WO2019078587A1 - 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 골 생성 촉진 또는 연골 분화 유도용 조성물 - Google Patents

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안지연
양우섭
김근천
안종일
고동우
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting bone formation or inducing cartilage differentiation, and more particularly to a composition for promoting osteogenesis or inducing differentiation of cartilage comprising a bone marrow-derived bone / cartilage precursor cell culture fluid as an effective ingredient.
  • the cells that make up the bones are osteocytes that maintain the homeostasis of the bones, osteoblasts that form the bones, osteoclasts that absorb the bones, and cartilage cells that play the joint functions of the ends of the bones (chondrocyte), and in the bone that has been grown, the cancellous bone is absorbed by the osteoclasts, and on the other surface, the new bone is formed by the osteoblasts and is reformed.
  • osteopathy Osteoporosis, non-union fracture, osteonecrosis, osteomalacia, osteoporosis, There are deficiencies.
  • avascular necrosis of the femoral head is a refractory osteoarthritis in which the bone is destroyed by stopping the blood supply to the femoral head that constitutes the hip joint due to trauma, alcohol and steroid use. It is known that the incidence rate is 20,000 per year and 4,000 ⁇ 5,000 per year in Korea, mostly occurring at the age of 20-50, with a high incidence in the late 30s. However, no special treatment has been developed other than the surgical method of arthroplasty.
  • Osteoporosis is also referred to as osteoporosis or osteoporosis. It refers to a metabolic bone disease in which the bone mass is significantly reduced compared with that of a normal person, and a major decrease in the bone constituent is the main lesion. In general, the condition of osteoporosis itself is often asymptomatic or mild. However, once a fracture occurs, it is generally difficult to treat and it is difficult to recover enough even after the operation of osteosynthesis.
  • a pharmaceutical composition containing a calcium preparation, an estrogen preparation, a selective estrogen receptor modulating agent (SERM), an active vitamin D3 preparation, a vitamin K preparation, an ipriflavone preparation, a calcitonin preparation, a bisphosphonate preparation, (BMP), fibroblast growth factor (FGF), etc. have been clinically used or clinical applications have been tried.
  • SERM selective estrogen receptor modulating agent
  • BMP bisphosphonate preparation
  • FGF fibroblast growth factor
  • mesenchymal stem cells are used, and the research has been actively carried out because of their suitability for potential allogeneic transplantation by the characteristics of the mesenchymal stem cells capable of proliferation in vitro and the immunity control characteristics.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • They are multipotent cells capable of differentiating into osteocytes, chondrocytes, adipocytes, muscle cells, neurons and cardiomyocytes.
  • Adult stem cells can be obtained from the patient's own body and are freed from the ethical problems of cell acquisition and can be used to treat bone, cartilage, fat, muscle, And it is recognized as a very useful cell source for regeneration of musculoskeletal tissues. Most studies on adult stem cells that have been carried out so far use mesenchymal stem cells cultured from bone marrow.
  • adult stem cells are known to exist in most musculoskeletal tissues such as periosteum, adipose tissue, and muscle.
  • adipose tissue can be easily obtained in large quantities without dysfunction of the donor using relatively simple liposuction, and recently, interest has been attracted as a source of adult stem cells.
  • adipose tissue originates from the mesoderm of the embryo as well as bone marrow cells and that differentiation of bone or cartilage may occur in adult stem cells isolated from fat.
  • the low differentiation potential of adipose-derived mesenchymal stem cells is considered to be a limit to the use of adipose stem cells as a cell source. Therefore, in order to use adipose stem cells as a useful cell source, various factors affecting differentiation of adipose stem cells need to be excavated and intensively studied.
  • the cartilage together with the bone constitutes the skeleton and serves as a protection for internal organs
  • the cartilage tissue is composed of cartilage cells and a cartilage matrix surrounding it.
  • Cartilage is formed by mesenchymal-derived cartilage cells, which form matrix around the processes of cell differentiation and growth.
  • the major components of the cartilage matrix are proteoglycans and collagen (Type II, Type IX, etc.). Proteoglycans are involved in the absorption (pilling) characteristic of cartilage tissue, and collagen is known to be involved in the rigidity of cartilage against tension and shear forces. In general, once a cartilage tissue of the vertebral joint is damaged, it is not regenerated normally in vivo.
  • Damage to cartilage tissue of these joints is associated with severe pain, limited to daily activities, and chronicization can lead to fatal degenerative arthritis, which interferes with normal life or professional activities.
  • Examples of known diseases due to cartilage disorders include deformity arthropathy, cartilage dysplasia, degenerative disc herniation, or meniscus injury.
  • the treatment of damaged cartilage developed so far includes chondroplasty, osteochondral transplantation, and autolaugous chondrocyte transplantation.
  • the cartilage plasty is the most commonly used method because it does not require direct joint incision and it can reduce the pain and burden of the patient, and has the merit of being able to treat fine tissue damage through arthroscopy immediately after observation.
  • fibrocartilage is not produced as a hyaline cartilage, which is necessary for actual joints. Therefore, it is not satisfactory in terms of function.
  • osteochondral grafting has been successful in some patients by collecting cartilage and cartilaginous parts that are already formed on the top of the patient and creating a real bone by digging a proper hole in a damaged cartilage site and transplanting it.
  • this method is not a complete treatment method because there is a gap between the grafted site and the original tissue, and it can not be a universal method because it can be performed only for patients capable of autolaugous transplantation .
  • the autologous chondrocyte transplantation which has recently begun, takes chondrocytes from the cartilage tissue collected from the top of the patient, cultivates the necessary number of cells in vitro, proliferates them, and uses the periosteum to secure space And injected with the medium to fill the damaged cartilage part by the proliferation of these cells.
  • autologous chondrocyte transplantation is complicated and difficult because of the limited donor tissue and the need for surgery to collect the tissue for transplantation.
  • the mesenchymal stem cell (MSC), a precursor cell of chondrocyte, was obtained from mesenchymal tissues such as bone marrow, muscle and skin by using the above method, And then injected into the articular cartilage damage site with the polymer.
  • the method of treating cartilage damage using the mesenchymal cells obtained from the matured individuals as described above showed that the cell proliferation was somewhat increased due to the in vitro culture of the undifferentiated cells as compared with the autologous chondrocyte transplantation.
  • Factors inducing differentiation of chondrocytes in the mesenchymal cells include bone morphogenetic protein (BMP), transforming growth factor beta (TGF-beta), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor Thyroid hormone-related peptides are known.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • TGF-beta transforming growth factor beta
  • FGF fibroblast growth factor
  • Thyroid hormone-related peptides insulin-like growth factor Thyroid hormone-related peptides
  • these differentiation factors have the problem of inducing differentiation into other cells when inducing differentiation from mesenchymal cells to chondrocytes.
  • TGF- ⁇ mesenchymal cells are differentiated into non-chondrocytes, and BMP is at risk of differentiation into osteophyte formation.
  • chicken intestine is a bone growth period in which endochondral ossification is progressing, in which cartilage is replaced with bone at a very rapid growth rate of bone.
  • the femoral bone of the chicken has a large amount of imaginary bone that has not undergone calcification yet.
  • Intra-cartilage ossification is an osteogenesis process that occurs when an elongated bone, that is, a long bone, is formed.
  • the mesenchymal cells inside the limb bud are aggregated into cartilage cells to form a cartilage strom, Chondrocytes in the center are selectively hypertrophied and calcified and die.
  • the mesenchymal cells that come along are differentiated into osteoblasts (primary ossification centers) and bones are produced.
  • This ossification process progresses from the primary ossification center to the tip of the intestinal bone, and the chondrocyte prolongs the growth of cartilage cells.
  • a separate secondary ossification center appears at both ends of the cartilage, and the remaining cartilage between the metaphysis ossified by the primary ossification center and the epiphysis formed by the secondary ossification center is called an epiphyseal plate And the cartilage proliferation and cartilage ossification continue until the growth is completed.
  • the precursor cells that can produce bone and cartilage during the bone development process are the cells located at the intermediate stage of the differentiated bone cells or cartilage cells.
  • the advantage of this cell is that it can differentiate into cartilage and bone in different directions unlike stem cells, which have limitations in the direction of differentiation.
  • studies on secretion of growth factors, cytokines and various proteins associated with bone and cartilage production and utilization of the active substances are under way, but they are still in the research stage. In particular, there is no research on the osteochondrocyte progenitor cell secretion of chicken.
  • the present inventors confirmed that a cell culture fluid obtained by culturing a large amount of bone and cartilage precursor cells in the iliac bone of an exogenous chicken can promote bone differentiation of human stem cells, As a result of intensive study on the use of a culture concentrate of osteochondrocyte precursor cells, it was found that when the osteogenic differentiation of osteochondrocyte precursor cells of chickens is induced by inducing bone differentiation of adipose tissue-derived stem cells, differentiation into osteoblasts is promoted The present invention has been completed.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies to discover factors that promote the differentiation efficiency of multipotent stem cells into osteocytes or induce the differentiation of stem cells into chondrocytes, It has been confirmed that osteogenic and cartilage precursor cell cultures derived from iliac bone promote the effect of bone-cell inducing agents conventionally used, thereby remarkably improving the differentiation efficiency of stem cells into osteoblasts and inducing the differentiation of stem cells into chondrocytes Thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a composition for promoting osteogenesis or inducing cartilage formation comprising osteogenic precursor cell culture derived from chicken bone marrow as an active ingredient, and a method for promoting the differentiation efficiency of stem cells into bone cells by treating the culture medium .
  • Another object of the present invention is to provide a method for inducing the differentiation of stem cells into chondrocytes by treating the culture solution, and a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage damage or cartilage defect including cartilage cells induced by the above method It is a further object to provide an emulsion composition.
  • the present invention provides a composition for inducing osteogenesis or inducing cartilage formation, comprising a chicken bone marrow-derived bone / cartilage precursor cell culture fluid as an active ingredient.
  • the chicken may be an exogenous chicken.
  • the chicken bone marrow-derived bone and cartilage precursor cell culture fluid may be a concentrated culture concentrate.
  • the composition may further comprise an osteogenesis inducer.
  • the composition can promote the differentiation of stem cells into bone cells.
  • the composition may induce differentiation of stem cells into chondrocytes.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be adipose derived mesenchymal stem cells.
  • the present invention also provides a method for promoting the differentiation efficiency of stem cells into osteoblasts, comprising the step of treating a stem cell with bone / cartilage precursor cell culture derived from chicken bone marrow.
  • the chicken may be an exogenous chicken.
  • the chicken bone marrow-derived bone and cartilage precursor cell culture fluid may be a concentrated culture concentrate.
  • the method may further comprise the step of treating the osteogenic differentiator.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be adipose derived mesenchymal stem cells.
  • the present invention also provides a method for inducing the differentiation of stem cells into chondrocytes, comprising the step of treating stem cell with bone / cartilage precursor cell culture fluid derived from chicken bone marrow.
  • the chicken may be an exogenous chicken.
  • the chicken bone marrow-derived bone and cartilage precursor cell culture fluid may be a concentrated culture concentrate.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be adipose derived mesenchymal stem cells.
  • the step of treating stem cell with bone / cartilage precursor cell culture fluid derived from chicken bone marrow may be performed by culturing stem cells in a culture medium containing bone / cartilage precursor cell culture medium derived from chicken bone marrow .
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis comprising a bone marrow-derived bone / cartilage precursor cell culture fluid or a culture concentrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for treating bone diseases comprising the step of administering to a subject a composition comprising a chicken bone marrow-derived bone / cartilage precursor cell culture liquid or a culture concentrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a therapeutic use of a bone marrow-derived bone / chondrocyte precursor cell culture fluid or a culture concentrate thereof for bone diseases.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating osteopathy comprising bone marrow-derived bone / cartilage precursor cell culture liquid or a culture concentrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage damage or cartilage defect diseases comprising, as an active ingredient, stem cells or differentiated chondrocytes differentiated by the above method.
  • the present invention also provides a method for treating cartilage damage or cartilage defect diseases, which comprises administering to a subject a composition comprising the cartilage cells induced to differentiate by the above method as an active ingredient.
  • the present invention provides a therapeutic use of cartilage damage or cartilage defect disease of cartilage cells induced differentiation by the above method.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating cartilage damage or cartilage defect comprising as an active ingredient, a culture medium for bone / cartilage precursor cells derived from chicken bone marrow or a culture concentrate thereof.
  • the composition for promoting bone formation or inducing cartilage formation according to the present invention is a composition for promoting bone formation or inducing cartilage formation by using a culture medium of osteochondrocyte precursor cells derived from chicken bone marrow derived from a host, It has the advantage of effectively differentiating stem cells into osteocytes.
  • Chick bone marrow-derived osteochondrocyte progenitor cells of the present invention have a high proliferative capacity and are capable of mass culture, and are capable of vigorous secretion of various proteins that induce differentiation into chondrocytes
  • the composition can provide a low cost, high efficiency cartilage cell differentiation inducer using the culture medium of the osteochondrocyte precursor cells derived from the exogenous chicken bone marrow without the secondary ossification center.
  • the present invention is economical because it utilizes a chick to be killed to acquire osteochondrocyte precursor cells, and thus it is possible to present a new field of utilization of chick poultry which is regarded as a waste resource.
  • composition of the present invention can be implemented in various formulations such as a concentrate, powder, and gel, and various treatment methods can be implemented according to the formulation.
  • various adult tissues such as bone marrow, periodontal, It is expected that it will be commonly used for stem cells.
