CN116622626A - 肺间质细胞以及化合物在肺上皮细胞和肺类器官中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了肺间质细胞以及化合物在肺上皮细胞和肺类器官中的应用。本申请的第一方面，提供分离的表达BDNF配体的肺间质细胞。申请人在实验过程中筛选到特异性表达脑源性神经营养因子(Brain‑Derived Neurotrophic Factor，BDNF)的肺间质细胞，单细胞测序和空间测序结果显示这类细胞对于近远端肺上皮细胞具有广泛的相互作用，特别是通过配体和近远端肺上皮细胞中的相应受体的相互作用。在对鉴定出的BDNF阳性的肺间质细胞的进一步实验中发现，其能够有效促进人肺上皮细胞的发育，以及近远端肺上皮细胞的特化。
Description
技术领域
本申请涉及肺上皮细胞技术领域，尤其是涉及肺间质细胞以及化合物在肺上皮细胞和肺类器官中的应用。
背景技术
包括间充质细胞(MSC)在内的不同类型间质细胞具有广阔的转化应用前景，可以用于改善体内细胞移植微环境、免疫调节与改进体外细胞培养、细胞治疗以及类器官诱导等等。在人肺发育的不同阶段，存在多种类型的间质细胞，对肺上皮细胞发育与功能特化、体内肺微环境调节起到重要调控与支持作用。在生物医学研究领域，已有报道发现成体肺中存在LGR5阳性间质细胞群(Kadur Lakshminarasimha Murthy,P.et al.Human distallung maps and lineage hierarchies reveal a bipotent progenitor.Nature,(2022).)，以及胚胎期存在NOTUM阳性间质细胞群(Lim,K.et al.Organoid modeling ofhuman fetal lung alveolar development reveals mechanisms of cell fatepatterning and neonatal respiratory disease.Cell Stem Cell 30,20-37(2023).)，分别对远端基底细胞与肺泡上皮细胞AT2的功能特化与成熟起到重要作用。
然而，这些研究并未确定在人肺器官发生过程起到关键作用的间质细胞，特别是在人肺器官发生过程能够促进人肺上皮细胞发育与近远端上皮细胞特化的间质细胞。而且，由于关键作用的间质细胞不确定，是否可以通过化合物实现细胞群体的一部分功能替代也不清楚。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种肺间质细胞以及化合物在肺上皮细胞和肺类器官中的应用。这一特定的肺间质细胞能够促进人肺上皮细胞发育与近远端上皮细胞特化，而这一化合物也能够有效促进人肺类器官存活、提高肺上皮类器官分支形成比例。
本申请的第一方面，提供分离的表达BDNF的肺间质细胞。
根据本申请实施例的细胞，至少具有如下有益效果：
申请人在实验过程中筛选到特异性表达脑源性神经营养因子(Brain-DerivedNeurotrophic Factor，BDNF)的肺间质细胞，单细胞测序和空间测序结果显示这类细胞对于近远端肺上皮细胞具有广泛的相互作用，特别是通过配体和近远端肺上皮细胞中的相应受体的相互作用。在对鉴定出的BDNF阳性的肺间质细胞的进一步实验中发现，其能够有效促进人肺上皮细胞的发育，以及近远端肺上皮细胞的特化。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞还表达BMP4(骨形态发生蛋白4)、WNT2(WNT家族成员蛋白2)、WNT2B(WNT家族成员蛋白2B)、FGF10(成纤维细胞生长因子10)、FGF9(成纤维细胞生长因子9)、LAMA5(层粘连蛋白α5亚单位)、NMU(神经调节肽U)中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞还表达BMP4、WNT2、WNT2B、FGF10、FGF9、LAMA5、NMU中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、全部七种。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞为胚肺间质细胞。在其它一些实施方式中，肺间质细胞也可以是不来源于形成或发育阶段的间质细胞，例如可以是成体肺间质细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞为哺乳动物源的肺间质细胞，例如可以是兔形目(如家兔)、啮齿目(如小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、豚鼠)、偶蹄目(如牛、绵羊、山羊、猪)、奇蹄目(如马)、食肉目(如狗、猫)、灵长目(如黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、人)等其中任一种哺乳动物源的肺间质细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞为人肺间质细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞为人胚肺间质细胞。在其它一些实施方式中，肺间质细胞也可以是人成体肺间质细胞。
