WO2020120105A1 - Verfahren und mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen abbildung einer probe - Google Patents

Verfahren und mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen abbildung einer probe Download PDF

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Werner Knebel
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the invention relates to a method for high-resolution light microscopic imaging of a sample, in which a target area of a sample is illuminated with a first illuminating light beam for a first dwell time in order to at least a first subset of fluorophores present in the sample from a first state to a second state to convict.
  • This first subset of the fluorophores emits fluorescence photons during the transition from the second state back to the first state, which are used to generate a first raw image.
  • the target area of the sample is illuminated with a second illuminating light beam, which has a power different from the power of the first illuminating light beam and / or a beam profile different from the beam profile of the first illuminating light beam, for at least a second partial amount of the in to transfer fluorophores present in the sample from the first state to the second state.
  • this second subset of the fluorophores emits fluorescence photons, which are used to generate a second raw image.
  • a high-resolution image of the sample is generated from the first raw image and the second raw image.
  • the invention further relates to a microscope for high-resolution light microscopic imaging of a sample.
  • DE 10 2005 027 896 B4 discloses a method in which fluorescent dyes in a sample are excited with pulsed laser light. The time interval between successive laser pulses is set so that it is longer than the lifespan of an excited state in which the fluorescent dye is excited by the laser pulse from the ground state.
  • ln Enderlein, Appl. Phys. Lett. 87, 094105 (2005) discloses a method for increasing the resolution by temporal analysis of a fluorescence signal. The procedure is carried out with a confocal scanning microscope. The method analyzes the first microseconds after the fluorophores have been irradiated with pulsed light.
  • the procedure Due to the demodulated detection, a large part of the fluorescent light is not detected at all.
  • the procedure also has an unfavorably long recording time.
  • the authors report that for microparticles, so-called "beads", the dwell time per pixel is 0.2 ms. This corresponds to a recording time of 52s for an image with 512x512 pixels.
  • this method criticizes strong photo bleaching, ie that due to irradiation Lung loss of fluorescence ability of a fluorescent dye.
  • Zhao, Optica 4, 633 (2017) describes a method which is referred to as "saturated absorption competition microscopy".
  • a first light beam which has a Gaussian cross section
  • a second A sample is scanned point by point with the two light beams, the first light beam stimulating fluorescence at each point and the second light beam saturating fluorophores in the edge region of the first light beam at a comparatively high intensity
  • the first light beam is modulated in time and the signal is measured via a lock-in amplifier.
  • the fluorophores excited in the edge region of the focus by the second light beam must be used have relaxed before measurements can be sensibly made there. This means that corresponding waiting times have to be planned if neighboring points in the sample are to be scanned one after the other, so that the recording time is extended.
  • Zhang et ai, arXiv 10.1.2018 describes a method of "stepwise optical saturation" (also known as SOS for short)
  • the method takes a number of M images in order to achieve a resolution increase by a factor of V ZU. To do this, the M images are offset against each other.
  • a first illumination light beam is used to illuminate a target area of a sample for a first residence time in order to convert at least a first partial amount of fluorophores present in the sample from a first state into a second state .
  • this first subset of the fluorophores emits fluorescence photons, which are used to generate a first raw image.
  • a second illuminating light beam which has a power different from the power of the first illuminating light beam and / or a beam profile different from the beam profile of the first illuminating light beam, for at least a second subset of the target area of the sample to convert fluorophores present in the sample from the first state to the second state.
  • This second subset of the fluorophores emits fluorescence photons during the transition from the second state back to the first state, which are used to generate a second raw image.
  • a high-resolution image of the sample is generated from the first raw image and the second raw image.
  • the first dwell time and the second dwell time are shorter than the lifespan of a third state of the fluorophores, into which a third subset of the fluorophores is transferred by the illumination of the target area of the sample with the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam and its lifespan by a factor of at least 2 is longer than the lifetime of the second state.
  • Dwell time in the present application is understood to mean the maximum period in which the respective target area is illuminated by the first or second illumination light beam.
  • Irradiation power or power for short
  • the beam profile means the transverse intensity profile of the first or second illuminating light beam. Possible beam profiles are realized in particular by Gaussian rays, Bessel rays and Airy rays.
  • the two subsets of the fluorophores can be identical or different. In particular, the two subsets can also overlap.
  • the present invention is based on the use of the nonlinear dependence of the fluorescence photons emitted during the transition from the second state to the first state on the intensity of the illuminating light beam at the location of the fluorophore.
  • the invention is based on the fact that one of the two illuminating lights, which illuminates fluorophores for a period of time that is shorter than the life of the second state, can stimulate a maximum of each fluorophore arranged in the target area. This reduces the number of fluorophores, which can be additionally excited by a higher output of the illuminating light beam, since a large part of the fluorophores has already been converted into an excited state at a lower output.
  • At least two raw images of the sample are generated in order to produce a high-resolution image of the sample.
  • the two raw images are each generated by illuminating the target area of the sample with one of the two illuminating light beams.
  • the two illuminating light beams have different beam parameters, ie they differ from one another in particular in terms of their power and / or their beam profile. Since the powers of the two illuminating light beams are each not evenly distributed over the cross section of the respective illuminating light beam, the entire target area is not illuminated with the same illuminance. Thus, the number of fluorescence photons emitted is not evenly distributed over the target area. As a result, the target area is divided into different areas. This division can be influenced in particular by selecting the beam parameters.
  • the method according to the invention uses saturation of the second state instead of saturation of the third state.
  • the lifespan of the second state is shorter than the lifespan of the third state.
  • the first residence time and the second residence time can be selected to be significantly shorter than the life of the third state, since there is no need to wait between two successive exposures until the majority of the fluorophores come out of the third state has passed into the first state.
  • the method according to the invention can thus be carried out more quickly than previously known methods which are based on saturation of the third state.
  • the lifespan of the third state of the fluorophores is a factor of at least 10, at least 50 or at least 100 longer than the lifespan of the second state.
  • the lifetime of the third state of the fluorophores is longer than the lifetime of the second state by a factor of at most 10, at most 100 or at most 1000, in which case the lower limit is preferably 2, for an upper limit of 10, 2 or 10 , for an upper limit of 100, and 2, 10 or 100 for an upper limit of 1000.
  • the method according to the invention can also be used to generate more than two raw images from which the high-resolution image of the sample is generated.
  • Each additional raw image is one of the two illuminating lights or another illuminating light beam is assigned.
  • the first retention period and / or the second retention period are preferably shorter than the lifetime of the second state. This means that the target area is illuminated by the two illuminating light beams for a period that is shorter than the lifespan of the second state. In this way, all fluorophores arranged in the target area can be excited at most once from the first state into the second state, as a result of which undesired phototoxic effects are avoided.
  • the target area of the sample is repeatedly illuminated with the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam.
  • the target area will be used to record additional raw images with the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam illuminated.
  • the time interval between two repetitions is preferably greater than the service life of the third state. This ensures that as few fluorophores as possible are in the third state when the target area is illuminated again. As a result, there is no saturation of the fluorophores in the third state, which would reduce the yield of fluorescent photons.
  • the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam are preferably generated by a pulsed light source, the pulse length corresponding in each case to the first residence time or the second residence time. This is a particularly simple way of realizing the two retention periods.
  • the time interval between two pulses of the first illumination light beam and / or the second illumination light beam is longer than the service life of the second state.
  • the time interval is selected in such a way that between two pulses a large part of the fluorophores arranged in the target area changes from the second state back to the first state. This prevents unwanted saturation of the fluorophores.
  • a light sheet illuminating the target area of the sample is preferably formed from the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam.
  • a light sheet can be formed by the method according to the invention, which has a high axial resolution.
  • a dot pattern illuminating the target area of the sample is formed from the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam. The target area is scanned with these dot patterns. This increases the speed at which the target area is illuminated with the two illuminating light beams, since several points in the target area are illuminated simultaneously.
  • the first raw image is preferably normalized or weighted with the power of the first illuminating light beam and the second raw image with the power of the second illuminating light beam. This considerably simplifies the further processing of the two raw images into the high-resolution image of the sample.
  • the high-resolution image of the sample is preferably generated by subtracting the first raw image from the second raw image.
  • a subtraction has the particular advantage that sensor-specific noise, which is also referred to as “fixed pattern noise” and occurs, for example, with CMOS elements, is simply removed.
  • preprocessed images which have been generated from the two raw images are used to generate the high-resolution image of the sample.
  • the preprocessed images are obtained from the two raw images by one or more image processing operations.
  • the image processing operations can in particular be the aforementioned noise reduction operation, a gital filter operation, an unfolding and / or the subtraction of a background image, ie an image that was taken with the sensor used without light falling on the sensor, or a large number of such images.
  • the invention further relates to a microscope for high-resolution light microscopic imaging of a sample.
  • the microscope has an illumination device which is designed to illuminate a target region of a sample with a first illumination light beam for a first dwell time in order to convert at least a first partial amount of fluorophores present in the sample from a first state into a second state , wherein this first subset of the fluorophores emits fluorescence photons during the transition from the second state back to the first state, and with a second illuminating light beam which has a power different from the power of the first illuminating light beam and / or a beam profile different from the beam profile of the first illuminating light beam has to illuminate the target area of the sample during a second residence time in order to transfer at least a second subset of the fluorophores present in the sample from the first state to the second state, this second subset of the fluorophores during the transition from the second Z.
  • the microscope also has an imaging device which is designed to generate a first raw image from the fluorescence photons emitted by the first subset of the fluorophores and to generate a second raw image from the fluorescence photons emitted by the second subset of the fluorophores; and with an image processing device which is designed to generate a high-resolution image of the sample from the first raw image and the second raw image.
  • the first residence time and the second residence time are shorter than the service life of a third state of the fluorophores, into which a third subset the fluorophore is transferred by illuminating the target area of the sample with the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam and whose lifespan is longer by a factor of at least 2 than the lifespan of the second state.
  • the microscope is, for example, a light sheet microscope or a confocal microscope.
  • the lighting device preferably comprises a pulsed light source. With such a pulsed light source, the two dwell times can be realized particularly easily.
  • the illumination device comprises a beam deflection unit for moving the illumination beam over the sample.
  • the first illuminating light beam is moved over the sample at a first speed and the second illuminating light beam at a second speed, the first speed and the second speed being greater than the quotient of the diameter of the first illuminating light beam and the service life of the second state.
  • the image generation device preferably comprises an area sensor element for capturing the first raw image and the second raw image.
  • the area sensor element is, for example, a CCD or CMOS element.
