WO2020130713A1 - 인간 줄기세포 유래 폐포 대식세포를 포함하는 3차원 폐 오가노이드의 제조방법 - Google Patents

인간 줄기세포 유래 폐포 대식세포를 포함하는 3차원 폐 오가노이드의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional lung organoid comprising alveolar macrophages derived from human stem cells.
  • Fine dust is classified into PM10 when the diameter is 10 ⁇ m or less, PM5 when it is 5 ⁇ m or less, PM2.5 when it is 2.5 ⁇ m or less, and PM1 when it is 1 ⁇ m or less. Is called.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • lung inflammation emphysema
  • airway remodeling in rat models exposed to fine dust, especially for long-term ultrafine dust. Studies have been consistently reported that lung function in exposed humans has been reduced (Fang He et al. , Scientific Report, 7: 45666, 2017; Mary B.
  • lung disease patients As described above, treatment and management of lung disease patients is required based on accurate lung disease diagnosis for patients exposed to environmental factors such as fine dust and humidifier fungicides. Of course, it is necessary to find markers through research on the mechanism of development of lung diseases.
  • a pulmonary fibrosis model an animal model is mainly used, but the immune response and drug pharmacological effects may be different due to differences in physiological characteristics between humans and animals, and the onset is accurate due to the absence of a specific biomarker for lung fibrosis disease Mechanism research is limited.
  • organoids are organ-specific cell aggregates made by three-dimensionally culturing or agglomerating or recombining stem cells, and are capable of self-renewal and are also called'mini organs'or'similarorgans'. Organoids are similar to real organs, and can be implemented in vitro in studies that are difficult to implement in animal models such as molecular signal control, which are very useful for basic research, as well as human development, disease model establishment, and drug efficacy evaluation screening. It is a technology that can be very useful in various fields such as development of drug toxicity evaluation platform and development of cell therapy products.
  • alveolar macrophages are macrophages present in the alveoli (Alveolar macrophage), which have been reported to be differentiated from yolk sac, not bone marrow, and actually differ significantly from bone marrow-derived macrophages, as well as markers of human alveolar macrophages. The derived macrophages and markers are different. If alveolar macrophages are not present in the lung organoid culture system, it is difficult to implement an infection or inflammatory response.
  • a method of producing cells similar to human alveolar macrophages is implanted into human lung tissues of macrophages differentiated in vitro to induce maturation into cells similar to alveolar macrophages.
  • Methods have been disclosed (Happle, C., et al. (2017).Induced pluripotent stem cell derived macrophages differentiate into AM like cells in the lungs of humanized PAP mice.Paediatric Bronchology.)
  • lung organoids including alveolar macrophages should be prepared only by including mesoendoderm that does not express CXCR4.
  • the present invention has been discovered and completed.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing lung organoids comprising alveolar macrophages and lung organoids prepared accordingly.
  • the present invention comprises: 1) differentiating the stem cells to include definitive endoderm (DE) cells and mesoendoderm cells;
  • step 2) culturing the complete endoderm cells and mesendoderm cells of step 1) in a two-dimensional culture vessel to differentiate into anterior foregut endoderm (AFE) cells;
  • AFE anterior foregut endoderm
  • step 2) culturing the AFE cells of step 2) in a two-dimensional culture vessel
  • step 4) culturing the cultured cells of step 3) in a 3D culture vessel;
  • It provides a method for producing lung organoids comprising alveolar macrophages, comprising a.
  • the present invention provides a lung organoid comprising alveolar macrophages produced by the method for producing the lung organoid.
  • the present invention differentiates cells that do not express CXCR4, a marker of complete endoderm cells, so that the lung organoids prepared according to the method of the present invention include alveolar macrophages including type 1 and type 2 alveolar epithelial cells. Because it contains, unlike conventional lung organoids that do not contain immune cells, it can be useful for research on mechanisms of related lung diseases, discovering biomarkers, and developing therapeutic agents, by implementing an infection or inflammatory response.
  • Figure 1a shows a schematic diagram of a method for producing lung organoids according to differentiation periods from human predifferentiated stem cells.
  • 1B is a diagram showing a cell morphology photograph according to the differentiation period of two-dimensional cultured cells.
  • Figure 1c is a diagram showing a cell morphology according to the differentiation period of cells changed to 3D culture on the 20th day of differentiation.
  • FIG. 2A shows the flow cytometry (FACS) analysis result of the differentiated cell marker on the 4th day after the start of differentiation, and is a diagram confirming that 20 to 30% of the total cells of CXCR4 negative cells are present.
  • FACS flow cytometry
  • Figure 2b shows the results of flow cytometry (FACS) analysis of differentiated cell markers on the 4th day after the start of differentiation. It is a diagram confirming the expression level of EpCAM and CD56, the markers of mesendodermal cells, in 20.99% of cells in which CXCR4 is negative. .
  • Figure 3 is a quantitative polymerase chain reaction (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) results graph measuring the degree of alveolar cell specific gene expression according to differentiation period and presence or absence of 3D culture.
  • Figure 4a is a graph showing the results of fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis measuring the degree of expression of alveolar cell specific genes (EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C and CD90) on day 10 of differentiation.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Figure 4b is a graph showing the results of fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis measuring the degree of expression of alveolar cell specific genes (EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C and CD90) on day 20 of differentiation.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Figure 4c is a fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of the degree of expression of alveolar cell specific genes (EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C and CD90) of cells of day 30 of differentiation maintained in 2D culture It is a diagram showing the result graph.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Figure 4d is a FACS (fluorescence-activated) measuring the degree of expression of alveolar cell specific genes (EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C and CD90) of day 30 differentiation cells changed to 3D culture on day 20 of differentiation cell sorting) It is a graph showing the result of the analysis.
  • FIG. 5A is a view of the alveolar structure including the branch structure of the 3D lung organoid.
  • 5B is a diagram showing a honeycomb structure photograph of a branch structure cross section of a 3D lung organoid.
  • Figure 5c is an immunofluorescence staining picture confirming the alveolar cell specific protein expression of the three-dimensional lung organoids.
  • Figure 5d is a transmission electron microscope (transmission electron microscopy, TEM) photograph of a three-dimensional lung organoid containing alveolar specific lamellar body (lamellar body).
  • Figure 6a is a FACS results graph confirming the expression of alveolar macrophage specific protein on the 30th day of differentiation of 3D lung organoids.
  • Figure 6b is a graph showing FACS results confirming the expression of alveolar macrophage-specific proteins on day 60 of differentiation.
  • Figure 6c is a graph showing FACS results confirming the expression of alveolar macrophage-specific proteins in the first year of differentiation.
  • 7A is a photograph confirming that there is no non-specific reaction of the antibody used by using only the secondary antibody without the primary antibody.
  • Figure 7b is a diagram showing a pro-surfactant protein C staining phototype 2 alveolar cell marker.
  • FIG. 7C is a diagram showing a picture of PDPN staining, a type 1 alveolar cell marker.
  • Figure 7d is a diagram showing a picture of the alveolar macrophage marker CD68 staining.
  • Figure 8a shows a picture of the appearance of the three-dimensional lung organoids at 10 months of differentiation.
  • 8B is a photograph of H&E staining of 3D lung organoids at 10 months of differentiation.
  • Figure 9 is a type A, B and M type pictures of the three-dimensional lung organoid on day 85 of differentiation.
  • 10A is a diagram showing the results of RNA sequencing of genes related to respiratory system development according to the A-type, B-type, and M-type forms of the three-dimensional lung organoid on day 85 of differentiation.
  • Figure 10b shows the results of RNA sequencing of macrophage-related genes according to the A-type, B-type and M-type forms of the three-dimensional lung organoid on day 85 of differentiation, and the expression of the macrophage-related gene (CD68) in the lung organoid It is also confirmed that it appears strongly.
  • the present invention 1) differentiating the stem cells to include complete endoderm (definitive endoderm, DE) cells and mesoendoderm (mesoendoderm) cells;
  • step 2) culturing the complete endoderm cells and mesendoderm cells of step 1) in a two-dimensional culture vessel to differentiate into anterior foregut endoderm (AFE) cells;
  • AFE anterior foregut endoderm
  • step 2) culturing the AFE cells of step 2) in a two-dimensional culture vessel
  • step 4) culturing the cultured cells of step 3) in a 3D culture vessel;
  • It provides a method for producing lung organoids comprising alveolar macrophages, comprising a.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, or adult stem cells, but are not limited thereto.
  • the complete endoderm cells may contain 50 to 90% of the total cells, specifically 50 to 80%, and more specifically 70 to 80%.
  • the mesendoderm cells may contain 10-40% of cells that do not express CXCR4 (CXC chemokine receptor type 4), a marker of complete endoderm cells, specifically 10-30%, and more specifically 15 to 25%.
  • CXCR4 CXC chemokine receptor type 4
  • a marker of complete endoderm cells specifically 10-30%, and more specifically 15 to 25%.
  • the differentiation may be to differentiate stem cells in a culture vessel coated with Matrigel for simulating the microenvironment of cells, but is not limited thereto, and a culture vessel coated with fibronectin or laminin may be used. .
  • step 1) can be carried out for 2 to 6 days, preferably for 3 to 6 days or more preferably for 4 to 6 days.
  • the culture of step 2) is performed in an anteriorization medium.
  • the anteriorization medium includes a TGF- ⁇ (transforming growth factor beta) signaling pathway inhibitor and a Wnt signaling pathway inhibitor, and can be differentiated into an anterior full-length endoderm cell using this, specifically, the TGF- ⁇ signaling pathway
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • the inhibitor may be SB431542 and Noggin, and the Wnt signaling pathway inhibitor may be IWP-2, IWP-3 or IWP-4, but is not limited thereto.
