WO2012133992A1 - 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법 - Google Patents

지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법 Download PDF

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WO2012133992A1
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stem cells
mesenchymal stem
chondrocytes
derived mesenchymal
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PCT/KR2011/005274
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임군일
김혜정
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동국대학교 산학협력단
한국보건산업진흥원
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    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method of introducing a transcription factor gene into adipose derived mesenchymal stem cells by electroporation to differentiate them into chondrocytes.
  • mesenchymal stem cells mesenchymal stem cells
  • Stem cells are a kind of blast cells that grow different cells or organs that make up the human body, also called hepatocytes.
  • Stem cells include adult stem cells, such as embryonic stem cells that can be made from human embryos, and bone marrow cells that constantly make blood cells.
  • Embryonic stem cells can differentiate into all the cells and tissues that make up the human body, but their use is limited for ethical reasons, while adult stem cells are derived from umbilical cord blood or bone marrow and blood of mature adults. It exists as a cell.
  • Adult stem cells are cells that have differentiation flexibility that can differentiate into specific tissues and organs after transplantation in vivo, and can metastasize to cells of other tissues different from the characteristics of the original cells. It is widely used in.
  • chondrocyte transplantation has a problem in that it is invasive and the amount of cells that can be obtained is limited because chondrocytes must be harvested from itself.
  • adipose derived mesenchymal stem cells among stem cells are expected to be useful in the method of cartilage regeneration through cell transplantation because a large amount of cells can be obtained.
  • the present invention is to provide a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into chondrocytes.
  • the present invention is a fat-derived mesenchymal stem comprising the step of introducing the SOX-5, SOX-6 and SOX-9 genes into electroporation to the adipose derived mesenchymal stem cells
  • the present invention provides a composition for treating cartilage damage disease containing chondrocytes differentiated through the above method.
  • the present invention provides a method for producing an artificial joint comprising culturing chondrocytes differentiated through the above method in a scaffold of any form.
  • the present invention also provides an artificial joint produced by the above method.
  • Adipose cells unlike the bone marrow, reduce the invasive factor to patients and are the areas where stem cells can be harvested, and there is a huge amount in the entire body of the patient. Therefore, the present invention regarding a method of differentiating stem cells collected from fat into chondrocytes can solve the problems caused by the method of differentiating stem cells collected from other sites into chondrocytes. In addition, the introduction of the gene by electroporation can significantly reduce immune rejection and mutagenesis at the time of transplantation compared to the method using a conventional viral vector.
  • Figure 1 is a photograph of the results of fluorescence intensity measurement on the degree of gene transfer.
  • Figure 3 is a photograph of Western blot results for the expression of cartilage differentiation-related proteins (type II collagen, type I collagen and type X collagen).
  • Figure 4 is a photograph of safranin-O staining after in vitro pellet culture.
  • 5 is a photograph of safranin-O staining results and alizarin red staining results after in vivo culture.
  • the present invention provides a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into chondrocytes comprising introducing SOX-5, SOX-6, and SOX-9 genes into electroporation into adipose derived mesenchymal stem cells and culturing them. Provide a method.
  • the adipose-derived mesenchymal stem cells are isolated from adipose tissue obtained by liposuction, fat cells, erythrocytes, cell debris and the like using a method such as washing, filtration, stem cells It can obtain by culturing in culture medium. Separation of the fat-derived mesenchymal stem cells 2 to 5 times, 2 to 4 times, or 2 to 3 times passaged is preferably used for bone formation in that it is possible to separate only differentiated stem cells.
  • the step of introducing the gene into the electroporation method using a recombinant plasmid vector into which the SOX-5, SOX-6 and SOX-9 genes are introduced, this is 1300 as a microporator (Invitrogen).
  • the desired gene may be introduced into the adipose derived mesenchymal stem cells by applying a voltage of 1,500 to 1,500 volts, or 1,350 to 1,430 volts, 1 to 3 times, 1 to 2 times, or 1 to 10 to 30 ms, or 15 to 25 ms.
  • the plasmid vector may be labeled with a fluorescent material so as to confirm whether the gene is introduced thereafter.
  • the SOX group refers to the transcription factor groups of the Sex-Determining Region Y type High-Mobility Group (HMG) box family, which are the major substrates of cartilage, type II, VII, VII I collagen and aggrecan. (aggrecan), which binds to the promoter region of cartilage derived retinoid active protein (CD RAP), promotes the synthesis of these proteins.
  • HMG High-Mobility Group
  • the inventors of the present invention while studying the effect of the genes of the SOX group on chondrocyte differentiation, it is confirmed in the following examples only when introducing the SOX-5, SOX-6 and SOX-9 of the SOX group to the stem cells at the same time As can be seen, the expression of major cartilage matrix was significantly increased.
  • the electroporation method is used as a gene introduction method, it was confirmed that genes can be introduced at a high introduction rate of 75% or more into fat-derived mesenchymal stem cells, which are generally difficult to introduce, thereby completing the present invention.
  • the transduced fat-derived mesenchymal stem cells are cultured.
  • a method for culturing the transgenic fat-derived mesenchymal stem cells in the present invention can be used a known three-dimensional culture method.
  • pellet culture, alginate beads, and alginate layer culture are mainly used as a three-dimensional culture method for differentiating mesenchymal stem cells into chondrocytes.
  • pellet culture is effective in maintaining the phenotype of chondrocytes, and can easily aggregate cells through centrifugation to induce a conjugation effect between cells, thereby providing an extracellular environment similar to the production of early cartilage tissue.
  • the culture medium may include any one or more substances selected from the group consisting of insulin, dexamethasone, ascorbate 2-phosphate, L-proline and sodium pyruvate, each amount of insulin 0.5 to 3 g / l, dexamethasone ( dexametasone) 10 -6 to 10 -8 M, ascorbate 2-phosphate 10-100 mM, L-proline 10-100 mM and sodium pyruvate 0.5-3 mM.
  • This medium can be replaced every 2 to 4 days, the temperature is 36 to 38 °C, it is preferable to culture in the presence of 5% carbon dioxide. Under these conditions, further culture may be performed by dispensing any type of scaffold or the like after 2 weeks of culture.
