EP3997505A1 - Verfahren und mikroskop mit einer korrekturvorrichtung zur korrektur von aberrationsinduzierten abbildungsfehlern - Google Patents

Verfahren und mikroskop mit einer korrekturvorrichtung zur korrektur von aberrationsinduzierten abbildungsfehlern

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EP3997505A1
EP3997505A1 EP20739894.2A EP20739894A EP3997505A1 EP 3997505 A1 EP3997505 A1 EP 3997505A1 EP 20739894 A EP20739894 A EP 20739894A EP 3997505 A1 EP3997505 A1 EP 3997505A1
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EP
European Patent Office
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light
sample
measurement signal
period
measure
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Application number
EP20739894.2A
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English (en)
French (fr)
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Alexander Egner
Claudia Geisler
Francesco Rocca
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Inst Fuer Nanophotonik Goettingen E V
Institut Fuer Nanophotonik Goettingen EV
Original Assignee
Inst Fuer Nanophotonik Goettingen E V
Institut Fuer Nanophotonik Goettingen EV
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Filing date
Publication date
Application filed by Inst Fuer Nanophotonik Goettingen E V, Institut Fuer Nanophotonik Goettingen EV filed Critical Inst Fuer Nanophotonik Goettingen E V
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    • G02B7/28—Systems for automatic generation of focusing signals
    • G02B7/40—Systems for automatic generation of focusing signals using time delay of the reflected waves, e.g. of ultrasonic waves

Definitions

  • the invention relates to a method for correcting aberration-induced imaging errors of an optical system which has an objective and an adaptive optics in the beam path through the objective.
  • the present invention also relates to a laser scanning microscope with a first light source for excitation light, a second light source for stimulation light, an objective and a correction device for correcting aberration-induced aberrations, which includes adaptive optics in the beam path through the objective.
  • the aberration-induced imaging errors can on the one hand be attributed to the optical system itself if it is not sufficiently achromatic, for example.
  • an area of a sample in front of a focus area of the optical system can also cause the underlying aberration.
  • the aberration-induced imaging errors of the optical system to be corrected have an effect both when projecting a light intensity distribution with the objective into the respective sample and when imaging the sample with the objective.
  • An SLM Spatial Light Modulator
  • SLM Spatial Light Modulator
  • the phase distortion through the sample is measured by applying a phase pattern to a beam of stimulation light with the SLM, in which the phase shift is modulated in different areas with different frequencies, with the intensity of a spot on which the beam of stimulation light is then focused , registered time-resolved and analyzed by Fourier transformation.
  • a search is made for the phase offsets in the individual areas of the phase pattern impressed with the SLM, which compensate for the aberration-induced imaging errors.
  • the intensity of the spot is detected by scanning a gold nanoparticle with the spot and by registering the stimulation light scattered by it.
  • the respective STED microscope has to be operated in a scattered light mode and the gold nanoparticle has to be arranged at the location of the respective sample for which the aberration-induced imaging errors are to be compensated.
  • the gold nanoparticles were only placed on the top and bottom of a sample to demonstrate how the method worked.
  • a method for correcting aberrations in STED microscopy with the aid of adaptive optics is known from WO 2014/029978 A1, in which a metric is used that combines image sharpness and image brightness.
  • this metric By driving a light modulator, which is an SLM or a deformable mirror, this metric is maximized or minimized.
  • the image sharpness can only be determined after the sample has been mapped into an image. Image brightness depends on the concentration and density of fluorescent markers used to mark a structure of interest in the sample. The respective maximum or minimum of the metric combining the image brightness and the image sharpness therefore only has local expressiveness and cannot be compared with other maxima or minima in other areas of the sample.
  • the invention is based on the object of showing methods for correcting aberration-induced aberrations of an optical system and a laser scanning microscope with an objective and a correction device for correcting aberration-induced aberrations that correct the aberrations for different areas of a sample enable during the ongoing use of the imaging system or the laser scanning microscope for measuring or imaging the respective sample.
  • the present invention uses a metric which represents a measure of the quality of the focus when illuminating a sample with light.
  • a metric which represents a measure of the quality of the focus when illuminating a sample with light.
  • aberrations such as those that can occur in microscopy, can be corrected.
  • the sample is first illuminated with the light with the given setting of the adaptive optics, whereby a measurement signal is influenced by the sample in that the light leads, for example, to the emission of fluorescent radiation.
  • the measurement signal is then detected in a time-resolved manner and divided into at least an early and a late period for the subsequent calculation.
  • a measure is calculated which represents a measure of the quality of the focus. This measure is determined by repeated adjustment of the adaptive optics, e.g. B. an adaptive mirror optimized, whereby the aberrations are corrected.
  • An equivalent measure can be determined in the frequency domain.
  • a method for correcting aberration-induced imaging errors of an optical system which has an objective and an adaptive optics arranged in the beam path through the objective, light and a sample are selected so that the light when acting on the sample a measurement signal from the sample either reduced or approaching a saturation value from below, a relative change in the measurement signal depending on an intensity of the light.
  • the measurement signal originating from a focal area of the optical system in the sample is recorded over a first time period in order to determine a first measurement value and over a second time period in order to determine a second measurement value.
  • the selected light is focused with the optical system in the focus area in the sample.
  • the first period is at least partly earlier than the second period and / or the second period is at least partly later than the first period, and the third period at least partly overlaps in time with the first period and / or the second period and / or an intermediate period Intermediate period.
  • a measure that is a strictly monotonically increasing or decreasing function of the relative change in the measurement signal is determined and is used as a metric when controlling the adaptive optics, which is to be optimized by changing the control.
  • the aberration-induced aberrations to be corrected have the effect, if the selected light is focused with the optical system in the focal area in the sample in the third time period, that the intensity of the selected light compared to its maximum value without the aberration-induced aberrations to be corrected, i.e. . H. the so-called Strehl number is reduced.
  • the relative change in the measurement signal from the sample caused by the selected light is correspondingly reduced.
  • the above relative definitions of the first, second and third time period have the consequence that the first measured value is less strongly influenced by the selected light focused in the focus area in the third time period than the second measured value. Due to the above selection of the light and the sample and the above relative definitions of the first, second and third time periods to one another, the first and the second measured value depend in the same way on local properties of the sample in the respective focus area. Therefore, for example, the determination of the measure by forming a quotient from the second measured value determined as the integral of the measurement signal over the second period and the first measured value determined as the integral of the measurement signal over the first period leads to a normalization to an initial value of the measurement signal, i.e. H. to independence from the absolute height, d. H. the level of the measurement signal. However, this measure remains dependent on the intensity of the selected light in the focus area.
  • the measure is thus comparable across the fluctuating level of the measurement signal.
  • the dimension figure can be optimized over adjacent areas of a sample, even if the level of the measurement signal fluctuates over these adjacent areas of the sample.
  • the dimension figure can be continuously optimized, particularly when the sample is scanned with the focus area.
  • the optimization of the dimension figure is not only constant over the changes in the control of the adaptive optics Position of the focus area in the sample possible.
  • the metric to be optimized in accordance with the invention ie the measurement figure for all positions of the focus area in a sample, has the same value.
  • the sample itself is the cause of aberrations that will vary at least in the axial direction along the optical axis of the objective, ie over the depth of the sample.
  • the optimized index will fluctuate only slightly, so that an optimization for a directly adjacent position of the focus area in the sample can begin with the control of the adaptive optics, which is the case with the earlier position of the focus area has led to the optimization of the metric according to the invention.
  • the figure either increases or decreases with the intensity of the selected light in the focus area.
  • the dimension figure is to be maximized or minimized as a metric to be optimized by controlling the adaptive optics in order to maximize the intensity of the light in the focus area. This maximum intensity is reached exactly when the aberration-induced imaging errors have been eliminated. Therefore, in the method according to the invention, the measure is suitable as a metric to be optimized by changing the control of the adaptive optics in order to achieve the goal of correcting the aberration-induced imaging errors.
  • the measure determined from the first measured value and the second measured value which is used as a metric to be optimized by changing the control of the adaptive optics, does not have to be a quotient, in particular a direct quotient of these two measured values. It is basically harmless if the denominator or numerator of the quotient also has a further factor that is multiplied by the measured value, or an offset that is added to the measured value. Furthermore, the denominator can have a difference and / or the numerator of the quotient can have a sum of the measured values or vice versa. In general, any measure is suitable that is a strictly monotonically increasing or decreasing function of the relative change in the measurement signal. It goes without saying that this function only needs to have these properties in the relevant range of the measured values.
  • each such measure reaches an extreme as the direct quotient of the second measured value determined as the integral of the measured signal over the second period and the first measured value determined as the integral of the measured signal over the first period. It is fundamentally advantageous if the measure is a constant and thus injective function of the relative change in the measurement signal. But this is by no means necessary.
  • the following procedure can be used.
  • An old measure is determined from the first measured value and the second measured value.
  • the control of the adaptive optics is changed in one direction of change.
  • the measurement signal is recorded again over the same first time period and the same second time period, the light being focused into the focal area in the sample over the same third time period in order to determine a new first measured value and a new second measured value.
  • a new measure is determined from the new first measured value and the new second measured value, and a difference between the new measure and the old measure is determined.
  • the control of the adaptive optics is changed again in the previous or another, ie in particular special in a change direction opposite to the previous change direction.
  • the metric according to the invention is to be maximized due to the underlying dependence of the change in the measurement signal on the intensity of the selected light, then, if the new measure is greater than the old measure, the control of the adaptive optics must be changed again in the previous direction of change, and if the new dimension is smaller than the old dimension, the change direction must be changed when the control of the adaptive optics is changed again. In the case of a metric according to the invention to be minimized, the situation is reversed.
  • the steps of re-acquiring the measurement signal over an identical first period of time and an identical second period of time, the light being focused into the focus area in the sample over an identical third period of time in order to determine a new first measured value and a new second measured value, the determination a new measure from the new first measured value and the new second measured value, the determination of a difference between the new measure and the old measure and the renewed change of the control of the adaptive optics in the previous or another change direction depending on a direction of the difference can at least can be carried out a further time, the new measure formed during a previous implementation of the steps being used as the old measure in the current implementation of the steps.
  • the steps mentioned can be repeated until the adaptive optics are controlled in the respective change direction, at which point the dimension figure reaches an extremum, ie either a minimum or a maximum.
  • an extremum ie either a minimum or a maximum.
  • it can be used, for example, that the difference between the new measure and the old measure falls below a limit value related to the last change in the control of the adaptive optics or that the difference between the new measure and the old measure is above the last repetitions of the steps repeatedly changes direction.
  • the size of the change in the control of the adaptive optics for each repetition of the steps can be dependent on the size of the difference between the new measure and the old measure in at least one of the preceding steps. In this way, overshooting of the sought extremum of the respective metric by changing the control of the adaptive optics too much can be avoided.
  • the measurement signal which is influenced with the selected light in the method according to the invention and is integrated to obtain the first and the second measurement value, can in particular be measurement light emitted from the sample.
  • This measuring light can be imaged with the optical system on a detector that detects the measuring light and, if necessary, integrates it directly.
  • the aberration-induced imaging errors of the optical system to be corrected have an effect. However, depending on the type of detection of the measuring light, this additional effect can be insignificant. This applies, for example, in all cases in which the detector registers the measurement light from the focus area without spatial resolution.
  • the direction of change in which the control of the adaptive optics is changed when the method according to the invention is carried out can be selected from various directions of change. These include in particular the directions of change in which a spherical aberration, a defocus, an astigmatism or a coma of the optical system can be compensated.
  • Which change in the control of the adaptive optics makes a particularly large contribution to the approach to the respective extreme of the metric according to the invention depends on the respective optical system and in particular on the respective sample. In many cases, it is sufficient to compensate for just one of the aberrations mentioned in order to keep the aberrations of the optical system very small. In particular, this can be spherical aberration.
  • the light can be selected from light that leads to an exponential decrease in the measurement signal towards zero over time or that leads to an exponential approximation of the measurement signal from below keeps the saturation value over time.
  • the selected light can be excitation light that excites the fluorescent dyes in the focus area into a fluorescent state until the intensity of the resulting fluorescent light from the fluorescent dyes approaches the saturation value.
  • the selected light can be stimulation light that stimulates the fluorescent dyes to stimulate emission before the fluorescent dyes emit the fluorescent light emit. Then the fluorescence light remaining after the action of the stimulation light depends non-linearly on the intensity of the stimulation light.
  • the additional excitation light can be focused together with the stimulation light from the optical system in the focus area in the sample. If an intensity distribution of the selected light has a central intensity minimum that coincides with a central intensity maximum of the excitation light in the focus area, there are intensity distributions of the excitation light and the stimulation light, as they are also used in STED microscopy.
  • the method according to the invention thus leads to the correction of the aberration-induced imaging errors of the imaging system, which have a negative effect on the spatially narrowly limited effective point smear function when the respective sample is excited to fluorescence.
  • the method according to the invention corrects the aberration-induced aberrations for precisely this environment of the intensity minimum.
  • this environment surrounds the minimum intensity, which corresponds to the respective point of the sample measured in STED microscopy, but does not itself include it, this also means a correction of the aberration-induced imaging errors for the respectively measured point of the sample. This correction is even highly specific for the respective measured point on the sample because the dimensions of the surroundings are already smaller than the diffraction limit for wavelengths of light and fluorescent light.
