WO2020080529A1 - 加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法、抽出容器、抽出液および抽出液を用いる毒性試験方法 - Google Patents

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浩士 伊藤
加藤　忠
慎也 角田
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日本たばこ産業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting particulate matter in smoke of a smoking article, which is carried out by a person skilled in the field of toxic science in the field of tobacco manufacturing, and a method of extracting particulate matter in smoke of a heated smoking article. , An extraction container, an extract, and a toxicity test method using the extract.
  • Flammable smoking articles such as cigarettes, typically comprise shredded tobacco (usually in the form of cut filler) surrounded by a paper wrapper that forms a tobacco rod. Cigarettes are used by consumers by igniting one end of the cigarette and burning a chopped tobacco rod. Consumers receive mainstream smoke by pulling on the opposite end (mouth end or filter end) of a burnt cigarette.
  • the nicotine-containing aerosol-forming substrate such as tobacco is a heating type instead of a combustion type.
  • the aerosol is produced by heating an aerosol-forming substrate.
  • Known heated smoking articles include, for example, smoking articles in which an aerosol is electrically heated or produced by transfer of heat from a combustible fuel element or heat source to an aerosol-forming substrate.
  • the porous or fibrous body impregnated with alcohol / ethanol / glycerin / propylene glycol or a mixed solution thereof is directly or indirectly heated with an electric heat source or a heat source by a chemical reaction. Heat to generate steam.
  • the gas in which the generated vapor and the particulate matter are mixed is mixed in the air drawn through the smoking article, and the mixed gas of the vapor, the particulate matter and the air is added to the above-mentioned tobacco and tobacco leaf. Pass through chopped tobacco, reconstituted tobacco, reconstituted tobacco sheet, reconstituted tobacco granules. During this passage, the mixed gas is mixed with a gas containing a flavor component such as tobacco, leaf tobacco, chopped tobacco, and reconstituted tobacco, and volatile compounds including nicotine and various natural flavors.
  • the consumer inhales the mixed gas containing the gas containing the volatile compound, that is, the mixed gas of the aerosol (particle phase component) and the gas phase component.
  • the consumer draws in the gas mixture by pulling it at the end (mouth end or filter end, mouthpiece end) of the heated smoking article.
  • the smoke generated from smoking articles such as cigarettes contains substances such as tar and nicotine.
  • a carrier such as a filter
  • a method shown by Health Canada is known as a standard for collecting and analyzing smoke components of cigarettes (Health Canada-Tobacco Reporting Regulations SOR / 2000-273, July 2018) (Non-patent document 1).
  • Heating-type smoking articles generally contain less particulate matter in smoke components than flammable smoking articles such as cigarettes, and cannot trap particulate matter in a sufficient amount and concentration. Therefore, it is difficult for those skilled in the tobacco manufacturing industry to analyze smoke components, particularly those skilled in the field of toxicology, to obtain appropriate toxicity test results conventionally or publicly required.
  • this method takes an enormous amount of time, and the possibility of volatilizing the components from the particulate matter captured during that time cannot be ruled out. Evaluation error may occur.
  • a method using a large amount of solvent can be considered.
  • the solvent is a low-toxicity solvent, the higher the concentration of the particulate matter, the more the solvent is concentrated and the concentration becomes high.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMSO also has weak cytotoxicity.
  • the present invention aims to provide a method for extracting particulate matter in the smoke of a heated smoking article.
  • the present invention also aims to provide an extraction container.
  • the extraction container can be used in a method of extracting particulate matter in the smoke of a heated smoking article.
  • Another object of the present invention is to provide an extract containing particulate matter in the smoke of a heated smoking article.
  • the present invention also relates to an in vitro toxicity test method, which comprises using an extract containing particulate matter in the smoke of a heated smoking article.
  • the inventors of the present invention stack two or more particulate matter trapped on the filter and squeeze the stacked filters to extract the components trapped on the filter with high efficiency. Based on this finding, the present invention has been accomplished.
  • a method for extracting particulate matter from smoke of a heated smoking article comprising: (1) The particulate matter in the smoke of the heating type smoking article is collected by two or more filters capable of capturing the particulate matter, (2) stack the two or more filters, and (3) The components attached to the filters are extracted by pressing the stacked filters, The method comprising: [Aspect 2] Step (3) (3-i) compress the stacked filters and restore them, (3-ii) Compress the stacked filters to extract the components adhering to the filters, apply the extract to the stacked filters, and compress again, or (3-iii) The method according to aspect 1, which is carried out by combining (3-i) and (3-ii).
  • a storage unit that can store two or more filters in a stacked state, One or a plurality of squeezing members that squeeze the filters stored in the storage section in a stacked state;
  • An extraction container comprising a reservoir communicating with the container.
  • the shape of the squeezing surface for squeezing the filter by the squeezing member is a flat surface, a conical slant surface, or a convex or concave curved surface.
  • a syringe-type cylinder member A sieve member having pores, which is arranged so as to partition the hollow space of the cylinder member into a proximal space and a distal space, A piston member capable of sliding in a liquid-tight manner on the base end side space of the cylinder member; Equipped with The sieving member and the piston member each constitute a squeezing member by forming a squeezing surface on their inner facing surfaces. At least a part of the proximal space between the pressing surface of the piston member and the pressing surface of the sieving member defines the accommodating portion, The distal space defines the reservoir, The extraction container according to any one of aspects 17-20.
  • the extraction method of the present invention has made it possible to extract particulate matter from smoke of a heating-type smoking article with high efficiency as compared with conventional extraction methods. According to the method of the present invention, extraction with no solvent or a small amount of solvent is possible. Therefore, an in vitro toxicity test can be performed with the influence of the solvent eliminated. Furthermore, the influence of the solvent can be grasped by arbitrarily adding the solvent, and a comparative test of various types of heating smoking articles can be conducted.
  • FIG. 1 is a sectional view of an extraction container according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view of a squeezing surface of a second squeezing member that constitutes the extraction container according to the first embodiment, FIG. An example in which radial grooves are formed on the surface is shown.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the extraction container according to the first embodiment, which is provided with a driving unit that drives the pressing member that constitutes the extraction container.
  • 4A and 4B are diagrams of an extraction container according to a second embodiment of the present invention, in which FIG. 4A is a sectional view of the extraction container, and FIG. 4B is an extraction device equipped with a circulation device for circulating an extraction liquid.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of the extraction container according to the first configuration example according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a sectional view of an extraction container according to a second exemplary configuration according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of the extraction container according to the first configuration example according to the fourth embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view of an extraction container according to a second configuration example according to the fourth embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is sectional drawing of the extraction container which concerns on the 5th Embodiment of this invention.
  • FIG. 10 is a flowchart showing a method for extracting a liquid from a filter using the extraction container according to each embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 shows the relationship between the compression and return pressures (MPa) (4 times) applied to the filter, the filter thickness (mm), and the amount of the extract. The thickness of the filter is shown by a white circle, and the amount of extract is shown by a black triangle.
  • FIG. 12 shows the results of the Ames test.
  • the horizontal axis represents the sample addition dose ( ⁇ g total particulate matter (TPM) eq./mL), and the vertical axis represents the number of viable cells after sample addition to the number of viable cells before sample addition (cells that have undergone cell reversion mutations). ) Is a plot of the ratio (%).
  • TPM total particulate matter
  • FIG. 13 shows the result of the MN test.
  • the abscissa plots the added dose of the sample ( ⁇ g total particulate matter (TPM) eq./mL), and the ordinate plots the frequency of occurrence of micronuclei (MN) (MN induction) (%). is there.
  • FIG. 14A shows the results of neutral red uptake activity test of DMSO extracted samples (conventional method). The abscissa plots the added dose of the sample, and the ordinate plots the percentage of the neutral red uptake of cells exposed to the sample to the neutral red uptake of cells without the sample.
  • FIG. 14B shows the neutral red uptake activity test results of the SEP method.
  • the abscissa plots the added dose of the sample, and the ordinate plots the percentage of the neutral red uptake of cells exposed to the sample to the neutral red uptake of cells without the sample.
  • FIG. 14C shows the neutral red uptake activity test results of the SEP method.
  • the abscissa plots the added dose of the sample, and the ordinate plots the percentage of the neutral red uptake of cells exposed to the sample to the neutral red uptake of cells without the sample.
  • FIG. 14D shows the neutral red uptake activity test results of the SEP method.
  • the abscissa plots the added dose of the sample, and the ordinate plots the percentage of the neutral red uptake of cells exposed to the sample to the neutral red uptake of cells without the sample.
  • Marlboro for iQOS REGULAR (trademark) (sample A) (black circle) of heating type smoking article, heating type smoking article B (sample B) (white circle), Mevius (registered trademark) Regular for Bloom Tech ( (Black triangle) was used.
  • a first aspect of the present invention relates to a method of extracting particulate matter in smoke of a heated smoking article.
  • the method of extracting particulate matter in the smoke of a heated smoking article comprises: (1) The particulate matter in the smoke of the heating type smoking article is collected by two or more filters capable of capturing the particulate matter, (2) stack the two or more filters, and (3) The components attached to the filters are extracted by pressing the stacked filters, Including that.
  • heated smoking articles In contrast to combustible smoking articles such as cigarettes, many "heated smoking articles" have been developed in which the nicotine-containing aerosol-forming substrate such as cigarettes is a heating type instead of a combustion type. In heated smoking articles, the aerosol is produced by heating an aerosol-forming substrate.