在本申请的一些实施方式中，还提供分离的肺间质细胞群，其中至少1％的细胞表达BDNF；可选的，还表达BMP4、WNT2、WNT2B、FGF10、FGF9、LAMA5、NMU中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、全部七种。
在本申请的一些实施方式中，分离的肺间质细胞群中至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的细胞表达BDNF；可选的，还表达BMP4、WNT2、WNT2B、FGF10、FGF9、LAMA5、NMU中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、全部七种。
在本申请的一些实施方式中，分离的肺间质细胞群中1～10％、2～10％、3～10％、4～10％、5～10％、6～10％、7～10％的细胞表达BDNF；可选的，还表达BMP4、WNT2、WNT2B、FGF10、FGF9、LAMA5、NMU中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、全部七种。
在本申请的一些实施方式中，分离的肺间质细胞群中或还表达BMP4和WNT2，或还表达BMP4和WNT2B，或还表达BMP4和FGF10，或还表达BMP4和FGF9，或还表达BMP4和LAMA5，或还表达BMP4和NMU，或还表达WNT2和WNT2B，或还表达WNT2和FGF10，或还表达WNT2和FGF9，或还表达WNT2和LAMA5，或还表达WNT2和NMU，或还表达WNT2B和FGF10，或还表达WNT2B和FGF9，或还表达WNT2B和LAMA5，或还表达WNT2B和NMU，或还表达FGF10和FGF9，或还表达FGF10和LAMA5，或还表达FGF10和NMU，或还表达FGF9和LAMA5，或还表达FGF9和NMU，或还表达LAMA5和NMU，或还表达BMP4、WNT2和WNT2B，或还表达BMP4、WNT2和FGF10，或还表达BMP4、WNT2和FGF9，或还表达BMP4、WNT2和LAMA5，或还表达BMP4、WNT2和NMU，或还表达BMP4、WNT2B和FGF10，或还表达BMP4、WNT2B和FGF9，或还表达BMP4、WNT2B和LAMA5，或还表达BMP4、WNT2B和NMU，或还表达BMP4、FGF10和FGF9，或还表达BMP4、FGF10和LAMA5，或还表达BMP4、FGF10和NMU，或还表达BMP4、FGF9和LAMA5，或还表达BMP4、FGF9和NMU，或还表达BMP4、LAMA5和NMU，或还表达WNT2、WNT2B和FGF10，或还表达WNT2、WNT2B和FGF9，或还表达WNT2、WNT2B和LAMA5，或还表达WNT2、WNT2B和NMU，或还表达WNT2、FGF10和FGF9，或还表达WNT2、FGF10和LAMA5，或还表达WNT2、FGF10和NMU，或还表达WNT2、FGF9和LAMA5，或还表达WNT2、FGF9和NMU，或还表达WNT2、LAMA5和NMU，或还表达WNT2B、FGF10和FGF9，或还表达WNT2B、FGF10和LAMA5，或还表达WNT2B、FGF10和NMU，或还表达WNT2B、FGF9和LAMA5，或还表达WNT2B、FGF9和NMU，或还表达WNT2B、LAMA5和NMU，或还表达FGF10、FGF9和LAMA5，或还表达FGF10、FGF9和NMU，或还表达FGF10、LAMA5和NMU，或还表达FGF9、LAMA5和NMU，或还表达BMP4、WNT2、WNT2B和FGF10，或还表达BMP4、WNT2、WNT2B和FGF9，或还表达BMP4、WNT2、WNT2B和LAMA5，或还表达BMP4、WNT2、WNT2B和NMU，或还表达BMP4、WNT2B、FGF10和FGF9，或还表达BMP4、WNT2B、FGF10和LAMA5，或还表达BMP4、WNT2B、FGF10和NMU，或还表达BMP4、WNT2、FGF9和LAMA5，或还表达BMP4、WNT2、FGF9和NMU，或还表达BMP4、WNT2、LAMA5和NMU，或还表达BMP4、WNT2B、FGF10和FGF9，或还表达BMP4、WNT2B、FGF10和LAMA5，或还表达BMP4、WNT2B、FGF10和NMU，或还表达BMP4、WNT2B、FGF9和LAMA5，或还表达BMP4、WNT2B、FGF9和NMU，或还表达BMP4、WNT2B、LAMA5和NMU，或还表达BMP4