  • the present invention is not limited to a therapeutic agent or an adjuvant for osteoporosis diseases that require new bone formation or regeneration such as osteoporosis, bone defect disease, Paget's disease, osteonecrosis of femoral head and osteoarthritis, And can be used for the treatment of cartilage damage diseases that require new cartilage production or regeneration such as degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, fracture, muscle tissue damage, plantar fasciitis, humerus surgery, calcification myositis, nonunion of fracture, , It is expected that it can be used as a health functional food for joint health as well as an adjuvant.
  • FIG. 1 is a schematic view of a process for producing a culture concentrate of bone and cartilage precursor cells of a chicken.
  • FIG. 2A is a diagram showing the state of staining the ilium of a 4-day-old chick.
  • FIG. 2B is a view showing the morphology of the cells recovered and cultured in the iliac bones of 4-day-old chicks.
  • FIG. 2c is a diagram showing expression of bone and chondrocyte precursor cell-related genes in cells cultured and recovered from the iliac bones of 4-day-old chicks.
  • FIG. 2d shows the expression of bone and cartilage precursor cell-related proteins in cells cultured and recovered from the iliac bones of 4-day old chicks.
  • FIG. 2E is a view showing that the cells are bone / cartilage precursor cells by verifying the pluripotency of cells recovered and cultured in the iliac bones of 4-day-old chicks.
  • FIG. 3A is a photograph of human adipose-derived mesenchymal stem cells obtained according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3A is a photograph of human adipose-derived mesenchymal stem cells obtained according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3B is a graph showing that the obtained cells are mesenchymal stem cells by analyzing protein expression of cells obtained according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3C is a graph showing that the obtained cells are mesenchymal stem cells by verifying the pluripotency of cells obtained according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of bone morphogenesis of mesenchymal stem cells cultured for 14 days or 21 days in a stem cell culture medium, a bone cell induced differentiation medium, a mixed culture medium for a bone cell-derived mixed cell culture medium or a mixed culture medium for a chicken cell culture concentrate And the degree of differentiation is confirmed.
  • FIG. 5 is a view showing the bone differentiation level of mesenchymal stem cells cultured in a stem cell culture medium, a bone cell induced differentiation medium, or a mixed culture medium of a chicken cell culture concentrate.
  • FIG. 6A is a graph comparing the bone differentiation level of mesenchymal stem cells cultured in a stem cell culture medium, a bone cell induced differentiation medium, or a chicken cell culture medium-mixed bone cell induced differentiation medium quantitatively.
  • FIG. 6b shows the results of Runx2 of mesenchymal stem cells cultured in a stem cell culture medium, a bone cell induced differentiation medium, or a mixed cell culture medium The figure shows the expression amount of the gene.
  • FIG. 7A is a diagram showing that human adipose tissue-derived stem cells are differentiated into chondrocytes according to the treatment of a culture concentrate of bone and cartilage precursor cells of a chicken.
  • FIG. 7B is a graph showing that a culture concentrate of chicken bone and cartilage precursor cells can be used as a cartilage differentiation inducer.
  • FIG. 8 is a photograph showing staining of the protein Sox9, collagen type I (Col I), and collagen type II (Col II), which can confirm the presence or absence of cartilage differentiation.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies in order to identify factors that promote the differentiation of stem cells having multipotency into osteocytes or induce the differentiation of stem cells into chondrocytes,
  • the bone / cartilage precursor cell culture fluid derived from the iliac bone improves the effect of the bone cell inducer used conventionally, and the differentiation efficiency and differentiation rate of stem cells into osteoblasts are remarkably improved and induction of stem cell differentiation into chondrocytes
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a composition for promoting differentiation of stem cells into bone cells or inducing differentiation of stem cells into chondrocytes, comprising a bone / cartilage precursor cell culture liquid as an active ingredient, and a composition for promoting bone formation or inducing cartilage formation to provide.
  • the osteochondrocyte precursor cell culture fluid may be concentrated, and the " culture concentrate " in which the culture medium is concentrated may be obtained by culturing osteochondrocyte precursor cells in a culture medium using a vacuum filtration apparatus, The cell debris is filtered, and the filtrate is concentrated to 2 to 1000 times, preferably 50 to 150 times by using a filter.
  • osteochondrogenitor cell in the present invention refers to a cell that has the ability to differentiate into bone and cartilage but its destiny has not yet been determined.
  • the osteoclast progenitor cell (Osteoprogenitor Cells) Stage, or stage between chondroprogenitor cells that differentiate into chondrocytes, and are present in the bone marrow as well as in the bone marrow.
  • stem cell refers to a cell capable of differentiating organisms constituting a biological tissue into various cells, and is a cell capable of differentiating the cells of the embryo, fetus,
  • the undifferentiated cell is not limited, but may be a mesenchymal stem cell which can be differentiated into bone cells.
  • Stem cells are differentiated into specific cells by differentiation stimuli (environment). Unlike the differentiated cells in which cell division is stopped, proliferation (proliferation) of cells can be produced by dividing cells by self-renewal. expansion, and can be differentiated into other cells by different environments or differentiation stimuli, and has plasticity in differentiation. Stem cells have pluripotency or multipotency.
  • mesenchymal stem cell is a stem cell having multipotency capable of differentiating into adipocytes, bone cells, cartilage cells, muscle cells, neurons.
  • mesenchymal stem cells are identified through the morphological characteristics of the spindle shape and the degree of expression of basic cell surface markers CD73 (+), CD105 (+), CD34 (-) and CD45 (-).
  • the cells were recovered from the femoral bone and calf bones of the chicks within 4 days after hatching (see Example 1-1), and the cells were observed with an optical microscope, and cuboidal shape (see Example 1-3). Further, as a result of analyzing the differentiation ability of the recovered cells, the recovered cells were differentiated into osteocytes and chondrocyte but not differentiated into adipocytes , It was confirmed that the recovered cells were osteochondrocyte precursor cells (see Example 1-4).
  • the osteochondrocyte precursor cells are chicken bone marrow derived osteochondrocyte precursor cells, more preferably osteochondrocyte precursor cells obtained from the matrix of the osteochondral fossa (femur bone and calf bone) at 4 days old chicks .
  • single cell mesenchymal stem cells are isolated from human adipose tissue and analyzed for cell phenotype to determine whether CD105 (+), CD73 (+) CD31 (-), CD45 ), CD166 (+), CD34 (-), and CD90 (+) were confirmed and the pluripotency of osteocytes, chondrocytes and adipocytes was verified to confirm that the isolated cells were mesenchymal stem cells See Example 2).
  • stem cells in which osteochondrocyte progenitor cell culture derived from chicken bone marrow or culture concentrate thereof is induced to differentiate into chondrocytes may be mesenchymal stem cells,
  • the kind is not particularly limited and can be used regardless of whether the mesenchymal stem cells originate from anywhere.
  • the mesenchymal stem cells may be various adult tissue-derived mesenchymal stem cells obtained from known sources such as fat, bone marrow, tissue, embryo, blood, bone marrow, cord blood and the like.
  • the present inventors prepared chicken serum free oocyte precursor cells to prepare a serum-free culture solution of the cells, and concentrated the culture (see Examples 1-5 and 1-6) (See Examples 3-2 and 3-3). The results are shown in Table 1.
  • the present invention provides a method for promoting differentiation efficiency and / or differentiation rate of bone cells into osteoclast precursor cell cultures or stem cells by culturing stem cells in a culture concentrate obtained by concentrating the culture broth.
  • the present invention also provides a method for inducing differentiation of stem cells into chondrocytes by treating the osteoclast precursor cell culture broth or a culture concentrate obtained by concentrating the culture broth to stem cells.
  • the induction of differentiation of stem cells into chondrocytes of the present invention can be performed in vivo or in vitro.
  • the method of treating the culture medium or the culture concentrate with the stem cells is not particularly limited. That is, it is only necessary that the culture solution or the culture concentrate is brought into contact with the stem cells for a predetermined time so that the stem cells can be induced to differentiate into chondrocytes.
  • the stem cells when the induction of differentiation of the stem cells into chondrocytes is performed in vitro, the stem cells are cultured in a culture medium containing a chicken bone marrow-derived osteoclast precursor cell culture broth or a culture concentrate obtained by concentrating the culture broth But is not limited thereto.
  • the culture concentrate does not induce the differentiation of stem cells into osteoblasts, it can increase the efficiency when it is mixed with an existing bone formation inducing agent, and can be used as a therapeutic agent for osteoporosis diseases, By mixing and applying the culture concentrate, it is possible to treat bone damage diseases more effectively. Accordingly, the osteoclast precursor cell culture solution of the present invention or a culture concentrate obtained by concentrating the culture solution can be mixed with a bone formation inducing agent to apply to a disease requiring bone regeneration or formation.
  • the osteoclast precursor cell culture medium of the present invention or a culture concentrate obtained by concentrating the culture medium can be applied to the treatment of diseases requiring regeneration or formation of cartilage.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoclast precursor cell culture fluid or a bone concentrate containing the culture concentrate as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a bone formation inducing agent, and the bone formation inducing agent may be a known substance that triggers the differentiation of stem cells into bone cells.
  • 10 -8 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2-phosphate, and 10 mM [beta] -Glycerophosphate were added to the stem cell culture medium (10% fetal bovine serum and 1% DMEM medium) (High abundance of CD271 (+) multipotential stromal cells (MSCs) in intramedullary cavities of long bones. Cox G et al, Bone, 2012).
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage damage diseases comprising an osteoclast precursor cell culture fluid or a culture concentrate obtained by concentrating the culture fluid as an active ingredient.
  • the composition according to the present invention can be implemented in various formulations such as a concentrate, powder, and gel, and various treatment methods can be implemented according to the formulation.
  • the present invention also provides a composition for promoting differentiation of stem cells into osteoblasts and a composition for promoting osteogenesis, comprising a cultured oocyte precursor cell culture fluid or a culture concentrate obtained by concentrating the culture fluid and an osteogenesis inducer as an active ingredient.
  • the term " culture solution” means a solution in which stem cells are cultured for a predetermined period of time in a liquid medium for supporting growth and survival in vitro of isolated stem cells, Secreted growth factors, proteins such as cytokines, and nutrients remaining in the cell culture.
  • the culture medium includes all conventional culture media suitable for culture of adult stem cells, and the culture medium and culture conditions can be selected depending on the type of cells.
  • the stem cell culture medium may generally be a cell culture minimum medium (CCMM) containing a carbon source, a nitrogen source and a trace element component, and examples thereof include DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, ⁇ MEM, Glasgows Minimal Essential Medium and Iscove's Modified Dulbecco's Medium.
  • the medium may also be supplemented with antibiotics such as penicillin, streptomycin or gentamicin and / or serum additives such as fetal bovine serum (FBS) and human serum albumin May be further included.
  • DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and 1% antidepressant was used as a stem cell culture medium.
  • culture concentrate in the present invention means that the culture solution is obtained by collecting and concentrating the culture solution by a method known in the art (for example, centrifugation, etc.).
  • the concentrated culture liquid can be kept frozen and, if necessary, it can be thawed and diluted to a desired concentration, and dried dry powder can be used.
  • the oocyte precursor cell culture concentrate is obtained by culturing the oocyte precursor cells in a culture medium, filtering the cells and cell debris using a vacuum filtration apparatus, To 1000 times, preferably 50 to 150 times, and more preferably 100 times.
  • composition according to the present invention can be implemented in various formulations such as a concentrate, powder, and gel, and various treatment methods can be implemented according to the formulation.
  • osteoporotic disease or " osteopathy” means a disease requiring bone regeneration or formation in the treatment thereof, and includes, but not limited to, osteoporosis, non-union fracture, osteonecrosis, osteomalacia, bone defect disease, Paget's disease, avascular necrosis of the femoral head, and osteoarthritis.
  • the osteonecrosis of the femoral head is a refractory osteopathy in which the blood supply to the femoral head that constitutes the hip joint is broken due to trauma, drinking and steroid use, and bone destruction. Osteoporosis is also called osteoporosis or osteoporosis.
  • a metabolic bone disease in which the quantitative reduction of bone constituents is a major lesion in a significantly reduced state.
  • cartilage damage disease or " cartilage disease” means a disease requiring cartilage regeneration or formation in the treatment thereof, and cartilage, cartilage tissue, and / or joint tissue (synovial membrane, articular cartilage, It is a disease caused by injury by mechanical stimulation or inflammatory reaction, and can be understood as including “cartilage defect disease”.
  • Non-limiting examples include degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, fracture, muscle tissue damage, plantar fasciitis, humerus ulcer, calcified myositis, nonunion of the fracture or joint injury due to trauma.
  • the term " pharmaceutical composition" means a preparation intended for the prevention or treatment of disease, and may be formulated into various forms according to ordinary methods.
  • it can be formulated into oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions and syrups, and can be formulated in the form of external preparations, suppositories, and sterilized injection solutions.
  • each of the formulations may be further prepared by incorporating pharmaceutically acceptable carriers such as buffers, preserving agents, wetting agents, solubilizing agents, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants and the like in the art .
  • pharmaceutically acceptable carriers such as buffers, preserving agents, wetting agents, solubilizing agents, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants and the like in the art .
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount of the present invention means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and not causing side effects, The severity, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the method of administration, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors involved in the formulation or concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a bone-related disease or cartilage damage-related disease by administering to a subject a composition comprising a cultured osteoclast precursor cell culture fluid or a culture concentrate obtained by concentrating the culture fluid,
  • Related diseases are preferably selected from the group consisting of osteoporosis, bone defect disease, Paget's disease, osteonecrosis of the femoral head, osteoarthritis, and the cartilage damage or cartilage-related diseases are preferably degenerative arthritis , Rheumatoid arthritis, fracture, muscle tissue damage, plantar fasciitis, humerus surgery, calcified myositis, nonunion of fracture, and traumatic joint damage.
