 신경, 근육, 건, 인대, 연골, 연골판(물렁뼈), 관절 및 그 주변 신체 조직에 대한 부착 또는 재부착 시술들로, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 회전근개 복원술, 회전근개 개방성 수복술, 회전근개 최소 개방성 수복술, 관절경하 수복술 등이 있다.

구체적으로 본 발명의 조성물은 환부에 주사될 수 있고, 상기 환부는 다발성 채널링(또는 미세골절술) 시술을 통해 형성된 건 또는 인대와 접합하는 접합부 부근의 하나 이상의 미세한 구멍 또는 통로일 수 있고, 상기 시술을 통해 형성된 구멍이나 통로로 본 발명의 조성물이 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 혼합하는 단계를 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산은 10-20 : 1-4 : 1 : 1-3의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 근골격계 질환을 치료하기 위한 키트를 제공한다.

상기 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물은 소정 농도의 혈소판풍부혈장을 포함한다. 혈소판풍부혈장의 농도는 치료되는 근골격계 손상과 질환의 특성에 따라 미리 결정될 수 있다.

상기 키트는 주사기를 더 포함할 수 있다. 상기 주사기는 수술 부위, 예를 들어 근골격계(근육, 건, 인대, 연골, 관절 및 그 주변 신체 조직)에 적용을 위해 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 주입 또는 투여를 용이하게 할 수 있다. 키트는 또한 사용 지시서를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

<제조예 1> 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 제조

혈소판 풍부 혈장(PRP)은 혈소판 성분 채집 시스템(plateletpheresis system with a leukoreduction set; COBE Spectra LRS Turbo, Caridian BCT, Lakewood, Colorado)를 이용하여 분리하였다. 혈소판의 농도는 마이크로 리터당 1,400 x 10³개였고, 항응고제는 ACD-A 용액을 사용하였다. 임상실험을 위하여 상술한 과정을 통해 분리한 혈소판 풍부 혈장을 5,000 × 10³platelets/microL의 농도로 농축하여 보관하였다. 실험에 따라 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.

실험에 사용하기에 앞서, 상기 회수한 동종 혈소판 풍부 혈장의 안전성 평가를 위하여 B형 및 C형 간염 검사, 인간 면역 결핍 바이러스 검사 및 매독 검사를 수행하였다.

<실시예 및 비교예> 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 제조

혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 혼합비율에 따른 젤화 특성을 분석하고자 하였다.

혈소판 풍부 혈장은 제조예 1로부터 회수하여 보관하던 것을 사용하였고, 구체적으로 1,000~1,400 x 10³platelets/microL 농도로 희석하여 사용하였다. 칼슘(Ca)은 칼슘 글루콘산으로 중외제약으로부터 구매하였다. 바트록소빈(BTX)은 보트로파제로, 한림제약으로 구입하였다. 트라넥사믹산(TXA)은 대한약품으로부터 구매하였다. 트롬빈(THRB)은 트롬빈동결건조분말로 이연제약으로부터 구매하였고, 166.67 IU의 농도로 희석한 용액을 사용하였다. 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 표 1에서와 같이 다양한 부피로 혼합하여 실시예와 비교예의 조성물을 제조하였다. 히알루론산은 LG생명과학으로부터 구입하였다.

구분	혈소판풍부혈장(㎖)	바트록소빈(㎖)	칼슘(㎖)	트라넥사믹산(㎖)	트롬빈(㎖)	히알루론산(㎖)
실시예 1	2	0.2	0.1	0.23	-	-
실시예 2	2	0.2	0.2	0.24	-	-
실시예 3	2	0.4	0.1	0.25	-	-
실시예 4	2	0.4	0.2	0.26	-	-
실시예 5	2	1	0.1	0.31	-	-
실시예 6	2	1	0.2	0.32	-	-
비교예 1	2	0.2	0	0	-	-
비교예 2	2	0.2	0	0.22	-	-
비교예 3	2	0.2	0.1	0	-	-
비교예 4	2	0.2	0.2	0	-	-
비교예 5	2	0.4	0	0	-	-
비교예 6	2	0.4	0.1	0	-	-
비교예 7	2	0.4	0.2	0	-	-
비교예 8	2	0.4	0	0.24	-	-
비교예 9	2	1	0	0	-	-
비교예 10	2	1	0	0.3	-	-
비교예 11	2	1	0.1	0	-	-
비교예 12	2	1	0.2	0	-	-
비교예 13	2	0	0.2	0	-	-
비교예 14	2	0	0.2	0.22	-	-
비교예 15	2	0	0.2	0	166.67 IU	-
비교예 16	2(혈소판 궁핍 혈장)	0.2	0.2	0	-	-
비교예 17	2	0	0	0	-	2
비교예 18	2	0	0.2	0	-	2

<실험예 1> 제조예 1로부터 회수한 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 특성 분석

제조예 1로부터 회수한 혈소판 풍부 혈장(PRP)과 전혈(whole blood)과 혈소판 궁핍 혈장(PPP)을 분리하고, 이를 전자동형 혈구 분석기(XE-2100, Sysmex Corp, Kobe, Japan)를 이용하여 전체 혈구 측정(complete blood counts)을 시행하여 측정된 혈소판 풍부 혈장의 평균 혈소판, 적혈구 및 백혈구의 농도를 표 2에 나타내었다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표기하였다.

구분	혈소판 농도 (×10³/㎕)	적혈구 농도 (×10⁶/㎕)	백혈구 농도(×10⁶/㎕)	피브리노겐 농도(㎎/㎗)
전혈	207.33±14.22	4.80±0.39	7.64±2.06	244.95±61.57
혈소판 풍부 혈장	1,050.00±234.80	0.18±0.07	0.03±0.03	258.18±58.86
혈소판 궁핍 혈장	4.75±2.22	0.00±0.00	0.01±0.00	236.10±82.22

표 2에 나타난 바와 같이, 혈소판 풍부 혈장의 평균 혈소판, 적혈구 및 백혈구의 농도는 각각 1,050.00 ± 234.80 × 10³/㎕, 0.18 ± 0.07 × 10⁶/㎕, 0.03 × 0 .03 × 10⁶/㎕인 것으로 확인되었다.

<실험예 2> 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물의 겔화 특성 분석

실시예 1 내지 6 및 비교예 1 내지 16으로부터 제조된 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물들의 젤화 특성을 분석하고자 하였다. 상기 조성물의 젤화시간(gelation time), 수축시간(contraction time)을 측정하여 표 3에 나타내었다. 상기 겔화시간은 조성물의 제조시점부터 젤이 형성될 때까지의 시간을 측정한 것이고, 상기 수축시간(contraction time)은 조성물의 제조시점부터 젤이 수축될 때까지의 시간을 측정한 것이다.

구분	혈소판풍부혈장(㎖)	바트록소빈(㎖)	칼슘(㎖)	트라넥사믹산(㎖)	트롬빈(㎖)	겔화시간(분)	수축시간(분)
실시예 1	2	0.2	0.1	0.23	-	4.5±1.0	23.8±4.8
실시예 2	2	0.2	0.2	0.24	-	7.3±1.5	17.0±1.2
실시예 3	2	0.4	0.1	0.25	-	5.3±1.0	23.8±4.8
실시예 4	2	0.4	0.2	0.26	-	3.8±0.5	18.0±1.6
실시예 5	2	1	0.1	0.31	-	3.3±1.0	24.5±3.3
실시예 6	2	1	0.2	0.32	-	3.3±1.0	17.8±2.1
비교예 1	2	0.2	0	0	-	4.7±1.2	108.0±41.6
비교예 2	2	0.2	0	0.22	-	5.3±2.3	108.0±41.6
비교예 3	2	0.2	0.1	0	-	4.5±1.0	20.3±7.1
비교예 4	2	0.2	0.2	0	-	7.8±2.4	14.8±1.5
비교예 5	2	0.4	0	0	-	3.8±1.3	na
비교예 6	2	0.4	0.1	0	-	5.3±1.0	18.8±7.8
비교예 7	2	0.4	0.2	0	-	5.3±1.0	15.5±2.5
비교예 8	2	0.4	0	0.24	-	3.8±1.3	na
비교예 9	2	1	0	0	-	2.3±0.5	na
비교예 10	2	1	0	0.3	-	3.8±2.9	na
비교예 11	2	1	0.1	0	-	4.8±2.2	22.0±3.6
비교예 12	2	1	0.2	0	-	2.8±1.0	15.5±2.5
비교예 13	2	0	0.2	0	-	20.0±12.0	35.0±7.1
비교예 14	2	0	0.2	0.22	-	16.5±10.2	31.5±5.0
비교예 15	2	0	0.2	0	166.67 IU	2.3±1.3	15.5±6.6
비교예 16	2(혈소판 궁핍 혈장)	0.2	0.2	0	-	24.5±13.7	na

*) na는 측정기간 동안 수축이 발생하지 않은 것을 의미한다.

