WO2020091376A1 - ３－하이드록시 플로레틴을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

３－하이드록시 플로레틴을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020091376A1
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preventing
present
hydroxy
treating obesity
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PCT/KR2019/014362
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윤철호
강형식
응우옌응억안
장진
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윤철호
강형식
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating obesity containing 3-hydroxy phloretin (3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin) as an active ingredient, more specifically 3-hydroxy floretine or a pharmaceutical thereof It relates to a composition for preventing or treating obesity containing an acceptable salt as an active ingredient.
  • Obesity refers to a condition in which fat is accumulated in the body more than necessary, and a typical cause of obesity is due to an imbalance in energy consumption and consumption by westernized eating habits.
  • visceral fat-type obesity increases, and the invention of metabolic syndrome, such as type 2 diabetes and hypertension, accompanied by insulin resistance is rapidly increasing.
  • metabolic syndrome such as type 2 diabetes and hypertension
  • insulin resistance is rapidly increasing.
  • Drug therapy is mainly used for the treatment of obesity, and the drugs in the form of synthetic drugs mainly reduce food intake through appetite suppression, or inhibit the absorption of carbohydrates or fats, thereby promoting metabolism. It is sold in each country.
  • many of these products have been reported to cause side effects when used, and mainly suppress the action of lipase or increase the concentration of serotonin or noradrenaline, gastrointestinal side effects, headache, food loss, constipation, insomnia, heart rate It is causing an increase, dizziness, etc. Due to the side effects of such synthetic drugs, there is a desperate need to discover substances that can achieve excellent anti-obesity effects while having fewer side effects from substances such as natural products.
  • Floretin is an IUPAC name, 3- (4-Hydroxyphenyl) -1- (2,4,6-trihydroxyphenyl) propan-1-one, and has a structure represented by the following Chemical Formula 1.
  • Floretin is a type of natural phenols, dihydrochalcone, and is known to be found in plants such as apples, pears, and succulent fruits or apple tree leaves. Floretin exhibits various biological and pharmacological activities such as anti-inflammatory and anti-cancer properties, and is also used as a cosmetic ingredient.
  • floretine plays a beneficial role in human health
  • research has been conducted to utilize the natural ingredients in various fields, but due to the fact that the metabolic process of floretine has not been specifically identified, It is necessary to study metabolic pathways and metabolic substances, and there is an urgent need to identify substances that have less side effects and have significant effects on preventing or treating obesity.
  • the present inventors induced and produced 3-hydroxyfloretine from phloretin isolated from apple grounds, thereby using this to reduce lipid accumulation in adipocytes. By suppressing it, it was intended to provide a composition containing an active ingredient that can effectively obtain an effect of preventing or treating obesity.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating obesity containing 3-hydroxy phloretin (3-OH phloretin) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the active ingredient is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention, but can suppress obesity through the inhibition of fat differentiation promoting factors.
  • the fat differentiation promoting factor is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention, but PPAR ⁇ (peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ ), C / EBP ⁇ (CCAAT / enhancer-binding protein ⁇ ) and fatty acid synthetase ( fatty acid synthase).
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • C / EBP ⁇ CCAAT / enhancer-binding protein ⁇
  • fatty acid synthetase fatty acid synthase
  • the present invention provides a method for preventing or treating obesity in mammals other than humans, comprising the step of treating the composition for preventing or treating obesity to fat progenitor cells.
  • the composition for preventing or treating obesity is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention, but can be treated at a concentration of 1 to 250 uM, preferably 10 to 150 uM, and more preferably 10 to 75 uM. have.
  • the present invention provides a health functional food for diet containing the composition.
  • composition for preventing or treating obesity containing 3-hydroxy floretine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient according to the present invention is a major fat differentiation promoting factor PPAR ⁇ (peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ ), C / EBP ⁇ (CCAAT / enhancer-binding protein ⁇ ) and fatty acid synthase are effectively suppressed, which is expected to be widely used for the prevention or treatment of obesity by reducing the fat content in cells.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • C / EBP ⁇ CCAAT / enhancer-binding protein ⁇
  • fatty acid synthase are effectively suppressed, which is expected to be widely used for the prevention or treatment of obesity by reducing the fat content in cells.
  • Figure 1 relates to the results of a) HPLC, and b) NMR measurement when converting 3-hydroxy-floretine from floretin using the P450 enzyme.
  • Figure 2 relates to the result of measuring the concentration and cell viability of 3-hydroxy floretine does not show cytotoxicity for 3T3-L1 adipocytes through MTS assay.
  • Figure 3 is a 3T3-L1 fat progenitor cells when treated with 3-hydroxy floretine, a) fat cell differentiation inhibitory effect is compared by Oil-red-O staining, b) the fat from the cells differentiated in a) The accumulation ratio was measured by a spectrophotometer.
  • Figure 5 is a high-fat diet (High Fat Diet, HD) when the mice are orally administered the 3-hydroxy floretine of the present invention, a) the appearance of the mouse, b) the body weight and c) the amount of food in the control group (SD ).
  • High Fat Diet, HD High Fat Diet
  • FIG. 6 relates to a result of comparing a) distribution of visceral adipose tissue, b) size of isolated adipose tissue, and c) size of isolated adipose tissue in the mouse of FIG. 5.
  • Figure 7 relates to the results of comparing the size of the adipocytes in a) visceral and liver tissues and b) visceral tissue in the mouse of FIG.
  • the units used without specific reference are based on weight, and for example, units of% or ratio mean weight percent or weight ratio.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating obesity containing 3-hydroxy phloretin (3-OH phloretin) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the active ingredient is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention, but can suppress obesity through the inhibition of fat differentiation promoting factors.
  • the fat differentiation promoting factor is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention, but PPAR ⁇ (peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ ), C / EBP ⁇ (CCAAT / enhancer-binding protein ⁇ ) and fatty acid synthetase ( fatty acid synthase).
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • C / EBP ⁇ CCAAT / enhancer-binding protein ⁇
  • fatty acid synthetase fatty acid synthase
  • the fat differentiation promoting factor is a core of transcriptional regulatory factors and plays a role in promoting the expression of genes related to fat production and differentiation into adipocytes through the interaction of PPAR ⁇ and C / EBP ⁇ . Inhibition can inhibit the accumulation of fat.