  • individual in the present invention may be a mammal such as a mouse, a domestic animal, a mouse, a human, and the like, and may specifically be a dog, horse race, human or the like requiring treatment of a bone disease or cartilage disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into various forms for administration to an individual, and representative examples of formulations for parenteral administration are preferably isotonic aqueous solutions or suspensions in the form of injection.
  • the injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • formulations for oral administration include, for example, ingestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups and wafers, etc.
  • These formulations may contain, in addition to the active ingredient, diluents (e.g., lactose, dextrose, , Sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine) and lubricants (e.g., silica, talc, stearic acid and magnesium or calcium salts thereof and / or polyethylene glycols).
  • diluents e.g., lactose, dextrose, , Sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine
  • lubricants e.g., silica, talc, stearic acid and magnesium or calcium salts thereof and / or polyethylene glycols.
  • the tablets may contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, optionally mixed with starch, agar, A disintegrating agent such as sodium salt, an absorbent, a coloring agent, a flavoring agent and / or a sweetening agent.
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, optionally mixed with starch, agar,
  • a disintegrating agent such as sodium salt, an absorbent, a coloring agent, a flavoring agent and / or a sweetening agent.
  • the formulations may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • composition of the present invention may further comprise adjuvants such as preservatives, wettable powders, emulsifying accelerators, salts for controlling osmotic pressure or buffering agents, and other therapeutically useful substances, and may be formulated according to a conventional method .
  • adjuvants such as preservatives, wettable powders, emulsifying accelerators, salts for controlling osmotic pressure or buffering agents, and other therapeutically useful substances.
  • composition according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or muscular, and the dose of the active ingredient may be appropriately determined depending on the administration route, age, sex, And can be appropriately selected according to various factors.
  • the composition of the present invention may be administered in combination with a known compound capable of raising the desired effect
  • the administration route of the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered to humans and animals parenterally such as orally, intravenously, subcutaneously, intranasally or intraperitoneally. Oral administration also includes sublingual administration. Parenteral administration includes injection and drip, such as subcutaneous, intramuscular, and intravenous.
  • the total effective amount of the osteoclast precursor cell culture solution or the culture concentrate derived from chicken bone marrow according to the present invention can be administered to a patient in a single dose, dose may be administered by a fractionated treatment protocol administered over a prolonged period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered several times a day at an effective dose of 100 ⁇ g to 3,000 mg per one administration on an adult basis, although the content of the active ingredient may be varied depending on the degree of disease .
  • the concentration of the culture solution or the culture concentrate is not limited to the administration route of the drug and the number of treatments, but also the effective dose to the patient in consideration of various factors such as age, body weight, health condition, sex, severity of disease, Can be determined.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to the formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a known osteogenic differentiation inducer or cartilage differentiation inducer as well as a cultured osteoclast precursor cell culture fluid or culture concentrate thereof derived from chicken bone marrow as an active ingredient, Can be used in combination with other therapies.
  • the composition comprising the culture medium of osteochondrocyte precursor cells derived from chicken bone marrow or the culture concentrate thereof as an active ingredient of the present invention can be used variously in medicines, foods and beverages effective for prevention or improvement of bone related diseases or cartilage related diseases.
  • Examples of the food to which the osteogenic precursor cell culture derived from chicken bone marrow of the present invention or a composition containing the culture concentrate as the active ingredient can be added include various foods, beverages, gums, tea, vitamin complex, And the like, and can be used in the form of powder, granule, tablet, capsule or beverage.
  • composition comprising the oocyte precursor cell culture liquid derived from chicken bone marrow or the culture concentrate thereof as an active ingredient of the present invention is useful as a food or drink for the purpose of preventing or improving bone related diseases or cartilage related diseases, Or beverages.
  • the amount of the compound in the food or beverage may generally be from 0.01 to 15% by weight of the total food, and the health beverage composition may be added in a proportion of 0.02 to 10 g, preferably 0.3 to 1 g, Can be added.
  • the health functional food of the present invention may contain, as an additional ingredient, a pharmaceutically acceptable food-aid additive, such as various flavors or natural carbohydrates, in addition to the above-mentioned compound as an essential ingredient in the indicated ratio.
  • a pharmaceutically acceptable food-aid additive such as various flavors or natural carbohydrates
  • natural carbohydrates include conventional sugars such as monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural flavors other than those mentioned above, natural flavors (tautatin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) .
  • the ratio of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of the health functional food of the present invention.
  • the health functional food of the present invention may contain flavorings such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, And salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the health functional food of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical, but is generally selected in the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • Example 1 Bone marrow cartilage Progenitor cell Separation / culture and preparation of culture concentrate of the cells
  • the femur and tibia portions were recovered from both legs of the chicks within 4 days after hatching and washed twice.
  • the muscles and tendons attached to the bones were cleanly removed and then rinsed twice. All rinsing procedures were performed with phosphate-buffered saline (PBS) containing 1% antibiotic and antimicrobial agent.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the cured portion of both sides of the bone was removed using surgical scissors, punched out with an 18 gauge (G) injection needle, and then immersed in PBS supplemented with 1% antibiotic and 2% fetal bovine serum (FBS) was placed in a 3-ml medical syringe with an 18-gauge needle and pushed into a hole in the bone tip to recover the matrix in the bone and repeated three times in both directions.
  • the femoral bone was used with 18G needle and the calf bone was recovered with 20G needle.
  • the collected matrix was collected from a total of four bones per mouse in a 14-ml round bottom tube and homogenized by passing 10 times through the syringe used for collection.
  • a 100 ⁇ m pore mesh was placed on a 50 ml conical tube and the homogenized matrix was sieved to filter out the bone fragments or flesh that had flowed in at the time of collection.
  • PBS was filled in the tube and centrifuged at 320G for 4 minutes using a centrifuge to obtain a cell pellet, which was a cell mass precipitated at the bottom of the tube. Subsequently, the supernatant was removed, and 5 ml of a basic medium (F12 / DMEM) was added to the cell pellet, which was uncoated.
  • a basic medium F12 / DMEM
  • Example 1-1 The cells recovered in Example 1-1 were cultured at a density of 3 ⁇ 10 6 cells per 1 cm 2 of the culture vessel in a concentration of 3.151 g / L of D-glucose, 365 mg / L (2.5 mM) of L-glutamine, 55 mg / DMEM medium supplemented with 0.5 mM sodium pyruvate, 10% FBS, and 1% antibiotic-antimicrobial were incubated in a 5% CO 2 incubator at about 90% humidity and 37 ° C temperature. When the confluency of the cells reached about 80 to 90%, the culture broth was removed and washed twice with cold PBS. After 0.25% trypsin-EDTA treatment for 2 minutes, the cell suspension was recovered and centrifuged at 320G for 4 minutes. Cell viability and cell viability were examined and then subcultured three times.
  • Histologic staining was performed with hematoxylin-eosin staining in order to analyze the morphological state of the inside of the iliac crest. 4-day-old chicks were immersed in 4% paraformaldehyde fixative for 24 hours at room temperature. The fixed tissues were washed, decalcified, invert and dehydrated and embedded in paraffin. Tissue sections were prepared with a thickness of 6 ⁇ m and deparaffinized by placing them in a heating block at 60 ° C. for 45 minutes. Xylene three times for 5 minutes, 100% ethanol for 3 minutes, 95% ethanol for 2 minutes, 70% ethanol for 2 minutes, and distilled water for 2 minutes.
  • the tissue sections were stained with 1% hematoxylin solution for 30 sec, distilled water washing, 0.25% hydrogen chloride for 1 sec, distilled water washing, and lithium carbonate color development. Eosin was treated for 2 seconds to stain the cytoplasm, dehydrated and transparentized, mounted, and observed with a microscope. As a result, as shown in FIG. 2A, the iliac bone of 4-day-old chickens is filled with cartilage cells of various stages at 60% or more of the total area, and epiphysis is not yet formed in the secondary ossification center It was confirmed that they were kept in faux bone state.
  • chicken bone and chondrocyte precursor cells generally have a small and cuboidal shape, unlike those of mesenchymal stem cells.
  • Example 1-1 the cells recovered in Example 1-1 were cultured in the fifth subculture according to the method of Example 1-2, and then bone marrow and cartilage precursor cell-related transcription factors Sox9 , Collagen type I, Collagen type II, Runx2 gene expression amount and Sox9 , Collagen type I, Collagen type II, and protein expression level.
  • RNA was extracted by phenol-chloroform extraction using Trizol reagent and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) PCR was performed using Sox9 , Collagen type I, Collagen type II, Runx2 , and the antisense ⁇ - actin gene as control genes, using primers specific for each gene.
  • the primer information used is shown in Table 1 below, and the PCR product was analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result is shown in FIG. 2C.
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes, washed three times with PBS, and blocked with 1% BSA and 10% goat serum solution.
  • Each of the proteins was treated with a primary antibody, reacted at 4 ° C for 18 hours, washed twice with PBS, treated with a secondary antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology) with fluorescence against the primary antibody, And reacted for 1 hour.
  • Dapi (4 ', 6-Diamidine-2'-phenylindole) was treated for 1 minute to stain nuclei. After mounting with the mounting solution, the expression was analyzed using a fluorescence microscope and the results are shown in FIG. 2d.
  • Figs. 2C and 2D As a result, as shown in Figs. 2C and 2D.
  • characteristic genes of bone and cartilage precursor cells, bone precursor cells, or chondrocyte precursor cells were expressed and it was confirmed that the specific proteins Sox9, Collagen type I and Collagen type II were expressed.
  • Examples 1-1 and 1-2 were osteochondrocyte progenitor cells having multipotential potential, differentiation induction was carried out into osteocytes, adipocytes and chondrocytes.
  • low glucose DMEM supplemented with 10 -7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2-phosphate, 10 mM ⁇ -glycerophosphate, 10% FBS and 1% antibiotics was changed every 3 days, Lt; / RTI > After induction of differentiation, Alizarin Red S (ARS, manufactured by Sigma) was stained to determine whether it was differentiated into bone cells.
  • ARS Alizarin Red S
  • adipocytes The differentiation of adipocytes was induced by low glucose DMEM supplemented with 10 -6 M dexamethasone, 0.5 mM IBMX (3-siobutyl-methylxanthine), 0.1 mM indomethacin, 10 ⁇ g / ml bovine insulin (PH 2.5), 10% FBS, The cultures were changed every 3 days and differentiation was induced for 21 days. After induction of differentiation, the cells were stained with Oil Red O (ORO, Sigma) and analyzed for differentiation into adipocytes.
  • ORO Oil Red O
  • Chondrocyte differentiation was induced by 10 ng / ml TGF- ⁇ 1, 10 -7 M dexamethasone, 1% ITS, 1.25 mg / ml BSA, 5 mg / ml linoleicacid, 50 mg / ml ascorbicacid- DMEM / F12 medium supplemented with L-proline, 10% FBS and 1% antibiotic was changed every 3 days to induce differentiation for 21 days. After induction of differentiation, Alcian blue staining was performed to analyze the differentiation into chondrocytes.
  • the chicken cells recovered by the method of Example 1-1 were differentiated into osteocytes and chondrocytes but not into adipocytes.
  • the above results indicate that the cells of the chicken recovered by the method of Example 1-1 are bone / cartilage precursor cells having the ability to differentiate into bone and cartilage.
  • Serum F12 / DMEM medium supplemented with 3.151 g / L D-glucose, 657 mg / L (4.5 mM) L-glutamine, 110 mg / L (1 mM) sodium pyruvate and 1% antibiotic- Serum-free culture medium of bone and cartilage precursor cells was prepared by culturing in a 5% CO 2 incubator for 3 days at a temperature of about 90% and a temperature of 37 ° C.
  • the culture solution prepared in Example 1-5 was collected and placed in a disposable vacuum filtration apparatus (0.45 ⁇ ⁇ pore size, manufactured by Corning) for filtration of the bone and cartilage precursor cells of the chicken, And the remaining cells and debris were removed.
  • the filtered culture was concentrated 100 times using an ultra-centrifugal filter (3 Kda cut off, Amicon).
  • the protein concentration of the concentrated culture medium was 2 to 3 mg / ml, and the culture concentrate was dispensed at a dose of 500 ⁇ g and stored at -20 ° C.
  • the culture concentrate was slowly dissolved in a refrigerator at 4 ° C.
  • Example 2 Origin of human adipose tissue Mesenchymal stem cells Acquisition and characterization
  • the collected visceral adipose tissue (omental adipose tissue) was washed three times in cold PBS containing 1% antibiotic-antimicrobial agent.
  • the blood vessels, coagulated blood, and connective tissue attached to the cleaned tissue were removed with forceps and surgical scissors and washed again twice.
  • the tissue was placed in a 100 ml glass bottle and chopped to less than 5 mm 2 using surgical scissors.
  • DMEM medium supplemented with 0.1% collagenase type I manufactured by Sigma-Aldrich was added twice as much as the tissue volume and slowly stirred for 30 minutes at 37 ° C in a thermostat so that sufficient enzyme reaction could take place.
  • the medium was collected, collected in a tube, stored in ice, and a new enzyme medium was added, and the above procedure was repeated once.
  • the medium collected in the first and second rounds was added to a 100 ⁇ m pore mesh and centrifuged at 320 G for 4 minutes. The pure fat layer was removed and the mononuclear layer was recovered and washed twice. The red blood cells were then immersed in erythrocyte hemolysis solution (Gibco BRL) for 10 minutes at room temperature.