、FGF10、FGF9和LAMA5，或还表达BMP4、FGF10、FGF9和NMU，或还表达BMP4、FGF10、LAMA5和NMU，或还表达BMP4、FGF9、LAMA5和NMU，或还表达WNT2、WNT2B、FGF10和FGF9，或还表达WNT2、WNT2B、FGF10和LAMA5，或还表达WNT2、WNT2B、FGF10和NMU，或还表达WNT2、FGF10、FGF9和LAMA5，或还表达WNT2、FGF10、FGF9和NMU，或还表达WNT2、FGF9、LAMA5和NMU，或还表达WNT2B、FGF10、FGF9和LAMA5，或还表达WNT2B、FGF10、FGF9和NMU，或还表达WNT2B、FGF10、LAMA5和NMU，或还表达WNT2B、FGF9、LAMA5和NMU，或还表达FGF10、FGF9、LAMA5和NMU。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞群为胚肺间质细胞群。在其它一些实施方式中，肺间质细胞群也可以是不来源于形成或发育阶段的间质细胞群，例如可以是成体肺间质细胞群。
在本申请的一些实施方式中，胚肺间质细胞群为哺乳动物源的肺间质细胞群，例如可以是兔形目(如家兔)、啮齿目(如小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、豚鼠)、偶蹄目(如牛、绵羊、山羊、猪)、奇蹄目(如马)、食肉目(如狗、猫)、灵长目(如黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、人)等其中任一种哺乳动物源的肺间质细胞群。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞群为人肺间质细胞群。
在本申请的一些实施方式中，肺间质细胞群为人胚肺间质细胞群。在其它一些实施方式中，肺间质细胞群也可以是人成体肺间质细胞群。
本申请的第二方面，提供一种肺间质细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
在培养基中培养多能干细胞，获取肺间质细胞；
分离出表达BDNF的肺间质细胞。
或，肺间质细胞的制备方法也可以包括以下步骤：
从肺或肺组织分离得到表达BDNF的肺间质细胞。
在本申请的一些实施方式中，所述的肺或肺组织选自胚肺。
在本申请的一些实施方式中，所述的胚肺来自4-8周的哺乳动物源的胚肺组织。
本申请的第三方面，提供一种组合物，该组合物包括前述任一种肺间质细胞，或组合物的制备原料包括前述任一种肺间质细胞。以上述任一种肺间质细胞作为制备原料制备得到的组合物具体可以是上述肺间质细胞培养得到的上清，或上清的浓缩产物，或上清的干燥产物，或由上述产物等为活性成分并添加本领域常用的配料、添加剂等成分得到的产品。
本申请的第四方面，提供前述任一种肺间质细胞，或前述任一种组合物在制备促进肺上皮细胞存活、增殖、分化或改善肺部细胞或组织微环境的产品中的应用。
在本申请的一些实施方式中，分化包括近端分化和远端分化中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮细胞的近远端分(特)化包括肺上皮细胞分(特)化为近端肺上皮细胞或远端肺上皮细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮细胞分化为气道上皮、肺泡上皮中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮细胞为肺上皮细胞群、肺组织、肺器官、肺类器官中任一种的肺上皮细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮细胞群包括2个以上、5个以上、10个以上、20个以上、50个以上、100个以上、200个以上、500个以上、1000个以上、2000个以上、5000个以上、10000个以上、20000个以上、50000个以上、100000个以上、200000个以上、500000个以上、1000000个以上的肺上皮细胞。在其中一些实施方式中，肺上皮细胞群包括2～1000000、2～500000、10～100000、100～10000个肺上皮细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮细胞包括肺上皮干细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮干细胞由前肠内胚层细胞诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，前肠内胚层细胞由定型内胚层细胞诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，定型内胚层细胞由多能干细胞诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，肺类器官为肺上皮类器官。