  • the 3-hydroxy phloretin (3-OH phloretin) according to the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and the pharmaceutically acceptable salt can be used by conventional methods in the art. It can be prepared, for example, salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, sodium hydrogen sulfate, phosphoric acid, nitric acid, carbonic acid, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, oxalic acid, succinic acid, benzoic acid, With citric acid, maleic acid, malonic acid, mandelic acid, cinnamic acid, stearic acid, palmitic acid, glycolic acid, glutamic acid tartaric acid, gluconic acid, lactic acid, fumaric acid, lactobionic acid, ascorbic acid, salicylic acid, or acetylsalicylic acid (aspirin) Amino acids such as salt
  • salts with sulphonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, metal salts by reaction with alkali metals such as sodium and potassium, or salts with ammonium ions.
  • the 3-hydroxy phloretin (3-OH phloretin) of the present invention may exist in a solvated form, for example, a hydrated form and an unsolvated form, and the 3-hydroxy phloretin according to the present invention
  • Solvates of tin (3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin) include all solvated forms with pharmaceutical activity.
  • the 3-hydroxy phloretin (3-OH phloretin) of the present invention may have a chiral center and may exist as a racemate, racemic mixture and individual enantiomers or diastereomers. These isomers can be separated or resolved by conventional methods, and any desired isomer can be obtained by conventional synthetic methods or by stereospecific or asymmetric synthesis. All such isomeric forms and mixtures thereof are included within the scope of the present invention.
  • the 3-hydroxy phloretin (3-OH phloretin) of the present invention can be administered in the form of a prodrug that degrades in the human or animal body to provide the compounds of the present invention.
  • Prodrugs can be used to alter or improve the physical and / or pharmacokinetic profile of the parent compound and can be formed if the parent compound contains suitable groups or substituents that can be derived to form a prodrug.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is conventional in the 3-hydroxy phloretin (3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin), its prodrug, its solvate, its stereoisomer, or its pharmaceutically acceptable salt.
  • non-toxic pharmaceutically acceptable carriers and excipients such as conventional formulations in the pharmaceutical field, such as tablets, pills, soft capsules, liquids, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs, etc. It can be formulated as a formulation for oral administration or for parenteral administration of a sterile aqueous or oily solvent for intravenous, subcutaneous, sublingual and intramuscular administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in formulation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin , Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and / or mineral oil, etc. , But is not limited thereto.
  • Excipients that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include sweeteners, binders, solubilizers, solubilizers, wetting agents, emulsifiers, isotonic agents, adsorbents, disintegrants, antioxidants, preservatives, lubricants, fillers, fragrances, etc.
  • the proportions and properties of excipients can be determined by the solubility and chemical properties of the selected tablet, the route of administration chosen, and standard drug practice.
  • excipients examples include lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose, glycine, silica, talc, stearic acid, sterin, magnesium stearate, magnesium aluminum silicate, starch, gelatin, tragacanth rubber, arginic acid, Sodium alginate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, agar, water, ethanol, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, sodium chloride, calcium chloride, orange essence, strawberry essence, vanilla flavor, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in a parenteral dosage form, in which case intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or local administration may be used, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition is an active ingredient, that is, 3-hydroxy phloretin (3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin), its prodrug, its solvate, Its stereoisomers or pharmaceutically acceptable salts thereof are mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions, and such solutions or suspensions can be prepared as unit dosage forms of ampoules or vials.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an auxiliary agent such as a sterilized, preservative, stabilizer, hydration agent or emulsifier, salt and / or buffer for osmotic pressure control, and other therapeutically useful substances. It can also be formulated according to conventional methods of mixing, granulating or coating.
  • an auxiliary agent such as a sterilized, preservative, stabilizer, hydration agent or emulsifier, salt and / or buffer for osmotic pressure control, and other therapeutically useful substances. It can also be formulated according to conventional methods of mixing, granulating or coating.
  • 3-hydroxy phloretin 3-hydroxy phloretin
  • its prodrug its solvate, its stereoisomer or pharmaceutically acceptable salt thereof
  • the dosage for mammals can vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status and disease. In general, it may be included in the pharmaceutical composition in an effective amount of 0.001 to 500 mg / kg (body weight) per day, preferably 0.01 to 100 mg / kg (body weight) per day, and the pharmaceutical composition is once or twice a day
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., so that the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a method for preventing or treating obesity in mammals other than humans, comprising the step of treating the composition for preventing or treating obesity to fat progenitor cells.
  • the type of the mammal is not particularly limited, and an organism having a disease caused by obesity can be treated without limitation through methods such as injection and oral administration.
  • the composition for preventing or treating obesity is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention, but can be treated at a concentration of 1 to 250 uM, preferably 10 to 150 uM, and more preferably 10 to 75 uM. In particular, it can be treated at a concentration of 12.5 uM, 25 uM, or 50 uM, and in the above range, synergistic effect that can minimize the stress or damage to the cells to be treated while maintaining the fat accumulation inhibitory effect at the same time. It is more preferable because it can be obtained.
  • the present invention reacts any or two or more enzymes selected from the group consisting of P450 enzyme, bacterial cytochrome, amino acid mutant of P450 enzyme, chimeric P450 enzyme and amino acid point mutant of chimeric P450 enzyme to floretin. It provides a method for producing 3-hydroxy floretine for preventing or treating obesity, comprising the step of preparing 3-hydroxy floretin.
  • 3-Hydroxy floretine is a metabolite of floretine having a structure similar to floretine, but it is known that it cannot be chemically synthesized in the general organic chemistry field. Accordingly, one method of producing 3-hydroxy floretine through an enzyme, a mutant, and the like, has recently been identified by the present researchers.
  • the P450 enzyme is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention, but may be CYP102A1 of the wild type of P450 BM3.
  • the CYP102A1 mutant may refer to the entire CYP102A1 having a sequence changed by natural or artificial substitution, deletion, addition and / or insertion of an amino acid based on the wild type CYP102A1.
  • the CYP102A1 mutant can be produced by a known mutation method.
  • a deletion-mutation method a PCT method, a Kunkel method, a point mutation method, a DNA shuffling, a Staggered Extension Process (StEP), or an error-prone PCR method may be used, but is not limited thereto.
  • the CYP102A1 mutant may be represented by amino acids, positions of amino acids, and substituted amino acids before mutation occurs.
  • R47L refers to a CYP102A1 mutant in which the amino acid sequence of wild type CYP102A1, the 47th amino acid of SEQ ID NO: 1, arginine (R), is naturally or artificially substituted by induction of mutation. If there is more than one amino acid substituted by mutation in the mutant, it may be represented by '/'.