  • the SB431542 is represented by the following formula, and may be included in the medium in an amount of 8 to 20 ⁇ M, preferably 8 to 15 ⁇ M, or more preferably 5 to 15 ⁇ M.
  • the Noggin may be included in the medium at 50 to 150 ng/ml, preferably 80 to 150 ng/ml or more preferably 80 to 120 ng/ml.
  • the Inhibitor of Wnt production-2 (IFP-2), Inhibitor of Wnt production-3 (IFP-3) or Inhibitor of Wnt production-4 (IFP-4) is 0.2 to 2 ⁇ M in the medium, preferably 0.5 to 2 ⁇ M or more preferably 0.8 to 2 ⁇ M.
  • the culture of step 3) is performed in LO (Lung Organoid formation) medium containing matrigel.
  • the LO medium is contained using a medium containing a GSK-3 ⁇ (glycogen synthase kinase 3 beta) inhibitor, fibroblast growth factor (FGF), lung branch type proliferation inhibitor and alveolar regeneration activator,
  • GSK-3 ⁇ glycose kinase 3 beta
  • FGF fibroblast growth factor
  • lung branch type proliferation inhibitor is bone morphogenetic protein (BMP)
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the alveolar regeneration activator is all -trans retinoic acid, and the bone-forming protein may be more specifically BMP4, but is not limited thereto.
  • the CHIR 99021 has the structure of the following formula, and may be included in the medium at 0.5 to 10 ⁇ M, preferably 0.8 to 10 ⁇ M, or more preferably 1.5 to 10 ⁇ M.
  • the FGF10 (Fibroblast Growth Factor 10) may be included in the medium in an amount of 8 to 20 ⁇ M, preferably 8 to 15 ⁇ M, or more preferably 5 to 15 ⁇ M.
  • the FGF7/KGF may be included in the medium at 8 to 20 ng/ml, preferably 8 to 15 ng/ml, or more preferably 5 to 15 ng/ml.
  • the BMP4 (Bone morphogenetic protein 4) may be included in the medium at 8 to 20 ng/ml, preferably 8 to 15 ng/ml, or more preferably 5 to 15 ng/ml.
  • the all-trans retinoic acid may be included in the medium as 20 to 80 nM, preferably 30 to 80 nM, or more preferably 40 to 80 nM.
  • the culture of step 4) is performed in LO (Lung Organoid formation) medium containing no Matrigel.
  • Incubation in the two-dimensional culture vessel of step 2) above starts from day 3 to 7 of differentiation, preferably from day 4 to 6 of differentiation, more preferably from day 4 to 5 of differentiation for 1 to 7 days, for 1 to 5 days Or 1 to 4 days.
  • Incubation in the two-dimensional culture vessel of step 3) above starts from day 5 to 15 of differentiation, preferably from day 6 to 12 of differentiation, more preferably from day 7 to 10 of differentiation for 5 to 20 days, for 7 to 15 days Or 10 to 14 days.
  • Incubation in the three-dimensional container is from 15 to 25 days of differentiation, preferably from 18 to 23 days of differentiation, more preferably from 19 to 21 days of differentiation, for 10 days to 1 year, 15 days to 6 months or 20 days It may be performed for 30 days.
  • the present invention provides a lung organoid comprising alveolar macrophages produced by the method for producing the lung organoid.
  • the present inventors differentiate human pluripotent stem cells (hPSC) to include DE cells and mesoderm cells, which contain Matrigel in a culture vessel coated with Matrigel.
  • Lung organoids were prepared by differentiating them into AFE cells using the cultured anteriorization medium, and transferring them to a three-dimensional culture vessel on the 20th day of differentiation to culture them using LO medium not containing Matrigel (see FIG. 1A ).
  • the present inventors cultivated the stem cells until cells expressing CXCR4, a marker of complete endoderm cells, accounted for a ratio of 70 to 80%, and then EpCAM (a marker of mesodermal cells among cells that do not express CXCR4) -) It was confirmed that the lung organoids containing alveolar macrophages can be prepared only when the cells expressing CD56(+) contain about 20% (see FIGS. 2A and 2B).
  • lung tissue-specific gene is highest in the case of lung organoids changed to 3D culture after day 20 of differentiation (FIG. 3).
  • alveolar epithelial cell markers, type 1 alveolar epithelial cell markers, type 2 alveolar epithelial cell markers, and the like are expressed in lung organoids on day 30 of differentiation (FIGS. 4A to 4D).
  • lung organoids which form a branched structure like the shape of a human lung, form a alveolar shape (FIG. 5A), and a honeycomb-like structure surrounded by cells forming a thin film similar to the structure of the human alveoli. It was confirmed that consists of (Fig. 5b), alveolar cell-specific protein expression (Fig. 5c), it was observed that the alveolar-specific lamella body was formed (Fig. 5d).
  • the present inventors confirmed the presence of alveolar macrophages in the prepared lung organoids by confirming the expression of alveolar macrophage specific markers in lung organoids at 30, 60 and 1 year of differentiation (FIGS. 6A to 6). Figure 6c).
  • the present inventors expressed pro-surfactant protein c, a type 2 alveolar epithelial cell marker, in the lung organoid at day 70 of differentiation (FIG. 7B), and expressed the type 1 alveolar epithelial cell marker, PDPN (FIG. 7C). ), by confirming that the alveolar macrophage marker CD68 is expressed (FIG. 7D ), it was confirmed that the lung organoids of the present invention include alveolar macrophages as well as type 1 and type 2 alveolar epithelial cells.
  • the present inventors confirmed that the epithelial cells forming the lumen and the thin membrane surrounded by a thin membrane similar to the human alveolar structure exist in the lung organoid at 10 months of differentiation (see FIGS. 8A and 8B ).
  • the present inventors confirmed the gene expression pattern according to the shape of the produced lung organoid, and confirmed that the expression of CD68, a gene related to alveolar macrophages, is strongly expressed in the type A lung organoid showing a transparent alveolar shape. It was confirmed that the lung organoids contained alveolar macrophages (see FIGS. 9, 10A and 10B).
  • the method of manufacturing lung organoids comprising alveolar macrophages according to the present invention and the lung organoids comprising alveolar macrophages produced by the above method are different from infection or inflammation unlike lung organoids that do not contain existing immune cells.
  • it can be usefully used to study mechanisms of related lung diseases, discover biomarkers, and develop therapeutic agents.
  • Cold DMEM/F12 medium (Cat. #. 11330-032, Matrigel-Matrix (Matrigel-hESC qualified Matrix, Cat. #. 354277, Corning, USA)) capable of simulating the extracellular microenvironment After diluting 200 times using Gibco (USA) (final Matrigel concentration: 250 to 290 ⁇ l/500 ml), put it in 400 ⁇ l per well in a 4-well plate and in a 37° C. incubator where 5% carbon dioxide is maintained 1 Coated for an hour.
  • Gibco USA
  • Vitronectin XF (Cat#.07180, Stem cell technologies) was added to the cell culture plate, and the wells of the plate were coated.
  • human pluripotent stem cell H9 cell line (Wicell, WA09-FD) was used at 37°C and 5% CO 2 condition using 2 ml of TeSRTM-E8TM medium (Cat#.05940, Stem cell technologies) per well. It was prepared by culturing under. At this time, the medium was changed every day during the passage.
  • EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
  • Example 1-1 After counting the obtained cells, diluted in mTeSR TM -1 medium (Cat. #. 5850, STEMCELL Technologies, Canada) to which 10 ⁇ M of ROCK inhibitor and matrigel (200-fold dilution) were added, coated in Example 1-1 Incubation was started by seeding 1.25 x 10 5 cells/well in one 6-well plate.
  • DE-1 medium DE basal medium having the composition of Table 1 was added and cultured for 24 hours.
  • the medium was removed, and 2 ml per well of DE-2 medium having the composition of Table 2 was added and cultured for 24 hours, and the medium was replaced every 24 hours. If it is confirmed that CXCR4, which is a marker of DE (complete endoderm cell), is expressed by 70 to 80% on the 4th or 5th day after the start of differentiation, the steps of Examples 1-5 below are performed.
  • composition of DE-2 medium (10 ml) DMEM/F12 (9.587 mL) 1 ⁇ N2 supplement (Cat. #. 17502048, Gibco) (100 ⁇ l) 1 ⁇ B27 supplement (Cat. #. 17504-044, Gibco) (200 ⁇ l) 1 ⁇ P/S (Penicillin/streptomycin) (Cat. #. 15140-122, Gibco) (100 ⁇ l) 50 ng/ml Activin A (Cat. #.338-AC, R&D system, 100 ⁇ l/ml stock) (5 ⁇ l) 0.5mM sodium butyrate (Cat. #. 303410, Sigma, 1M stock) (1 ⁇ l)
  • TrypLE TM Express (Gibco, Cat#:12604013) was added and cultured for 3 to 5 minutes. Then, TrypLE TM Express was removed, DPBS was added to collect the cells, centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes, DPBS was removed, and 1 ml of anteriorization-1 medium (Table 3) containing Matrigel was added. Suspended. After counting the cells, they were diluted with anteriorization-1 medium and seeded at 5 to 9 x 10 5 cells/well in the 6-well plate coated in Example 1-1, and cultured for 24 hours.
  • composition of anteriorization-1 medium (5ml) DMEM/F12 (4.790 mL) 1 ⁇ N2 supplement (Cat. #. 17502048, Gibco) (50 ⁇ l) 1 ⁇ B27 supplement (Cat. #. 17504-044, Gibco) (100 ⁇ l) 1 ⁇ P/S (Penicillin/Streptomycin) (Cat. #. 15140-122, Gibco) (50 ⁇ l) 100 ng/mL Noggin (Cat. #.120-10C, Peprotech, 100 ⁇ g/mL stock) (5 ⁇ l) 10 ⁇ M SB431542 (Cat. #.S1067, Selleckchem, 10 mM stock) (5 ⁇ l) 1/200 Matrigel
  • the medium was removed, and 2 ml per well of Matrigel-containing anteriorization-2 medium (Table 4) was added and cultured for 48 hours.