本申请的第五方面，提供BDNF蛋白，或BDNF促进剂在制备肺上皮类器官、促进肺上皮类器官存活和/或分支形成的产品、促进肺部细胞或组织增殖和/或新生的产品、促进肺部器官或气管修复和/或再生的产品中的应用。
在本申请的一些实施方式中，BDNF促进剂包括在蛋白或基因水平上提高BDNF表达或活性的物质。
在本申请的一些实施方式中，BDNF促进剂包括提高BDNF表达或活性的核酸分子、表达盒、重组载体、重组细胞、蛋白质、小分子化合物中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，BDNF促进剂包括内源性促进剂和外源性促进剂中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，BDNF促进剂包括特异性敲入BDNF基因的物质、特异性上调BDNF的mRNA水平的物质、特异性促进BDNF的蛋白表达水平的物质、特异性提高BDNF蛋白活性的物质，或包含前述任一种的载体。
在本申请的一些实施方式中，特异性敲入BDNF基因的物质包括CRISPR/Cas、ZFN、TALEN、Cre-LoxP中的至少一种。
本申请的第六方面，提供一种肺上皮类器官的制备方法，该制备方法包括将肺上皮细胞在肺上皮类器官培养基中培养的步骤，肺类器官培养基中添加有BDNF。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基包括1～1000ng/ml、10～800ng/ml、50～500ng/ml、100～300ng/ml、150～250ng/ml的BDNF，例如可以是1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml的BDNF。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基包括：
Ⅰ、基础培养基；
Ⅱ、BDNF；
Ⅲ、细胞生长因子、L-谷氨酰胺添加剂、Wnt通路小分子抑制剂、硫代甘油、B27、N2和Vc中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，基础培养基包括MEM、α-MEM、G-MEM、IMDM、DMEM、F10、F12、DMEM/F12、RPMI1640等其中至少一种。
在本申请的一些实施方式中，细胞生长因子包括角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)等其中至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括0～50ng/ml的KGF和0～50ng/ml的FGF10。在其中一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～50ng/ml、2～40ng/ml、3～30ng/ml、5～20ng/ml、5～15ng/ml的KGF和1～50ng/ml、2～40ng/ml、3～30ng/ml、5～20ng/ml、5～15ng/ml的FGF10。
在本申请的一些实施方式中，L-谷氨酰胺添加剂是指含有L-谷氨酰胺或在培养过程中反应(例如水解等)生成L-谷氨酰胺的物质，包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺的二肽中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，L-谷氨酰胺的二肽包括丙氨酰L-谷氨酰胺、甘氨酰L-谷氨酰胺中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax)。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～5mM、1～4mM、1～3mM的丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本申请的一些实施方式中，Wnt通路小分子抑制剂包括CHIR99021、XAV939中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～10μM的CHIR99021、1～10μM的XAV939中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～10μM、1～8μM、1～5μM、2～4μM的CHIR99021。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～1000μM、10～900μM、50～800μM、100～700μM、200～600μM、300～500μM、350～450μM的硫代甘油。