  • arginine (R), the 47th amino acid of SEQ ID NO: 1, is substituted with leucine (L), and phenylalanine (F), the 87th amino acid of SEQ ID NO: 11, is substituted with valine (V).
  • R arginine
  • F phenylalanine
  • V valine
  • the group consisting of the mutants of CYP102A1 is not limited as long as it does not inhibit the achievement of the object of the present invention.
  • the mutant of wild type CYP102A1 may include a mutant in which a point mutation occurred in wild type CYP102A1, specifically, R47L / F87V / L188Q of wild type CYP102A1.
  • the production method of 3-hydroxy floretine may further include a NADPH-generating system.
  • the NADPH-producing system may use a system known in the field to which the present invention pertains, and for example, glucose 6-phosphate, NADP + and yeast glucose 6-phosphate dehydrogenase (glucose 6-phosphate dehydrogenase) ) Can be used, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a health functional food for diet containing the composition.
  • the term 'health functional food' means a natural product or a processed product that contains one or more nutrients, and preferably uses a physical, biochemical, or biotechnological method on the food to specify the function of the food.
  • a food product that has been designed to sufficiently express the body control functions related to the control of biological defense rhythms, disease prevention and recovery, etc. of food groups or food compositions that have added value to act and express on the processed food.
  • the dietary supplement may contain food-acceptable food supplement additives, and may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of dietary supplements.
  • Health functional foods to which the active ingredient of the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, gums, teas, and vitamin complexes.
  • special nutritional foods e.g., formulas, infants, infants, etc.
  • health supplements e.g., confectionery (e.g., snacks), dairy products (e.g. fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, beverages (e.g. fruits, vegetables) Beverages, soy milk, fermented beverages, and the like).
  • confectionery e.g., snacks
  • dairy products e.g. fermented milk, cheese, etc.
  • other processed foods e.g. fruits, vegetables
  • beverages e.g. fruits, vegetables
  • Beverages soy milk, fermented beverages, and the like.
  • the above-mentioned food, beverage or food additive may be prepared by a conventional manufacturing method.
  • the health functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and the like. It may contain salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, water, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like. These components can be used independently or in combination.
  • the health functional food of the present invention may have various formulations as described above, and may have any one formulation in powders, granules, tablets, capsules, and beverages, but is not limited thereto.
  • P450 BM3 wild type CYP102A1: Produced and used by Joint Experiment Lab 303 of Chonnam National University where the inventors Yoon Chul-ho and Nguyen Ngok-an conduct research.
  • Adipose progenitor cells 3T3-L1 was used from the American Type Culture Collection (ATCC, USA).
  • MTS Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
  • mice The diet for mice was administered as a standard diet (SD) or high fat diet (HD) diet in the form of free feeding for 12 weeks.
  • SD standard diet
  • HD high fat diet
  • mice were repeatedly housed in a 12-hour light and dark cycle, individually housed in a cage dedicated to mice, and then diet was used for 12 weeks using the feed.
  • 3-hydroxy floretin was prepared using a mutant of the P450 enzyme CYP102A1 enzyme to floretin.
  • the preparation of the 3-hydroxy floretine was based on the method of the present inventor in Korea No. 10-2017-0124724 (filed on September 27, 2017.).
  • the mutant of the P450 enzyme CYP102A1 was R47L / F87V / L188Q point mutations in the CYP102A1 protein and was used in the following preparation.
  • 3T3-L1 adipocytes were divided into 7 experimental groups, and the 3-hydroxy floretin prepared in Example 1 was treated with 200, 100, 50, 25, 12.5, and 6.25 uM, respectively, and the other experimental group was untreated control group. After making (control), cytotoxicity was measured using the MTS Assay Kit.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the 3-hydroxy floretine of the present invention does not have a significant effect on cell survival even at a low concentration as well as a certain level increase.
  • the cell viability slightly decreased when treated with a concentration of 200 uM.
  • MDI culture medium (10% fetal bovine serum (FBS) Differentiation was induced in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) containing high concentration glucose, 500 uM methylisobutylxanthine, 1 uM dexamethasone, 10 ug / mL insulin).
  • FBS fetal bovine serum
  • the medium was replaced with 10% FBS DMEM, 500 uM methylisobutylxanthine, 1 uM dexamethasone and 10 ug / mL insulin, and after 3 days, the medium was replaced with 10 ug / mL insulin. After 6 days, differentiation was induced for 10 days while replacing 10% FBS DMEM medium every two days.
  • the differentiated cells were fixed in PBS (phosphate buffered-saline) solution mixed with 4% Paraformaldehyde for 1 hour, washed twice with PBS containing 60% isopropanol, and then Oil- After staining with Red-O dye solution for 15 minutes, it was washed with running water.
  • PBS phosphate buffered-saline
  • adipocytes with differentiation were harvested for the three experimental groups of 3-hydroxy floretin, floretin and untreated control.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • C / EBP ⁇ CCAAT / enhancer-binding protein ⁇
  • FAS fatty acid synthase
  • Standard diet and high fat diet HFD D12451 (Research Diets Co .; described above) for 12 weeks at room temperature of 24 ⁇ 2 ° C. while supplying sufficient water, using 21-22 g C57BL / 6 female mice 10 weeks of age. New Brunswick, NJ) Diet was applied to diet freely.
  • mice in the experimental group were orally administered at 20 mg / kg every other day for 14 weeks.
  • DMSO was administered to the other mouse experimental group in the same manner.
  • the body weight was measured in units of 0.01 g at the same time every day, and the dietary amount of the feed was measured once a week and 7 days later.
  • the fat tissue of each mouse was separated 12 weeks after the high-fat feed diet, and its size and weight were confirmed.
  • DMSO was administered in the same manner by applying standard diet (SD) at the same temperature and environmental conditions as the high fat diet, and then, after measuring the weight and 12 weeks after diet, the fat tissue of each mouse was measured. Separated, the size and weight were checked.
  • SD standard diet
  • Adipose tissue separated from the high fat diet test group and the standard diet test group was subjected to biopsy using a conventional hematoxylin and eosin (H & E) staining method.
  • the adipose tissue was frozen by embedding using paraffin, and then sliced to a thickness of 8 um using a cryo-cut microtome, and then attached to the slide glass.
  • the slides to which the tissue sections were attached were supported on xylene for 5 minutes to remove paraffin, and the concentration of ethanol was gradually lowered to 100% -95% -85% -70% for 2 minutes each to hydrate.