표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 6, 비교예 1 내지 16으로부터 제조된 조성물의 겔화시간과 수축시간을 비교하였다.

혈소판 풍부 혈장(PRP)에 바트록소빈만 혼합하여 제조된 조성물(비교예 1, 5, 9)은 겔형의 제제를 형성하기는 하였으나 수축속도가 실시예 1-5의 조성물에 비해 6 배 이상 현저히 느려지거나, 수축되지 않는 것을 확인하였다.

이에 반해 혈소판 풍부 혈장(PRP)에 칼슘만 혼합될 경우(비교예 13)에는 겔화되는데 소요되는 시간과 수축에 소요되는 시간이 모두 1.25 내지 5배 이상 지연되고 있음을 확인하였다.

비교예 1, 2, 5, 8, 9, 10에서와 같이 칼슘이 혼합되지 않은 조성물은 수축이 제대로 이뤄지지 않거나 수축에 소요되는 시간이 100 분 이상이 걸렸다. 또한 비교예 13, 14의 조성물은 바트록소빈이 혼합되지 않은 것으로, 겔화속도가 유의하게 느려졌고 수축속도 또한 다소 감소하였다.

비교예 3, 4, 6, 7, 11, 12의 조성물은 혈소판 풍부 혈장(PRP)에 바트록소빈과 칼슘만이 혼합되어 제조된 것으로, 겔화 및 수축이 모두 실시예 1-5의 조성물과 동등한 수준임을 확인하였다. 그러나 추후 실험에서 혈소한 유래 성장인자의 분비나 발현량이 적거나 줄기세포(내재성 세포) 증식과 기능 회복에 유의적으로 낮은 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

종합하면, 본 발명의 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산의 구성성분 중 일부를 포함하지 않을 경우에는 겔화 및 수축되지 않거나, 겔화 또는 수축에 소요되는 시간이 현저히 길어지게 되는 문제가 발생할 수 있다. 상술한 문제를 갖는 조성물을 생체 내에 주입할 경우 내재 줄기 세포의 동원(recruitment or homing) 및 증식(proliferation)을 유도할 수 없고, 오히려 줄기세포(내재성 세포)의 유실을 촉진할 염려가 있으므로, 상기 조성물은 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산으로 구성되고, 상술한 범위 내에서 혼합되는 것이 가장 바람직하다.

<실험예 3> 시간에 따른 혈소판 유래 성장인자 분비

혈소판 유래 성장 인자(Human PDGF-AB ELISA, ELH-PDGF-2; RayBiotech, Norcross, Georgia, USA)의 농도는 실제 인체 내에서 체액에 의하여 성장 인자가 씻겨 제거되는 상황을 고려하여, wash-out 방법을 이용하여 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 방법에 따라 혈소판 유래 성장 인자 농도(ng/㎖)를 측정하여 표 4에 나타내었다. 이때, 음성 대조군은 제조예 1로부터 회수한 혈소판 풍부 혈장 2 ㎖를 포함하는 것을 사용하였다.

농도 (ng/㎖)	실시예 1(PRP+Ca+BTX+TXA)	비교예 3(PRP+Ca+BTX)	비교예 14(PRP+Ca+THRB)	비교예 13(PRP+Ca)	음성 대조군(PRP 단독)
1일	1.44	1.75	0.42	0.57	1.18
P	0.02	0.02	0.001	0.009
2일	1.65	2.04	1.22	1.07	1.9
P	0.104	0.314	0.039	0.069
5일	1.95	1.96	0.82	0.5	0.42
P	0.036	0.032	0.144	0.65
7일	0.99	1.25	0.11	0.5	0.54
P	0.068	0.071	0.02	0.008
10일	0.85	1.34	0	0.49	0.3
P	0.084	0.04	0.047	0.103
14일	0.68	1.68	0	0.51	0.34
P	0.015	0.069	0.026	0.04

P 값은 음성 대조군 농도에 대한 차이

실시예 1 및 비교예 3으로부터 제조된 조성물은 음성 대조군보다 유의하게 많은 혈소판 유래 성장 인자를 장기간(1~14일)동안 분비하였고, 그 이후로도 음성 대조군에 비해 상대적으로 높은 농도의 혈소판 유래 성장 인자를 분비함을 확인하였다.

반면, 바트록소빈과 트라넥사믹산이 혼합되지 않은 비교예 14, 13으로부터 제조된 조성물은 음성 대조군에 비해 현저히 작은 양의 혈소판 유래 성장 인자를 분비하였으며, 특히, 7일부터 분비량이 급격히 감소하여, 10일부터는 측정이 불가하거나 매우 미량의 농도만이 검출될 뿐이였다.

<실험예 4> 줄기세포 증식능

앞선 실험예 2를 통해 확인된 조성물 중에서, 겔화시간과 수축시간이 짧고, 충분한 겔 형성이 이루어진 조성물(실시예 1-3, 비교예 3-4, 6, 13-15, 17, 18)에 대하여 줄기세포 증식능을 비교하였다. 겔화되지 않은 조성물은 생체내에 병변부위에 주입할 경우, 병변부위에 머무르지 못하고 흡수되거나, 와해되거나 유실되어 버리는 문제가 있으므로, 제외하였다.

줄기세포의 증식능은 다음과 같이 분석하였다. 우선 24-well 배양 접시의 바닥에 5X10² cells/㎠의 밀도로 골수 유래 줄기세포를 분주하고, 24시간 동안 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 항생제(HyClone, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)가 함유된 LG DMEM 배지에서 배양하였다. 실시예 1-3, 비교예 3-4, 6, 13-15, 17, 18와 같이 각 time point별로 wash out 방법으로 조성물을 제조한 후, 배지 부피의 10%로 각 time point에 세포에 처리하였다. 조성물을 처리할 때는 2% 소태아혈청과 항생제가 포함된 LG DMEM 배지를 사용하였다. 이때, 음성 대조군은 제조예 1로부터 회수한 혈소판 풍부 혈장 2 ㎖를 포함하는 것을 사용하였고, 양성 대조군은 2% 소태아혈청(fetal bovine serum) 2 ㎖를 포함하는 것으로 사용하였다. 배양 배지는 매 3일마다 교환하였다. 줄기세포의 증식은 처리 후 2, 5, 7 및 14일째에 WST colorimetric 분석방법(이지사이톡스, 대일랩서비스)을 이용하여 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복수행하였고, 결과는 표 5에 나타내었다.

표 5에서의 데이터는 0 일차 양성 대조군의 측정치에 대한 배수 변화 (fold-change)를 계산하여 나타낸 것이다.