在本申请的一些实施方式中，B27为包含所有成分的B27(例如可以包含维生素A)。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1×～50×的B27。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1×～50×的N2。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～100μg/ml、10～90μg/ml、20～80μg/ml、30～70μg/ml、40～60μg/ml的Vc。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括基础培养基、BDNF、KGF、FGF10、GlutaMax、CHIR99021、硫代甘油、B27、N2和Vc。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括基础培养基、1～1000ng/ml的BDNF、1～50ng/ml的KGF、1～50ng/ml的FGF10、1～5mM的GlutaMax、1～10μM的CHIR99021、1～1000μM的硫代甘油、1×～50×的B27、1×～50×的N2和1～100μg/ml的Vc。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮细胞包括肺上皮干细胞。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮干细胞由前肠内胚层细胞诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮干细胞由前肠内胚层细胞通过肺上皮干细胞诱导培养基诱导分化得到，肺上皮干细胞诱导培养基包括基础培养基，以及细胞生长因子、L-谷氨酰胺添加剂、Wnt通路小分子抑制剂、硫代甘油、B27、N2、BMP4、RA和Vc中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮干细胞诱导培养基包括基础培养基、1～50ng/ml的KGF、1～50ng/ml的FGF10、1～5mM的GlutaMax、1～10μM的CHIR99021、1～1000μM的硫代甘油、1～50ng/ml的BMP4、0.01～1μM的RA、1×～50×的B27、1×～50×的N2和1～100μg/ml的Vc。
在本申请的一些实施方式中，前肠内胚层细胞由定型内胚层细胞诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，前肠内胚层细胞由定型内胚层细胞通过前肠内胚层细胞诱导分化培养基诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，前肠内胚层细胞诱导分化培养基包括基础培养基，以及L-谷氨酰胺添加剂、硫代甘油、B27、N2、SB431542、SAG、Noggin、IWP-2和Vc中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，前肠内胚层细胞诱导分化培养基包括基础培养基、1～5mM的GlutaMax、1～1000μM的硫代甘油、1～100μM的SB431542、0.1～10μM的SAG、1～500ng/ml的Noggin、1～10μM的IWP-2、1×～50×的B27、1×～50×的N2和1～100μg/ml的Vc。
在本申请的一些实施方式中，定型内胚层细胞由多能干细胞诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，定型内胚层细胞由多能干细胞通过定型内胚层细胞诱导分化培养基诱导分化得到。
在本申请的一些实施方式中，定型内胚层细胞诱导分化培养基包括基础培养基，以及Wnt通路小分子抑制剂、Activin A和Y27632中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，定型内胚层细胞诱导分化培养基包括基础培养基，以及1～10μM的CHIR99021、1～500μg/ml的Activin A和1～100μM的Y27632中的至少一种。
本申请的第七方面，提供一种肺上皮类器官培养基，该肺上皮类器官培养基包括BDNF。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基包括1～1000ng/ml、10～800ng/ml、50～500ng/ml、100～300ng/ml、150～250ng/ml的BDNF，例如可以是1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml的BDNF。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基包括：
Ⅰ、基础培养基；
Ⅱ、BDNF；
