JP2022539474A - 収差起因性結像誤差を補正するための補正装置による方法および顕微鏡 - Google Patents

Abstract

対物レンズ（１４）および適応型光学系（１８）を有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するために、光（５）および試料（２０）は、試料（２０）に作用する際に光（５）が、試料（２０）からの測定信号（２８）を低減するように選択され、測定信号（２８）の相対的変化は、光（５）の強度に依存する。測定信号（２８）が、試料（２０）中にある光学システムの焦点領域から、第１およびその後の第２の期間（３８、３７）にわたり、第１および第２の測定値を決定するために検出される。第１および／または第２の期間と重なる第３の期間（３９）にわたり、光（５）が光学システムにより焦点領域に集束される。第１と第２の測定値から、測定信号（２８）の相対的変化に対する程度指数が決定され、適応型光学系（１８）の制御の際に最適化すべきメトリックとして使用される。【選択図】 図１７

Description

本発明は、対物レンズと、対物レンズを通る光線路にある適応型光学系とを有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するための方法に関する。さらに本発明は、励起光のための第１の光源と、刺激光のための第２の光線と、対物レンズと、収差起因性結像誤差を補正するための補正装置であって、対物レンズを通る光線路に適応型光学系を含む補正装置とを有するレーザ走査顕微鏡に関する。

収差起因性結像誤差は、一方では、光学システムが例えば十分にアクロマチックでない場合、この光学システム自体に起因することがある。他方では、光学システムの焦点領域の前方にある試料の領域も、根本的な収差を引き起こすことがある。

光学システムの補正すべき収差起因性結像誤差は、光強度分布を対物レンズによりそれぞれの試料に投影する際にも、試料を対物レンズにより結像する際にも影響を及ぼす。

非特許文献１から、収差起因性結像誤差の補正が公知であり、この結像誤差は、試料、特に厚い試料の光学特性の不均一性に起因するものである。ここではＣＯＡＴ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、コヒーレント光学的適合技術）と呼ばれる方法が適用され、この方法では、それぞれの試料による位相歪みが測定され、補償される。位相歪みの測定にも補償にも、ＳＬＭ（Ｓｐａｔｉａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、空間光変調器)が使用され、このＳＬＭによりＳＴＥＤ顕微鏡においてさらに、試料に集束された刺激光がドーナッツ状の強度分布を有するように刺激光の位相波面が変調される。試料による位相歪みは、刺激光の光線にＳＬＭによって位相パターンが刻み込まれることにより測定され、この位相パターンでは異なる領域に異なる周波数により位相シフトが変調される。ここでは、刺激光の光線が引き続き集束されるスポットの強度を時間的に分解して記録し、フーリエ変換により分析する。実際には、ＳＬＭにより刻み込まれた位相パターンの個々の領域において、収差起因性結像誤差を補償する位相ずれが求められる。具体的にはスポットの強度は、金ナノ粒子をスポットにより走査し、金ナノ粒子から散乱された刺激光を記録することにより検出される。対応してそれぞれのＳＴＥＤ顕微鏡を散乱光モードでドライブし、それぞれの試料の収差起因性結像誤差を補償すべき個所に金ナノ粒子を配置しなければならない。実際には、金ナノ粒子は、この方法の機能を実証するために、試料の上側と下側にだけ配置された。

特許文献１から、適応型光学系を用いてＳＴＥＤ顕微鏡において収差を補正する方法が公知であり、この方法では、画像鮮明度と画像明度とを組み合わせたメトリックが使用される。ＳＬＭまたは変形可能なミラーである光変調器を制御することにより、このメトリックが最大化または最小化される。画像鮮明度は、試料を画像に結像した後に初めて決定することができる。画像明度は、試料において対象構造をマークする蛍光マーカの濃度と密度に依存している。したがって、画像明度と画像鮮明度とを組み合わせるメトリックのそれぞれの最大と最小は、局所的な表現力しか有しておらず、試料の別の領域の別の最大または最小と比較することはできない。

非特許文献２から、ドーナッツ状の刺激光焦点をスポット状の励起光焦点と互いに整列するための方法が公知であり、この方法では、ＳＴＥＤ画像と蛍光ナノビーズの寿命画像との間のずれが決定され除去される。具体的にはそのために、ナノビーズからの蛍光光の正規化された空間強度分布の重心と、ナノビーズからの蛍光光の正規化された空間寿命強度分布の重心との間のずれが決定され調整される。

特許文献２から、対物レンズの焦点において励起光の最大強度とＳＴＥＤ光の最大強度とが一致する、ＳＴＥＤ顕微鏡の正確な調整を設定することが公知であり、蛍光色素によりマークされた試料内の構造を励起光の最大強度により走査し、試料の画像を、強度の異なる蛍光阻止光により構造を結像することによって形成する。この場合、形成された画像内にある構造の結像の位置の間のずれが計算され、調整される。

国際公開第２０１４／０２９９７８（Ａ１）号 国際公開第２０１８／０４２０５６（Ａ１）号

Ｗｅｉ Ｙａｎら：Ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｏｐｔｉｃａｌ ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＥＤ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｔｈｉｃｋ ｓａｍｐｌｅｓ， Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ５， Ｎｏ． ３，２０１７年６月 Ｙｉｆａｎ Ｗａｎｇら：Ａ ３Ｄ Ａｌｉｇｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ７７：９３５－９４０，２０１４年８月

本発明の基礎となる課題は、それぞれの試料を測定ないし結像するための結像システムないしレーザ走査顕微鏡の継続的使用中に、試料の異なる領域に対して結像誤差を補正することのできる、光学システムの収差起因性結像誤差の補正方法、および対物レンズと、収差起因性結像誤差を補正するための補正装置とを有するレーザ走査顕微鏡を提示することである。

この課題は、請求項１、３および７の特徴を備える方法、および請求項２１の特徴と備えるレーザ走査顕微鏡によって解決される。ここで請求項７の特徴を備える方法は、請求項１の特徴を備える方法と周波数空間において等価である。従属請求項２、４から６、および８から２０は本発明の方法の好ましい実施形態に関するものであり、請求項２２は、本発明のレーザ走査顕微鏡の好ましい実施形態に向けられたものである。

本発明は、試料を光により照明する際の焦点の品質に対する尺度であるメトリックを利用する。このメトリックを用いて、顕微鏡に発生し得るような収差を補正することができる。このことは、試料を照明するための光の分布を適応型光学系により、このメトリックが最適化されるように適合することによって可能である。そのために試料は、まず適応型光学系の所与の設定により光によって照明され、これにより、例えば蛍光光線を放射させるために光を案内することによって試料からの測定光が影響を受ける。引き続き測定信号が時間的に分解され検出され、後続の計算のために少なくとも１つの先行および後行の期間に分割される。２つの期間についての測定信号の測定値の比、例えば蛍光光の先行と後行の光子の比から、焦点の品質に対する尺度である程度指数（Masszahl）が計算される。この程度指数は、適応型光学系、例えば適応型ミラーの反復的適合によって最適化され、これにより収差が補正される。等価の程度指数を、周波数空間において決定することができる。