  • the method according to the invention can be used while a STED microscopic measurement or also a STED measurement is being carried out.
  • microscopic image acquisition Specifically, the photons of the fluorescent light registered for the respective measurement or image recording can be used to carry out the method according to the invention if they are timed Resolution are registered so that they can be assigned to the first and the second period.
  • the method according to the invention can also be carried out before the optical system is used for the actual imaging of the sample.
  • the quotient whose denominator contains the first measured value and whose numerator contains the second measured value is used as the metric to be minimized. This means that if the respective new measure determined as a quotient is smaller than the respective old measure determined as a quotient, the control of the adaptive optics must be changed again in the previous direction of change because the decreasing metric indicates decreasing aberration-induced imaging errors.
  • the method according to the invention aims instead at the fact that the stimulation light prevents the emission of fluorescent light as far as possible in the entire focus area. This requires the maximum intensity of the stimulation light in the focus area, as can only be achieved without aberration-induced aberrations.
  • the remaining emission of fluorescent light from the intensity minimum of the intensity distribution of the stimulation light which can even increase with decreasing aberration-induced imaging errors, does not interfere with the function of the method according to the invention.
  • the respective first period of time, the respective second period of time and also the respective third period of time can each be a closed period of time independently of one another or be made up of partial periods of time separated from one another.
  • the fact that the third time period is made up of partial time periods can mean, for example, that the light is directed into the focus area in several very rapidly successive pulses that are not resolved when the measurement signal is recorded.
  • the fact that the first time period and / or the second time period is made up of partial time periods can mean that the measurement signal from the sample is recorded in several successive partial time periods, between which there are dead times in the registration of the measurement signal.
  • the first, the second and the third time period are composed of partial time periods, that the focus area is shifted somewhat between a partial period of the first, the second and the third time period in the sample before each second and then possibly further partial periods of the first period, the second period and the third period follow.
  • averaging is carried out over a spatial area of the sample when the measurement signal is recorded and, if necessary, integrated. This has proven to be particularly advantageous in the embodiment of the method according to the invention, which is close to STED microscopy, in order to average out effects of a concentration of the fluorescent dyes in the sample that fluctuates with high spatial frequency on the measure used as the metric.
  • the acquisition and, if necessary, integration of the measurement signal can be carried out over the same first and the same second time periods, with the light being focused over the same third time period in the focal area in the sample, for several image points around the respective first Measured value and the respective second measured value.
  • the correction device for performing the following steps of the method according to the invention are formed: Detecting the measurement signal over the first time period and the second time period, the stimulation light as the light that reduces the measurement signal when it acts on the sample, being focused into the focus area in the sample over the third time period, to determine the first measurement value and the second measurement value; Determining the measure from the first measured value and the second measured value; and using the measure when controlling the adaptive optics as a metric to be optimized by changing the control.
  • the adaptive optics of the laser scanning microscope according to the invention can for example have an adaptive mirror and / or a controllable micromirror array and / or an SLM (spatial light modulator).
  • the SLM in particular can also be used for wavefront shaping in the case of the Stimulation light can be used in such a way that the stimulation light forms the intensity distribution with the central intensity minimum in the focus area.
  • first light, second light and a sample are selected so that the first light is applied when acting on the sample excites first measurement signal from components of the sample with a first transition probability, which depends with a first power on an intensity of the first light, and that the second light when acting on the sample, the first or a second measurement signal from the same components of the sample with a second transition probability excites, which depends with a second power on an intensity of the second light, wherein the first and the second power are different by at least one.
  • the first light is then focused with the optical system into a focal area of the optical system in the sample, the first measurement signal excited by the first light being recorded from the focal area over a first period in order to determine a first measured value.
  • the second light with the optical signal is focused into the focal area in the sample, the first or second measurement signal excited by the second light from the focal area in the sample being recorded over a second period in order to determine a second measured value.
  • a measure that is a strictly monotonically increasing or decreasing function of a relative change in the first measurement signal or a relative difference between the first and the second measurement signal is determined and used as a metric when driving the adaptive optics which is to be optimized by changing the control.
  • the different dependencies of the first and second transition probabilities on the intensity of the first and second light when the respective measurement signal is excited are used to determine a measure that is used as a metric to be optimized when driving the adaptive optics.
  • the measure which is a strictly monotonically increasing or decreasing function of the relative change in the first measurement signal or the relative difference between the first and the second measurement signal, by forming a quotient between the first and the second measurement value certainly.
  • the first and second transition probabilities depend on the intensity of the light to a first and second power, which differ by at least one, while the intensities of the first and second light both depend in the same way on the aberration-induced aberrations, this quotient is dependent on the aberrations. All other influences on the two measured values, on the other hand, are included in a constant factor of the quotient, which does not change when determining the first and second measured value for the same focus area with the aberration-induced imaging errors. This basically applies even when the first light excites other components of the sample in the same or even a different focus area to emit the first measurement signal than the second light.
  • the measurement signal excited with the second light can be the same measurement signal as the measurement signal excited with the first light, which can simplify the implementation of the method according to the invention, but it can also be a second measurement signal, for example measurement light of a different wavelength.
  • the first light can excite the first measurement signal from the constituents of the sample by a one-photon process, while the second light excites the first or the second measurement signal from the same constituents of the sample by a multiphoton process.
  • a phase shift between the light modulation and a signal modulation of the measurement signal is used as a measure, which is a strictly monotonically increasing or decreasing one
  • the function of the relative change in the measurement signal is determined and used as a metric when controlling the adaptive optics, which is to be optimized, ie to be minimized or maximized, by changing the control.
  • This method according to the invention is the equivalent of the method according to the invention described first in the frequency domain.
  • the phase shift between the light modulation and the signal modulation is similarly dependent on the aberration-induced imaging errors as the quotient of the second measured value and the first measured value in the inventive method explained above.
  • FIG. 1 shows a laser scanning microscope according to the invention.
  • FIG. 3 is a histogram of photons of fluorescent light, which is recorded as a measurement signal in the laser scanning microscope, over time.
  • FIG. 4 shows a plot of the metric according to the invention over various spherical aberrations (black squares) that are specifically caused and over a free-running optimization of the metric according to the invention (white circles).
  • Fig. 5 is a plot of a metric according to the invention against a spherical one
  • FIG. 6 shows, above the same spherical aberration, the half-width of images of the beads filled with dye.
  • FIG. 7 shows, in comparison with FIG. 5, above the same spherical aberration, the intensity of the fluorescent light from the beads filled with dye.
  • FIG. 8 shows the course of the metric according to the invention over a defocus of the optical system of the laser scanning microscope according to FIG. 1.
  • FIG. 9 shows the course of the metric according to the invention over a spherical one
  • FIG. 10 shows the course of the metric according to the invention over an astigmatism of the optical system of the laser scanning microscope according to FIG. 1.
  • FIG. 12 shows a bright image of a structure marked with a fluorescent dye and the associated course of the metric according to the invention over a spherical aberration.
  • FIG. 13 shows a less bright image of the same structure as in FIG. 12 and the associated course of the metric according to the invention over the same spherical aberration.
  • FIGS. 12 and 13 shows a dark image of the same structure as in FIGS. 12 and 13 and the associated course of the metric according to the invention over the same spherical aberration.
  • 15 shows an intensity distribution of excitation light and stimulation light in
  • 16 shows different time sequences of a first time period in which the measurement signal is integrated into a first measurement value, a second time period in which the measurement signal is integrated into a second measurement value and a third Time period in which selected light is focused in the focus area of the respective optical system.
  • 17 is a flow chart of the essential steps of an inventive method
  • Fig. 18 is a flow chart of the essential steps of a further inventive method.
  • 19 is a flow chart of the essential steps of yet another method according to the invention.
  • the laser scanning microscope 1 according to the invention shown in FIG. 1 is based on a STED microscope and accordingly has a first light source 2 for excitation light 3 and a second light source 4 for excitation by excitation light 3 in the form of stimulation light 6 on.
  • Each of the two light sources 2 and 4 comprises a laser 7 or 8, a polarization-maintaining optical fiber 9 or 10 and a collimation optics 11 or 12 for the excitation light 3 or 10 emerging from the optical fiber 9 or 10.
  • an SLM 13 for wavefront shaping is arranged in the beam path of the stimulation light 6, so that the stimulation light 6 forms a light intensity distribution with a central intensity minimum in the focus area of an objective 14.
  • the stimulation light 6 is combined with the excitation light 3 behind the SLM 13 after further optics 15 with the aid of a dichroic beam splitter 16.
  • the excitation light 3 and the stimulation light 6 are coupled into the objective 14 via a deformable mirror 17 as adaptive optics 18 and yet another optics 19, which focus the excitation light 3 and the stimulation light 6 together into a focus area in a sample 20.
  • the optics 15 and 19 are designed such that the deformable mirror 17 and the SLM 13 are in planes that are conjugate to an entrance pupil of the objective 14.
  • the position of the focus area in which the excitation light 3 and the stimulation light 6 are focused can be moved in the sample 20 with the aid of a scanner 21.
  • the scanner 21 is indicated as a movable sample table.
  • the scanner 21 can, however, also be designed differently, and specifically for this, the excitation light 3 and the stimulation light 6 opposite the objective 14 to shift, in particular to tilt a center of the entrance pupil of the objective 14.
  • Fluorescent light 22 emitted from the focus area in the sample 20 due to the excitation of fluorescent dyes located there with the excitation light 3 is decoupled from the beam path of the excitation light 3 with a second dichroic beam splitter 23, focused with an optics 24 in a multimode optical fiber 25 and through this led to a time-resolving detector 26.
  • the deformable mirror 17 is controlled as adaptive optics 18 arranged in the beam path through the objective 14 by a controller 27 to which a measurement signal 28 indicating the fluorescent light is fed from the detector 26.
  • the adaptive optics 18 could also be formed by an SLM, a micromirror array or in another manner known to the person skilled in the art.
  • Fig. 2 shows light intensity distributions 29 and 30 of the excitation light 3 and the stimulation light 6 along a section in the x direction through the center of the focus area.
  • the intensity distribution 29 of the excitation light is that of a diffraction-limited spot.
  • the spatially donut-shaped intensity distribution 30 of the stimulation light has an intensity minimum in the center 31 in the form of a zero 32, which in the section according to FIG. 2 is delimited by intensity maxima 33.
  • intensity maxima 33 the intensity of the stimulation light exceeds a saturation intensity Is, which leads to the excitation of fluorescent dyes being completely returned by the excitation light 3.
  • FIG. 3 shows the times at which the individual photons of the fluorescent light 22 arrive at the detector 26 according to FIG. 1 after a pulse 35 of the excitation light and a subsequent pulse 36 of the stimulation light.
  • the photons of the fluorescent light 22 registered in a period 37 after the pulse 36 are then those from the environment 34 of the zero 32.
  • the number of photons of the fluorescent light 22 registered in the period 37 becomes a number of photons of the fluorescent light 22, which are registered during an earlier time period 38.
  • This earlier period 38 is also referred to here as the first period, while the period 37 is referred to as the second period.
  • the pulses 35 and 36 fall in the first time period 38.
  • the photons registered in the second time period 37 are related to the photons of the fluorescent light 22 registered in the first time period 38 by determining a measure, in particular by forming a Quotients of the photons registered in the second period 37 and the photons registered in the first period 38.
  • the invention is based on the knowledge that this measure assumes an extreme when the controller 27 controls the adaptive optics 18 in such a way that aberration-induced imaging errors of the optical system of the laser scanning microscope 1 comprising the lens 14 are precisely compensated by the adaptive optics 18 be sated. Aberration-induced imaging errors of the optical system of the laser scanning microscope 1 according to FIG.
  • the intensities of the excitation light 3 and the stimulation light 6 in the focal area in the sample 20 in such a way that the intensities decrease with increasing imaging errors. Due to increasing imaging errors, the excitation of fluorescent dyes in the sample 20 and thus the fluorescent light 22 also decrease with the intensity of the excitation light. However, this decrease is indistinguishable from other decreases in the intensity of the fluorescent light 22, such as, for example, a decrease caused by spatial variations in the concentration of the fluorescent dyes or a decrease caused by bleaching of the fluorescent dyes. However, if one considers the relative effect of the stimulation light 6 on the fluorescent dyes previously excited by the excitation light 3, which is indicated by the number determined from the photons registered in the two time periods 37 and 38, this is only dependent on the intensity of the stimulation light 6.
  • the effect of aberration-induced imaging errors can also be explained in such a way that the saturation intensity ls is only exceeded at a greater distance from the zero 32 and correspondingly more fluorescent light from the environment with the intensity distribution 30 of the stimulation light 6 reduced overall by aberration-induced imaging errors 34 of the zero 32 remains.
  • the metric 4 is the quotient of the photons of the fluorescent light 22 registered in the first time period 38 divided by the photons of the fluorescent light 22 registered in the second time period 37.
  • the metric therefore increases if in the second time period 37 relatively fewer photons are registered than in the first time period 38 because the stimulation light 3 had a stronger reducing effect on the fluorescent light 22 due to an increased intensity.
  • the effects of six spherical aberrations (black squares) introduced artificially in the laser scanning microscope 1 according to FIG. 4 with the adaptive optics 18 are shown. The increasing spherical aberrations lead, regardless of their sign, to increasing decreases in the metric compared to its maximum.