  • Known heated smoking articles include, for example, smoking articles in which an aerosol is electrically heated or produced by transfer of heat from a combustible fuel element or heat source to an aerosol-forming substrate. During smoking, volatile compounds are released from the aerosol-forming substrate by heat transfer from a heat source and become entrained in the air drawn through the smoking article. As the released compound cools, it condenses to form an aerosol, which is inhaled by the consumer.
  • the heating type smoking article of the aspect is a porous or fibrous material impregnated with alcohol, ethanol, glycerin, propylene glycol or a mixed solution thereof with an electric heat source or a heat source by a chemical reaction described above without burning tobacco.
  • the mixed gas of vapor and particulate matter generated by directly or indirectly heating the object is mixed in the air drawn through the smoking article.
  • the mixed gas of steam, particulate matter, and air is passed through the tobacco, reconstituted tobacco, reconstituted tobacco sheet, and reconstituted tobacco granules, in addition to the above-mentioned tobacco, to contain tobacco, leaf tobacco, and reconstituted tobacco.
  • a gas containing a flavor component, a volatile compound such as nicotine or various natural flavors is mixed.
  • the consumer inhales the mixed gas containing the gas containing the volatile compound, that is, the mixed gas of the aerosol (particle phase component) and the gas phase component.
  • the consumer draws in the gas mixture by pulling it at the end (mouth end or filter end, mouthpiece end) of the heated smoking article.
  • non-combustible smoking articles in which the nicotine-containing aerosol is produced from a tobacco material, tobacco extract, or other source of nicotine, in some cases without heating, for example by a chemical reaction. And referred to as "heated smoking article”.
  • heating type smoking article includes all types of heating type smoking articles described above, unless otherwise specified.
  • the "particulate matter in smoke of a heating-type smoking article” means all substances except gaseous and volatile substances in smoke generated from the heating-type smoking article, and total particulate matter (TPM, total). In some cases, it is also referred to as a particle matter).
  • the particulate matter in the smoke of the heated smoking article includes water vapor, nicotine, propylene glycol, glycerin, menthol, and the like.
  • One of the heating-type smoking articles Philip Morris Products Societe Anonym's heating-type smoking article (Product name Marlboro (registered trademark) Heat Sticks (registered trademark) SMOOTH & PURPLE, PURPLE MENTHOL, REGULAR, and BARLARE) , MENTHOL, and MINT (trademark)) are applied to the dedicated heating type smoking device (trade name iQOS (registered trademark), iQOS2.4, iQOS2.4plus) in the particulate matter in smoke generated.
  • Nicotine, propylene glycol, glycerin, fructose, glucose, and trace amounts of carbon monoxide below the limit of quantification. Analysis can be performed by gas chromatography-mass spectrometry (GC / MS) or the like depending on the type of component.
  • the material and shape of the “filter capable of capturing particulate matter” are not particularly limited as long as they can capture the particulate matter in the smoke of the heating type smoking article.
  • Usable filters include glass fiber filters, HEPA filters, ULPA filters, Cambridge filters and the like.
  • a glass fiber filter is preferable.
  • the shape is preferably a flat circular shape having a diameter of about 10 mm to 100 mm. More preferably, it is a flat circular shape having a diameter of 40 mm to 50 mm. More preferably, it is a flat circular shape having a diameter of 44 mm. Shapes other than circles, squares, diamonds, triangles, etc. can also be used.
  • the thickness of each filter is preferably 4 mm or less, more preferably 2 mm or less.
  • the “filter capable of capturing particulate matter” includes a HEPA filter (High Efficiency Particulate Air Filter), which is a type of air filter capable of removing dust, dirt, and the like from the air.
  • HEPA filter High Efficiency Particulate Air Filter
  • the HEPA filter is "an air filter that has a particle collection rate of 99% or more for particles with a size of 0.3 ⁇ m at the rated air volume and an initial pressure loss of 245 Pa or less". It is prescribed.
  • the "filter capable of trapping particulate matter” is a filter that "has a particle collection rate of 99% or more with respect to particles having a particle size of 0.3 ⁇ m at the rated air volume".
  • a ULPA filter (Ultra Low Penetration Air Filter) is a filter with a higher particle collection efficiency than the HEPA filter.
  • the ULPA filter is a JIS Z 8122, "air filter that has a particle collection rate of 99.9995% or more for particles having a particle size of 0.15 ⁇ m at the rated air volume and an initial pressure loss of 245 Pa or less. It is prescribed.
  • a filter having the same properties as the HEPA filter or ULPA filter can also be used.
  • a Cambridge filter can be used as the “filter capable of capturing particulate matter”.
  • the Cambridge filter is a flat circular glass fiber filter having a diameter of about 44 or 92 mm and a thickness of 1.5 mm, and is well known and widely used by those skilled in the art as a filter capable of capturing particulate matter.
  • the Cambridge filter is available from Nippon Cambridge Filter Co., Ltd., Borgwalt (catalog number 80202852) and the like.
  • “Collecting two or more filters capable of trapping particulate matter” may be performed, for example, by generating smoke from a heated smoking article and directly blowing the generated smoke onto the filter.
  • the generation of smoke from the heating-type smoking article is described, for example, in the recommended method No. 81 (Non-Patent Document 4), it can be performed according to a predetermined mechanical smoking method (for example, negative pressure of the mechanical smoking device, suction time, suction amount, suction operation interval 30 seconds ⁇ 0.5 seconds).
  • Generation of smoke from a heating-type smoking article is performed by using, for example, a sample prepared according to a humidity control / conditioning method of the heating-type smoking article defined by ISO (the International Organization for Standardization) 3402: 1999 (Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 6 2012 (Non-Patent Document 6), a predetermined suction method of a smoking machine (for example, suction amount 55 mL / time, suction time: 2.0 seconds / time, suction interval: every 30 seconds) and start and end of suction. It can be performed according to the conditions of.
  • the filter is replaced with the next filter when the amount of the particulate matter captured on the first filter reaches a certain level, without limitation. It is preferable to spray smoke one by one on the filter so that the smoke is similarly sprayed on the filter in (1) and so on.
  • exchange is performed when the particulate matter captured by the first filter reaches 300 mg / pad or more, 400 mg / pad or more, 450 mg / pad or more, 500 mg / pad or more.
  • exchange is performed when the particulate matter captured by the first filter is 800 mg / pad or less, 750 mg / pad or less, 700 mg / pad or less, 650 mg / pad or less.
  • the filter is replaced in the range of 500-650 mg / pad of particulate matter captured by the first filter.
  • the method involves crushing the filter by squeezing and allowing the exuding liquid (pressing liquid) to remove the particulate matter (components adhering to the filter) captured by the filter from the filter.
  • the dissolved particulate matter is dissolved in the exuded liquid (pressed liquid).
  • the means for "squeezing" is not particularly limited as long as it can loosen the filter and exude the liquid.
  • the compression reversion of the stacked filters in step (3-i) may be repeated twice or more.
  • the compression reversion of the stacked filters is repeated 2 or more times, 3 or more times, or 4 or more times.
  • the compression is preferably performed at 0.01 MPa or more, 0.1 MP or more, 0.5 MP or more, 2.0 MP or more. In one aspect, the compression is preferably performed at 0.5 MPa or less, 2.0 MPa or less, 5.0 MPa or less, 10.0 MPa or less. It is desirable that the pressure is such that the fluidity of the compressed liquid is not lost.
  • the pressing may be started from 0 MPa and the pressing pressure may be gradually increased. The pressing is performed in the range of 0 MPa-10.0 MPa, for example.
  • the compression recovery in step (3-i) is performed twice or more, the pressure at each time may be the same or different. The pressure of the squeeze may be gradually increased with each repetition.
  • step of compressing the stacked filters in step (3-ii) to extract the components adhering to the filters, the extract solution being put back on the stacked filters, and compressed again may be repeated twice or more.
  • step (3-ii) is repeated 2 or more times, 3 or more times, 4 or more times.
  • (3-i) and (3-ii) may be performed alone or in combination.
  • the pressure and frequency of compression (pressurization) of (3-i) can be reduced.
  • the filter and the extract may be shaken during the steps (3-i) and / or (3-ii).
  • the degree of shaking (strength) may be, without limitation, an amplitude of 2 cm to 6 cm, and 100 to 300 reciprocations per minute. In one aspect, it may be 4 cm, 200 round trips per minute.
  • step (3) is performed with the filter contained in an extraction vessel having two squeezing surfaces.
  • step (3) the extract extracted by pressing is made to flow or circulate.
  • step (3) it is preferable to repeat the step (3) until the thickness of the stacked filters becomes equal to or less than the predetermined thickness.
  • step (3) is repeated until it becomes 1 ⁇ 2 or less before performing step (3), 1 ⁇ 3 or less, or 1 ⁇ 4 or less.
  • step (3) is repeated until the filter is messed up by pressing.
  • the method for extracting the particulate matter in the smoke of the heated smoking article does not use a solvent in the step (3) in one embodiment.
  • a small amount of amphiphilic solvent may be added in step (3).
  • the amount of the amphipathic solvent added is not particularly limited. In one embodiment, it is 400% (weight / volume) or less, more preferably 200% (weight / volume) or less, based on the filter volume. In one aspect, the amount of amphiphilic solvent added is greater than 0% (weight / volume), or greater than or equal to 10% (weight / volume).
  • Amphiphilic solvents include, but are not limited to, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol, isopropanol, acetone and the like.