対物レンズと、対物レンズを通る光線路に配置された適応型光学系とを有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するための本発明の方法では、光と試料が、試料に作用する光が試料からの測定信号を低減するか、または測定信号を下方から飽和値に近似させるように選択され、ここで、測定信号の相対的変化は、光の強度に依存する。試料内にある光学システムの焦点領域から由来する測定信号が、第１の測定値を決定するために第１の期間にわたり検出され、第２の測定値を決定するために第２の期間にわたり検出される。第３の期間にわたり、選択光が光学システムにより試料の焦点領域に集束される。ここで第１の期間は、第２の期間よりも少なくとも部分的に先行し、および／または第２の期間は、第１の期間よりも少なくとも部分的に後行し、第３の期間は、第１の期間と、および／または第２の期間と、および／またはそれらの間にある中間期間と時間的に少なくとも部分的に重なる。第１の測定値および第２の測定値から、測定信号の相対的変化の極めて単調に上昇または下降する関数が決定され、適応型光学系の制御の際に、制御の変更によって最適化すべきメトリックとして使用される。

この本発明の方法を実施する際に、補正すべき収差起因性結像誤差が、選択光を光学システムにより試料の焦点領域に集束する際に影響を及ぼす。この集束の際に発生する結像誤差が補正されれば、この結像誤差は、焦点領域が結像システムにより結像される場合にも補正される。

補正すべき収差起因性結像誤差は、選択光が第３の期間で光学システムにより試料の焦点領域に集束される場合、選択光の強度がその最大値よりも、補正すべき収差起因性結像誤差なしで、すなわちいわゆるストレールレシオなしで低減されるという作用を有する。対応して、選択光により生じる、試料の測定信号の相対的変化も低減される

第１、第２および第３の期間の上記の相対的定義から、第１の測定値は第２の測定値よりも、第３の期間で焦点領域に集束された選択光から強く影響を受けないことになる。

光と試料の上記選択並びに第１、第２および第３の期間相互の上記の相対的定義により、第１と第２の測定値は同じように、それぞれの焦点領域における試料の局所的特性に依存する。したがって例えば、第２の期間にわたり測定信号の積分として決定された第２の測定値と、第１の期間にわたり測定信号の積分として決定された第１の測定値との商の算出によって程度指数を決定すると、測定信号の初期値に正規化される。すなわち絶対的高さに、すなわち測定信号のレベルに依存しなくなる。しかしこの程度指数は、焦点領域における選択光の強度には依存したままである。

したがって程度指数は、測定信号の変動するレベルを超えて比較可能である。このことは、測定信号のレベルが試料の互いに隣接する領域にわたって変動しても、程度指数を試料の互いに隣接する領域にわたって最適化できることを意味する。これによって程度指数を、特に試料を焦点領域により走査する際に、連続的に最適化することができる。程度指数の最適化は、適応型光学系の制御を変更しても試料内の焦点領域の位置が同じである場合にのみ可能なわけではない。しかしこれは、本発明により最適化すべきメトリック、すなわち程度指数が、試料内の焦点領域の全ての位置に対して同じ値を有することを意味するものではない。むしろこれは、確実にそうではない。なぜなら試料自体が、対物レンズの光軸に沿って少なくとも軸方向に、すなわち試料の深さ方向に変化する収差の原因だからである。しかし、互いに側方に隣接する試料内の焦点領域の位置の間では、最適化された程度指数が僅かに変動する。したがって試料内で直接隣接する焦点領域に対する最適化は、適応型光学系の、焦点領域の先行の位置において本発明のメトリックの最適化に至った制御により開始することができる。

焦点領域内での選択光の強度の依存性が、程度指数の決定により失われないことは、選択光が測定信号を低減する場合、および選択光が測定信号を下方から飽和値に近似させる場合には、第１と第２の測定値の両方が選択光の強度に線形にも、ゼロではない別の同じべき乗によっても直接依存しないことにより保証される。

このことから程度指数は、本発明の方法では、焦点領域における選択光の強度と共に上昇または下降することになる。対応して程度指数は、焦点領域における光の強度を最大にするために、適応型光学系の制御により最適化されるメトリックとして最大化または最小化される。この最大強度には、収差起因性結像誤差が除去された場合に正確に達する。したがって程度指数は、本発明の方法では、適応型光学系の制御の変更によって、収差起因性結像誤差の補正の目標を達成するために最適化すべきメトリックとして適切である。

すでに例として述べた、第２の期間にわたり測定信号の積分として決定された第２の測定値と、第１の期間にわたり測定信号の積分として決定された第１の測定値との商を算出することは、測定信号の初期値に正規化することであり、この商の算出は、例えば選択光が試料からの測定信号を低減させる場合には、程度指数を決定するのに適する。しかしこの商の逆数も、選択光が測定信号に作用する場合には程度指数として適するが、しかしこの場合、この程度指数は最小化されるのではなく最大化される。

選択光が試料からの測定信号を、下方から飽和値に近似させる場合、程度指数を決定するためには、測定信号の変化の絶対値を飽和値に正規化するのが有利である。この正規化は、程度指数の決定が第１の測定値と第２の測定値との商を形成することによって行われるようにして近似的に行うことができる。

本発明の方法では、第１の測定値と第２の測定値とから決定された程度指数であって、適応型光学系の制御の変更により最適化すべきメトリックとして使用される程度指数は、これら２つの測定値の商、特に直接的な商である必要はない。したがって、商の分母または分子が、測定値と乗算される別の因数、または測定値に加算されるオフセットを有していても基本的に問題はない。さらに商の分母が測定値の差を有し、および／または分子が和を有しても、またはその逆であっても良い。測定信号の相対的変化の極めて単調に上昇または下降する関数である何れの程度指数も、全く一般的に適する。この関数は、発生する測定値の関連領域においてだけこの特性を有していれば良いことは自明である。

このような程度指数は何れも、適応型光学系の同じ制御において、第２の期間にわたり測定信号の積分として決定された第２の測定値と、第１の期間にわたり測定信号の積分として決定された第１の測定値との直接的な商のように極値に達する。

程度指数が、測定信号の相対的変化の上昇かつ単射関数であると基本的に有利である。しかし、これは必ずしも必須ではない。

本発明のメトリックを最適化するために適応型光学系の制御を変更する際に、本発明によればメトリックは、具体的には以下のように処理することができる。古い程度指数が、第１の測定値および第２の測定値から決定される。適応型光学系の制御が一変更方向で変更される。測定信号が新たに、同じ第１の期間と同じ第２の期間にわたり検出され、光が同じ第３の期間にわたり試料内の焦点領域に集束され、これにより新規の第１の測定値および新規の第２の測定値を決定する。新規の第１の測定値および新規の第２の測定値から新規の程度指数が決定され、新規の程度指数と古い程度指数との差が決定される。差の方向に応じて、適応型光学系の制御を新たに、これまでの変更方向で、または別の、すなわちこれまでの変更方向とは逆の変更方向で変更する。測定信号の変化が選択光の強度に基本的に依存することに基づき、本発明のメトリックを最大化すべき場合、新規の程度指数が古い程度指数よりも大きい場合には、適応型光学系の制御を新たにこれまでの変更方向で変更し、新規の程度指数が古い程度指数よりも小さい場合には、適応型光学系の新たな制御の際に変更方向を反転する。本発明のメトリックを最小化すべき場合には、反対に行う。