  • the present invention also differentiates the adipose derived mesenchymal stem cells into chondrocytes, comprising introducing the SOX-5, SOX-6 and SOX-9 genes into the adipose derived mesenchymal stem cells by electroporation and culturing them. It provides a composition for treating cartilage injury disease containing differentiated chondrocytes through the method.
  • Chondrocytes differentiated from adipose derived mesenchymal stem cells produced by the method according to the present invention can be used as an active ingredient of a cell composition for cell replacement therapy for treating cartilage damage and the like.
  • Cartilage damage diseases that can be treated using chondrocytes of the present invention include, but are not limited to, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, and joint damage due to trauma.
  • the therapeutic composition comprising chondrocytes produced according to the present invention as an active ingredient may be directly injected into the joints of a patient according to a known method, or may be transplanted together with a scaffold after three-dimensional culture.
  • the number of cells to be administered can be controlled by considering various factors such as severity, route of administration, weight, age and sex of the patient.
  • the present invention is to differentiate the adipose derived mesenchymal stem cells into chondrocytes, including the step of introducing the SOX-5, SOX-6 and SOX-9 genes into electroporation and culturing them into adipose derived mesenchymal stem cells It provides a method of producing artificial joints and artificial joints prepared by the above method comprising continuously culturing differentiated chondrocytes in a scaffold of any form through the method.
  • Artificial cartilage of a certain type can be obtained by using a conventional method of culturing chondrocytes differentiated by the production method according to the present invention in a scaffold of any form, and by using the artificial joint or ear or nose Artificial cartilage used for molding can be produced.
  • Adipose tissue was obtained from five patients aged 36 to 55 years (mean age: 41 years), washed with PBS buffer, treated with 1.5 mg / ml collagenase, and treated with a nylon mesh with a diameter of 100 ⁇ m. Filtered out. The filtered solution was removed using red blood cell hemolysis buffer.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • antibiotics 100 U / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin, 0.25 mg / ml amphotericin B; Gibco BRL, Green Island, NY.
  • F-12 medium Invitrogen / Gibco, Green Island, NY
  • the cells were then washed with PBS to remove nonadhesives.
  • the medium was changed twice a week, and when cells covered 80% of the bottom (80% confluence), the cells attached to the bottom were separated using 0.25% trypsin containing 1 mM EDTA and washed with PBS. After culturing again.
  • cryopreservation medium containing 90% FBS and 10% DMSO.
  • the cDNA clones (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) of the coding sites of human SOX-5, SOX-6 and SOX-9 of the NIH Mammalian Gene Collection (MGC) were respectively amplified by PCR.
  • the amplified fragment was cloned into pECFP (enhanced green fluorescent protein) -C1 vector (Clontech, Palo Alto, Calif., USA).
  • the 5 'end was made adhesive and the 3' was blunt.
  • inserts were isolated using Sma I and BglII (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Sma I in combination with T7 polymerase (Takara Bio Inc.) was used to cut the 3 'end, producing a blunt end. Bgl II is used to produce an adhesive 5 'end. Vectors and inserts were ligated using Ligation Mix (Takara Bio Inc.) and then validated plasmids prepared via DNA sequencing.
  • the resulting adipose-derived mesenchymal stem cells were recovered and washed with PBS.
  • the cells were dispensed at 3 * 10 5 cells / ml in redistribution buffer R (Invitrogen) and mixed with 0.5 ⁇ g of each plasmid. Thereafter, electroporation was performed using a microporator (Invitrogen) (1400 voltage, 20 ms). After electroporation, the cells were cultured in 12-well plates in the presence of 37 ° C., 5% carbon dioxide.
  • the six experimental groups are as follows.
  • Experimental group 5 EGFP-C1 transduced adipose-derived mesenchymal stem cells (Example) introduced with SOX-5, SOX-6 and SOX-9 genes (0.17 ⁇ g of each plasmid).
  • Transduction efficiency was measured 24 hours after transduction using a leica DMI 6000B microscope (Leica Microsystem, Wetzlar, Germany) and flow cytometry (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA), which measure the green fluorescence of EGFP-C1. It was.
  • HBSS Hank's Buffered Salt Solution
  • FBS Invitrogen / GIBCO
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells of each experimental group were 1% ITS (insulin 1g / l), 10 -7 M dexamethasone, 50 mM ascorbate 2-phosphate, 50 mM L-proline And incubated in DMEM / F-12 medium supplemented with 1 mM sodium pyruvate.
  • pellet culture 2.5 * 10 5 cells were dispensed in 500 ⁇ l culture medium, which was aliquoted into a 15 ml polypropylene centrifuge tube and centrifuged at 500 g for 10 minutes. The tubes were then placed in a 37 ° C. incubator under 95% air / 5% carbon dioxide atmosphere and medium changed every three days. Pellet cultures were performed for up to 3 weeks.
  • the pellets of each experimental group were treated with papain buffer solution at 60 ° C. overnight, and then the amount of DNA was measured using a Quant-iT TM dsDNA assay kit and a qubit fluorescence intensity measurement system (Invitrogen, Carlsbad, CA). It was.
  • the amount of GAG was measured using the Blyscan kit (Biocolor, Carrickfergus, United Kingdom).
  • the import efficiency was found to be excellent at 75% or more.
  • Table 3 shows the experimental results for SOX-5, SOX-6, or SOX-9 gene expression.
  • GAG gene expression amount is shown in Table 5. This was a 4.2-fold increase in the Example of the invention where all of the SOX-5, SOX-6 and SOX-9 genes were introduced, and a 3.8-fold increase in the positive control treated with TGF- ⁇ - 2 and BMP-7. In Comparative Examples 1 to 4, a significant increase in GAG gene expression could not be confirmed.
  • Table 6 shows the expression level of the COL2A1 (type 2 collagen) gene, which is a marker of cartilage differentiation.
  • the COL2A1 gene had a 9-fold increase in expression in the embodiment of the present invention in which all of SOX-5, SOX-6, and SOX-9 were introduced, and TGF- ⁇ - 2 and BMP-7 treated positive. 7-fold increase in control.