  • Figure 1 is a schematic representation of a microscope according to the invention
  • Figure 2 is a schematic representation of the microscope according to the invention as a further embodiment
  • Figure 3a is a schematic representation of an illumination lens and one
  • FIG. 3b shows a schematic illustration of an illuminating light beam of the microscope according to the invention according to FIGS. 1 and 2;
  • FIGS. 1 and 2 shows a schematic illustration of a first illuminating light beam and a second illuminating light beam of the microscope according to the invention according to FIGS. 1 and 2 as an exemplary embodiment
  • Figure 3d is a schematic representation of the first illuminating light beam and the second illuminating light beam of the microscope according to the invention according to Figures 1 and 2 as a further embodiment;
  • FIG. 4c shows a diagram in which the location-dependent distribution of the number of emitted fluorescence photons as a function of the location-dependent intensity of Gaussian illuminating light beams is illustrated
  • FIG. 4d shows a diagram in which the non-linear dependence of the number of emitted fluorescence photons on the intensity of chisel-shaped illumination light beams is shown;
  • Figure 5a is a diagram showing a spatial distribution of emitted fluorescence photons when illuminated with the Gaussian illumination light beams as an exemplary embodiment
  • FIG. 5b shows a diagram in which a spatial distribution of emitted fluorescence photons is shown as an exemplary embodiment when illuminated with the gnarled illumination light beams;
  • Figure 6a is a diagram showing intensity profiles of the first partial light beam and the second partial light beam
  • FIG. 6b shows a diagram in which two intensity profiles of exemplary superimpositions of the first and the second partial light beam according to FIG. 6a are shown for generating two illuminating light beams;
  • FIG. 6c shows a diagram in which the effective intensity profiles of the fluorescence of the sample when illuminated by means of the two illuminating light beams according to FIG. 6b are shown;
  • FIG. 6d shows a diagram in which, by way of example, effective fluorescence intensity profiles are shown as they result when the method is carried out as shown in FIGS. 6a to 6c;
  • FIG. 7 shows a diagram in which the position of an illuminating light beam in a target area of a sample and the speed of the illuminating light beam are shown as a function of time;
  • FIG. 8 shows a simplified energy level diagram of fluorophores.
  • FIG 1 shows a schematic representation of a microscope 10 according to the invention as an embodiment.
  • the microscope 10 comprises an illumination device 12, an image generation device 14 and an image processing device 16.
  • the illuminating device 12 comprises a light source 18 for generating illuminating light 20, a beam shaping unit 22, a beam deflecting unit 26 and an illumination optics 28.
  • the beam shaping unit 22 is in particular formed by one or more cylindrical lenses, gratings, axicon laser beam formers, spatial light modulators (SLM), digital micromirror arrangements (DMD) or deformable mirrors (DM) are formed.
  • the illumination optics 28 comprise a telecentric system 30 consisting of a scan lens and a tube lens, and a lighting objective 32.
  • the image generating device 14 comprises a detection optics 40 and a sensor element 48.
  • the detection optics 40 comprises a detection objective 42, a tube lens 44 and an emission filter 46.
  • the sensor element 48 is, for example, an area sensor, in particular a CCD or CMOS element , an EMCCD element (EMCCD: electron multiplying charge-coupled device), or one of the aforementioned elements with an upstream, time-high frequency modulable amplifier or a point sensor with a high temporal resolution.
  • EMCCD electron multiplying charge-coupled device
  • the beam shaping unit 22 becomes a first illuminating light beam and follows the first illuminating light beam in time formed second illuminating light beam, which are designated for the sake of simplicity in Figure 1 with the common reference numeral 24.
  • the two illuminating light beams 24 are directed by the beam deflecting unit 26 and the illuminating optics 28 of the illuminating device 12 onto or into a target area 34 of a sample 36.
  • the two illuminating light beams 24 can be moved on or within the sample 36 by the beam deflection unit 26.
  • the two illuminating light beams 24 excite fluorophores arranged in the target area 34 from a first state ZI to a second state Z2. This suggestion is described in more detail below with reference to FIG. 8.
  • the fluorophores When transitioning from the second state Z2 back to the first state ZI, the fluorophores emit fluorescence photons which form fluorescent light 38.
  • the fluorescent light 38 is directed by the detection optics 40 to generate one of the two illuminating light beams 24 associated with raw images on the sensor element 48.
  • the image processing device 16 generates a high-resolution image of the sample 34 from the two raw images.
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a microscope 50 according to the invention as a further exemplary embodiment.
  • the microscope 50 shown in FIG. 2 differs from the microscope 10 shown in FIG. 1 essentially in that the illuminating device 52 comprises a unit 54 for generating two illuminating light beams 24a, 24b with different beam profiles.
  • the same or equivalent elements are shown in Figures 1 and 2 with the same reference numerals be.
  • the unit 54 comprises two beam shaping units 56, 58, two beam splitters 60, 62 and two deflecting mirrors 64, 66.
  • Part of the illumination light 20 is coupled out of the beam path of the illumination unit 52 by the first beam splitter 60 and directed to a first beam shaping unit 56 via the first deflecting mirror 64 to generate the first illuminating light beam 24a.
  • the first illuminating light beam 24a is directed by the second deflecting mirror 66 onto the second beam splitter 62, which couples the first illuminating light beam 24a back into the beam path of the illuminating device 52.
  • the uncoupled part of the illuminating light 20 is formed into the second illuminating light beam 24b by the second beam shaping unit 58.
  • the two illuminating light beams 24a, 24b are again identified in FIG.
  • the two illuminating light beams 24a, 24b can be generated simultaneously or in succession.
  • spectral beam splitting in particular can take place through the two beam splitters 60, 62.
  • the powers of the two illuminating light beams 24a, 24b then depend on the spectral width of the two illuminating light beams 24a, 24b.
  • two light sources can be used, the wavelengths of which are slightly offset from one another, for example by a few nm, in particular in the range from 1 nm to 100 nm, for example 20 nm, the two wavelengths being within the absorption spectrum of the fluorophores.
  • the two beam splitters 60, 62 can also be acousto-optical deflectors (AOD).
  • AOD acousto-optical deflectors
  • the two illuminating light beams 24a, 24b can also have a different wavelength and / or polarization.
  • the two beam splitters 60, 62 can also be beam splitters with a color and / or polarization-dependent division ratio.
  • Flier notebook can, for example Interference effects of the two illuminating light beams 24a, 24b in the sample 36 can be used.
  • the two illuminating light beams 24a, 24b can also be delayed against one another in such a way that they do not overlap in time. The delay is preferably within the lifetime of the second state Z2, ideally significantly less.
  • FIG. 3a shows a schematic illustration of the illumination lens 32 and the detection lens 42 of the microscope 10, 50 according to the invention.
  • the two illumination light rays are again designated by the common reference numeral 24 in FIG. 3a.
  • the illumination lens 32 and the detection lens 42 are aimed at the target area 34 and are arranged such that their optical axes are perpendicular to one another.
  • the two illuminating light beams 24 are moved such that the entire target area 34 is scanned, which is indicated by a double arrow PI.
  • FIG. 3b shows a schematic illustration of one of the two illuminating light beams 24a, 24b of the microscope 10, 50.
  • the illuminating light beam is a Bessel beam.
  • the left part of FIG. 3b shows a view of the illuminating light beam from the illuminating lens 32.
  • the solid lines indicate areas of the same illuminance.
  • the right part of FIG. 3b shows an intensity distribution of the illuminating light beam perpendicular to the optical axis of the illuminating lens 32.
  • FIG. 3b a scanning movement along the target region 34 is indicated by a double arrow P2.
  • a double arrow P3 indicates an assignment of the areas of the same illuminance in the left part of FIG. 3b to the intensity distribution of the illuminating light beam in the right part of FIG. 3b.
  • FIG. 3c shows a schematic representation of an exemplary implementation of the first illuminating light beam 24a and the second illuminating light beam 24b of the microscope 10, 50.
  • the left area of FIG. 3c shows the two illuminating light beams 24a, 24b seen from the illuminating lens 32.
  • the first illuminating light beam 24a according to FIG. 3c is a Gaussian beam and has a single intensity maximum.
  • the second illuminating light beam 24b according to FIG. 3c has two intensity maxima, which in the illustration according to FIG. 3c lie above and below the intensity maximum of the first illuminating light beam 24a. How this can be used to increase the axial resolution is described below with reference to FIGS. 5a and 5b below.
  • FIG. 3c is indicated by a double arrow P4, a scanning movement along the target area 34.
  • a double arrow P5 indicates an assignment of the areas of the same illuminance in the left part of FIG. 3c to the intensity distributions of the two illuminating light beams 24a, 24b in the right part of FIG. 3b.
  • FIG. 3d shows a schematic representation of another exemplary realization of the first illuminating light beam 25a and the second illuminating light beam 25b of the microscope 10, 50.
  • the two illuminating light beams 25a, 25b according to FIG. 3d differ essentially from the two illuminating light beams 24a, 24b according to FIG. 3c that they each form as a sheet of light. In the exemplary embodiment according to FIG. 3d, there is therefore no scanning movement by the two illuminating light beams 25a, 25b.
  • FIG. 4a is a diagram in which a non-linear dependence of a number of emitted fluorescence photons on the intensity I of the illuminating light beams 24a, 24b is illustrated in linear scaling.
  • F emitted For the number of fluorescence photons F emitted, it is assumed that F oc 1 / (1 + 1 Sat / 1) applies, where 1 Sat is the saturation intensity of the fluorophores.
  • the values of the function 1 / (1 + l Sat / I) are plotted against the normalized intensity l / l Sat.
  • a first area 68 can be seen in which the number of fluorescence photons emitted approximately linearly scaled with the normalized intensity l / l Sat and thus with the intensity I of the illuminating light beams 24a, 24b.
  • the number of fluorescence photons emitted scales clearly non-linearly with the intensity l / l Sat and the intensity I of the illuminating light beams 24a, 24b.
  • FIG. 4b is a diagram in which the non-linear dependency of the number of emitted fluorescence photons F on the intensity I of the illuminating light beams 24a, 24b is illustrated in double logarithmic scaling.
  • the values of the function 1 / (1 + 1 Sat / I) are plotted against the normalized intensity 1/1 Sat.
  • FIG. 4c is a diagram in which the location-dependent distribution of the number of emitted fluorescence photons as a function of the location-dependent intensity of Gaussian illuminating light beams is illustrated.
  • the position z is plotted on the abscissa axis perpendicular to the direction of propagation of the respective illuminating light beam.
  • the values of the function 1 / (1 + l Sat / l (z)) are plotted on the ordinate axis, which are proportional to the number of emitted fluorescence photons F (z) at position z.
  • I (z) is the intensity of a Gaussian illumination beam at position z.
  • FIG. 5a is a diagram in which the spatial distribution of the emitted fluorescence photons when illuminated with the Gaussian illumination light rays is illustrated.
  • the position z is plotted on the abscissa axis perpendicular to the direction of propagation of the respective illuminating light beam.
  • the number of emitted fluorescence photons F (z) normalized to the intensity of the respective illuminating light beam is plotted on the ordinate axis.
  • a first curve G6 shows the spatial distribution of emitted fluorescence photons for a Gaussian illuminating light beam with an intensity in a range in which the number of emitted fluorescent photons scales linearly with the intensity of the illuminating light beam, i.e.
  • FIG. 5 b shows a diagram in which the spatial distribution of the emitted fluorescence photons is shown when illuminated with the gnome-shaped illuminating light beams. The position z is plotted on the abscissa axis perpendicular to the direction of propagation of the respective illuminating light beam.
  • Figures 6a to 6d show a special embodiment of the inventive method.
  • the resolution is increased by offsetting the two raw images of the sample 36, which were recorded while a first partial light beam and a second partial light beam were superimposed at the same time, the ratios of the powers of these partial lights radiating from one another when the first raw image for taking the two- th raw image can be varied.