  • tissue sections stained with hematoxylin were re-stained with eosin for 1 minute, and the concentration of ethanol was increased to 70% -85% -95% -100% for 2 minutes each to dehydration.
  • the dehydrated tissue slides were soaked in xylene for 5 minutes, washed thoroughly, dried completely at room temperature, and the tissue sections were observed and photographed under a microscope.
  • liver tissues separated from the high fat diet test group and the standard diet test group were measured for fat accumulation using a conventional Oil-Red-O staining method.
  • the liver tissue was fixed in a 10% Para-formaldehyde solution dissolved in PBS (phosphate buffered-saline) for 1 hour, and washed twice with PBS containing 60% isopropanol. Then, it was dyed at room temperature for 1 hour with an Oil-Red-O dye solution (0.5% Oil Red-O dye dissolved in isopropanol and water, diluted in a ratio of 6 to 4).
  • PBS phosphate buffered-saline
  • mice The results of dietary application to mice are shown in FIG. 5.
  • the appearance of the mouse to which the standard diet was applied is the smallest, and compared to the case where DMSO and floretine were administered among the experimental groups to which the high-fat diet was applied, the 3-hydroxyfloretine component of the present invention. It can be seen that the appearance of the mouse experimental group administered with a smaller one (FIG. 5A), and the weight gain rate was significantly lower than that of the DMSO and floretine administered groups among the mouse experimental groups to which a high fat diet was applied (FIG. 5b).
  • the 3-hydroxy fluoretine of the present invention administered mice of the gonad white adipose tissue (Gonadal White Adipose Tissue, GWAT) and posterior abdominal white adipose tissue (Retroperitoneal White Adipose Tissue, RWAT) of Visceral adipose tissue distribution was significantly reduced compared to the mice administered fluoretine (FIG. 6A), and the size of these visceral fat tissues (FIG. 6B) and the weight of visceral fat tissues (FIG. 6C) were also significantly reduced.
  • GWAT Gonadal White Adipose Tissue
  • RWAT Retroperitoneal White Adipose Tissue
  • the size of adipocytes isolated from mice administered with the 3-hydroxyfloretine of the present invention is floretine.
  • the results of measuring the degree of fat accumulation in the liver tissue were confirmed to significantly decrease the fat accumulation when 3-hydroxy floretine was administered.
  • FIG. 7A The size of the adipocytes in FIG. 7A was measured and presented graphically (FIG. 7B).
  • the 3-hydroxy floretine of the present invention has a remarkably excellent effect of improving weight loss and fatty liver compared to the experimental groups treated with floretine and DMSO treated with a high fat diet, and the above effects are not caused by suppression of appetite. Was confirmed.
  • the present invention was completed by confirming that the 3-hydroxy proletin of the present invention has a remarkably excellent inhibitory effect on obesity and can be useful for prevention or treatment.
  • sequence information of SEQ ID NOs: 1 to 9 was submitted in a separate file format.

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Abstract

본 발명은 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin)을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 3-하이드록시 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물은 주요한 지방 분화 촉진 인자인 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein α) 및 지방산 합성 효소(fatty acid synthase) 등을 효과적으로 억제하여 세포 내 지방 함량을 감소시켜 비만의 예방 또는 치료를 위해 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

３－하이드록시 플로레틴을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin)을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3-하이드록시 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
비만은 몸에 지방이 필요 이상 축적되어 있는 상태를 의미하며, 대표적인 비만 발생의 원인으로는 서구화된 식습관에 의한 에너지 섭취와 소모의 불균형에 기인한다. 이로 인해 내장 지방형 비만이 증가하면서, 인슐린 저항성을 동반한 제 2형 당뇨 및 고혈압 등의 대사증후군(metabolic syndrome) 발명이 급격히 증가하고 있다. 이들 질병은 상호간의 발생 위험도를 높여 노화, 스트레스, 염증 발생 및 면역 기능 저하 등의 합병증을 동반하게 된다.
이와 같은 비만 치료에는 주로 약물 요법이 사용되는데, 상기 합성의약품 형태의 약물은 주로 식욕 억제를 통해 음식물의 섭취를 줄이거나, 탄수화물 또는 지방의 흡수를 억제하여 신진대사를 촉진시키는 역할을 수행하는 제품들이 각국에서 판매되고 있다. 그러나, 이들 제품들은 사용시 부작용을 발생하는 경우가 다수 보고되고 있으며, 주로, 리파아제의 작용을 억제하거나, 세로토닌 또는 노르아드레날린의 농도를 증가시킴으로 인해 위장계 부작용, 두통, 식용부진, 변비, 불면증, 심박수 증가, 현기증 등을 일으키고 있다. 이와 같은 합성의약품의 부작용으로 인해, 천연물 등의 물질로부터 부작용이 적으면서도 우수한 비만 억제 효과를 얻을 수 있는 물질의 발굴이 절실한 상황이다.
플로레틴(phloretin)은 IUPAC 명으로 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)propan-1-one이며, 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는다.
[화학식 1]
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플로레틴은 천연 페놀(natural phenols)의 한 종류인 디히드로찰콘(dihydrochalcone)이며, 사과, 배 등 즙이 많은 과실 또는 사과나무 잎 등의 식물에서 발견되는 것으로 알려져 있다. 플로레틴은 항염, 항암 등 다양한 생물학적 활성 및 약리 활성을 나타내며, 화장품 성분으로도 사용된다. 또한 최근 들어 플로레틴이 사람의 건강에 유익한 역할을 하는 것으로 알려지면서, 다양한 분야에서 상기 천연 성분의 활용을 위한 연구가 이루어지고 있으나, 플로레틴의 대사 과정에 대해서 구체적으로 밝혀지지 않은 점으로 인해, 대사 경로 및 대사 물질에 대한 연구가 필요하며, 이로부터 부작용이 적으면서도 비만 예방 또는 치료 효과가 현저한 물질의 규명이 절실한 상황이다.
상기와 같은 문제의 해결을 위해 본 발명자들은 사과 찌꺼기에서 분리한 플로레틴(phloretin)으로부터 3-하이드록시 플로레틴을 유도, 제조함으로써, 이를 이용하여 지방 세포(adipocyte) 내의 지방 축적(lipid accumulation)을 억제함으로써, 효과적으로 비만 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있는 유효 성분을 포함하는 조성물을 제공하고자 하였다.
본 발명은 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 유효 성분은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 지방 분화 촉진 인자의 억제를 통해 비만을 억제할 수 있다.