  • the metric was created for a 2D STED image of a layer filled with 40 nm sized dyestuff-filled beads with the laser scanning microscope 1 according to FIG. 1, the photons of the fluorescent light 22 according to FIG. 3 being recorded in a time-resolved manner .
  • FIG. 5 is a plot of the same metric according to the invention as in FIG. 4, with STED images of individual 40 nm large dye-filled spheres for various spherical aberrations introduced in a targeted manner with the adaptive optics 18.
  • FIG. 6 shows the corresponding half-widths of the images of the individual spheres and
  • FIG. 7 shows the fluorescent light intensity of the individual spheres, each plotted over the aberrations introduced by the same.
  • the comparison of FIGS. 5 to 7 shows that the maximum of the metric according to the invention in FIG. 5 is reached within a significantly broader minimum of the half-width in FIG. 6 and within an even broader maximum of the intensity of the fluorescent light in FIG becomes.
  • FIGS. 8 to 11 show the influence of different aberrations on the metric according to the invention according to FIGS. 4 and 5.
  • the different brightnesses of the images of the structure are based on bleaching of the fluorescent dyes with which the structure is marked.
  • the metric always shows its maximum with the same artificially introduced spherical aberration close to zero, and the optimization of the metric according to the invention is successful.
  • the elimination of aberration-induced imaging errors according to the invention therefore takes place reliably regardless of the image brightness.
  • the stimulation light 6 illustrates an alternative intensity distribution 30 of the stimulation light 6 compared to the intensity distribution 29 of the excitation light 3. Specifically, the stimulation light 6 likewise forms a diffraction-limited spot. Even then, the optimization of a quotient of early and late photons of the fluorescent light by changing the control of the adaptive optics 18 according to FIG. 1 leads to an elimination of aberration-induced aberrations. As with the intensity distribution 30 of the stimulation light 6, this also applies when the stimulation light 6 does not reach the saturation intensity Is.
  • FIG. 16 illustrates various sequences of the first time period 38 in which the measurement signal 28 is integrated from the sample 20, of the later second time period 37 in which the measurement signal 28 is reintegrated, and a third time period 39 in which the reference to the Measurement signal 28 acting light 5 is focused in the focus area of the sample 20.
  • the third time period 39 corresponds to the pulse 36 according to FIG. 3, in which the stimulation light 6 is directed onto the sample there.
  • the period 37 directly followed the period 38, and the period 39 or the pulse 36 overlaps with the later part of the period 38.
  • the sequence of the periods 37 and 38 is the same.
  • the third period 39 covers the first period 38 Completely.
  • the sequence of time periods 37 and 38 is again the same.
  • the third time period 39 overlaps both with part of the first time period 38 and with part of the second time period 37.
  • the sequence of time periods 37 and 38 is again the same.
  • the third time period 39 only overlaps with the second time period 37.
  • the third time period 39 is arranged between the time periods 37 and 38 without any overlap.
  • the light 5 focused into the sample 20 in the third time period 39 has a stronger effect on the measurement signal integrated over the later time period 37 than on the measurement signal integrated over the time period 38 because the light 5 contains the measurement signal 28, for example in form of the fluorescent light 22 according to FIG. 1, increasingly reduced.
  • the measured value obtained by integrating the measurement signal 28 in the first time period 38 would only be influenced by the light 5 no less than the second measurement value obtained by integrating the measurement signal 28 in the second time period 37 if the third time period 39 was completely before the first period 38 would be.
  • the flow chart 40 of a method according to the invention shown in FIG. 17 begins with a selection 41 of the light 5 and the sample 20, so that the light 5 when acting on the sample 20 either reduces the measurement signal 28 from the sample 20 or from below to a saturation value approximates, a change in the measurement signal 28 depending on an intensity of the light 5. Then, during acquisition 42, the measurement signal from a focal area of the optical system, whose aberration-induced aberrations are to be corrected, is acquired in the sample 20 over the first period 38 and, for example, integrated in order to determine the first measured value, and over the later second period 37 in order to determine the second measured value, the light 5 being focused over the third time period 39 with the optical system into the focus area in the sample 20.
  • a new measure is determined, for example in the form of a new quotient, and then, when determining 44, a difference between the new measure and an earlier measure is determined.
  • a direction of an earlier change in the control of the adaptive optics 18 is maintained or changed. Steps 42 to 45 are repeated in a loop 46. During these repetitions, the focus area of the optical system in the sample 20 can be shifted in order to continuously optimally compensate aberration-induced aberrations of the optical system with the adaptive optics 18 for different positions of the focus area in the sample 20.
  • the Focus area in the sample 20 are shifted in order to carry out spatial averaging.
  • the time periods 37 to 39 are to be divided into corresponding partial time periods, one of which is assigned to the respective location of the focus area in the sample 20.
  • FIG. 18 shows a flow chart 40 of a method modified as follows compared to the method explained with reference to FIG. 17.
  • first and second light and a sample are selected in such a way that the first light, when acting on the sample 20, excites a first measurement signal from constituents of the sample with a first transition probability that depends on an intensity of the first light to a first power
  • the second light when acting on the sample, excites a second measurement signal from the same components, i.e. in particular the same fluorescent dyes, of the sample with a second transition probability that depends on an intensity of the second light to a second power
  • the first and the second power are different by at least one.
  • the first light is then first focused with the optical system in a focus area of the optical system in the sample, the first measurement signal excited by the first light from the focus area being recorded over a first period of time 38 in order to obtain a first measurement value determine.
  • the second light is focused with the optical system in the same focus area in the sample 20, the second measurement signal excited by the second light from the focus area in the sample being recorded over a second time period 37 by a second measurement value to determine.
  • the determination 43 in the same way as in the method according to the invention explained with reference to FIG.
  • a new measure is determined, for example in the form of a new quotient, and then in the determination 44 a difference between the new measure and an earlier measure is determined and in a change 45, the control of the adaptive optics 18 is changed in the same or a different direction than before.
  • the steps repeated in loop 46 here include steps 48, 49 and 43 to 45.
  • the selection 41 corresponds to the selection 41 according to FIG. 17.
  • the subsequent focusing 50 of the selected light takes place with a temporal light modulation of its intensity and the simultaneous acquisition of the measurement signal 28 takes place over time dissolved.
  • determining 51 a phase shift between the light modulation and a signal modulation of the measurement signal 28 is then determined as a new measure.
  • determining 44 the difference between this new measure and an old measure is then determined, and the change 45 the control of the adaptive optics 18 takes place depending on this difference.
  • the loop 46 here comprises steps 50, 51, 44 and 45.

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Abstract

Zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv (14) und eine adaptive Optik (18) aufweist, werden Licht (5) und eine Probe (20) so ausgewählt, dass das Licht (5) beim Einwirken auf die Probe (20) ein Messsignal (28) aus der Probe (20) reduziert, wobei eine relative Änderung des Messsignals (28) von einer Intensität des Lichts (5) abhängt. Das Messsignal (28) aus einem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe (20) wird über einen ersten und einen späteren zweiten Zeitraum (38, 37) erfasst, um einen ersten und einen zweiten Messwert zu bestimmen. Über einen mit dem ersten und/oder zweiten Zeitraum überlappenden dritten Zeitraum (39), wird das Licht (5) mit dem optischen System in den Fokusbereich fokussiert. Aus dem ersten und dem zweiten Messwert wird eine Maßzahl für die relative Änderung des Messsignals (28) bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik (18) als zu optimierende Metrik verwendet.

Description

VERFAHREN UND MIKROSKOP MIT EINER KORREKTURVORRICHTUNG ZUR KORREKTUR VON ABERRATIONSINDUZIERTEN ABBILDUNGSFEHLERN
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv aufweist. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Laser-Scanning- Mikroskop mit einer ersten Lichtquelle für Anregungslicht, einer zweiten Lichtquelle für Stimula tionslicht, einem Objektiv und einer Korrekturvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern, die eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv umfasst.
Die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler können einerseits auf das optische System selbst zurückzuführen sein, wenn dieses beispielsweise nicht ausreichend achromatisch ist. Anderer- seits kann auch ein vor einem Fokusbereich des optischen Systems liegender Bereich einer Probe die zugrunde liegende Aberration verursachen.
Die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler des optischen Systems wirken sich sowohl beim Projizieren einer Lichtintensitätsverteilung mit dem Objektiv in die jeweilige Probe als auch beim Abbilden der Probe mit dem Objektiv aus.
STAND DER TECHNIK
Aus Wei Yan, et al.: Coherent optical adaptive technique improves the spatial resolution of STED microscopy in thick samples, Photonics Research, Vol. 5, No. 3, Juni 2017, ist eine Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern bekannt, die auf Inhomogenitäten der optischen Eigen schaften einer Probe, insbesondere einer dickeren Probe, zurückzuführen sind. Angewandt wird dabei ein COAT (Coherent Optical Adaptive Technique) genanntes Verfahren, bei dem die Phasenverzerrung durch die jeweilige Probe gemessen und kompensiert wird. Sowohl für das Messen als auch für das Kompensieren der Phasenverzerrung wird ein SLM (Spatial Light Modulator) verwendet, mit dem in der STED-Mikroskopie zudem die Phasenfronten von Stimulationslicht so moduliert werden, dass das in die Probe fokussierte Stimulationslicht eine Donut-förmige Intensitätsverteilung aufweist. Die Phasenverzerrung durch die Probe wird gemessen, indem einem Strahl von Stimulationslicht mit dem SLM ein Phasenmuster aufgeprägt wird, bei dem die Phasenverschiebung in verschiedenen Bereichen mit unterschiedlichen Fre quenzen moduliert wird, wobei die Intensität eines Spots, zu dem der Strahl des Stimulationslichts anschließend fokussiert wird, zeitaufgelöst registriert und durch Fouriertransformation analysiert wird. Praktisch wird so nach den Phasenversätzen in den einzelnen Bereichen des mit dem SLM aufgeprägten Phasenmusters gesucht, die die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler kompen sieren. Konkret wird die Intensität des Spots durch Abtasten eines Gold-Nanopartikels mit dem Spot und durch Registrieren des von diesem gestreuten Stimulationslichts erfasst. Entsprechend muss das jeweilige STED-Mikroskop in einem Streulichtmodus betrieben und der Gold- Nanopartikel an dem Ort der jeweiligen Probe angeordnet werden, für den die aberrations induzierten Abbildungsfehler kompensiert werden sollen. Praktisch wurden die Gold-Nanopartikel nur an der Oberseite und der Unterseite einer Probe angeordnet, um die Funktionsweise des Verfahrens zu demonstrieren. Aus der WO 2014/029978 A1 ist ein Verfahren zum Korrigieren von Aberrationen in der STED- Mikroskopie mit Hilfe einer adaptiven Optik bekannt, bei dem eine Metrik verwendet wird, die Bildschärfe und Bildhelligkeit kombiniert. Durch Ansteuern eines Lichtmodulators, bei dem es sich um einen SLM oder einen verformbaren Spiegel handelt, wird diese Metrik maximiert oder minimiert. Die Bildschärfe kann erst nach dem Abbilden der Probe in ein Bild bestimmt werden. Die Bildhelligkeit hängt von der Konzentration und der Dichte von Fluoreszenzmarkern ab, mit denen eine interessierende Struktur in der Probe markiert ist. Das jeweilige Maximum oder Minimum der die Bildhelligkeit und die Bildschärfe kombinierenden Metrik hat daher nur lokale Aussagekraft und ist nicht mit anderen Maxima oder Minima in anderen Bereichen der Probe vergleichbar. Aus Yifan Wang et al.: A 3D Aligning Method for Stimulated Emission Depletion Microscopy Using Fluorescence Lifetime Distribution, Microscopy Research and Technique 77:935-940, August 2014 ist ein Verfahren zum aufeinander Ausrichten eines Donut-förmigen Stimulationslichtfokus mit einem spotförmigen Anregungslichtfokus bekannt, bei dem ein Versatz zwischen einem STED-Bild und einem Lebensdauerbild einer fluoreszenten Nanoperle bestimmt und beseitigt wird. Konkret wird dazu der Versatz zwischen dem Schwerpunkt einer normalisierten räumlichen Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts von der Nanoperle und dem Schwerpunkt einer normalisierten räumlichen Lebensdauerintensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts von der Nano perle bestimmt und ausgeglichen.
Aus der WO 2018/042056 A1 ist es zum Einstellen einer korrekten Justierung eines STED- Mikroskops, in der ein Intensitätsmaximum von Anregungslicht und ein Intensitätsminimum von STED-Licht im Fokus eines Objektivs zusammenfallen, bekannt, eine mit einem Fluoreszenz- farbstoff markierte Struktur in einer Probe mit dem Intensitätsmaximum des Anregungslichts abzutasten, um Bilder der Probe mit Abbildern der Struktur mit unterschiedlichen Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts zu erzeugen. Dann wird zwischen Lagen der Abbilder der Struktur in den erzeugten Bildern ein Versatz berechnet und ausgeglichen.
AUFGABE DER ERFINDUNG Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems und ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Objektiv und einer Korrekturvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern aufzuzeigen, die eine Korrektur der Abbildungsfehler für unterschiedliche Bereiche einer Probe während der laufenden Verwendung des Abbildungssystems bzw. des Laser-Scanning- Mikroskops zum Messen bzw. Abbilden der jeweiligen Probe ermöglichen.
LOSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 , 3 und 7 und durch ein Laser-Scanning-Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 21 gelöst. Dabei ist das Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 7 das Äquivalent im Frequenzraum zu dem Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die abhängigen Patentansprüche 2, 4 bis 6 und 8 bis 20 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungs gemäßen Verfahrens, und Patentanspruch 22 ist auf eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops gerichtet. BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung nutzt eine Metrik, welche ein Maß für die Güte des Fokus bei der Beleuchtung einer Probe mit Licht darstellt. Mit Hilfe dieser Metrik können Aberrationen, wie sie z.B. in der Mikroskopie auftreten können, korrigiert werden. Dies ist möglich, indem die Verteilung des Lichts zur Beleuchtung der Probe mit einer adaptiven Optik so angepasst wird, dass die Metrik optimiert wird. Dazu wird die Probe zunächst mit gegebener Einstellung der adaptiven Optik mit dem Licht beleuchtet, wodurch ein Messsignal von der Probe beeinflusst wird, indem das Licht zum Beispiel zur Emission von Fluoreszenzstrahlung führt. Anschließend wird das Messsignal zeitaufgelöst detektiert und für die nachfolgende Berechnung in mindestens einen frühen und einen spätem Zeitraum unterteilt. Aus dem Verhältnis der Messwerte des Messsignals zu den beiden Zeiträumen, zum Beispiel dem Verhältnis von frühen und späten Photonen des Fluoreszenzlichts wird eine Maßzahl berechnet, welche ein Maß für die Güte des Fokus darstellt. Diese Maßzahl wird durch wiederholte Anpassung der adaptiven Optik, z. B. eines adaptiven Spiegels optimiert, wodurch die Aberrationen korrigiert werden. Eine äquivalente Maßzahl kann im Frequenzraum bestimmt werden.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine im Strahlengang durch das Objektiv angeordnete adaptive Optik aufweist, werden Licht und eine Probe so ausgewählt, dass das Licht beim Einwirken auf die Probe ein Messsignal aus der Probe entweder reduziert oder von unten an einen Sättigungswert annähert, wobei eine relative Änderung des Messsignals von einer Intensität des Lichts abhängt. Das aus einem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe stammende Messsignal wird über einen ersten Zeitraum erfasst, um einen ersten Messwert zu bestimmen, und über einen zweiten Zeitraum, um einen zweiten Messwert zu bestimmen. Über einen dritten Zeitraum wird das ausgewählte Licht mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe fokussiert. Dabei liegt der erste Zeitraum zumindest teilweise früher als der zweite Zeitraum und/oder der zweite Zeitraum zumindest teilweise später als der erste Zeitraum, und der dritte Zeitraum überlappt zumindest teilweise zeitlich mit dem ersten Zeitraum und/oder dem zweiten Zeitraum und/oder einem dazwischen liegenden Zwischenzeitraum. Aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert wird eine Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik als Metrik verwendet wird, die durch Ändern der Ansteuerung zu optimieren ist. Bei der Durchführung dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wirken sich die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler beim Fokussieren des ausgewählten Lichts mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe aus. Wenn die bei diesem Fokussieren auftretenden Abbildungsfehler korrigiert sind, sind sie auch dann korrigiert, wenn der Fokusbereich mit dem Abbildungssystem abgebildet wird.
Die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler haben dann, wenn das ausge wählte Licht in dem dritten Zeitraum mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, die Auswirkung, dass die Intensität des ausgewählten Lichts gegenüber ihrem Maximalwert ohne die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler, d. h. die soge- nannte Strehl-Zahl, reduziert ist. Entsprechend ist auch die durch das ausgewählte Licht bewirkte relative Änderung des Messsignals von der Probe reduziert.
Die obigen relativen Definitionen des ersten, zweiten und dritten Zeitraums haben zur Folge, dass der erste Messwert weniger stark von dem in dem dritten Zeitraum in den Fokusbereich fokussierten ausgewählten Licht beeinflusst ist, als der zweite Messwert. Durch die obige Auswahl des Lichts und der Probe und die obigen relativen Definitionen des ersten, zweiten und dritten Zeitraums zueinander hängen der erste und der zweite Messwert in gleicher Weise von lokalen Eigenschaften der Probe in dem jeweiligen Fokusbereich ab. Daher führt zum Beispiel die Bestimmung der Maßzahl durch Bildung eines Quotienten aus dem als Integral des Messsignals über den zweiten Zeitraum bestimmten zweiten Messwert und dem als Integral des Messsignals über den ersten Zeitraum bestimmten ersten Messwert zu einer Normierung auf einen Anfangswert des Messsignals, d. h. zu einer Unabhängigkeit von der absoluten Höhe, d. h. dem Pegel des Messsignals. Von der Intensität des ausgewählten Lichts in dem Fokusbereich bleibt diese Maßzahl aber abhängig.
Somit ist die Maßzahl über schwankende Pegel des Messsignals hinweg vergleichbar. Dies bedeutet, dass die Maßzahl über aneinander angrenzende Bereiche einer Probe hinweg optimiert werden kann, auch wenn der Pegel des Messsignals über diese aneinander angrenzenden Bereiche der Probe schwankt. Dadurch kann die Maßzahl insbesondere beim Abtasten der Probe mit dem Fokusbereich fortlaufend optimiert werden. Die Optimierung der Maßzahl ist nicht nur bei einer über die Änderungen der Ansteuerung der adaptiven Optik hinweg gleichbleibenden Lage des Fokusbereichs in der Probe möglich. Dies bedeutet jedoch nicht, dass die erfindungs gemäß zu optimierende Metrik, d. h. die Maßzahl für alle Lagen des Fokusbereichs in einer Probe denselben Wert aufweist. Dies ist vielmehr sicher nicht der Fall, weil die Probe selbst Ursache von Aberrationen ist, die zumindest in axialer Richtung längs der optischen Achse des Objektivs, d. h. über die Tiefe der Probe variieren werden. Zwischen einander lateral benachbarten Lagen des Fokusbereichs in der Probe wird die optimierte Maßzahl jedoch nur wenig schwanken, so dass eine Optimierung für eine unmittelbar benachbarte Lage des Fokusbereichs in der Probe mit der Ansteuerung der adaptiven Optik beginnen kann, die bei der früheren Lage des Fokus bereichs zu der Optimierung der erfindungsgemäßen Metrik geführt hat.
Dass die Abhängigkeit von der Intensität des ausgewählten Lichts in dem Fokusbereich durch die Bestimmung der Maßzahl nicht verloren geht, ist dadurch sichergestellt, dass sowohl dann, wenn das ausgewählte Licht das Messsignal reduziert, als auch dann, wenn das ausgewählte Licht das Messsignal von unten an den Sättigungswert annähert, der erste und der zweite Messwert beide weder linear noch mit einer anderen gleichen Potenz ungleich null unmittelbar von der Intensität des ausgewählten Lichts abhängen.
Daraus folgt, dass die Maßzahl bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder mit der Intensität des ausgewählten Lichts in dem Fokusbereich ansteigt oder abfällt. Entsprechend ist die Maßzahl als durch Ansteuern der adaptiven Optik zu optimierende Metrik zu maximieren oder zu minimieren, um die Intensität des Lichts in dem Fokusbereich zu maximieren. Diese maximale Intensität wird genau dann erreicht, wenn die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler beseitigt sind. Deshalb ist die Maßzahl bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als durch Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik zu optimierende Metrik geeignet, um das Ziel der Korrektur der aberrationsinduzierten Abbildungsfehler zu erreichen.
Die schon als Beispiel angegebene Bildung eines Quotienten aus dem als Integral des Messsignals über den zweiten Zeitraum bestimmten zweiten Messwert und dem als Integral des Messsignals über den ersten Zeitraum bestimmten ersten Messwert, die zu einer Normierung auf den Anfangswert des Messsignals führt, ist zum Beispiel dann zur Bestimmung der Maßzahl geeignet, wenn das ausgewählte Licht das Messsignal aus der Probe reduziert. Aber auch der Kehrwert dieses Quotienten ist bei dieser Auswirkung des ausgewählten Lichts auf das Mess signal als Maßzahl geeignet, die dann aber nicht minimieren, sondern zu maximieren ist. Wenn das ausgewählte Licht das Messsignal aus der Probe von unten an einen Sättigungswert annähert, ist eine Normierung einer absoluten Änderung des Messsignals auf den Sättigungswert vorteilhaft, um die Maßzahl zu bestimmen. Diese Normierung kann näherungsweise dadurch erfolgen, dass die Bestimmung der Maßzahl durch Bildung eines Quotienten aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert erfolgt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muss die aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert bestimmte Maßzahl, die als durch Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik zu optimierende Metrik verwendet wird, aber kein Quotient, insbesondere kein direkter Quotient dieser beiden Messwerte sein. So ist es grundsätzlich unschädlich, wenn der Nenner oder Zähler des Quotienten noch einen weiteren Faktor, der mit dem Messwert multipliziert wird, oder einen Offset, der zu dem Messwert addiert wird, aufweist. Weiterhin kann der Nenner eine Differenz und/oder der Zähler des Quotienten eine Summe der Messwerte aufweisen oder umgekehrt. Ganz allgemein ist jede Maßzahl geeignet, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist. Dabei versteht es sich, dass diese Funktion nur im relevanten Bereich der auftretenden Messwerte diese Eigenschaften haben muss.
Jede solche Maßzahl erreicht bei derselben Ansteuerung der adaptiven Optik ein Extremum wie der direkte Quotient aus dem als Integral des Messsignals über den zweiten Zeitraum bestimmten zweiten Messwert und dem als Integral des Messsignals über den ersten Zeitraum bestimmten ersten Messwert. Grundsätzlich vorteilhaft ist es, wenn die Maßzahl eine stetige und damit injektive Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist. Dies ist aber keinesfalls erforderlich.
Beim Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik zur Optimierung der erfindungsgemäßen Metrik kann konkret wie folgt vorgegangen werden. Es wird eine alte Maßzahl aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert bestimmt. Die Ansteuerung der adaptiven Optik wird in einer Änderungsrichtung geändert. Das Messsignal wird erneut über einen gleichen ersten Zeitraum und einen gleichen zweiten Zeitraum erfasst, wobei das Licht über einen gleichen dritten Zeitraum in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, um einen neuen ersten Messwert und einen neuen zweiten Messwert zu bestimmen. Aus dem neuen ersten Messwert und dem neuen zweiten Messwert wird eine neue Maßzahl bestimmt, und ein Unterschied zwischen der neuen Maßzahl und der alten Maßzahl wird bestimmt. Abhängig von der Richtung des Unterschieds wird die Ansteuerung der adaptiven Optik erneut in der bisherigen oder einer anderen, d. h. insbe sondere in einer zu der bisherigen Änderungsrichtung entgegengesetzten Änderungsrichtung geändert. Wenn die erfindungsgemäße Metrik aufgrund der zugrunde liegenden Abhängigkeit der Änderung des Messsignals von der Intensität des ausgewählten Lichts zu maximieren ist, ist dann, wenn die neue Maßzahl größer ist als die alte Maßzahl, die Ansteuerung der adaptiven Optik erneut in der bisherigen Änderungsrichtung zu ändern, und dann, wenn die neue Maßzahl kleiner ist als die alte Maßzahl, ist bei erneuter Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik die Änderungsrichtung zu wechseln. Bei einer zu minimierenden erfindungsgemäßen Metrik verhält es sich umgekehrt. Die Schritte des erneuten Erfassens des Messsignals über einen gleichen ersten Zeitraum und einen gleichen zweiten Zeitraum, wobei das Licht über einen gleichen dritten Zeitraum in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, um einen neuen ersten Messwert und einen neuen zweiten Messwert zu bestimmen, des Bestimmens einer neuen Maßzahl aus dem neuen ersten Messwert und dem neuen zweiten Messwert, des Bestimmens eines Unterschieds zwischen der neuen Maßzahl und der alten Maßzahl und des erneuten Änderns der Ansteuerung der adaptiven Optik in der bisherigen oder einer anderen Änderungsrichtung abhängig von einer Richtung des Unterschieds können mindestens noch ein weiteres Mal durchgeführt werden, wobei jeweils die bei einer vorherigen Durchführung der Schritte gebildete neue Maßzahl bei der aktuellen Durchführung der Schritte als die alte Maßzahl verwendet wird. Die genannten Schritte können so oft wiederholt werden, bis eine Ansteuerung der adaptiven Optik in der jeweiligen Änderungs richtung erreicht ist, bei der die Maßzahl ein Extremum also entweder ein Minimum oder ein Maximum erreicht. Als Kriterium für das Erreichen des Extremums kann zum Beispiel heran gezogen werden, dass der Unterschied der neuen Maßzahl zu der alten Maßzahl einen auf die letzte Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik bezogenen Grenzwert unterschreitet oder dass der Unterschied der neuen Maßzahl zu der alten Maßzahl über die letzten Wiederholungen der Schritte wiederholt seine Richtung wechselt.