  • the two raw images are taken in the exemplary embodiment shown for different powers of the weaker, second beam and identical power of the stronger, first partial light beam.
  • FIG. 6a is a diagram in which intensity profiles II, 12 (and thus the beam profiles) of the first partial light beam (with intensity profile II) and the second partial light beam (with intensity profile 12) are shown.
  • the profiles of the two partial light beams are normalized to their respective intensity maxima in the illustration in FIG. 6a.
  • the position z is plotted on the abscissa axis perpendicular to the direction of propagation of the respective partial light beam.
  • the intensity of the respective partial light beam normalized to a maximum value of 1 is plotted on the ordinate axis.
  • the two partial light beams are superimposed in the target area 34 of the sample 36 to generate the respective illumination light beam (see FIG. 1).
  • FIG. 6b is a diagram in which two intensity profiles E1, E2 are shown, by way of example, under different superimpositions (in the sense of linear combinations) of the first and the second partial light beam according to FIG. 6a for illuminating the sample 36 when the first or second raw image is recorded.
  • the position z is plotted on the abscissa axis perpendicular to the direction of propagation of the respective light beam.
  • the ordinate axis shows the intensity profile of two illuminating light beams which result from two different superimpositions of the two partial light beams with the two standardized intensity profiles II, 12 shown in FIG. 6a.
  • El arll + bi-12
  • E2 a 2 -ll + b 2 -l2.
  • the coefficients a ,, b each indicate the weighting of the two standardized intensity profiles II, 12 to one another in the illuminating light beam generated by superimposing them.
  • the coefficients a ,, b are thus also a measure of the power of the partial light beams used in each case to generate the respective illuminating light beam.
  • the two intensity profiles of the illuminating light beams E1, E2 are each normalized in FIG. 6b to the maximum intensity of the second partial light beam used.
  • the power of the second partial light beam used - and thus the maximum intensity - is probably much higher for the first and the second illuminating light beam than the power and thus the maximum intensity of the first partial light beam used. Due to its high intensity in the areas of the two maxima, the second partial light beam used largely saturates the fluorophores in sample 36.
  • FIG. 6c is a diagram in which the effective intensity profiles F1, F2 of the fluorescence of the sample 36 are shown when illuminated by means of the two illuminating light beams according to FIG. 6b.
  • the position z is plotted on the abscissa axis perpendicular to the direction of propagation of the respective light beam.
  • the fluorescence signal normalized to its respective maximum is plotted on the ordinate axis.
  • FIG. 6c clearly shows that when the two raw images are taken, the fluorophores are saturated in the areas of the two maxima, so that the different powers of the first partial light beams used have hardly any effect on the fluorescence excited in this area.
  • the second partial light beam has a zero and consequently only excites a few fluorophores despite high power, no saturation effects occur, and a change in the power of the first partial light beam has a strong effect on the fluorescence excited in this area.
  • FIG. 6d is a diagram which shows, by way of example, effective fluorescence intensity profiles D1, D2 as they result when the method is carried out as shown in FIGS. 6a to 6c.
  • the two effective fluorescence intensity profiles D1, D2 result from the difference between the two intensity profile files F1, F2 shown in FIG. 6c. They thus correspond to the difference between two raw images according to the invention.
  • the two effective fluorescence intensity profiles D1, D2 show two different exemplary cases:
  • the first intensity profile Dl shows the case in which the power of the second partial light beam (reference number 12 in FIG. 6a) is not so strong that the resulting illuminating light beam is in the region of its intensity maxima leads to extensive saturation.
  • the second intensity profile D2 results for an output of the second partial light beam at which the intensity in the region of the maxima is sufficiently high for saturation of the fluorophores.
  • the powers of the first partial light beams used are identical for the two effective fluorescence intensity profiles D1, D2.
  • the shape of the second effective fluorescence intensity profile D2 clearly shows that for a high output of the second partial light beam used, the first effective fluorescence intensity profile D1 is significantly narrowed. This narrowing corresponds to an increase in the resolution along the z-axis.
  • FIG. 7 is a diagram in which the position x of an illuminating light beam 24a, 24b in the target area 34 of the sample 36 and the speed v of the illuminating light beam 24a, 24b are shown as a function of the time t.
  • the position x of the illuminating light beam 24a, 24b perpendicular to the direction of propagation of the respective illuminating light beam 24a, 24b is shown as a first curve Kl, which has the shape of a sine curve with a period P.
  • the speed of the illuminating light beam 24a, 24b is shown as a second curve K2, which has the shape of a sine curve that is offset from the first curve Kl by a quarter of the period P of the first curve Kl.
  • the amplitude of the first curve K 1 is 100 pm.
  • the target area can thus be scanned over a length of approximately 160 pm at an approximately constant speed by the illuminating light beam 24a, 24b.
  • the amount of the approximately constant speed is> 5 pm / ps.
  • the sample 36 can therefore be illuminated in a range of approx. 160 pm by a beam which is moved over the sample at a scanning speed of at least 5 pm/ps.
  • the illumination of the sample 36 with the illumination light beam 24a, 24b can take place either bidirectionally or unidirectionally. In the case of bidirectional lighting, the time interval between two successive illuminations is 15 ps.
  • FIG. 8 shows a simplified energy level diagram of the fluorophores which are arranged in the target area 34 of the sample 36.
  • the energy level diagram shows the first state ZI, which corresponds to a basic state of the fluorophores, the second state Z2, which corresponds to an excited state of the fluorophores, and a third state Z3, which corresponds to a metastable state of the fluorophores.
  • the fluorophores By illuminating with the two illuminating light beams 24a, 24b, the fluorophores are excited from the first state ZI to the second state Z2.
  • the fluorophores When changing from the second state Z2 back to the first state ZI, the fluorophores emit fluorescence photons, which form the fluorescent light 38. This transition is indicated in Figure 8 by an arrow Pdl.
  • the fluorophores can also transition from the second state Z2 to the third state Z3. This transition is marked in Figure 8 by an arrow Pd2.
  • the transition probability from the second state Z2 to the third state Z3 is clear, for example by a factor of 100, preferably by a factor of 1000, less than the transition probability from the second state Z2 to the first state ZI.
  • the lifespan of the second state Z2 is, for example, between 1 ns and 100 ns.
  • the lifetime of the third state Z3 is, for example, between 10 ps and 1 ms. Because of its comparatively long lifespan, the third state Z3 is also referred to as a metastable state.

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Abstract

Beschriebenist ein Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe (36), bei dem mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) während einer ersten Verweildauerein Zielbereich (34) einer Probe (36) beleuchtet wird, um zumindest eine erste Teilmenge von in der Probe (36) vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand (Z1) in einen zweiten Zustand (Z2) zu überführen, wobei diese erste Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand (Z2) zurück in den ersten Zustand (Z1) Fluoreszenzphotonen emittiert, die zum Erzeugen eines ersten Rohbildes genutzt werden. Es wird mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (24b, 25b), der eine von der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) verschiedenes Strahlprofil hat, währendeiner zweiten Verweildauerder Zielbereich (34) der Probe (36) beleuchtet, um zumindest eine zweite Teilmenge der in der Probe (36) vorhandenen Fluorophore aus dem ersten Zustand (Z1) in den zweiten Zustand (Z2) zu überführen, wobei diese zweite Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand (Z2) zurück in den ersten Zustand (Z1) Fluoreszenzphotonen emittiert, die zum Erzeugen eines zweiten Rohbildes genutzt werden.Aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbildwirdein hochaufgelöstes Bild der Probe (36) erzeugt.Die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer sind kürzer als die Lebensdauer eines dritten Zustands (Z3) der Fluorophore, in den eine dritte Teilmenge der Fluorophore durch die Beleuchtung des Zielbereichs 34 der Probe (36) mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (24b, 25b) überführt wird und dessen Lebensdauer um einen Faktorvon mindestens 2 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands (Z2).

Description

Verfahren und Mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbil dung einer Probe, bei dem mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl während einer ersten Verweildauer ein Zielbereich einer Probe beleuchtet wird, um zumindest eine erste Teilmenge von in der Probe vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zu stand in einen zweiten Zustand zu überführen. Diese erste Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluo reszenzphotonen, die zum Erzeugen eines ersten Rohbildes genutzt werden. Es wird mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine von der Leistung des ersten Be leuchtungslichtstrahls verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Verweildauer der Zielbereich der Probe beleuchtet, um zumindest eine zweite Teil menge der in der Probe vorhandenen Fluorophore aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand zu überführen. Diese zweite Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenz photonen, die zum Erzeugen eines zweiten Rohbildes genutzt werden. Ferner wird aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe er zeugt. Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikrosko pischen Abbildung einer Probe.
In DE 10 2005 027 896 B4 ist ein Verfahren offenbart, bei dem Fluoreszenzfarbstoffe in einer Probe mit gepulstem Laserlicht angeregt werden. Der zeitliche Abstand zwi schen aufeinanderfolgenden Laserpulsen wird so eingestellt, dass er länger ist als die Lebensdauer eines angeregten Zustands, in den der Fluoreszenzfarbstoff durch den Laserpuls aus dem Grundzustand heraus angeregt wird. ln Enderlein, Appl. Phys. Lett. 87, 094105 (2005) wird ein Verfahren zur Auflösungser höhung durch eine zeitliche Analyse eines Fluoreszenzsignals offenbart. Das Verfahren wird mit einem konfokalen Rastermikroskop durchgeführt. Bei dem Verfahren werden die ersten Mikrosekunden nach Beginn der Bestrahlung der Fluorophore mit gepuls tem Licht analysiert.
In Fujita et al., Phys. Rev. Lett. 99, 228105 (2007) wird ein Verfahren beschrieben, das auf der Untersuchung einer Abhängigkeit einer Fluoreszenzausbeute von der Intensi tät von Laserlicht basiert, das einen in einer Probe angeordneten Fluoreszenzfarbstoff zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt. Eine beobachtete Sättigung wird zur Über auflösung verwendet. Bei dem Verfahren wird die Beleuchtungsstärke des Lichts mit einer Frequenz f irn khlz-Bereich moduliert und mit einer höheren Frequenz detektiert, die ein ganzzahliges Vielfaches der Frequenz f ist, d.h. 2f, 3f, usw., was auch als har monische Demodulation bezeichnet wird. Das Verfahren erfordert schnelle Detekto ren mit Auslesegeschwindigkeiten im khlz-Bereich. Durch die demodulierte Detektion wird ein großer Teil des Fluoreszenzlichts überhaupt nicht detektiert. Das Verfahren hat außerdem eine unvorteilhaft lange Aufnahmezeit. Die Autoren berichten, dass bei Mikropartikeln, sogenannten„Beads", eine Verweildauer pro Pixel von 0,2 ms beträgt. Dies entspricht bei einem Bild mit 512x512 Pixeln einer Aufnahmezeit von 52s. Ferner wird bei diesem Verfahren starke Photobleichung bemängelt, d.h. der durch Bestrah lung versachte Verlust an Fluoreszenzfähigkeit eines Fluoreszenzfarbstoffs.