배수변화구분	0일	2일	P	5일	P	7일	P	14일	P
앙성 대조군(2% FBS)	1.00	1.33		2.47		3.19		5.84
음성 대조군(PRP 단독)	1.00	0.91	0.002	2.29	0.583	3.30	0.787	5.97	0.837
실시예 1(PRP+Ca+BTX+TXA)	1.00	1.46	0.251	4.20	0.000	6.11	0.000	8.26	0.028
실시예 2(PRP+Ca+BTX+TXA)	1.00	1.37	0.555	3.63	0.000	4.78	0.002	6.98	0.110
실시예 3(PRP+Ca+BTX+TXA)	1.00	1.38	0.528	3.84	0.000	4.68	0.009	7.23	0.095
비교예 3(PRP+Ca+BTX)	1.00	1.45	0.246	4.08	0.000	5.42	0.000	7.92	0.024
비교예 4(PRP+Ca+BTX)	1.00	1.42	0.349	3.76	0.000	4.67	0.000	6.87	0.130
비교예 6(PRP+Ca+BTX)	1.00	1.32	0.943	3.68	0.000	4.37	0.002	7.15	0.092
비교예 13(PRP+Ca)	1.00	1.33	0.786	3.66	0.001	3.93	0.016	7.54	0.049
비교예 14(PRP+Ca+TXA)	1.00	1.39	0.381	3.70	0.000	5.16	0.000	7.66	0.011
비교예 15(PRP+Ca+THRB)	1.00	1.40	0.307	4.11	0.000	4.48	0.001	6.57	0.612
비교예 17(PRP+Hyaluronic acid)	1.00	1.27	0.281	2.50	0.729	3.41	0.032	5.85	0.984
비교예 18(PRP+Ca+Hyaluronic acid)	1.00	1.34	0.793	2.92	0.015	4.01	0.005	6.45	0.416

표 5에 나타난 바와 같이, 양성 대조군은 2일째부터 1.33 이상의 수치를 나타내는데 반해, 혈소판 풍부 혈장만을 단독으로 투여한 음성 대조군은 2일째에서는 줄기세포의 증식이 오히려 감소되었다가 5일째부터 증가하였다.

히알루론산과 칼슘이 첨가된 비교예 18, 19의 조성물은 음성 대조군보다 현저히 낮은 줄기세포 증식을 나타내었다.

실시예 1 내지 3으로부터 제조된 조성물은 양성 대조군과 음성 대조군에 비해 유의하게 줄기세포의 증식이 증가하였으며, 특히 바트록소빈과 칼슘의 혼합부피비가 2:1인 실시예 1의 조성물이 가장 줄기세포의 증식을 증가시켰음을 확인하였다. 구체적으로 실시예 1의 조성물은 5일째에는 1.7배 증가하였고 7일째에는 1.92배 증가하였으며, 14일째에는 1.36배 증가하였음을 알 수 있다.

비교예 3, 4, 6의 조성물은 실시예 1-3의 조성물과 달리 트라넥사믹산이 제외된 조성물로, 동일한 혼합비율로 혼합된 각각의 실시예보다 유의적으로 낮은 줄기세포 증식능을 나타내었다.

즉, 칼슘과 바트록소빈 또는 칼슘과 트라넥사믹산이 포함된 조성물에서는 대조군에 비해 높은 줄기세포 증식능을 갖는 것으로 확인되었으나, 칼슘이 존재하더라도 히알루론산 또는 트롬빈과 혼합될 경우에는 줄기세포 증식능이 저하되는 것을 알 수 있다.

또한, 칼슘과 바트록소빈 또는 트라넥사믹산의 혼합부피비가 1:2일 때 가장 우수한 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다. 특히 칼슘과 바트록소빈을 1:2, 2:2, 1:4로 혼합한 것 중에서 1:2인 조성물(실시예 1, 비교예 3)가 가장 우수한 효과를 나타내고 있으므로, 이는 실시예와 비교예가 동일한 양상을 나타내는 바, 줄기세포 증식에서 우수한 효과를 위해서는 칼슘과 바트록소빈의 혼합부피비가 1:2이 가장 바람직함을 알 수 있다.

<실험예 6> 골수 내 투여를 통한 내재성 줄기세포(내재성 세포) 증식 효능 분석

1) 임상실험(근위부 상완골내 투여)

실시예 1로부터 제조된 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물을 근위부 상완골 내에 투여하여, 골수의 내재성 세포의 증식과 기능을 강화 시킬 수 있는지 확인하고자 하였고, 이를 위해 내재성 세포 중 하나인 골수 줄기세포의 증식능을 다음의 방법으로 수행하였다. 우선 3 내지 14일후 근위부 상완골 수술이 예정되어 있는 환자를 의자에 앉게 한 후, 수술할 상완을 환자의 복부 방향으로 약간 정도 내회전 시킨 후, 주입하려는 부위와 초음파 탐촉자(transducer)를 베타딘 용액 등으로 소독하고, 멸균된 초음파용 젤을 탐촉자에 바른 후, 상완골 근위부위에 갖다댄 다음, 대결절 부위의 시야를 확보하였다. 18G 척추 바늘을 근위 상완골의 외측에서부터 접근시켜, 피질골을 뚫은 후 근위 상완골 내로 집어넣었다. 약 4-5 ㎖의 골수를 먼저 뽑아내어, 실시예 1으로부터 제조된 조성물 2-5 ㎖ 내외 정도가 주입될 수 있는 공간을 확보한 후, 주입하였다. 이때, 실시예 1의 조성물을 투여하기 전에 병변 부위에서 골수를 채취하여 대조군으로 사용하였다.

2) 섬유모세포-집락 형성 단위 분석(Colony-forming unit fibroblast(CFU-F) assay)

상기 환자로부터 채취한 골수 줄기세포의 섬유모세포-집락 형성 단위를 분석하여 내재성 세포의 증식과 기능 강화 효과를 분석하고자 하였다.

섬유모세포-집락 형성 단위 분석은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 실시예 1의 조성물을 투여하기 전에 병변 부위에서 골수(대조군)를 채취하였고, 병변 부위에 투여한 후 3일 ~ 7일 후 병변부위에서의 골수(시험군)와 정상 부위에서의 골수 (비교군)를 채취하였다. 상기 골수로부터 골수 단핵 세포(bone marrow mononuclear cells)을 분리하고, 도 1(표 6)은 2×10⁴cells/㎠, 도 2(표 7, P0)는 1×10⁵cells/㎠ 밀도로 각각 6-well 배양 접시에 분주하였다. 14일 후에 계대배양하지 않고 바로 CFU-F 분석을 수행하였다. 도 3(표 7, P1)은 1회 계대배양하여 1x10²cells/㎠ 밀도로 6-well 배양 접시에 분주하고, 14일 후에 CFU-F 분석을 수행하였다.

CFU-F 분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 상기 세포들을 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드로 고정한 다음, 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 1시간동안 염색하였다. 염색이 완료되면 흐르는 물로 세척하고, 세포집락을 관찰하였다. 50개 이상의 섬유모세포 모양의 세포집락을 섬유모세포-집락 형성 단위로 정의하고, 섬유모세포-집락 형성 단위의 개수와 크기를 측정하여 표 6 및 도 1에 나타내었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표기하였다.

	대조군(affected_before injection)	비교군(contralateral normal_W/O PRP injection)	실험군(Affected_w/ PRP injection)	P 값
개수	11.33 ± 4.16	14.66 ± 3.51	32.33 ± 1.15	0.007
크기(㎟)	4.42 ± 0.56	5.37 ± 0.72	8.49 ± 0.75	0.001

표 6에 나타난 바와 같이, 근위 상완골에 본 발명에 따른 조성물(실시예 1)을 주입하기 전에는 섬유모세포-집락 단위의 평균 빈도가 14.66개(1 / 1,364.3개의 분주된 골수 줄기 세포당)이었다. 이에 반해 실시예 1로부터 제조된 조성물을 주입한 후에는 평균 빈도가 32.33개(1 / 618.6 개의 분주된 골수 줄기 세포당)로 2.2배 증가하였다. 비교군에서는 11.33개(1 / 1,765.2 개의 분주된 골수 줄기 세포당)의 빈도를 나타냈고, 이는 대조군과 유사한 빈도임을 확인하였다.

대조군에서 섬유모세포-집락 단위의 크기는 5.37 ± 0.72 ㎟이었고, 실험군에서는 8.49 ± 0.75 ㎟로 1.58배 증가하였다. 비교군에서의 크기는 4.42 ± 0.56 ㎟로 대조군과 그 크기가 유사하였다(P = 0.238).

<실험예 7> 골수줄기세포의 계대배양에 따른 내재성 세포 증식 효능 분석

실시예 1로부터 제조된 조성물의 골수 줄기 세포의 한 세대 이후에서의 영향을 분석하기 위하여 1차 계대배양하기 전(P0)과 후(P1)의 섬유모세포-집락 단위 실험을 실험예 6의 방법으로 수행하여, 그 결과를 표 7과 도 2 및 3에 나타내었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표기하였고, 계대배양하지 않은 골수 줄기 세포는 P0로, 1차 계대 배양한 골수 줄기 세포는 P1로 표기하였다.