Weiterhin kann die Größe der Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik bei jeder Wieder holung der Schritte von der Größe des Unterschieds der neuen Maßzahl zu der alten Maßzahl bei mindestens einem der vorhergehenden Schritte abhängig sein. So kann ein Überschießen des gesuchten Extremums der jeweiligen Metrik durch eine zu starke Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik vermieden werden. Das Messsignal, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem ausgewählten Licht beein flusst und zum Erhalten des ersten und des zweiten Messwerts integriert wird, kann insbesondere aus der Probe emittiertes Messlicht sein. Dabei kann dieses Messlicht mit dem optischen System auf einen das Messlicht erfassenden und ggf. direkt integrierenden Detektor abgebildet werden. Bei der Abbildung des Messlichts auf den Detektor wirken sich die zu korrigierenden aberrations induzierten Abbildungsfehler des optischen Systems aus. Je nach Art der Erfassung des Mess lichts kann diese zusätzliche Auswirkung aber unerheblich sein. Dies gilt beispielsweise in allen Fällen, in denen der Detektor das Messlicht aus dem Fokusbereich ohne räumlicher Auflösung registriert.
Die Änderungsrichtung, in der die Ansteuerung der adaptiven Optik bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geändert wird, kann aus verschiedenen Änderungsrichtungen ausgewählt werden. Hierzu zählen insbesondere die Änderungsrichtungen, in denen eine sphä rische Aberration, ein Defokus, ein Astigmatismus oder eine Koma des optischen Systems kompensierbar ist. Welche Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik einen besonders großen Beitrag zur Annäherung an das jeweilige Extremum der erfindungsgemäßen Metrik liefert, hängt von dem jeweiligen optischen System und insbesondere der jeweiligen Probe ab. Vielfach ist es ausreichend, nur eine der genannten Aberrationen zu kompensieren, um die Abbildungsfehler des optischen Systems sehr klein zu halten. Dies kann insbesondere die sphärische Aberration sein.
Das Licht, dessen Intensität in dem Fokusbereich sich auf die zeitliche Veränderung des Mess signals auswirkt, kann aus solchem Licht ausgewählt werden, das zu einer exponentiellen Abnah me des Messsignals gegen null mit der Zeit führt oder das zu einer exponentiellen Annäherung des Messsignals von unten an den Sättigungswert mit der Zeit führt. Wenn beispielsweise das Messsignal Fluoreszenzlicht ist, das von Fluoreszenzfarbstoffen in der Probe emittiert wird, kann das ausgewählte Licht Anregungslicht sein, das die Fluoreszenzfarbstoffe in dem Fokusbereich in einen fluoreszenten Zustand anregt, bis sich die Intensität des resultierenden Fluoreszenzlichts von den Fluoreszenzfarbstoffen an den Sättigungswert annähert.
Wenn die Fluoreszenzfarbstoffe durch zu dem Licht zusätzliches Anregungslicht in dem Fokus bereich in einen fluoreszenten Zustand angeregt werden, aus dem sie das Fluoreszenzlicht als Messlicht emittieren, kann das ausgewählte Licht Stimulationslicht sein, das die Fluoreszenzfarb stoffe zu stimulierter Emission stimuliert, bevor die Fluoreszenzfarbstoffe das Fluoreszenzlicht emittieren. Dann hängt das nach der Einwirkung des Stimulationslichts verbleibende Fluores zenzlicht nichtlinear von der Intensität des Stimulationslichts ab. Konkret kann das zusätzliche Anregungslicht zusammen mit dem Stimulationslicht von dem optischen System in den Fokus bereich in der Probe fokussiert werden. Wenn dabei eine Intensitätsverteilung des ausgewählten Lichts ein zentrales Intensitätsminimum aufweist, das in dem Fokusbereich mit einem zentralen Intensitätsmaximum des Anregungslichts zusammenfällt, liegen Intensitätsverteilungen des Anregungslichts und des Stimulationslichts vor, wie sie auch bei der STED-Mikroskopie zur Anwendung kommen. So führt das erfindungsgemäße Verfahren zur Korrektur der aberra tionsinduzierten Abbildungsfehler des Abbildungssystems, die sich negativ auf die räumlich eng begrenzte effektive Punktverschmierungsfunktion bei der Anregung der jeweiligen Probe zur Fluoreszenz auswirken.
Wenn dann konkret der dritte Zeitraum bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens so vor dem ersten Zeitraum beginnt und die Intensität des Lichts in dem zentralen Intensitäts minimum benachbarten Intensitätsmaxima der Intensitätsverteilung des Stimulationslichts so hoch ist, dass das Messsignal zu mehr als 50 %, vorzugsweise zu mehr als 66 % oder noch mehr bevorzugt zu mehr als 90 % aus einem Umfeld des Intensitätsminimums stammt, dessen Abmessungen in zumindest einer Raumrichtung kleiner als eine Beugungsgrenze bei beiden Längen des Lichts und des Fluoreszenzlichts sind, korrigiert das erfindungsgemäße Verfahren die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler für eben dieses Umfeld des Intensitätsminimums. Obwohl dieses Umfeld das Intensitätsminimum, das dem bei der STED-Mikroskopie jeweils gemessenen Punkt der Probe entspricht, zwar umschließt aber selbst nicht einschließt, bedeutet dies auch eine Korrektur der aberrationsinduzierten Abbildungsfehler für den jeweils gemessenen Punkt der Probe. Diese Korrektur ist für den jeweils gemessenen Punkt der Probe sogar hoch spezifisch, weil die Abmessungen des Umfelds bereits kleiner als die Beugungsgrenze bei Wellenlängen des Lichts und des Fluoreszenzlichts sind.
Da die Anforderungen an das Anregungslicht und das Stimulationslicht bei der Durchführung der hier zuletzt beschriebenen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens den Anforde rungen bei der STED-Mikroskopie vollständig entsprechen können, kann das erfindungsgemäße Verfahren während der laufenden Durchführung einer STED-mikroskopischen Messung oder auch einer STED-mikroskopischen Bildaufnahme durchgeführt werden. Konkret können die für die jeweilige Messung bzw. Bildaufnahme registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, wenn sie mit zeitlicher Auflösung registriert werden, so dass sie dem ersten und dem zweiten Zeitraum zugeordnet werden können. Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch schon vor der Verwendung des optischen Systems zum eigentlichen Abbilden der Probe durchgeführt werden.
Bei der der STED-Mikroskopie gleichenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens ist die als Quotient, in dessen Nenner der erste Messwert und in dessen Zähler der zweite Messwert steht, bestimmte Maßzahl als zu minimierende Metrik zu verwenden. Dies bedeutet, dass dann, wenn die jeweilige als Quotient bestimmte neue Maßzahl kleiner als die jeweilige als Quotient bestimmte alte Maßzahl ist, die Ansteuerung der adaptiven Optik erneut in der bisherigen Änderungsrichtung zu ändern ist, weil die kleiner werdende Metrik kleiner werdende aberrationsinduzierte Abbildungsfehler anzeigt.
Hiermit wird ein Unterschied zu solchen Verfahren deutlich, die zur Justierung eines STED- Mikroskops die Helligkeit eines aufgenommenen Bilds, d. h. die Intensität des nach dem Einwirken des Stimulationslichts verbleibenden Fluoreszenzlichts als eine zu maximierende Metrik verwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren zielt in seiner der STED-Mikroskopie gleichenden Ausführungsform stattdessen darauf ab, dass das Stimulationslicht im dem gesamten Fokusbereich die Emission von Fluoreszenzlicht soweit als möglich verhindert. Dies erfordert die maximale Intensität des Stimulationslichts in dem Fokusbereich, wie sie nur ohne aberrationsinduzierte Abbildungsfehler erreicht wird. Die verbleibende Emission von Fluores zenzlicht aus dem Intensitätsminimum der Intensitätsverteilung des Stimulationslicht, die mit kleiner werdenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern sogar zunehmen kann, spielt dabei keine die Funktion des erfindungsgemäßen Verfahrens störende Rolle.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können der jeweilige erste Zeitraum, der jeweilige zweite Zeitraum und auch der jeweilige dritte Zeitraum unabhängig voneinander jeweils ein geschlos sener Zeitraum oder aus voneinander zeitlich beabstandeten Teilzeiträumen zusammengesetzt sein. Dass der dritte Zeitraum aus Teilzeiträumen zusammengesetzt ist, kann zum Beispiel bedeuten, dass das Licht jeweils in mehreren sehr schnell aufeinander folgenden Pulsen, die beim Registrieren des Messsignals nicht aufgelöst werden, in den Fokusbereich gerichtet wird. Dass der erste Zeitraum und/oder der zweite Zeitraum aus Teilzeiträumen zusammengesetzt ist, kann bedeuten, dass das Messsignal aus der Probe jeweils in mehreren zeitlich aufeinander folgenden Teilzeiträumen registriert wird, zwischen denen sich Totzeiten der Registrierung des Messsignals befinden. In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeutet, dass der erste, der zweite und der dritte Zeitraum aus Teilzeiträumen zusammengesetzt sind, dass der Fokusbereich zwischen jeweils einem Teilzeitraum des ersten, des zweiten und des dritten Zeitraums in der Probe etwas verschoben wird, bevor jeweils ein zweiter und anschließend eventuell weitere Teilzeiträume des ersten Zeitraums, des zweiten Zeitraums und des dritten Zeitraums folgen. Auf diese Weise wird beim Erfassen und ggf. Integrieren des Messsignals über einen räumlichen Bereich der Probe gemittelt. Dies hat sich insbesondere bei der der STED- Mikroskopie-nahen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als vorteilhaft erwie sen, um Effekte einer mit hoher Raumfrequenz schwankender Konzentrationen der Fluoreszenz- farbstoffe in der Probe auf die als Metrik verwendete Maßzahl heraus zu mittein.
Anders gesagt kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Erfassen und ggf. Integrieren des Messsignals über gleiche erste und gleiche zweite Zeiträume, wobei das Licht über einen gleichen dritten Zeitraum in dem Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, für mehrere Bildpunkte durchgeführt werden, um den jeweiligen ersten Messwert und den jeweiligen zweiten Messwert zu erhalten.
Bei einem erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer ersten Lichtquelle für Anregungslicht, einer zweiten Lichtquelle für Stimulationslicht, einem Objektiv und einer Korrek turvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern, die eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv umfasst, ist die Korrekturvorrichtung zur Durchführung der folgenden Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet: Erfassen des Mess signals über den ersten Zeitraum und den zweiten Zeitraum, wobei das Stimulationslicht als das Licht, das das Messsignal beim Einwirken auf die Probe reduziert, über den dritten Zeitraum in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, um den ersten Messwert und den zweiten Messwert zu bestimmen; Bestimmen der Maßzahl aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert; und Verwenden der Maßzahl beim Ansteuern der adaptiven Optik als durch das Ändern der Ansteuerung zu optimierenden Metrik.
Die adaptive Optik des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops kann zum Beispiel einen adaptiven Spiegel und/oder ein ansteuerbares Mikrospiegelarray und/oder einen SLM (Spatial- Light-Modulator) aufweisen. Insbesondere der SLM kann bei der STED-Mikroskopie-nahen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zugleich zur Wellenfrontformung bei dem Stimulationslicht derart genutzt werden, dass das Stimulationslicht die Intensitätsverteilung mit dem zentralen Intensitätsminimum in dem Fokusbereich ausbildet.
Bei einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv aufweist, werden erstes Licht, zweites Licht und eine Probe so ausgewählt, dass das erste Licht beim Einwirken auf die Probe ein erstes Messsignal von Bestandteilen der Probe mit einer ersten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer ersten Potenz von einer Intensität des ersten Lichts abhängt, und dass das zweite Licht beim Einwirken auf die Probe das erste oder ein zweites Messsignal von denselben Bestandteilen der Probe mit einer zweiten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer zweiten Potenz von einer Intensität des zweiten Lichts abhängt, wobei die erste und die zweite Potenz um mindestens eins verschieden sind. Dann wird das erste Licht mit dem optischen System in einen Fokusbereich des optischen Systems in der Probe fokussiert, wobei das von dem ersten Licht angeregte erste Messsignal aus dem Fokusbereich über einen ersten Zeitraum erfasst wird, um einen ersten Messwert zu bestimmen. Weiterhin wird das zweite Licht mit dem optischen Signal in den Fokusbereich in der Probe fokussiert, wobei das von dem zweiten Licht angeregte erste oder zweite Messsignal aus dem Fokusbereich in der Probe über einen zweiten Zeitraum erfasst wird, um eine zweiten Messwert zu bestimmen. Dann wird aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert eine Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion einer relativen Änderung des ersten Messsignals oder eines relativen Unterschieds zwischen dem ersten und dem zweiten Messsignal ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik als Metrik verwendet, die durch Ändern der Ansteuerung zu optimieren ist.
Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren werden die unterschiedlichen Abhängigkeiten der ersten und zweiten Übergangswahrscheinlichkeiten von der Intensität des ersten und zweiten Lichts bei der Anregung des jeweiligen Messsignals ausgenutzt, um eine Maßzahl zu bestimmen, die beim Ansteuern der adaptiven Optik als zu optimierende Metrik verwendet wird. Am einfachsten ist es auch bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren die Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des ersten Messsignals oder des relativen Unterschieds zwischen dem ersten und dem zweiten Messsignal ist, durch Bildung eines Quotienten zwischen dem ersten und dem zweiten Messwert bestimmt. Weil die erste und die zweite Übergangswahrscheinlichkeit mit einer ersten und zweiten Potenz von der Intensität des Lichts abhängen, die um mindestens eins verschieden sind, während die Intensitäten des ersten und des zweiten Lichts von den aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern beide in gleicher Weise abhängen, ist dieser Quotient von den Abbildungsfehlern abhängig. Alle anderen Einflüsse auf die beiden Messwerte gehen hingegen in einen konstanten Faktor des Quotienten ein, der sich beim Bestimmen des ersten und des zweiten Messwerts für jeweils denselben Fokusbereich mit den aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern nicht ändert. Dies gilt grundsätzlich sogar dann, wenn das erste Licht andere Bestandteile der Probe in demselben oder selbst einem anderen Fokusbereich zur Emission des ersten Messsignals anregt als das zweite Licht. Indem bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren das jeweilige Messsignal mit dem ersten bzw. zweiten Licht jedoch in demselben Fokusbereich von denselben Bestandteilen der Probe angeregt wird, wird die Maßzahl von dem betrachteten Ort der Probe im Wesentlichen unabhängig. Das mit dem zweiten Licht angeregte Messsignal kann dasselbe Messsignal wie das mit dem ersten Licht angeregte Messsignal sein, was die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verein fachen kann, es kann sich aber auch um ein zweites Messsignal, beispielsweise um Messlicht einer anderen Wellenlänge handeln.
Konkret kann das erste Licht das erste Messsignal von den Bestandteilen der Probe durch ein Einphotonenprozess anregen, während das zweite Licht das erste oder das zweite Messsignal von denselben Bestandteilen der Probe durch ein Mehrphotonenprozess anregt.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen denjenigen des voranstehend zuerst beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens.
Bei noch einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv aufweist, werden Licht und eine Probe ebenso wie bei dem oben zuerst beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt, d. h. so, dass das Licht beim Einwirken auf die Probe ein Messsignal aus der Probe entweder reduziert oder von unten an einen Sättigungswert annähert, wobei eine relative Änderung des Messsignals von einer Intensität des Lichts abhängt. Abweichend von beiden zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren wird bei diesem Verfahren das Licht mit einer zeitlichen Lichtmodulation seiner Intensität versehen und mit dem optischen System in einen Fokusbereich in der Probe fokussiert. Dabei wird das Messsignal aus dem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe zeitlich aufgelöst erfasst. Dann wird eine Phasenverschiebung zwischen der Lichtmodulation und einer Signalmodulation des Messsignals als Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik als Metrik verwendet, die durch Ändern der Ansteuerung zu optimieren, d. h. zu minimieren oder maximieren ist.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist das Äquivalent zu dem zuerst beschriebenen erfindungs- gemäßen Verfahren im Frequenzraum. Die Phasenverschiebung zwischen der Lichtmodulation und der Signalmodulation ist in ähnlicher Weise von den aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern abhängig wie der Quotient aus dem zweiten Messwert und dem ersten Messwert bei dem voranstehend zuerst erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren.
Die meisten oben erläuterten bevorzugten Ausführungsformen des zuerst beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher auch bevorzugte Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Be schreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beige fügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprüng lichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnun gen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merk malen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rück beziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombi niert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Aus führungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einer adaptiven Optik die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau eine adaptive Optik, zwei adaptive Optiken oder mehr adaptive Optiken vorhanden sind. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Verfahren bzw. das jeweilige Laser-Scanning-Mikroskop aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Um fangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungs beispiele weiter erläutert und beschrieben.
Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Laser-Scanning-Mikroskop.
Fig. 2 zeigt Lichtintensitätsverteilungen von Anregungslicht und Stimulationslicht im
Fokusbereich eines Objektivs des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1. Fig. 3 ist ein Histogramm von Photonen von Fluoreszenzlicht, das in dem Laser- Scanning-Mikroskop als Messsignal registriert wird, über der Zeit.
Fig. 4 zeigt eine Auftragung der erfindungsgemäßen Metrik über verschiedene gezielt hervorgerufene sphärische Aberrationen (schwarze Vierecke) und über eine freilaufende erfindungsgemäße Optimierung der Metrik (weiße Kreise). Fig. 5 ist eine Auftragung einer erfindungsgemäßen Metrik über einer sphärischen
Aberration des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1 beim Abbilden von mit Farbstoff gefüllten Kügelchen.
Fig. 6 zeigt im Vergleich zu Fig. 5 über derselben sphärische Aberration die Halbwerts breite von Abbildern der mit Farbstoff gefüllten Kügelchen. Fig. 7 zeigt im Vergleich zu Fig. 5 über derselben sphärischen Aberration die Intensität des Fluoreszenzlichts von den mit Farbstoff gefüllten Kügelchen.
Fig. 8 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einem Defokus des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1. Fig. 9 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einer sphärischen
Aberration des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1.
Fig. 10 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einem Astigmatismus des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1.
Fig. 11 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einer Koma des optischen
Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1.
Fig. 12 zeigt ein helles Abbild einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur und den zugehörigen Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einer sphäri schen Aberration.
Fig. 13 zeigt ein weniger helles Abbild derselben Struktur wie in Fig. 12 und den zugehörigen Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über derselben sphärischen Aberration.
Fig. 14 zeigt ein dunkles Bild derselben Struktur wie in Fig. 12 und 13 und den zugehörigen Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über derselben sphärischen Aberration. Fig. 15 zeigt eine Intensitätsverteilung von Anregungslicht und Stimulationslicht im
Fokusbereich eines Objektivs des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1 bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 16 zeigt verschiedene zeitliche Abfolgen eines ersten Zeitraums, in dem das Mess signal zu einem ersten Messwert integriert wird, eines zweiten Zeitraums, in dem das Messsignal zu einem zweiten Messwert integriert wird und einem dritten Zeitraum, in dem ausgewähltes Licht in den Fokusbereich des jeweiligen optischen Systems fokussiert wird.
Fig. 17 ist ein Ablaufdiagramm der wesentlichen Schritte eines erfindungsgemäßen
Verfahrens. Fig. 18 ist ein Ablaufdiagramm der wesentlichen Schritte eines weiteren erfindungs gemäßen Verfahrens.
Fig. 19 ist ein Ablaufdiagramm der wesentlichen Schritte noch eines weiteren erfin dungsgemäßen Verfahrens.
FIGURENBESCHREIBUNG Das in Fig. 1 dargestellte erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop 1 basiert auf einem STED-Mikroskop und weist entsprechend neben einer ersten Lichtquelle 2 für Anregungslicht 3 eine zweite Lichtquelle 4 für eine Anregung durch das Anregungslicht 3 wieder beseitigendes Licht 5 in Form von Stimulationslicht 6 auf. Jede der beiden Lichtquellen 2 und 4 umfasst einen Laser 7 bzw. 8, eine polarisationserhaltende Lichtleiterfaser 9 bzw. 10 und eine Kollimationsoptik 11 bzw. 12 für das aus der Lichtleiterfaser 9 bzw. 10 austretende Anregungslicht 3 bzw.
Stimulationslicht 6. In dem Strahlengang des Stimulationslichts 6 ist darüber hinaus ein SLM 13 zur Wellenfrontformung angeordnet, damit das Stimulationslicht 6 im Fokusbereich eines Objektivs 14 eine Lichtintensitätsverteilung mit einem zentralen Intensitätsminimum ausbildet. Das Stimulationslicht 6 wird hinter dem SLM 13 nach einer weiteren Optik 15 mithilfe eines dichroitischen Strahlteilers 16 mit dem Anregungslicht 3 zusammengeführt. Über einen deformierbaren Spiegel 17 als adaptive Optik 18 und noch eine weitere Optik 19 werden das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 in das Objektiv 14 eingekoppelt, das das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 gemeinsam in einen Fokusbereich in einer Probe 20 fokussiert. Die Optiken 15 und 19 sind so ausgebildet, dass der deformierbare Spiegel 17 und der SLM 13 in Ebenen stehen, die zu einer Eintrittspupille des Objektivs 14 konjugiert sind. Die Lage des Fokusbereichs, in dem das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 fokussiert werden, ist mithilfe eines Scanners 21 in der Probe 20 verschiebbar. In Fig. 1 ist der Scanner 21 als verfahrbarer Probentisch angedeutet. Der Scanner 21 kann jedoch auch anders ausgebildet sein, und speziell dazu, das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 gegenüber dem Objektiv 14 zu verlagern, insbesondere um ein Zentrum der Eintrittspupille des Objektivs 14 zu verkippen. Aus dem Fokusbereich in der Probe 20 aufgrund der Anregung von dort befindlichen Fluoreszenzfarbstoffen mit dem Anregungslicht 3 emittiertes Fluoreszenzlicht 22 wird mit einem zweiten dichroitischen Strahlteiler 23 aus dem Strahlengang des Anregungslichts 3 ausgekoppelt, mit einer Optik 24 in eine Multimode-Lichtleiterfaser 25 fokussiert und durch diese zu einem zeitlich auflösenden Detektor 26 geführt. Bei dem erfindungsgemäßen Laser-Scanning- Mikroskop 1 wird der deformierbare Spiegel 17 als im Strahlengang durch das Objektiv 14 angeordnete adaptive Optik 18 von einer Steuerung 27 angesteuert, der ein das Fluoreszenzlicht anzeigendes Messsignal 28 von dem Detektor 26 zugeführt wird. Statt des deformierbaren Spiegels 17 könnte die adaptive Optik 18 auch durch einen SLM, ein Mikrospiegelarray oder in anderer dem Fachmann bekannter Weise ausgebildet sein.
Fig. 2 zeigt Lichtintensitätsverteilungen 29 und 30 des Anregungslichts 3 und des Stimulations lichts 6 längs eines Schnitts in x-Richtung durch das Zentrum des Fokusbereichs. Die Inten sitätsverteilung 29 des Anregungslichts ist diejenige eines beugungsbegrenzten Spots. Die räumlich gesehen Donut-förmige Intensitätsverteilung 30 des Stimulationslichts weist in dem Zentrum 31 ein Intensitätsminimum in Form einer Nullstelle 32 auf, welche in dem Schnitt gemäß Fig. 2 von Intensitätsmaxima 33 begrenzt ist. In den Intensitätsmaxima 33 überschreitet die Intensität des Stimulationslichts eine Sättigungsintensität ls, die dazu führt, dass die Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen durch das Anregungslicht 3 vollständig zurückgeführt wird. Entsprechend kann das von dem Detektor 26 gemäß Fig. 1 registrierte Fluoreszenzlicht 22 dem Umfeld 34 der Nullstelle 32 zugeordnet werden, dessen Abmessungen weit unterhalb der Beu gungsgrenze liegen. Dies gilt aber nur für das Fluoreszenzlicht 22, welches erst dann registriert wird, wenn das Stimulationslicht 6 die Anregung durch das Anregungslicht 3 außerhalb des Umfelds 34 der Nullstelle 32 beseitigt hat. Fig. 3 zeigt die Zeitpunkte des Eintreffens der einzelnen Photonen des Fluoreszenzlichts 22 an dem Detektor 26 gemäß Fig. 1 nach einem Puls 35 des Anregungslichts und einem nach folgenden Puls 36 des Stimulationslichts. Zunächst steigt die pro Zeiteinheit registrierte Anzahl der Photonen durch die Anregung durch das Anregungslicht 3 während des Pulses 35 steil an. Dann fällt sie durch die Einwirkung des Stimulationslichts während des Pulses 36 steil ab. Die in einem Zeitraum 37 nach dem Puls 36 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 sind dann diejenigen aus dem Umfeld 34 der Nullstelle 32. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Anzahl der in dem Zeitraum 37 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 zu einer Anzahl von Photonen des Fluoreszenzlichts 22 in Beziehung gesetzt, die während eines früheren Zeitraums 38 registriert werden. Dieser frühere Zeitraum 38 wird hier auch als erster Zeitraum bezeichnet, während der Zeitraum 37 als zweiter Zeitraum bezeichnet wird. Gemäß Fig. 3 fallen die Pulse 35 und 36 in den ersten Zeitraum 38. Das in Beziehung Setzen der in dem zweiten Zeitraum 37 registrierten Photonen zu den in dem ersten Zeitraum 38 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 erfolgt erfindungsgemäß durch Bestimmen einer Maßzahl insbesondere durch Bildung eines Quotienten der in dem zweiten Zeitraum 37 registrierten Photonen und der in dem ersten Zeitraum 38 registrierten Photonen. Dabei beruht die Erfindung auf der Erkenntnis, dass diese Maßzahl ein Extremum annimmt, wenn die Steuerung 27 die adaptive Optik 18 so ansteuert, dass aberrationsinduzierte Abbildungsfehler des das Objektiv 14 umfassenden optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops 1 von der adaptiven Optik 18 genau kompen siert werden. Aberrationsinduzierte Abbildungsfehler des optischen Systems des Laser-Scan- ning-Mikroskops 1 gemäß Fig. 1 wirken sich auf die Intensitäten des Anregungslichts 3 und des Stimulationslichts 6 in dem Fokusbereich in der Probe 20 so aus, dass die Intensitäten mit zunehmenden Abbildungsfehlern kleiner werden. Aufgrund von zunehmenden Abbildungsfehlern geht also mit der Intensität des Anregungslichts auch die Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen in der Probe 20 und damit das Fluoreszenzlicht 22 zurück. Dieser Rückgang ist jedoch nicht von anderen Rückgängen der Intensität des Fluoreszenzlichts 22 zu unterscheiden, wie beispielsweise ein durch räumliche Variationen der Konzentration der Fluoreszenzfarbstoffe oder ein durch Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe verursachter Rückgang. Wenn man jedoch die relative Auswirkung des Stimulationslichts 6 auf die zuvor von dem Anregungslicht 3 angeregten Fluoreszenzfarbstoffe betrachtet, die durch die aus den in den beiden Zeiträumen 37 und 38 registrierten Photonen bestimmte Maßzahl angezeigt wird, ist diese nur von der Intensität des Stimulationslichts 6 abhängig. Umso weniger Photonen in dem zweiten Zeitraum 37 gegenüber den Photonen in dem ersten Zeitraum 38 registriert werden, umso mehr Fluoreszenzfarbstoffe regt das Stimulationslicht 6 vor dem zweiten Zeitraum 37 ab, was gleichbedeutend damit ist, dass die Intensität des Stimulationslichts umso höher ist und die aberrationsinduzierten Abbildungs fehler umso geringer sind. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 ist die Auswirkung von aberrationsin duzierten Abbildungsfehlern auch so erklärbar, dass die Sättigungsintensität ls bei durch aberrationsinduzierte Abbildungsfehler insgesamt reduzierter Intensitätsverteilung 30 des Stimu lationslichts 6 erst in größerem Abstand zu der Nullstelle 32 überschritten wird und entsprechend mehr Fluoreszenzlicht aus dem Umfeld 34 der Nullstelle 32 übrigbleibt. Die in Fig. 4 aufgetragene Metrik ist der Quotient aus den in dem ersten Zeitraum 38 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 geteilt durch die in den zweiten Zeitraum 37 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22. Die Metrik steigt also dann an, wenn in dem zweiten Zeitraum 37 relativ weniger Photonen registriert werden als in dem ersten Zeitraum 38, weil das Stimula- tionslicht 3 aufgrund einer erhöhten Intensität eine stärkere reduzierende Auswirkung auf das Fluoreszenzlicht 22 hatte. Dargestellt sind die Auswirkungen von sechs künstlich bei dem Laser- Scanning-Mikroskop 1 gemäß Fig. 4 mit der adaptiven Optik 18 eingeführten sphärischen Aber rationen (schwarze Quadrate). Die zunehmenden sphärischen Aberrationen führen unabhängig von ihrem Vorzeichen zu zunehmenden Abnahmen der Metrik gegenüber deren Maximum. Dieses Maximum bei einer künstlich eingeführten Aberration von null ließ sich überdies durch eine freilaufende erfindungsgemäße Optimierung der Metrik mittels Variation der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 durch die Steuerung 27 gemäß Fig. 1 gegenüber der Ausgangssituation signifikant steigern (weiße Kreise). Für Fig. 4 wurde die Metrik bei einer 2D-STED-Aufnahme einer Schicht mit 40 nm großen Farbstoff gefüllten Kügelchen mit dem Laser-Scanning-Mikroskop 1 gemäß Fig. 1 erstellt, wobei die Photonen des Fluoreszenzlichts 22 gemäß Fig. 3 zeitaufgelöst registriert wurden.