In Yamanaka et al., Journal of Biomedical Optics 13, 050507 (2008) und Yamanaka 2011, Biomed. Opt. Express 2, 1946 (2011) wird ein weiteres Verfahren beschrieben, das auf dem vorstehend beschriebenen Verfahren nach Fujita et al. aufbaut. Als we sentlicher Nachteil dieses Verfahrens wird ebenfalls Photobleichung genannt. ln Humpolickova et ai, Biophys. J. 97, 2623 (2009) wird ein Verfahren beschrieben, das auf einer direkten Messung einer Sättigungskurve eines Fluoreszenzsignals basiert. Bei diesem Verfahren wird ebenfalls eine zeitlich modulierte Beleuchtung verwendet.
In Kuang, C. et ai, Sei. Rep. 3, 1441 (2013) ist ein Verfahren beschrieben, bei dem aus zwei bei unterschiedlicher Intensität und unterschiedlichem Strahlprofil eines gepuls ten Lasers aufgenommenen Rohbildern ein hochaufgelöstes Bild einer Probe erzeugt wird. Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Aufnahmegeschwindigkeit nicht hoch ge nug ist, um bestimmte dynamische Prozesse beobachten zu können.
In Zhao, Optica 4, 633 (2017) wird ein Verfahren beschrieben, das als„gesättigte Ab sorptionskonkurrenzmikroskopie" (saturated absorption competition microscopy) be zeichnet wird. Bei diesem Verfahren wird ein erster Lichtstrahl, der einen gaußförmi gen Querschnitt hat, mit einem zweiten Lichtstrahl gleicher Wellenlänge überlagert, der einen Donut-förmigen Querschnitt hat. Eine Probe wird mit den beiden Lichtstrah len punktweise abgerastert, wobei an jedem Punkt der erste Lichtstrahl Fluoreszenz anregt und der zweite Lichtstrahl bei vergleichsweise hoher Intensität zur Sättigung von Fluorophoren im Randbereich des ersten Lichtstrahls verwendet wird. Um den Ef fekt der Sättigung aus dem überlagerten Fluoreszenzsignal extrahieren zu können, wird der erste Lichtstrahl zeitlich moduliert und das Signal über einen Lock-In-Verstär- ker gemessen. Die im Randbereich des Fokus durch den zweiten Lichtstrahl angereg ten Fluorophore müssen relaxiert haben, bevor dort sinnvoll gemessen werden kann. Das bedeutet, dass entsprechende Wartezeiten eingeplant werden müssen, sollen be nachbarte Punkte in der Probe nacheinander abgescannt werden, so dass sich die Auf nahmezeit verlängert.
In Zhang et ai, arXiv 10.1.2018 ist ein Verfahren der„schrittweisen optischen Sätti gung" (stepwise optical Saturation), auch kurz als SOS bezeichnet, beschrieben. Bei dem Verfahren wird eine Anzahl von M Bildern aufgenommen, um eine Auflösungs steigerung um einen Faktor von V ZU erreichen. Hierzu werden die M Bilder mit ei nander verrechnet.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe anzugeben, das eine höhere Auflösung und einen besseren Bildkontrasts als bisher bekannte Verfahren ermöglicht und dabei schneller durchführ bar ist. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskop anzugeben, mit dem das vorgenannte Verfahren durchführbar ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 12 gelöst.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Ab bildung einer Probe wird mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl während einer ers ten Verweildauer ein Zielbereich einer Probe beleuchtet, um zumindest eine erste Teil menge von in der Probe vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand in ei nen zweiten Zustand zu überführen. Diese erste Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenz photonen, die zum Erzeugen eines ersten Rohbildes genutzt werden. Es wird mit ei nem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine von der Leistung des ersten Beleuch tungslichtstrahls verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Ver weildauer der Zielbereich der Probe beleuchtet, um zumindest eine zweite Teilmenge der in der Probe vorhandenen Fluorophore aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand zu überführen. Diese zweite Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Über gang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenzphotonen, die zum Erzeugen eines zweiten Rohbildes genutzt werden. Ferner wird aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe erzeugt. Die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer sind kürzer als die Lebensdauer eines dritten Zustands der Fluorophore, in den eine dritte Teilmenge der Fluorophore durch die Beleuchtung des Zielbereichs der Probe mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl überführt wird und dessen Lebens dauer um einen Faktor von mindestens 2 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands.
Unter Verweildauer wird in der vorliegenden Anmeldung der maximale Zeitraum ver standen, in dem der jeweilige Zielbereich durch den ersten bzw. zweiten Beleuch tungslichtstrahl beleuchtet wird. Unter Bestrahlungsleistung (oder kurz Leistung) wird in dieser Anmeldung die zeitlich gemittelte und über die beleuchtete Fläche integrierte Bestrahlungsstärke (Intensität) des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls verstanden. Mit Strahlprofil ist in der vorliegenden Anmeldung das transversale Intensitätsprofil des ersten bzw. zweiten Beleuchtungslichtstrahls gemeint. Mögliche Strahlprofile sind insbesondere durch Gauß-Strahlen, Bessel-Strahlen und Airy-Strahlen realisiert.
Die beiden Teilmengen der Fluorophore können identisch oder verschieden sein. Ins besondere können sich die beiden Teilmengen auch überlappen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Nutzung der nichtlinearen Abhängigkeit der beim Übergang aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand emittierten Fluores zenzphotonen von der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls am Ort des Fluorophors. Insbesondere basiert die Erfindung darauf, dass einer der beiden Beleuchtungslicht strahlen, der Fluorophore für eine Zeitdauer beleuchtet, die kürzer ist als die Lebens dauer des zweiten Zustands, maximal jedes in dem Zielbereich angeordnete Fluoro phor an regen kann. Flierdurch sinkt die Anzahl an Fluorophoren, die durch eine höhere Leistung des Beleuchtungslichtstrahls noch zusätzlich anregbar sind, da schon bei ge ringerer Leistung ein Großteil der Fluorophore in einen angeregten Zustand überführt worden ist. Erfindungsgemäß werden wenigstens zwei Rohbilder der Probe zur Erzeugung eines hochaufgelösten Bildes der Probe erzeugt. Die beiden Rohbilder werden jeweils er zeugt, indem der Zielbereich der Probe mit einem der beiden Beleuchtungslichtstrah len beleuchtet wird. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen weisen dabei unterschied liche Strahlparameter auf, d.h. sie unterscheiden sich insbesondere in ihrer Leistung und/oder ihrem Strahlprofil voneinander. Da die Leistungen der beiden Beleuchtungs lichtstrahlen jeweils nicht gleichmäßig über den Querschnitt des jeweiligen Beleuch tungslichtstrahls verteilt sind, wird jeweils nicht der gesamte Zielbereich mit der glei chen Beleuchtungsstärke beleuchtet. Somit ist die Anzahl an emittierten Fluoreszenz photonen auch nicht gleichmäßig über den Zielbereich verteilt. Der Zielbereich wird hierdurch gleichsam in verschiedene Bereiche aufgeteilt. Diese Aufteilung lässt sich insbesondere durch Auswahl der Strahlparameter beeinflussen.
Da die Anzahl der in den verschiedenen Bereichen des Zielbereichs emittierten Fluo reszenzphotonen nichtlinear von der Beleuchtungsstärke des Beleuchtungslichtstrahls in den verschiedenen Bereichen abhängt, können, beispielsweise durch Subtraktion des ersten Rohbildes von dem zweiten Rohbild oder umgekehrt, die verschiedenen Bereiche voneinander getrennt werden. Da die verschiedenen Bereiche kleiner sind als der jeweilige Strahldurchmesser der beiden Beleuchtungslichtstrahlen, entspricht dies einer Verbesserung der Auflösung und des Bildkontrasts. Bei Lichtblattmikrosko pen entspricht dies wiederum einer Verbesserung der axialen Auflösung.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt anstelle einer Sättigung des dritten Zustands eine Sättigung des zweiten Zustands aus. Die Lebensdauer des zweiten Zustands ist kürzer als die Lebensdauer des dritten Zustands. Somit können die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer wesentlich kürzer als die Lebensdauer des dritten Zu stands gewählt werden, da zwischen zwei aufeinanderfolgenden Aufnahmen nicht ge wartet werden muss, bis der Großteil der Fluorophore aus dem dritten Zustand wieder in den ersten Zustand übergegangen ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit schneller durchführbar als bisher bekannte Verfahren, die auf einer Sättigung des drit ten Zustands beruhen.
Vorzugsweise ist die Lebensdauer des dritten Zustands der Fluorophore um einen Fak tor von mindestens 10, mindestens 50 oder mindestens 100 länger ist als die Lebens dauer des zweiten Zustands. Vorzugsweise ist die Lebensdauer des dritten Zustands der Fluorophore um einen Faktor von höchstens 10, höchstens 100 oder höchstens 1000 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands, wobei in diesen Fällen die untere Grenze vorzugsweise 2, für eine obere Grenze von 10, 2 oder 10, für eine obere Grenze von 100, und 2, 10 oder 100 für eine obere Grenze von 1000 beträgt.
Es versteht sich von selbst, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch mehr als zwei Rohbilder erzeugt werden können, aus denen das hochaufgelöste Bild der Probe erzeugt wird. Jedem weiteren Rohbild ist dabei einer der beiden Beleuchtungslicht strahlen oder ein weiterer Beleuchtungslichtstrahl zugeordnet.
Vorzugsweise sind die erste Verweildauer und/oder die zweite Verweildauer kürzer als die Lebensdauer des zweiten Zustands. Das bedeutet, dass der Zielbereich durch die beiden Beleuchtungslichtstrahlen jeweils für einen Zeitraum beleuchtet wird, der kürzer ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands. Flierdurch können alle in dem Zielbereich angeordneten Fluorophore maximal einmal aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand angeregt werden, wodurch unerwünschte phototoxische Effekte ver mieden werden.
Es ist vorteilhaft, wenn der Zielbereich der Probe wiederholt mit dem ersten Beleuch tungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl beleuchtet wird. Ins besondere wird der Zielbereich zur Aufnahme weiterer Rohbilder mit dem ersten Be- leuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl beleuchtet. Hier durch kann insbesondere eine Folge von hochaufgelösten Bildern der Probe gewon nen werden, mit deren Hilfe sich dynamische Vorgänge in der Probe beobachten las sen. Vorzugsweise ist der zeitliche Abstand zwischen zwei Wiederholungen größer als die Lebensdauer des dritten Zustands. Dies stellt sicher, dass sich möglichst wenige Fluorophore in dem dritten Zustand befinden, wenn der Zielbereich erneut beleuchtet wird. Hierdurch tritt keine Sättigung der Fluorophore in dem dritten Zustand auf, wel che die Ausbeute an Fluoreszenzphotonen verringern würde.
Vorzugsweise werden der erste Beleuchtungslichtstrahl und/oder der zweite Beleuch tungslichtstrahl durch eine gepulste Lichtquelle erzeugt, wobei die Pulslänge jeweils der ersten Verweildauer bzw. der zweiten Verweildauer entspricht. Dies ist eine be sonders einfache Art und Weise, die beiden Verweildauern zu realisieren.