  • composition of anteriorization-2 medium (5ml) DMEM/F12 (4.8 mL) 1 ⁇ N2 supplement (Cat. #. 17502048, Gibco) (50 ⁇ l) 1 ⁇ B27 supplement (Cat. #. 17504-044, Gibco) (100 ⁇ l) 1 ⁇ P/S (Penicillin/Streptomycin) (Cat. #. 15140-122, Gibco) (5 ⁇ l) 1 ⁇ M IWP-4 (Cat. #. 04-0036, Stemgent, 1 mM stock) (5 ⁇ l) 10 ⁇ M SB431542 (Cat. #.S1067, Selleckchem, 10 mM stock) (5 ⁇ l) 1/200 Matrigel
  • the medium was removed and cultured with 2 ml per well of Lung organoid formation (LO) medium containing Table Matrigel (Table 5), and half of the existing medium was replaced with a new medium every 2 days. .
  • LO Lung organoid formation
  • Composition of LO medium 50 ml) DMEM/F12 (47.965 mL) 1 ⁇ N2 supplement (Cat. #. 17502048, Gibco) (500 ⁇ l) 1 ⁇ B27 supplement (Cat. #. 17504-044, Gibco) (1 ml) 1 ⁇ P/S (Penicillin/Streptomycin) (5 mL) 3 ⁇ M CHIR 99021 (Cat. #.S1263, Selleckchem, 10 mM stock) (15 ⁇ l) 10 ng/mL FGF10 (Cat. #. 100-26, Peprotech, 100 ⁇ g/mL stock) (5 ⁇ l) 10 ng/mL FGF7/KGF (Cat. #.
  • the culture medium of cells was removed on the 4th or 5th day of differentiation, washed with DPBS, and then cultured for 3 to 5 minutes by adding TrypLETM Express. Then, TrypLETM Express was removed, DPBS was added to collect the cells, centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes, DPBS was removed, and suspended in FACS buffer. 2 ⁇ l of antibodies (CXCR4, cat. #. 551510, BD pharmigen; EpCAM, Cat. #.324204, Biolegend; CD56, Cat. #. 555518, BD pharmigen) to 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 cells each Add in each and react for 15 to 20 minutes at room temperature.
  • CXCR4 cat. #. 551510, BD pharmigen
  • EpCAM EpCAM
  • CD56 Cat. #. 555518, BD pharmigen
  • Quantitative polymerase chain reaction was performed to compare the lung tissue-specific gene expression level of the three-dimensional lung organoid of the present invention according to differentiation period and presence or absence of three-dimensional culture.
  • RNA was isolated from lung organoids on the 30th day of differentiation changed to culture.
  • Complementary DNA (cDNA) complementary from each RNA was synthesized using the cDNA synthesis kit (Primescript 1 strand cDNA synthesis kit, Cat. #. 6110A, TAKARA, Japan), followed by primers in Table 6 and SYBR green QPCR was performed using a PCR master mix (Power SYBR Green PCR Master Mix, Cat. #.
  • lung organoid according to the present invention exhibits properties very similar to actual lung tissue.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Example 1 cells of day 30 of differentiation that maintained a two-dimensional culture after day 10, 20, and day 20 of differentiation of Example 1 were added with 1 ml of TrypLE TM Express reagent (Cat. #. 12604013, Gibco), respectively, and at room temperature. After 5 minutes of reaction, the cells were washed with FACS buffer (5% FBS, 0.1% sodium azide in DPBS), and changed to a three-dimensional culture on the 20th day of differentiation. The type collagenase (collagenase type II, STEMCELL TECHNOLOGIES) was added and reacted three times for 20 minutes at 37° C., followed by washing with FACS buffer. Then, FACS analysis was performed using a FACS instrument (FACSAria II, Becton Dickinson and Company, USA).
  • FACS buffer 5% FBS, 0.1% sodium azide in DPBS
  • EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C and CD90 which are markers expressed at the early stage of differentiation, was high in day 10 differentiation cells, whereas the expression of these markers decreased as the differentiation progressed.
  • Pulmonary tissue-specific proteins Sox9 (alveolar epithelial cell marker), PDPN (type 1 alveolar epithelial cell marker), Mucin (goblet cell marker), and Surfactant in lung organoids at day 30 of differentiation changed to 3D culture on day 20 It was confirmed that protein C (type 2 alveolar epithelial cell marker) and P63 (basal cell marker) were expressed (FIG. 4).
  • the alveolar structure-like morphology of the three-dimensional lung organoid of the present invention was observed by microscopic observation.
  • Example 1 culture cells of day 20 of differentiation were mixed with Matrigel in a volume ratio of 1:1, seeded in an inner chamber of a trans-well, cultured, and cultured lung Organoids were observed under a microscope.
  • lung organoids in the Matrigel form branches and alveoli like human lungs (FIG. 5A).
  • a freeze-section embedding agent FSC22 Clear Frozen section compound, Cat. #. 3801480, Leica Biosystems, Germany
  • FSC22 Clear Frozen section compound Cat. #. 3801480, Leica Biosystems, Germany
  • the frozen sample was made into 8 ⁇ m-thick sections using a frozen microtome, and then dried on a slide.
  • 200 ⁇ l of a dilution of one drop of DAPI staining reagent NucBlue TM Fixed Cell Stein Ready Probes TM reagent, Cat. #.R37606, Invitrogen, USA
  • DAPI staining reagent NucBlue TM Fixed Cell Stein Ready Probes TM reagent, Cat. #.R37606, Invitrogen, USA
  • the 3D lung organoid was composed of a honeycomb-like structure surrounded by cells forming a thin membrane similar to that of the human alveoli (Fig. 5B).
  • the alveolar cell specific protein expression of the three-dimensional lung organoid of Experimental Example 5-1 was confirmed by immunofluorescence.
  • the three-dimensional lung organoid of the present invention expresses surfactant protein B and Sox9, alveolar cell specific proteins (FIG. 5C).
  • FACS analysis was performed in the same manner as described in Experimental Example 3.
  • immunofluorescence staining was performed on the lung organoid of day 70 of differentiation in the same manner as described in Experimental Example 5-3.
  • Anti-pro-surfactant protein C rabbit antibody (Cat. #. 400879, abcam), a type 2 alveolar cell marker, and primary antibody against alveolar macrophage marker CD68 (anti After double staining with -hCD68 mouse antibody, Cat.#.ab201340, abcam), washed and then fluorescent secondary antibody Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG, Cat. #.A11034, Invitrogen) and Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody (Alexa Fluor 647 anti-mouse IgG, Cat.
  • the expression of the type 2 alveolar epithelial cell marker Pro-surfactant protein C, the alveolar macrophage marker CD68, and the type 1 alveolar epithelial cell marker PDPN in the 3D lung organoid of the present invention were confirmed. It was confirmed that both type 1 and type 2 alveolar epithelial cells were expressed and alveolar macrophages were also expressed (FIGS. 7A to 7D ).
  • the shape of the three-dimensional lung organoid at 10 months of differentiation was observed by taking a picture under a microscope, and confirmed by performing H&E (hematoxylin and eosin) staining.
  • the three-dimensional lung organoid of Example 1 was cultured until the 10th month of differentiation and observed by taking a picture under a general microscope.
  • the 3D lung organoids were fixed with 4% PFA, washed with PBS, and then sequentially dehydrated using 70%, 90%, 95%, and 100% alcohol. Then, it was washed with xylene and embedded with paraffin. Sections embedded with paraffin were attached to slides to perform H&E staining, and photographs were observed under a microscope.
  • the gene expression pattern according to the form of the three-dimensional lung organoid according to the present invention was confirmed by RNA sequencing.
  • M type multi-lineage, round sphere form
  • B type brochioalveolar type, differentiating branch form
  • RNA sequencing of respiratory-related genes and macrophage-related genes was selected by selecting lung organoids of type A) and type A (alveolar type, transparent alveolar-like) (respiratory system development related genes, GO) #. 0060541).

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Abstract

본 발명은 인간 줄기세포 유래 폐포 대식세포를 포함하는 3차원 폐 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 완전 내배엽 세포의 마커인 CRCX4를 발현하지 않는 세포를 함께 분화시켜, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 폐 오가노이드는 제1형 및 제2형 폐포 상피세포를 포함하는 동시에 폐포 대식세포를 포함하므로, 기존의 면역세포를 포함하지 못하는 폐 오가노이드와 달리 감염 또는 염증 반응을 구현하여 관련 폐 질환의 기전 연구, 바이오마커 발굴, 치료제 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 줄기세포 유래 폐포 대식세포를 포함하는 3차원 폐 오가노이드의 제조방법
본 발명은 인간 줄기세포 유래 폐포 대식세포를 포함하는 3차원 폐 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
최근 미세먼지가 국민이 안전과 건강을 위협하는 중요한 환경 현안으로 떠오른 가운데 지속적으로 미세먼지 오염도가 증가되고 있는 추세이며, 그 체감 수치는 더욱 높아지고 있다. 미세먼지는 입자크기에 따라 지름이 10 ㎛ 이하인 경우 PM10, 5 ㎛ 이하인 경우 PM5, 2.5 ㎛ 이하인 경우 PM2.5, 1 ㎛ 이하인 경우 PM1로 구분되며, 지름이 2.5 ㎛ 이하인 경우를 '초미세먼지'라고 부른다. 최근 연구에 따르면 미세먼지에 노출시킨 랫드 모델에서 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 폐 염증, 폐기종(emphysema), 기도 개형(airway remodeling) 등이 보고되었으며, 특히 초미세먼지에 장기간 노출된 사람의 폐기능이 감소되었음을 규명한 연구가 계속적으로 보고되어 왔다(Fang He et al., Scientific Report, 7: 45666, 2017; Mary B. Rice et al., All AJRCCM, 191(6): 656-664, 2015; Zwozdziak et al., Environ Sci Pollut Res Int, 23(23): 23892-23901, 2016; 및 Yu-Fei Xing et al., J Thorac Dis, 1: E69-E74, 2016). 현재 미세먼지에 대한 측정장비 개발, 필터 개발 및 미세먼지 저감 기술에 대한 연구가 진행되어 오고 있으나, 미세먼지의 인체 위해성 평가법 개발 및 병리 기전에 대한 연구가 부족한 실정이다.