  • erythrocyte hemolysis solution Gibco BRL
  • FIG. 3A shows the morphology of the cells after photographing the cells after 5 passages.
  • Example 2-1 In order to examine the characteristics of mesenchymal stem cells isolated and cultured in Example 2-1, the expression of CD105, CD73, CD31, CD45, HLA-DR, CD166, CD34 and CD90, which are markers of mesenchymal stem cells, (B & D Bioscience, CellQuest TM Pro).
  • CD31 vascular endothelial cell
  • CD34 hematopoietic stem cell
  • CD45 hematopoietic cell
  • MHC class II leukocyte antigen class II
  • Example 2-1 In order to analyze the pluripotency of mesenchymal stem cells isolated and cultured in Example 2-1, differentiation induction was carried out into bone cells, adipocytes and chondrocytes.
  • low glucose DMEM supplemented with 10 -7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2-phosphate, 10 mM ⁇ -glycerophosphate, 10% FBS and 1% antibiotics was changed every 3 days, Lt; / RTI > After induction of differentiation, Alizarin Red S (ARS, manufactured by Sigma) was stained to determine whether it was differentiated into bone cells.
  • ARS Alizarin Red S
  • adipocytes The differentiation of adipocytes was induced by low glucose DMEM supplemented with 10 -6 M dexamethasone, 0.5 mM IBMX (3-siobutyl-methylxanthine), 0.1 mM indomethacin, 10 ⁇ g / ml bovine insulin (PH 2.5), 10% FBS, The cultures were changed every 3 days and differentiation was induced for 21 days. After induction of differentiation, the cells were stained with Oil Red O (ORO, Sigma) and analyzed for differentiation into adipocytes.
  • ORO Oil Red O
  • Chondrocyte differentiation was induced by 10 ng / ml TGF- ⁇ 1, 10-7 M dexamethasone, 1% ITS, 1.25 mg / ml BSA, 5 ⁇ g / ml linoleicacid, 50 ⁇ g / ml ascorbicacid- DMEM / F12 medium supplemented with L-proline, 10% FBS and 1% antibiotic was changed every 3 days to induce differentiation for 21 days. After induction of differentiation, Alcian blue staining was performed to analyze the differentiation into chondrocytes.
  • Example 2-1 As a result, as shown in FIG. 3C, it was confirmed that the mesenchymal stem cells isolated and cultured in Example 2-1 had a pluripotency capable of differentiating into bone cells, adipocytes and chondrocytes.
  • Example 3 Origin of human adipose tissue Mesenchymal stem cells Bone differentiation Accelerated test
  • the human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells obtained in Example 2 were added to the oocyte-derived differentiation medium at a concentration of 200 ⁇ g / ml to examine whether bone cell differentiation was promoted.
  • the stem cell culture medium used was DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic, and 10 -7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2-phosphate, 10 mM ⁇ - Glycerophosphate, DMEM supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic was used.
  • the human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells obtained in Example 2 were seeded in a 6-well culture plate (manufactured by SPL) at 2 ⁇ 10 5 cells in the 5th passage culture, and when the confluency reached 90% Osteoclast differentiation was induced. Bone cell differentiation was performed by culturing in four different media for 14 days or 21 days, respectively, and medium was changed every 3 days.
  • DMEM medium stem cell culture medium, control group
  • Bone cell-induced differentiation medium group of bone formation inducing agent alone
  • a culture medium containing 200 ⁇ ⁇ / ml of the chicken cell culture concentrate prepared by culturing the cells in a culture medium (cell culture medium) supplemented with 200 ⁇ ⁇ / ml of the chicken cell culture concentrate prepared above) Concentrate alone treatment group).
  • ARS Alizarin Red S
  • ARS binds to metal ions, it can be used to determine osteoclast differentiation by staining calcium-secreted calcium (Calcium Precipitation, Mineralization) from cells.
  • Cells at the time of differentiation were treated with 4% PFA (paraformaldehyde) and fixed at room temperature for 1 hour. The fixed cells were washed twice with D.W and treated with 1% ARS staining solution at room temperature for 15 minutes. At this time, ARS solution was diluted with 1% concentration of ARS in D.W of pH 4.5 and stirred for 18 hours using a magnetic bar and filtered. After staining the cells, the cells were washed 5 times with D.W, and then ARS staining was confirmed on an optical microscope.
  • CPC buffer cetrlpyridinium chloride buffer, manufactured by Sigma
  • Example 3-1 the expression level of Runx2 gene was analyzed by Real-time PCR in the cells of the control group, bone marrow differentiation inducer alone treatment group, and bone marrow differentiation inducer and culture concentrate mixed treatment group.
  • the Runx2 gene is known to be the most important transcription factor in bone differentiation. Specifically, RNA was extracted with phenol-chloroform extraction method using Trizol reagent and cDNA was synthesized using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) Runx2 And the control gene GAPDH Real-time PCR was performed using a gene-specific primer. The primer information used in the PCR is shown in Table 2 below. The PCR product was electrophoresed on an agarose gel to analyze the relative gene expression amount, and the result is shown in FIG. 6B.
  • the culture medium of chicken osteochondrocyte precursor cells or the concentrate thereof promotes the differentiation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into osteocytes.
  • the present invention provides a composition for promoting the differentiation of stem cells into osteoblasts using a culture medium of bone and cartilage precursor cells of a chicken, which can promote bone formation using the composition, And to provide supplements.
  • the application of the cell-based therapy using stem cells will be enhanced in the treatment approach of various bone diseases, and a new application method of the cholesterol as a disposal resource, which is a worldwide issue, It is expected.
  • Example 2 From the human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells obtained in Example 2, the culture medium concentrate prepared in Example 1 was inoculated into a stem cell culture medium (DMEM containing 10% FBS, 1% antibiotic, Medium) to induce chondrocyte differentiation induction test.
  • DMEM stem cell culture medium
  • the positive control was DMEM medium supplemented with 1X ITS, 1.25 mg / ml BSA, 5 ⁇ g / ml linoleic acid, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid-2-phosphate, 10 ng / ml TGF- Were used.
  • Example 2 When the human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells obtained in Example 2 were cultured in 5 passages, 2 to 2.5 ⁇ 10 5 cells were placed in a 15 ml conical tube (manufactured by SPL), centrifuged at 320 G for 1 minute, To make pellets. Chondrocyte differentiation was performed by culturing the pellet in each of the following three media for 10 days, and the medium was changed every 3 days. Alcian blue staining was used to determine whether the cells were differentiated into chondrocytes.
  • Negative control group Non-induction culture medium (stem cell culture medium) 2) Positive control group: Chondrocyte-induced differentiation medium based on TGF- ⁇ 1 3) Experimental group: 100 ⁇ g of the chicken cell culture concentrate prepared in Example 1-6 / ml single added chondrocyte-induced differentiation medium.
  • Alician blue can be stained blue with sulfated glycosaminoglycan of cartilaginous substrate, or cysteine more than 4% in protein, and it can be judged whether it is differentiated into chondrocytes.
  • the pellet was recovered, washed with DPBS three times, immersed in 4% PFA (paraformaldehyde) and fixed at room temperature for 24 hours. The fixed pellet was subjected to transparency and dehydration and then embedded in paraffin.
  • Cell slices were prepared with a thickness of 6 ⁇ m using a slicer. The prepared slices were stained by deparaffinization and hydrolysis in an alician blue solution for 30 minutes.
  • alician blue solution was prepared by diluting 1% alician blue powder in acetic acid solution and adjusting pH 2.5 with 1/10 N HCl. After washing for 5 minutes in flowing water, the pellet slice was treated with 0.1% Nuclear Fast Red Solution for 2 minutes. Nuclear Fast Red Solution was prepared by mixing 0.1% Nuclear Fast Red Solution and 5% aluminum sulfate powder in distilled water. After that, it was washed in running water for 5 minutes, dehydrated, and then subjected to transparency to mount it. The stained cell pellet was confirmed by optical microscopy for alician blue staining, and photographed cell pellet photographs were quantified using the Image J program.
  • Sox9, Aggrecan, and Collagen type II are proteins that can confirm the presence or absence of chondrogenic differentiation of stem cells.
  • the expression of Sox9, Aggrecan, and ColII in one stem cell was confirmed. Specifically, after 10 days from the induction of chondrocyte differentiation by the method of Example 4-1, the pellet was recovered, washed with DPBS three times, immersed in 4% PFA (paraformaldehyde) and fixed at room temperature for 24 hours. The fixed pellet was subjected to transparency and dehydration and then embedded in paraffin.
  • Cell slices were prepared with a thickness of 6 ⁇ m using a slicer, and the prepared cell slices were exposed to a heating block at 60 ⁇ for 45 minutes to perform deparaffinization. Then, the cell slice was washed three times for 5 minutes each with xylene, 3 times for 5 minutes for 100% ethanol, 2 times for 2 minutes for 95% ethanol, twice for 2 minutes for 70% ethanol and 2 minutes for distilled water. treated with unmasking solution (manufactured by Vector), 100% methanol and 30% hydrogen peroxide were mixed at a ratio of 9: 1 and treated for 10 minutes. The cell slice was then washed three times with PBS and blocked with PBS supplemented with 1% BSA and 10% goat serum for 1 hour at room temperature.
  • unmasking solution manufactured by Vector
  • the cell culture concentrate obtained by culturing chicken bone and cartilage precursor cells induces cartilage differentiation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. It is expected that the present invention can be developed as a therapeutic or adjuvant for cartilage disease using chicken bone and chondrocyte culture fluid, and it is expected to be a new application method of chickberry as a disposal resource which is being discussed worldwide.
  • the bone marrow-derived bone / cartilage precursor cell culture solution or the culture concentrate thereof according to the present invention is useful as a therapeutic agent for bone injury diseases requiring new bone formation or regeneration such as osteoporosis, bone defect disease, Paget's disease, osteonecrosis of femoral head and osteoarthritis , And may be used as a health functional food for bone health as well as an adjuvant, and may be used as a health functional food for bone health, such as degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, fracture, muscle tissue damage, plantar fasciitis, humeral fracture, calcific myositis, nonunion of the fracture, It is expected that it can be used as a health functional food for joint health as well as a therapeutic agent and an adjuvant for cartilage damage diseases which require new cartilage production or regeneration.
  • bone injury diseases requiring new bone formation or regeneration such as osteoporosis, bone defect disease, Paget's disease, osteonecrosis of femoral head and osteoarthriti

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Abstract

본 발명은 골 생성 촉진 또는 연골 분화 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 골 생성 촉진 또는 연골 분화 유도용 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명에 따라 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 기존에 골세포 유도를 위하여 사용된 화학물질 기반의 분화유도제와 혼합하여 사용하는 경우, 골분화유도제를 단독으로 사용하는 경우보다 더욱 효과적으로 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있으며, 유추기 닭 골수 유래 골연골전구세포는 증식능력이 높아 대량배양이 가능하고, 연골세포로 분화를 유도하는 다양한 단백질을 왕성하게 분비하는 질 좋은 골연골전구세포로써, 상기 조성물은 2차골화중심이 생성되지 않은 유추기 닭 골수 유래 골연골전구세포의 배양액을 이용하여, 저비용 고효율의 연골세포 분화 유도제를 제공할 수 있다. 이에 본 발명은 골다공증, 골결손질환, 파제트병, 대퇴골두무혈성 괴사증, 및 골관절염 등의 새로운 뼈의생성 또는 재생이 필요한 골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 뼈 건강을 위한 건강기능식품으로 활용될 수 있으며, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상 등의 새로운 연골의 생성 또는 재생이 필요한 연골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 관절 건강을 위한 건강기능식품으로도 활용 가능할 것으로 기대된다.

Description

닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 골 생성 촉진 또는 연골 분화 유도용 조성물
본 발명은 골 생성 촉진 또는 연골 분화 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 골 생성 촉진 또는 연골 분화 유도용 조성물 등에 관한 것이다.
뼈를 구성하는 세포는 뼈의 항상성을 유지하는 골세포(osteocyte), 뼈를 형성하는 골모세포(osteoblast), 뼈를 흡수하는 파골세포(osteoclast), 그리고 뼈의 말단의 관절기능을 담당하는 연골세포(chondrocyte) 등이 있으며, 성장이 완료된 골(骨)에서도 해면골은 파골세포에 의해서 흡수되면 다른 표면에서는 골모세포에 의해서 새로운 골이 형성되면서 재형성되게 된다. 이러한 골형성과 골흡수의 균형이 깨어지면 골질환으로 진행되는데, 이러한 골질환으로 난치성 골질환에는 골다공증(osteoporosis), 불유합(non-union) 골절, 골괴사증(osteonecrosis), 골연화증(osteomalacia), 골결손 등이 있다. 또한, 무혈성대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head)는 외상, 음주, 스테로이드제 복용 등의 원인으로 고관절을 이루는 대퇴골 골두에 혈액 공급이 중단되어 뼈가 파괴되는 난치성 골질환으로, 이 질환은 미국에서는 연간 20,000명, 한국에서는 연간 4,000명~5,000명의 발병률을 보이며, 대부분 20-50세에서 발생하며 평균 30대 후반에서 발생률이 높은 것으로 알려져 있다. 그러나, 인공관절 치환술의 수술적 방법 이외에는 특별한 치료 방법이 개발되어 있지 않다.