Es ist vorteilhaft, wenn der zeitliche Abstand zwischen zwei Pulsen des ersten Beleuch tungslichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls länger ist als die Le bensdauer des zweiten Zustands. Der zeitliche Abstand ist hierdurch so gewählt, dass zwischen zwei Pulsen ein Großteil der in dem Zielbereich angeordneten Fluorophore aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand übergeht. Hierdurch wird eine ungewollte Sättigung der Fluorophore vermieden.
Vorzugsweise ist der zeitliche Abstand zwischen zwei Pulsen des ersten Beleuchtungs lichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls kürzer als die Lebensdauer des dritten Zustands.
Vorzugsweise wird aus dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Be leuchtungslichtstrahl ein den Zielbereich der Probe beleuchtendes Lichtblatt gebildet. Durch das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich insbesondere ein Lichtblatt bilden, das eine hohe axiale Auflösung besitzt. Alternativ oder zusätzlich wird aus dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl ein den Zielbereich der Probe beleuchtendes Punkt muster gebildet. Mit diesen Punktmustern wird jeweils der Zielbereich abgerastert. Hierdurch wird die Geschwindigkeit erhöht, mit der der Zielbereich mit den beiden Beleuchtungslichtstrahlen beleuchtet wird, da mehrere Punkte in dem Zielbereich gleichzeitig beleuchtet werden.
Es ist vorteilhaft, wenn auf das erste Rohbild und das zweite Rohbild eine Rauschmin derungsoperation angewendet wird. Hierdurch wird die Bildqualität des aus den bei den Rohbildern erzeugten hochaufgelösten Bildes der Probe weiter verbessert.
Vorzugsweise werden im Rahmen der Weiterverarbeitung das erste Rohbild mit der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls und das zweite Rohbild mit der Leistung des zweiten Beleuchtungslichtstrahls normiert oder gewichtet. Hierdurch wird die weitere Verarbeitung der beiden Rohbilder zu dem hochaufgelösten Bild der Probe wesentlich vereinfacht.
Vorzugsweise wird das hochaufgelöste Bild der Probe erzeugt, indem das erste Rohbild von dem zweiten Rohbild subtrahiert wird. Eine Subtraktion hat insbesondere den Vorteil, dass sensorspezifisches Rauschen, das auch als„fixed pattern noise" bezeich net wird und beispielsweise bei CMOS-Elementen auftritt, einfach entfernt wird.
Alternativ oder zusätzlich werden zur Erzeugung des hochaufgelösten Bildes der Probe vorverarbeitete Bilder verwendet, die aus den beiden Rohbildern erzeugt worden sind. Die vorverarbeiteten Bilder werden durch eine oder mehrere Bildverarbeitungsopera tionen aus den beiden Rohbildern gewonnen. Bei den Bildverarbeitungsoperationen kann es sich insbesondere um die vorgenannte Rauschminderungsoperation, eine di- gitale Filteroperation, eine Entfaltung und/oder die Subtraktion eines Hintergrundbil des, d.h. eines Bildes, das mit dem verwendeten Sensor aufgenommen wurden, ohne dass Licht auf den Sensor fällt, bzw. eine Vielzahl solcher Bilder, handeln.
Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe. Das Mikroskop hat eine Beleuchtungseinrichtung, die ausge bildet ist, mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl während einer ersten Verweil dauer einen Zielbereich einer Probe zu beleuchten, um zumindest eine erste Teil menge von in der Probe vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand in ei nen zweiten Zustand zu überführen, wobei diese erste Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenz photonen emittiert, und mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine von der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Verweildauer den Zielbereich der Probe zu beleuchten, um zu mindest eine zweite Teilmenge der in der Probe vorhandenen Fluorophore aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand zu überführen, wobei diese zweite Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zu stand Fluoreszenzphotonen emittiert. Das Mikroskop hat außerdem eine Bilderzeu gungseinrichtung, die ausgebildet ist, aus den von der ersten Teilmenge der Fluoro phore emittierten Fluoreszenzphotonen ein erstes Rohbild und aus den von der zwei ten Teilmenge der Fluorophore emittierten Fluoreszenzphotonen ein zweites Rohbild zu erzeugen; und mit einer Bildverarbeitungseinrichtung, die ausgebildet ist, aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe zu erzeu gen. Die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer sind kürzer als die Lebens dauer eines dritten Zustands der Fluorophore, in den eine dritte Teilmenge der Flu orophore durch die Beleuchtung des Zielbereichs der Probe mit dem ersten Beleuch tungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl überführt wird und dessen Lebensdauer um einen Faktor von mindestens 2 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands.
Das Mikroskop ist beispielsweise ein Lichtblattmikroskop oder ein Konfokalmikroskop.
Vorzugsweise umfasst die Beleuchtungseinrichtung eine gepulste Lichtquelle. Mit ei ner solchen gepulsten Lichtquelle lassen sich die beiden Verweildauern besonders ein fach realisieren. Alternativ oder zusätzlich umfasst die Beleuchtungseinrichtung eine Strahlablenkungseinheit zum Bewegen des Beleuchtungsstrahls über die Probe. Vor zugsweise wird der erste Beleuchtungslichtstrahl mit einer ersten Geschwindigkeit und der zweite Beleuchtungslichtstrahl mit einer zweiten Geschwindigkeit über die Probe bewegt, wobei die erste Geschwindigkeit und die zweite Geschwindigkeit grö ßer sind als der Quotient aus dem Durchmesser des ersten Beleuchtungslichtstrahls und der Lebensdauer des zweiten Zustands.
Vorzugsweise umfasst die Bilderzeugungseinrichtung ein Flächensensorelement zum Erfassen des ersten Rohbildes und des zweiten Rohbildes. Das Flächensensorelement ist beispielsweise ein CCD- oder CMOS-Element.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Be schreibung, die die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops als
Ausführungsbeispiel; Figur 2 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Mikroskops als weiteres Ausführungsbeispiel;
Figur 3a eine schematische Darstellung eines Beleuchtungsobjektivs und eines
Detektionsobjektivs des erfindungsgemäßen Mikroskops nach den Figu ren 1 und 2;
Figur 3b eine schematische Darstellung eines Beleuchtungslichtstrahls des erfin dungsgemäßen Mikroskops nach den Figuren 1 und 2;
Figur 3c eine schematische Darstellung eines ersten Beleuchtungslichtstrahls und eines zweiten Beleuchtungslichtstrahls des erfindungsgemäßen Mikroskops nach den Figuren 1 und 2 als Ausführungsbeispiel;
Figur 3d eine schematische Darstellung des ersten Beleuchtungslichtstrahls und des zweiten Beleuchtungslichtstrahls des erfindungsgemäßen Mikro skops nach den Figuren 1 und 2 als weiteres Ausführungsbeispiel;
Figur 4a ein Diagramm, in dem eine nichtlineare Abhängigkeit einer Anzahl emit tierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität der Beleuchtungslicht strahlen in linearer Skalierung verdeutlicht wird;
Figur 4b ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittier ter Fluoreszenzphotonen von der Intensität der Beleuchtungslichtstrah len in doppeltlogarithmischer Skalierung verdeutlich wird;
Figur 4c ein Diagramm, in dem die ortsabhängige Verteilung der Anzahl emittier ter Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit von der ortsabhängigen Inten sität gaußförmiger Beleuchtungslichtstrahlen verdeutlicht wird; Figur 4d ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittier ter Fluoreszenzphotonen von der Intensität besselförmiger Beleuch tungslichtstrahlen gezeigt ist;
Figur 5a ein Diagramm, in dem eine räumliche Verteilung emittierter Fluores zenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den gaußförmigen Beleuch tungslichtstrahlen als Ausführungsbeispiel gezeigt sind;
Figur 5b ein Diagramm, in dem eine räumliche Verteilung emittierter Fluores zenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den besselförmigen Beleuch tungslichtstrahlen als Ausführungsbeispiel gezeigt ist;
Figur 6a Figur 6a ist ein Diagramm, in dem Intensitätsprofile des ersten Teillicht strahls und des zweiten Teillichtstrahls gezeigt sind;
Figur 6b ein Diagramm, in dem zwei Intensitätsprofile beispielhafter Überlage rungen des ersten und des zweiten Teillichtstrahls nach Figur 6a zur Er zeugung von zwei Beleuchtungslichtstrahlen gezeigt sind;
Figur 6c ein Diagramm, in dem die effektiven Intensitätsprofile der Fluoreszenz der Probe bei Beleuchtung mittels der beiden Beleuchtungslichtstrahlen nach Figur 6b gezeigt sind;
Figur 6d ein Diagramm, in dem beispielhaft effektive Fluoreszenz-Intensitätspro file gezeigt sind, wie sie sich bei einer Durchführung des Verfahrens wie in den Figuren 6a bis 6c gezeigt ergeben; Figur 7 ein Diagramm, in dem die Position eines Beleuchtungslichtstrahls in ei nem Zielbereich einer Probe und die Geschwindigkeit des Beleuchtungs lichtstrahls in Abhängigkeit der Zeit dargestellt sind; und
Figur 8 ein vereinfachtes Energieniveauschema von Fluorophoren.
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 10 als Ausführungsbeispiel. Das Mikroskop 10 umfasst eine Beleuchtungseinrichtung 12, eine Bilderzeugungseinrichtung 14 und eine Bildverarbeitungseinrichtung 16.
Die Beleuchtungseinrichtung 12 umfasst eine Lichtquelle 18 zum Erzeugen von Be leuchtungslicht 20, eine Strahlformungseinheit 22, eine Strahlablenkeinheit 26 und eine Beleuchtungsoptik 28. Die Strahlformungseinheit 22 wird insbesondere durch eine oder mehrere Zylinderlinsen, Gitter, Axikon-Lasertrahlformer, räumliche Licht modulatoren (SLM), digitale Mikrospiegelanordnungen (DMD) oder deformierbare Spiegel (DM, deformable mirrors) gebildet. Die Beleuchtungsoptik 28 umfasst ein aus einer Scan- und einer Tubuslinse bestehendes telezentrisches System 30 und ein Be leuchtungsobjektiv 32.
Die Bilderzeugungseinrichtung 14 umfasst eine Detektionsoptik 40 und ein Sensorele ment 48. Die Detektionsoptik 40 umfasst ein Detektionsobjektiv 42, eine Tubuslinse 44 und einen Emissionsfilter 46. Bei dem Sensorelement 48 handelt es sich beispiels weise um einen Flächensensor, insbesondere ein CCD- oder CMOS-Element, ein EMCCD-Element (EMCCD: electron multiplying charge-coupled device), oder eines der vorgenannten Elemente mit einem vorgeschaltetem, zeitlich hochfrequent modulier barem Verstärker oder einen Punktsensor mit einer hohen zeitlichen Auflösung.
Aus dem Beleuchtungslicht 20 wird durch die Strahlformungseinheit 22 ein erster Be leuchtungslichtstrahl und zeitlich auf den ersten Beleuchtungslichtstrahl folgend ein zweiter Beleuchtungslichtstrahl geformt, die der Einfachheit halber in Figur 1 mit dem gemeinsamen Bezugszeichen 24 bezeichnet sind. Die beiden Beleuchtungslichtstrah len 24 werden durch die Strahlablenkeinheit 26 und die Beleuchtungsoptik 28 der Be leuchtungseinrichtung 12 auf oder in einen Zielbereich 34 einer Probe 36 gerichtet. Durch die Strahlablenkeinheit 26 können die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 auf oder innerhalb der Probe 36 bewegt werden.
Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 regen im Zielbereich 34 angeordnete Fluoro phore aus einem ersten Zustand ZI in einen zweiten Zustand Z2 an. Diese Anregung ist weiter unten anhand von Figur 8 näher beschrieben. Beim Übergang aus dem zwei ten Zustand Z2 zurück in den ersten Zustand ZI emittieren die Fluorophore Fluores zenzphotonen, die Fluoreszenzlicht 38 bilden. Das Fluoreszenzlicht 38 wird durch die Detektionsoptik 40 zur Erzeugung von jeweils einem der beiden Beleuchtungslicht strahlen 24 zugeordneten Rohbildern auf das Sensorelement 48 gerichtet.
Die Bildverarbeitungseinrichtung 16 erzeugt aus den beiden Rohbildern ein hochauf gelöstes Bild der Probe 34.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 50 als weiteres Ausführungsbeispiel. Das in Figur 2 gezeigte Mikroskop 50 unterscheidet sich von dem in Figur 1 gezeigten Mikroskop 10 im Wesentlichen dadurch, dass die Beleuchtungseinrichtung 52 eine Einheit 54 zum Erzeugen von zwei Beleuchtungslicht strahlen 24a, 24b mit unterschiedlichen Strahlprofilen umfasst. Gleiche oder gleich wirkenden Elemente sind in den Figuren 1 und 2 mit den gleichen Bezugszeichen be zeichnet.
Die Einheit 54 umfasst zwei Strahlformungseinheiten 56, 58, zwei Strahlteiler 60, 62 und zwei Umlenkspiegel 64, 66. Durch den ersten Strahlteiler 60 wird ein Teil des Be leuchtungslichts 20 aus dem Strahlengang der Beleuchtungseinheit 52 ausgekoppelt und über den ersten Umlenkspiegel 64 zum Erzeugen des ersten Beleuchtungslicht strahls 24a auf eine erste Strahlformungseinheit 56 gelenkt. Nach Verlassen der ersten Strahlformungseinheit 56 wird der erste Beleuchtungslichtstrahl 24a durch den zwei ten Umlenkspiegel 66 auf den zweiten Strahlteiler 62 gelenkt, der den ersten Beleuch tungslichtstrahl 24a wieder in den Strahlengang der Beleuchtungseinrichtung 52 ein gekoppelt. Der nichtausgekoppelte Teil des Beleuchtungslichts 20 wird durch den zweiten Strahlformungseinheit 58 zu dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl 24b ge formt. Nach Verlassen der Einheit 54 sind die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in Figur 2 der Einfachheit halber wieder mit den gemeinsamen Bezugszeichen 24 bezeichnet. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b können zeitgleich oder auf einander folgend erzeugt werden.
Bei Verwendung einer breitbandigen Lichtquelle kann insbesondere eine spektrale Strahlteilung durch die beiden Strahlteiler 60, 62 erfolgen. Die Leistungen der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b hängen dann von der spektralen Breite der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b ab.
Alternativ können zwei Lichtquellen genutzt werden, deren Wellenlängen geringfügig, beispielsweise um einige nm, insbesondere im Bereich von 1 nm bis 100 nm, beispiels weise 20 nm, gegeneinander versetzt sind, wobei die beiden Wellenlängen innerhalb des Absorptionsspektrums der Fluorophore liegen.
Insbesondere kann es sich bei den beiden Strahlteilern 60, 62 auch um akustooptische Deflektoren (AOD) handeln. In dieser Ausgestaltung können die beiden Beleuchtungs lichtstrahlen 24a, 24b zudem eine unterschiedliche Wellenlänge und/oder Polarisation aufweisen.
Es kann sich bei den beiden Strahlteilern 60, 62 auch um Strahlteiler mit einem farb- und/oder polarisationsabhängigen Teilungsverhältnis handeln. Flierdurch können z.B. Interferenzeffekte der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in der Probe 36 aus genutzt werden. Alternativ können die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b bei Verwendung einer gepulsten Lichtquelle auch so gegeneinander verzögert werden, dass sie sich zeitlich nicht überlappen. Die Verzögerung liegt dabei vorzugsweise in nerhalb der Lebensdauer des zweiten Zustand Z2, idealerweise deutlich darunter.
Figur 3a zeigt eine schematische Darstellung des Beleuchtungsobjektivs 32 und des Detektionsobjektivs 42 des erfindungsgemäßen Mikroskops 10, 50. Die beiden Be leuchtungslichtstrahlen sind der Einfachheit halber in Figur 3a wieder mit dem ge meinsamen Bezugszeichen 24 bezeichnet.
Das Beleuchtungsobjektiv 32 und das Detektionsobjektiv 42 sind auf den Zielbereich 34 gerichtet und derart angeordnet, dass ihre optischen Achsen senkrecht zueinander liegen. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 werden so bewegt, dass sich den ge samten Zielbereich 34 abrastern, was durch einen Doppelpfeil PI angedeutet ist.
Figur 3b zeigt eine schematische Darstellung eines der beiden Beleuchtungslichtstrah len 24a, 24b des Mikroskops 10, 50. Der Beleuchtungslichtstrahl ist in dem Ausfüh rungsbeispiel nach Figur 3b ein Besselstrahl. Der linke Teil der Figur 3b zeigt eine An sicht des Beleuchtungslichtstrahls von dem Beleuchtungsobjektiv 32 her gesehen. Die durchgezogenen Linien deuten dabei Bereiche gleicher Beleuchtungsstärke an. Der rechte Teil der Figur 3b zeigt eine Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichtstrahls senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 32.
In Figur 3b ist durch einen Doppelpfeil P2 eine Abrasterbewegung längs des Zielbe reichs 34 angedeutet. Durch einen Doppelpfeil P3 ist eine Zuordnung der Bereiche gleicher Beleuchtungsstärke im linken Teil der Figur 3b zu der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichtstrahls im rechten Teil der Figur 3b angedeutet. Figur 3c zeigt in schematischer Darstellung eine beispielhafte Realisierung des ersten Beleuchtungslichtstrahls 24a und des zweiten Beleuchtungslichtstrahls 24b des Mik roskops 10, 50. Der linke Bereich der Figur 3c zeigt die beiden Beleuchtungslichtstrah len 24a, 24b von dem Beleuchtungsobjektiv 32 her gesehen. Der rechte Teil der Figur 3c zeigt jeweils die Intensitätsverteilung der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 32. Der erste Beleuch tungslichtstrahl 24a nach Figur 3c ist ein Gaußstrahl und weist ein einziges Intensitäts maximum auf. Der zweite Beleuchtungslichtstrahl 24b nach Figur 3c weist zwei Inten- sitätsmaxima auf, die in der Darstellung nach Figur 3c ober- und unterhalb des Inten sitätsmaximums des ersten Beleuchtungslichtstrahls 24a liegen. Wie sich dies zur Stei gerung der axialen Auflösung nutzen lässt, ist weiter unten anhand der Figuren 5a und 5b weiter unten beschrieben.
In Figur 3c ist durch einen Doppelpfeil P4 ist eine Abrasterbewegung längs des Zielbe reichs 34 angedeutet. Durch einen Doppelpfeil P5 ist eine Zuordnung der Bereiche gleicher Beleuchtungsstärke im linken Teil der Figur 3c zu den Intensitätsverteilungen der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b im rechten Teil der Figur 3b angedeu tet.
Figur 3d zeigt in schematische Darstellung eine weitere beispielhafte Realisierung des ersten Beleuchtungslichtstrahls 25a und des zweiten Beleuchtungslichtstrahls 25b des Mikroskops 10, 50. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 25a, 25b nach Figur 3d un terscheiden sich von den beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b nach Figur 3c im Wesentlichen dadurch, dass sie jeweils als ein Lichtblatt bilden. Im Ausführungsbei spiel nach Figur 3d erfolgt daher auch keine Abrasterbewegung durch die beiden Be leuchtungslichtstrahlen 25a, 25b.
Figur 4a ist ein Diagramm, in dem eine nichtlineare Abhängigkeit einer Anzahl F emit tierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität I der Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in linearer Skalierung verdeutlicht wird. Für die Anzahl emittierter Fluoreszenz photonen F wird dabei angenommen, dass F oc 1 / (1 + lSat / l) gilt, wobei lSat die Sätti gungsintensität der Fluorophore ist. In der Darstellung nach Figur 4a sind deshalb die Werte der Funktion 1 / (1 + lSat / I) gegenüber der normierten Intensität l/lSat aufgetra gen. Es ist ein erster Bereich 68 zu erkennen, in dem die Anzahl emittierter Fluores zenzphotonen annähernd linear mit der ebenfalls eingezeichneten normierten Inten sität l/lSat und damit mit der Intensität I der Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b ska liert. In einem zweiten Bereich 70 skaliert die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen deutlich nichtlinear mit der Intensität l/lSat und der Intensität I der Beleuchtungslicht strahlen 24a, 24b.
Figur 4b ist ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F von der Intensität I der Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in doppeltlogarithmischer Skalierung verdeutlich wird. In der Darstellung nach Figur 4b sind wie in Fig. 4a die Werte der Funktion 1 / (1 + lSat / I) gegenüber der normierten Intensität l/lSat aufgetragen.
Figur 4c ist ein Diagramm, in dem die ortsabhängige Verteilung der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit von der ortsabhängigen Intensität gaußförmiger Beleuchtungslichtstrahlen verdeutlicht wird. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetra gen. Auf der Ordinatenachse sind die Werte der Funktion 1 / (1 + lSat / l(z)) aufgetragen, die proportional zu der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F(z) an der Position z ist. I(z) ist die Intensität eines Gauß'schen Beleuchtungsstrahls an der Position z. Eine erste Kurve Gl zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmi gen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität an der Position z=0 von l(z=0)=lSat/2. Eine zweite Kurve G2 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gauß förmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von l(z=0)=lSat- Eine dritte Kurve G3 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuch tungslichtstrahl mit einer Intensität von l(z=0)=2lSat· Eine vierte Kurve G4 zeigt die An zahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von l(z=0)=3lSat· Eine fünfte Kurve G5 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Inten sität von l(z=0)=4lSat. Aus der Zusammenschau der Kurven Gl bis G5 wird deutlich, dass die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen nichtlinear von der Intensität der gauß förmigen Beleuchtungslichtstrahlen abhängig ist, da das Signal F um z=0 herum für eine weitere Steigerung der Intensität weniger stark ansteigt als im Randbereich z»0 oder z«0, wo die gleiche relative Steigerung der Intensität für deutlich niedrigere ab solute Werte zu deutlich weniger stark ausgeprägten Saturierungseffekten führt, F(z) also eher linear mit l(z) ansteigt.