또한, 2000년대 초반부터 피해 사례가 보고되기 시작하여 2012년 이후 사용이 금지된 가습기 살균제는 원인미상의 폐 손상 질환을 유발하는 것으로 보고되었다. 질병관리본부의 역학 조사 결과, 가습기 살균제에 의한 원인미상의 중증 폐 질환 환자들은 병리 소견상 괴사성 세기관지염, 급격히 진행하는 불응성 저산소증, 스테로이드 및 면역억제제에 대한 무반응 등의 특성을 나타내는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 중증 폐 질환 소견이 발견되지 않은 낮은 단계의 피해자들 또한 약 4,800명이 넘는 것으로 확인되었으며, 아직까지도 많은 환자들이 가습기 살균제 피해로 고통받고 있다고 보고되고 있다. 그러나, 가습기 살균제 피해자들에게서 나타난 폐섬유화(lung fibrosis)는 동물모델을 활용한 기전 연구가 진행되어 왔으나, 현재까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 못하고 있는 실정이다.
상기와 같이 미세먼지 및 가습기 살균제 등 환경 유해 인자에 노출된 환자들에 대한 정확한 폐 질환 진단을 바탕으로 폐 질환 환자의 치료 및 관리가 요구되고 있으며, 이를 위하여 이미징 기반 폐 질환 평가, 진단 기술 개발은 물론, 폐 질환의 발병 기전 연구를 통한 마커 발굴 등이 필요하다. 현재, 폐섬유화 모델의 경우 동물 모델이 주로 사용되고 있으나, 인간과 동물간의 생리적 특성 차이로 인한 면역반응 및 약물의 약리작용 결과가 상이할 수 있으며, 폐섬유화 질환 특이적 바이오마커의 부재로 인하여 정확한 발병기전 연구에 제약이 따르고 있다.
세포를 이용한 연구로는 환경 유해 인자에 노출된 인간의 일차(primary) 배양 폐 세포를 이용한 연구가 가장 이상적이나, 인간 일차 배양 폐 조직 또는 세포를 확보하는데 어려움이 있고, 장기간 배양이 어려워 불멸화한 세포주 등을 이용하여 연구가 진행되고 있다. 그러나, 이러한 세포주들은 일차 배양 세포의 생리학적 특성을 정확히 반영하지 못하고, 정상 핵형(karyotype)을 유지하는 비율이 현저히 낮으며, 한 종류의 세포로 이루어져 있어, 다양한 세포들이 3차원 형태를 유지하고 있는 인간 폐 조직의 특징을 정확히 모사할 수 없는 한계가 존재한다.
한편, 오가노이드란 줄기세포를 3차원적으로 배양하거나 응집 또는 재조합하여 만든 장기 특이적 세포 집합체로 자기 재생(self-renewal)이 가능하며 '미니 장기' 또는 '유사 장기'라고도 불린다. 오가노이드는 실제 장기와 유사한 형태로 분자 신호 조절 등과 같은 동물 모델에서는 구현하기 힘든 연구를 in vitro 상에서 구현할 수 있어 기초 연구에 매우 유용함은 물론, 인간의 발생과정, 질환 모델 확립, 의약품 유효성 평가 스크리닝, 의약품 독성 평가 플랫폼 개발, 세포치료제 개발 등 다양한 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있는 기술이다.
현재 다양한 오가노이드 확립을 위한 연구가 진행되어 오고 있으며, 폐 오가노이드도 개발되어 있다. 폐 오가노이드 제조 방법 관련 종래기술로는 hPSC로부터 폐 오가노이드를 제조할 수 있는 방법을 개시한 Development, 144: 986-997, 2017 및 Nature cell biology, 19(5): 542-549, 2017이 있다.
그러나 현재까지 알려진 폐 오가노이드는 폐포 대식세포를 포함하고 있지 않아 감염 또는 염증 반응을 구현하기 어려운 한계가 존재한다. 폐포 대식세포는 폐포 안에 존재하는 대식세포(Alveolar macrophage)로서 그 유래가 골수가 아닌 yolk sac으로부터 분화된다는 보고가 있으며, 실제로 골수 유래 대식세포와 크게 다를 뿐만 아니라, 인간의 폐포 대식세포의 마커도 골수 유래 대식세포와 마커가 상이하다. 폐 오가노이드 배양 시스템에 폐포 대식세포가 존재하지 않으면 감염이나 염증반응을 구현하기가 어려운 한계가 있다. 이와 같은 한계를 극복하기 위하여 인간의 폐포 대식세포와 유사한 세포를 제작하는 방법으로, in vitro에서 분화시킨 대식세포를 인간화된 쥐의 폐 조직에 이식하여 폐포 대식세포와 유사한 세포로의 성숙을 유도하는 방법이 개시된 바 있으나(Happle, C., et al. (2017). Induced pluripotent stem cell derived macrophages differentiate into AM like cells in the lungs of humanized PAP mice. Paediatric Bronchology.), 현재까지 성숙한 인간 폐포 대식세포가 포함된 폐 오가노이드를 제작할 수 있는 방법은 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 마트리겔에 hPSC를 overlay하여 2D 방법으로 분화시켰으며, 분화 4 내지 5일째에 CXCR4를 발현하지 않는 중내배엽 세포(mesoendoderm)를 포함해야만 폐포 대식세포를 포함한 폐 오가노이드를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법 및 이에 따라 제조된 폐 오가노이드를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 줄기세포를 완전 내배엽(definitive endoderm, DE) 세포 및 중내배엽(mesoendoderm) 세포를 포함하도록 분화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포 및 중내배엽 세포를 2차원 배양용기에서 배양하여 전방 전장 내배엽(anterior foregut endoderm, AFE) 세포로 분화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 AFE 세포를 2차원 배양용기에서 배양하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 배양된 세포를 3차원 배양용기에서 배양하는 단계;
를 포함하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폐 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드를 제공한다.
본 발명은 완전 내배엽 세포의 마커인 CXCR4를 발현하지 않는 세포를 함께 분화시켜, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 폐 오가노이드는 제1형 및 제2형 폐포 상피세포를 포함하는 동시에 폐포 대식세포를 포함하므로, 기존의 면역세포를 포함하지 못하는 폐 오가노이드와 달리 감염 또는 염증 반응을 구현하여 관련 폐 질환의 기전 연구, 바이오마커 발굴, 치료제 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화 기간에 따른 폐 오가노이드의 제조방법 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 2차원 배양 세포의 분화 기간에 따른 세포 형태 사진을 나타낸 도이다.
도 1c는 분화 20일차에 3차원 배양으로 변경한 세포의 분화 기간에 따른 세포 형태 사진을 나타낸 도이다.
도 2a는 분화 시작 후 4일째의 분화세포 마커의 유세포 분석기(FACS) 분석 결과를 나타낸 것으로, CXCR4가 음성을 나타내는 세포가 전체 세포의 20 내지 30% 존재함을 확인한 도이다.
도 2b는 분화 시작 후 4일째의 분화세포 마커의 유세포 분석기(FACS) 분석 결과를 나타낸 것으로, CXCR4가 음성을 나타내는 세포의 20.99%에서 중내배엽 세포의 마커인 EpCAM과 CD56의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 3은 분화 기간 및 3차원 배양 유무에 따른 폐포 세포 특이적 유전자 발현 정도를 측정한 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 결과 그래프이다.
도 4a는 분화 10일차의 폐포 세포 특이적 유전자(EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C 및 CD90) 발현 정도를 측정한 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석 결과 그래프를 나타낸 도이다.
도 4b는 분화 20일차의 폐포 세포 특이적 유전자(EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C 및 CD90) 발현 정도를 측정한 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석 결과 그래프를 나타낸 도이다.
도 4c는 2차원 배양을 유지한 분화 30일차 세포의 폐포 세포 특이적 유전자(EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C 및 CD90) 발현 정도를 측정한 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석 결과 그래프를 나타낸 도이다.
도 4d는 분화 20일차에 3차원 배양으로 변경한 분화 30일차 세포의 폐포 세포 특이적 유전자(EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C 및 CD90) 발현 정도를 측정한 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석 결과 그래프를 나타낸 도이다.
도 5a는 3차원 폐 오가노이드의 가지 구조를 포함하는 폐포 구조 사진을 낱나낸 도이다.
도 5b는 3차원 폐 오가노이드의 가지 구조 단면의 벌집모양 구조 사진을 나타낸 도이다.
도 5c는 3차원 폐 오가노이드의 폐포 세포 특이적 단백질 발현을 확인한 면역형광염색 사진이다.
도 5d는 폐포 특이적 라멜라체(lamellar body)를 포함하는 3차원 폐 오가노이드의 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 사진이다.
도 6a는 3차원 폐 오가노이드의 분화 30일차의 폐포 대식세포 특이적 단백질의 발현을 확인한 FACS 결과 그래프이다.