본 발명에서, 상기 지방 분화 촉진 인자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein α) 및 지방산 합성 효소(fatty acid synthase) 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 비만 예방 또는 치료용 조성물을 지방 전구 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유류에 대한 비만 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 비만 예방 또는 치료용 조성물은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 1 내지 250 uM, 좋게는 10 내지 150 uM, 더욱 좋게는 10 내지 75 uM의 농도로 처리할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 함유하는 다이어트용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 3-하이드록시 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물은 주요한 지방 분화 촉진 인자인 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein α) 및 지방산 합성 효소(fatty acid synthase) 등을 효과적으로 억제하여 세포 내 지방 함량을 감소시켜 비만의 예방 또는 치료를 위해 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 P450 효소를 이용하여 플로레틴으로부터 3-하이드록시 플로레틴 전환시의 a) HPLC, 및 b) NMR 측정 결과에 관한 것이다.
도 2는 MTS 시험(MTS assay)을 통해 3T3-L1 지방 전구세포에 대하여 3-하이드록시 플로레틴이 세포 독성을 나타내지 않는 농도 및 세포의 생존률을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 3은 3T3-L1 지방 전구세포에 3-하이드록시 플로레틴 처리시에, a) 지방 세포 분화 억제효과를 Oil-red-O 염색으로 비교한 것이며, b) 상기 a)에서 분화된 세포에서 지방 축적 비율(lipid accumulation)을 분광광도계로 측정한 것이다.
도 4는 지방 분화 촉진 인자의 유전자 발현의 결과에 관한 것이다.
도 5는 고지방 사료(High Fat Diet, HD) 식이 중인 마우스에 본 발명의 3-하이드록시 플로레틴을 경구 투여시, 마우스의 a) 외형, b) 체중 및 c) 사료의 식이량을 대조군(SD)와 비교한 결과에 관한 것이다.
도 6은 상기 도 5의 마우스에서 a) 내장 지방 조직의 분포, b) 분리한 지방 조직의 크기 및 c) 분리한 지방 조직의 크기를 비교한 결과에 관한 것이다.
도 7은 상기 도 5의 마우스에서 a) 내장 및 간 조직의 양상 및 b) 내장 조직에서 지방 세포의 크기를 비교한 결과에 관한 것이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 3-하이드록시 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 대해 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
이하 본 발명에 따른 3-하이드록시 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 유효 성분은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 지방 분화 촉진 인자의 억제를 통해 비만을 억제할 수 있다.
본 발명에서, 상기 지방 분화 촉진 인자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein α) 및 지방산 합성 효소(fatty acid synthase) 등을 포함할 수 있다.
상기 지방 분화 촉진 인자는 전사 조절 인자 중 핵심적인 것으로 PPARγ 및 C/EBPα의 상호 작용을 통해 지방 생성과 관련된 유전자의 발현과 지방세포로의 분화를 촉진시키는 역할을 수행하기 때문에, 상기 지방 분화 촉진 인자의 억제를 통해 지방의 축적을 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin)은 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 염은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 질산, 탄산 등과 같은 무기산과의 염, 개미산, 초산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 옥살산, 석신산, 벤조산, 시트르산, 말레산, 말론산, 만델산, 신남산, 스테아르산, 팔미트산, 글리콜산, 글루탐산 타르타르산, 글루콘산, 락트산, 푸마르산, 락토비온산, 아스코르브산, 살리실산, 또는 아세틸살리실산(아스피린)과 같은 유기산과의 염, 글리신, 알라닌, 바닐린, 이소루신, 세린, 시스테인, 시스틴, 아스파라진산, 글루타민, 리진, 아르기닌, 타이로신, 프롤린 등과 같은 아미노산과의 염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산과의 염, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속과의 반응에 의한 금속염, 또는 암모늄 이온과의 염 등을 포함한다.
본 발명의 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin)은 용매화된 형태, 예를 들어 수화된 형태 및 비용매화 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명에 따른 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin)의 용매화물은 제약 활성을 갖는 모든 용매화된 형태를 포함하는 것이다.
본 발명의 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin)은 키랄 중심을 가질 수 있고, 라세메이트, 라세미 혼합물 및 개개의 거울상 이성질체 또는 부분 입체이성질체로서 존재할 수 있다. 이러한 이성질체는 통상의 방법에 의해 분리되거나 분해될 수 있으며 임의의 소정 이성질체는 통상의 합성법에 의해 또는 입체특이적 또는 비대칭적 합성에 의해 수득할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 형 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin)은 인간 또는 동물의 체내에서 분해되어 본 발명의 화합물을 제공하는 프로드럭의 형태로 투여될 수 있다. 프로드럭은 모 화합물의 물리적 및(또는) 약동학적 프로파일을 변경 또는 개선하는데 사용될 수 있고 모 화합물이 프로드럭을 형성하도록 유도될 수 있는 적합한 기 또는 치환체를 함유할 경우 형성될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin), 그의 프로드럭, 그의 용매화물, 그의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염에 통상의 무독성 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제 등을 첨가하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 환제, 경연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 경구투여용 제제 또는 정맥내, 피하, 설하, 근육내 투약용 멸균성 수성 또는 오일상 용제의 비경구투여용 제제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및/또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 있으며, 이러한 부형제의 비율 및 성질은 선택된 정제의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약제 실무에 의해 결정될 수 있다. 부형제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 마그네슘 스테아린산염, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소디움 알진산염, 메틸셀룰로오스, 소디움 카르복실메틸셀룰로오스, 아가, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화될 수도 있는데, 이러한 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 때, 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약제학적 조성물은 유효 성분, 즉, 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin), 그의 프로드럭, 그의 용매화물, 그의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염이 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물에서 유효성분인 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin), 그의 프로드럭, 그의 용매화물, 그의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 사람을 포함하는 포유류에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 하루에 0.001 내지 500 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎/㎏(체중)의 유효량으로 상기 약제학적 조성물에 포함될 수 있고, 이러한 약제학적 조성물은 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 비만 예방 또는 치료용 조성물을 지방 전구 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유류에 대한 비만 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 포유류의 종류는 특별히 제한되는 것이 아니며, 비만으로 인한 질병을 갖는 계통의 생물체라면 주사, 경구 투여 등의 방법을 통해 제한 없이 처리할 수 있다.