도 2는 계대배양을 하기 전(P0) 실시예 1의 조성물을 투여하기 전과 투여한 후 환자로부터 채취한 골수의 섬유모세포-집락 형성 단위 분석(CFU-F assay)결과이고, 도 3은 계대배양을 한 후(P1) 실시예 1의 조성물을 투여하기 전과 투여한 후 환자로부터 채취한 골수의 섬유모세포-집락 형성 단위 분석(CFU-F assay)결과이다.

구분		실시예 1의 조성물을 투여하기 전(-)	실시예 1의 조성물을 투여한 후(+)	P 값
P0	개수	39.67 ± 6.11	71.67 ± 3.21	0.016
P0	크기(㎟)	5.24 ± 0.34	8.29 ± 0.63	0.013
P1	개수	60.33 ± 5.51	73.33 ± 4.04	0.014
P1	크기(㎟)	5.45 ± 0.92	6.39 ± 0.61	0.256

표 7에 나타난 바와 같이 계대배양을 하기 전(P0) 실시예 1의 조성물을 투여하기 전과 투여한 후의 섬유모세포-집락 단위의 평균 빈도는 각각 39.67개(1 / 2,520.8 분주된 골수 줄기 세포당), 71.67개(1 / 1,395.3 분주된 골수 줄기 세포당)였다. 투여한 후 1.81배 더 증가함을 확인하였다.

1차 계대배양한 후(P1) 실시예 1의 조성물을 투여하기 전과 투여한 후의 섬유모세포-집락 단위의 평균 빈도는 각각 60.33개(1 / 1.66 분주된 골수 줄기 세포당), 100,000 세포당 73.33개(1 / 1.36 분주된 골수 줄기 세포당)였다. 투여한 후 1.22배 더 증가함을 확인하였다.

섬유모세포-집락 단위의 크기 역시, 실시예 1의 조성물을 투여한 후 1.58배 증가하였음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물을 골수내로 투여하는 것이 골수의 내재성 세포에 대한 증식 및 기능을 강화시키는데 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 계대 배양 후에도 효과가 지속됨을 확인하였다. 즉 본 발명의 실시예 1의 조성물은 내재성 세포에 대한 일회성 단기간의 효과가 아닌 장기간의 효과를 나타냄을 알 수 있다.

<실험예 7> 임상평가

회전근개 질환에서 치료 전 실시예 1의 조성물을 상완골 골수내에 주입하였을 때 회전근개 복원술의 결과에 대한 영향을 분석하고자 하였다.

1) 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술

회전근개 복원술은 전신 마취하에 측와위(lateral decutibus)에서 시행하였다. 회전근개 질환으로 내원한 환자를 대상으로 하였으며, 회전근개 수술 5일전 이환된 상완골의 골두와 골간단에 실시예 1의 조성물을 주입하였다. 회전근개 부착부에 다발성 채널링을 시행하여 골두와 골간단 골수의 줄기세포가 회전근개 부착부로의 접근을 촉진하여 회전근개 복원술을 시행하였다.

구체적으로 견갑와 상완관절(Systemic glenohumeral joint)과 견봉하 공간(subacromial space)에서 체계적인 탐색적 관절경술을 시행하였고, 필요한 경우 적절한 치료를 시행하였다. 회전근개 파열 부위에서 닳아서 해어져 있는 부분을 제거하고, 파열의 전후방 및 내외측 크기, 이환된 건의 개수, 육안적 건 등급을 기록하였다. 파열 건의 가동 범위(excursion)이 크지 않으면, 상방 관절낭 절개술(superior capsulotomy), 오구상완 인대 유리술(coracohumeral ligament release) 및 극상건 부착부 내측이동술(medialization of the supraspinatus insertion) 등을 포함하는 건 이동술(tendon mobilization)을 시행하였다. 대결절의 회전근개 부착부에서는 연부 조직을 제거하였고, 석회화 섬유연골층(calcified fibrocartilage layer)의 제거는 최소한으로 시행하였다.

근위 상완골의 골수와 회전근개 부착부 사이의 교통 통로(communication route)는 골수 자극 시술법(bone marrow stimulation procedure)의 한 종류인 다발성 채널링(multiple channeling)을 이용하였다. 다발성 채널링은 이전에 보고된 방법을 이용하여 근위 상완골의 대결절 부위를 중심으로 시행하였다.직경 1.9 ~ 2.1 ㎜의 골 펀치(bone punch)를 이용하여 대결절의 관절 연골경계에서부터 외측 능선 부위까지 여러 개의 채널을 뚫어, 상완골의 골수강과 대결절에서의 회전근개 부착부위가 서로 연결될 수 있는 통로를 만든다. 짧고 굵은 송곳을 이용하는 것보다, 길고 얇은 송곳형태의 펀치를 이용하는 것이 연결 통로를 보다 더 확실하게 형성할 수 있을 뿐더러, 골절의 위험도 감소하여 더 바람직하다. 채널링은 상완을 내회전 및 외회전 시키면서 대결절 부위 뿐 아니라, 치유 및 재생이 필요한 부위에 모두 시행가능하다. 통상적으로 채널사이의 간격은 약 4-5 ㎜정도이고, 채널의 깊이는 10 ㎜ 이상으로 하였다. 채널링을 하면, 골수로부터 올라오는 골수방울(marrow droplet)을 확인할 수 있다. 다발성 채널링 후 통상적인 회전근개 봉합술을 이어서 시행하였다. 상기의 각각의 수술과정은 도 4에 나타내었다.

2) 임상적 및 구조적 결과의 평가

임상적 및 구조적 결과의 평가를 위하여 발열, 오한, 소양감(pruritis), 호흡 곤란(dyspnea), 두드러기(urticaria) 및 발진(rash) 등의 면역반응과 관련된 증상 및 징후를 관찰하였다. 또한 주사 부위에서 홍반(erythema), 종창(swelling) 및 비정상적인 분비(abnormal discharge) 등의 유무를 관찰하였다.

치료 전과 치료 후 3, 6, 및 12 개월후에 표준화된 결과 평가치를 이용하여 환자의 임상상태를 분석하였다. 임상 결과 측정은 (1) 동통, (2) 관절 운동 범위, (3) 근력, 그리고 (4) 6종류의 흔하게 사용되는 견관절의 기능 점수를 사용하였다.

3) 통계 분석.

명목 척도(Nominal value) 및 서열 척도(ordinal value)는 피어슨 카이 제곱 검사로 검증하였다. 척도치(scale value)는 독립 t 검증을 이용하여 비교하였다. 치료 전후의 동통, 관절 운동 범위, 근력 및 기능 점수는 수술 전 상태를 고려한 공분산 분석(analysis of covariance) 을 이용하여 분석하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05 로 판단하였다.

4) 환자의 인구 통계학적 특성

연구에 참여한 환자의 인구 통계학적 특성은 표 8에 정리하였다.

변수	총 8명
평균 연령(년)	60.1 ± 11.3
성별(남:여)	5:3
우세수(예:아니오)	4:4
증상 발현 기간(개월)	20.6 ± 28.5
증상 악화 기간(개월)	2.6 ± 2.5
Cofield 유형(부분:소:중:대:광범위)	3 : 0 : 1 : 3 : 1
Boileau 유형(부분:I:I:II:IV)	3 : 1 : 0 : 1 : 3
1 열 : 2 열	2 : 6
견봉성형술(예:아니오)	4 : 4

표 8에 나타난 바와 같이, 본 임상평가를 진행하기 위한 환자 8명은 다음과 같다. 자기 공명 영상은 6명(75%)에서 시행하였고, 평균 연령은 60세였으며, 5명이 남자, 3명이 여자였다. 평균 증상 기간은 20 개월이었다. 3명은 회전근개 부분 파열 환자이었으며, 5명은 전층 파열 환자였다(중, 대 및 광범위 파열 각각 1, 3, 및 1명).

상기 8명의 환자들을 대상으로 임상실험을 진행하였고, 수술을 진행한 후 12개월이상 관찰하였으며, 상기 기간동안 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 조성물의 투여에 따른 전신 및 국소 이상 반응은 없음을 확인하였다.