도 6b는 분화 60일차의 폐포 대식세포 특이적 단백질의 발현을 확인한 FACS 결과 그래프이다.
도 6c는 분화 1년차의 폐포 대식세포 특이적 단백질의 발현을 확인한 FACS 결과 그래프이다.
도 7a는 1차 항체 없이 2차 항체만을 이용하여 사용된 항체의 비특이적 반응이 없음을 확인한 사진이다.
도 7b는 제2형 폐포 세포 마커인 pro-surfactant protein C 염색 사진을 나타낸 도이다.
도 7c는 제1형 폐포 세포 마커인 PDPN 염색 사진을 나타낸 도이다.
도 7d는 폐포 대식세포 마커인 CD68 염색 사진을 나타낸 도이다.
도 8a는 분화 10개월차 3차원 폐 오가노이드에 대한 외관 사진을 나타낸 것이다.
도 8b는 분화 10개월차 3차원 폐 오가노이드의 H&E 염색 사진이다.
도 9는 분화 85일차 3차원 폐 오가노이드의 A 타입, B 타입 및 M 타입 형태 사진이다.
도 10a는 분화 85일차 3차원 폐 오가노이드의 A 타입, B 타입 및 M 타입 형태에 따른 호흡기계 발달 관련 유전자들의 RNA 서열분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 10b는 분화 85일차 3차원 폐 오가노이드의 A 타입, B 타입 및 M 타입 형태에 따른 대식세포 관련 유전자들의 RNA 서열분석 결과를 나타낸 것으로, 대식세포 관련 유전자(CD68)의 발현이 폐 오가노이드에서 강하게 나타남을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 줄기세포를 완전 내배엽(definitive endoderm, DE) 세포 및 중내배엽(mesoendoderm) 세포를 포함하도록 분화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포 및 중내배엽 세포를 2차원 배양용기에서 배양하여 전방 전장 내배엽(anterior foregut endoderm, AFE) 세포로 분화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 AFE 세포를 2차원 배양용기에서 배양하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 배양된 세포를 3차원 배양용기에서 배양하는 단계;
를 포함하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell) 또는 성체 줄기세포(adult stem cell)일 수 있고, 인간 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 완전 내배엽 세포는 전체 세포 중 50 내지 90% 함유될 수 있고, 구체적으로 50 내지 80% 함유될 수 있으며, 더 구체적으로는 70 내지 80% 함유될 수 있다.
상기 중내배엽 세포는 완전 내배엽 세포의 마커인 CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)를 발현하지 않는 세포들 중 10 내지 40% 함유될 수 있고, 구체적으로 10 내지 30% 함유될 수 있으며, 더 구체적으로는 15 내지 25% 함유될 수 있다.
상기 분화는 세포의 미세환경 모사를 위해 마트리겔이 코팅된 배양용기에서 줄기세포를 분화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 코팅된 배양용기가 사용될 수 있다.
상기 단계 1)의 분화는 2 내지 6일 동안, 바람직하게는 3 내지 6일 동안 또는 더 바람직하게는 4 내지 6일 동안 수행될 수 있다.
상기 단계 2)의 배양은 전방화(anteriorization) 배지에서 이루어진다.
상기 전방화 배지는 TGF-β(transforming growth factor beta) 신호전달 경로 억제제 및 Wnt 신호전달 경로 억제제를 포함하고, 이를 이용하여 전방 전장 내배엽 세포로 분화시킬 수 있고, 구체적으로 상기 TGF-β 신호전달 경로 억제제는 SB431542 및 Noggin일 수 있고, Wnt 신호전달 경로 억제제는 IWP-2, IWP-3 또는 IWP-4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SB431542는 하기 화학식으로 표시되고, 상기 배지에 8 내지 20 μM 바람직하게는 8 내지 15 μM 또는 더 바람직하게는 5 내지 15 μM로 포함될 수 있다.
Figure PCTKR2019018219-appb-I000001
상기 Noggin은 상기 배지에 50 내지 150 ng/㎖, 바람직하게는 80 내지 150 ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 80 내지 120 ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 IWP-2(Inhibitor of Wnt production-2), IWP-3(Inhibitor of Wnt production-3) 또는 IWP-4(Inhibitor of Wnt production-4)는 상기 배지에 0.2 내지 2 μM, 바람직하게는 0.5 내지 2 μM 또는 더 바람직하게는 0.8 내지 2 μM로 포함될 수 있다.
상기 단계 3)의 배양은 마트리겔이 포함된 LO(Lung Organoid formation) 배지에서 이루어진다.
또한, 상기 LO 배지는 GSK-3β(glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제, 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 폐 분지형태 증식 억제제 및 폐포 재생 활성화제를 포함하는 배지를 이용하여 포함하며, 구체적으로 상기 GSK-3β 억제제는 CHIR 99021, 섬유아세포 성장 인자는 FGF10 및 FGF7/KGF(keratinocyte growth factor), 폐 분지형태 증식 억제제는 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 폐포 재생 활성화제는 all-trans retinoic acid일 수 있고, 상기 골형성 단백질은 보다 구체적으로 BMP4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CHIR 99021은 하기 화학식의 구조를 가지고, 상기 배지에 0.5 내지 10 μM, 바람직하게는 0.8 내지 10 μM 또는 더 바람직하게는 1.5 내지 10 μM로 포함될 수 있다.
Figure PCTKR2019018219-appb-I000002
상기 FGF10(Fibroblast Growth Factor 10)은 상기 배지에 8 내지 20 μM, 바람직하게는 8 내지 15 μM 또는 더 바람직하게는 5 내지 15 μM로 포함될 수 있다.
상기 FGF7/KGF(Fibroblast growth factor 7/keratinocyte growth factor)는 상기 배지에 8 내지 20 ng/㎖, 바람직하게는 8 내지 15 ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 5 내지 15 ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)는 상기 배지에 8 내지 20 ng/㎖, 바람직하게는 8 내지 15 ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 5 내지 15 ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 all-trans retinoic acid는 상기 배지에 20 내지 80 nM, 바람직하게는 30 내지 80 nM 또는 더 바람직하게는 40 내지 80 nM로 포함될 수 있다.
상기 단계 4)의 배양은 마트리겔이 포함되지 않은 LO(Lung Organoid formation) 배지에서 이루어진다.
상기 단계 2)의 2차원 배양 용기에서의 배양은 분화 3 내지 7일차 바람직하게는 분화 4 내지 6일차, 더 바람직하게는 분화 4 내지 5일차부터 시작하여 1 내지 7일 동안, 1 내지 5일 동안 또는 1 내지 4일 동안 수행될 수 있다.
상기 단계 3)의 2차원 배양 용기에서의 배양은 분화 5 내지 15일차 바람직하게는 분화 6 내지 12일차, 더 바람직하게는 분화 7 내지 10일차부터 시작하여 5 내지 20일 동안, 7 내지 15일 동안 또는 10 내지 14일 동안 수행될 수 있다.
상기 3차원 용기에서의 배양은 분화 15 내지 25일차 바람직하게는 분화 18 내지 23일차, 더 바람직하게는 분화 19 내지 21일차부터 시작하여 10일 내지 1년 동안, 15일 내지 6개월 동안 또는 20일 내지 30일 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폐 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)를 DE 세포 및 중내배엽 세포를 포함하도록 분화시키고, 이를 마트리겔이 코팅된 배양용기에서 마트리겔이 포함된 전방화 배지를 이용하여 AFE 세포로 분화시키고, 분화 20일차에 이를 3차원 배양용기로 옮겨 마트리겔이 포함되지 않은 LO 배지를 이용하여 배양함으로써 폐 오가노이드를 제조하였다(도 1a 참조).
제조한 폐 오가노이드를 20일차에 3차원 배양으로 변경한 세포의 경우 그렇지 않은 경우에 다발 모양의 세포 집합체를 형성하는 것에 비하여 3차원의 구형의 모양을 형성하는 것을 확인하여 3차원 배양이 꼭 필요함을 확인하였다(도 1b 및 도 1c).
또한, 본 발명자들은 줄기세포를 완전 내배엽 세포의 마커인 CXCR4를 발현하는 세포가 70 내지 80% 의 비율을 차지할 때까지 배양한 후, CXCR4를 발현하지 않는 세포들 중 중내배엽 세포의 마커인 EpCAM(-) CD56(+)를 발현하는 세포가 약 20% 포함하여야 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드를 제조할 수 있음을 확인하였다(도 2a 및 도 2b 참조).
또한, 본 발명자들은 폐 조직 특이적 유전자의 발현이 분화 20일차 이후 3차원 배양으로 변경한 폐 오가노이드의 경우에 가장 높음을 확인하였다(도 3).
또한, 본 발명자들은 분화 30일차의 폐 오가노이드에서 폐포 상피세포 마커, 제1형 폐포 상피세포 마커, 제2형 폐포 상피세포마커, 등이 발현됨을 확인하였다(도 4a 내지 도 4d).
또한, 본 발명자들은 제조한 폐 오가노이드가 인간의 폐 모양처럼 가지구조를 형성하고, 폐포모양을 형성함과(도 5a), 인간의 폐포 구조와 유사하게 얇은 막을 이루는 세포로 둘러싸인 벌집과 같은 구조로 이루어져 있음을 확인하였으며(도 5b), 폐포 세포 특이적 단백질을 발현하는 것과(도 5c), 폐포 특이적 라멜라체가 형성된 것을 관찰하였다(도 5d).
또한, 본 발명자들은 분화 30일, 60일 및 1년차의 폐 오가노이드에서 폐포 대식세포 특이적인 마커가 발현하는 것을 확인하여 제조한 폐 오가노이드 내에 폐포 대식세포가 존재함을 확인하였다(도 6a 내지 도 6c).