또한, 골다공증은 골소공증 또는 골 조송증이라고도 하며, 정상인에 비해 골량이 현저히 감소된 상태로 골의 구성성분의 양적 감소를 주 병변으로 하는 대사성 골 질환을 의미한다. 일반적으로 골다공증의 병태 자체는 무증상 또는 경미한 증상인 경우가 많지만, 일단 골절이 생기면 일반적으로 치료가 곤란하고, 골접합술을 시술해도 충분하게 회복되기가 어렵다.
이제까지 골다공증, 골절을 비롯한 골질환의 예방제 및/또는 치료제로서, 칼슘 제제, 에스트로겐 제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절약(SERM), 활성형 비타민 D3 제제, 비타민 K 제제, 이프리플라본 제제, 칼시토닌 제제, 비스포스포네이트 제제, 부갑상선 호르몬 제제, 단백 동화 호르몬 제제, 골형태 유도 인자(BMP), 또는 섬유아세포 증식 인자(FGF) 등이 임상적으로 사용되거나, 또는 임상 응용이 시도되어 왔으나, 이와 같이 다수의 약제가 사용되고 있음에도 불구하고, 골질환의 환자수는 해마다 증가되고 있는 실정이며, 따라서 이런 난치성 골 질환을 효율적으로 치료하기 위한 새로운 개념의 치료제 개발이 절실히 요구되고 있다.
상기와 같은 필요에 의해 골 재생을 촉진하는 생체 유사성(biomimetic) 물질, 유전자 기반의 치료, 및 세포 기반의 치료와 관련된 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 그 중에서도 세포 기반의 치료(cell based therapy)는 중간엽줄기세포를 이용한 것으로, 생체 외에서도 증식이 가능한 중간엽줄기세포의 특성 및 면역조절 특성에 의한 잠재적 동종 이식에 적합성 덕분에 활발한 연구가 진행되고 있다.
중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)란 부착성 성질을 가지는 성체줄기세포의 한 종류로 골세포, 연골세포, 지방세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능 (multipotency)을 가진 줄기세포이다(한국공개특허 제10-2015-0069375호). 성체줄기세포(adult stem cell)는 환자 본인의 몸에서 얻을 수 있어, 세포획득에 관한 윤리적인 문제에서 자유로우며, 자가 복제능력과 배양조건에 따라 골, 연골, 지방, 근육, 건 등 각 결체조직으로 분화할 수 있어 근골격계 조직의 재생을 위한 아주 유용한 세포원으로 인식되고 있다. 현재까지 진행된 성체줄기세포에 대한 대부분의 연구들은 골수에서 추출하여 배양된 중간엽줄기세포를 이용하고 있으며, 이외에도 골막, 지방조직, 근육 등의 대부분의 근골격계 조직에서도 성체줄기세포가 존재한다고 알려져 있다. 특히 지방조직은 비교적 간단한 지방흡인술을 이용해 공여부의 기능 장애 없이 손쉽게 다량을 얻을 수 있으므로, 최근 성체줄기세포의 공급원으로써 관심이 모아지고 있다.
지방조직은 골수세포와 마찬가지로 배아 중배엽에서 기원하며 지방에서 분리한 성체줄기세포에서 골이나 연골로의 분화가 일어날 수 있음이 여러 연구에 의하여 밝혀지고 있다. 하지만, 언급된 장점에도 불구하고 지방 유래의 중간엽줄기세포의 낮은 분화능은 지방줄기세포의 세포원으로써의 사용에 한계점으로 여겨지고 있다. 따라서 지방줄기세포를 유용한 세포원으로 사용하기 위해서는 지방줄기세포의 분화에 영향을 주는 다양한 인자들에 대한 발굴과 집중적인 연구가 필요한 실정이다.
한편, 연골은 뼈와 함께 골격을 구성하고 내부 기관들의 보호 역할을 하며, 연골 조직은 연골세포들과 그것을 둘러싼 연골 매트릭스로 이루어진다. 연골은 중간엽-유래의 연골아 세포에 의해 형성되는데, 연골아 세포는 세포 분화와 성장의 과정 동안 주변에 매트릭스를 만들어낸다. 연골 매트릭스의 주요 성분들은 프로테오글라이칸과 콜라겐이다(타입 II, 타입 IX 등). 프로테오글라이칸은 연골조직에 특유한 흡수(팽화) 특성에 관여하고, 콜라겐은 긴장과 전단력에 대항하여 연골의 단단함에 관여하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다. 연골장애로 인한 알려진 병들의 예들은 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 추간판증 또는 반월판 손상을 포함한다.
지금까지 개발된 손상 연골의 치료법으로는 연골성형술(chondroplasty), 골연골이식술(osteochondraltransplantation), 자기유래연골세포 이식술(autolaugous chondrocyte transplantation) 등을 들 수 있다.
상기 연골성형술은 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 직접적인 관절 절개가 필요 없어 환자의 고통 및 부담을 줄일 수 있으며, 관절경을 통해 미세한 조직손상을 관찰 즉시 치료할 수 있다는 장점을 지닌다. 그러나 연골성형술에서는 실제의 관절에 필요한 초자연골(hyaline cartilage)이 아니라 섬유 연골(fibro-cartilage)이 주로 생성되기 때문에, 기능적인 측면에서 볼 때는 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다.
한편 골연골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골부위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식(autolaugous transplantation)이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다.
최근 시행되기 시작한 자가 유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 채취한 연골조직으로부터 연골세포를 얻어, 체외에서 필요한 수만큼 배양하고 증식한 후, 이를 연골 손상부위에 골막(periosteum)을 이용하여 공간을 확보하고 배지와 함께 주입하여, 이 세포들의 증식에 의해 손상된 연골 부분을 채우도록 하는 방법이다. 그러나 자가 유래 연골세포 이식술은 공여 조직이 제한되어 있고, 이식용 조직을 채취하기 위한 수술을 필요로 하기 때문에 시술 과정이 복잡하고 까다롭다.
상기 방법을 응용하여 자가 유래 골수(bone marrow), 근육, 피부 등의 중간엽 조직으로부터 연골세포(chondrocyte)의 전구모세포(precursor cell)인 중간엽세포(mesenchymal stem cell; MSC)를 얻고, 체외에서 분화시켜 고분자와 함께 관절연골손상 부위에 주입하는 방법이 보고 된 바 있다. 상기와 같이 성숙된 개체에서 얻은 중간엽세포를 이용하여 연골손상을 치료하는 방법은 자가 유래 연골세포 이식술에 비해, 보다 미분화된 세포를 얻어 체외 배양하므로 세포 증식력이 다소 높아지는 것으로 나타났다. 상기 중간엽세포에서 연골세포의 분화를 유도하는 인자들로는 BMP(bone mophogenetic protein), TGF-β(transforming growth factor β), FGF(fibroblast growth factor), IGF-I(insulin-like growth factor), 파라티로이드 호르몬 관련 펩타이드가 알려져 있다. 그러나 상기 분화인자들은 중간엽세포에서 연골세포로의 분화 유도시 원치 않는 다른 세포로의 분화를 유발하는 문제점을 가지고 있다. 즉, TGF-β의 경우 중간엽세포가 비대연골세포로 분화될 위험이 있으며, BMP의 경우 골증식체(osteophyte formation)로 분화될 위험이 있다.
따라서, 기존의 중간엽세포에서 연골세포의 분화를 유도하는 인자들에 비해 부작용이 적고, 효과적인 분화 유도용 물질에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
한편, 닭의 유추기는 뼈의 성장속도가 매우 빠른 시기로 연골이 뼈로 대체되는 연골내 골화(endochondral ossification)가 진행되고 있는 골 성장기이다. 이 시기에 닭의 대퇴부 장골은 아직 석회화가 진행되지 않은 초자연골이 다량 존재한다. 연골내 골화는 길쭉하게 생긴 뼈, 즉 장관 골을 형성할 때 나타나는 골 형성 과정으로 지아(limb bud) 내부의 중간엽세포들이 뭉치면서 연골세포로 분화하여 원골 원기(cartilage anlage)가 생성된 후 원기 중앙부의 연골세포가 선택적으로 비대해지고 석회화(calcification)가 일어나 죽게 되는데 여기로 혈관이 자라 들어오면서 따라 들어온 중간엽세포들이 골모세포로 분화(일차 골화중심)하면서 뼈가 생성되게 된다. 이러한 연골내 골화 과정은 일차 골화 중심에서 장관 골 양 끝단으로 진행되며, 연골 원기에서는 연골세포 증식이 지속되어 길이 성장을 하게 된다. 연골 원기 양단에서 별도의 이차 골화 중심이 출현하며, 일차 골화 중심에 의해서 골화되는 간단부(metaphysis)와 이차 골화 중심에 의해서 형성되는 골단부(epiphysis) 사이에 잔존하는 연골을 골단판(epiphyseal plate)이라 하며 성장이 완료될 때까지 지속적으로 연골세포 증식과 연골내 골화가 진행된다.
이러한 골 발생과정에서 골과 연골을 생성할 수 있는 전구세포는 분화가 완료된 골세포 혹은 연골세포의 중간 단계에 위치하는 세포이다. 이 세포의 장점은 분화 방향 조절의 한계가 있는 줄기세포와 달리 연골과 골 양방향으로 분화 할 수 있는 분화 방향이 정해져 있으며, 분화 완료된 세포에 비해 증식능력이 높아서 대량배양이 가능하다. 또한, 골과 연골 생성과 관련된 성장인자와 사인토카인 및 다양한 단백질들을 분비하여 그 활성물질을 활용한 연구들이 진행되고 있지만 연구단계에 머물고 있다. 특히, 닭의 골·연골 전구세포 분비물에 대한 연구는 전무한 상태이다.
본 발명자들은 유추기 닭의 장골에서 골·연골전구세포를 대량 배양하여 확보한 세포배양액이 인간 줄기세포의 골 분화를 촉진할 수 있는 사실을 확인하고, 줄기세포의 조골세포로의 분화에 닭의 골·연골 전구세포의 배양 농축액을 사용할 수 있는지 예의 연구한 결과, 지방조직 유래 줄기세포의 골분화 유도 시 닭의 골·연골 전구세포의 배양 농축액을 혼합 처리함으로써 조골세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
더욱이 세계적으로 연간 25억 마리 이상 비인도적 방법으로 살처분 되는 폐기자원인 유추기 수컷 병아리의 생산적 활용에 대한 새로운 방법이 요구되고 있는 상황에서 유추기 닭의 세포를 이용하는 기술은 닭 활용측면의 새로운 방향을 제시할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 다분화능(multipotency)을 가지는 줄기세포의 골세포(osteocyte)로의 분화효율을 촉진시키거나 또는 줄기세포의 연골세포(chondrocyte)로의 분화를 유도하는 인자를 발굴하고자 예의 연구한 결과, 닭의 장골 유래의 골·연골전구세포 배양액이 종래부터 사용된 골세포유도제의 효과를 증진시켜 줄기세포의 골세포로의 분화효율이 현저하게 향상되고, 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 닭 골수 유래의 골연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물 및 상기 배양액을 처리하여 줄기세포의 골세포로의 분화효율 촉진 방법을 제공함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배양액을 처리하여 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공함을 다른 목적으로 하고, 상기 방법에 의해 유도된 연골세포를 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 닭은 유추기 닭일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 골분화유도제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 줄기세포의 골세포로의 분화를 촉진할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 중간엽줄기세포는 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포의 골세포로의 분화효율 촉진 방법으로서, 상기 방법은 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 닭은 유추기 닭일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 골분화유도제를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 중간엽줄기세포는 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법으로서, 상기 방법은 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 닭은 유추기 닭일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 중간엽줄기세포는 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계는 줄기세포를 상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액의 골 질환의 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화 유도된 줄기세포 또는 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화 유도된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화 유도된 연골세포의 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물은 유추기 닭 골수 유래 골연골전구세포 배양액을 이용하여 기존에 골세포 유도를 위하여 사용된 화학물질 기반의 분화유도제를 단독으로 처리하는 경우보다 더욱 효과적으로 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있는 장점이 있으며, 유추기 닭 골수 유래 골연골전구세포는 증식능력이 높아 대량배양이 가능하고, 연골세포로 분화를 유도하는 다양한 단백질을 왕성하게 분비하는 질 좋은 골연골전구세포로써, 상기 조성물은 2차골화중심이 생성되지 않은 유추기 닭 골수 유래 골연골전구세포의 배양액을 이용하여, 저비용 고효율의 연골세포 분화 유도제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 골연골전구세포의 획득을 위하여 살처분되는 유추기 병아리를 이용하므로 경제적이고, 이를 통해 폐기자원으로 여겨지는 수평아리 활용의 새로운 장을 제시할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 농축액, 분말, 젤 등 다양한 제형으로 구현이 가능하고, 그 제형에 다라 다양한 처치방법을 구현할 수 있으며, 지방조직 유래 줄기세포뿐만 아니라 골수, 치주, 제대혈 등 다양한 성체 조직 유래 줄기세포에도 공통적으로 활용 가능할 것으로 기대된다.
이에 본 발명은 골다공증, 골결손질환, 파제트병, 대퇴골두무혈성 괴사증, 및 골관절염 등의 새로운 뼈의생성 또는 재생이 필요한 골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 뼈 건강을 위한 건강기능식품으로 활용될 수 있으며, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상 등의 새로운 연골의 생성 또는 재생이 필요한 연골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 관절 건강을 위한 건강기능식품으로도 활용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액 제조과정의 개략도를 나타낸 도면이다.
도 2a는 4일령 병아리의 장골을 염색하여 그 상태를 확인한 도면이다.
도 2b는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포의 형태를 확인한 도면이다.
도 2c는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포에서 골 및 연골 전구세포 관련 유전자 발현을 확인한 도면이다.