Ⅲ、细胞生长因子、L-谷氨酰胺添加剂、Wnt通路小分子抑制剂、硫代甘油、B27、N2和Vc中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，基础培养基包括MEM、α-MEM、G-MEM、IMDM、DMEM、F10、F12、DMEM/F12、RPMI1640等其中至少一种。
在本申请的一些实施方式中，细胞生长因子包括角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)等其中至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括0～50ng/ml的KGF和0～50ng/ml的FGF10。在其中一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～50ng/ml、2～40ng/ml、3～30ng/ml、5～20ng/ml、5～15ng/ml的KGF和1～50ng/ml、2～40ng/ml、3～30ng/ml、5～20ng/ml、5～15ng/ml的FGF10。
在本申请的一些实施方式中，L-谷氨酰胺添加剂是指含有L-谷氨酰胺或在培养过程中反应(例如水解等)生成L-谷氨酰胺的物质，包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺的二肽中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，L-谷氨酰胺的二肽包括丙氨酰L-谷氨酰胺、甘氨酰L-谷氨酰胺中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax)。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～5mM、1～4mM、1～3mM的丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本申请的一些实施方式中，Wnt通路小分子抑制剂包括CHIR99021、XAV939中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～10μM的CHIR99021、1～10μM的XAV939中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～10μM、1～8μM、1～5μM、2～4μM的CHIR99021。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～1000μM、10～900μM、50～800μM、100～700μM、200～600μM、300～500μM、350～450μM的硫代甘油。
在本申请的一些实施方式中，B27为包含所有成分的B27(例如可以包含维生素A)。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1×～50×的B27。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1×～50×的N2。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括1～100μg/ml、10～90μg/ml、20～80μg/ml、30～70μg/ml、40～60μg/ml的Vc。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括基础培养基、BDNF、KGF、FGF10、GlutaMax、CHIR99021、硫代甘油、B27、N2和Vc。
在本申请的一些实施方式中，肺上皮类器官培养基中包括基础培养基、1～1000ng/ml的BDNF、1～50ng/ml的KGF、1～50ng/ml的FGF10、1～5mM的GlutaMax、1～10μM的CHIR99021、1～1000μM的硫代甘油、1×～50×的B27、1×～50×的N2和1～100μg/ml的Vc。
本申请的第八方面，提供一种肺上皮类器官，该肺上皮类器官采用前述的制备方法制得。
本申请的第九方面，提供前述的肺上皮类器官在制备发育模型产品、疾病模型产品、器官再生或修复产品、药物测试或筛选产品中的应用。
在本申请的一些实施方式中，发育模型产品包括肺发育模型、肺泡发育模型、气道发育模型、气管发育模型、支气管发育模型、肺腺泡发育、肺叶模型等其中任一种。
在本申请的一些实施方式中，疾病模型产品包括囊性肺纤维化模型、特发性肺纤维化模型、哮喘模型、慢性阻塞性肺病模型、病毒感染模型、肺癌模型等其中至少一种。
在本申请的一些实施方式中，器官再生或修复产品包括用于替代或修复受损或病变的肺组织或肺的产品，或促进肺部细胞、组织、气管新生或发育的产品。