본 발명에서, 상기 비만 예방 또는 치료용 조성물은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 1 내지 250 uM, 좋게는 10 내지 150 uM, 더욱 좋게는 10 내지 75 uM의 농도로 처리할 수 있으며, 보다 구체적으로는 12.5 uM, 25 uM 또는 50 uM의 농도 등으로 처리할 수 있으며, 상기 범위에서 처리 대상 세포에 스트레스 또는 손상을 최소화하면서도 동시에 지방 축적 억제 효과를 높은 상태로 유지할 수 있는 상승 효과를 얻을 수 있어 보다 바람직하다.
또한, 본 발명은 플로레틴(phloretin)에 박테리아 사이토크롬인 P450 효소, P450 효소의 아미노산 돌연변이체, 키메라 P450 효소 및 키메라 P450 효소의 아미노산 점 돌연변이체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 효소를 반응시켜 3-하이드록시 플로레틴을 제조하는 단계를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 3-하이드록시 플로레틴의 제조방법을 제공한다.
3-하이드록시 플로레틴은 플로레틴과 유사한 구조를 갖는 플로레틴의 대사 산물이지만, 일반적인 유기화학 분야에서 화학적으로 합성할 수 없는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 생물학적 촉매인 효소 및 그 돌연변이체 등을 통해 3-하이드록시 플로레틴을 제조하는 한 가지 방법이 최근 본 연구진에 의해 규명된 바 있다.
본 발명에서, 상기 P450 효소는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 P450 BM3의 야생형의 CYP102A1일 수 있다.
본 발명에서 CYP102A1 돌연변이체는 야생형 CYP102A1을 기준으로 아미노산의 자연적이거나 인위적인 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의하여 변화된 서열을 가지는 CYP102A1 전체를 의미할 수 있다. 바람직하게는 야생형 CYP102A의 아미노산 서열을 기준으로 점 돌연변이가 일어난 개체 등을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 CYP102A1 돌연변이체는 공지의 돌연변이 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 결실-돌연변이 방법, PCT 방법, 쿤켈법, 점 돌연변이 방법, DNA 셔플링, StEP(staggered extension process), 오류유발(error-prone) PCR 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 CYP102A1 돌연변이체는 변이가 일어나기 전 아미노산, 아미노산의 위치, 변이가 일어나 치환된 아미노산으로 표시할 수 있다. 예를 들어, R47L은 야생형 CYP102A1의 아미노산 서열인 서열번호 1의 47번째 아미노산인 아르기닌(R)이 류신(L)으로 자연적 또는 인위적으로 변이 유도에 의해 치환된 CYP102A1 돌연변이체를 의미한다. 돌연변이체에서 변이에 의해 치환된 아미노산이 하나 이상인 경우 '/'로 나타낼 수 있다. 예를 들어, R47L/F87V/L188Q는 서열번호 1의 47번째 아미노산인 아르기닌(R)이 류신(L)로로 치환되고 서열번호 11의 87번째 아미노산인 페닐알라닌(F)이 발린(V)으로 치환되고 서열번호 1의 188번째 아미노산인 류신(L)이 글루타민(Q)로 치환된 야생형 CYP102A1의 돌연변이체를 의미한다.
본 발명에서 상기 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 일예로, 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E로 구성된 군일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 야생형 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1에서 점 돌연변이가 일어난 돌연변이체를 포함할 수 있으며, 구체적으로는 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q이다.
본 발명에서 3-하이드록시 플로레틴의 생산방법은 NADPH-생성 시스템을 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 NADPH-생성 시스템은 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 시스템을 사용할 수 있으며, 일예로 글루코스 6-포스페이트(glucose 6-phosphate), NADP+ 및 효모 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase)를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 함유하는 다이어트용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 '건강기능식품'이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 유효성분을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 건강보조식품, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상술된 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 물, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 건강기능식품은 상술된 바와 같이 다양한　제형을 갖을 수 있으며, 특히 분말, 과립, 정제, 캡슐 및 음료 등에서 어느 하나의　제형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[시약 및 재료]
P450 BM3 (야생형 CYP102A1): 발명자 윤철호 및 응우옌응곡안이 연구를 수행하는 전남대학교 공동실험실습관 303호에서 생산하여 사용하였다.
(참고문헌: Kang JY, Kim SY, Kim D, Kim DH, Shin SM, Park SH, Kim KH, Jung HC, Pan JG, Joung YH, Chi YT, Chae HZ, Ahn T, Yun CH. Characterization of diverse natural variants of CYP102A1 found within a species of Bacillus megaterium. AMB Express. 2011 Mar 28;1(1):1. doi: 10.1186/2191-0855-1-1.)
지방전구세포: 3T3-L1은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 미국)에서 분양받아 사용하였다.
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay(MTS): G5430, Promega에서 구입하여 사용하였다.
기타 모든 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
[마우스(mouse), 사료 및 식이요법]
마우스(mouse)는 10주령의 암컷 C57BL/6을 ㈜ 다물사이언스(대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
마우스용 사료는 표준 식이요법(Standard Diet, SD) 또는 고지방 사료(High Fat Diet, HD) 식이요법을 12주 동안 자유 급식의 형태로 실시하였다.
고지방 사료는 카탈로그 번호 HFD D12451(Research Diets Co.; New Brunswick, NJ) 제품을 사용하였다. 상기 고지방 사료의 조성은 하기 표 1과 같다.
영양분 Kcal (%)
단백질 (protein) 20
탄수화물 (carbohydrate) 35
지방 (fat) 45
합계 (kcal/gram) 100
마우스는 12 시간의 명암 주기를 반복하여, 마우스 전용 케이지에 개별적으로 수용한 후 상기 사료를 이용하여 식이요법을 12주 동안 적용하였다.
[ 실시예 1] 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin)의 제조
플로레틴(phloretin)에 P450 효소인 CYP102A1 효소의 돌연변이체를 이용하여 3-하이드록시 플로레틴을 제조하였다. 상기 3-하이드록시 플로레틴의 제조는 본 발명자의 대한민국 국내출원 제10-2017-0124724호(2017.09.27. 출원.)의 방법을 기초로 하였다.
P450 효소인 CYP102A1의 돌연변이체는 CYP102A1 단백질에서 R47L/F87V/L188Q 점 돌연변이(point mutations)시켜 아래 제조에 사용하였다.
최종 부피가 30 mL가 되도록, 플라스크에 50 uM 플로레틴, 60 pM CYP102A1 돌연변이체, 100 mM 인산 칼륨(pH 8.0)과 NADPH-생성 시스템(최종 농도 0.5 mM NADP +, 10 mM 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate; pH 8.0) 및 1 mL 당 1.0 IU 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase))을 혼합한 후, 40 분간 반응시켜 3-하이드록시 플로레틴을 제조하였다.