5) 동통 분석

본 발명의 실시예 1로부터 제조된 조성물의 투여하는 다발성 채널링 및 회전근개 복원술 수술을 수행한 후, 동통을 측정하였다. 구체적으로 동통은 휴식할 때, 움직일 때, 그리고 야간에서의 통증을 10 ㎝의 시각 유사 점수(visual analog scale)를 이용하여 평가하였다. 위 3가지 동통 점수를 평균하여 평균 동통 점수도 계산하였다. 추가적으로, 가장 심한 동통 점수를 측정하였고, 그 결과를 표 9에 나타내었다.

변수		치료 전	3 개월	6 개월	1 년
휴식시 동통	수치	3.25±1.75	3.63±2.56	2.00±1.83	0.00±0.00
휴식시 동통	P값	-	0.670	0.025	0.046
움직임시 동통	수치	5.07±1.29	5.38±2.04	3.04±2.22	0.08±0.17
움직임시 동통	P값	-	0.933	0.072	0.001
야간 동통	수치	4.88±2.23	4.50±1.41	2.57±2.76	0.25±0.50
야간 동통	P값	-	0.685	0.052	0.010
동통 평균	수치	4.37±1.56	4.50±1.75	2.54±2.23	0.11±0.22
동통 평균	P값	-	0.869	0.042	0.008
최악의 동통	수치	6.13±1.73	5.88±2.03	3.86±2.54	0.25±0.50
최악의 동통	P값	-	0.749	0.028	0.007

표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물을 투여하는 다발성 채널링 및 회전근개 복원술을 시행 한 후, 모든 동통 측정치가 점진적으로 감소하였으며, 수술 전에 비해 유의하게 낮은 수준까지 감소하였음을 알 수 있다. 특히 수술하고 1년이 지난 후, 휴식 시 동통, 움직임시 동통, 야간 동통, 평균 동통 및 최악의 동통은 수술 전 대비 전혀 고통이 나타나지 않거나 10~20배 이상 크게 감소하였음을 알 수 있다.

6) 관절 운동 범위 분석

관절 운동 범위는 각도기를 이용하여, 능동적 전방 굴곡, 외전, 외회전, 및 내회전을 측정하였다. 근력은 극상근, 극하근, 그리고 견갑하근에서 전자 측정 기구(CHS, CAS, 대한민국)을 이용하여 측정하였고, 그 결과는 표 10에 나타내었다.

변수		치료 전	3 개월	6 개월	1 년
전방 굴곡, 도	수치	135.62±45.85	115.63±36.30	143.57±17.01	156.25±14.93
전방 굴곡, 도	P값	-	0.271	0.482	0.297
외전, 도	수치	140.63±50.46	107.50±41.14	142.86±25.14	163.75±12.50
외전, 도	P값	-	0.128	0.720	0.311
외회전, 도	수치	44.38±14.74	23.75±13.82	30.71±12.05	46.25±14.36
외회전, 도	P값	-	0.003	0.028	1.000
내회선, 척추레벨	수치	10.00±2.88	5.75±3.92	7.71±3.50	10.25±1.26
내회선, 척추레벨	P값	-	0.006	0.280	0.236

표 10에 나타난 바와 같이 전방 굴곡, 외전, 외회전 및 내회전은 수술 전과 비교하였을 때, 감소하거나 악화되지 않았음을 알 수 있다.

7) 근력 분석

변수		치료 전	3 개월	6 개월	1 년
극상근, 파운드	수치	5.50±7.07	3.00±3.05	8.66±5.58	16.00±4.81
극상근, 파운드	P값	-	0.463	0.360	0.178
극하근, 파운드	수치	6.45±3.77	5.12±1.49	9.83±5.45	14.45±4.31
극하근, 파운드	P값	-	0.240	0.511	0.348
견갑하근, 파운드	수치	11.15±6.59	9.03±5.17	14.20±5.61	21.15±0.435
견갑하근, 파운드	P값	-	0.572	0.367	0.435

표 11에 나타난 바와 같이 극상근의 평균 근력은, 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물을 투여한 다발성 채널링&회전근개 복원술을 수행하기 전에는 5.50 ± 7.07 파운드였고, 수술 후에는 16.00 ± 4.81 파운드로 2.9 배 증가하였다. 극하근의 평균 근력은 2.2 배 증가하였고, 견갑하근의 평균 근력은 1.9 배 증가하였다. 이를 통해 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 조성물의 투여를 통해 극상근, 극하근, 견갑하근의 근력을 유의성 있게 회복시키는 것을 알 수 있다.

8) 견관절 기능 평가

견관절의 기능은 미국 견주관절학회 점수(ASES score), 콘스탄트 점수(the Constant score), UCLA 점수, 상완-견관절-수부 장애 점수(DASH), 그리고 견관절 동통 및 장애 인덱스(SPADI)를 이용하여 평가하여, 표 12에 나타내었다.

변수		치료 전	3 개월	6 개월	1 년
미국 견주관절학회 점수	수치	50.12±19.12	49.38±20.41	74.44±21.97	96.94±4.19
미국 견주관절학회 점수	P값	-	0.674	0.032	0.018
콘스탄트 점수	수치	49.69±19.08	40.25±18.19	64.66±14.00	86.75±7.76
콘스탄트 점수	P값	-	0.230	0.106	0.049
UCLA 점수	수치	17.13±5.089	18.75±7.07	27.29±5.02	34.00±1.41
UCLA 점수	P값	-	0.568	0.008	0.003
상완-견관절-수부 장애 점수	수치	31.67±13.07	41.15±19.21	18.45±15.51	0.83±1.67
상완-견관절-수부 장애 점수	P값	-	0.142	0.030	0.009
견관절 동통 및 장애 인덱스	수치	45.34±19.81	50.19±19.62	25.28±22.09	1.69±2.89
견관절 동통 및 장애 인덱스	P값	-	0.611	0.045	0.013

표 12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물을 투여한 다발성 채널링&회전근개 복원술을 수행하고 나서 견관절 기능(미국 견주관절학회 점수(ASES score), 콘스탄트 점수(the Constant score), UCLA 점수, 상완-견관절-수부 장애 점수 DASH), 그리고 견관절 동통 및 장애 인덱스(SPADI))이 유의성 있게 증가하였음을 확인하였다.

9) 구조적 연속성 평가

구조적 연속성(structural integrity) 평가를 위하여, 수술 12개월 후에 자기 공명 영상 검사(Achieva 3.0 T, Philips Medical System, 네델란드)를 시행하였다. 구조적 연속성은 수가야 등의 분류 체계를 이용하였다. 수가야 제1~3형은 치유(healing)으로, 그리고 제4~5형은 재파열(retear)로 판단하여, 표 13에 나타내었다.

도 5a는 정상 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 도 5b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술하기 전, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 빨간 화살표는 회전근개 파열로 회전근개가 관찰되지 않는 부위를 나타낸 것이다. 도 5c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 직후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 빨간 화살표는 다발성 채널링으로 형성된 수술부위의 통로를 나타낸 것이다. 도 5d는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술하고 1년이 지난 후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 빨간 화살표는 재생된 회전근개 건을 표기한다.

	치유	재파열
개수	5	1
백분율	83.3%	16.7%

도 5 및 표 13에 나타난 바와 같이, 실시에 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 받은 6명의 환자 중에서, 1년이 지났을 때 5명에서 회전근개가 치유(healing) 되었음을 확인하였다(83.3%).

구체적으로 실시예 1로부터 제조된 조성물을 수술 전 약 3~14일에 근위 상완골로 주입하기 위하여, 골수 자극 시술법(bone marrow stimulating procedure)의 하나인 다발성 채널링을 시행하여 투여하고, 1년동안 지켜보았다. 그 결과 중파열의 크기의 회전근개 복원술 뿐만 아니라, 광범위 파열의 복원술에서도 회전근개가 완전하게 치유되었음을 확인하였다. 특히, 광범위하게 파열된 회전근개의 환자는 회전근개 복원술시 파열단(torn end)의 가동성(mobility)이 부족하여 회전근개를 완전하게 복원시키지 못하였음에도, 재생된 회전근개 조직이 관찰되었다.