Figur 4d ist ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität besselförmiger Beleuchtungslichtstrahlen ge zeigt ist. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse sind die Werte der Funktion 1 / (1 + lSat / l(z)) aufgetragen, die proportional zu der Anzahl emit tierter Fluoreszenzphotonen F(z) an der Position z ist. Eine erste Kurve Bl zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslicht strahl mit einer Intensität von l(z=0)=lSat/2. Eine zweite Kurve B2 zeigt die Anzahl emit tierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit ei ner Intensität von l(z=0)=lSat- Eine dritte Kurve B3 zeigt die Anzahl emittierter Fluores zenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von l(z=0)=2lSat. Eine vierte Kurve B4 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von l(z=0)=3lSat- Eine fünfte Kurve B5 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen bes selförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von l(z=0)=4lSat. Aus der Zu- sammenschau der Kurven Bl bis B5 wird deutlich, dass die Anzahl emittierter Fluores zenzphotonen nichtlinear von der Intensität der besselförmigen Beleuchtungslicht strahlen abhängig ist.
Figur 5a ist ein Diagramm, in dem die räumliche Verteilung der emittierten Fluores zenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahlen verdeutlicht wird. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungs richtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist die auf die Intensität des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls normierte Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F(z) aufgetragen. Eine erste Kurve G6 zeigt die räum liche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuch tungslichtstrahl mit einer Intensität in einem Bereich, in dem die Anzahl der emittier ten Fluoreszenzphotonen linear mit der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls ska liert, also l(z=0) < Isat- Eine zweite Kurve G7 zeigt die räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Inten sität in einem Bereich, in dem deutliche Sättigungseffekte auftreten und die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen nichtlinear mit der Intensität des Beleuchtungs lichtstrahls skaliert, d.h. l(z=0) > lsat· Die Differenz zwischen den beiden Kurven G6, G7 ist eine vorteilhafte Messgröße, da sie nur in einem engen Bereich um z = 0 einen Wert annimmt, der signifikant von Null verschieden ist. Die Differenz kann durch Subtrak tion eines dem ersten Beleuchtungslichtstrahl zugeordneten ersten Rohbildes von ei nem dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl zugeordneten zweiten Rohbild ermittelt werden. In dem in den Figuren 1 und 2 beschriebenen Mikroskop 10, 50 entspricht der Bereich um z = 0 einem dünnen Bereich um die Fokusebene des Detektionsobjektivs 42. Somit wird durch eine Subtraktion der beiden Rohbilder eine verbesserte axiale Auflösung und ein höherer Bildkontrast erreicht, mit anderen Worten ein hochaufge löstes und kontrastreiches Bild der Probe 36 erzeugt. Figur 5b zeigt ein Diagramm, in dem die räumliche Verteilung der emittierten Fluores zenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den besselförmigen Beleuchtungslichtstrah len gezeigt ist. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungs richtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist die auf die Intensität des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls normierte Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen aufgetragen. Eine erste Kurve B6 zeigt die räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungs lichtstrahl mit einer Gesamtleistung, die dazu führt, dass auch im Bereich vergleichs weise hoher Intensitäten des Flauptmaximums um z=0 herum die Intensität in einem Bereich liegt, in dem die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen linear mit der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls skaliert, da l(z) < lsat auch in diesem Bereich gilt. Eine zweite Kurve B7 zeigt die räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer höheren Gesamtleistung, so dass im Bereich vergleichsweise hoher Intensitäten, also an der Position des Flaupt maximums (z = 0) deutliche Sättigungseffekte auftreten und die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen nichtlinear mit der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls ska liert. Auch hier ist die Differenz zwischen den beiden Kurven B6, B7 ist eine vorteilhafte Messgröße, da sie wie in dem Ausführungsbeispiel nach Figur 5a in einem engen Be reich um z = 0 konzentriert ist, d.h. nur dort einen Wert annimmt, der signifikant von Null verschieden ist.
Die Figuren 6a bis 6d zeigen ein spezielles Ausführungsbeispiel des erfindungsgemä ßen Verfahrens. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel wird die Auflösung erhöht, in dem die zwei Rohbilder der Probe 36 miteinander verrechnet werden, die bei gleich zeitiger Überlagerung eines ersten Teillichtstrahls und eines zweiten Teillichtstrahls aufgenommen worden sind, wobei die Verhältnisse der Leistungen dieser Teillicht strahlen zueinander von der Aufnahme des ersten Rohbildes zur Aufnahme des zwei- ten Rohbildes variiert werden. Die beiden Rohbilder werden in dem gezeigten Ausfüh rungsbeispiel für verschiedene Leistungen des schwächeren, zweiten Strahls und iden tische Leistung des stärkeren, ersten Teillichtstrahls aufgenommen.
Figur 6a ist ein Diagramm, in dem Intensitätsprofile II, 12 (und damit die Strahlprofile) des ersten Teillichtstrahls (mit Intensitätsprofil II) und des zweiten Teillichtstrahls (mit Intensitätsprofil 12) gezeigt sind. Die Profile der beiden Teillichtstrahlen sind in der Dar stellung in Figur 6a auf ihre jeweiligen Intensitätsmaxima normiert. Auf der Abszissen achse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Teillicht strahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist die auf einen maximalen Wert von 1 normierte Intensität des jeweiligen Teillichtstrahls aufgetragen. Der erste Teillicht strahl weist ein Intensitätsmaximum bei z = 0 auf. Der zweite Teillichtstrahl weist eine von zwei Intensitätsmaxima umgebene Nullstelle bei z = 0 auf. Die beiden Teillicht strahlen werden in dem Zielbereich 34 der Probe 36 zur Erzeugung des jeweiligen Be leuchtungslichtstrahls überlagert (siehe Figur 1).
Figur 6b ist ein Diagramm, in dem zwei Intensitätsprofile El, E2 beispielhafter unter schiedlicher Überlagerungen (im Sinne von Linearkombinationen) des ersten und des zweiten Teillichtstrahls nach Figur 6a zur Beleuchtung der Probe 36 bei der Aufnahme des ersten bzw. zweiten Rohbildes gezeigt sind. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Lichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist das Intensitätsprofil zweier Beleuchtungslichtstrahlen gezeigt, die sich aus zwei unterschiedlichen Überlagerungen der beiden Teillichtstrahlen mit den beiden in Figur 6a gezeigten normierten Intensitätsprofilen II, 12 ergeben. Es gilt: El = arll + bi-12, E2 = a2-ll + b2-l2. Die Koeffizienten a,, b, geben jeweils die Wichtung der beiden normierten Intensitätsprofile II, 12 zueinander in dem durch Überlagerung er zeugten Beleuchtungslichtstrahl an. Die Koeffizienten a,, b, sind somit auch ein Maß für die Leistung der jeweils zur Erzeugung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls ver wendeten Teillichtstrahlen. Im gezeigten Ausführungsbeispiel unterscheiden sich die Beleuchtungslichtstrahlen nur in der Leistung des ersten verwendeten Teillichtstrahls - wobei die Leistung des ersten verwendeten Teillichtstrahls für den zweiten Beleuch tungslichtstrahl E2 sehr viel kleiner ist als für den ersten Beleuchtungslichtstrahl El (also a2 « ai). Dies führt zu einem unterschiedlichen resultierenden Intensitätsprofil insbesondere bei z = 0. Die Leistung des zweiten verwendeten Teillichtstrahls ist für den ersten und den zweiten Beleuchtungslichtstrahl gleich (also bi = b2). Die beiden Intensitätsprofile der Beleuchtungslichtstrahlen El, E2 sind in Figur 6b jeweils auf die maximale Intensität des zweiten verwendeten Teillichtstrahls normiert. Die Leistung des zweiten verwendeten Teillichtstrahls - und damit die maximale Intensität - ist so wohl für den ersten als auch den zweiten Beleuchtungslichtstrahl wesentlich höher als die Leistung und damit die maximale Intensität des ersten verwendeten Teillicht strahls. Der zweite verwendete Teillichtstrahl sorgt durch seine hohe Intensität in den Bereichen der beiden Maxima für eine weitgehende Sättigung der Fluorophore in der Probe 36.
Figur 6c ist ein Diagramm, in dem die effektiven Intensitätsprofile Fl, F2 der Fluores zenz der Probe 36 bei Beleuchtung mittels der beiden Beleuchtungslichtstrahlen nach Figur 6b gezeigt sind. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbrei tungsrichtung des jeweiligen Lichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist das auf sein jeweiliges Maximum normierte Fluoreszenzsignal aufgetragen. In Figur 6c ist gut zu erkennen, dass es bei der Aufnahme der beiden Rohbilder jeweils es zu einer Sättigung der Fluorophore in den Bereichen der beiden Maxima kommt, wodurch sich die unterschiedlichen Leistungen der verwendeten ersten Teillichtstrahlen kaum auf die in diesem Bereich angeregte Fluoreszenz auswirkt. Bei z = 0 hingegen, wo der zweite Teillichtstrahl eine Nullstelle aufweist und folglich trotz hoher Leistung nur we nige Fluorophore anregt, treten keine Sättigungseffekte auf, und eine Änderung der Leistung des ersten Teillichtstrahls wirkt sich stark auf die in diesem Bereich angeregte Fluoreszenz aus. Das erste Rohbild, welches vom ersten Beleuchtungslichtstrahl El an- geregte Fluoreszenz erfasst, und das zweite Rohbild, welches vom zweiten Beleuch tungslichtstrahl E2 anregte Fluoreszenz erfasst, unterscheiden sich damit hauptsäch lich in dem Bereich um z = 0 (also für z = 0 und nahe z = 0). Subtrahiert man folglich die mit den unterschiedlichen Beleuchtungslichtstrahlen El, E2 erzeugten Rohbilder von einander, führt dies zu einer Auflösungsverbesserung, wie im Folgenden anhand von Figur 6d erläutert wird.