同じ第１の期間および同じ第２の期間にわたり測定信号を新たに検出するステップであって、新規の第１の測定値および新規の第２の測定値を決定するために光を同じ第３の期間にわたり、試料内の焦点領域に集束するステップと、新規の程度指数を新規の第１の測定値および新規の第２の測定値から決定するステップと、新規の程度指数と古い程度指数との差を決定するステップと、適応型光学系の制御を、差の方向に応じてこれまでの変更方向または逆の変更方向で新たに変更するステップとは、少なくとももう一度実行することができ、これまでのステップの実行の際に形成されたそれぞれ新たな程度指数が、ステップの目下の実行の際に古い程度指数として使用される。前記のステップは、それぞれの変更方向での適応型光学系の制御により、程度指数が極値に、すなわち最小値または最大値に達するまで反復することができる。極値に達することの基準として、例えば、古い程度指数に対する新規の程度指数の差が、適応型光学系の制御の直前の変更を基準にする限界値を下回ること、または古い程度指数に対する新規の程度指数の差が、ステップの直前の反復にわたって、その方向を繰り返し反転すること、を利用することができる。

さらに、適応型光学系の制御の変更の大きさは、ステップの各繰り返しの際に、少なくとも１つの先行するステップにおける古い程度指数に対する新規の程度指数の差の大きさに依存しても良い。これにより、それぞれのメトリックの求める極値が、適応型光学系の制御の過度に大きな変更によってオーバシュートすることを回避できる。

本発明の方法で選択光により影響を受け、第１および第２の測定値を得るために積分される測定信号は、特に試料から放射される測定光とすることができる。ここでこの測定光は、光学システムによって、測定光を検出し、場合により直接積分する検出器に結像することができる。測定光を検出器に結像する際に、光学システムの補正すべき収差起因性結像誤差が影響を及ぼす。しかし測定光の検出の形式によっては、この付加的な影響を無視できることもある。このことは例えば、検出器が焦点領域から測定光を、空間分解能なしで記録する全ての場合に当てはまる。

本発明の方法の実施の際に適応型光学系の制御が変更される変更方向は、種々の変更方向から選択することができる。これには特に、光学システムの球面収差、デフォーカス、非点収差、またはコマ収差が補償可能である変更方向が含まれる。適応型光学系の制御のどのような変更が、本発明のメトリックのそれぞれの極値に近似するのに特に大きく貢献するかは、それぞれの光学システムおよび特にそれぞれの試料に依存する。多くの場合、光学システムの結像誤差を非常に小さく維持するためには、前記の収差の１つを補償するだけで十分である。これは特に球面収差とすることができる。

焦点領域における強度が測定信号の時間的変化に作用する光は、測定信号をゼロに向かって時間と共に指数関数的に減少させる光、または測定信号を下方から飽和値に時間と共に指数関数的に近似させる光から選択することができる。例えば測定信号が、試料中の蛍光色素から放射される蛍光光の場合、選択された光は、焦点領域内の蛍光色素を、生じる蛍光光の強度が飽和値に近似するまで蛍光状態に励起する励起光とすることができる。

蛍光色素が、光に加えて付加的な励起光により焦点領域内で、この蛍光色素が蛍光光を測定光として放射し始める蛍光状態に励起される場合、選択される光は、蛍光色素が蛍光光を放射する前に蛍光色素を誘導放出に刺激する刺激光とすることができる。この場合、刺激光の作用後に残る蛍光光は、刺激光の強度に非線形に依存する。具体的には、付加的な励起光は、刺激光と共に光学システムによって試料内の焦点領域に集束することができる。ここで選択光の強度分布が焦点領域において励起光の中心最大強度と一致する中心最小強度を有する場合、ＳＴＥＤ顕微鏡でも使用されるような励起光と刺激光の強度分布が存在する。したがって本発明による方法は、それぞれの試料を蛍光発光のために励起する際に、空間的に狭く制限された点広がり関数に負の影響を与える、結像システムの収差起因性結像誤差を補正する。

そして具体的には、第３の期間が第１の期間の前に開始され、中心最小強度に隣接する刺激光の強度分布の最大強度における光の強度が、測定信号の５０％超、好適には６６％超、さらに好適には９０％超が最小強度の周囲領域から発生する程大きく、その寸法が少なくとも１つの空間方向において、光と蛍光光の両方の波長における回折限界よりも小さい場合、本発明の方法は、最小強度の周囲領域に対して収差起因性結像誤差を補正する。この周囲領域が、ＳＴＥＤ顕微鏡において試料のそれぞれ測定される点に対応する最小強度を取り囲み、しかしそれ自体を含まない場合であっても、このことも、試料のそれぞれ測定される点に対する収差起因性結像誤差の補正を意味する。それどころかこの補正は、試料のそれぞれ測定される点に対して極めて特異的である。なぜなら周囲領域の寸法は、光と蛍光光の波長における回折限界よりもすでに小さいからである。

本発明の方法の最後に記載した実施形態における励起光および刺激光への要求は、ＳＴＥＤ顕微鏡における要求に完全に対応するから、本発明の方法は、ＳＴＥＤ顕微鏡測定またはＳＴＥＤ顕微鏡画像撮影の連続実行中に実施することができる。具体的には、それぞれの測定または画像撮影のために記録される蛍光光の光子は、これらが時間的分解能をもって記録され、これにより第１と第２の期間に割り当てることができる場合には、本発明の方法を実施するために使用することができる。もちろん本発明の方法は、本来の試料を結像するために光学システムを使用する前にすでに実施することもできる。

ＳＴＥＤ顕微鏡と同じ本発明の方法の実施形態では、分母が第１の測定値であり、分子が第２の測定値である商として決定されたメトリックが最小化すべきメトリックとして使用される。これは、それぞれ商として決定された新しい程度指数がそれぞれ商として決定された古い程度指数よりも小さい場合には、適応型光学系の制御を、これまでの変更方向で新たに変更すべきであることを意味する。なぜなら、メトリックが小さくなることは、収差起因性結像誤差が小さくなることを示すからである。

これにより、ＳＴＥＤ顕微鏡を調節するために記録された画像の明度、すなわち刺激光の作用の後に残る蛍光光を最大化すべきメトリックとして使用する方法との相違が明確である。その代わりに本発明の方法は、ＳＴＥＤ顕微鏡と同じ実施形態において、刺激光が焦点領域全体で蛍光光の放射を可及的に阻止することを目的にする。これは、収差起因性結像誤差がない場合にだけ達成されるような、焦点領域における刺激光の最大強度を必要とする。ここで、刺激光の強度分布の最小強度からの蛍光光の残り放射であって、収差起因性結像誤差が小さくなるにつれそれどころか大きくなり得る放射は、本発明の方法の機能を損なうようなことはしない。

本発明の方法では、それぞれの第１の期間、それぞれの第２の期間、および加えてそれぞれの第３の期間は、互いに独立したそれぞれ１つの閉じた期間とすることができ、または互いに時間的に離れた部分期間から統合することができる。第３の期間が部分期間から統合されることは、例えば、急速に連続し、測定光の記録の際に分解されない複数のパルスで光が焦点領域に指向されることを意味することができる。第１の期間および／または第２の期間が部分期間から統合されることは、試料からの測定光が時間的に連続する複数の部分期間で記録され、それら期間の間には測定信号の記録のデッドタイムが存在することを意味することができる。