在本申请的一些实施方式中，药物测试或筛选产品包括用于验证新药在肺或肺组织中的药代毒性和功效，或其它药物反应测试，进而可完成药物筛选的产品。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例1中人胚肺的细胞的特异性表达基因。其中，A为人胚肺中不同类型细胞特异性表达谱，B为FISH鉴定出的人胚肺间质细胞特异性表达TCF21和TSHZ3，C为根据高变异基因对人胚肺间质细胞亚类的分类结果。
图2是本申请的实施例1中人胚肺不同类型间质细胞与肺上皮近远端细胞相互作用。
图3是本申请的实施例1中人胚肺不同类型间质细胞分泌配体与肺上皮近远端细胞受体表达值、所占比例与相互作用。
图4是本申请的实施例2中在人胚肺中单分子FISH原位鉴定BDNF阳性人胚肺间质细胞。
图5是本申请的实施例3中利用人多能干细胞定向分化技术与3D培养技术检测BDNF对肺上皮类器官诱导与生长的影响。其中，A为肺上皮类器官的制备流程，B为实验组和对照组的肺上皮类器官在诱导观察的第2天和第10天的照片，C为实验组和对照组在诱导观察的第10天出现分支的肺上皮类器官的比例。
图6是本申请的实施例3中肺上皮类器官的免疫荧光染色结果。其中，A和B分别为肺上皮类器官的不同分支的免疫荧光染色结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
除非另有定义，本申请中所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
下面结合具体实例进行说明。下述实施例中涉及到的部分实验方法如下：
单分子FISH：
取新鲜包埋的样品切片，室温干燥后4％ PFA固定10min，以PBS洗涤3次，每次5分钟，然后用70％的酒精常温透化1h以上。取出切片，擦去多余酒精，稍微晾干后用免疫组化笔画疏水圈，在圈内滴加洗涤液，常温摇晃5～15min复水。去掉洗涤液，滴加含有探针的杂交液，然后将玻片放置在湿盒内，37℃孵育4～16小时。取出湿盒，去掉杂交液，用洗涤液与37℃清洗30分钟，重复2次。取出湿盒，常温孵育DAPI标记细胞核。去掉DAPI，用PBS洗5分钟，用防淬灭封片剂封片，避光保存。荧光显微镜观察FISH结果。
免疫荧光染色：
取新鲜包埋的样品切片，室温干燥后4％ PFA固定10min，以PBS洗涤3次，每次5分钟，然后用0.5％ Triton透膜20分钟，5％ BSA封闭1小时。孵育一抗，4℃过夜；PBS洗涤3次，每次10分钟；孵育二抗，常温2小时；PBS洗涤2次，每次5分钟；孵育DAPI，5分钟；PBS洗涤2次，每次5分钟。用防淬灭封片剂封片，避光保存。荧光显微镜观察结果。
实施例1：表达BDNF的人胚肺间质细胞功能分析
收集4～8周正常的人类胎儿肺组织，进行单细胞测序和空间测序，并对测序结果进行分析，分析结果如图1和2所示，根据图1，肺组织中不同类型的细胞具有不同的特异性表达基因，其中，间质细胞表达TCF21、TSHZ3、PDGFRA、SNAI2等特征基因。根据人胚间质细胞内高变异基因的表达情况，可以将其进一步分为SC_BDNF+、SC_TOP2A+、SC_CRABP1+、SC_COL9A2+、SC_Early、ASMC与VSMC共7类亚群。根据图2，在这7个亚群中，表达BDNF的人胚肺间质细胞占所有间质细胞的7.5％，与肺上皮近远端细胞相互作用比例贡献高达33.6％。参考图3，表达BDNF的人胚肺间质细胞相比于其它类型的间质干细胞或其它细胞，不仅高表达BDNF，而且BMP4、WNT2、WNT2B、FGF10、FGF9、LAMA5、NMU等配体也存在相对的高表达，这些配体与肺上皮干细胞中近端和远端细胞的相应受体存在广泛的相互作用。
综合以上结果可以看出，在人胚肺中存在一种表达BDNF的间质细胞。
实施例2：表达BDNF的人胚肺间质细胞的鉴定
收集4～8周正常的人类胎儿肺组织，单分子FISH原位鉴定BDNF阳性人胚肺间质细胞，结果如图4所示，这些BDNF阳性的人胚肺间质细胞共表达BDNF与FGF10，分布在人胚肺远端边缘部位。
实施例3：BDNF在肺上皮类器官诱导分化中的作用
参考图5的A所示的肺上皮类器官的制备流程，具体如下：
(1)将人多能干细胞置于包被Matrigel的孔板中添加mTeSR1培养，融合度达到90％-100％时，用预热的RPMI1640培养基洗一次，加入定型内胚层细胞诱导分化培养基，每天更换诱导培养基，共3天。
(2)3天后，用预热的DMEM/F12培养基洗一次细胞，换为前肠内胚层细胞诱导分化培养基，每2天换液，共4天。
(3)4天后，更换肺上皮干细胞诱导培养基，换液前同样用DMEM/12洗涤，每2天换液，共7-8天。
(4)到达第14天左右，挑取上皮细胞集落，按照50微升Matrigel包埋10～15个上皮细胞集落，然后加入肺上皮类器官培养基进行诱导观察判断，每2天换液。
上述实验过程中，各个培养基具体组成如下：
定型内胚层细胞诱导分化培养基：RPMI 1640+Activin A(100ng/ml)+CHIR99021(2μM)
+Y27632(10μM)。