  • step (3) no solvent is used, or only a small amount of amphipathic solvent is used, so that, for example, in the state where the influence of the solvent in the in vitro toxicity test method to be described later is excluded, various effects on the living body can be obtained.
  • the impact can be examined.
  • the influence of the solvent can be grasped by arbitrarily adding the solvent, and a comparative test of various types of heated smoking articles can be conducted.
  • effects such as comparison between the undiluted solution (liquid) and the aerosol collected after smoking can be obtained.
  • step (3) it may further include (4) centrifugation of the filter to obtain a separated liquid; and (5) mixing the separated liquid with the extract obtained in the step (3).
  • Centrifugation is not particularly limited in strength (rotation speed, time) as long as it can separate liquid components remaining in the filter even after pressing.
  • the rotation speed is, for example, 1,000 rpm-6,000 rpm, preferably 3,500 rpm-5,000 rpm.
  • the time is, for example, 1 minute or longer, preferably 5 minutes or longer. In one aspect, for example, centrifugation may be performed at 4000 rpm for 5 minutes.
  • the separated liquid obtained by centrifugation was mixed with the squeezed liquid obtained in step (3) to obtain an extract.
  • the liquid obtained in the step (3) is referred to as "pressed liquid” or “extracted liquid”.
  • a mixture of the “pressed liquid” and the “separated liquid” obtained by centrifugation may be referred to as an “extracted liquid”.
  • Extraction container The second aspect of the present invention relates to an extraction container.
  • the extraction container is useful for extracting particulate matter from the smoke of heated smoking articles.
  • the extraction container can be used in a method of extracting particulate matter in the smoke of a heated smoking article as described herein.
  • each of the first to fifth embodiments of the "extraction container" which is the second embodiment of the present invention will be described.
  • FIG. 1 shows an extraction container 1a according to the first embodiment.
  • the extraction container 1a includes a first pressing member 2a and a second pressing member 3a.
  • the first squeezing member 2a is provided with a substantially cylindrical recess 6, and the inner bottom surface of the recess 6 forms the first squeezing surface 4.
  • the second squeezing member 3a has a tip portion 11 formed so as to be inserted into the concave portion 6 of the first squeezing member 2a, and the tip portion 11 has a groove 9 formed along the outer periphery of the side surface thereof.
  • An O-ring 12 is fitted in the groove 9 so as to engage with the inner surface of the recess 6. That is, the second squeezing member 3a is formed so as to be liquid-tightly slidable in the recess 6 of the first squeezing member 2a.
  • positioned facing the said 1st pressing surface 4 define the accommodating part 8 between them.
  • the storage portion 8 can store the two or more filter members 7 in a stacked state.
  • the “extraction container” is used in the "method for extracting particulate matter in smoke of a heating-type smoking article" which is the first embodiment of the present invention described above, the first embodiment of the present invention is used as the filter member 7.
  • the filters described in the first and third modes and the examples can be used.
  • a reservoir 10 is formed on the second squeezing member 3a, and the reservoir 10 communicates with the housing portion 8 via a thin tube 13 extending from the reservoir 10.
  • a trumpet-shaped opening 14 may be formed in the vicinity of the second squeezing surface 4 in order to facilitate collection of the liquid in the storage portion 8.
  • the second squeezing surface 5 of the second squeezing member 3a may be formed in a flat shape in a region other than the opening 14 as shown in FIG. 2 (a). More preferably, as shown in FIG. 2B, a plurality of grooves 15 are formed radially in the radial direction around the opening 14.
  • the second squeezing member 3a can slide in the recess 6 of the first squeezing member 2a in a liquid-tight manner, so that the first squeezing member 2a and the second squeezing member 3a are positioned relative to each other.
  • Relative movement that is, the first and second squeezing surfaces 4, 5 can be moved closer to each other or separated from each other.
  • the driving means for the first and second pressing members 2a, 3a that bring about this relative movement for example, the configuration shown in FIG.
  • the brewing container 1 a equipped with a driving means includes a housing 20 for housing the brewing container 1 a, a lid portion 21 of the housing 20, and a screw through hole 22 formed in a central portion of the lid portion 21.
  • the bearing portion 25 is rotatably supported at its end portion and is fixed to the opening top portion of the reservoir 10 of the second pressing member 3a.
  • the first squeezing member 2a of the extraction container 1a is fixed to the bottom plate of the housing 20 with a bolt 30, the second squeezing member 3a is fixed to the bottom plate 26 of the bearing portion 25 overhanging with a bolt 31, and the lid portion 21 is , Are fixed to the housing 20 with bolts 32.
  • step 100 two or more filter members 7 that have trapped the particulate matter are stacked and placed in the housing portion 8 (step 100).
  • step 102 is performed by rotating the handle 24 in the direction in which the threaded rod 24 is drawn into the housing 20 (direction A in FIG. 3), as described above.
  • step 104 is performed by rotating the handle 24 in the direction in which the screw rod 24 is pulled out from the housing 20 (direction B in FIG. 3), as described above.
  • the compression process of step 102 and the recovery process of step 104 count as one compression-recovery cycle.
  • the pressure described above in the first embodiment of the present invention or the pressure described later in the third embodiment of the present invention is used.
  • step 106 it is determined whether the number of compression-recovery cycles executed in steps 102 and 104 is less than M.
  • M is set to an integer of 2 or more.
  • step 106 If the number of compression-recovery cycles is less than M (affirmative determination in step 106), the process returns to step 102 and the compression-recovery cycle is repeated again.
  • the filter member 7 is squeezed and the liquid containing the trapped particulate matter is extracted.
  • the extract liquid permeates from the opening 14 through the thin tube 13 into the reservoir 10.
  • the second squeezing surface 5 is provided with the groove 15 as shown in FIG. 2 (b)
  • the extraction liquid passes through the groove 15 more smoothly, passes through the narrow tube 13 from the opening 14, and passes through the reservoir 10. Leaches into.
  • step 108 the extract leached into the reservoir 10 is collected and returned to the filter member 7 in the housing portion 8. This return process is counted once.
  • the extraction and leaching of the extract leached in the reservoir 10 are performed using, for example, a pipette. Further, when the extract is recovered, the first squeezing surface 4 and the second squeezing surface 5 are returned from the separated state to the close state, so that a larger amount of the extract solution is leached into the reservoir 10 and then performed. Is preferred.
  • N is set to an integer of 2 or more.
  • step 110 If the number of times the extract is fed back is less than N (affirmative determination in step 110), the process returns to step 102 again, the compression-return cycle is repeated M times, and the extract is collected and returned.
  • the extract leached into the reservoir 10 is finally collected with a pipette or the like.
  • the recovered extract is used for the analysis of particulate matter.
  • a step of shaking the extraction container 1a can be added after the compression-recovery cycle of steps 102 and 104 in FIG.
  • the direction in which the extraction container 1a is shaken is preferably, for example, a lateral direction along the pressing surface (in the example of FIG. 3, a direction perpendicular to the axial direction of the screw rod 23), but is not limited thereto.
  • step 102 of FIG. 10 not only compression by pressing the pressing surfaces 4 and 5 but also a step of rotating the pressing surfaces 4 and 5 relative to each other may be added.
  • a step of rotating the pressing surfaces 4 and 5 relative to each other By rotating the squeezing surfaces 4 and 5 relative to each other, not only the compressive force but also the twisting force is applied to the stacked filter members 7, and the liquid extraction effect can be further improved.
  • step 102 of FIG. 10 as described above in “Method for extracting particulate matter in smoke of heated smoking article”, the amphipathic solvent may be added to the filter member 7 and compression may be performed. . Of course, compression without solvent is also possible.
  • the compression-return cycle is performed N times for each M compression-recovery cycles, that is, a total of M ⁇ N compression-recovery cycles are performed.
  • step 108 moves between steps 104 and 106, and step 110 is deleted.
  • the timing of the back-and-back process can be appropriately changed other than this, and the embodiment of the present invention includes an arbitrary combination of the compression-return cycle and the back-and-back process.
  • the squeezing is performed by rotating the handle 24 manually, but an electric drive means such as a motor may be used instead of the handle 24. Further, the squeezing member may squeeze the filter member 7 directly or indirectly by the piezoelectric actuator.
  • the second pressing member 3a was moved, but the first pressing member 2a may be moved, or both the first and second pressing members may be moved.
  • step 106 conditions are set so that the compression-return cycle is continued until the thickness of the laminated filter member 7 becomes a thickness equal to or less than a predetermined ratio (for example, 1/3) before the start of the compression-return cycle. It can be changed.
  • a predetermined ratio for example, 1/3
  • the reservoir 10 is formed inside the second pressing member 3a, but the reservoir 10 may be formed inside the first pressing member 2a, or the first pressing member 3a. It may be formed on both 2a and the second pressing member 3a.
  • the second embodiment relates to an extraction container provided with a mechanism for circulating an extraction liquid without using a pipette, which will be described below with reference to FIG.
  • symbol is attached
  • the extraction container 1b includes a first pressing member 2b and a second pressing member 3b.
  • the second squeezing member 3b is formed so as to be liquid-tightly slidable in the recess 6 of the first squeezing member 2b, and the first squeezing surface 4 and the second squeezing surface 5 are housed between them.
  • a part 8 is defined, and the housing part 8 can house two or more filter members 7 in a stacked state.
  • the first squeezing member 2b has a first cavity 40 that functions as a tube connector for a circulation tube described later, and the second squeezing member 3b has a second cavity that functions as a tube connector for a circulation tube. It has a part 45.