  • the comparative example in which each of the SOX-5, SOX-6 or SOX-9 genes was introduced, no effect of inducing differentiation into chondrocytes was observed.
  • the change in gene expression shows that only the introduction of SOX-5, SOX-6 and SOX-9 into adipose derived mesenchymal stem cells increases the expression of only the COL2A1 gene without altering the COL1A1 and COL10A1 expression levels.
  • SOX-5 SOX-6 and SOX-9 transcription and cartilage related gene expression at the protein level
  • SOX-5, SOX-6, SOX-9, type I collagen (COL1A1), type II collagen (COL2A1) SOX-9
  • type I collagen COL1A1
  • type II collagen COL2A1
  • western blot for type 10 collagen COL10A1.
  • the lysate was dissolved in ice and centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to precipitate the protein. Protein amounts were determined using conventional methods known to those skilled in the art using a Qubit fluoromoter (Invitrogen). Protein extract was subjected to 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) -polyacrylamide gel electrophoresis.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the isolated protein was electrophoresed on a Bio Trace TM NT nitrocellulose transfer membrane. After treatment with TBS-T (10 mM Tris; 150 mM NaCl, 0.05% tween-20) containing 3% nonfat dry milk (BioRad Laboratories, Inc, Gothenburg, Sweden), the primary antibody was added and incubated for 2 hours. . It was then washed and the secondary antibody was treated at room temperature for 1 hour and washed again. Protein bands were formed using SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce). After washing three times, it was visualized with enhanced chemiluminescence (ECL) western blot analysis reagent (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
  • TBS-T 10 mM Tris; 150 mM NaCl, 0.05% tween-20
  • 3% nonfat dry milk BioRad Laboratories, Inc, Gothenburg, Sweden
  • Primary antibodies were rabbit type I collagen (COL1A1) polyclonal antibodies (Millipore, Billerica, MA, USA) and rat type II collagen (COL2A1) diluted 1: 200 in TBS-T / 2.5% nonfat dry milk, respectively.
  • Monoclonal Antibody (Millipore), Murine Anti-Human Type 10 Collagen (COL10A1) Monoclonal Antibody (Sigma-Aldich, St. Louis, MO, USA) and Rabbit SOX-5, SOX-6 and SOX-9 Polyclones Raw antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) was used.
  • the secondary antibody was an antibody against goat rabbit or mouse IgG bound to horseradish peroxidase (HRP) diluted 1: 2000 in TBS-T / 2.5% nonfat dry milk.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the experiment was performed three times per mesenchymal stem cell collected from each patient.
  • Protein expression was found to increase more markedly in Comparative Examples 2-4 where each gene was introduced, and slightly weaker in the Examples of the present invention. However, it was found that gene expression and protein expression continued in all experimental groups 21 days after the introduction of the gene.
  • type II collagen increased sharply in the Examples of the present invention in which all of SOX-5, SOX-6 and SOX-9 were introduced, which was larger than the positive control.
  • Type I collagen was detected in all experimental groups, but expression was increased in Comparative Examples 2, 3 and 5.
  • Type VII collagen expression was reduced in the Example of the present invention in which all of SOX-5, SOX-6 and SOX-9 were introduced, whereas expression was markedly increased in Comparative Example 5, a positive control.
  • Experimental results on the protein expression suggests that the import of SOX-5, SOX-6 and SOX-9 genes have the effect of preventing the hypertrophy of adipose derived mesenchymal stem cells and differentiating them into chondrocytes.
  • Pellets of Experimental Groups 1 to 5 were in-vitro cultured for 7 days and then implanted into the dorsal subcutaneous tissue of anesthetized combined immunodeficiency (SCID) mice. Pellets were attached to non-absorbable surgical sutures fixed to fibrin glue to enable recovery of recovery time. Six subcutaneous sacs were formed on each male SCID mouse and the like. Samples were examined 3 weeks after transplantation and GAG, calcium content and histological analysis were performed.
  • SCID combined immunodeficiency
  • lysis buffer (RIPA; Thermo, Rockford, IL, USA) was added to the collected pellets and homogenized with liquid nitrogen. The lysate was left for 2 hours and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes. A Calcium Colorimetric Assay Kit (Biovision, Mountain View, CA, USA) was used to analyze the calcium content of the supernatant. The measured content was normalized to the DNA content of the pellets.
  • pellets of the experimental group incubated for 3 weeks in vitro or the pellets collected in the in vivo experiment were fixed in 4% paraformaldehyde solution for 3 hours, dehydrated with 100% ethanol, and then washed with xylene. It was. It was then fixed in paraffin. Sections cut to 4 ⁇ m thickness from paraffin blocks were covered with glass slides and safranin-O staining for proteoglycans and alizarin red staining for the degree of mineralization were performed.
  • safranin-O staining the samples were deparaffinized with xylene and ethanol. Aqueous safranin-O (0.1%) was added thereto for 30 minutes, and then washed with distilled water.
  • alizarin red staining the samples were stained with 2% alizarin red solution (Junsei Chemical, Tokyo, Japan) for 10 minutes and then washed with distilled water.
  • the present invention can introduce a gene by electroporation, it can significantly reduce immune rejection and mutagenesis at the time of transplantation compared to the method using a conventional viral vector.

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Abstract

본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지방유래 중간엽 줄기세포에 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법으로 분화된 연골세포를 함유하는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 연골세포로 전분화된 중간엽 줄기세포를 생체 내에 이식하면, 이식된 중간엽 줄기세포가 뼈 등의 다른 세포로 분화할 우려가 적어 보다 안전하게 치료에 이용할 수 있다.

Description

지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법
본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 전기천공법으로 전사인자 유전자를 도입하여 이를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
최근 조직공학과 재생의학의 발달에 의하여 손상된 조직과 장기를 치료할 수 있는 종래와는 다른 방법들이 개발되고 있는데, 그 중 제일 각광을 받고 있는 것은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 의한 세포치료이다.