도 2d는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포에서 골 및 연골 전구세포 관련 단백질 발현을 확인한 도면이다.
도 2e는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포의 다분화능을 검증하여 상기 세포가 골·연골 전구세포임을 확인한 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 촬영한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 세포의 단백질 발현을 분석하여 상기 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인한 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 세포의 다분화능을 검증하여 상기 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인한 도면이다.
도 4는 줄기세포 배양배지, 골세포 유도 분화배지, 닭 세포 배양농축액 혼합 골세포 유도 분화배지, 또는 닭 세포 배양농축액 혼합 줄기세포 배양배지에서 14일 또는 21일 동안 배양한 중간엽줄기세포의 골 분화 정도를 확인한 도면이다.
도 5는 줄기세포 배양배지, 골세포 유도 분화배지, 또는 닭 세포 배양농축액 혼합 골세포 유도 분화배지에서 배양한 중간엽줄기세포의 골 분화 정도를 확인한 도면이다.
도 6a는 줄기세포 배양배지, 골세포 유도 분화배지, 또는 닭 세포 배양농축액 혼합 골세포 유도 분화배지에서 배양한 중간엽줄기세포의 골 분화 정도를 정량적으로 비교 확인한 도면이다.
도 6b는 줄기세포 배양배지, 골세포 유도 분화배지, 또는 닭 세포 배양농축액 혼합 골세포 유도 분화배지에서 배양한 중간엽줄기세포의 Runx2 유전자의 발현량을 확인한 도면이다.
도 7a는 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액의 처리에 따라 인간 지방조직 유래 줄기세포가 연골세포로 분화됨을 확인한 도면이다.
도 7b는 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액을 연골 분화 유도제로 이용할 수 있음을 확인한 도면이다.
도 8은 연골분화 유무를 확인할 수 있는 단백질 Sox9, Collagen type Ⅰ(Col I), Collagen type Ⅱ(ColⅡ)를 염색하여 나타낸 것이다.
본 발명자들은 다분화능(multipotency)를 가지는 줄기세포를 골세포(osteocyte)로의 분화효율을 촉진시키거나 또는 줄기세포의 연골세포(chondrocyte)로의 분화를 유도하는 인자를 발굴하고자 예의 연구한 결과, 닭의 장골 유래의 골·연골전구세포 배양액이 종래부터 사용된 골세포유도제의 효과를 증진시켜 줄기세포의 골세포로의 분화효율 및 분화속도가 현저하게 향상되고, 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은, 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 골세포로의 분화 촉진 또는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물 및 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 골·연골전구세포 배양액은 농축된 것일 수 있으며, 상기 배양액이 농축된 "배양농축액"은 진공여과장치를 이용하여 골·연골전구세포를 배양한 배양액에서 세포 및 세포찌꺼기를 여과하고, 상기 여과된 배양액을 필터를 이용하여 2 내지 1000배, 바람직하게는 50 내지 150배 농축하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 "골연골전구세포 (Osteochondroprogenitor Cell)"란 골 및 연골로 분화능이 있으나, 그 운명이 아직 결정되지 않은 세포로서, 중간엽줄기세포와 골세포로 분화하는 골 전구세포(Osteoprogenitor Cells)의 사이 단계, 또는 연골세포로 분화하는 연골 전구세포(Chondroprogenitor Cells)의 사이 단계의 세포이고, 골수뿐만 아니라 골조직 내에도 존재한다.
본 발명에서 "줄기세포(stem cell)"란 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 골세포로 분화될 수 있는 중간엽줄기세포 일 수 있다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있다. 줄기세포는 전분화능(pluripotency)또는 다분화능 (multipotency)을 가지고 있다.
본 발명에서 “중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)”는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포라면 제한되지 아니하며, 일반적으로 중배엽 줄기세포는 방추형(Spindle shape)의 형태학적 특성과 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도를 통하여 식별된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 부화 후 4일 이내의 병아리의 대퇴부뼈 및 종아리뼈에서 세포를 회수하여(실시예 1-1 참조), 광학현미경으로 관찰한 결과 상기 회수된 세포는 입방형태(small and cuboidal shape)의 형태학적 특성을 갖으며(실시예 1-3 참조), 나아가 상기 회수된 세포의 분화능을 분석한 결과 상기 회수된 세포가 골세포 및 연골세포로는 분화하지만 지방세포로는 분화되지 않음을 근거로 상기 회수된 세포가 골연골전구세포임을 확인할 수 있었다(실시예 1-4 참조).
따라서, 본 발명의 일 측면에 따르면 상기 골연골전구세포는 닭 골수 유래 골연골전구세포이며, 보다 바람직하게는 4일령 병아리의 장골(대퇴부뼈 및 종아리뼈)의 매트릭스로부터 획득된 골연골전구세포이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인간 지방조직에서 단세포 중간엽줄기세포를 분리하여 세포 표현형을 분석하여 CD105(+), CD73(+) CD31(-), CD45(-), HLA-DR(-), CD166(+), CD34(-), CD90(+)의 발현을 확인하고, 골세포, 연골세포, 및 지방세포로의 다분화능을 검증함으로써 상기 분리된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인하였다(실시예 2 참조).
따라서, 본 발명의 다른 측면에 따르면 닭 골수 유래의 골연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 이용하여 연골세포로의 분화가 유도되는 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있으며, 상기 중간엽줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 상기 중간엽줄기세포가 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 모두 이용될 수 있다. 상기 중간엽줄기세포는 공지의 공급원, 예를 들어, 지방, 골수, 조직, 배아, 혈액, 골수 치주, 제대혈 등으로부터 얻을 수 있는 다양한 성체 조직 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.
이에 본 발명자들은 닭의 골연골전구세포를 배양하여 상기 세포의 무혈청 배양액을 제조하고 상기 배양액을 농축하여(실시예 1-5 및 1-6 참조), 상기 배양농축액이 중간엽줄기세포의 골세포로의 분화효율을 촉진하는 효과가 있음을 실험을 통해 확인하였다(실시예 3-2 및 3-3 참조).
이에 본 발명은 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 줄기세포에 처리함으로써 줄기세포의 골세포로의 분화효율 및/또는 분화속도를 촉진하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 줄기세포에 처리함으로써 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공한다. 본 발명의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도는 생체 내 또는 생체 외에서 이루어 질 수 있다. 상기 배양액 또는 배양농축액을 줄기세포의 처리하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 즉 일정 시간 동안 상기 배양액 또는 배양농축액을 줄기세포에 접촉시켜 줄기세포가 연골세포로 분화 유도될 수 있기만 하면 된다.
본 발명의 일 구현예로서 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도가 생체 외에서 이루어지는 경우, 줄기세포를 닭 골수 유래 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 포함하는 배양배지에서 배양함으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양농축액은 줄기세포의 골세포로의 분화를 촉발시키지는 못하지만, 기존의 골분화유도제와 혼합하여 사용하는 경우 그 효율을 증진시킬 수 있으며, 골 손상 질환의 치료제로 골분화유도제의 단독 사용보다 상기 배양농축액을 혼합하여 적용함으로써 더 효과적으로 골 손상 질환의 치료가 가능함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 골분화유도제와 혼합하여 골의 재생 또는 형성이 필요한 질환에 치료에 적용할 수 있다.
또한, 본 발명의 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 연골의 재생 또는 형성이 필요한 질환에 치료에 적용할 수 있다.
이에 본 발명은 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 골분화유도제를 더 포함할 수 있으며, 상기 골분화유도제는 줄기세포의 골세포로의 분화를 촉발(trigger)시키는 공지의 물질일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 골분화유도제로써 10-8 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2-phosphate, 및 10 mM β-Glycerophosphate을 줄기세포 배양배지(10% 우태아혈청 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지)에 첨가하였다(High abundance of CD271(+) multipotential stromal cells (MSCs) in intramedullary cavities of long bones. Cox G et al, Bone, 2012).
또한, 본 발명은 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 연골손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 농축액, 분말, 젤 등 다양한 제형으로 구현이 가능하며, 그 제형에 따라 다양한 처치방법을 구현할 수 있다.
또한, 본 발명은 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액, 및 골분화유도제를 유효성분으로 포함한 줄기세포의 골세포로의 분화 촉진용 조성물 및 골 생성 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "배양액"이란 분리된 줄기세포의 시험관 내에서 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 액체 배지에 줄기세포를 일정기간 배양한 후 세포를 제거하고 남은 용액을 의미하며, 배양기간동안 세포로부터 분비된 성장 인자 및 사이토카인 등의 단백질 및 세포 배양시 소모되고 남은 영양성분 등도 모두 포함한다. 상기 배지는 성 체줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함하며, 배지 및 배양 조건은 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 줄기세포 배양배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량 원소 성분을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cellculture minimum medium; CCMM)일 수 있으며, 그 비제한적인 예로서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(αMinimal essential Medium), GMEM(Glasgows Minimal essential Medium) 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제 및/또는 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 인간혈청알부민(human serum albumin) 등의 혈청 첨가물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 10% 우태아혈청 및 1% 항제제가 포함된 DMEM 배지를 줄기세포 배양배지로 하였다.
또한, 본 발명에서 "배양농축액"이란 상기 배양액을 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 원심분리 등)에 의해 수거하여 농축함으로써 획득되는 것을 의미한다. 농축한 배양액은 냉동보관할 수 있고, 필요에 따라 해동시켜 원하는 농도로 희석하여 사용할 수 있으며, 이를 건조한 건조분말을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골연골전구세포 배양농축액은 골연골전구세포를 배양한 배양액을 진공여과장치를 이용하여 세포 및 세포찌꺼기를 여과하고, 상기 여과된 배양액을 필터를 이용하여 2 내지 1000배, 바람직하게는 50 내지 150배, 더욱 바람직하게는 100배 농축하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 농축액, 분말, 젤 등 다양한 제형으로 구현이 가능하며, 그 제형에 따라 다양한 처치방법을 구현할 수 있다.
본 발명에서 "골 손상 질환" 또는 "골 질환"은 그 치료에 있어서 골의 재생 또는 형성이 필요한 질환을 의미하고, 비제한적인 예로서 골다공증(osteoporosis), 불유합(non-union) 골절, 골괴사증(osteonecrosis), 골연화증(osteomalacia), 골결손질환, 파제트병, 대퇴골두무혈성 괴사증(avascular necrosis of the femoral head), 및 골관절염 등이 있다. 대퇴골두무혈성 괴사증은 외상, 음주, 스테로이드제 복용 등의 원인으로 고관절을 이루는 대퇴골 골두에 혈액 공급이 중단되어 뼈가 파괴되는 난치성 골질환이고, 골다공증은 골소공증 또는 골 조송증이라고도 하며 정상인에 비해 골량이 현저히 감소된 상태로 골의 구성성분의 양적 감소를 주 병변으로 하는 대사성 골 질환을 의미한다.
본 발명에서 "연골 손상 질환" 또는 "연골 질환"은 그 치료에 있어서 연골의 재생 또는 형성이 필요한 질환을 의미하고, 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환으로써, "연골 결손 질환"을 포함하는 의미로 이해될 수 있다. 비제한적인 예로서 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상 등이 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 골 손상 또는 골 자체 관련 질환, 및 연골 손상 또는 연골 자체 관련 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또한, 본 발명은 골연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 골손상 관련 질환 또는 연골손상 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 골 손상 또는 골 자체 관련 질환은 바람직하게는 골다공증, 골결손질환, 파제트병, 대퇴골두무혈성 괴사증, 및 골관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있고, 상기 연골손상 또는 연골 자체 관련 질환은 바람직하게는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체"는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 구체적으로 골 질환 또는 연골질환 치료가 필요한 반려견, 경주마, 인간 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 닭 골수 유래의 골연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 배양액 또는 배양농축액의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 상기 배양액 또는 배양농축액의 골손상 또는 골 자체 관련 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여방법에 특별히 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 닭 골수 유래의 골연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액 이외에 공지된 골분화유도제 또는 연골분화유도제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
본 발명의 닭 골수 유래의 골연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 골 관련 질환 또는 연골 관련 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 닭 골수 유래의 골연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 닭 골수 유래의 골연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 골 또는 연골의 재생 또는 형성이 필요한 골 관련 질환 또는 연골 관련 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 g을 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제, 예컨대 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예에는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예컨대, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 골수 내 골·연골 전구세포 분리·배양 및 상기 세포의 배양농축액 제조
1-1. 유추기 닭의 장골 내 초자연골과 골수에서 골과 연골로 분화할 수 있는 전구 세포 회수
부화 후 4일 이내의 병아리의 양쪽 다리에서 대퇴부뼈(femur)와 종아리뼈(tibia) 부분을 회수하여 2회 세정하였다. 뼈에 부착된 근육과 힘줄을 깨끗하게 제거한 후 다시 2회 세정하였다. 모든 세정과정은 1% 항생제와 항균제가 포함된 인산완충액(phosphate-buffered saline, PBS)을 사용하였다. 이후 수술용 가위를 이용하여 뼈 양쪽의 경화된 부분을 제거하고 18 게이지(gauge, G) 주사바늘로 구멍을 내고, 1% 항생제와 2% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 PBS를 18G 주사바늘을 부착한 3㎖ 의료용 주사기에 담아 뼈 끝의 구멍에 밀어 넣어 뼈 내의 매트릭스를 회수하고, 양쪽 방향으로 3회 반복 실시하였다. 대퇴부뼈는 18G 바늘을 사용하였고 종아리뼈는 20G 바늘을 사용하여 회수하였다. 1마리 당 총 4개의 뼈에서 회수한 매트릭스를 14㎖ round bottom 튜브에 모으고 회수할 때 사용한 주사기로 10회 통과시켜 조직을 균질화(homogenization) 하였다. 50㎖ conical tube에 100㎛ pore mesh를 걸치고 균질화된 매트릭스를 걸러 회수 당시 유입된 뼛조각이나 살점을 걸러내었다. PBS를 튜브에 채우고 원심분리기를 이용하여 320G에서 4분 동안 원심분리하여 튜브 하단부에 침전된 세포 덩어리인 세포 펠렛(pellet)을 획득하였다. 이어서, 상층액을 제거하고 기본 배지 (F12/DMEM) 5㎖을 넣어 상기 세포 펠렛을 풀어 단세포화 하였다.