[ 실시예 2] 3-하이드록시 플로레틴의 세포 독성 측정
3T3-L1 지방 전구 세포를 7개의 실험군으로 나누어 상기 실시예 1에서 제조한 3-하이드록시 플로레틴을 각각 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 uM 처리하고, 나머지 하나의 실험군은 무처리 대조군(control)으로 한 후, MTS Assay Kit를 이용하여 세포 독성을 측정하였다.
비교 실험군으로는 3-하이드록시 플로레틴 대신 플로레틴을 이용하여 동일한 농도로 처리한 후, 마찬가지 방법으로 세포 독성을 측정하였다.
또한 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 각각 0.2, 0.1 % 처리하고, 무처리 대조군과의 세포 독성을 비교하였다.
상기 결과를 도 2에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3-하이드록시 플로레틴은 낮은 농도에서는 물론이고, 농도가 일정 수준 증가하여도 세포 생존에 큰 영향을 주지 않음을 확인하였다. 그러나, 200 uM의 농도로 처리 시 세포 생존률이 다소 감소하는 것을 확인하였다.
[ 실시예 3] 3-하이드록시 플로레틴의 지방 세포 분화 및 지방 축적 억제 효과
3T3-L1 지방 전구세포를 12-웰 플레이트에 뭉치는 상태(confluent)가 될 때까지 배양한 후, 3-하이드록시 플로레틴을 처리하고, 지방 분화 배양액인 MDI 배양액(10% FBS(fetal bovine serum)이 함유된 고농도 글루코스 함유 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 500 uM 메틸이소부틸잔틴(methylisobutylxanthine), 1 uM 덱사메타손(dexamethasone), 10 ug/mL 인슐린 혼합액)에서 분화를 유도하였다.
10% FBS DMEM, 500 uM 메틸이소부틸잔틴(methylisobutylxanthine), 1 uM 덱사메타손 및 10 ug/mL 인슐린이 포함된 배지로 교체하고 3일 경과 후, 10 ug/mL 인슐린이 포함된 배지로 교체하였다. 6일 경과 후, 이틀 간격으로 10% FBS DMEM 배지를 교체해 주면서 10일간 분화를 유도하였다.
10일 경과 후, 분화된 세포는 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)이 혼합된 PBS(phosphate buffered-saline) 용액에서 1 시간 고정시키고, 60% 이소프로판올이 포함된 PBS로 2회 세척한 후, Oil-Red-O 염색 용액으로 15분간 염색한 후, 흐르는 물로 세척하였다.
염색 완료 후, 세포 사진을 촬영하고, '이미지 제이(Image J)' 프로그램을 이용하여 염색된 부분을 정량화한 후, 그래프로 나타내었다.
상기 실험에서 3-하이드록시 플로레틴 대신 각각 플로레틴 및 무처리 대조군에 대해 동일한 과정을 수행하여 광학 밀도를 측정하였다.
상기 실험군의 지방 축적 촬영 사진 및 지방 축적량을 도 3에 도시하였다.
이로부터, 3-하이드록시 플로레틴을 처리한 군에서 지방 세포의 분화가 현저히 억제된 것을 확인하였으며, 이는 플로레틴을 처리한 군에 비해서도 현저히 우수한 것을 확인하였다(도 3a).
또한, 세포 내 지방 축적량을 측정한 결과 역시 대조군(control) 대비 30% 정도로 현저히 억제되었으며, 플로레틴을 처리한 경우에 비해서도 2배 이상 탁월한 지방 축적 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 3b).
[ 실시예 4] 지방 전구세포에서 비만 관련 지방 분화 촉진 인자 유전자의 발현 측정
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 지방 전구세포를 분화시킨 후, 3-하이드록시 플로레틴, 플로레틴 및 무처리 대조군의 3가지 실험군에 대하여, 분화가 완료된 지방 전구세포를 각각 수확하였다.
이후, 비만 관련 유전자인 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein α) 및 지방산 합성 효소(fatty acid synthase; FAS) 유전자 증폭을 위한 프라이머를 하기 표 2와 같이 제작하여, RT-PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 1분간 변성(denaturation), 54℃에서 1분간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분간 연장(extension)하는 주기(cycle)을 35회 반복 수행하였다.
프라이머 염기서열
GAPDH-F 5'-CCC TTA TTG ACC TCA ACT ACA TGG T-3
GAPDH-R 5'-GAG GGG CCA TCC ACA GTC TTC TG-3'
PPARγ2-F 5'-GTT TTA TGC TGT TAT GGG TG-3'
PPARγ2-R 5'-GTA ATT TCT TGT GAA GTG CT-3'
C/EBPα-F 5-TTA CAA CAG GCC AGG TTT CC-3'
C/EBPα-R 5'-GGC TGG CGA CAT ACA GTA CA-3'
FAS-F 5'-TTG CTG GCA CTA CAG AAT GC-3
FAS-R 5-AAC AGC CTC AGA GCG ACA AT-3'
RT-PCR 수행 후 결과를 도 4에 도시하였다.이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 3-하이드록시 플로레틴 처리 실험군에서는 대조군들에 비해 지방 세포 분화 촉진에 중추적인 역할을 담당하는 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein α) 및 지방산 합성 효소(fatty acid synthase; FAS) 유전자의 발현이 현저히 억제되었으며, 특히, 플로레틴 대비해서도 현저히 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
[ 실시예 5] 고지방 사료 식이중인 마우스에 3-하이드록시 플로레틴을 경구 투여한 마우스에서의 비만 유도 및 측정
생후 10주령인 21~22 g의 C57BL/6 암컷 마우스를 이용하여, 충분한 물을 공급하면서, 24±2 ℃의 실온에서 12주간 상기 기술한 표준 식이요법 및 고지방 사료 HFD D12451(Research Diets Co.; New Brunswick, NJ) 식이요법을 적용하여 자유롭게 식이하였다.
고지방 식이요법 실험군
3-하이드록시 플로레틴, 플로레틴을 각각 0.5% DMSO에 용해시킨 후, 실험군의 마우스에 격일 간격으로 20 mg/kg씩 14주 동안 경구 투여하였다. 다른 하나의 마우스 실험군에는 DMSO를 같은 방법으로 투여하였다.
체중은 매일 같은 시각에 0.01 g 단위로 측정하였고, 사료의 식이량은 1주일에 1회씩 7일이 경과하는 시점에 측정하였다.
이후, 고지방 사료 식이 12주 후에 각 마우스의 지방 조직을 분리하여, 그 크기와 무게를 확인하였다.