Fig. 5 ist eine Auftragung derselben erfindungsgemäßen Metrik wie in Fig. 4, wobei STED-Bilder einzelner 40 nm großen Farbstoff gefüllten Kügelchen für verschiedene mit der adaptiven Optik 18 gezielt eingebrachte sphärische Aberrationen aufgenommen wurden. Fig. 6 zeigt die entsprechenden Halbwertsbreiten der Abbilder der einzelnen Kügelchen und Fig. 7 die Fluores zenzlichtintensität von den einzelnen Kügelchen, jeweils aufgetragen über dieselben einge- brachten Aberrationen. Der Vergleich der Fig. 5 bis 7 zeigt, dass das Maximum der erfindungs gemäßen Metrik in Fig. 5 innerhalb eines deutlich breiteren Minimums der Halbwertsbreite in Fig. 6 und innerhalb eines ebenfalls noch breiteren Maximums der Intensität des Fluoreszenz- lichts in Fig. 7 erreicht wird. Dies ist der Hintergrund, warum es bei dem erfindungsgemäßen Optimieren der Metrik zur Beseitigung der aberrationsinduzierten Abbildungsfehler des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops 1 gemäß Fig. 1 möglich ist, die Ansteuerung der adap tiven Optik 18 mit dem Ziel der Optimierung der Metrik versuchsweise zu ändern, ohne damit bereits die Abbildungsqualität des Laser-Scanning-Mikroskops 1 zu verschlechtern. Von den in den Fig. 5 bis 7 über der sphärische Aberration aufgetragenen Kriterien spricht die erfindungsgemäße Metrik am schnellsten auf die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler an, so dass die Metrik ihr Extremum bereits erkennbar verlassen hat, bevor bei den anderen Kriterien ein Verlassen des Extremums und damit eine Verschlechterung der Bildqualität zu erkennen ist. Die Fig. 8 bis 11 zeigen den Einfluss unterschiedlicher Aberrationen auf die erfindungsgemäße Metrik gemäß Fig. 4 und 5. Dabei zeigt sich sowohl bei einem Defokus gemäß Fig. 8, als auch der sphärischen Aberration gemäß Fig. 9, als auch einem als Astigmatismus gemäß Fig. 10, als auch einer Koma gemäß Fig. 11 ein globales Maximum der Metrik dann, wenn die jeweilige Aberration null beträgt. Das Optimieren der Metrik ist damit zur Beseitigung von Abbildungs fehlern geeignet, die auf jeder dieser vier verschiedenen Aberrationen beruhen.
In den Fig. 12 bis 14 ist jeweils ein Bild derselben Struktur mit unterschiedlichen Helligkeiten gezeigt und die zugehörige Auftragung der Metrik entsprechend Fig. 4, d. h. einmal mit vorgegebenen Aberrationen (schwarze Quadrate) und einmal bei freilaufender Optimierung (weiße Kreise) aufgetragen. Die unterschiedlichen Helligkeiten der Abbilder der Struktur basieren auf einem unterschiedlich weit fortgeschrittenen Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Struktur markiert ist. Unabhängig von der Helligkeit der Abbilder zeigt die Metrik ihr Maximum immer bei der gleichen künstlich eingeführten sphärischen Aberration nahe null, und das erfindungsgemäße Optimieren der Metrik ist erfolgreich. Die erfindungsgemäße Beseitigung aberrationsinduzierter Abbildungsfehler erfolgt daher zuverlässig unabhängig von der Bild helligkeit.
Fig. 15 illustriert eine alternative Intensitätsverteilung 30 des Stimulationslichts 6 gegenüber der Intensitätsverteilung 29 des Anregungslichts 3. Konkret bildet das Stimulationslicht 6 ebenfalls einen beugungsbegrenzten Spot aus. Auch dann führt das Optimieren eines Quotienten von frühen und späten Photonen des Fluoreszenzlichts durch Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 gemäß Fig. 1 zu einer Beseitigung aberrationsinduzierter Abbildungsfehler. Dies gilt wie bei der Intensitätsverteilung 30 des Stimulationslichts 6 im Übrigen auch dann, wenn das Stimulationslicht 6 die Sättigungsintensität ls nicht erreicht.
Fig. 16 illustriert verschiedene Abfolgen des ersten Zeitraums 38, in dem das Messsignal 28 von der Probe 20 aufintegriert wird, des späteren zweiten Zeitraums 37, in dem das Messsignal 28 erneut aufintegriert wird, und eines dritten Zeitraums 39, in dem das sich auf das Messsignal 28 auswirkende Licht 5 in den Fokusbereich der Probe 20 fokussiert wird. Der dritte Zeitraum 39 entspricht dem Puls 36 gemäß Fig. 3, in dem dort das Stimulationslicht 6 auf die Probe gerichtet wird. Gemäß Fig. 3 folgte der Zeitraum 37 direkt auf den Zeitraum 38, und der Zeitraum 39 bzw. der Puls 36 überlappt mit dem späteren Teil des Zeitraums 38. Gemäß Fig. 16 a) ist die Abfolge der Zeiträume 37 und 38 dieselbe. Der dritte Zeitraum 39 überdeckt den ersten Zeitraum 38 aber vollständig. Gemäß Fig. 16 b) ist die Abfolge der Zeiträume 37 und 38 wieder dieselbe. Hier überlappt der dritte Zeitraum 39 aber sowohl mit einem Teil des ersten Zeitraums 38 als auch mit einem Teil des zweiten Zeitraums 37. Gemäß Fig. 16 c) ist die Abfolge der Zeiträume 37 und 38 erneut dieselbe. Hier überlappt der dritte Zeitraum 39 jedoch nur mit dem zweiten Zeitraum 37. Gemäß Fig. 16 d) ist der dritte Zeitraum 39 ohne Überlappung zwischen den Zeiträumen 37 und 38 angeordnet. In jedem Fall wirkt sich das in dem dritten Zeitraum 39 in die Probe 20 fokussierte Licht 5 stärker auf das über den späteren Zeitraum 37 integrierte Messsignal als auf das über den Zeitraum 38 integrierte Messsignal aus, weil das Licht 5 das Messsignal 28, beispielsweise in Form des Fluoreszenzlichts 22 gemäß Fig. 1 , immer weiter reduziert. So wäre der durch das Integrieren des Messsignals 28 in dem ersten Zeitraum 38 erhaltene Messwert nur dann nicht weniger von dem Licht 5 beeinflusst als der durch das Integrieren des Messsignals 28 in dem zweiten Zeitraum 37 gewonnene zweite Messwert, wenn der dritte Zeitraum 39 vollständig vor dem ersten Zeitraum 38 läge.
Das in Fig. 17 gezeigte Ablaufdiagramm 40 eines erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt mit einem Auswählen 41 des Lichts 5 und der Probe 20, so dass das Licht 5 beim Einwirken auf die Probe 20 das Messsignal 28 aus der Probe 20 entweder reduziert oder von unten an ein Sättigungswert annähert, wobei eine Änderung des Messsignals 28 von einer Intensität des Lichts 5 abhängt. Dann wird bei einem Erfassen 42 das Messsignal aus einem Fokusbereich des optischen Systems, dessen aberrationsinduzierte Abbildungsfehler zu korrigieren sind, in der Probe 20 über den ersten Zeitraum 38 erfasst und beispielsweise integriert, um den ersten Messwert zu bestimmen, und über den späteren zweiten Zeitraum 37, um den zweiten Messwert zu bestimmen, wobei das Licht 5 über den dritten Zeitraum 39 mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe 20 fokussiert wird. Aus dem ersten und dem zweiten Messwert wird bei einem Bestimmen 43 eine neue Maßzahl beispielsweise in Form eines neuen Quotienten bestimmt, und dann wird bei einem Bestimmen 44 ein Unterschied der neuen Maßzahl zu einer früheren Maßzahl bestimmt. Je nach Richtung des Unterschieds der Maßzahlen wird bei einem Ändern 45 der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 eine Richtung einer früheren Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 beibehalten oder gewechselt. Die Schritte 42 bis 45 werden in einer Schleife 46 wiederholt. Während dieser Wiederholungen kann der Fokusbereich des optischen Systems in der Probe 20 verschoben werden, um fortlaufend für verschiedene Lagen des Fokusbereichs in der Probe 20 aberrationsinduzierte Abbildungsfehler des optischen Systems mit der adaptiven Optik 18 optimal zu kompensieren. Auch während des Erfassens 42 des Messsignals 28 zum Bestimmen des ersten und des zweiten Messwerts kann der Fokusbereich in der Probe 20 verschoben werden, um eine räumliche Mittelung durchzuführen. Dazu sind die Zeiträume 37 bis 39 in entsprechende Teilzeiträume aufzuteilen, von denen jeweils einer dem jeweiligen Ort des Fokusbereichs in der Probe 20 zugeordnet ist.
Fig. 18 zeigt ein Ablaufdiagramm 40 eines gegenüber dem anhand von Fig. 17 erläuterten Verfahren wie folgt modifizierten Verfahrens. Bei einem Auswählen 47 werden erstes und zweites Licht und eine Probe so ausgewählt, dass das erste Licht beim Einwirken auf die Probe 20 ein erstes Messsignal von Bestandteilen der Probe mit einer ersten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer ersten Potenz von einer Intensität des ersten Lichts abhängt, und dass das zweite Licht beim Einwirken auf die Probe ein zweites Messsignal von denselben Bestandteilen, also insbesondere denselben Fluoreszenzfarbstoffen, der Probe mit einer zweiten Übergangs wahrscheinlichkeit anregt, die mit einer zweiten Potenz von einer Intensität des zweiten Lichts abhängt, wobei die erste und die zweite Potenz um mindestens eins verschieden sind. Bei einem Fokussieren 48 wird dann zunächst das erste Licht mit dem optischen System in einen Fokusbereich des optischen Systems in der Probe fokussiert, wobei das von dem ersten Licht angeregte erste Messsignal aus dem Fokusbereich über einen ersten Zeitraum 38 erfasst wird, um einen ersten Messwert zu bestimmen. Dann wird bei einem weiteren Fokussieren 49 das zweite Licht mit dem optischen System in denselben Fokusbereich in der Probe 20 fokussiert, wobei das von dem zweiten Licht angeregte zweite Messsignal aus dem Fokusbereich in der Probe über eine zweiten Zeitraum 37 erfasst wird, um einen zweiten Messwert zu bestimmen. Anschließend wird bei dem Bestimmen 43 in derselben Weise wie bei dem anhand von Fig. 7 erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren eine neue Maßzahl beispielsweise in Form eines neuen Quotienten bestimmt, und dann wird bei dem Bestimmen 44 ein Unterschied der neuen Maßzahl zu einer früheren Maßzahl bestimmt sowie bei einem Ändern 45 die Ansteuerung der adaptiven Optik 18 in derselben wie oder einen anderen Richtung als zuvor geändert. Die in der Schleife 46 wiederholten Schritte umfassen hier die Schritte 48, 49 und 43 bis 45.