  • a large-diameter portion 41, a medium-diameter portion 42, and a small-diameter portion 43, each having three different diameters, are formed in the first hollow portion 40.
  • the large-diameter portion 41 opens at the bottom of the first squeezing member 2b, and is connected to the escape port 44 of the circulation tube formed as a cutout on the side surface of the first squeezing member 2b.
  • the small diameter portion 43 is open at the first squeezing surface 4, whereby the first cavity portion 40 communicates with the accommodation portion 8.
  • the second cavity portion 45 is formed with a large diameter portion 46, a medium diameter portion 47, and a small diameter portion 48 each having three different diameters.
  • the large-diameter portion 46 opens at the top of the second pressing member 3b and is connected to the escape port 49 of the circulation tube formed as a cutout on the side surface of the second pressing member 3b.
  • the small diameter portion 48 is open at the second pressing surface 5, so that the second hollow portion 45 communicates with the accommodation portion 8.
  • FIG. 4B shows a state in which the circulation tube 50 is attached to the extraction container 1b.
  • one end portion 51 of the circulation tube 50 is inserted into the large diameter portion 41 of the first cavity portion 40, and the other end portion 52 of the circulation tube 50 is formed into the second end portion 52.
  • the circulation tube 50 is attached to the extraction container 1b by being inserted into the large diameter portion 46 of the hollow portion 45 of FIG.
  • a peristaltic pump 53 is attached to the circulation tube 50. When the peristaltic pump 53 is driven to draw from one end 51 of the circulation tube 50, the extract liquid in the storage portion 8 passes through the small diameter portion 43 and the medium diameter portion 42 of the first hollow portion 40 and the circulation tube 50.
  • the driving means shown in FIG. 3 may be attached to the extraction container 1b according to the second embodiment, for example.
  • the direction of the circulation tube can be changed by bending one end 51 of the circulation tube 50 at the escape port 44. Therefore, even if the bottom surface of the first squeezing member 2b is attached to, for example, the housing 20 of FIG. 3, it is possible to avoid this and appropriately arrange the circulation tube 50.
  • the bearing portion 25 of FIG. 3 is attached to the top of the second pressing member 3b by bending the other end portion 52 of the circulation tube 50 at the escape port 49, avoid this.
  • the circulation tube 50 can be appropriately arranged.
  • the first hollow portion 40 and the second hollow portion 45 are the reservoir 10 in the first embodiment. Will also play a role.
  • the liquid can be extracted from the filter member 7 according to the flowchart of FIG. 10 by using the extraction container 1b according to the second embodiment.
  • the “collection of the extract and the return to the filter” in step 108 of FIG. 10 corresponds to the “circulation of the extract through the circulation hose 50 and the housing 8” by the peristaltic pump 53.
  • the “number of times the extract is returned and returned” in step 110 is, for example, the number of times when “driving the peristaltic pump 53 for a predetermined time to circulate the extract” is counted once, or “extract is It is also possible to count that one round from the accommodation section 8 to the accommodation section 8 via the circulation tube 50.
  • step 112 one of the ends 51 and 52 of the circulation tube 50 on the discharge side of the extract is removed from the extraction container 1b, and the extract is separated from the removed end using the peristaltic pump 53, for example, for analysis.
  • the extract is finally collected by discharging it into a container or the like.
  • the threshold M in step 106 and the threshold N in step 110 are small, for example.
  • the reservoir is formed inside the first squeezing member or the second squeezing member.
  • the third embodiment has a configuration in which the reservoir is provided on the outer periphery of the housing portion 8 of the filter member 7, and will be described below with reference to FIGS. 5 and 6.
  • symbol is attached
  • FIG. 5 shows an extraction container 1c according to the first configuration example of the third embodiment.
  • the extraction container 1c is provided with the 1st pressing member 2c and the 2nd pressing member 3c similarly to 1st Embodiment.
  • the second squeezing member 3c is formed so as to be liquid-tightly slidable in the recess 6 of the first squeezing member 2c, and the first squeezing surface 4 and the second squeezing surface 5 are housed between them.
  • a part 8 is defined, and the housing part 8 can house two or more filter members 7 in a stacked state.
  • the reservoir 54 there is an empty space on the outer periphery of the accommodation portion 8, and this entire space forms the reservoir 54.
  • the reservoir 54 has an annular groove 55 formed on the outer circumference of the first pressing surface 4.
  • FIG. 6 shows an extraction container 1d according to the second configuration example of the third embodiment.
  • the extraction container 1d includes a first squeezing member 2d and a second squeezing member 3d, and has a reservoir 56 on the outer periphery of the storage section 8.
  • the reservoir 56 of the extraction container 1d has an annular groove 57 on the outer periphery of the second compressed surface 5 in contrast to the annular groove 55 formed on the first compressed surface 4 in the first configuration example.
  • the other points are similar to those of the first configuration example.
  • the pressing surfaces 4 and 5 are formed as flat surfaces, but the present invention is not limited to this example.
  • An example in which the compression surface is not a flat surface will be described as a fourth embodiment with reference to FIGS. 7 and 8.
  • FIG. 7 shows an extraction container 1e according to the first configuration example of the fourth embodiment.
  • the extraction container 1e has the same basic configuration as the extraction container 1c shown in FIG. 5, but the first pressing surface 4e and the second pressing surface 5e are not flat surfaces but spherical surfaces.
  • the spherical surface of the first compression surface 4e is concave and the spherical surface of the second compression surface 5e is convex, but the configuration may be reversed.
  • the radius of the spherical surface of the first pressing surface 4e and the second pressing surface 5e is substantially the same so that both pressing surfaces can be fitted.
  • the “spherical surface” in the fourth embodiment may be a convex (or concave) curved surface as a whole, and may be another quadric surface such as an elliptic surface, a paraboloid, or a hyperboloid, or a quadric or higher surface
  • quadric surface such as an elliptic surface, a paraboloid, or a hyperboloid, or a quadric or higher surface
  • the higher-order curved surface of may be used.
  • FIG. 8 shows an extraction container 1f according to a second configuration example of the fourth embodiment.
  • the extraction container 1f has the same basic configuration as the extraction container 1d shown in FIG. 6, except that the first pressing surface 4f and the second pressing surface 5f are not flat but are formed as conical slopes.
  • the conical slope of the first compression surface 4f is concave and the conical slope of the second compression surface 5f is convex, but the converse may be adopted.
  • the slope angles of the first compression surface 4f and the second compression surface 5f are substantially the same so that both compression surfaces can be fitted.
  • the shapes of the first and second compressed surfaces according to the fourth embodiment are applicable not only to the third embodiment but also to other embodiments.
  • the fifth embodiment relates to a syringe-type extraction container, which will be described below with reference to FIG. 9.
  • an extraction container 1g has a syringe type cylinder member (first pressing member) 2g having a hollow space 6g (recess) and a piston member (second). Squeezing member) 3g.
  • the cylinder member (first squeezing member) 2g is a sieve having pores (capillary tubes) arranged so as to partition the hollow space 6g (recess) into the proximal space 62 and the distal space (reservoir) 10g. It has a member 60 and a tip portion 61 in which a pipe for ejecting the extraction liquid is formed.
  • a groove 9 is formed along the outer periphery of the side surface of the piston member (second pressing member) 3g, and an O-ring 12 is fitted in the groove 9 so as to engage with the inner side surface of the proximal space 62.
  • the piston member (second pressing member) 3g can slide in a liquid-tight manner in the proximal space 62 of the cylinder member (first pressing member) 2g.
  • the sieving member 60 and the piston member (second squeezing member) 3g have their inner facing surfaces forming a first squeezing surface 4g and a second squeezing surface 5g, respectively. At least a part of the proximal space 62 between the first compression surface 4g and the second compression surface 5g defines the accommodating portion 8g of the stacked filter members 7.
  • the piston member (second squeezing member) 3g is slid in the cylinder member (first squeezing member) 2g so that the storage portion 8g
  • the compression-recovery cycle described in the first embodiment with reference to FIG. 10 can be executed for the filter member 7 of FIG.
  • the liquid is extracted from the filter member 7 that has undergone the compression-recovery cycle, and the extracted liquid permeates from the pores of the sieving member 60 into the tip side space (reservoir) 10g.
  • the extraction container 1g by arranging the extraction container 1g so that the tip portion 61 faces downward and closing the opening of the tip portion 61, it is possible to store the extraction liquid in the tip side space (reservoir) 10g. Become.
  • the extraction container 1g if the extraction container 1g is arranged so that the tip 61 faces downward, the extraction liquid stored in the tip side space (reservoir) 10g due to gravity is sieved. After passing through the pores of the member 60, it is put back to the filter member 7 again.
  • the extraction container 1g according to the fifth embodiment is configured as a syringe type, the compression-return cycle and the back-and-back process can be executed very easily, and the operability can be greatly improved.
  • Extraction liquid containing particulate matter in smoke of heated smoking article is a smoke of heated smoking article obtained by a method of extracting particulate matter in smoke of heated smoking article. An extract containing particulate matter therein.
  • the extract contains the particulate matter in the smoke of the heated smoking article at a sufficient concentration effective for being subjected to the in vitro toxicity test described later.
  • the “sufficient concentration effective for subjecting to in vitro toxicity test etc.” is, for example, a concentration at which the cytotoxicity becomes 55 ⁇ 5% using a predetermined cytotoxicity parameter at the highest concentration.