표준 식이요법 실험군 (음성 대조군)
나머지 하나의 마우스 실험군에는 상기 고지방 식이요법과 동일한 온도 및 환경 조건에서표준 식이요법(SD)을 적용하여 DMSO를 같은 방법으로 투여한 후, 마찬가지로 체중을 측정하고 식이 12주 후에 각 마우스의 지방 조직을 분리하여, 그 크기와 무게를 확인하였다.
지방 조직의 조직검사
상기 고지방 식이요법 실험군 및 표준 식이요법 실험군으로부터 분리한 지방 조직은 통상적인 헤마톡실린과 에오신(Hematoxylin and Eosin, H&E) 염색 방법을 이용하여 조직검사를 수행하였다.
구체적으로, 지방 조직을 파라핀(paraffin)을 이용하여 포매(Embedding)하여 동결한 후, 냉동조직절편기(cryo-cut microtome)를 이용하여 8 um의 두께로 박절한 후, 슬라이드 글래스에 부착시켰다. 조직의 절편이 부착되어 있는 슬라이드를 크실렌(xylene)에 5분간 담지하여 파라핀을 제거하고, 에탄올의 농도를 각각 2분씩 100%-95%-85%-70%로 서서히 낮추어 수화(hydration) 시켰다.
이후, 물로 세척하여 잔류한 에탄올을 제거하고 헤마톡실린으로 6분간 염색시킨 후, 1% 염산-에탄올(HCl-EtOH) 혼합 용액에 3회 담갔다가 꺼내는 과정을 반복하여 헤마톡실린이 조직에 충분히 흡수되도록 하고, 0.5% 암모니아수에 10회 담갔다가 꺼내는 과정을 반복하여 염색을 고정시켰다.
상기 헤마톡실린으로 염색된 조직 절편을 에오신으로 1분 동안 다시 염색시키고 에탄올의 농도를 각각 2분씩 70%-85%-95%-100%로 높여주어 탈수화(dehydration) 시켰다.
탈수된 조직 슬라이드를 크실렌에 5분간 담가 깨끗이 세척한 후 상온에서 완전히 말린 후, 조직 단면을 현미경으로 관찰하고 촬영하였다.
간 조직의 지방 축적 정도 측정
상기 고지방 식이요법 실험군 및 표준 식이요법 실험군으로부터 분리한 간 조직은 통상적인 Oil-Red-O 염색 방법을 이용하여 지방 축적 정도를 측정하였다.
구체적으로, 간 조직을 PBS(phosphate buffered-saline)로 용해된 10% 파라-포름알데히드(Para-formaldehyde) 용액에서 1 시간 동안 고정시키고, 60% 이소프로판올(isopropanol)이 포함된 PBS로 2회 세척한 후, Oil-Red-O 염색 용액(이소프로판올에 용해된 0.5% Oil Red-O 염색 시약과 물을, 6대 4비율로 희석)으로 1시간동안 상온에서 염색하였다.
염색 후 남은 용액은 흐르는 물로 세척하고 완전히 말린 후 조직 단면을 현미경 하에서 촬영하였다.
마우스에 대한 식이요법 적용 결과를 도 5에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 표준 식이요법을 적용한 마우스의 외형이 가장 작으며, 고지방 식이요법을 적용한 마우스 실험군 중에서도 DMSO 및 플로레틴을 투여한 경우에 비해, 본 발명의 3-하이드록시 플로레틴 성분을 투여한 마우스 실험군의 외형이 더 작은 것은 것을 확인할 수 있으며(도 5a), 체중 또한 고지방 식이요법을 적용한 마우스 실험군 중에서 DMSO 및 플로레틴을 투여한 경우에 비해 체중 증가율이 현저히 낮음을 확인하였다(도 5b).
이로부터, 3-하이드록시 플로레틴 성분의 투여에 의해 체중 증가를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, 이러한 체중 증가 억제 효과는 실험군 간의 사료 식이량에 변화가 없는 점으로부터, 식이량 차이에 의한 효과가 아님을 확인하였다(도 5c).
또한, 지방 조직을 분리하여 분석한 결과를 도 6 및 도 7에 도시하였다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3-하이드록시 플로레틴을 투여한 마우스의 생식선 백색 지방조직(Gonadal White Adipose Tissue, GWAT) 및 후복강 백색 지방조직(Retroperitoneal White Adipose Tissue, RWAT)의 내장 지방조직 분포는 플로레틴을 투여한 마우스 대비 현저히 감소되었으며(도 6a), 이들 내장 지방조직의 크기(도 6b) 및 내장 지방조직의 무게(도 6c) 또한 현저히 감소된 것을 확인하였다.
상기 H&E 염색을 이용한 생식선 백색 지방조직의 조직검사 결과, 도 7a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3-하이드록시 플로레틴을 투여한 마우스에서 분리한 지방세포(adipocyte)의 크기가, 플로레틴을 투여한 마우스의 지방세포 대비 현저히 감소되었으며, 상기 간 조직의 지방 축적 정도 측정 수행 결과에서도 3-하이드록시 플로레틴 투여 시, 지방 축적이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
상기 도 7a에서의 지방 세포의 크기를 측정하여 그래프로 나타내었다(도 7b).
이로부터, 본 발명의 3-하이드록시 플로레틴 처리를 통해 지방세포의 크기가 유의적인 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 3-하이드록시 플로레틴은 고지방 식이요법을 수행한 플로레틴 및 DMSO 처리 실험군들 대비 체중 저하 및 지방간의 개선 효과가 현저히 우수하며, 상기와 같은 효과는 식욕의 억제에 기인한 현상이 아님을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 3-하이드록시 프롤레틴이 비만의 억제 효과가 현저히 우수하여 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
서열번호 1 내지 9의 서열 정보는 별도의 파일 형태로 제출하였다.

Claims (6)

  1. 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin, 3-OH phloretin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 유효 성분은 지방 분화 촉진 인자의 억제를 통해 비만을 억제하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 지방 분화 촉진 인자는 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein α) 및 지방산 합성 효소(fatty acid synthase)를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 비만 예방 또는 치료용 조성물을 지방 전구 세포에 처리하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유류에 대한 비만 예방 또는 치료방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 비만 예방 또는 치료용 조성물은 10 내지 75 uM의 농도로 처리하는 인간을 제외한 포유류에 대한 비만 예방 또는 치료방법.
  6. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 함유하는 다이어트용 건강기능식품.
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