本発明の方法の特別の実施形態では、第１、第２、および第３の期間が部分期間から統合されることは、第１、第２、および第３の期間のそれぞれの部分期間の間で焦点領域が試料内で、それぞれ第２の期間、並びに場合により第１の期間、第２の期間、および第３の期間の引き続くさらなる期間が続く前に、シフトされることを意味する。このようにして測定信号の検出および場合により積分の際に、試料の空間領域にわたって平均化される。このことは、特にＳＴＥＤ顕微鏡に類似する本発明の方法の実施形態では、高い空間周波数と共に変動する、試料中の蛍光色素の濃度がメトリックとして使用される程度指数に及ぼす作用を平均化するのに特に有利であることが示された。

言い替えると、本発明の方法では、同じ第１および同じ第２の期間にわたる測定信号の検出および場合による積分は、それぞれ第１および第２の測定値を獲得するために複数の画素に対して実行することができ、ここでは光が同じ第３の期間にわたり試料内の焦点領域に集束される。

励起光のための第１の光源、刺激光のための第２の光源、対物レンズ、および収差起因性結像誤差を補正するための補正装置であって、対物レンズを通る光線路に適応型光学系を含む補正装置を備える本発明のレーザ走査顕微鏡において、補正装置は、本発明の方法の以下のステップを実行するように構成されている。第１の測定値および第２の測定値を決定するために、第１の期間および第２の期間にわたり測定信号を検出するステップであって、刺激光が、試料に作用する際に測定信号を低減させる光として第３の期間にわたり試料内の焦点領域に集束される、ステップ；第１の測定値および第２の測定値から程度指数を決定するステップ；および適応型光学系の制御の際に程度指数を、適応型光学系の制御の変更により最適化すべきメトリックとして使用するステップ。

本発明のレーザ走査顕微鏡の適応型光学系は、例えば適応型ミラーおよび／または制御可能なマイクロミラーアレイおよび／またはＳＬＭ（空間光変調器）を有することができる。特にＳＬＭは、ＳＴＥＤ顕微鏡に類似する本発明の方法の実施形態では、同時に刺激光の波面成形のために、刺激光が焦点領域内に中心最小強度を備える強度分布を形成するように使用することができる。

対物レンズと対物レンズを通る光線路に適応型光学系とを有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するための本発明のさらなる方法では、第１の光、第２の光、および試料は、試料に作用する際に試料の構成部分から、第１のべき乗で第１の光の強度に依存する第１の遷移確率をもって第１の光が、第１の光が第１の測定信号を励起し、試料に作用する際に試料の同じ構成部分から、第２のべき乗で第２の光の強度に依存する第２の遷移確率をもって第２の光が第１または第２の測定信号を励起するように選択され、ここで第１のべき乗と第２のべき乗は、少なくとも１だけ異なる。そして第１の光が光学システムにより、試料中の光学システムの焦点領域に集束され、第１の光により励起された第１の測定信号が焦点領域から第１の期間にわたり、第１の測定値を決定するために検出される。さらに、第２の光が光学システムにより、試料内の焦点領域に集束され、第２の光により励起された第１または第２の測定信号が試料の焦点領域から第２の期間にわたり、第２の測定値を決定するために検出される。そして、第１の測定値および第２の測定値から、第１の測定信号の相対的変化または第１と第２の測定信号間の相対的差の極めて単調に上昇または下降する関数が決定され、適応型光学系の制御の際に、制御の変更によって最適化すべきメトリックとして使用される。

本発明の方法では、第１と第２の遷移確率が、それぞれの測定信号の励起の際に第１と第２の光の強度に異なって依存することが、適応型光学系の制御の際に最適化すべきメトリックとして使用される程度指数を決定するために利用される。最も単純には、この本発明の方法でも、第１の測定信号の相対的変化または第１と第２の測定信号間の相対的差の極めて単調に上昇または下降する関数である程度指数は、第１と第２の測定値間の商を算出することによって決定される。第１と第２の遷移確率は、少なくとも１だけ異なる第１と第２のべき乗をもって光の強度に依存し、一方、第１と第２の光の強度は、収差起因性結像誤差に両方とも同じように依存するから、この商は結像誤差に依存する。これに対して両方の測定値に対する他の全ての影響は、商の一定の因数に入り込むが、この因数は、それぞれ同じ焦点領域について第１と第２の測定値を決定する際に収差起因性結像誤差によって変化しない。それどころかこのことは基本的に、第１の光が試料の別の構成部分を、同じ焦点領域で、または他の焦点領域であっても、第１の測定信号を放射させるために第２の光として励起する場合にも当てはまる。この本発明の方法では、それぞれの測定信号を第１または第２の光により、しかし試料の同じ構成部分の同じ焦点領域で励起することにより、程度指数は、試料の観察場所に実質的に依存しなくなる。第２の光により励起された測定信号は、第１の光により励起された測定信号と同じ測定信号とすることができる。これは、本発明の方法の実施を簡単にすることができるが、これは第２の測定信号であっても、例えば別の波長の測定信号であっても良い。

具体的には、第１の光は、試料の構成部分から第１の測定信号を単一光子プロセスにより励起し、一方、第２の光は、試料の同じ構成部分から第１または第２の測定信号を多重光子プロセスにより励起する。

この本発明の方法のさらなる好適な実施形態は、前に最初に説明した本発明の方法の実施形態に対応する。

対物レンズと、対物レンズを通る光線路に適応型光学系とを有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するための本発明のさらなる方法では、光と試料が、上に最初に説明した本発明方法で選択されたように選択される。すなわち光は、試料に作用する際に、試料からの測定信号を低減するか、または下方から飽和値に近似させ、測定信号の相対的変化は、光の強度に依存する。前に説明した２つの本発明の方法とは異なり、この方法では光は、その強度が時間的に光変調されて、光学システムにより試料の焦点領域に集束される。ここで、試料における光学システムの焦点領域からの測定信号は、時間的に分解されて検出される。そして、光変調と測定信号の信号変調との間の位相ずれが、測定信号の相対的変化の極めて単調に上昇または下降する関数である程度指数として決定され、適応型光学系の制御の際に、制御の変更によって最適化すべき、すなわち最小化または最大化すべきメトリックとして使用される。

この本発明の方法は、前に説明した、周波数空間における本発明の方法と等価である。光変調と信号変調との間の位相ずれは、前に最初に説明した本発明の方法での第２の測定値と第１の測定値の商と同じように収差起因性結像誤差に依存する。

したがって最初に説明した本発明の方法の上に説明した好適な実施形態の多くは、この本発明の方法の好適な実施形態でもある。

本発明の有利な発展形態は、特許請求の範囲、明細書および図面から得られる。明細書に述べた特徴および複数の特徴の組み合わせの利点は単なる例であり、択一的にまたは累積的に作用することができ、これらの利点は本発明の実施形態により必然的に達成する必要はない。これにより添付された特許請求の範囲の対象が変更されることなく、元の出願書類および特許の開示内容に関して以下のことが当てはまる。さらなる特徴は、図面、とりわけ図示の幾何形状および複数の構成部材の互いの相対的寸法並びにそれらの相対的配置と作用接続から理解される。本発明の種々の実施形態の特徴の組み合わせ、または種々の特許請求項の特徴の組み合わせは、特許請求項の選択された引用関係から異なっても同様に可能であり、ここにおいて提案される。このことは、別個の図面に示される特徴、または図面の説明において述べられる特徴にも該当する。これらの特徴は、異なる特許請求項の特徴と組み合わせることもできる。同様に特許請求の範囲に挙げられた特徴は、本発明のさらなる実施形態に対しても当てはまる。