1-2. 닭의 골·연골 전구세포의 배양
상기 실시예 1-1에서 회수한 세포를 배양용기 1 ㎠ 면적당 3×106 세포의 밀도로 3.151 g/L 의 D-glucose, 365 ㎎/L(2.5mM)의 L-glutamine, 55 ㎎/L(0.5mM)의 sodium pyruvate, 10% FBS, 1% 항생-항균제가 보충된 F12/DMEM 배지에 넣어 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 계대배양은 세포의 컨플루언시(confluency)가 약 80~90% 되었을 때 배양액을 제거하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 0.25% Trypsin-EDTA를 2분 처치 후 세포부유액을 회수하여 320G에서 4분 동안 원심분리 한 다음, 세포수 측정과 세포 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다.
1-3. 닭의 골·연골 전구세포의 특성분석
유추기 닭 장골 내부의 형태학적 상태를 분석하기 위하여 헤마토실린-에오신 염색법(hematoxylin-eosin staining)으로 조직학적 염색을 실시하였다. 4일령 병아리의 장골을 4% 파라포름알데하이드 고정액에 담가 24시간 동안 상온에서 고정하였다. 고정한 조직을 수세 후 디칼시피케이션 과정과 투명화 및 탈수화 과정을 거친 후 파라핀에 포매 하였다. 6㎛의 두께로 조직절편을 제작 한 후 60℃ 가열블락(Heating block)에 45분간 놓아 두어 탈파라핀화 하였다. Xylene 5분씩 3회, 100% Ethanol 5분씩 3회, 95% Ethanol 2분씩 2회, 70% Ethanol 2분씩 2회, 증류수로 2분씩 2회 과정을 순차적으로 시행하였다. 수화(hydration) 과정을 마친 조직절편을 1% 헤마톡실린용액 30초, 증류수 세척, 0.25% 염화수소 1초, 증류수 세척, 리튬카보네이트 발색을 순차적으로 진행하여 핵을 염색하였다. 에오신을 2초간 처리하여 세포질을 염색한 뒤 탈수화 및 투명화 후 봉입(mounting) 하여 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 4일령 병아리의 장골은 총 면적의 60% 이상이 다양한 상태(stage)의 연골세포로 채워져 있으며, 골말단(epiphysis)은 아직 2차 골화중심이 생성되지 않은 초자연골 상태로 유지하고 있음을 확인하였다.
이어서, 상기 실시예 1-1 및 1-2를 통해 회수하여 배양된 세포의 형태를 광학현미경으로 촬영하여 확인하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 닭의 골·연골 전구세포는, 일반적으로 중간엽줄기세포가 방추형인 것과 달리, 입방형태(small and cuboidal shape)를 가짐을 확인할 수 있었다.
이어서, 상기 실시예 1-1에서 회수한 세포를 상기 실시예 1-2의 방법으로 5차 계대배양한 후 골과 연골 전구세포 관련 전사인자인 Sox9 , Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ, Runx2 유전자 발현량과 Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ, 단백질 발현량 분석을 실시하였다.
구체적으로, 상기 유전자 발현량 분석을 위하여 RNA는 트리졸 시약(Trizol reagent)을 이용하여 페놀-클로로폼 추출(phenol-chloroform extraction) 방법으로 추출하고, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Sox9 , Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ, Runx2, 및 항존유전자인 β-actin 유전자를 대조유전자로 하여 각 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었고, 상기 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 분석한 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
유전자 서열번호 프라이머 염기서열
β-actin 1 5'-ATGAAGCCCAGAGCAAAAGA -3'
2 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA -3'
Sox9 3 5'-GCTTTCTCGCATGAATCTCC -3'
4 5'-TTGGGGAAGGTGTTCTCTTG -3'
Collagen typeⅠ 5 5'-CAAACCAGGCGAAAGGGGTC -3'
6 5'-AATGGACCACGGCTTCCAA -3'
Collagen typeⅡ 7 5'-AAGATGTTGTAGGACCCCGA -3'
8 5'-CATCTGCGCCGCAAAGTTTC -3'
Runx2 9 5'-CAGACCAGCAGCACTCCATA -3'
10 5'-TTGGGCAAGTTTGGGTTTAG -3'
또한, 상기 단백질 발현량을 분석하기 위하여 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드로 10분간 고정한 후, PBS로 3회 세정하고, 1% BSA와 10% goat serum 용액으로 블로킹(blocking)을 하였다. 각 단백질에 대한 1차 항체를 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, PBS로 2회 세정하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체 (Santa Cruz Biotechnology사 제조)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 2회 세정 후 Dapi (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole) 를 1분간 처리하여 핵을 염색하였다. 마운팅 용액으로 마운팅 후 형광현미경을 사용하여 발현 여부를 분석하여 그 결과를 도 2d에 나타내었다.
그 결과, 도 2c 및 도2d에 나타난 바와 같이. 배양된 세포에서 골·연골 전구세포, 골 전구세포, 또는 연골 전구세포의 특징적인 유전자들이 발현되었으며, 특이 단백질인 Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ이 발현됨을 확인할 수 있었다.
1-4. 닭의 골·연골 전구세포의 분화능 검증
상기 실시예 1-1 및 1-2를 통해 회수하여 배양된 세포가 다분화능을 가진 골·연골전구세포인지 여부를 분석하기 위하여 골세포, 지방세포, 연골세포로 각기 분화 유도를 수행하였다.
골세포로의 분화는 10-7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2- phosphate, 10 mM β-glycerophosphate, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Alizarin Red S (ARS, Sigma제조) 염색을 수행하여 골세포로의 분화여부를 분석하였다.
지방세포로의 분화는 10-6 M dexamethasone, 0.5 mM IBMX (3-siobutyl1-methylxanthine), 0.1 mM indomethacin, 10 μg/㎖ bovine insulin (PH 2.5), 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Oil Red O (ORO, Sigma 제조) 염색을 수행하여 지방세포로의 분화여부를 분석하였다.
연골세포로의 분화는 10 ng/㎖ TGF-β1, 10-7 M dexamethasone, 1% ITS, 1.25 ㎎/㎖ BSA, 5 ㎎/㎖ linoleicacid, 50 ㎎/㎖ ascorbicacid-2-phosphate, 40 μg/㎖ L-proline, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 DMEM/F12 배양액을 3일에 한번씩 교환하여 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Alcian blue 염색을 수행하여 연골세포로의 분화여부를 분석하였다.
그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-1의 방법으로 회수된 닭의 세포는 골세포와 연골세포로 분화되었지만 지방세포로는 분화되지 않음을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 상기 실시예 1-1의 방법으로 회수된 닭의 세포가 골과 연골로 분화할 수 있는 능력을 지닌 골·연골전구세포임을 의미한다.
1-5. 닭의 골·연골 전구세포의 무혈청 배양액 제조
상기 실시예 1-1의 방법으로 회수된 닭의 세포를 1-2의 방법으로 5차 계대배양한 세포의 컨플루언시(confluency)가 약 90~100% 되었을 때 배양액을 제거하고 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 3.151 g/L 의 D-glucose, 657 ㎎/L(4.5mM)의 L-glutamine, 110㎎/L(1mM) 의 sodium pyruvate, 1% 항생-항균제가 보충된 무혈청 F12/DMEM 배지를 넣은 후 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 3일간 배양하여 골·연골 전구세포의 무혈청 배양액을 제조하였다.
1-6. 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액 제조
닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액 제조를 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-5에서 제조한 배양액을 회수하여 일회용 진공여과장치 (0.45㎛ pore size, Corning 제조)에 넣어 여과하여 잔존하는 세포와 세포찌꺼기(debris)를 제거하였다. 상기 여과된 배양액을 ultra-centrifugal filter (3Kda cut off, Amicon사) 를 이용하여 100배 농축하였다. 상기 농축한 배양액의 단백질 농도는 2 ~ 3 ㎎/㎖ 이고, 상기 배양농축액을 500㎍의 용량으로 분주하여 -20℃에 보관하였다. 이하 실시예에서는 상기 배양농축액을 4℃ 냉장고에서 천천히 녹여 사용하였다.
실시예 2. 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포 획득 및 그 특성분석
2-1. 지방조직에서 단세포 중간엽줄기세포 분리 및 배양
채취된 내장지방 조직 (장막 지방조직, omental adipose tissue)을 1% 항생제-항균제가 담긴 차가운 PBS에 3회 세척하였다. 상기 세척 된 조직에 붙어 있는 혈관, 응고된 혈액, 및 결합조직을 포셉과 수술가위로 제거하고 다시 2회 세척하였다. 상기 조직을 100㎖ 유리병에 담아 수술가위를 이용하여 5 mm2 이하로 잘게 자른 후. 0.1% collagenase type I (sigma-aldrich제조)이 첨가된 DMEM 배지를 조직 볼륨의 2배 되도록 첨가하여 37℃ 항온기에서 효소반응이 충분히 일어날 수 있도록 30분간 천천히 교반하였다. 상기 효소반응 후 배지를 걷어 튜브에 모아 얼음 안에 보관하고 새로운 효소 배지를 넣어 상기 과정을 1회 반복하였다. 1, 2차에 회수한 배지를 합하여 100㎛ pore mesh에 거른 후 320G에서 4분간 원심분리 하였다. 순수지방층을 제거하고 단핵구층을 회수하여 2회 세척 후 적혈구 제거를 위하여 적혈구용혈용액(Gibco BRL 제조)에 담가 상온에서 10분간 반응시켰다. 다시 2회 세척 후 세포수와 세포생존율을 측정하고 ㎠ 면적당 1×105 세포의 밀도로 5 ng/㎖ human recombinant basic fibroblast growth factor (hrbFGF, Gibco BRL 제조), 10% FBS, 1% 항생제가 보충된 F12/DMEM 배지에 분주하여, 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 분주 후 3일마다 배지를 교환해주었으며, 컨플루언시가 80~90% 되었을 때 계대배양을 실시하였다. 5 계대배양 후 세포의 형태를 촬영하고 특성을 분석 후, 시험에 사용하였다. 도 3a는 5 계대배양 후 세포를 촬영하여 그 형태를 확인한 것이다.
2-2. 세포 표현형 분석
상기 실시예 2-1에서 분리·배양한 중간엽줄기세포의 특성을 검증하기 위하여 중간엽줄기세포의 마커인 CD105, CD73, CD31, CD45, HLA-DR, CD166, CD34, CD90 발현 여부를 FACS caliber (B&D Bioscience 제조, CellQuest™ Pro)를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, CD31(혈관내피세포), CD34(조혈모세포), CD45(혈구세포), MHC class II(백혈구항원 클래스II) 항원은 음성, CD105, CD73, CD166, CD90 항원은 양성으로 분석되었으며, 분리된 세포가 중간엽줄기세포의 마커를 모두 발현함을 확인하였다.
2-3. 다분화능 분석
상기 실시예 2-1에서 분리·배양한 중간엽줄기세포의 다분화능 여부를 분석하기 위하여 골세포, 지방세포, 연골세포로 각기 분화 유도를 수행하였다.
골세포로의 분화는 10-7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2- phosphate, 10 mM β-glycerophosphate, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Alizarin Red S (ARS, Sigma제조) 염색을 수행하여 골세포로의 분화여부를 분석하였다.
지방세포로의 분화는 10-6 M dexamethasone, 0.5 mM IBMX (3-siobutyl1-methylxanthine), 0.1 mM indomethacin, 10 μg/㎖ bovine insulin (PH 2.5), 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Oil Red O (ORO, Sigma 제조) 염색을 수행하여 지방세포로의 분화여부를 분석하였다.
연골세포로의 분화는 10 ng/㎖ TGF-β1, 10-7 M dexamethasone, 1% ITS, 1.25 ㎎/㎖ BSA, 5 μg/㎖ linoleicacid, 50 μg/㎖ ascorbicacid-2-phosphate, 40 μg/㎖ L-proline, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 DMEM/F12 배양액을 3일에 한번씩 교환하여 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Alcian blue 염색을 수행하여 연골세포로의 분화여부를 분석하였다.
그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2-1에서 분리·배양한 중간엽줄기세포가 골세포, 지방세포, 연골세포로 분화할 수 있는 다분화능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포 골분화 촉진 시험
상기 실시예 2 에서 획득한 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 대상으로 실시예 1에서 제조한 배양농축액을 200㎍/㎖ 농도로 골세포 유도 분화배지에 첨가하여 골세포 분화 촉진여부를 시험하였다. 구체적으로, 구체적으로 줄기세포 배양배지는 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하였고, 골세포 유도 분화배지는 10-7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2-phosphate, 10 mM β-Glycerophosphate, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다.