Figur 6d ist ein Diagramm, in dem beispielhaft effektive Fluoreszenz-Intensitätsprofile Dl, D2 gezeigt sind, wie sie sich bei einer Durchführung des Verfahrens wie in den Figuren 6a bis 6c gezeigt ergeben. Die beiden effektiven Fluoreszenz-Intensitätsprofile Dl, D2 ergeben sich aus der Differenz der beiden in Figur 6c gezeigten Intensitätspro file Fl, F2. Damit entsprechen diese der erfindungsgemäßen Differenzbildung zweier Rohbilder. Die beiden effektiven Fluoreszenz-Intensitätsprofile Dl, D2 zeigen zwei ver schiedene beispielhafte Fälle: Das erste Intensitätsprofil Dl zeigt den Fall, dass die Leistung des zweiten Teillichtstrahls (Bezugszeichen 12 in Figur 6a) nicht so stark ist, dass der resultierende Beleuchtungslichtstrahl im Bereich seiner Intensitätsmaxima zu einer weitgehenden Saturierung führt. Das zweite Intensitätsprofil D2 hingegen ergibt sich für eine Leistung des zweiten Teillichtstrahls, bei der die Intensität im Bereich der Maxima ausreichend hoch zur Saturierung der Fluorophore ist. Die Leistungen der ver wendeten ersten Teillichtstrahlen sind für die beiden effektiven Fluoreszenz-Intensi tätsprofile Dl, D2 identisch. Die beiden effektive Fluoreszenz-Intensitätsprofile Dl, D2 weisen jeweils ein Maximum bei z = 0 auf. Die Form des zweiten effektiven Fluores zenz-Intensitätsprofils D2 zeigt deutlich, dass sich für eine hohe Leistung des zweiten verwendeten Teillichtstrahlen das erste effektive Fluoreszenz-Intensitätsprofil Dl deutlich verschmälert. Diese Verschmälerung entspricht einer Steigerung der Auflö sung längs der z-Achse. Figur 7 ist ein Diagramm, in dem die Position x eines Beleuchtungslichtstrahls 24a, 24b in dem Zielbereich 34 der Probe 36 und die Geschwindigkeit v des Beleuchtungslicht strahls 24a, 24b in Abhängigkeit der Zeit t dargestellt sind. Die Position x des Beleuch tungslichtstrahls 24a, 24b senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuch tungslichtstrahls 24a, 24b ist als eine erste Kurve Kl gezeigt, die die Form einer Sinus kurve mit einer Periode P hat. Die Geschwindigkeit des Beleuchtungslichtstrahls 24a, 24b ist als eine zweite Kurve K2 gezeigt, die die Form einer Sinuskurve hat, die um ein Viertel der Periode P der ersten Kurve Kl gegenüber der ersten Kurve Kl versetzt ist. In dem Ausführungsbeispiel nach Figur 7 beträgt die Amplitude der ersten Kurve Kl 100 pm. Die Frequenz der ersten Kurve ist f = 12 kHz. Somit kann der Zielbereich auf einer Länge von ca. 160 pm mit einer annähernd konstanten Geschwindigkeit durch den Beleuchtungslichtstrahl 24a, 24b abgerastert werden. Der Betrag der annähernd konstanten Geschwindigkeit ist >5 pm/ps. Die Probe 36 kann daher in einem Bereich von ca. 160 pm von einem Strahl beleuchtet werden, der mit einer Scangeschwindig keit von mindestens 5pm/ps über die Probe bewegt wird. Die Beleuchtung der Probe 36 mit dem Beleuchtungslichtstrahl 24a, 24b kann entweder bidirektional oder unidi- rektional erfolgen. Im Fall der bidirektionalen Beleuchtung beträgt der Zeitabstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Beleuchtungen 15 ps. Im Fall der unidirektiona- len Beleuchtung beträgt der Zeitabstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Be leuchtungen 83 ps. Ebenfalls ist möglich, dass die Probe 36 mit einem gepulsten Be leuchtungslichtstrahl beleuchtet wird, beispielsweise mit einer Frequenz von 1 Puls/ps = 1 MHz.
Figur 8 zeigt ein vereinfachtes Energieniveauschema der Fluorophore, die in dem Ziel bereich 34 der Probe 36 angeordnet sind. Das Energieniveauschema zeigt den ersten Zustand ZI, der einem Grundzustand der Fluorophore entspricht, den zweiten Zustand Z2, der einem angeregten Zustand der Fluorophore entspricht, und einen dritten Zu stand Z3, der einem metastabilen Zustand der Fluorophore entspricht. - 21
Durch die Beleuchtung mit den beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b werden die Fluorophore aus dem ersten Zustand ZI in den Zweiten Zustand Z2 angeregt. Beim Übergang aus dem zweiten Zustand Z2 zurück in den ersten Zustand ZI emittieren die Fluorophore Fluoreszenzphotonen, die das Fluoreszenzlicht 38 bilden. Dieser Über gang ist in Figur 8 durch einen Pfeil Pdl gekennzeichnet. Statt zurück in den ersten Zustand ZI können die Fluorophore auch aus dem zweiten Zustand Z2 in den dritten Zustand Z3 übergehen. Dieser Übergang ist in Figur 8 durch einen Pfeil Pd2 gekenn zeichnet. Die Übergangswahrscheinlichkeit aus dem zweiten Zustand Z2 in den dritten Zustand Z3 ist jedoch deutlich, beispielsweise um einen Faktor von 100, vorzugsweise um einen Faktor von 1000, geringer als die Übergangswahrscheinlichkeit aus dem zweiten Zustand Z2 in den ersten Zustand ZI. Die Lebensdauer des zweiten Zustands Z2 beträgt beispielsweise zwischen 1 ns und 100 ns. Die Lebensdauer des dritten Zu stands Z3 beträgt beispielsweise zwischen 10 ps und 1 ms. Aufgrund seiner vergleichs weise langen Lebensdauer wird der dritte Zustand Z3 auch als metastabiler Zustand bezeichnet.
Bezugszeichenliste
10 Mikroskop
12 Beleuchtungseinrichtung
14 Bilderzeugungseinrichtung
16 Bildverarbeitungseinrichtung
20 Beleuchtungslicht
22 Strahlformungseinheit
24, 24a, 24b, 25a, 25b Beleuchtungslichtstrahl
26 Strahlablenkeinheit
28 Beleuchtungsoptik
30 telezentrisches System
32 Beleuchtungsobjektiv
34 Zielbereich
36 Probe
38 Fluoreszenzlicht
40 Detektionsoptik
42 Detektionsobjektiv
44 Tubuslinse
46 Emissionsfilter
48 Sensorelement
50 Mikroskop
52 Beleuchtungseinrichtung
54 Einheit
56, 58 Strahlformungseinheit 60, 62 Strahlteiler
64, 66 Umlenkspiegel
68, 78 Bereich Bl, B2, B3, B4, B5, B6, Kurve
B7, Gl, G2, G3, G4,
G5, G6, G7
Dl, D2, El, E2, Fl, F2, Intensitätsprofil II, 12
I Intensität x, z Position
V Geschwindigkeit

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe (36), bei dem
mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) während einer ersten Ver weildauer ein Zielbereich (34) einer Probe (36) beleuchtet wird, um zumindest eine erste Teilmenge von in der Probe (36) vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand (ZI) in einen zweiten Zustand (Z2) zu überführen, wobei diese erste Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand (Z2) zurück in den ersten Zustand (ZI) Fluoreszenzphotonen emittiert, die zum Erzeugen eines ersten Rohbildes genutzt werden;
mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (24b, 25b), der eine von der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Verweildauer der Zielbereich (34) der Probe (36) beleuchtet wird, um zumindest eine zweite Teilmenge der in der Probe (36) vor handenen Fluorophore aus dem ersten Zustand (ZI) in den zweiten Zustand (Z2) zu überführen, wobei diese zweite Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand (Z2) zurück in den ersten Zustand (ZI) Fluoreszenzphotonen emit tiert, die zum Erzeugen eines zweiten Rohbildes genutzt werden; und
aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe (36) erzeugt wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste Verweildauer und die zweite Verweil dauer kürzer sind als die Lebensdauer eines dritten Zustands (Z3) der Fluorophore, in den eine dritte Teilmenge der Fluorophore durch die Beleuchtung des Zielbereichs 34 der Probe (36) mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) und/oder dem zwei ten Beleuchtungslichtstrahl (24b, 25b) überführt wird und dessen Lebensdauer um ei nen Faktor von mindestens 2 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands (Z2).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Verweil dauer und/oder die zweite Verweildauer kürzer sind als die Lebensdauer des zweiten Zustands (Z2).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Zielbe reich (34) der Probe (36) wiederholt mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (24b, 25b) beleuchtet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl (24b, 25b) durch eine gepulste Lichtquelle erzeugt werden, wobei die Pulslänge jeweils der ersten Verweildauer bzw. der zweiten Verweildauer entspricht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Ab stand zwischen zwei Pulsen des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls (24b, 25b) länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands [12) .
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Abstand zwischen zwei Pulsen des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) und/o der des zweiten Beleuchtungslichtstrahls (24b, 25b) kürzer ist als die Lebensdauer des dritten Zustands (Z3).
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) und/oder dem zweiten Beleuchtungs lichtstrahl (24b, 25b) ein den Zielbereich (34) der Probe (36) beleuchtendes Lichtblatt gebildet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) und/oder dem zweiten Beleuchtungs lichtstrahl (24b, 25b) ein den Zielbereich (34) der Probe (36) beleuchtendes Punktmus ter gebildet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf das erste Rohbild und das zweite Rohbild eine Rauschminderungsoperation angewen det wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der Weiterverarbeitung das erste Rohbild mit der Leistung des ersten Be leuchtungslichtstrahls (24a, 25a) und das zweite Rohbild mit der Leistung des zweiten Beleuchtungslichtstrahls (24b, 25b) normiert oder gewichtet werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das hochaufgelöste Bild der Probe (36) erzeugt wird, indem das erste Rohbild oder ein aus dem ersten Rohbild erzeugtes Bild von dem zweiten Rohbild oder einem aus dem zweiten Rohbild erzeugten Bild subtrahiert wird.
12. Mikroskop 10, 50 zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe (36), mit einer Beleuchtungseinrichtung (12, 52), die ausgebildet ist,
mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) während einer ersten Ver weildauer einen Zielbereich (34) einer Probe (36) zu beleuchten, um zumindest eine erste Teilmenge von in der Probe (36) vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand (ZI) in einen zweiten Zustand (Z2) zu überführen, wobei diese erste Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand (Z2) zurück in den ersten Zustand (ZI) Fluoreszenzphotonen emittiert, und
mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (24b, 25b), der eine von der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24a, 25a) verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Verweildauer den Zielbereich (34) der Probe (36) zu beleuchten, um zumindest eine zweite Teilmenge der in der Probe (36) vor handenen Fluorophore aus dem ersten Zustand (ZI) in den zweiten Zustand (Z2) zu überführen, wobei diese zweite Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand (Z2) zurück in den ersten Zustand (ZI) Fluoreszenzphotonen emit tiert;
mit einer Bilderzeugungseinrichtung (14), die ausgebildet ist, aus den von der ersten Teilmenge der Fluorophore emittierten Fluoreszenzphotonen ein erstes Roh bild und aus den von der zweiten Teilmenge der Fluorophore emittierten Fluoreszenz photonen ein zweites Rohbild zu erzeugen; und
mit einer Bildverarbeitungseinrichtung (16), die ausgebildet ist, aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe (36) zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (12, 52) derart aus gebildet ist, dass die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer kürzer sind als die Lebensdauer eines dritten Zustands (Z3) der Fluorophore, in den eine dritte Teil menge der Fluorophore durch die Beleuchtung des Zielbereichs 34 der Probe (36) mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (24a, 25a) und/oder dem zweiten Beleuchtungs lichtstrahl (24b, 25b) überführt wird und dessen Lebensdauer mindestens um einen Faktor 2 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands (Z2).
13. Mikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Lichtblatt mikroskop oder ein Konfokalmikroskop ist.
14. Mikroskop nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Be leuchtungseinrichtung (12, 52) eine gepulste Lichtquelle umfasst.
15. Mikroskop nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Be leuchtungseinrichtung (12, 52) eine Strahlablenkeinheit (26) zum Bewegen des Be leuchtungsstrahls über die Probe (36) umfasst.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilderzeugungseinrichtung (14) ein Flächensensorelement zum Erfassen des ersten Rohbildes und des zweiten Rohbildes umfasst.
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