特許請求の範囲および明細書に述べられた特徴は、それらの数に関して、副詞「少なくとも」を明示的に使用する必要なしに、ちょうどその数または述べた数よりも大きい数が存在していると理解すべきである。したがって例えば適応型光学系について述べる場合、これはちょうど１つの適応型光学系、２つの適応型光学系またはそれ以上の適応型光学系が存在することであると理解すべきである。特許請求の範囲に挙げられた特徴は、別の特徴と置換することができ、またはそれぞれの方法あるいはそれぞれのレーザ走査顕微鏡を有するただ1つの特徴とすることができる。

特許請求の範囲に含まれる参照符号は、特許請求の範囲により保護される対象の範囲を制限するものではない。参照符号は、特許請求の範囲を容易に理解する目的のためにだけ用いられる。

以下、本発明を、図面に示された好ましい実施例に基づき更に説明し記述する。

本発明のレーザ走査顕微鏡を示す図である。 図１のレーザ走査顕微鏡の対物レンズの焦点領域における励起光および刺激光の強度分布を示す図である。 レーザ走査顕微鏡において測定信号として記録される蛍光光の光子の、時間についてのヒストグラムである。 本発明のメトリックを、意図的に引き起こされた種々の球面収差（黒い四角）、およびメトリックの本発明による自動最適化（白い円）についてプロットした図である。 本発明のメトリックを、色素により充填されたビーズを結像する場合において、図１のレーザ走査顕微鏡の光学システムの球面収差についてプロットした図である。 図５との比較において同じ球面収差について、色素により充填されたビーズの結像の半値幅を示す図である。 図５との比較において同じ球面収差について、色素により充填されたビーズの蛍光光の強度を示す図である。 図１のレーザ走査顕微鏡の光学システムのデフォーカスについて本発明のメトリックの経過を示す図である。 図１のレーザ走査顕微鏡の光学システムの球面収差について本発明のメトリックの経過を示す図である。 図１のレーザ走査顕微鏡の光学システムの非点収差について本発明のメトリックの経過を示す図である。 図１のレーザ走査顕微鏡の光学システムのコマ収差について本発明のメトリックの経過を示す図である。 蛍光色素によりマークされた構造の明画像、および球面収差についての本発明のメトリックの所属の経過を示す図である。 図１２と同じ構造の薄明画像、および同じ球面収差についての本発明のメトリックの所属の経過を示す図である。 図１２および１３と同じ構造の暗画像、および同じ球面収差についての本発明のメトリックの所属の経過を示す図である。 本発明の別の実施形態での、図１のレーザ走査顕微鏡の対物レンズの焦点領域における励起光および刺激光の強度分布を示す図である。 測定信号が第１の測定値に積分される第１の期間、測定信号が第２の測定値に積分される第２の期間、および選択光がそれぞれの光学システムの焦点領域に集束される第３の期間の種々の時間的順序を示す図である。 本発明の方法の主要ステップのフローチャートである。 さらなる本発明の方法の主要ステップのフローチャートである。 さらにもう１つの本発明の方法の主要ステップのフローチャートである。

図１に示した本発明のレーザ走査顕微鏡１は、ＳＴＥＤ顕微鏡に基づくものであり、対応して励起光３のための第１の光源２の他に、励起光３による励起を再び除去するための、刺激光６の形態の光５のための第２の光源４を有する。２つの光源２と４の各々は、レーザ７ないし８、偏光維持光ファイバ９ないし１０，および光ファイバ９ないし１０から出射する励起光３ないし刺激光６のための視準光学系１１ないし１２を含む。刺激光６の光線路にはさらに、波面成形のためのＳＬＭ１３が配置されており、これにより刺激光６は、対物レンズ１４の焦点領域に中心最小強度を備える光強度分布を形成する。刺激光６は、ＳＬＭ１３の後方、さらなる光学系１５の後で二色性ビームスプリッタ１６によって励起光３とまとめて導かれる。適応型光学系１８としての変形可能ミラー１７と、さらなる別の光学系１９とを介して、励起光３と刺激光６は対物レンズ１４に入力結合され、この対物レンズは、励起光３と刺激光６を共に試料２０内の焦点領域に集束する。光学系１５と１９は、変形可能ミラー１７およびＳＬＭ１３が対物レンズ１４の入射瞳に対して共役の平面に来るよう構成されている。励起光３および刺激光６が集束される焦点領域の位置は、スキャナ２１によって試料２０内で移動可能である。図１ではスキャナ２１が、走行可能な試料台として暗示されている。しかしスキャナ２１は、別に構成することもでき、特に励起光３と刺激光６が対物レンズ１４に対して移動するように、特に対物レンズ１４の入射瞳の中心を傾斜させるために移動するように構成することができる。試料２０の焦点領域から、そこに存在する蛍光色素を励起光により励起することに基づき放射される蛍光光２２が、第２の二色性ビームスプリッタ２３により励起光３の光線路から出力結合され、光学系２４によりマルチモード光ファイバ２５に集束され、これを通って時間分解能のある検出器２６に導かれる。本発明のレーザ走査顕微鏡１では、変形可能ミラー１７が、対物レンズ１４を通る光線路に配置された適応型光学系１８として制御部２７により制御され、この制御部には蛍光光を表す測定信号２８が検出器２６から供給される。変形可能ミラー１７の代わりに適応型光学系１８は、ＳＬＭ、マイクロミラーアレイにより、または当業者に公知の他のやり方で構成することができる。

図２は、励起光３と刺激光６の強度分布２９と３０を、焦点領域の中心を通るｘ方向の断面に沿って示す。励起光の強度分布２９は、回折限界スポットの強度分布である。空間的に見てドーナツ形の刺激光の強度分布３０は、中心３１にゼロ点３２の形の最小強度を有し、このゼロ点は、図２の部分では最大強度３３によって画定されている。最大強度３３において刺激光の強度は飽和強度Ｉ_Ｓを上回り、これにより励起光３による蛍光色素の励起は完全に元に戻される。対応して、図１の検出器２６により記録された蛍光光２２をゼロ点３２の周囲領域３４に割り当てることができ、この周囲領域の寸法は回折限界よりもはるか下にある。しかしこのことは、ゼロ点３２の周囲領域３４の外で励起光３による励起を刺激光６が除去した場合に初めて記録される蛍光光２２に対してだけ当てはまる。