3-1. 골세포로의 분화 유도
상기 실시예 2 에서 획득한 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포는 5 계대배양시 2×105개의 세포를 6-well culture plate (SPL 제조)에 seeding 한 후 컨플루언시가 90% 정도 되었을 때 골세포 분화를 유도하였다. 골세포 분화는 하기와 같이 4가지 배지에서 각각 14일 또는 21일간 배양하여 수행하였으며, 배지는 3일에 한번씩 교환하였다. 1) 분화유도제가 포함되지 않은 10% FBS와 1% 항생제가 보충된 DMEM 배지 (줄기세포 배양배지, 대조군) 2) 골세포 유도 분화배지(골분화유도제 단독 처리군) 3) 상기 실시예 1-6에서 제조한 닭 세포 배양농축액을 200㎍/㎖ 첨가한 골세포 유도 분화배지(골분화유도제 및 세포배양농축액 혼합 처리군) 4) 상기 닭 세포 배양농축액 200㎍/㎖ 단독처리한 배지(세포배양농축액 단독 처리군).
3-2. Alizarin Red S 염색을 통한 골세포로의 분화 효율 확인
상기 실시예 3-1의 방법으로 시간별 골세포로 분화 유도 후 Alizarin Red S (ARS, Sigma제조) 염색을 수행하였다. ARS는 금속이온과 결합하는 성질이 있기 때문에 세포에서 분비된 칼슘 침전(Calcium Precipitation, Mineralization)을 염색하여 골세포 분화 여부를 판정할 수 있다. 분화 완료 시점의 세포시료에 4% PFA(paraformaldehyde)를 처리하여 상온에서 1시간 동안 세포를 고정하였다. 상기 고정된 세포를 D.W로 2회 세척하고 1% ARS 염색용액을 상온에서 15분간 처리하였다. 이 때 ARS 용액은 PH 4.5의 D.W에 1% 농도의 ARS을 희석하여 마그네틱 바를 이용하여 18시간 동안 교반하고 필터링하여 사용하였다. 염색이 완료된 세포를 D.W로 5회 세척한 후 광학현미경상에서 ARS 염색여부를 확인하고 촬영하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 골분화유도제 단독 처리군에 비하여 골분화유도제와 세포 배양농축액혼합 처리군에서 14일만에 골세포로의 분화가 효과적으로 증가됨을 확인하였으며, 21일에는 골분화 효과가 극대화됨을 확인하였다. 반면 기본 배양배지로 배양한 대조군과 세포배양농축액 단독 처리군에서는 분화가 유도되지 않음을 확인하였다.
다음으로, 닭 세포 배양농축액이 골분화가 유도된 줄기세포의 골분화로의 분화효율 및 분화속도를 촉진시킴을 재확인하기 위하여 3명의 다른 사람의 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 대상으로 상기 실험과 동일한 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 3명의 다른 사람의 지방조직 유래 중간엽줄기세포에서도 공통적으로 골분화유도제에 상기 배양농축액을 처리한 경우 줄기세포의 골세포로의 분화를 촉진하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이어서, 상기 실험에 따라 염색된 ARS의 양을 정량하기 위하여, 용기에 남아 있는 잔여 물기를 제거한 후 10%의 CPC 완충액(cetrlpyridinium chloride buffer, sigma 제조)을 1㎖ 넣고 상온에서 30분간 노출시켜 ARS를 용출하였다. 용출한 ARS는 200㎕씩 96 well plate(SPL 제조)에 분주하여 microplate reader기(Molecular Device 제조)를 이용하여 550㎚ 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 닭 세포 배양농축액을 분화유도배지에 첨가할 경우 사람의 중간엽줄기세포의 골세포로의 분화를 정량적으로 유의하게 촉진한다는 결과를 도출할 수 있었다.
3-3. RUNX2 유전자 분석
상기 실시예 3-1에 대조군, 골분화유도제 단독 처리군, 및 골분화유도제와 배양농축액의 혼합 처리군의세포에서 Runx2 유전자의 발현 정도를 Real-time PCR을 이용하여 분석하였다. Runx2 유전자는 골 분화에서 가장 핵심 전사인자로 알려져있다. 구체적으로, RNA는 트리졸 시약(Trizol reagent)을 이용하여 페놀-클로로폼 추출(phenol-chloroform extraction) 방법으로 추출하고, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Runx2 및 대조유전자 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 Real-time PCR을 진행하였다. PCR에 이용한 프라이머의 정보는 하기 표 2에 나타내었다. PCR 산물을 아가로즈 겔에 전기영동 하여 상대적 유전자 발현량을 분석한 결과를 도 6b에 나타내었다.
유전자 서열번호 프라이머 염기서열
humanGAPDH 11 5’-gagtcaacggatttggtcgt -3’
12 5’-ttgattttggagggatctcg -3’
humanRUNX2 13 5’-gacagccccaacttcctgt -3’
14 5’-ccggagctcagcagaataat -3’
그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 골세포로 유도하지 않은 대조군 및 기존에 보편적으로 사용되는 골 분화유도제 단독 처리군에 비해 골분화유도제와 배양농축액의 혼합 처리군에서 Runx2 유전자의 발현이 유의적으로 증가됨을 확인할 수 있었다.
상기 결과에 따라, 닭의 골·연골전구세포 배양액 또는 이를 농축한 배양농축액은 인간의 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 골세포로의 분화를 촉진한다는 결과를 도출할 수 있었다. 이에 본 발명은 닭의 골·연골 전구세포 배양액을 활용한 줄기세포의 골세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공하며, 상기 조성물을 이용하여 골 생성을 촉진할 수 있으며, 이를 포함하는 골 질환 치료제 또는 보조제를 제공하게 되었다. 본 발명의 개시로 다양한 골 질환의 치료 접근에 있어 줄기세포를 이용한 세포 기반의 치료법의 적용 가능성이 높아짐을 기대할 수 있으며, 아울러 전세계적으로 이슈화되고 있는 폐기자원인 수평아리의 새로운 활용방안을 제시할 것으로 기대된다.
실시예 4. 사람 지방조직 유래 중간엽줄기세포 연골분화 유도 시험
상기 실시예 2 에서 확보한 사람 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 대상으로 실시예 1에서 제조된 배양배지 농축액을 100㎍/㎖ 농도로 줄기세포 배양배지(10% FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지)에 첨가하여 연골세포 분화 유도시험을 시행하였다. 양성대조군은 1X ITS, 1.25 ㎎/㎖ BSA, 5 μg/㎖ linoleic acid, 50 μg/㎖ ascorbic acid-2-phosphate, 10 ng/㎖ TGF-β1, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다.
4-1. 연골세포 분화 유도
상기 실시예 2에서 획득한 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 5 계대배양시 2~2.5×105개의 세포를 15㎖ 코니칼 튜브(SPL 제조)에 넣은 후 320G로 1분 동안 원심분리하여 침전시켜 펠렛을 만들었다. 연골세포 분화는 하기 3가지 배지에서 각각 상기 펠렛을 10일간 배양하여 수행하였으며, 배지는 3일에 한번씩 교환하였다. 연골세포로 분화되었는지 여부는 알시안 블루(alician blue) 염색법을 사용하였다.
1) 음성대조군: Non-induction 배양배지(줄기세포 배양배지) 2) 양성대조군: TGF-β1 기반 연골세포 유도 분화배지 3) 실험군: 상기 실시예 1-6에서 제조한 닭 세포 배양농축액을 100㎍/㎖ 단독 첨가한 연골세포 유도 분화배지.
4-2. Alician blue 염색법을 통한 연골세포 분화 여부 확인
Alician blue는 연골기질의 sulfated glycosaminoglycan, 또는 단백질에 cysteine이 4% 이상 함유된 경우에 푸른색으로 염색되어 연골세포로의 분화 여부를 판정할 수 있다. 상기 실시예 4-1의 방법으로 연골세포 분화 유도 10일 후에 펠렛을 회수하여 DPBS로 3회 세척 후, 4% PFA(paraformaldehyde)에 담가 상온에서 24시간 동안 고정하였다. 고정한 펠렛은 투명화와 탈수화를 거친 후, 파라핀에 포매하였다. 절편기를 이용하여 6㎛의 두께로 세포절편을 제작하여, 제작된 절편을 탈파라핀과 가수과정 후 alician blue 용액에 30분 동안 방치하여 염색하였다. 이때 alician blue 용액은 아세트산 용액에 1%의 농도의 alician blue 분말을 희석하고 1/10 N Hcl을 이용해 pH 2.5을 맞춘 것을 사용하였다. 이후 흐르는 물에 5분 정도 세척 후, 상기 펠렛 절편을 0.1% Nuclear Fast Red Solution 용액에 2분간 처리하였다. Nuclear Fast Red Solution 용액은 증류수에 0.1% Nuclear Fast Red Solution 분말과 5% aluminum sulfate 분말을 교반하여 만든 것을 사용하였다. 이후 흐르는 물에 5분 동안 세척하고 탈수화, 투명화 작업을 거쳐 마운팅하였다. 상기 염색된 세포 펠렛은 광학현미경상에서 alician blue 염색여부를 확인하고 촬영하고, 촬영한 세포 펠렛 사진을 Image J 프로그램을 사용하여 염색된 부분을 정량화 하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 100㎍/㎖ 배양농축액을 단독 처리하였을 때 Alician blue에 의해 염색된 연골기질의 sulfated glycosaminoglycan, 또는 4% 이상 cysteine을 함유한 단백질이 다량 관찰되었는바, 닭 세포 배양 농축액에 의해 줄기세포가 연골세포로 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7b에 나타난 바와 같이, 닭 세포 배양농축액은 인간 지방 유래 줄기세포를 연골로 분화시킬 수 있는 유도제임을 확인할 수 있었다. 상기 결과는, 닭 세포 배양농축액이 기존의 연골분화유도제를 대체하는 새로운 분화 유도용 물질로써 이용될 수 있음을 시사한다.
4-3. 연골관련 단백질인 Sox9, Aggrecan, 및 ColⅡ 발현 확인
Sox9, Aggrecan, 및 Collagen type Ⅱ(ColⅡ)는 줄기세포의 연골분화 유무를 확인할 수 있는 단백질로서, 본 발명의 닭 세포 배양농축액이 줄기세포의 연골분화를 유도함을 재확인하기 위하여, 상기 배양농축액을 처리한 줄기세포의 Sox9, Aggrecan, 및 ColⅡ발현을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4-1의 방법으로 연골세포 분화 유도 10일 후에 펠렛을 회수하여 DPBS로 3회 세척 후, 4% PFA(paraformaldehyde)에 담가 상온에서 24시간 동안 고정하였다. 고정한 펠렛은 투명화와 탈수화를 거친 후, 파라핀에 포매하였다. 절편기를 이용하여 6㎛의 두께로 세포절편을 제작하여, 제작된 세포절편을 60℃ 가열블락(Heating block)에 45분간 노출시켜 탈파라핀 과정을 수행하였다. 이어서 Xylene에 5분씩 3회, 100% Ethanol 5분씩 3회, 95% Ethanol 2분씩 2회, 70% Ethanol 2분씩 2회, 증류수 2분씩 2회 수세과정을 거치고, 수세과정이 끝난 세포절편을 항원 unmasking 용액 (Vector사 제조)에 처리한 후 100% 메탄올과 30% 과산화수소를 9:1 비율로 혼합하여 10분 동안 처리하였다. 이어서 상기 세포절편을 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA와 10% goat serum 이 첨가된 PBS로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)을 하였다. 각 단백질에 대한 1차 항체를 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하고 biotinylated anti-IgG를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 다시 PBS로 3회 세척 후, streptavidin-HRP를 45분 동안 상온에서 처리하였다. DAB(3,3-diaminobenzidine)을 1분 동안 반응시켜 발색하였다. 광학현미경을 통하여 발색여부를 확인하고 단백질 발현여부를 확인하여 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 음성대조군과 비교하여 양성대조군 만큼 닭 세포 배양농축액 단독 처리한 실험군에서 연골분화 관련 단백질인 Sox9, Aggrecan, 및 ColⅡ가 발현함을 확인하였다.
상기 결과에 따라, 닭 골·연골전구세포을 배양하여 얻은 세포배양농축액은 인간의 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 연골 분화를 유도한다는 결과를 도출할 수 있었다. 본 발명은 닭 골·연골세포배양액을 활용한 연골 질환 치료제 또는 보조제로의 개발 가능성이 있으며, 전세계적으로 이슈화되고 있는 폐기자원인 수평아리의 새로운 활용방안을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액은 골다공증, 골결손질환, 파제트병, 대퇴골두무혈성 괴사증, 및 골관절염 등의 새로운 뼈의생성 또는 재생이 필요한 골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 뼈 건강을 위한 건강기능식품으로 활용될 수 있으며, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상 등의 새로운 연골의 생성 또는 재생이 필요한 연골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 관절 건강을 위한 건강기능식품으로도 활용 가능할 것으로 기대된다.

Claims (23)

  1. 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 닭은 유추기 닭인 것을 특징으로 하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액인 것을 특징으로 하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 골분화유도제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 줄기세포의 골세포로의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 골 생성 촉진 또는 연골 생성 유도용 조성물.
  8. 줄기세포의 골세포로의 분화효율 촉진 방법으로서, 상기 방법은 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 닭은 유추기의 닭인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 골세포로의 분화효율 촉진 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 골세포로의 분화효율 촉진 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 방법은 골분화유도제를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 골세포로의 분화효율 촉진 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 골세포로의 분화효율 촉진 방법.
  13. 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법으로서, 상기 방법은 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 닭은 유추기의 닭인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계는 줄기세포를 상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  18. 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는, 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  20. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법으로 분화 유도된 줄기세포 또는 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  22. 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료 방법.
  23. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법으로 분화 유도된 줄기세포 또는 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 치료 방법.
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