  • the particulate matter in the smoke of the heated smoking article contained in the extract comprises one or more of a substance selected from water vapor, nicotine, propylene glycol, glycerin, menthol, fructose, glucose and carbon monoxide.
  • the extract contains these particulates in proportions that reflect the proportions contained in the smoke of the heated smoking article.
  • the extract contains 40% (weight / weight) or more, preferably 45% (weight / weight) or more of “glycerin + PG + water”.
  • the extract contains no solvent. In one aspect, the extract may contain only a small amount of amphipathic solvent. In one aspect, the extract may comprise up to 400% by weight, preferably up to 200% by weight of amphiphilic solvent.
  • An extract containing no solvent or containing only a small amount of an amphipathic solvent can avoid the influence of the solvent in the in vitro toxicity test method described later, for example. Furthermore, the influence of the solvent can be grasped by arbitrarily adding the solvent, and a comparative test of various types of heating smoking articles can be conducted.
  • the extract is for use in an in vitro toxicity test.
  • the in vitro toxicity test is a micronucleus test or an Ames test. "In vitro toxicity test is described in detail in” 4. In vitro toxicity test method ".
  • the present invention also relates to an in vitro toxicity test method.
  • the in vitro toxicity test method comprises using the extract containing particulate matter in the smoke of a heated smoking article obtained by the method of the present invention.
  • In vitro toxicity test methods include bacterial reverse mutation test (Ames test, Ames test), micronucleus test (MN test), neutral red test, etc.
  • Ames test In the bacterial reverse mutation test (Ames test, Ames test), point mutations are detected using Salmonella and Escherichia coli strains that require amino acids. This point mutation involves the substitution, addition or deletion of one to a few DNA base pairs.
  • the principle of this test is to detect mutations in which the mutations in the test strain are reverted to restore the functional ability to synthesize essential amino acids. Revertant strains are detected by their ability to grow in the absence of amino acids required by the parental test strain. It is called a cell reverse mutation test because it means that a bacterium modified so that amino acid synthesis cannot be performed will revert to the original amino acid synthesis of the bacterium by mutation.
  • the Ames test can be performed, for example, in accordance with “Bacterial reverse mutation test” (OECD / OCDE TG471) of “OECD Guideline for Testing of Chemical Tests” (adopted July 21, 1997).
  • the micronucleus test is a genotoxicity test aimed at detecting micronuclei (MN) in the intracellular chambers of interphase cells. Micronuclei arise from acentric chromosomal fragments (lack of centromeres) or whole chromosomes that cannot move to the poles of the cell during late cell division. In this test, cells undergoing cell division are exposed to a test substance, and the chromosomal aberration-inducing activity or aneuploidy-inducing activity of the chemical substance is detected during or after the exposure.
  • the MN test can be performed according to, for example, “INVITRO mammalian cell micronucleus test” (OECD / OCDE TG487) of “OECD Guideline for Chemical Tests” (adopted September 26, 2014).
  • Example 1 Extraction of Particulate Matter in Smoke of a Heated Smoking Article by Solventless Extraction Method
  • SEP solventless extraction method
  • a smoking device (Borgwalt, product name Smoking Machine, product number RM20H), a predetermined suction method (suction amount 55 mL / time, suction time: 2 seconds / time, suction interval: 30 seconds), heating type smoking Articles (types generated by the transfer of heat from a heat source to an aerosol-forming substrate, heated smoking articles by Philip Morris Products Societe Anonyme (trade name: Marlboro (registered trademark) HeatSticks (registered trademark) SMOOTH REGULAR) Smoke was generated from a dedicated heating smoking device (trade name: iQOS (registered trademark), iQOS2.4, Phillip Morris Co., Ltd.) Smoke components were collected by spraying onto a Cambridge filter (CF) (obtained from Borgwalt). Specifically, the first CF is 500-650mg. When it reached / pad, the CF was replaced with the next CF, and by repeating this, the smoke component was continuously collected on 10 to 15 CFs.
  • CF
  • the obtained 10 to 15 CFs were stacked and housed in a hermetically-sealed pressurized container (FIGS. 5, 6, 7, and 8) having an inner size 20 mm larger than the maximum size of the CF.
  • the accommodated CF was squeezed by repeating compression (press, rightward arrow) and restoration (release, leftward arrow) four times according to the schedule shown in FIG. 11.
  • the CF and the squeezing liquid coming out of the CF by squeezing were especially shaken in the sealed pressure vessel. Shaking was performed at 4 cm and 200 reciprocations per minute. After squeezing, CF was taken out of the solution and centrifuged (4000 rpm, 5 minutes) to obtain a separated liquid. The squeezed liquid and the separated liquid were mixed to obtain an extract.
  • Fig. 11 shows changes in the CF thickness and the amount of extracted liquid (mL) at each of the first and fourth compression recovery.
  • the result of FIG. 11 is an average value of three experiments. In this experiment, since the fluidity of the squeezed liquid disappears during shaking when excessive compression is applied, 10 Mpa was the upper limit.
  • an extract containing particulate matter at a concentration of 1000 mg / mL was prepared.
  • Example 2 Water Recovery Rate in Extraction of Particulate Matter in Smoke of Heating-Type Smoking Article by Solvent-Free Extraction Method
  • 8.000 mL of water was added into a sealed pressure vessel, and the extraction was performed.
  • the water addition recovery rate was investigated when the method was used.
  • the water addition recovery rate was 91.5% on average over three times, and the solution recovery rate was 90% or more. This is a recovery rate equivalent to that of the conventional extraction method using, for example, DMSO.
  • Example 3 Main component composition of particulate matter extracted from smoke of heating type smoking article
  • the heated smoking article used was a heated smoking article (type generated by transfer of heat from a heat source to an aerosol-forming substrate, iQOS, Philip Morris).
  • SEP solventless extraction method
  • Continuous extraction refers to the work of extracting multiple glass fiber filters with the same extraction liquid. When the predetermined concentration is not reached in one extraction, continuous extraction is performed. Continuous extraction with DMSO was performed as follows.
  • PG propylene glycol
  • G glycerin
  • the main component composition of the particulate matter extracted by SEP is similar to IPA extraction and DMSO extraction (low concentration), and SEP is obtained by appropriately extracting the main ingredient of the particulate matter in the smoke of the heating-type smoking article.
  • Example 4 Bacterial reverse mutation test and micronucleus test
  • SEP solventless extraction method
  • MN test micronucleus test
  • Ames Test was performed in accordance with “Bacterial reverse mutation test” (OECD / OCDE TG471) of “OECD Guideline for Testing of Chemical Tests” (adopted July 21, 1997). Specifically, it carried out as follows.
  • test bacterial strains (Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 and TA102) obtained from the National Institute of Health Sciences (Kanagawa, Japan) were used in the presence and absence of a metabolic activation system.
  • the total particulate matter (TPM) fraction was tested for mutagenicity.
  • TA98, TA100, and TA102 were furylfluamide (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan), and TA1535 was sodium azide (Fuji Film Wako Pure). Yaku Co., Ltd., Tokyo, Japan) and TA1537 ICR-191 (Sigma Aldrich; St. Louis, MO, USA) were used.
  • TA102 and TA1535 were treated with 2-aminoanthracene (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan), and TA98, TA100 and TA1537 were treated with benzopyrene (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). , Tokyo, Japan). Only DMSO was used as a solvent control.
  • reaction mixture was mixed with thawed upper agar (top agar) and plated on a minimum glucose agar plate.
  • the plates were incubated at 37 ° C ⁇ 1 ° C for 48-72 hours and revertants per plate were automatically counted. The average number of revertants was calculated based on the results of 3 plates. Two or three independent tests were performed using the independently prepared test samples.
  • JMP version 10.0.2 SAS Institute Japan, Tokyo, Japan was used to determine the slope parameter (ie, The linear coefficient) was calculated.
  • MN test was performed in accordance with "IN VITRO mammalian cell micronucleus test" (OECD / OCDE TG487) of "OECD Guideline for Testing of Chemical Tests" (adopted September 26, 2014). Specifically, it carried out as follows.
  • the CHO ⁇ U cell line purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) was used for the analysis. Cells were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) at 37 ° C ⁇ 2 ° C in a 5% CO 2 incubator.
  • TPM Total particulate matter
  • the cell suspension (2 ⁇ 10 4 cells / well) was pre-incubated for 24 hours ⁇ 3 hours before treatment.
  • cell cultures were treated with test samples (SEP samples or DMSO extracted samples) for 3 hours ⁇ 15 minutes with or without S9 mix containing Arcolor 1254-induced rat liver homogenate. Processed. After removal of the test sample, the cells were incubated for 21 hours ⁇ 1 hour.
  • cells were incubated for 24 hours ⁇ 1 hour in the absence of metabolic activation system.
  • mitomycin C Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) in the absence of metabolic activation and cyclophosphamide (Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) in the presence of metabolic activation.
  • DMSO alone was used as a solvent control.
  • Non-Patent Document 10 The genotoxicity of each sample is described in Matsushima et al. , 1999, Environ. Pollut. 64, 121-132 (Non-Patent Document 10).
  • the Cochrane-Armitage binomial test was used to investigate the dose dependence of MN frequency. Fisher's exact test was used to assess whether the MN frequency was significantly increased at one or more concentrations of the test sample relative to the parallel solvent controls.
  • test sample was determined to be genotoxic if the results of both statistical tests were significant and reproducible in two independent experiments.
  • logistic regression analysis was performed on the data up to the concentration at which the MN frequency reached the maximum value.