図３は、蛍光光２２の個々の光子が、励起光のパルス３５および刺激光のパルス３６の後に、図１の検出器２６に当たる時点を示す。まず、単位時間当たりに記録される光子の数が、励起光３による励起によってパルス３５の間に急峻に上昇する。次に、この数は、刺激光の作用によってパルス３６の間に急速に低下する。パルス３６後の期間３７で記録された蛍光光２２の光子は、ゼロ点３２の周囲領域３４からの光子である。本発明の方法では、期間３７で記録された蛍光光２２の光子の数が、先行する期間３８の間に記録される蛍光光２２の光子の数に関連付けられる。この先行する期間３８は、ここでは第１の期間とも称され、一方、期間３７は第２の期間と称される。図３によれば、パルス３５と３６は第１の期間３８にある。第２の期間３７に記録された光子を第１の期間３８に記録された蛍光光２２の光子に関連付けることは、本発明によれば、特に第２の期間３７に記録された光子と第１の期間３８に記録された光子との商を算出することにより程度指数を決定することよって行われる。ここで本発明は、制御部２７が適応型光学系１８を、対物レンズ１４を含むレーザ走査顕微鏡１の光学システムの収差起因性結像誤差が適応型光学系１８により正確に補償されるように制御すれば、この程度指数は極値を取るという知識に基づく。図１によるレーザ走査顕微鏡１の光学システムの収差起因性結像誤差は、試料２０内の焦点領域において励起光３と刺激光６の強度に、この強度が結像誤差の増大につれ小さくなるように作用する。したがって結像誤差の増大に基づいて、励起光の強度と共に試料２０中の蛍光色素の励起も減退し、ひいては蛍光光２２も減退する。しかしこの減退は、例えば蛍光色素の濃度の空間的変動による減退または蛍光色素のブリーチングに起因する減退のような、蛍光光２２の別の減退から区別されない。しかし、２つの期間３７と３８で記録された光子から決定された程度指数によって表される、以前に励起光３により励起された蛍光色素への刺激光６の相対的作用を考慮すれば、この作用は刺激光６の強度にだけ依存する。第１の期間３８の光子よりも第２の期間３７において記録される光子が少なければ少ないほど、刺激光６が第２の期間３７の前に励起する蛍光色素は多数ある。これは、刺激光の強度が大きければ大きいほど、収差起因性結像誤差が小さいことを意味する。図２を参照すると、収差起因性結像誤差の作用は次のように説明することもできる。すなわち、収差起因性結像誤差により全体的に低減された刺激光６の強度分布３０において、飽和強度Ｉ_Ｓをゼロ点３２に対して比較的に大きな間隔で初めて上回り、対応してゼロ点３２の周囲領域３４からはより多くの蛍光光が残っていると説明できる。

図４にプロットされたメトリックは、第１の期間３８に記録された蛍光光２２の光子を第２の期間３７に記録された蛍光光２２の光子により割り算した商である。この場合、メトリックは、第２の期間３７で第１の期間３８よりも相対的に少数の光子が記録されれば上昇する。なぜなら、刺激光３は、強度が比較的大きいので、より強く低減作用を蛍光光２２に及ぼすことになるからである。図示されているのは、適応型光学系１８を備える図４のレーザ走査顕微鏡１に人工的に導入された６つの球面収差（黒い四角）の作用である。球面収差が大きくなると、その符号に関係なく、最大と比較したメトリックの減少が増大する。この最大は、人工的に導入されたゼロである収差において、図１の制御部２７により適応型光学系１８の制御を変更することによる本発明のメトリックの自動最適化によって、初期状態よりも有意に上昇する（白い円）。図４の場合、メトリックは、４０ｎｍサイズの色素が充填されたビーズの層を図１のレーザ走査顕微鏡１により二次元ＳＴＥＤ撮影した際に作成されたものであり、蛍光光２２の光子は図３に従い時間分解されて記録された。

図５は、図４と同じ本発明のメトリックをプロットしたものであり、４０ｎｍサイズの色素が充填された個々のビーズのＳＴＥＤ画像が、適応型光学系１８により目的どおりに取り込まれた種々の球面収差について撮影された。図６は、個々のビーズの画像の対応する半値幅を、図７は、個々のビーズからの蛍光光強度を、それぞれ取り込まれた同じ収差についてプロットして示す。図５から７を比較すると、図５の本発明のメトリックの最大は、図６の半値幅の格段に広い最小内と、図７の蛍光光の強度の同様にさらに広い最大内で達成されることが分かる。これは、図１のレーザ走査顕微鏡１の光学システムの収差起因性結像誤差を除去するためのメトリックを本発明により最適化する際に、なぜ適応型光学系１８を、メトリックの最適化の目的で試験的に変更することができ、その際に、これによりレーザ走査顕微鏡１の結像品質を劣化させることがないかという背後関係である。図５から７に球面収差についてプロットされた基準のうち、本発明のメトリックは、収差起因性結像誤差に対して最も迅速に応答する。したがって、このメトリックはその極値を、他の基準が極値を去り、それにより画像品質の劣化が識別される前にすでに去っていることが分かる。

図８から１１は、種々の収差が図４と５の本発明のメトリックに及ぼす影響を示す。ここでは、図８のデフォーカスにおいても、図９の球面収差においても、図１０の非点収差においても、図１１のコマ収差においても、それぞれの収差がゼロのときにメトリックは大域的に最大である。したがってメトリックの最適化は、この４つの異なる収差の各々に基づく結像誤差を除去するのに適する。

図１２から１４には、同じ構造の画像がそれぞれ異なる明度で示されており、メトリックの所属のプロットは図４に対応する。すなわち、所与の収差によるもの（黒い四角）と、自動最適化の際のもの（白い円）とがプロットされている。構造の画像の明度が異なるのは、構造をマークする蛍光色素の進行するブリーチングが異なることによるものである。画像の明度に関係なく、メトリックは、人工的に導入された同じほぼゼロの球面収差において常に最大を示し、メトリックの本発明による最適化が必要である。したがって、収差起因性結像誤差の本発明による除去は、画像明度に関係なく確実に行われる。

図１５は、励起光３の強度分布２９に対する刺激光６の択一的な強度分布３０を示す。具体的には、刺激光６は同様に回折限界スポットを形成する。この場合も、蛍光光の先行の光子と後行の光子との商を図１の適応型光学系１８の制御の変更によって最適化すれば、収差起因性結像誤差が除去される。このことは、刺激光６の強度分布３０の場合と同様に、刺激光６が飽和強度Ｉ_Ｓに達しない場合にも当てはまる。

図１６は、試料２０からの測定信号２８が積分される第１の期間３８、測定信号２８が新たに積分されるその後の第２の期間３７、測定信号２８に作用する光５が試料２０の焦点領域に集束される第３の期間３９の種々の順序を示す。第３の期間３９は、図３のパルス３６に相当し、そこでは刺激光６が試料に向けられる。図３によれば、期間３７は、期間３８に直接続き、期間３９ないしパルス３６は、期間３８の後半部分と重なっている。図１６ａ）によれば、期間３７と３８の順序は同じである。第３の期間３９は、第１の期間３８と完全に重なる。図１６ｂ）によれば、期間３７と３８の順序も同じである。しかしここで第３の期間３９は、第１の期間３８の一部とも、第２の期間３７の一部とも重なっている。図１６ｃ）によれば、期間３７と３８の順序は再度同じである。しかしここで第３の期間３９は、第２の期間３７とだけ重なっている。図１６ｄ）によれば、第３の期間３９は、重ならずに期間３７と３８の間に配置されている。何れの場合も、第３の期間３９で試料２０に集束された光５は、後の期間３７にわたって積分された測定信号に対して、期間３８にわたって積分された測定信号よりも強く作用する。なぜなら光５は、例えば図１によれば蛍光光２２の形態にある測定信号２８を常にさらに低減するからである。したがって第１の期間３８での測定信号２８の積分により得られた測定値は、第３の期間３９が完全に第１の期間３８の前にあれば、第２の期間３７での積分により得られた第２の測定値よりも光５によって影響を受けない。