줄기세포(Stem cell)는 인간의 몸을 구성하는 서로 다른 세포나 장기가 성장하는 일종의 모세포로, 간세포라 불리기도 한다. 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 성체 줄기세포(Adult stem cell)가 있다. 배아줄기세포는 인체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있지만 윤리적인 이유로 사용이 제한되어 있는 반면, 성체 줄기세포는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출한 것으로, 중간엽 줄기세포와 조혈 줄기세포로 존재한다.
성체 줄기세포는 생체 내 이식 후에 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있고, 본래 세포의 특성과는 다른 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 분화 유연성을 가지는 세포로서, 윤리적인 제한 없어 조직공학에 널리 사용되고 있다.
연골은 한번 손상되는 경우 원래의 조직으로 치유가 되지 않기 때문에, 어떠한 이유에서든지 한번 연골손상이 생기면 시간의 경과에 따라 골관절염으로 진행하게 된다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 연골 손상 부위에 성장인자의 투여 및 세포이식을 통하여 연골세포를 재생시키려는 시도가 많이 시도되고 있다.
그러나 연골세포의 이식에 의한 세포치료는 본인에게서 연골세포를 채취하여야 하므로 침습적이며 얻을 수 있는 세포의 양이 제한적이라는 문제점이 존재한다. 이에 반하여, 줄기세포 중 지방유래 중간엽 줄기세포는 많은 양의 세포를 얻을 수 있어 세포이식을 통한 연골재생방법에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 예상되고 있다.
따라서 본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법을 통해 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법을 통해 분화된 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 것을 포함하는 인공관절의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인공관절을 제공한다.
[유리한 효과]
지방세포는 골수와 달리 환자에게 침습적 요소를 줄이며 줄기세포의 채취가 가능한 부위이고, 환자의 신체 전 범위에 막대한 양이 존재한다. 따라서 지방에서 채취한 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 본 발명은 종래 다른 부위에서 채취한 줄기세포를 연골세포로 분화 시키는 방법에 따른 문제들을 해결할 수 있다. 또한 전기천공법으로 유전자를 도입하는 바, 종래의 바이러스 벡터를 사용하는 방법에 비해 이식시 면역 거부반응 및 돌연변이 유발을 현저히 감소시킬 수 있다.
도 1은 유전자 이입 정도에 관한 형광 강도 측정 결과 사진이다.
도 2는 SOX-5, SOX-6, 또는 SOX-9 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 3은 연골분화 관련 단백질(typeⅡ 콜라겐, typeⅠ 콜라겐 및 type Ⅹ 콜라겐) 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 4는 In vitro 펠렛 배양 후 사프라닌-O 염색 결과 사진이다.
도 5는 In vivo 배양 후 사프라닌-O 염색 결과 사진 및 알리자린 적색 염색 결과 사진이다.
본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포는 지방흡입술 등을 이용해 얻은 지방조직에서, 지방세포, 적혈구, 세포 파쇄물 등을 세척, 여과 등의 방법을 이용하여 분리한 후, 줄기세포 배양용 배지에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 상기 지방유래 중간엽 줄기세포를 분리한 후 2 내지 5 회, 2 내지 4회, 또는 2 내지 3회 계대배양한 것을 골형성에 사용하는 것이 분화 가능한 줄기세포만을 분리한다는 점에서 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 전기천공법으로 유전자를 도입하는 단계에서는, SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자가 도입된 재조합 플라스미드 벡터를 사용하여 이를 마이크로포레이터(Invitrogen)로 1300 내지 1500 볼트, 또는 1350 내지 1430 볼트의 전압을 10 내지 30ms, 또는 15 내지 25ms 로 1 내지 3번, 1 내지 2번 또는 1번 인가하여 지방유래 중간엽 줄기세포에 원하는 유전자를 도입할 수 있다.
상기 플라스미드 벡터는 형광물질로 표지 되어 이후 유전자 도입 여부를 확인할 수 있도록 하는 것이 좋다.
SOX 그룹은 성 결정 부위(Sex-Determining Region) Y 유형 HMG(High-Mobility Group) 박스 패밀리의 전사인자 그룹들을 지칭하며, 이 인자들은 연골의 주요기질인 type Ⅱ, Ⅸ, ⅩⅠ 콜라겐과 아그레칸(aggrecan), 연골 유래 레티노이드 활성 단백질(cartilage derived retinoid active protein, CD RAP)의 프로모터 부위에 결합하여, 이 단백질들의 합성을 촉진시키는 역할을 수행한다.
본 발명의 발명자들은 SOX 그룹의 유전자가 연골세포 분화에 미치는 영향에 대해 연구하던 중, SOX 그룹 중 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9을 동시에 줄기세포에 도입시키는 경우에만 이하 실시예에서 확인할 수 있듯이 연골 주요 기질의 발현이 유의적으로 증가한다는 점을 확인하였다. 또한 유전자 도입 방법으로 상기 전기천공법을 사용하는 경우 일반적으로 유전자 도입이 어려운 지방 유래 간엽줄기세포에 75% 이상의 높은 도입률로 유전자를 도입할 수 있다는 점을 확인하였고, 이에 본 발명을 완성하였다.
이후 형질 도입된 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양한다. 본 발명에서 상기 형질 도입된 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법으로는 공지의 3차원 배양방법을 이용할 수 있다. 현재까지 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 3차원 배양방법으로는 펠렛(pellet) 배양과 알지네이트 비드 및 알지네이트 층 배양이 주로 이용되고 있다. 특히, 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이고, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있다.
이때 배양 배지로는 인슐린, 덱사메타손, 아스코르베이트 2-포스페이트, L-프롤린 및 소듐 피루베이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 것이 좋으며, 각각의 양은 인슐린 0.5 내지 3g/l, 덱사메타손(dexametasone) 10-6 내지 10-8M, 아스코르베이트 2-포스페이트 10~100mM, L-프롤린 10~100mM 및 소듐 피루베이트 0.5 내지 3mM이 적당하다.
이러한 배지는 2~4일 주기로 교체될 수 있으며, 이때 온도는 36 내지 38℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 배양하는 것이 좋다. 이러한 조건으로 2 주간 배양 후 임의의 형태의 스캐폴드 등에 분주하여 추가 배양을 실시할 수 있다.