또한, 본 발명자들은 분화 70일차의 폐 오가노이드에서 제2형 폐포 상피세포 마커인 pro-surfactant protein c가 발현됨과(도 7b), 제1형 폐포 상피세포 마커인 PDPN이 발현되는 것과(도 7c), 폐포 대식세포의 마커인 CD68이 발현되는 것(도 7d)을 확인하여, 본 발명의 폐 오가노이드는 제1형 및 제2형 폐포 상피세포 뿐만 아니라 폐포 대식세포도 포함하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 분화 10개월차의 폐 오가노이드에서 인간의 폐포 구조와 유사한 얇은 막으로 둘러싸인 내강 및 얇은 막을 형성하는 상피세포가 존재함을 확인하였다(도 8a 및 도 8b 참조).
또한, 본 발명자들은 제조한 폐 오가노이드의 형태에 따른 유전자 발현 패턴을 확인하고, 투명한 폐포 형태를 나타내는 A 타입 폐 오가노이드에서 폐포 대식세포 관련 유전자인 CD68의 발현이 강하게 나타나는 것을 확인하여, 제조한 폐 오가노이드가 폐포 대식세포를 포함하는 것을 확인하였다(도 9, 도 10a 및 도 10b 참조).
따라서, 본 발명에 따른 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드는 기존의 면역세포를 포함하지 못하는 폐 오가노이드와 달리 감염 또는 염증 반응을 구현하여 관련 폐 질환의 기전 연구, 바이오마커 발굴, 치료제 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 3차원 폐 오가노이드의 제조
<1-1> 플레이트의 코팅
세포 외 미세환경을 모사할 수 있는 마트리겔(Matrigel) 매트릭스(Matrix)(Matrigel-hESC qualified Matrix, Cat. #. 354277, Corning, 미국)를 차가운 DMEM/F12 배지(Cat. #. 11330-032, Gibco, 미국)를 이용하여 200배 희석한 후(최종 마트리겔 농도: 250 내지 290 ㎕/500㎖), 4-웰 플레이트에 웰 당 400 ㎕로 넣어 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃의 인큐베이터에서 1 시간 동안 코팅하였다.
<1-2> 분화 -1일차
먼저, 세포 배양용 플레이트에 웰당 10 ㎍의 비트로넥틴 XF(Vitronectin XF, Cat#.07180, Stem cell technologies)를 첨가하여, 플레이트의 웰을 코팅하였다. 코팅된 플레이트에 인간 만능 줄기세포인 H9 세포주(Wicell, WA09-FD)를 웰당 2㎖의 TeSR™-E8™ 배지(Cat#.05940, Stem cell technologies)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 준비하였다. 이때, 계대배양 기간 동안에는 배지를 매일 교체하였다.
배양된 H9 세포(WiCell, 미국)의 배양액을 제거한 후, 0.5 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 웰 당 1 ㎖씩 넣고 5% CO2가 유지되는 37℃의 배양기에서 5 내지 7분간 반응시켰다. 이후, EDTA를 제거하고 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제(Y-27632, Cat. #. 04-0012-02, Stemgent, 미국)가 10 μM로 첨가된 줄기세포 배양액(TeSRTM-E8TM medium)을 웰 당 1 ㎖씩 넣고 파이펫팅하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 계수한 후 ROCK 억제제 10 μM 및 마트리겔(200배 희석)이 첨가된 mTeSRTM-1 배지(Cat. #. 5850, STEMCELL Technologies, 캐나다)에 희석하고, 실시예 1-1에서 코팅한 6-웰 플레이트에 1.25 × 105 개/웰로 시딩(seeding)하여 배양을 시작하였다.
<1-3> 분화 0일차
배지를 제거하고, DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척한 후, 하기 표 1의 조성을 가지는 DE-1 배지(DE basal medium)를 웰 당 2 ㎖씩 넣어 24시간 동안 배양하였다.
DE-1 배지의 조성(10㎖)
DMEM/F12 (9.597 ㎖)
1× N2 supplement(Cat. #. 17502048, Gibco) (100㎕)
1× B27 supplement(Cat. #. 17504-044, Gibco) (200㎕)
1×P/S(Penicillin/streptomycin) (Cat. #. 15140-122, Gibco) (100 ㎕)
50 ng/㎖ Activin A (Cat. #.338-AC, R&D system, 100㎕/ml stock) (5㎕)
0.5mM sodium butyrate(Cat. #. 303410, Sigma , 1M stock) (5㎕)
3 μM CHIR 99021(Cat. #. S1263, Selleckchem, 10mM stock) (3㎕)
<1-4> 분화 1 내지 3일 또는 4일차-줄기세포를 완전 내배엽 세포(definitive endodrem, DE) 및 중내배엽 세포(mesoendoderm)를 포함하도록 분화
배지를 제거하고, 하기 표 2의 조성을 가지는 DE-2 배지를 웰 당 2 ㎖씩 넣어 24시간 동안 배양하고, 24시간 마다 배지를 교체해 주었다. 분화를 시작한지 4일 또는 5일에 DE(완전 내배엽 세포)의 마커인 CXCR4가 70 내지 80% 발현된 것을 확인하면, 하기 실시예 1-5의 단계를 진행한다.
DE-2 배지의 조성(10㎖)
DMEM/F12 (9.587 ㎖)
1× N2 supplement(Cat. #. 17502048, Gibco) (100㎕)
1× B27 supplement(Cat. #. 17504-044, Gibco) (200㎕)
1×P/S(Penicillin/streptomycin) (Cat. #. 15140-122, Gibco) (100 ㎕)
50 ng/㎖ Activin A (Cat. #.338-AC, R&D system, 100㎕/ml stock) (5㎕)
0.5mM sodium butyrate(Cat. #. 303410, Sigma , 1M stock) (1㎕)
<1-5> 분화 4일 또는 5일차-완전 내배엽 세포(definitive endodrem, DE) 및 중내배엽 세포(mesoendoderm)를 전방 전장 내배엽 세포(anterior foregut endoderm)로 분화
배지를 제거하고, DPBS로 세척한 후, 세포의 해리에 사용되는 재조합 효소인 TrypLETM Express(Gibco, Cat#:12604013)를 넣어 3 내지 5분 동안 배양하였다. 이후, TrypLETM Express를 제거하고, DPBS를 넣어 세포를 모아 1,300 rpm에서 5분간 원심분리 후, DPBS를 제거하고, 마트리겔이 포함된 전방화(anteriorization)-1 배지(표 3) 1 ㎖를 넣어 현탁시켰다. 상기 세포를 계수한 후 전방화-1 배지로 희석하여 실시예 1-1에서 코팅한 6웰 플레이트에 5 내지 9 × 105개/웰로 시딩하고, 24시간 동안 배양하였다.
전방화-1 배지의 조성 (5㎖)
DMEM/F12 (4.790 ㎖)
1× N2 supplement(Cat. #. 17502048, Gibco) (50㎕)
1× B27 supplement(Cat. #. 17504-044, Gibco) (100㎕)
1× P/S(Penicillin/Streptomycin) (Cat. #. 15140-122, Gibco) (50㎕)
100 ng/㎖ Noggin(Cat. #. 120-10C, Peprotech, 100㎍/㎖ stock) (5㎕)
10 μM SB431542(Cat. #. S1067, Selleckchem, 10mM stock) (5㎕)
1/200 마트리겔
<1-6> 분화 6일차-완전 내배엽 세포(definitive endodrem, DE) 및 중내배엽 세포(mesoendoderm)를 전방 전장 내배엽 세포(anterior foregut endoderm)로 분화
배지를 제거하고, 마트리겔이 포함된 전방화-2 배지(표 4)를 웰 당 2 ㎖씩 넣어 48시간 동안 배양하였다.
전방화-2 배지의 조성 (5㎖)
DMEM/F12 (4.8 ㎖)
1× N2 supplement(Cat. #. 17502048, Gibco) (50㎕)
1× B27 supplement(Cat. #. 17504-044, Gibco) (100㎕)
1× P/S(Penicillin/Streptomycin)(Cat. #. 15140-122, Gibco) (5㎕)
1 μM IWP-4(Cat. #. 04-0036, Stemgent, 1mM stock) (5㎕)
10 μM SB431542(Cat. #. S1067, Selleckchem, 10mM stock) (5㎕)
1/200 마트리겔
<1-7> 분화 8 내지 20일차
배지를 제거하고, 마트리겔이 포함된 폐 오가노이드 형성 배지(Lung organoid formation (LO) medium, 표 5)를 웰 당 2 ㎖씩 넣어 배양하였고, 2일 마다 기존 배지의 반을 새로운 배지로 교체하였다.
LO 배지의 조성 (50㎖)
DMEM/F12 (47.965 ㎖)
1× N2 supplement(Cat. #. 17502048, Gibco) (500㎕)
1× B27 supplement(Cat. #. 17504-044, Gibco) (1㎖)
1× P/S(Penicillin/Streptomycin) (5 ㎖)
3 μM CHIR 99021(Cat. #. S1263, Selleckchem, 10mM stock) (15㎕)
10 ng/㎖ FGF10(Cat. #. 100-26, Peprotech, 100㎍/㎖ stock) (5㎕)
10 ng/㎖ FGF7/KGF(Cat. #. 100-19, Peprotech, 100㎍/㎖ stock) (5㎕)
10 ng/㎖ BMP4(Cat. #. 120-05, Peprotech, 100㎍/㎖ stock) (5㎕)
50 nM All-trans Retinoic acid(Cat. #. 0695, R&D Systems, 500μM stock) (5㎕)
1/200 마트리겔
<1-8> 분화 20일차 및 그 이후: 3차원 배양
Day 20에 세포를 모아 저 부착 플레이트(low attachment plate)에 옮겨 상기 표 3의 LO 배지의 조성 중 마트리겔만이 포함되지 않은 LO 배지로 배양하였다. 배양 기간 동안 2일마다 기존 배지의 반을 새로운 배지로 교체하였다. 상기 3차원 배양 과정을 통하여 최종적으로 3차원 폐 오가노이드를 형성하였다.