  • the gradient parameter of logistic counting was identified as genotoxic activity.
  • Data analysis was performed using JMP version 10.0.2 (SAS Institute Japan, Tokyo, Japan).
  • FIG. 12 shows the results of the Ames test.
  • the horizontal axis represents the sample addition dose ( ⁇ g total particulate matter (TPM) eq./mL), and the vertical axis represents the number of viable cells after sample addition to the number of viable cells before sample addition (cells that have undergone cell reversion mutation). ) Is a plot of the ratio (%).
  • FIG. 13 shows the result of the MN test.
  • the abscissa plots the added dose of the sample ( ⁇ g total particulate matter (TPM) eq./mL), and the ordinate plots the frequency of occurrence of micronuclei (MN) (MN induction) (%). is there.
  • OECD / OCDE TG487 states, "The maximum concentration is 55.5 ⁇ 5% of cytotoxicity.” "Concentration of test substance Should be selected to cover a range from those that produce 55.5 ⁇ 5% cytotoxicity to those that exhibit little or no cytotoxicity. " Only 40% exposure was possible (Fig. 12, normal). Dose 2000 ⁇ g TPMeq. This is because the dose higher than 1 ml / ml exceeds the additional dose of 2% where the cytotoxicity of DMSO solvent can be mixed. When the DMSO extracted sample was used, it could not be confirmed until the MN-induced downturn. (Fig. 13, normal). All of these are insufficient results for the MN test.
  • Cigarette Samples The Kentucky Reference Cigarette 3R4F has been provided by the University of Kentucky for Research purposes by the Tobacco and Health Research Institute with cigarettes. (Partially modified from 2008-544938).
  • Sample A heated smoking article (trade name: Marlboro for) manufactured by Philip Morris Products Societe Anonym, a type in which aerosol is generated by transfer of heat from a heat source inserted inside a heated smoking article to an aerosol-forming substrate.
  • iQOS REGULAR (trademark) was used as a dedicated heating type smoking device (trade name iQOS2.4 (registered trademark)) manufactured by Philip Morris Products Societe Anonym.
  • Sample B a type in which an aerosol is generated by the transfer of heat from a heat source arranged on the outer periphery of the heating type smoking article to the aerosol-forming substrate was used as a dedicated heating type smoking device.
  • Sample C heated smoking article Mevius (Registered trademark) Regular for Bloom Tech (manufactured by Japan Tobacco Inc.) was used with the enclosed cartomizer and a dedicated smoking device (Ploom (registered trademark) Tech). The sample was stored at 4 ° C. until just before the start of the next humidity control / conditioning.
  • ACM aerosol collected mass
  • DMSO extraction solution of smoke / aerosol extracted by a conventional method was adjusted by adding a DMSO solvent so as to be 100 mg / mL in terms of the TPM / ACM weight weighed in advance in this example.
  • the smoke / aerosol solution extracted by the SEP method was used as an in vitro test sample without adjustment.
  • the CHO-K1 cell suspension (1.0 ⁇ 10 4 cells / well) was pre-incubated in 96 well microtiter plates for 24 hours ⁇ 2 hours. Cells were treated with total particulate matter (TPM) fraction for 24 hours. Sodium dodecyl sulfate was used as a positive control. Only DMSO or CMF-PBS (calcium-magnesium free-PBS) was used as a solvent control for the TPM or GVP test, respectively.
  • TPM total particulate matter
  • the cytotoxicity at each treatment level was expressed as the relative absorbance with the solvent control of the parallel runs.
  • a non-linear regression analysis was performed on the relationship between relative absorbance and concentration based on the least squares method with the logistic coefficient to calculate IC50 values for comparison of cytotoxic activity between relaxed samples.
  • the IC50 value was calculated by inverse estimation of the effective concentration at the time when the absorbance was reduced to 50% of the value of the solvent control for simultaneous parallelization. Calculations were performed using JMP version 10.0.2 (SAS Institute Japan, Tokyo, Japan).
  • FIG. 14 the horizontal axis represents the dose of the sample added, and the vertical axis represents the percentage of the neutral red uptake amount of the cells exposed to the sample with respect to the neutral red uptake amount of the cells without the sample.
  • the conventional method (DMSO) was performed once (FIG. 14A) and the SEP method was performed three times (three independent tests in FIGS. 14B to 14D).
  • the heating-type smoking article sample was exposed to both the sample A heating-type smoking article iQOS and the sample B heating-type smoking article B to such an extent that the neutral red uptake activity disappeared. It was possible (FIG. 14B, same C, same D). Regarding Sample C heating type smoking article PlumTech, exposure was possible up to about 90% neutral red uptake activity (FIGS. 14B, C, and D).
  • the SEP method is a method of extracting the undiluted solution of the aerosol generated by the heating type smoking article in principle, but the undiluted solution of the PloomTech sample has an upper limit of 20000 ⁇ g / ml of TPM.
  • the neutral red uptake activity test using the aerosol component of the heated smoking article as a sample can be completed with the sample obtained by the SEP method.
  • the heat source arranged on the outer periphery of the heating type smoking article. Comparative tests could be performed on heated smoking articles, infused heated smoking articles, and various types of heated smoking articles in which aerosol is generated by the transfer of heat to an aerosol-forming substrate.

Abstract

本発明は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法、抽出容器、抽出液、並びに抽出液を用いる毒性試験方法を提供することを目的とする。　本発明の方法は、（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、ことを含む。本発明の抽出容器１ａは、２枚以上のフィルター７を重ねた状態で収容可能な収容部８と、収容部８に重ねた状態で収容されたフィルター７を圧搾する１または複数の圧搾部材（２ａ、３ａ）と、収容部８と連通するリザーバー１０とを含む。

Description

加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法、抽出容器、抽出液および抽出液を用いる毒性試験方法
　本発明は、たばこ製造業分野における毒性科学分野に携わる当業者が実施する喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法のうち、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法、抽出容器、抽出液、並びに抽出液を用いる毒性試験方法に関する。
　紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品は通常、たばこロッドを形成する紙ラッパーに囲まれた細かく切られたたばこ（普通はカットフィラーの形態）を備える。紙巻たばこは、その一方の端に点火し、細かく切られたたばこロッドを燃焼することにより、消費者によって使用される。消費者は、燃焼された紙巻たばこの反対側の端（口側の端またはフィルター端）で引き込むことによって主流煙を受ける。
　一方、たばこなどのニコチン含有エアロゾル形成基質が燃焼式ではなく加熱式である、「加熱式喫煙物品」も種々のものが提案されている。加熱式喫煙物品では、エアロゾルはエアロゾル形成基質の加熱によって生成される。公知の加熱式喫煙物品には、例えば、エアロゾルが電気的に加熱されるか、あるいは、可燃性燃料要素または熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるような喫煙物品が含まれる。さらに、別の一態様では、電気的熱源または化学反応による熱源で、アルコール・エタノール・グリセリン・プロピレングリコールまたはそれらの混合溶液を含浸させた多孔質または繊維質の物体を直接的にまたは間接的に加熱して蒸気を発生させる。この態様では、発生した蒸気と粒子状物質が混合した気体が、喫煙物品を通して引き込まれた空気中に混入され、さらに蒸気と粒子状物質と空気の混合気体が、上述のたばこに加え葉タバコ・刻みたばこ・再構成たばこ・再構成たばこシート・再構成たばこ顆粒に通過される。この通過の際に、当該混合気体には、たばこ・葉タバコ・刻みたばこ・再構成たばこ類が含む香喫味成分、ニコチンや各種の天然香料からなる揮発性化合物を含む気体が混入される。当該態様の加熱式喫煙物品においては、当該揮発性化合物を含む気体を含む混合気体、即ち、エアロゾル（粒子相成分）とガス相成分との混合気体が、消費者によって吸引される。通常、消費者は、加熱式喫煙物品の端（口側の端またはフィルター端、マウスピース端）で引き込むことによって、当該混合気体を吸引する。