Bei dem in Fig. 19 anhand des Ablaufdiagramms 40 dargestellten weiteren erfindungsgemäßen Verfahren entspricht das Auswählen 41 dem Auswählen 41 gemäß Fig. 17. Das anschließende Fokussieren 50 des ausgewählten Lichts erfolgt jedoch mit einer zeitlichen Lichtmodulation seiner Intensität und das gleichzeitige Erfassen des Messsignals 28 erfolgt zeitlich aufgelöst. Als neue Maßzahl wird dann bei einem Bestimmen 51 eine Phasenverschiebung zwischen der Lichtmo dulation und einer Signalmodulation des Messsignals 28 bestimmt. Bei dem Bestimmen 44 wird dann der Unterschied dieser neuen Maßzahl zu einer alten Maßzahl bestimmt, und das Ändern 45 der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 erfolgt abhängig von diesem Unterschied. Die Schleife 46 umfasst hierbei die Schritte 50, 51 , 44 und 45.
BEZUGSZEICHENLISTE
Laser-Scanning-Mikroskop
erste Lichtquelle
Anregungslicht
zweite Lichtquelle
Licht
Stimulationslicht
Laser
Laser
Lichtleiterfaser
Lichtleiterfaser
Kollimationsoptik
Kollimationsoptik
SLM
Objektiv
Optik
dichroitischer Strahlteiler
deformierbarer Spiegel
adaptive Optik
Optik
Probe
Scanner
Fluoreszenzlicht
dichroitischer Strahlteiler
Optik
Multimode-Lichtleiterfaser
Detektor
Steuerung
Messsignal
Lichtintensitätsverteilung
Lichtintensitätsverteilung
Zentrum
Nullstelle Intensitätsmaximum Umfeld
Puls
Puls
zweiter Zeitraum erster Zeitraum dritter Zeitraum Ablaufdiagramm Auswählen
Erfassen
Bestimmen
Bestimmen
Ändern
Schleife
Auswählen
Fokussieren Fokussieren Fokussieren Bestimmen
Sättigungsintensität

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv (14) und eine adaptive Optik (18) im Strahlengang durch das Objektiv (14) aufweist,
wobei Licht (5) und eine Probe (20) so ausgewählt werden, dass das Licht (5) beim Einwirken auf die Probe (20) ein Messsignal (28) aus der Probe (20)
entweder reduziert
oder von unten an einen Sättigungswert annähert,
wobei eine relative Änderung des Messsignals (28) von einer Intensität des Lichts (5) abhängt, wobei das Messsignal (28) aus einem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe (20) über einen ersten Zeitraum (38) erfasst wird, um einen ersten Messwert zu bestimmen, wobei das Messsignal (28) aus dem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe (20) über einen zweiten Zeitraum (37) erfasst wird, um einen zweiten Messwert zu bestimmen, wobei das Licht (5) über einen dritten Zeitraum (39) mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird,
wobei der erste Zeitraum (38) zumindest teilweise früher als der zweite Zeitraum (37) liegt und/oder der zweite Zeitraum (37) zumindest teilweise später als der erste Zeitraum (38) liegt, wobei der dritte Zeitraum (39) mit dem ersten Zeitraum (38) und/oder dem zweiten Zeitraum (37) und/oder einem dazwischen liegenden Zwischenzeitraum zumindest teilweise zeitlich überlappt und
wobei aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert eine Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals (28) ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik (18) als Metrik verwendet wird, die durch Ändern (45) der Ansteuerung zu optimieren ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
dann, wenn das Licht (5) das Messsignal (28) aus der Probe (20) reduziert, eine absolute Änderung des Messsignals (28) auf einen Anfangswert des Messsignals normiert wird, um die Maßzahl zu bestimmen, während dann, wenn das Licht (5) das Messsignal (28) aus der Probe (20) von unten an einen Sättigungswert annähert, eine absolute Änderung des Messsignals (28) auf den Sättigungswert normiert wird, um die Maßzahl zu bestimmen.
3. Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv (14) und eine adaptive Optik (18) im Strahlengang durch das Objektiv (14) aufweist,
wobei erstes Licht (5), zweites Licht und eine Probe (20) so ausgewählt werden, dass das erste Licht (5) beim Einwirken auf die Probe (20) ein erstes Messsignal (28) von Bestandteilen der Probe (20) mit einer ersten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer ersten Potenz von einer Intensität des ersten Lichts (5) abhängt, und dass das zweite Licht beim Einwirken auf die Probe (20) das erste oder ein zweites Messsignal (28) von denselben Bestandteilen der Probe (20) mit einer zweiten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer zweiten Potenz von einer Intensität des zweiten Lichts abhängt, wobei die erste und die zweite Potenz um mindestens 1 verschieden sind,
wobei das erste Licht (5) mit dem optischen System in einen Fokusbereich des optischen Systems in der Probe (20) fokussiert wird, wobei das von dem ersten Licht (5) angeregte erste Messsignal (28) aus dem Fokusbereich über einen ersten Zeitraum (38) erfasst wird, um einen ersten Messwert zu bestimmen,
wobei das zweite Licht mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird, wobei das von dem zweiten Licht angeregte erste oder zweite Messsignal (28) aus dem Fokusbereich in der Probe (20) über einen zweiten Zeitraum (37) erfasst wird, um einen zweiten Messwert zu bestimmen,
wobei aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert eine Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion einer relativen Änderung des ersten Messsignals (28) oder eines relativen Unterschieds zwischen dem ersten und dem zweiten Messsignal (28) ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik (18) als Metrik verwendet wird, die durch Ändern (45) der Ansteuerung zu optimieren ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Licht (5) das erste Messsignal (28) von den Bestandteilen der Probe (20) durch einen Einphotonenprozess anregt, während das zweite Licht das erste oder das zweite Messsignal (28) von denselben Bestandteilen der Probe (20) durch einen Mehrphotonenprozess anregt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Messwert so bestimmt wird, dass er ein erstes Integral des Messsignals (28) über den ersten Zeitraum (38) anzeigt, und dass der zweite Messwert so bestimmt wird, dass er ein zweites Integral des Messsignals (28) über den zweiten Zeitraum (37) anzeigt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Maßzahl als Quotient des zweiten Messwerts und des ersten Messwerts bestimmt wird.
7. Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv (14) und eine adaptive Optik (18) im Strahlengang durch das Objektiv (14) aufweist,
wobei Licht (5) und eine Probe so ausgewählt werden, dass das Licht (5) beim Einwirken auf die Probe (20) ein Messsignal (28) aus der Probe (20)
entweder reduziert
oder von unten an einen Sättigungswert annähert,
wobei eine relative Änderung des Messsignals (28) von einer Intensität des Lichts (5) abhängt, wobei das Licht (5) mit einer zeitlichen Lichtmodulation seiner Intensität versehen und mit dem optischen System in einen Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird,
wobei das Messsignal (28) aus dem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe (20) zeitlich aufgelöst erfasst wird,
wobei eine Phasenverschiebung zwischen der Lichtmodulation und einer Signalmodulation des Messsignals als Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals (28) ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik (18) als Metrik verwendet wird, die durch Ändern (45) der Ansteuerung zu optimieren ist.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass eine alte Maßzahl bestimmt wird,
dass die Ansteuerung der adaptiven Optik (18) in einer Änderungsrichtung geändert wird, dass erneut das Messsignal (28) erfasst wird, wobei das Licht (5) erneut in den Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird,
dass eine neue Maßzahl bestimmt wird,
dass ein Unterschied zwischen der neuen Maßzahl und der alten Maßzahl bestimmt wird und dass abhängig von einer Richtung des Unterschieds die Ansteuerung der adaptiven Optik (18) in der bisherigen oder einer anderen Änderungsrichtung erneut geändert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte
erneut Erfassen des Messsignals (28), wobei das Licht (5) erneut in den Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird,
Bestimmen einer neuen Maßzahl,
Bestimmen (44) eines Unterschieds zwischen der neuen Maßzahl und der alten Maßzahl und
erneut Ändern (45) der Ansteuerung der adaptiven Optik (18) in der bisherigen oder einer anderen Änderungsrichtung abhängig von einer Richtung des Unterschieds,
mindestens ein weiteres Mal durchgeführt werden oder so viele Male durchgeführt werden, bis eine Ansteuerung der adaptiven Optik (18) in der Änderungsrichtung erreicht ist, bei der die Maßzahl ein Extremum erreicht, wobei jeweils eine der bei einer der vorherigen Durchführungen der Schritte bestimmten neuen Maßzahlen bei der aktuellen Durchführung der Schritte als die alte Maßzahl verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Messsignal (28) aus der Probe (20) emittiertes Messlicht ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Messlicht mit dem optischen System auf einen Detektor (26) abgebildet wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderungsrichtung, in der die Ansteuerung der adaptiven Optik (18) geändert wird, ausgewählt wird aus Änderungsrichtungen, in denen
eine sphärische Aberration,
ein Defokus,
ein Astigmatismus,
eine Koma
kompensierbar ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Messsignal (28) Fluoreszenzlicht (22) ist, das von Fluoreszenzfarbstoffen in der Probe (20) emittiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, soweit direkt oder indirekt rückbezogen auf Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzfarbstoffe durch das Licht (5) in dem Fokusbereich bis zur Annäherung an den Sättigungswert in einen fluoreszenten Zustand angeregt werden, aus dem die Fluoreszenzfarbstoffe das Fluoreszenzlicht (22) emittieren.
15. Verfahren nach Anspruch 13, soweit direkt oder indirekt rückbezogen auf Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzfarbstoffe durch zu dem Licht (5) zusätzliches Anregungslicht (3) in dem Fokusbereich in einen fluoreszenten Zustand angeregt werden, aus dem sie das Fluoreszenzlicht (22) emittieren, und dass das Licht (5) Stimulationslicht (6) ist, das die Fluoreszenzfarbstoffe zu stimulierter Emission stimuliert, bevor die Fluoreszenzfarbstoffe das Fluoreszenzlicht (22) emittieren.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das zusätzliche Anregungslicht (3) mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Intensitätsverteilung des Lichts (5) ein zentrales Intensitätsminimum aufweist, das in dem Fokusbereich mit einem zentralen Intensitätsmaximum des Anregungslichts (3) zusammenfällt.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, soweit indirekt rückbezogen auf Anspruch 6 und Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass dann, wenn die jeweilige als Quotient bestimmte neue Maßzahl kleiner als die jeweilige als Quotient bestimmte alte Maßzahl ist, wobei die Quotienten den jeweiligen ersten Messwert im Nenner und den jeweiligen zweiten Messwert im Zähler aufweisen, die Ansteuerung der adaptiven Optik (18) erneut in der bisherigen Änderungsrichtung geändert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3 oder einem der vorhergehenden Ansprüche, soweit direkt oder indirekt rückbezogen auf Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zeitraum (38), der zweite Zeitraum (37) und, soweit vorhanden, der dritte Zeitraum (39) unabhängig voneinander jeweils ein geschlossener Zeitraum oder aus voneinander zeitlich beabstandeten Teilzeiträumen zusammengesetzt sind.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Erfassen des Messsignals (28), wobei das Licht (5) in den Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird, für mehrere Bildpunkte durchgeführt werden, um die jeweilige Maßzahl zu bestimmen.
21. Laser-Scanning-Mikroskop (1) mit
einer ersten Lichtquelle (2) für Anregungslicht (3),
einer zweiten Lichtquelle (4) für Stimulationslicht (6),
einem Objektiv (14) und
einer Korrekturvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern, die eine adaptive Optik (18) im Strahlengang durch das Objektiv (14) umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturvorrichtung zur Durchführung der folgenden Schritte des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 7 oder einem der vorhergehenden Ansprüche, soweit direkt oder indirekt rückbezogen auf Anspruch 1 oder 7, ausgebildet ist:
Erfassen des Messsignals (28), wobei das Stimulationslicht (6) als das Licht (5), das das Messsignal (28) beim Einwirken auf die Probe (20) reduziert, in den Fokusbereich in der Probe (20) fokussiert wird,
Bestimmen der Maßzahl und
Verwenden der Maßzahl beim Ansteuern der adaptiven Optik (18) als die durch das Ändern (45) der Ansteuerung zu optimierende Metrik.
22. Laser-Scanning-Mikroskop (1) nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die adaptive Optik (18)
einen adaptiven Spiegel (17) und/oder
ein ansteuerbares Mikrospiegelarray und/oder
einen Spatial-Light-Modulator (SLM)
aufweist.
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