<실험예 1> 2차원 배양 및 분화 20일차 이후 3차원 배양의 세포 형태 확인
hPSC 세포의 분화 과정에서 20일차 이후에도 계속해서 2차원 배양한 경우와 20일차 이후에 3차원 배양으로 변경한 경우의 세포 형태를 사진을 찍어 관찰하였다.
구체적으로, 분화 0일차, 1일차, 5일차, 6일차, 7일차, 9일차 및 13일차의 세포 사진, 2차원 배양을 지속한 경우의 분화 26일차, 30일차 및 33일차의 세포 사진, 및 분화 20일차에 3차원 배양으로 변경한 경우의 분화 32일차, 35일차, 52일차, 65일차 및 85일차의 세포 사진을 현미경으로 찍고, 세포 모양을 관찰하였다.
그 결과, 33일차까지 2차원 배양법으로 분화시킨 경우, 다발 모양의 세포 집합체가 관찰된 반면, 분화 20일차에 3차원 배양법으로 변경한 후 마트리겔이 없는 상태로 분화시킨 세포들은 3차원인 구형으로 실제 폐포 세포의 형태와 유사한 모양으로 분화되었음을 확인하였다(도 1b 및 1c).
<실험예 2> 분화 4일 또는 5일차의 CXCR4 마커 발현 확인 및 중내배엽(mesoendoderm) 세포의 마커 발현 확인
분화 4일 또는 5일째가 되어 완전내배엽(DE)의 마커인 CXCR4를 발현하는 세포의 비율이 70 내지 80%가 되었을 때 세포 표면에 CXCR4, EpCAM, CD56을 염색하고 유세포 분석기로 분화 정도를 분석하였다.
구체적으로, 분화 4일 또는 5일째 세포의 배지를 제거하고, DPBS로 세척한 후, TrypLETM Express를 넣어 3 내지 5분 동안 배양하였다. 이후, TrypLETM Express를 제거하고, DPBS를 넣어 세포를 모아 1,300 rpm에서 5분간 원심분리 후, DPBS를 제거하고, FACS 완충용액에 현탁하였다. 1×104 내지 1×105개의 세포에 항체(CXCR4, cat. #. 551510, BD pharmigen; EpCAM, Cat. #. 324204, Biolegend; CD56, Cat. #. 555518, BD pharmigen)를 각각 2 ㎕씩 넣고 실온에서 15분 내지 20분 반응시킨다. 그 후 3,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 새로운 FACS 완충용액 1㎖를 첨가하고, 동일한 과정을 두 번 반복하였다. 마지막 원심분리 이후, 상층액을 제거하고 새로운 FACS 완충용액을 넣어준 다음 펠렛을 잘 풀어준다. 4% 파라포름알데하이드 300㎕ 넣어준 다음 잘 교반하여 유세포 분석기(Cytoflex, Beckman Coulter)를 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 완전내배엽(DE)의 마커인 CXCR4를 발현하는 세포의 비율이 70 내지 80%가 되었을 때, CXCR4를 발현하지 않는(CXCR4-)세포들 중 EpCAM-CD56+ 세포가 15 내지 25% 존재함을 확인하였다(도 2b). 이는 기존 다른 논문에서 CXCR4를 발현하는 (CXCR4+) 세포만을 분리 (FACS sorting)하여 오가노이드를 제작한 반면, 본 발명에서 제작한 오가노이드에는 분화 4-5일째에서 중내배엽(EpCAM-CD56+)세포를 포함하는 CXCR4- 와 CXCR4+ 세포 전체를 분화시켰다.
<실험예 3> 본 발명의 3차원 폐 오가노이드의 폐 조직 특이적 유전자 발현 확인
본 발명의 3차원 폐 오가노이드의 폐 조직 특이적 유전자 발현 정도를 분화 기간 및 3차원 배양 유무에 따라 비교하기 위하여, 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1의 3차원 폐 오가노이드 제조 과정 중 분화 0일차, 5일차 및 20일차의 세포, 분화 20일차 이후 2차원 배양을 지속한 분화 30일차의 세포, 및 분화 20일차 이후 3차원 배양으로 변경한 분화 30일차의 폐 오가노이드로부터 각각 RNA를 분리하였다. 각 RNA로부터 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 cDNA 합성 키트(Primescript 1 strand cDNA synthesis kit, Cat. #. 6110A, TAKARA, 일본)를 사용하여 합성한 후, 하기 표 6의 프라이머들을 및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Power SYBR Green PCR Master Mix, Cat. #. 4367659, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 qPCR을 수행하였다(StepOnePlus, Applied Biosystems). qPCR 반응은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분 과정을 40번 반복하고 마지막으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 및 95℃에서 15초로 설정하여 수행하였다.
프라이머명 서열(5'→3') 서열번호
hNkx2.1 forward CGGCATGAACATGAGCGGCAT 1
hNkx2.1 reverse GCCGACAGGTACTTCTGTTGCTTG 2
hP63 forward CCTATAACACAGACCACGCGCAGAA 3
hP63 reverse GTGATGGAGAGAGAGCATCGAAG 4
hSox9 forward GTACCCGCACTTGCACAAC 5
hSox9 reverse TCTCGCTCTCGTTCAGAAGTC 6
hMucin5AC forward GCACCAACGACAGGAAGGATGAG 7
hMucin5AC reverse CACGTTCCAGAGCCGGACAT 8
hHOPX forward GCCTTTCCGAGGAGGAGAC 9
hHOPX reverse TCTGTGACGGATCTGCACTC 10
hSFTPA forward GTGCGAAGTGAAGGACGTTTGTGT 11
hSFTPA reverse TTTGAGACCATCTCTCCCGTCCC 12
그 결과, 폐 조직 특이적 유전자인 NKX2.1, P63, Sox9, Mucin 5Ac, HOPX 및 SFTPA의 발현이 분화 20일차 이후 3차원 배양으로 변경한 분화 30일차의 폐 오가노이드에서 가장 높게 나타났다(도 3). 이는 본 발명에 따른 폐 오가노이드가 실제 폐 조직과 매우 유사한 특성을 나타냄을 제시한다.
<실험예 4> 본 발명의 3차원 폐 오가노이드의 폐 조직 특이적 단백질 발현 확인
본 발명의 3차원 폐 오가노이드의 폐 조직 특이적 단백질 발현 정도를 분화 기간 및 3차원 배양 유무에 따라 비교하기 위하여, FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1의 분화 10일차, 20일차 및 분화 20일차 이후 2차원 배양을 유지한 분화 30일차의 세포는 각각 TrypLETM Express 시약(Cat. #. 12604013, Gibco) 1 ㎖을 첨가하고 상온에서 5분간 반응시킨 후, FACS 버퍼(5% FBS, 0.1% sodium azide in DPBS)로 세척하였고, 분화 20일차에 3차원 배양으로 변경한 분화 30일차의 폐 오가노이드에는 10 ㎎/㎖의 제2형 콜라게나아제(collagenase type II, STEMCELL TECHNOLOGIES)를 첨가하고 37℃에서 20분씩 3번 반응시킨 후, FACS 버퍼로 세척하였다. 이후, FACS 기기(FACSAria II, Becton Dickinson and Company, 미국)를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 분화 10일차 세포에서는 분화 초기에 발현되는 마커인 EpCAM, c-Kit, CXCR4, Pro-surfactant protein C 및 CD90의 발현이 높게 나타난 반면, 이들 마커의 발현은 분화가 진행될수록 감소하였고, 분화 20일차에 3차원 배양으로 변경한 분화 30일차의 폐 오가노이드에서 폐 조직 특이적 단백질인 Sox9(폐포 상피세포 마커), PDPN(제1형 폐포 상피세포 마커), Mucin(goblet cell 마커), Surfactant protein C(제2형 폐포 상피세포 마커) 및 P63(basal cell 마커) 등이 발현됨을 확인하였다(도 4).
<실험예 5> 본 발명의 3차원 폐 오가노이드의 폐포 구조 유사 형태 확인
본 발명의 3차원 폐 오가노이드가 실제 인간의 폐 구조와 유사한 정도를 하기 실험들을 통한 형태 분석으로 확인하였다.
<5-1> 3차원 폐 오가노이드의 폐포 구조 확인
본 발명의 3차원 폐 오가노이드의 폐포 구조 유사 형태를 현미경으로 관찰하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 분화 20일차의 배양 세포를 마트리겔과 1 : 1의 부피 비로 혼합하여 트랜스-웰(trans-well)의 내부 챔버(inner chamber)에 시딩하여 배양하고, 배양된 폐 오가노이드를 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 마트리겔 안에서 폐 오가노이드는 인간의 폐 모양처럼 가지를 형성(branching)하고 폐포 모양을 형성함을 확인하였다(도 5a).
<5-2> 3차원 폐 오가노이드의 폐포 구조 단면 확인
실험예 5-1의 3차원 폐 오가노이드의 가지 구조의 단면을 확인하고자, DAPI 염색을 수행하였다.