　紙巻たばこなどの喫煙物品から生じる煙には、タール、ニコチン等の物質が含まれている。喫煙物品については、煙成分中の粒子状物質を例えばフィルター等の担体に捕捉して、成分を分析評価することが重要である。例えば、紙巻きたばこの煙成分の捕集および分析の基準として、カナダ保健省の示す方法が知られている（Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ－ＴｏｂａｃｃｏＲｅｐｏｒｔｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ　ＳＯＲ／２０００－２７３、Ｊｕｌｙ　２０１８）（非特許文献１）。
　加熱式喫煙物品は、一般に、紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品よりも、煙成分中の粒子状物質が少なく、十分な量、濃度で粒子状物質を捕捉することができない。そのため、たばこ製造業において煙成分の分析業務に携わる当業者、特に毒性科学分野に携わる当業者に、慣例的にまたは公的に求められる適切な毒性試験の結果を得難い。
　加熱式喫煙物品についても、たばこ製造業において煙成分の分析業務に携わる当業者、特に毒性科学分野に携わる当業者に、慣例的にまたは公的に求められる適切な毒性試験の結果を得るために、十分な量、濃度で粒子状物質を捕捉して試料を調製することが重要である。１つの方法として、１つの捕捉用担体に大量の加熱式喫煙物品から発生させた煙成分を連続的に捕捉させて抽出する、連続抽出法が考えられる。例えば、１フィルターに１００本の喫煙物品の煙成分を捕捉させる、というものである。これにより、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ程度しか捕捉できなかったものが、５０－１００ｍｇ／ｍＬ程度の高濃度に粒子状物質を捕捉できる可能性がある。しかしながら、この方法には、膨大な時間がかかり、その間に捕捉された粒子状物質から成分が揮散する可能性を否定することはできず、さらに、大量の加熱式喫煙物品を用いるため濃縮による過大評価の誤差が生じうる。あるいは、別の方法として、大量の溶媒を用いる方法が考えられる。しかしながら溶媒を大量に用いる場合、低毒性溶媒であっても、粒子状物質を高濃度に調製しようとするほど溶媒が濃縮され高濃度となる。例えば、たばこの煙成分の捕捉には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が用いられることがある。しかしながら、ＤＭＳＯにも弱い細胞毒性がある。原核生物や真核生物の培養細胞等を用いた毒性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験）において培地に高濃度でＤＭＳＯが含まれると細胞の生理活性に影響がおよぶ。ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験を行う場合、溶媒として用いることが可能なＤＭＳＯ上限は培地に対する体積百分率で２％程度までと規定されている（非特許文献２、３）。捕捉した粒子状物質を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏの毒性試験を行う場合、培地に規定以上のＤＭＳＯが含まれていると、粒子状物質に関係なくＤＭＳＯが原因で細胞の生理活性が低下する、細胞が死ぬなどの可能性があり、有効な毒性試験を適切に行うことができない。
特開２０１８－５７４０３
Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ－ＴｏｂａｃｃｏＲｅｐｏｒｔｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ　ＳＯＲ／２０００－２７３、Ｊｕｌｙ　２０１８ 「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「細菌復帰突然変異試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４７１）（１９９７年７月２１日採択） 「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「ＩＮ　ＶＩＴＲＯ　哺乳類細胞小核試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４８７）（２０１４年９月２６日採択） ＣＯＲＥＳＴＡ　ＲＥＣＯＭＭＥＮＤＥＤ　ＭＥＴＨＯＤ　Ｎｏ．８１　ＲＯＵＴＩＮＥ　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＭＡＣＨＩＮＥ　ＦＯＲ　Ｅ－ＣＩＧＡＲＥＴＴＥ　ＡＥＲＯＳＯＬ　ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ－ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮＳ　ＡＮＤ　ＳＴＡＮＤＡＲＤ　ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ　（Ｊｕｎｅ　２０１５） ＩＳＯ　３４０２ ＩＳＯ　３３０８ ＩＳＯ４３８７ Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ　Ｏｆｆｉｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｔ－５０１　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ　Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｓｍｏｋｅ ＣＯＲＥＳＴＡ　Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｎｏ．　８４　ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＧＬＹＣＥＲＩＮ，　ＰＲＯＰＹＬＥＮＥ　ＧＬＹＣＯＬ，　ＷＡＴＥＲ，　ＡＮＤ　ＮＩＣＯＴＩＮＥ　ＩＮ　ＴＨＥ　ＡＥＲＯＳＯＬ　ＯＦ　Ｅ－ＣＩＧＡＲＥＴＴＥＳ　ＢＹ　ＧＡＳ　ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＩＣ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｐｏｌｌｕｔ．　６４，　１２１－１３２ Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ　Ｏｆｆｉｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｔ－５０２，Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｒｅｄ　Ｕｐｔａｋｅ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ　Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｓｍｏｋｅ　（Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ，　２００４ｃ）
　本発明は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法を提供することを目的とする。
　本発明はまた、抽出容器を提供することを目的とする。抽出容器は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法に用いることができる。
　本発明はさらに、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を提供することを目的とする。
　本発明はさらにまた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ことを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法に関する。
　本発明者らは、鋭意研究に務めた結果、粒子状物質をフィルターに捕捉したものを２枚以上重ね、重ねたフィルターを圧搾することにより、フィルターに捕捉された成分が高効率で抽出されることを見出し、本発明を想到した。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
　加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法であって、
　（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
　（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
　（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む、前記方法。
［態様２］
　（３）の工程を、
　（３－ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
　（３－ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
　（３－ｉｉｉ）（３－ｉ）と（３－ｉｉ）を組み合わせて行う
ことによって行う、態様１に記載の方法。
［態様３］
　（３－ｉ）の前記重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返す、態様２に記載の方法。
［態様４］
　（３－ｉ）および／または（３－ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうする、態様２に記載の方法。
［態様５］
　（３－ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返す、態様２に記載の方法。
［態様６］
　工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う、態様１－５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
　工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる、態様１－６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
　フィルターを３枚以上使用する、態様１－７のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
　フィルターを１０枚－１５枚使用する、態様１－８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
　重ねたフィルターの厚さが工程（３）を行う前の１／３以下になるまで、工程（３）を繰り返す、態様１－９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
　工程（３）において溶媒を使用しない、態様１－１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
　工程（３）において、フィルター容積に対して０％（重量／容積）より多く、４００％（重量／容積）以下の量の両親媒性溶媒を加える、態様１－１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１３］
　圧縮を１０ＭＰａ以下で行う、態様１－１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］
　フィルターがガラス繊維フィルターである、態様１－１３のいずれか１項に記載の方法。
［態様１５］
　フィルターが、定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有するフィルターである、態様１－１４のいずれか１項に記載の方法。
［態様１６］
　さらに、
　（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
　（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含む、態様１－１５のいずれか１項に記載の方法。
［態様１７］
　２枚以上のフィルターを重ねた状態で収容可能な収容部と、
　前記収容部に重ねた状態で収容されたフィルターを圧搾する１または複数の圧搾部材と、
　前記収容部と連通するリザーバーと
を含む、抽出容器。
［態様１８］
　前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面の形状が、平面、錐形の斜面または凸状若しくは凹状の曲面、のいずれかである、態様１７の抽出容器。
［態様１９］
　前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面が２面ある、態様１７または１８の抽出容器。
［態様２０］
　２つの前記圧搾面が互いに回転摺動する、態様１９の抽出容器。
［態様２１］
　前記リザーバーが、前記収容部の上方および下方の少なくともいずれかに配置される、態様１７－２０に記載の抽出容器。
［態様２２］
　前記リザーバーが前記収容部の外周に設けられている、態様１７－２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２３］
　前記リザーバーは前記圧搾面の少なくとも１つを貫通する細管を通して前記収容部と連通している、態様１７－２１のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２４］
　前記圧搾部材の圧搾面に溝が設けられている、態様１７－２３のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２５］
　前記圧搾部材を２つ有し、該２つの圧搾部材は各々の圧搾面を対向させた状態で移動可能であり、
　前記２つの圧搾部材の各々対向する圧搾面の間の空間が前記収容部を画成する、態様１７－２４のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２６］
　前記２つの圧搾部材のうち一方が凹部を有し、該凹部の内側底面が圧搾面を形成し、
　前記２つの圧搾部材のうち他方がその圧搾面を前記内側底面に向けた状態で前記凹部内を液密に摺動可能である、態様２５に記載の抽出容器。
［態様２７］
　注射器型のシリンダー部材と、
　前記シリンダー部材の中空空間を基端側空間と先端側空間とに仕切るように配置された、細孔を有するふるい部材と、
　前記シリンダー部材の前記基端側空間を液密に摺動可能なピストン部材と、
を備え、
　前記ふるい部材および前記ピストン部材は、それらの内側対向する面が圧搾面を各々形成して前記圧搾部材を構成し、