본 발명은 또한 지방유래 중간엽 줄기세포에 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 생산되는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 연골세포는 연골손상 등을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 본 발명의 연골세포를 이용하여 치료할 수 있는 연골손상 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 등이 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 따라 생산된 연골세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이식될 수도 있으며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절할 수 있다.
또한 본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 것을 포함하는 인공관절의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 인공관절을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법에 의해 분화된 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 통상의 방법을 사용하여 일정 형태의 인공연골을 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 인공관절 또는 귀나 코의 성형에 사용되는 인공연골을 제조할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<제조예 1> 지방기원 중간엽 줄기세포의 분리
지방흡입술을 이용해 36세에서 55세 사이의 환자 5명(평균나이: 41세)에게서 지방조직을 얻고, 이를 PBS 완충액으로 세척한 후, 1.5 ㎎/㎖ 콜라게나제로 처리하여 눈금 100㎛의 나일론 망으로 걸러냈다. 그 걸러낸 액을 적혈구 용혈 완충액을 사용하여 적혈구를 제거하였다.
이를 10% 우태혈청과 1% 항생물질(100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 0.25mg/ml 암포테리신B; Gibco BRL, Green Island, NY)를 함유하는DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F-12 배지(Invitrogen/Gibco, Green Island, NY)에서 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후 비접착물질을 제거하기 위해 세포를 PBS로 세척하였다.
배양기간 동안, 배지는 한주에 두번 교체되었고, 세포들이 바닥의 80%를 덮을 때 (80% confluence), 1mM EDTA를 포함하는 0.25% 트립신을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 분리하였고, PBS로 세척 후 다시 배양하였다.
2회 계대배양한 후 세포는 90% FBS와 10% DMSO를 포함하는 냉동 보존 배지에서 보관되었다.
<제조예 2> 플라스미드 및 분자 클로닝
NIH Mammalian Gene Collection(MGC)의 사람 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9의 코딩 부위의 cDNA 클론(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)는 PCR로 각각 증폭되었다. 증폭된 절편은 pECFP(enhanced green fluorescent protein, 녹색형광단백질)-C1 백터(Clontech, Palo Alto, CA, USA)로 클로닝되었다.
클로닝 효율을 증가시키기 위해, 5' 말단은 접착성있게 제조하였고, 3' 은 뭉툭하게 제작하였다. PCR 후, 삽입부는 SmaⅠ 및 BglⅡ (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)을 사용하여 분리되었다. T7 폴리머라아제(Takara Bio Inc.)와 함께 SmaⅠ은 3' 말단을 절단하기 위해 사용되었고, 뭉툭한 말단을 제조한다. BglⅡ는 접착성있는 5' 말단을 제조하기 위해 사용된다. 벡터 및 삽입부는 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)를 사용하여 접착(ligation)되고, 그 후 DNA 서열분석을 통해 제조된 플라스미드를 검증하였다.
<제조예 3> 마이크로포레이터(Microporator) 이용 지방기원 중간엽줄기세포에 비 바이러스성 형질 주입
제조된 지방기원 중간엽줄기세포를 회수하고 이를 PBS로 세척하였다. 상기 세포를 3*105 세포/ml로 재분주 버퍼 R(Invitrogen)에 분주하고 각 플라스미드 0.5μg와 혼합하였다. 그 후 마이크로포레이터(Invitrogen)를 사용하여 전기천공법을 실시하였다(1400voltage, 20ms). 전기천공법 실시 후, 상기 세포는 12-웰 플레이트에 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 배양되었다.
여섯개의 실험군은 다음과 같다.
실험군 1) 전사인자가 도입되지 않은 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(비교예 1, 음성대조군).
실험군 2) SOX-5 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(비교예 2).
실험군 3) SOX-6 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(비교예 3).
실험군 4) SOX-9 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(비교예 4).
실험군 5) SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자(각 플라스미드 0.17μg씩) 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(실시예).
실험군 6) 5ng/ml TGF-β2 및 100ng/ml BMP-7 처리된 지방유래 중간엽줄기세포(비교예 5, 양성대조군).
유전자 서열은 GenBank 에서 획득하였다 [accession nos. AB081589 (SOX-5), AF309034(SOX-6), 및 Z46629(SOX-9)].
EGFP-C1의 녹색 형광을 측정하는 leica DMI 6000B 현미경(Leica Microsystem, Wetzlar, Germany) 및 유동세포계수법(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA)을 사용하여 형질도입 24시간 후 형질도입 효율을 측정하였다.
유동세포계수법을 위해, 세포는 세번 세척되고, 2% FBS (Invitrogen/GIBCO)와 함께 Hank's Buffered Salt Solution (HBSS; Welgene)에 분주되었다. 그 후 세포는 CXP software (Beckman Coulter Inc.)를 사용하여 분석되었다.
<제조예 4> 펠렛 배양
각 실험군의 지방유래 중간엽줄기세포는 1% ITS(인슐린 1g/l), 10-7 M 덱사메타손(dexamethasone), 50 mM 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate-2-phosphate), 50 mM L-프롤린, 및 1mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)가 보충된 DMEM/F-12 배지에서 배양되었다.
펠렛 배양을 위해, 2.5*105 세포가 500 ㎕ 배양 배지에 분주되었고, 이는 15ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 분취되고, 500g로 10분간 원심분리 되었다. 그 후 튜브를 95% 공기/5% 이산화탄소 대기 하의 37℃ 인큐베이터에 위치시키고, 3일마다 배지를 교체하였다. 펠렛 배양은 최대 3주간 수행하였다.
<실험예 1> DNA 정량화 및 글루코사미노글리칸(Glucosaminoglycan: GAG) 측정
각 실험군의 펠렛은 60℃의 파파인(papain) 완충용액에 하룻밤동안 처리된 후 DNA량을 Quant-iTTM dsDNA 분석키트와 큐빗(Qubit) 형광 강도 측정 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 측정하였다.
GAG의 양은 블리스칸(Blyscan) 키트(Biocolor, Carrickfergus, United Kingdom)를 사용하여 측정하였다.