10) 회전근개 근육의 상태 평가

회전근의 근육 상태는 자기 공명 영상의 T1 강조 사시상면의 오구돌기와 견갑골극(scapular spine)이 만나는 가장 외측 단면에서 지방 침윤(fatty infiltration)과 근위축(muscle atrophy)을 측정하여 평가하였다. 지방 침윤은 구딸리에 등급으로 평가하였으며, 근위축은 탄젠트 사인과 극상근 단면적을 이용하여 평가하였고, 그 결과는 표 14에 나타내었다.

도 6a는 정상 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 도 6b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술하기 전, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육, 특히 극상근, 극하근 및 견갑하근에 근위측과 지방변성(침윤)이 관찰된다. 도 6c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육이 재생되었음을 알 수 있다.

변수		수술전(%)		1년(%)		P값
Goutallier_SS	G0	3	3.90%	3	3.90%
	G1	23	29.87%	24	31.17%
	G2	26	33.77%	35	45.45%
	G3	8	10.39%	10	12.99%
	G4	17	22.08%	5	6.49%	0.087
Goutallier_IS	G0	8	10.39%	6	7.79%
	G1	39	50.65%	43	55.84%
	G2	22	28.57%	21	27.27%
	G3	3	3.90%	1	1.30%
	G4	5	6.49%	6	7.79%	0.81
Goutallier_SSC	G0	21	27.27%	13	16.88%
	G1	44	57.14%	45	58.44%
	G2	9	11.69%	13	16.88%
	G3	2	2.60%	4	5.19%
	G4	1	1.30%	2	2.60%	0.46
Tangent	G1	41	53.25%	56	72.73%
	G2	29	37.66%	14	18.18%
	G3	7	9.09%	7	9.09%	0.023
Occupation ratio	G1	29	37.66%	35	45.45%
	G2	31	40.26%	36	46.75%
	G3	17	22.08%	6	7.79%	0.045

도 6 및 표 14에 나타난 바와 같이, 일부의 환자에서는 수술 후 회전근개의 지방 침윤과 근위축이 호전되었음을 확인할 수 있다. 지방침윤은 구딸리에 등급으로 평가하였다. 수술전에는 극상근, 극하근, 견갑하근, 및 소원근에서 각각 3, 2, 1 및 1 등급이였으나, 수술하고 1년이 지난 후에는 2, 2, 1, 및 1로 호전되었음을 확인하였다. 탄젠트 신호를 이용한 근위축 평가의 경우, 수술전에는 2 등급이였으나, 수술하고 1년이 지난후에는 1 등급으로 호전되었다. 극상근의 단면적은 수술 전에는 298.9 ㎟였으나, 수술하고 1년이 지난 후에는 326.3 ㎟로 호전되었다.

상기 결과를 통해 본원발명의 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물은 회전근개 수술에서 골수내 내재성 세포 증식을 효과적으로 증진시키는 활성이 있어 건, 인대와 같은 근골격계 손상과 질환을 치료하는 치료제로서 효능이 있음을 확인하였다.

<실험예 8> 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술 전, 후의 임상평가

중간 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of medium size)을 갖는 환자(도 7)와 거대한 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of massive size)을 갖는 환자(도 8)에, 회전근개 복원술을 시행하면서, 시행 전 실시예 1의 조성물을 상완골 골수내에 주입하는 다발성 채널링을 수행하였을 때의 결과에 대한 영향을 분석하고자 하였다.

1) 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술

회전근개 복원술은 전신 마취하에 측와위(lateral decutibus)에서 시행하였다. 회전근개 질환으로 내원한 환자를 대상으로 하였으며, 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 다음과 같이 시행하였다. 우선 견갑와 상완관절(Systemic glenohumeral joint)과 견봉하 공간(subacromial space)에서 체계적인 탐색적 관절경술을 시행하였고, 필요한 경우 적절한 치료를 시행하였다. 회전근개 파열 부위에서 닳아서 해어져 있는 부분을 제거하고, 파열의 전후방 및 내외측 크기, 이환된 건의 개수, 육안적 건 등급을 기록하였다. 파열 건의 가동 범위(excursion)이 크지 않으면, 상방 관절낭 절개술(superior capsulotomy), 오구상완 인대 유리술(coracohumeral ligament release) 및 극상건 부착부 내측이동술(medialization of the supraspinatus insertion) 등을 포함하는 건 이동술(tendon mobilization)을 시행하였다. 대결절의 회전근개 부착부에서는 연부 조직을 제거하였고, 석회화 섬유연골층(calcified fibrocartilage layer)의 제거는 최소한으로 시행하였다.

근위 상완골의 골수와 회전근개 부착부 사이의 교통 통로(communication route)는 골수 자극 시술법(bone marrow stimulation procedure)의 한 종류인 다발성 채널링(multiple channeling)을 이용하였다. 다발성 채널링은 이전에 보고된 방법을 이용하여 근위 상완골의 대결절 부위를 중심으로 시행하였다.직경 1.9 ~ 2.1 ㎜의 골 펀치(bone punch)를 이용하여 대결절의 관절 연골경계에서부터 외측 능선 부위까지 여러 개의 채널을 뚫어, 상완골의 골수강과 대결절에서의 회전근개 부착부위가 서로 연결될 수 있는 통로를 만든다. 짧고 굵은 송곳을 이용하는 것보다, 길고 얇은 송곳형태의 펀치를 이용하는 것이 연결 통로를 보다 더 확실하게 형성할 수 있을 뿐더러, 골절의 위험도 감소하여 더 바람직하다. 채널링은 상완을 내회전 및 외회전 시키면서 대결절 부위 뿐 아니라, 치유 및 재생이 필요한 부위에 모두 시행가능하다. 통상적으로 채널사이의 간격은 약 4-5 ㎜정도이고, 채널의 깊이는 10 ㎜ 이상으로 하였다. 채널링을 하면, 골수로부터 올라오는 골수방울(marrow droplet)을 확인할 수 있다. 다발성 채널링을 통해 형성된 채널에 실시예 1의 조성물을 주입하고, 통상적인 회전근개 봉합술을 이어서 시행하였다.

2) 임상평가

도 7a는 수술전, 중간 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of medium size)을 갖는 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 도 7b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 직후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다. 도 7c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육이 재생되었음을 알 수 있다.

도 8a는 수술전, 거대한 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of massive size)을 갖는 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이고, 도 8b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 직후, 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)이다. 도 8c는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육이 재생되었음을 알 수 있다.

도 9a는 수술전, 거대한 크기의 회전근개 질환(Rotator cuff tear of massive size)을 갖는 환자의 회전근개 근육에 대한 자기공명영상(MRI)이고, 도9b는 본 발명에 따른 실시예 1의 조성물과 다발성 채널링을 이용한 회전근개 복원술을 수술한 후 1년이 지났을 때 환자의 회전근개 근육에 대한 자기공명영상(MRI)으로, 회전근개 근육이 효과적으로 재생되었음을 확인하였다.

상기 결과를 통해 본원발명의 혈소판 풍부 혈장, 칼슘, 바트록소빈 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물은 다양한 크기의 회전근개 질환에 대하여, 골수내 내재성 세포 증식을 효과적으로 증진시킴으로써, 회전근개 복원술의 성공률을 높이는 효과를 가지고 있음을 확인하였다. 즉 본원발명의 조성물은 건, 인대와 같은 근골격계 손상과 질환을 치료하는 치료제와 근골격계 복원술의 보조치료제로서 효능이 있음을 확인하였다.

<실험예 10> 줄기세포의 화학주성(chemotaxis)에 대한 효과

실시예 1로부터 제조된 조성물의 줄기세포의 화학주성을 하기 2가지 방법으로 평가하였다. 도 10은 보이든 챔버 분석 방법을 통해 줄기세포의 화학주성을 측정하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이고, 도 11은 아가로스 화학주성 분석 방법을 통해 줄기세포의 화학주성을 측정하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.