구체적으로, 실험예 4-1의 3차원 폐 오가노이드를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)로 고정시킨 후, 동결절편 포매제(FSC22 Clear Frozen section compound, Cat. #. 3801480, Leica Biosystems, 독일)를 넣은 동결절편 몰드에 올려놓은 후, 다시 동결절편 포매제로 덮어준 다음 -20℃에서 동결시켰다. 동결된 시료를 동결 마이크로톰(microtome)을 이용하여 8 ㎛ 두께의 절편으로 만든 후, 슬라이드에 올려 건조시켰다. 이후, DAPI 염색 시약(NucBlueTM Fixed Cell Stein Ready ProbesTM reagent, Cat. #. R37606, Invitrogen, 미국) 한 방울을 1 ㎖의 PBS에 희석한 희석액 200 ㎕를 폐 오가노이드 시료 위에 올리고, 5분간 반응시킨 후, 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.
그 결과, 3차원 폐 오가노이드는 인간의 폐포 구조와 유사하게 얇은 막을 이루는 세포로 둘러싸인 벌집과 같은 구조로 이루어져 있음을 확인하였다(도 5b).
<5-3> 3차원 폐 오가노이드의 폐포 세포 특이적 단백질 발현 확인
실험예 5-1의 3차원 폐 오가노이드의 폐포 세포 특이적 단백질 발현을 면역형광염색(immunofluorescence)으로 확인하였다.
구체적으로, 실험예 5-1의 3차원 폐 오가노이드를 4% PFA로 고정시킨 후, PBS로 세척하고, 0.5% 트리톤 X-100 용액(Triton X-100 in PBS)으로 5분간 투과화(permeabilization)한 후, 0.1% 트리톤 X-100 용액으로 3번 세척하였다. 0.1% 트리톤 X-100 용액에 용해시킨 2% BSA(bovine serum albumin) 용액에 항-surfactant protein B 항체(Cat. #. sc-133143, Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 항-Sox9 항체(Cat. #. ab185966, abcam, 영국)를 희석하여 상기 시료와 4℃에서 18 내지 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 0.1% 트리톤 X-100 용액으로 3번 세척한 후, 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척한 후, DAPI로 염색하고, 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 3차원 폐 오가노이드는 폐포 세포 특이적 단백질인 surfactant protein B 및 Sox9을 발현함을 확인하였다(도 5c).
<5-4> 3차원 폐 오가노이드의 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 사진 확인
실험예 5-1의 3차원 폐 오가노이드의 구조를 TEM 사진을 찍어 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 3차원 폐 오가노이드에 폐포 특이적 라멜라체(lamellar body)가 관찰되었다(도 5d).
<실험예 6> 본 발명의 3차원 폐 오가노이드 내의 폐포 대식세포 확인 (1)
본 발명의 3차원 폐 오가노이드 내에 폐포 대식세포가 분화되었는지 여부를 FACS 분석으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 분화 30일차, 60일차 및 1년차의 3차원 폐 오가노이드에서 인간 폐포 대식세포 마커인 HLA-DR, CD11b, CD11c, CD68, CD64 및 CD206에 대한 각 항체(anti-hHLA-DR-PE, Cat. #. 556644, BD Pharmingen, 미국; anti-hCD11b-PerCP-Cy5.5, Cat. #. 301418, Biolegend, 미국; anti-hCD11c-PE-Cy7, Cat. #. 561356, BD Pharmingen; anti-hCD68-FITC, Cat. #. 333806, Biolegend; anti-hCD64-APC, Cat. #. 305014, Biolegend; 및 anti-hCD206-APC/Cy7, Cat. #. 321120, Biolegend)를 이용하여 상기 실험예 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 제조한 3차원 폐 오가노이드에서 인간 폐포 대식세포 마커의 발현을 확인하여, 분화 30일차, 60일차 및 1년차의 3차원 폐 오가노이드에서 분화된 폐포 대식세포가 존재함을 확인하였다(도 6).
<실험예 7> 본 발명의 3차원 폐 오가노이드 내의 폐포 대식세포 확인 (2)
본 발명의 3차원 폐 오가노이드 내에 폐포 대식세포가 분화되었는지 여부를 면역형광염색으로 확인하였다
구체적으로, 분화 70일차의 폐 오가노이드를 실험예 5-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역형광염색을 수행하였다. 제2형 폐포 세포 마커인 pro-surfactant protein C에 대한 1차 항체(anti-pro-surfactant protein C rabbit antibody, Cat. #. 400879, abcam) 및 폐포 대식세포 마커인 CD68에 대한 1차 항체(anti-hCD68 mouse antibody, Cat. #. ab201340, abcam)로 이중 염색(double staining)을 한 후, 세척한 다음 형광 2차 항체인 Alexa Fluor 488 항-토끼 항체(Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG, Cat. #. A11034, Invitrogen) 및 Alexa Fluor 647 항-마우스 항체(Alexa Fluor 647 anti-mouse IgG, Cat. #. A21236, Invitrogen)와 반응시키고, 공초점 현미경(confocal microscope)으로 사진을 찍어 관찰하였다. 또한, 제1형 폐포 상피세포 마커인 PDPN에 대한 1차 항체(anti-PDPN rabbit antibody, Cat. #. sc-59347, Santa Cruz Biotechnology)와 반응시키고, 세척 후 Alexa Fluor 488 항-토끼 항체와 반응시켜 공초점 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다. 또한, 폐포 대식세포 마커인 CD68에 대한 1차 항체(anti-hCD68 mouse antibody, Cat. #. ab201340, abcam)와 반응시키고, 세척 후 Alexa Fluor 488 항-토끼 항체와 반응시켜 공초점 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 3차원 폐 오가노이드에서 제2형 폐포 상피세포의 마커인 Pro-surfactant protein C, 폐포 대식세포 마커인 CD68, 제1형 폐포 상피세포 마커인 PDPN의 발현을 확인하여, 제1형 및 제2형 폐포 상피세포도 발현됨과 동시에 폐포 대식세포도 발현됨을 확인하였다(도 7a 내지 도 7d).
<실험예 8> 분화 10개월차의 3차원 폐 오가노이드의 형태 및 구조 확인
분화 10개월차의 3차원 폐 오가노이드의 형태를 현미경으로 사진을 찍어 관찰하고, H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1의 3차원 폐 오가노이드를 분화 10개월차까지 배양하여 일반 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다. 또한, H&E 염색을 수행하기 위하여, 상기 3차원 폐 오가노이드를 4% PFA로 고정하고, PBS로 세척한 후, 70%, 90%, 95% 및 100% 알코올을 이용하여 순차적으로 탈수과정을 거친 후, 자일렌(xylene)으로 세척하고 파라핀으로 포매하였다. 파라핀으로 포매한 절편을 슬라이드에 부착하여 H&E 염색을 수행하고, 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.
그 결과, 분화 10개월차의 3차원 폐 오가노이드에 인간의 폐포 구조와 유사한 얇은 막으로 둘러싸인 내강 및 얇은 막을 형성하는 상피세포가 존재함을 확인하였다(도 8a 내지 도 8b).
<실험예 9> 3차원 폐 오가노이드 중 형태에 따른 유전자 발현 패턴 확인
본 발명에 따른 3차원 폐 오가노이드 중 형태에 따른 유전자 발현 패턴을 RNA 서열분석(RNA sequencing)으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1의 3차원 폐 오가노이드의 분화 85일차에 육안으로 뚜렷이 구분되는 3가지 형태에 따라 M 타입(multi-lineage, 동그란 구 형태), B 타입(brochioalveolar type, 분화하는 가지 형태를 포함하는 형태), 및 A 타입(alveolar type, 투명한 폐포처럼 생긴 형태)의 폐 오가노이드를 선택하여 호흡기계 관련 유전자들 및 대식세포 관련 유전자들의 RNA 서열분석을 수행하였다(respiratory system development related genes, GO #. 0060541).
그 결과, M 타입, B 타입 및 A 타입에 따라 유전자 발현 패턴이 다름을 확인하였으며, 특히 대식세포 관련 유전자(CD68)의 발현이 A 타입 폐 오가노이드에서 강하게 나타남을 확인하였다(도 9, 도 10a 및 도 10b).

Claims (18)

1) 줄기세포를 완전 내배엽(definitive endoderm, DE) 세포 및 중내배엽(mesoendoderm) 세포를 포함하도록 분화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포 및 중내배엽 세포를 2차원 배양용기에서 배양하여 전방 전장 내배엽(anterior foregut endoderm, AFE) 세포로 분화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 AFE 세포를 2차원 배양용기에서 배양하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 배양된 세포를 3차원 배양용기에서 배양하는 단계;
를 포함하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell) 또는 성체 줄기세포(adult stem cell)인, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포는 전체 세포 중 50 내지 90% 함유되는 것인, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포는 전체 세포 중 50 내지 80% 함유되는 것인, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포는 전체 세포 중 70 내지 80% 함유되는 것인, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 배양은 전방화(anteriorization) 배지에서 이루어지는 것인, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 전방화 배지는 TGF-β(transforming growth factor beta) 신호전달 경로 억제제 및 Wnt 신호전달 경로 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 TGF-β 신호전달 경로 억제제는 SB431542 또는 Noggin인 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달 경로 억제제는 IWP-2, IWP-3 또는 IWP-4인 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 배양은 마트리겔이 포함된 LO(Lung Organoid formation) 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 LO 배지는 GSK-3β(glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제, 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 폐 분지형태 증식 억제제 및 폐포 재생 활성화제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 GSK-3β 억제제는 CHIR 99021인 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자는 FGF10 및 FGF7/KGF인 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 폐 분지형태 증식 억제제는 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)인 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 폐포 재생 활성화제는 all-trans retinoic acid인 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 배양은 마트리겔이 포함되지 않은 LO(Lung Organoid formation) 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 3차원 배양은 분화 15 내지 25일차부터 수행되는 것을 특징으로 하는, 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드의 제조방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폐 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 폐포 대식세포를 포함하는 폐 오가노이드.
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