전기천공법 수행 24시간 후 유전자 이입 정도를 조사한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1a를 참조하면, 실험군 1 내지 5 모두에서 녹생 형광이 관측되는 바, 유전자 도입 효율이 우수하며, 2/3 이상의 세포가 형질도입 되었음을 알 수 있다.
도 1b를 참조하면, 이러한 녹색 형광 활성은 유전자 이입 21일 후에도 관측됨을 알 수 있다. 파란색 부분은 핵을 나타난다.
각각의 실험군별 유전자 이입 정도는 다음 표 1과 같다.
표 1
Transfected gene Vector SOX-5 SOX-6 SOX-9 SOX-5,-6,-9
Mean percentsge of transfected cells[95% Cl] 83.7 [77.9, 89.5] 76.7 [68.9, 84.5] 66.7 [56.3, 75.1] 74.9 [71.1, 78.7] 76.8 [73.8, 79.8]
따라서, 본 발명에 따른 전기천공법으로 유전자를 이입하는 경우, 이입 효율이 75% 이상으로 우수하게 나타남을 알 수 있었다.
<실험예 2> 역전사 및 RT-PCR 분석
총 RNA는 RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하였고, Quant-iTTM RNA 분석키트와 큐빗(Qubit) 형광 강도 측정 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 정량하였다. 총 RNA 샘플은 DNAse Ⅰ(Quiagen)으로 처리되었다.
총 RNA는 Multiscribe reverse transcriptase (Invitrogen) 올리고 (dT) 프라이머 40 ㎕ 반응볼륨과 함께 역전사되었다. 모든 PCR은 LightCycler 480 system(Roche)로 수행하였다. 표준 10㎕ 반응은 4.5㎕(10ng) cDNA, 0.5㎕ 10mM 주가닥, 0.5㎕ 10mM 보조가닥 프라이머 및 4.5㎕ LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster Mix (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)로 수행하였다.
사용된 SOX-5, SOX-6, SOX-9, type Ⅰ 콜라겐(COL1A1), type Ⅱ 콜라겐(COL2A1), 및 type Ⅹ 콜라겐(COL10A1)의 프라이머와 반응 조건은 아래 표 2와 같다.
표 2
Gene symbol Sequences(5'-3') Accession no.
COL1A1 F-CCGCCGCTTCACCTACAGC R-TTTTGTATTCAATCACTGTCTTGCC NM_000088
COL2A1 F-ATAAGGATGTGTGGAAGCCG R-TTTCTGTCCCTTTGGTCCTG NM_001844
COL10A1 F-CAGTCATGCCTGAGGGTTTT R-GGGTCATAATGCTGTTGCCT NM_000493
SOX-5 F-CAAGGCAATCCAAGAAGCTC R-CCAATCATTGCATGGCTAAA AB_081589
SOX-6 F-AGGATCTCGCTGGAAATCAA R-CTGCCTCATCTCCTGTCTCC AF_309034
SOX-9 F-GGAGCTCGAAACTGACTGGAA R-GAGGCGAATTGGAGAGGAGGA NM_000346
GAPDH F-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA R-GTACATGACAAGGTGCGGCTC NM_002046
글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로나아제(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)에 대한 Ct값이 표준화를 위한 기준으로 사용되었다. 따라서 대조군 대비 표준화가 이루어졌다. 세 번씩 실험을 수행하였다.
(1) SOX-5, SOX-6, 또는 SOX-9 유전자 발현에 대한 실험 결과를 표 3에 나타내었다.
유전자 도입 21일 후에도 전사가 이루어지는지 확인한 결과, SOX-5, SOX-6, 또는 SOX-9 유전자가 이입된 지방유래 간엽줄기세포는 대조군 대비 100 내지 550배 증가된 유전자 발현을 보였다(각각 P < 0.0001, <0.0001, =0.011). SOX-5, SOX-6, 및 SOX-9 유전자가 이입된 지방유래 간엽줄기세포 또한 상기와 같이 유전자 하나씩 이입된 경우만큼은 아니지만 각각의 유전자 발현이 대조군 대비 증가하였다(각각 P=0.041, 0.023, 0.045).
표 3
Gene N=3 SOX-5 SOX-6 SOX-9
Mean fold change [95% Cl] P-value vs control Mean fold change [95% Cl] P-value vs control Mean fold change [95% Cl] P-value vs control
Vector 1 1 1
SOX-5 173.14[124.51, 221.77] <0.0001 2.20[0.93, 3.47] 1.000 1.51 [0.86, 2.15] 1.000
SOX-6 1.08 [0.01, 2.16] 1.000 97.12 [76.84, 117.40] <0.0001 1.62 [0.09, 3.14] 1.000
SOX-9 1.92 [0.99, 3.90] 1.000 4.2 [-2.79, 11.19] 0.982 544.39[-159.67, 1248.45] 0.011
SOX-trio 45.73 [29.6, 61.9] 0.041 22.8[16.15, 29.37] 0.023 76.00[-13.58, 165.60] 0.045
TGF-β+BMP-7 0.97 [0.10, 1.85] 1.000 2.14 [0.16, 4.12] 1.000 1.69 [0.10, 3.29] 1.000
(2) 총 DNA량은 아래 표 4에 나타내었다. 표 4를 참조하면, 유전자 이입에 따라 총 DNA 량이 0.4 내지 0.6 μg 범위 내로 큰 변화가 없는 바, 따라서 유전자 이입은 세포 수에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
표 4 DNA
N=5 Mean DNA contents(㎍) [95% Cl] P-value vs control
Vector (Control) 0.44 [0.27, 0.61]
SOX-5 0.43 [0.27, 0.60] 1.000
SOX-6 0.57 [0.42, 0.73] 0.285
SOX-9 0.49 [0.39, 0.58] 0.662
SOX-trio 0.51 [0.37, 0.65] 0.754
TGF-β+BMP-7 0.53 [0.37, 0.70] 0.741
(3) GAG 유전자 발현량은 표 5에 나타내었다. 이는 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자가 모두 이입된 본 발명의 실시예에서 4.2배 증가하였고, TGF-β-2 및 BMP-7가 처리된 양성 대조군에서 3.8배 증가하였다. 비교예 1 내지 4에서는 GAG 유전자 발현의 유의적인 증가를 확인할 수 없었다.