1) 보이든 챔버 분석법(Boyden chamber assay)

1 × 10⁴골수 줄기세포를 transwell의 위쪽 insert 부분에 분주하고, 24시간 동안 항생제(HyClone, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)가 함유된 LG DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후 transwell의 아랫면에 항생제가 함유된 DMEM 배지에 워시아웃(wash-out)방법으로 실시예 1의 조성물을 배지 부피의 10%로 처리하였다. 이때 음성 대조군으로 FBS가 포함되어 있지 않은 LG DMEM을 사용하였고, 화학주성의 양성 대조군으로 G-CSF 100 ng/ml, SDF-1α 100 ng/ml, IL-1β 100 ng/ml을 사용하여 비교하였다. Insert의 윗면에서 아랫면으로 이동한 세포를 측정하기 위하여 24시간 후에 면봉으로 insert 윗면에 있는 세포를 제거하였고 아랫면에 있는 세포만 남도록 하였다. 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 후, 크리스탈바이올렛으로 염색하여 현미경상에서 관찰한 후에 촬영하였다. 또한 아랫면으로 이동한 세포를 정량화하기 위하여 아세트산으로 크리스탈바이올렛을 녹여 OD540을 측정하여 표 15에 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

구분		이동한 세포수	P 값
대조군(항생제)		100.00 ± 0.00	-
실시예 1		416.41 ± 226.08	0.019
양성 대조군	G-CSF	415.01 ± 338.54	0.072
	SDF-1α	365.28 ± 280.55	0.015
	IL-1β	358.85 ± 271.58	0.010

도 12 및 표 15에 나타난 바와 같이, 아랫면으로 이동한 골수 줄기세포 수를 비교하였을 때, 실시예 1의 조성물을 처리한 경우가 대조군 대비 4.16 배 더 많았음을 확인하였다(P = 0.0187). 이는 양성대조군(4.15 배, 3.65 배, 3.59 배)과 동등하거나 더 우수한 수치이다. 즉 본 발명의 조성물(실시예 1)이 양성대조군보다 줄기세포의 동원(recruitment) 능력도 우수함을 알 수 있다.

2) 아가로스 화학주성 분석법(Agarose chemotaxis assay)

우선, 0.8% 아가로스 겔을 6 웰 플레이트에 제조한 후, 각 웰에 5 mm 피부 생검 펀치(skin biopsy punch)로 간격이 5 mm가 되도록 구멍을 3개 뚫어주었다. 1 X 10⁴골수 줄기세포를 중앙에 10% FBS와 항생제가 포함된 LG DMEM 배지에 분주하여 5시간 동안 부착할 수 있는 시간을 두었다. 5 시간 후에 항생제만 포함된 LG DMEM 배지로 교체하고, 왼쪽 구멍에 대조군으로 항생제만 포함된 LG DMEM 배지를 첨가하였고, 오른쪽 구멍에 항생제가 함유된 DMEM 배지에 워시아웃(wash-out) 방법으로 실시에 1의 조성물을 배지 부피의 50%로 처리하였다. 또한 화학주성의 양성 대조군으로 G-CSF 100ng/ml, SDF-1α 100ng/ml, IL-1β 100ng/ml을 처리하여 비교하였다. 72시간 후에 4% 파라포름알데하이드로 고정한 후, DAPI로 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 형광 현미경을 사용하여 왼쪽과 오른쪽으로 이동한 세포를 각각 촬영하였다. 이때 구멍의 각각 끝부분을 기준으로 100 um 이상 이동한 경우만 세포수를 세어 정량화하여 표 15에 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

구분		이동한 세포수	P 값
대조군(항생제)		100.00 ± 0.00	-
실시예 1		935.94 ± 469.63	0.000
양성 대조군	G-CSF	393.76 ± 280.52	0.014
	SDF-1α	466.68 ± 348.04	0.021
	IL-1β	314.13 ± 220.72	0.063

도 13 및 표 16에 나타난 바와 같이, 대조군 대비 실시예 1의 조성물을 처리한 쪽으로 9.36 배 더 많은 줄기세포가 이동하였음을 확인하였다. 이는 양성대조군(3.94 배, 4.67 배, 3.14 배)보다 현저히 우수한 수치이다. 즉 본 발명의 조성물(실시예 1)이 양성대조군보다 줄기세포의 동원(recruitment) 능력도 2 배 이상 우수함을 알 수 있다.

<실험예 11> 연골 결손 동물모델에서의 효과

1) 연골결손 동물모델

실험동물은 몸무게가 평균 350g인 12주령 Spraque-Dawley 랫드(Core Lab Inc., Seoul, Korea)의 양측 슬관절을 사용하였다. 수술 과정은 랫드를 마취시킨 상태에서 수행되었다. 랫드의 양 하지를 베타딘 용액으로 소독하고, 슬관절의 내측 도달법을 이용하여 슬개골을 외측으로 젖힌 후 대퇴골의 연골을 노출시켰다. 2 mm와 1 mm 지름의 드릴을 이용하여 대퇴-슬개구의 과간 절흔 상부 2 mm되는 지점에 직경 2 mm의 둥근 모양의 전층 연골 결손이 유도된 연골결손 동물모델을 제조하였다.

상기 연골결손 동물모델은 3 그룹으로 나뉘었다. 1 그룹(손상 그룹)은 전층(full-thickness) 연골 손상을 가진 음성 대조군이었다. 2 그룹(미세골절술 그룹)은 전층 연골 손상 후, 미세골절술 시술하여 혈괴(blood clot) 형성을 유도하였다. 3 그룹(실시예 1의 조성물 처리그룹)은 전층 연골 손상 5일 전, 대퇴과 내에 23 게이지 척추바늘을 삽입하여 구멍을 만들고, 구멍 내에 존재하는 골수를 50 μL 제거하고 실시예 1의 조성물(50μL)을 서서히 주입한 다음, 전층 연골 손상시키고 미세골절술을 시술하였다.

이때, 미세골절술은 0.2 mm 지름, 3 mm 깊이의 얇은 Kirschner-강선을 이용하여 시행하였다.

2) 각 그룹에서의 연골재생 효과 분석

각 그룹에서 연골재생 효과는 육안 및 현미경을 사용하여 평가하였다.

수술 후 2, 4주에 각 그룹의 동물모델은 희생되었다. 희생 후 즉시, 랫드의 슬관절(실험부위)을 내측 관절 도달법으로 노출시켰다. 슬관절의 연골에 손상이 가지 않게 조심스럽게 주위 연부조직을 제거한 후에 국제 연골재생학회(International Cartilage Repair Society; ICRS) ICRS 평가 시스템에 따라 육안적으로 평가하였다. ICRS 평가 시스템은 하기 3개의 파라미터로 평가된다. (1) 결손 회복 정도(Degree of defect repair), (2) 경계 구역의 통합성(Integration to border zone), (3) 육안적 외관(Macroscopic appearance). 합산 최고점은 12점, 최저점은 0으로 하여 평가하였다.

상술한 과정을 통해 얻은 각 그룹의 표본(연골)을 10% 중성 포르말린에 3일간 고정하고 탈석회용액(decalcifying agent, Calci-Clear Rapid; National Diagnostics, Atlanta, GA, USA)으로 탈석회화 과정을 거친 후, 파라핀에 포매하여 4 mm의 두께로 절제하여 조직 표본을 만들었다. 글리코스아미노글리칸 존재 여부를 확인하기 위하여 Safranin-O/Fast green 염색을 하여 광학 현미경에서 관찰하였다.

상기 조직 표면에서 재생 조직에 대하여 조직학적으로 평가하기 위하여 O'Driscoll 평가 시스템과 국제 연골재생학회(International Cartilage Repair Society; ICRS) II 평가 시스템을 사용하였다. O'Driscoll 평가 시스템은 9개의 파라미터로 체계적으로 평가된다. (1) 세포 형태(Cell morphology), (2) 매트릭스-염색(Matrix staining), (3) 표면 규칙성(surface regularity), (4) 구조적 안정성(structural integrity), (5) 연골의 두께(Thickness), (6) 인접 연골과의 통합성(Bonding to the adjacent cartilage), (7) 저세포성(Hypocellulartiy) (8) 연골세포 집락형성(Chondrocyte clustering), 및 (9) 인접 연골의 퇴행성 변화(Freedom from degenerative changes in adjacent cartilage). 합산 최고점은 24점, 최저점은 0으로 하여 평가하였다.