前肠内胚层细胞诱导分化培养基：DMEM/F12+GlutaMax(1×)+B27(1×)+N2(1×)
+Vc(50μg/ml)+MTG(0.4mM)+SB431542(10μM)+SAG(1μM)+Noggin(100ng/ml)/IWP-2(2μM)。
肺上皮干细胞诱导培养基：DMEM/F12+GlutaMax(1×)+B27(1×)+N2(1×)+Vc(50μg/ml)
+MTG(0.4mM)+CHIR99021(3μM)+KGF(10ng/ml)+FGF10(10ng/ml)+BMP4(20ng/ml)
+RA(0.1μM)。
肺上皮类器官培养基：DMEM/F12+GlutaMax(1×)+B27(1×)+N2(1×)+Vc(50μg/ml)+MTG(0.4mM)+CHIR99021(3μM)+KGF(10ng/ml)+FGF10(10ng/ml)。
其中，实验组(BDNF)相比于对照组(Ctrl)在肺上皮类器官培养基中额外加入BDNF(200ng/ml)。
结果如图5的B和C所示，根据图5的B，实验组肺上皮类器官的大小远大于对照组，且形成了明显的分支，根据图5的C，在诱导的这些肺上皮类器官中，实验组中形成分支的类器官的比例也远远高于对照组，因此，BDNF能够显著促进人肺上皮类器官的存活，同时还可以有效提高人肺上皮类器官的分支形成。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.分离的表达BDNF的肺间质细胞；
可选地，所述肺间质细胞还表达BMP4、WNT2、WNT2B、FGF10、FGF9、LAMA5、NMU中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的肺间质细胞，其特征在于，所述肺间质细胞为胚胎肺间质细胞或成体肺间质细胞，或，所述肺间质细胞为哺乳动物来源的肺间质细胞；
可选地，所述肺间质细胞选自兔形目、啮齿目、偶蹄目、奇蹄目、食肉目、灵长目中任一种哺乳动物源的肺间质细胞；
可选地，所述肺间质细胞选自家兔、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、豚鼠、牛、绵羊、山羊、猪、马、狗、猫、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、人中任一种哺乳动物源的肺间质细胞。
3.权利要求1至2任一项所述的肺间质细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在培养基中培养多能干细胞，获取肺间质细胞；
分离出表达BDNF的所述肺间质细胞；或，
从肺或肺组织分离得到表达BDNF的所述肺间质细胞。
4.组合物，其特征在于，包括权利要求1至2任一项所述的肺间质细胞，或所述组合物的制备原料包括权利要求1至2任一项所述的肺间质细胞。
5.权利要求1至2任一项所述的肺间质细胞，或权利要求4所述的组合物在制备促进肺上皮细胞存活、增殖、分化或改善肺部细胞或组织微环境的产品中的应用；
可选地，所述分化包括近端分化和远端分化中的至少一种；
可选地，肺上皮细胞分化为气道上皮、肺泡上皮中的至少一种；
可选地，所述肺上皮细胞为肺上皮细胞群、肺组织、肺器官、肺类器官中任一种的所述肺上皮细胞；
可选地，所述肺类器官为肺上皮类器官。
6.BDNF蛋白，或BDNF促进剂在制备肺上皮类器官、促进肺上皮类器官存活和/或分支形成的产品、促进肺部细胞或组织增殖和/或新生的产品、促进肺部器官或气管修复和/或再生的产品中的应用；
可选地，BDNF促进剂包括在蛋白或基因水平上提高BDNF表达或活性的物质；
可选地，BDNF促进剂包括提高BDNF表达或活性的核酸分子、表达盒、重组载体、重组细胞、蛋白质、小分子化合物中的至少一种；
可选地，BDNF促进剂包括内源性促进剂和外源性促进剂中的至少一种。
7.肺上皮类器官的制备方法，其特征在于，包括将肺上皮细胞在肺上皮类器官培养基中培养的步骤，所述肺上皮类器官培养基中添加有BDNF；
可选地，所述肺上皮类器官培养基包括：
Ⅰ、基础培养基；
Ⅱ、BDNF；
Ⅲ、细胞生长因子、L-谷氨酰胺添加剂、Wnt通路小分子抑制剂、硫代甘油、B27、N2和Vc中的至少一种。
8.肺上皮类器官培养基，其特征在于，包括BDNF；
可选地，所述肺上皮类器官培养基包括：
Ⅰ、基础培养基；
Ⅱ、BDNF；
Ⅲ、细胞生长因子、L-谷氨酰胺添加剂、Wnt通路小分子抑制剂、硫代甘油、B27、N2和Vc中的至少一种。
9.肺上皮类器官，其特征在于，采用权利要求7所述的制备方法或利用权利要求8所述的培养基制得。
10.权利要求9所述的肺上皮类器官在制备发育模型产品、疾病模型产品、器官再生或修复产品、药物测试或筛选产品中的应用。
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2023
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