표 5
N=5 Mean GAG/ DNA [95% Cl] P-value vs control
Vector (Control) 2.79 [0.01, 5.58]
SOX-5 3.34 [0.23, 6.45] 0.998
SOX-6 1.85 [1.14, 2.57] 1.000
SOX-9 3.28 [2.53, 4.02] 0.452
SOX-trio 6.92 [4.83, 9.00] 0.007
TGF-β+BMP-7 6.25 [4.41, 8.08] 0.015
(4) 연골 분화의 표지자인 COL2A1(type 2 콜라겐)유전자의 발현량은 표 6에 나타내었다.
표 6을 참조하면, COL2A1 유전자는 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 모두가 이입된 본 발명의 실시예에서 발현이 9배 증가하였고, TGF-β-2 및 BMP-7가 처리된 양성 대조군에서 7배 증가하였다. 그러나 SOX-5, SOX-6 또는 SOX-9 유전자 각각이 이입된 비교예에서는 연골세포로의 분화 유도 효과가 관측되지 아니하였다.
표 6
Gene N=3 TypeⅡ collagen TypeⅠ collagen Type X collagen
Mean fold change [95% Cl] P-value vs control Mean fold change [95% Cl] P-value vs control Mean fold change [95% Cl] P-value vs control
Vector (Control) 1 1 1
SOX-5 168[0.56, 2.81] 0.999 0.86[0.71, 1.01] 1.000 2.54[0.86, 4.21] 0.801
SOX-6 0.67[-0.15, 1.49] 1.000 2.42[0.08, 4.77] 0.355 2.23[-0.79, 5.26] 0.901
SOX-9 1.91[-0.28, 4.10] 0.996 2.12[1.00, 3.23] 0.565 1.71[0.34, 3.08] 0.988
SOX-trio 8.89[2.28, 15.49] 0.045 1.00[0.36, 1.64] 1.000 1.35[0.79, 1.91] 1.000
TGF-β+BMP-7 7.07[1.16, 12.97] 0.145 4.03[2.88, 5.18] 0.015 6.34[2.23, 10.45] 0.024
COL10A1(type 10 콜라겐)유전자의 발현량은 상기 표 6에서 볼 수 있듯이, TGF-β-2 및 BMP-7가 처리된 양성 대조군에서 6배 증가하였다. 그러나 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 모두가 이입된 본 발명의 실시예에서 발현량의 변화는 관측되지 아니하였다.
상기 유전자 발현량의 변화는 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 모두를 지방유래 간엽줄기세포에 도입할 때에만 COL1A1 및 COL10A1 발현량의 변화 없이 COL2A1 유전자만의 발현을 증가시킴을 보여준다.
<실험예 3> SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿
SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 전사 및 연골분화 관련 유전자 발현을 단백질 수준에서 조사하기 위해, SOX-5, SOX-6, SOX-9, type Ⅰ 콜라겐(COL1A1), type Ⅱ 콜라겐(COL2A1), 및 type 10 콜라겐(COL10A1)에 대한 웨스턴 블럿을 수행하였다.
총 단백질을 추출하기 위해서, 세포를 차가운 인산염 완충용액으로 두번 세척하고, 50㎕ RIPA 완충용액(25mM 트리스-염산, pH7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 에틸렌다이아민테트라아세트산 제외된 단백질 분해효소 억제제)으로 세포증식을 억제시켰다.
용해질을 얼음에 녹이고, 단백질을 침전시키기 위해 12,000g로 10분 동안 원심분리 시켰다. 단백질 양은 큐빗(Qubit) 분석키트(Qubit fluoromoter; Invitrogen)를 사용하여 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 측정하였다. 단백질 추출물을 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 시켰다.
분리된 단백질은 Bio Trace™ NT 니트로셀룰로오스 이동막에 전기영동 되었다. 3% 무지방 가루우유(BioRad Laboratories, Inc, Gothenburg, Sweden)를 포함하는 TBS-T(10mM Tris; 150mM NaCl, 0.05% tween-20)로 처리한 후 1차 항체를 부가하고 2시간 동안 배양하였다. 그 후 세척하고 2차 항체를 1시간 동안 상온에서 처리하고 다시 세척하였다. 단백질 띠는 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)를 사용하여 형성하였다. 이후 세 번 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블롯 분석 검출시약 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 시각화하였다.
1차 항체는 TBS-T/2.5% 무지방 건조우유에 각각 1:200으로 희석된 토끼 type Ⅰ 콜라겐(COL1A1) 폴리클로날 항체 (Millipore, Billerica, MA, USA), 쥐 type Ⅱ 콜라겐(COL2A1) 모노클로날 항체 (Millipore), 쥐 항-인간 type 10 콜라겐(COL10A1) 모노클로날 항체 (Sigma-Aldich, St. Louis, MO, USA) 및 토끼 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 폴리클로날 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) 를 사용하였다.
2차 항체는 TBS-T/2.5% 무지방 건조우유에 1:2000으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)에 결합된 염소의 토끼, 쥐의 IgG에 대한 항체를 사용하였다.
각 환자에게서 채취된 간엽줄기세포당 세 번씩 실험을 수행하였다.
(1) SOX-5, SOX-6, 또는 SOX-9 유전자 도입 21일 후 단백질 발현에 대한 실험 결과를 도 2에 나타내었다.
단백질 발현은 각각의 유전자가 도입된 비교예 2 내지 4에서 더욱 뚜렷하게 증가하는 것으로 나타났고, 본 발명의 실시예에서는 그보다 조금 약하게 나타났다. 그러나 유전자 도입 21일 후에도 모든 실험군에서 유전자 발현 및 단백질 발현이 지속적으로 이루어지고 있는 것을 알 수 있었다.