상기 ICRS II 평가 시스템은 다음 14개의 파라미터로 체계적으로 평가된다. (1) 조직 형태(Tissue morphology), (2) 매트릭스-염색(Matrix staining), (3) 세포 형태(Cell morphology), (4) 연골세포 집락형성(Chondrocyte clustering), (5) 표면 구성(Surface architecture), (6) 기저 안정성(Basal integration), (7) 타이드마크 형성(Formation of a tidemark), (8) 연골하골 이상 및 골수의 섬유화(Subchondral bone abnormalities, marrow fibrosis), (9) 염증(Inflammation), (10) 비정상 석회화(Abnormal calcification, ossification), (11) 혈관 형성(Vascularization), (12) 표면 및 천부 평가(Surface/superficial assessment), (13) 중간층 및 심부 평가(Mid/Deep zone assessment), 및 (14) 전체 평가(Overall assessment). 각각의 파라미터의 최고점은 100이고, 최저점은 0이며, 총합의 최고점은 1400점, 최저점은 0점으로 하여 평가하였다. 각 값은 평균±S.D로 표시하였으며, 비모수적인 다중비교인 Mann-Whitney 검정법을 통해 나타내었다.

3) 분석결과(육안평가)

도 14는 수술 2, 4주 후, 수확된 2 그룹과 3 그룹의 손상 부위를 촬영한 사진이다. 표 17은 국제 연골재생학회(International Cartilage Repair Society; ICRS) ICRS 평가 시스템에 따라 육안적으로 평가한 결과이다. 이는 3개의 파라미터의 점수를 합산하여 평균±SD(표준편차)로서 표시한 것으로, 합산 최고점은 12점, 최저점은 0으로 하여 평가하였다.

육안검사	1 그룹(손상 그룹)	2 그룹(미세골절술 그룹)	3 그룹(실시에 1의 조성물 처리그룹)	P 값
2주	2.6 ± 1.7	4.0 ± 1.6	5.0 ± 0.8	0.352
4주	5.2 ± 2.7	8.8 ± 1.7	9.1 ± 2.2	0.574

도 14에 나타난 바와 같이 수술 2주 후에서는, 각 그룹 모두에서 붉은 색의 육아 조직(granulation tissue)으로 보이는 재생 조직이 결손 부위에서 관절되었으며, 육안으로 2 그룹 및 3 그룹 사이에서 큰 차이는 관찰할 수 없었다.

수술 4주 후에서는, 2 그룹과 3 그룹 모두의 결손 부위에서 흰색의 재생 조직이 관찰되었으며, 3 그룹에서 약간 더 매끄럽고, 주변과의 연결이 좋아 보였으나, 육안으로는 유의미한 큰 차이를 확인할 수 없었다.

표 17에 나타난 바와 같이, 국제 연골재생학회(ICRS)에 따른 평가 결과, 수술 2주 후에는 2 그룹(미세골절술 그룹)은 4.0 ± 1.6이였고, 3 그룹(실시예 1의 조성물 처리그룹)은 5.0 ± 0.8이였다(P = 0.352). 수술 4주 후에는 2 그룹(미세골절술 그룹)은 8.8 ± 1.7, 3 그룹(실시예 1의 조성물 처리그룹)은 9.1 ± 2.2로 연골 재생이 이루어진 것을 확인할 수 있었으나, 두 군간에는 유의한 차이는 없었다.

4) 분석결과(O'Driscoll 시스템 평가)

도 15는 각 그룹으로부터 수확한 조직 표면을 Safranin-O/Fast green 염색하고 광학현미경으로 촬영한 사진이다. 표 18은 도 15로부터 O'Driscoll 평가 시스템에 따라 평가한 결과이다. 이는 9개의 파라미터의 점수를 합산하여 평균 ± SD(표준편차)로서 표시한 것으로, 합산 최고점은 24점, 최저점은 0으로 하여 평가하였다.

O’Driscoll	1 그룹(손상 그룹)	2 그룹(미세골절술 그룹)	3 그룹(실시에 1의 조성물 처리그룹)	P 값
2주	7.9 ± 1.6	10.5 ± 2.1	14.3 ± 2.9	0.114
4주	11.1 ± 2.7	15.1 ± 2.5	19.3 ± 2.3	0.003

표 18에 나타난 바와 같이, 수술 후 2 주에 측정한 결과 2 그룹은 10.5 ± 2.1이였고, 3 그룹은 14.3 ± 2.9인 것으로 확인되었다(P = 0.114).

수술 4주 후에는 2 그룹은 15.1 ± 2.5, 3 그룹은 19.3 ± 2.3인 것으로 확인되었다. 2 그룹 모두 시간이 지날수록 유의한 호전을 보였으며, 2 그룹과 3 그룹간에도 유의한 차이가 나타남을 확인하였다(P = 0.003).

3 그룹이 2 그룹에 비하여 1 그룹(손상 그룹) 대비 유의미한 정도가 더 높은 것을 확인하였다(각각 2주 : P = 0.035(2그룹), 0.006(3그룹); 4주: P = 0.003(2그룹), <0.001(3그룹))

4) 분석결과(ICRS II 시스템 평가)

도 15는 각 그룹으로부터 수확한 조직 표면을 Safranin-O/Fast green 염색하고 광학현미경으로 촬영한 사진이다. 표 19는 도 15로부터 ICRS II 평가 시스템에 따라 평가한 결과이다. 이는 14개의 파라미터의 점수를 합산하여 평균 ± SD(표준편차)로서 표시한 것으로, 총합의 최고점은 1400점, 최저점은 0점으로 하여 평가하였다

ICRSII	1 그룹(손상 그룹)	2 그룹(미세골절술 그룹)	3 그룹(실시에 1의 조성물 처리그룹)	P 값
2주	529.3 ± 71.4	674.2 ± 151.5	888.8 ± 142.2	0.067
4주	860.0 ± 93.1	952.5 ± 59.7	1103.8 ± 98.6	0.001

표 19에 나타난 바와 같이, 수술 후 2 주에 측정한 결과 2 그룹은 674.2 ± 151.5이였고, 3 그룹은 888.8 ± 142.2인 것으로 확인되었다(P = 0.067).

수술 4주 후에는 2 그룹은 952.5 ± 59.7, 3 그룹은 1103.8 ± 98.6인 것으로 확인되었다. 2 그룹 모두 시간이 지날수록 유의한 호전을 보였으며, 2 그룹과 3 그룹간에도 유의한 차이가 나타남을 확인하였다(P = 0.001).

3 그룹이 2 그룹에 비하여 유의미한 정도의 호전을 나타낸 것을 확인하였다(4주: P = 0.020(2그룹), <0.001(3그룹)). 결과적으로 육안으로 미세골절술만 수행한 경우(2 그룹)와 본발명의 조성물을 처리한 그룹(3 그룹) 간의 유의적인 차이가 거의 관찰되지 않았으나, 조직학적으로 3 그룹이 현저히 연골재생에 호전을 유도하고 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산의 혼합 중량비가 10-20 : 1-4 : 1 : 1-3인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 혈소판풍부혈장(PRP)은 자가 또는 동종유래인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 혈소판풍부혈장(PRP)는 200~5,000 × 10³platelets/㎖ 농도인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 약학 조성물은 환부에 주사되는 겔형의 주사제인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,

상기 환부가 골-건 접합부 또는 골-인대 접합부인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,

상기 환부가 다발성 채널링을 통해 형성된 골내 통로인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 근골격계 질환은 근육 질환, 건 질환, 연골질환, 관절 질환, 인대 질환, 신경, 근육, 건, 인대, 골, 연골, 연골판(물렁뼈), 관절의 손상과 변성으로 인해 유도된 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 근골격계 질환은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염 , 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상, 건 좌상, 건 파열, 건 열상, 건 박리, 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상, 인대 파열, 인대 염좌, 연골연화증, 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 약학 조성물은 내재성 세포의 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
근골격계 질환의 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한, 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 근골격계 질환 치료방법.
혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하고, 근골격계의 골수내에 내재성 세포를 증식시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 근골격계 복원술 전처리용 조성물.
혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 유효성분으로 포함하고, 근골격계의 골수내에 내재성 세포를 증식시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 근골격계 복원술 보조제.
혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산을 혼합하는 단계를 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법.
제 15 항에 있어서,

상기 혈소판풍부혈장(PRP), 바트록소빈, 칼슘 및 트라넥사믹산은 10-20 : 1-4 : 1 : 1-3의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법.