図１７に示された本発明の方法のフローチャート４０は、光５と試料２０の選択４１により開始し、したがって光５は、試料２０に作用する際に試料２０からの測定信号２８を低減するか、または下方から飽和値に近似させ、測定信号２８の変化は光５の強度に依存する。そして検出４２の際に、収差起因性結像誤差が補正されるべき光学システムの焦点領域からの、試料２０の測定信号が第１の期間３８にわたり検出され、例えば積分され、第１の測定値が決定され、そして第２の期間３７にわたり第２の測定値が決定される。その際に光５は、第３の期間３９にわたり光学システムにより試料２０内の焦点領域に集束される。第１および第２の測定値から、決定４３の際に、例えば新規の商の形態の新規の程度指数が決定され、そして決定４４の際に、先行の程度指数に対する新規の程度指数の差が決定される。程度指数の差の方向に応じて、適応型光学系１８の制御の変更４５の際に、適応型光学系１８の制御の以前の変更の方向が維持されるか、または反転される。ステップ４２から４５は、ループ４６で反復される。この反復の間、試料２０中の光学システムの焦点領域を移動させることができ、これにより試料２０内の焦点領域の種々に位置に対して、光学システムの収差起因性結像誤差を適応型光学系１８により連続して最適に補償する。第１と第２の測定値を決定するための測定信号２８の検出４２中にも、試料２０内の焦点領域を移動させ、空間的平均化を実行することができる。そのために期間３７から３９が、相応の部分期間に分割され、それらの部分期間のそれぞれ１つは試料２０内の焦点領域のそれぞれの位置に割り当てられる。

図１８は、図１７に基づき説明した方法に対して以下のように変形された方法のフローチャート４０を示す。選択４７の際に第１と第２の光、および試料は、第１の光が、試料２０に作用する際に、試料の構成部分から、第１のべき乗で第１の光の強度に依存する第１の遷移確率をもって第１の測定信号を励起し、第２の光が、試料に作用する際に試料の同じ構成部分から、すなわち特に同じ蛍光色素から、第２のべき乗で第２の光の強度に依存する第２の遷移確率をもって第２の測定信号を励起するように選択され、ここで第１のべき乗と第２のべき乗は、少なくとも１だけ異なる。次に集束４８の際に、まず第１の光が光学システムにより、試料中の光学システムの焦点領域に集束され、第１の光により励起された第１の測定信号が焦点領域から第１の期間３８にわたり、第１の測定値を決定するために検出される。次にさらなる集束４９の際に、第２の光が光学システムにより、試料２０中の同じ焦点領域に集束され、第２の光により励起された第２の測定信号が試料の焦点領域から第２の期間３７にわたり、第２の測定値を決定するために検出される。引き続き決定４３の際に、図７に基づき説明した本発明の方法と同じようにして、第１の程度指数が、例えば新規の商の形態で決定され、次に決定４４の際に、先行の程度指数に対する新規の程度指数との差が決定され、並びに変更４５の際に、適応型光学系１８の制御が、以前と同じ方向または別の方向で変更される。ループ４６で反復されるステップは、ここではステップ４８，４９および４３から４５を含む。

図１９にフローチャート４０に基づいて示された本発明のさらなる方法では、選択４１が図１７の選択４１に相当する。しかし、選択光の引き続く集束５０は、その強度を時間的に光変調して行われ、測定信号２８の同時の検出は時間的に分解して行われる。次に新規の程度指数として決定５１の際に、光変調と測定信号２８の信号変調との間の位相ずれが決定される。そして決定４４の際に、古い程度指数に対するこの新規の程度指数の差が決定され、適応型光学系１８の制御の変更４５がこの差に基づいて行われる。ここでループ４６は、ステップ５０，５１，４４および４５を含む。

１ レーザ走査顕微鏡
２ 第１の光源
３ 励起光
４ 第２の光源
５ 光
６ 刺激光
７ レーザ
８ レーザ
９ 光ファイバ
１０ 光ファイバ
１１ 視準光学系
１２ 視準光学系
１３ ＳＬＭ
１４ 対物レンズ
１５ 光学系
１６ 二色性ビームスプリッタ
１７ 変形可能ミラー
１８ 適応型光学系
１９ 光学系
２０ 試料
２１ スキャナ
２２ 蛍光光
２３ 二色性ビームスプリッタ
２４ 光学系
２５ マルチモード光ファイバ
２６ 検出器
２７ 制御部
２８ 測定信号
２９ 光強度分布
３０ 光強度分布
３１ 中心
３２ ゼロ点
３３ 最大強度
３４ 周囲領域
３５ パルス
３６ パルス
３７ 第２の期間
３８ 第１の期間
３９ 第３の期間
４０ フローチャート
４１ 選択
４２ 検出
４３ 決定
４４ 決定
４５ 変更
４６ ループ
４７ 選択
４８ 集束
４９ 集束
５０ 集束
５１ 決定
Ｉ_Ｓ 飽和強度

Claims (22)