(2) 각 실험군별 연골분화 관련 단백질(typeⅡ 콜라겐, typeⅠ 콜라겐 및 type Ⅹ 콜라겐) 발현에 대한 웨스턴 블럿 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, type Ⅱ 콜라겐은 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 모두가 이입된 본 발명의 실시예에서 급격히 증가하였고, 이는 양성 대조군보다 더 크게 나타났다. Type Ⅰ 콜라겐은 모든 실험군에서 검출 되었으나, 비교예 2, 3, 5에서 발현이 증가하였다. Type Ⅹ 콜라겐 발현은 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 모두가 이입된 본 발명의 실시예에서 감소된 반면, 양성 대조군인 비교예 5에서는 발현이 현저하게 증가되었다. 상기 단백질 발현에 대한 실험 결과는 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자의 이입이 지방유래 간엽줄기세포의 비대화를 막으면서 이를 연골세포로 분화시키는 효과가 있음을 시사한다.
<실험예 4> in-vivo 피하 이식
실험군 1 내지 5의 펠렛을 7일간 in-vitro배양한 후, 마취된 SCID(severe combined immunodeficiency) 마우스의 등 피하조직에 이식하였다. 펠렛은 회수시기의 회복을 가능하게 하기 위해 피프린 글루에 고정된 비-흡수성 수술용 봉합선에 부착되었다. 여섯 개의 피하 주머니가 각각의 수컷 SCID 마우스 등에 형성되었다. 샘플은 이식 3주 후 조사되었고, GAG, 칼슘함량, 조직학적 분석을 수행하였다.
수거된 펠렛에 100㎕의 lysis buffer(RIPA; Thermo, Rockford, IL, USA)를 가하고, 액체질소로 균질화시켰다. 용균물은 2시간 동안 정치되고, 20분 동안 12,000rpm으로 원심분리 하였다. Calcium Colorimetric Assay Kit (Biovision, Mountain View, CA, USA)가 상등액의 칼슘 함량을 분석하기 위해 사용되었다. 측정 함량은 펠렛의 DNA 함량에 대해 표준화하였다.
결과를 표 7에 나타내었다. 표 7을 참조하면, SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자 모두가 이입된 본 발명의 실시예에서 측정된 GAG 값은 대조군에 비해 3배 증가하였고, 칼슘 함량은 35% 감소하였다. 이러한 결과는 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자의 이입이 In vivo 에서도 지방유래 간엽줄기세포의 연골세포 분화를 촉진시킨다는 점을 시사한다.
표 7
Figure PCTKR2011005274-appb-T000001
<실험예 5> 조직학적 분석
In vitro에서 3주간 배양된 상기 실험군의 펠렛 또는 in vivo 실험에서 수거된 펠렛을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 3시간 동안 고정시키고 100% 에탄올로 탈수시킨 후, 자일렌(xylene)으로 세척하였다. 그 후 파라핀에 고정시켰다. 파라핀 블록에서 4μm 두께로 잘라낸 절편을 유리 슬라이드로 덮고 프로테오글리칸(proteoglycan)에 대한 사프라닌-O 염색 및 무기물화 정도에 대한 알리자린 적색 염색을 수행하였다.
사프라닌-O 염색을 위해서, 견본을 자일렌과 에탄올로 탈파라핀화 하였다. 이에 수성 사프라닌-O(0.1%)를 30분간 가한 후, 증류수로 세척하였다.
알리자린 적색 염색을 위해, 견본을 2% 알리자린 레드 용액 (Junsei Chemical, Tokyo, Japan)으로 10분간 염색한 후, 증류수로 세척하였다.
프로테오글리칸 형성을 검출하는 사프라닌-O 염색 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, In vitro 에서 3주간 배양된 실험군 1 내지 6 중, SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자 모두가 이입된 본 발명의 실시예에서만 뚜렷한 변색이 나타난 것을 알 수 있었다. 따라서 연골 형성에 수반되는 GAG 형성은 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자 모두가 이입되는 경우에만 증가한다는 결론을 도출할 수 있었다.
도 5를 참조하면, In vivo에서 3주간 배양된 실험군 1 내지 6 중, SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자 모두가 이입된 본 발명의 실시예에서만 사프라닌-O 염색시 풍푸한 프로테오글리칸을 함유함을 알 수 있었고, 알리자린 적색 염색을 통해 비교예에 비해 무기물화 정도는 감소된 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 전기천공법으로 유전자를 도입하는 바, 종래의 바이러스 벡터를 사용하는 방법에 비해 이식 시 면역 거부반응 및 돌연변이 유발을 현저히 감소시킬 수 있다.

Claims (7)

  1. 지방유래 중간엽 줄기세포에 SOX-5, SOX-6 및 SOX-9 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전기천공법으로 도입하는 단계는 1300 내지 1500 볼트의 전압을 10 내지 30ms 로 1 내지 3번 인가하는 단계를 포함하는 것인 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    배양 배지는 인슐린, 덱사메타손, 아스코르베이트 2-포스페이트, L-프롤린 및 소듐 피루베이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항의 방법 중 어느 하나의 방법을 통해 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 연골손상 질환은 퇴행성 관절염 또는 류마티스성 관절염인 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항의 방법 중 어느 하나의 방법을 통해 분화된 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 것을 포함하는 인공관절의 제조방법.
  7. 제6항의 방법으로 제조된 인공관절.
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KR102232283B1 (ko) * 2018-07-26 2021-03-25 에이비온 주식회사 연골세포 분화 마커
KR102463245B1 (ko) * 2020-06-19 2022-11-07 동국대학교 산학협력단 Mettl7a 과발현 줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 세포치료제

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IACF.DONGGUK UNIVERSITY: "Cartilage regeneration using plasmid DNA-loaded porous polymeric scaffold/mesenchymal stem cell", STUDY REPORT OF HEALTH & MEDICAL TECHNOLOGY R&D PROGRAM AND POLICY IMPLICATIONS, 3 May 2010 (2010-05-03) *
IKEDA ET AL.: "The combination of SOX5, SOX6, and SOX9 (the SOX trio) provides signals sufficient for induction of permanent cartilage", ARTHRITIS & RHEUMATISM, vol. 50, no. 11, November 2004 (2004-11-01), pages 3561 - 3573 *
IM ET AL.: "Electroporation-mediated gene transfer of SOX trio to enhance chongrogenesis in adipose stem cells", OSTEOARTHRITIS AND CARTILAGE, vol. 19, 18 January 2011 (2011-01-18), pages 449 - 457 *

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