1. 対物レンズ（１４）と、前記対物レンズ（１４）を通る光線路にある適応型光学系（１８）とを有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するための方法であって、
   －光（５）および試料（２０）は、前記光（５）が、前記試料（２０）に作用する際に、前記試料（２０）からの測定信号（２８）を、
   －低減するか、または
   －下方から飽和値に近似させるように、選択され、
   前記測定信号（２８）の相対的変化は、前記光（５）の強度に依存し、
   －前記測定信号（２８）は、前記光学システムの前記試料（２０）内の焦点領域から第１の期間（３８）にわたり、第１の測定値を決定するために検出され、
   －前記測定信号（２８）は、前記光学システムの前記試料（２０）内の焦点領域から第２の期間（３７）にわたり、第２の測定値を決定するために検出され、
   －前記光（５）は、第３の期間（３９）にわたり前記光学システムにより前記試料（２０）の焦点領域に集束され、
   －前記第１の期間（３８）は、前記第２の期間（３７）よりも少なくとも部分的に先行しており、および／または前記第２の期間（３７）は、前記第１の期間（３８）よりも少なくとも部分的に後行しており、
   －前記第３の期間（３９）は、前記第１の期間（３８）および／または前記第２の期間（３７）および／または前記第１と第２の期間の間にある中間期間と、少なくとも一部が時間的に重なっており、
   －前記第１の測定値および前記第２の測定値から、前記測定信号（２８）の相対的変化の極めて単調に上昇または下降する関数である程度指数が決定され、前記適応型光学系（１８）の制御の際に、当該制御の変更（４５）によって最適化すべきメトリックとして使用される、方法。
2. －前記光（５）が前記試料（２０）からの測定信号（２８）を低減する場合、前記測定信号（２８）の変化の絶対値を、程度指数を決定するために当該測定信号の初期値に正規化し、
   －一方、前記光（５）が前記試料（２０）からの測定信号（２８）を下方から飽和値に近似させる場合、前記測定信号（２８）の変化の絶対値を、程度指数を決定するために前記飽和値に正規化する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 対物レンズ（１４）と、前記対物レンズ（１４）を通る光線路にある適応型光学系（１８）とを有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するための方法であって、
   －第１の光（５）、第２の光、および試料（２０）を、前記第１の光（５）が、前記試料（２０）に作用する際に当該試料（２０）の構成部分から、第１のべき乗で前記第１の光（５）の強度に依存する第１の遷移確率をもって第１の測定信号（２８）を励起し、前記第２の光が、前記試料（２０）に作用する際に当該試料（２０）の同じ構成部分から、第２のべき乗で前記第２の光の強度に依存する第２の遷移確率をもって第２の測定信号（２８）を励起するように選択し、ここで第１のべき乗と第２のべき乗は、少なくとも１だけ異なり、
   －前記第１の光（５）が前記光学システムにより、前記試料（２０）中の当該光学システムの焦点領域に集束され、前記第１の光（５）により前記焦点領域から励起された前記第１の測定信号（２８）が第１の期間（３８）にわたり、第１の測定値を決定するために検出され、
   －前記第２の光が前記光学システムにより、前記試料（２０）内の焦点領域に集束され、前記第２の光により励起された第１または第２の測定信号（２８）が当該試料（２０）内の焦点領域から第２の期間（３７）にわたり、第２の測定値を決定するために検出され、
   －前記第１の測定値および前記第２の測定値から、前記第１の測定信号（２８）の相対的変化、または前記第１の測定信号と前記第２の測定信号（２８）との間の相対的差の極めて単調に上昇または下降する関数である程度指数が決定され、前記適応型光学系（１８）の制御の際に、制御の変更（４５）によって最適化すべきメトリックとして使用される、方法。
4. 前記第１の光（５）は、前記試料（２０）の構成部分から第１の測定信号（２８）を単一光子ピロセスにより励起し、一方、前記第２の光は、前記試料（２０）の同じ構成部分から前記第１または第２の測定信号（２８）を多重光子プロセスにより励起する、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記第１の測定値は、これが前記測定信号（２８）の前記第１の期間（３８）にわたる第１の積分を指示するように決定され、前記第２の測定値は、これが前記測定信号（２８）の前記第２の期間（３７）にわたる第２の積分を指示するように決定される、ことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記程度指数は、前記第２の測定値と前記第１の測定値の商として決定される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 対物レンズ（１４）と、前記対物レンズ（１４）を通る光線路にある適応型光学系（１８）とを有する光学システムの収差起因性結像誤差を補正するための方法であって、
   －光（５）および試料は、前記光（５）が、前記試料（２０）に作用する際に前記試料（２０）からの測定信号（２８）を、
   －低減するか、または
   －下方から飽和値に近似させるように、選択され、
   前記測定信号（２８）の相対的変化は、前記光（５）の強度に依存し、
   －前記光（５）は、その強度が時間的に光変調されて、前記光学システムにより前記試料（２０）内の焦点領域に集束され、
   －前記試料（２０）における光学システムの焦点領域からの測定信号（２８）は、時間的に分解されて検出され、
   －前記光変調と前記測定信号の信号変調との間の位相ずれが、前記測定信号（２８）の相対的変化の極めて単調に上昇または下降する関数である程度指数として決定され、前記適応型光学系（１８）の制御の際に、制御の変更（４５）によって最適化すべきメトリックとして使用される、方法。
8. －古い程度指数を決定し、
   －前記適応型光学系（１８）の制御を一変更方向で変更し、
   －新たに測定信号（２８）を検出し、その際に光（５）が新たに前記試料（２０）内の焦点領域に集束され、
   －新規の程度指数を決定し、
   －前記新規の程度指数と前記古い程度指数との差を決定し、
   －前記差の方向に応じて、前記適応型光学系（１８）の制御を、これまでの変更方向または別の変更方向で新たに変更する、ことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. －測定信号（２８）を新たに検出するステップであって、光（５）が新たに前記試料（２０）内の焦点領域に集束される、ステップと、
   －新規の程度指数を決定するステップと、
   －前記新規の程度指数と前記古い程度指数と差を決定するステップ（４４）と、
   －前記適応型光学系（１８）の制御を、前記差の方向に応じてこれまでの変更方向または別の変更方向で新たに変更するステップ（４５）と、
   －前記変更方向での前記適応型光学系（１８）の制御を、当該制御において前記程度指数が極値に達するまで少なくとももう一度、または複数回実行するステップであって、前記ステップの先行の実行の１つの際に決定された新規の程度指数の１つが、前記ステップの目下の実行の際に古い程度指数として使用される、ステップと
   を特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記測定信号（２８）は、前記試料（２０）から放射される測定光である、ことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記測定光は、前記光学システムにより検出器（２６）上に結像される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記適応型光学系（１８）の制御が変更される変更方向は、
    －球面収差、
    －デフォーカス、
    －非点収差、
    －コマ収差
    が補償可能である変更方向から選択される、ことを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記測定信号（２８）は、前記試料（２０）中の蛍光色素から放射される蛍光光（２２）である、ことを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記蛍光色素は、前記光（５）によって前記焦点領域で、飽和値に近似するまで、当該蛍光色素が蛍光光（２２）を放射する蛍光状態に励起される、ことを特徴とする、請求項１または７を直接または間接的に引用する場合の請求項１３に記載の方法。
15. 前記蛍光色素は、前記光（５）に加えて付加的な励起光（３）によって前記焦点領域で、前記蛍光色素が蛍光光（２２）を放射し始める励起状態に励起され、前記光（５）は、前記蛍光色素が蛍光光（２２）を放射する前に前記蛍光色素を誘導放出に刺激する刺激光（６）である、ことを特徴とする、請求項１または７を直接または間接的に引用する場合の請求項１３に記載の方法。
16. 前記付加的な励起光（３）は、前記光学システムにより前記試料（２０）内の焦点領域に集束される、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 前記光（５）の強度分布は、前記焦点領域において前記励起光（３）の中心最大強度と一致する中心最小強度を有する、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. それぞれ商として決定された新規の程度指数が、それぞれ商として決定された古い程度指数よりも小さい場合であって、前記商が、それぞれ第１の測定値を分母に、それぞれ第２の測定値を分子に有する場合には、前記適応型光学系（１８）の制御をこれまでの変更方向で新たに変更する、ことを特徴とする請求項６および請求項８または９を直接引用する場合の請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記第１の期間（３８）、前記第２の期間（３７）、および存在する場合には前記第３の期間（３９）は、互いに独立したそれぞれ１つの閉じた期間であり、または互いに時間的に離れた部分期間から統合されている、ことを特徴とする請求項１または３に記載の、または請求項１または３を直接または間接的に引用する場合の先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
20. それぞれの程度指数を決定するために、複数の画素について前記測定信号（２８）の検出が実行され、前記光（５）が前記試料（２０）内の焦点領域に集束される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. レーザ走査顕微鏡（１）であって、
    －励起光（３）のための第１の光源（２）と、
    －刺激光（６）のための第２の光源（４）と、
    －対物レンズ（１４）と、
    －収差起因性結像誤差を補正するための、前記対物レンズ（１４）を通る光線路に適応型光学系（１８）を含む補正装置と
    を有するレーザ走査顕微鏡において、
    前記補正装置は、請求項１または７に記載の、または請求項１または７を直接または間接的に引用する場合の先行請求項のいずれか一項に記載の
    －前記測定信号（２８）を検出するステップであって、前記刺激光（６）が、前記試料（２０）に作用する際に前記測定信号（２８）を低減する前記光（５）として、前記試料（２０）中の前記焦点領域に集束される、ステップと、
    －前記程度指数を決定するステップと、
    －前記適応型光学系（１８）の制御の際に前記程度指数を、前記制御の変更（４５）によって最適化すべきメトリックとして使用するステップと
    を実行するためのものである、ことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
22. 前記適応型光学系（１８）は、
    －適応型ミラー（１７）、および／または
    －制御可能なマイクロミラーアレイ、および／または
    －空間光変調器（ＳＬＭ）を有する、
    を有する、ことを特徴とする請求項２１に記載のレーザ走査顕微鏡（１）。

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