　前記ピストン部材の圧搾面と前記ふるい部材の圧搾面との間の前記基端側空間の少なくとも一部が前記収容部を画成し、
　前記先端側空間が前記リザーバーを画成する、
　態様１７－２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２８］
　リザーバーに回収された抽出液が流動または循環される、態様１７－２７のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２９］
　態様１－１６のいずれか１項に記載の方法に使用するための態様１７－２８のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様３０］
　態様１－１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液。
［態様３１］
　溶媒を含まない、態様３０に記載の抽出液。
［態様３２］
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるための態様３０または３１に記載の抽出液。
［態様３３］
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの毒性試験が、小核試験またはエームズ試験である、態様３２に記載の抽出液。
［態様３４］
　態様１－１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法。
　本発明の抽出方法により、加熱式喫煙物品の煙から従来の抽出方法と比較して高効率で粒子状物質の抽出が可能になった。本発明の方法によれば、無溶媒または少量の溶媒での抽出が可能である。よって、溶媒の影響を排除した状態で、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験を実施できる。さらに、溶媒を任意に添加することで溶媒の影響を把握することもでき、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うこともできる。
図１は、本発明の第１の実施形態に係る抽出容器の断面図である。 図２は、第１の実施形態に係る抽出容器を構成する第２の圧搾部材の圧搾面の平面図であって、（ａ）は当該圧搾面が平面である例、（ｂ）は当該圧搾面に放射状の溝が形成された例を示す。 図３は、第１の実施形態に係る抽出容器を構成する圧搾部材を駆動させる駆動手段を備えた状態での当該抽出容器の断面図である。 図４は、本発明の第２の実施形態に係る抽出容器の図であって、（ａ）は、当該抽出容器の断面図、（ｂ）は、抽出液体を循環させる循環装置を備えた抽出容器の概略図である。 図５は、本発明の第３の実施形態に係る、第１の構成例による抽出容器の断面図である。 図６は、本発明の第３の実施形態に係る、第２の構成例による抽出容器の断面図である。 図７は、本発明の第４の実施形態に係る、第１の構成例による抽出容器の断面図である。 図８は、本発明の第４の実施形態に係る、第２の構成例による抽出容器の断面図である。 図９は、本発明の第５の実施形態に係る抽出容器の断面図である。 図１０は、本発明の各実施形態に係る抽出容器を用いてフィルターから液体を抽出する一方法を示すフローチャートである。 図１１は、フィルターに与えた圧縮および復帰の圧力（ＭＰａ）（４回）と、フィルターの厚さ（ｍｍ）および抽出液量との関係を示す。フィルターの厚さを白丸、抽出液量を黒三角で示す。 図１２は、Ａｍｅｓ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）　ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、試料添加前の生細胞数に対する試料添加後の生細胞数（細胞復帰突然変異を起こした細胞）の割合（％）をプロットしたものである。 図１３は、ＭＮ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）　ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、小核（ＭＮ）の発生頻度（ＭＮ誘発が生じた）割合（％）をプロットしたものである。 図１４Ａは、ＤＭＳＯ抽出試料（慣用法）のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、紙巻きたばこ３Ｒ４Ｆ（白抜き三角形）、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ　ｆｏｒ　ｉＱＯＳ　ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）　Ｒｅｇｕｌａｒ　ｆｏｒ　Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。 図１４Ｂは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ　ｆｏｒ　ｉＱＯＳ　ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）　Ｒｅｇｕｌａｒ　ｆｏｒ　Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。 図１４Ｃは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ　ｆｏｒ　ｉＱＯＳ　ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）　Ｒｅｇｕｌａｒ　ｆｏｒ　Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。 図１４Ｄは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ　ｆｏｒ　ｉＱＯＳ　ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）　Ｒｅｇｕｌａｒ　ｆｏｒ　Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。
　１．加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法
本発明の第１の形態は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法に関する。
一態様において、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法は、
（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む。
　紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品に対し、たばこなどのニコチン含有エアロゾル形成基質が燃焼式ではなく加熱式である「加熱式喫煙物品」が多く開発されている。加熱式喫煙物品では、エアロゾルはエアロゾル形成基質の加熱によって生成される。公知の加熱式喫煙物品には、例えば、エアロゾルが電気的に加熱されるか、あるいは、可燃性燃料要素または熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるような喫煙物品が含まれる。喫煙中、熱源からの熱伝達によってエアロゾル形成基質から揮発性化合物が放出され、喫煙物品を通して引き込まれた空気中に混入される。放出された化合物が冷めるにつれて凝結してエアロゾルを形成し、これが消費者によって吸い込まれる。
　さらに加熱式喫煙物品の別の一態様も知られている。当該態様の加熱式喫煙物品は、たばこを燃焼させることなく、上述の電気的熱源または化学反応による熱源で、アルコール・エタノール・グリセリン・プロピレングリコールまたはそれらの混合溶液を含浸させた多孔質または繊維質の物体を直接的にまたは間接的に加熱して発生させた蒸気と粒子状物質が混合した気体が、喫煙物品を通して引き込まれた空気中に混入される。さらに蒸気と粒子状物質と空気の混合気体が、上述のたばこに加え葉タバコ・再構成たばこ・再構成たばこシート・再構成たばこ顆粒に通過されて、たばこ・葉タバコ・再構成たばこ類が含む香喫味成分、ニコチンや各種の天然香料からなる揮発性化合物を含む気体が混入される。当該態様の加熱式喫煙物品においては、当該揮発性化合物を含む気体を含む混合気体、即ち、エアロゾル（粒子相成分）とガス相成分との混合気体が、消費者によって吸引される。通常、消費者は、加熱式喫煙物品の端（口側の端またはフィルター端、マウスピース端）で引き込むことによって、当該混合気体を吸引する。
　さらにまた、本明細書において、ニコチン含有エアロゾルがたばこ材料、たばこ抽出物、またはその他のニコチン源から、一部の場合に加熱することなく、例えば化学反応によって生成される非燃焼型喫煙物品も含めて、「加熱式喫煙物品」と呼称する。
　本明細書において、「加熱式喫煙物品」は、特に明記した場合を除き、上述した全ての態様の加熱式喫煙物品を含む。
　「加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質」とは、加熱式喫煙物品から発生する煙中のガス状、揮発性の物質を除く全ての物質を意味し、総粒子状物質（ＴＰＭ、ｔｏｔａｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｍａｔｔｅｒ）と呼称される場合もある。一態様において、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質には、水蒸気、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、メントール等を含む。加熱式喫煙物品の1つであるフィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名　Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標） ＨｅａｔＳｔｉｃｋｓ（登録商標）ＳＭＯＯＴＨ　＆　ＰＵＲＰＬＥ、同ＰＵＲＰＬＥ　ＭＥＮＴＨＯＬ、同ＲＥＧＵＬＡＲ、同ＢＡＬＡＮＣＥＤ　ＲＥＧＵＬＡＲ、同ＭＥＮＴＨＯＬ、同ＭＩＮＴ（商標）））を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ（登録商標）、ｉＱＯＳ２．４、ｉＱＯＳ２．４ｐｌｕｓ）に適用した場合に発生する煙中の粒子状物質には、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、フルクトース、グルコース、定量限界以下の微量の一酸化炭素等を含む。成分の種類に応じてガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）等により分析をすることができる。
　「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を捕捉可能なものであれば、材質も、形状も、特に限定されない。使用可能なフィルターとしてガラス繊維フィルター、ＨＥＰＡフィルター、ＵＬＰＡフィルター、ケンブリッジフィルター等が含まれる。好ましくは、ガラス繊維フィルターである。形状は、好ましくは、直径１０ｍｍから１００ｍｍ程度の平たい円形である。より好ましくは、直径４０ｍｍから５０ｍｍの平たい円形である。より好ましくは、直径４４ｍｍの平たい円形である。円形以外の形状、四角、菱形、三角等も使用可能である。１枚当たりのフィルターの厚さは、好ましくは４ｍｍ以下、より好ましくは、２ｍｍ以下である。
　一態様において、「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」には、空気中からゴミ、塵埃などを取り除くことが可能なエアフィルターの一種である、ＨＥＰＡフィルター（Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　Ａｉｒ　Ｆｉｌｔｅｒ）が含まれる。ＨＥＰＡフィルターは、ＪＩＳ　Ｚ　８１２２によって「定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率をもち、かつ初期圧力損失が２４５Ｐａ以下の性能を持つエアフィルター」と規定されている。一態様において、「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」は、「定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有する」とフィルターである。ＨＥＰＡフィルターよりもさらに、粒子捕集効率の高いフィルターに、ＵＬＰＡフィルター　（Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　Ａｉｒ　Ｆｉｌｔｅｒ）がある。ＵＬＰＡフィルターは、ＪＩＳ　Ｚ　８１２２で、「定格風量で粒径が０．１５μｍの粒子に対して９９．９９９５％以上の粒子捕集率をもち、かつ初期圧力損失が２４５Ｐａ以下の性能を持つエアフィルター」と規定されている。ＨＥＰＡフィルターやＵＬＰＡフィルターと同様の性質を有するフィルターも使用可能である。
　一態様において、「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」としてケンブリッジフィルターを使用可能である。ケンブリッジフィルターは、直径約４４または９２ｍｍ、厚さ１．５　ｍｍの平たい円形のガラス繊維のフィルターで、粒子状物質を捕捉可能なフィルターとして、当業者に周知であり汎用されている。ケンブリッジフィルターは、日本ケンブリッジフィルター株式会社、Ｂｏｒｇｗａｌｔ社（カタログ番号８０２０　２８５　２）等より入手可能である。
　「粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集」することは、例えば、加熱式喫煙物品から煙を発生させ、発生した煙をフィルターに直接吹き付けることによって行ってもよい。加熱式喫煙物品からの煙の発生は、例えば、コレスタ推奨法Ｎｏ．８１（非特許文献４）に従い、所定の機械喫煙方法（例えば、機械喫煙装置の陰圧、吸引時間、吸引量、吸引動作間隔３０秒±０．５秒）に従い行うことができる。
加熱式喫煙物品からの煙の発生は、例えば、ＩＳＯ（ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）　３４０２：１９９９（非特許文献５）が定める加熱式喫煙物品の調湿・調和法に従い用意した試料を用い、ＩＳＯ　３３０８：２０１２（非特許文献６）が定める喫煙機の所定の吸引方式（例えば、吸引量５５ｍＬ／回、吸引時間：２．０秒／回、吸引間隔：３０秒毎）および吸引の開始および終了の条件に従い行うことができる。
　より多くの粒子状物質をフィルターに捕捉するためには、非限定的に、１枚目のフィルターに捕捉される粒状状物質の量が一定程度に達した時点で次のフィルターに交換し、次のフィルターに同様に煙を吹き付ける、ことを繰り返すというように、フィルターに１枚ずつ煙を吹き付けることが好ましい。一態様において、１枚目のフィルターに捕捉される粒子状物質が３００ｍｇ／ｐａｄ以上、４００ｍｇ／ｐａｄ以上、４５０ｍｇ／ｐａｄ以上、５００ｍｇ／ｐａｄ以上に達した時点で交換を行う。一態様において、１枚目のフィルターに捕捉される粒子状物質が８００ｍｇ／ｐａｄ以下、７５０ｍｇ／ｐａｄ以下、７００ｍｇ／ｐａｄ以下、６５０ｍｇ／ｐａｄ以下で交換を行う。一態様において、１枚目のフィルターに捕捉される粒子状物質が５００－６５０ｍｇ／ｐａｄの範囲でフィルターを交換する。
　非限定的に、一態様において、フィルターを３枚以上、５枚以上、７枚以上、９枚以上、１０枚以上使用する。一態様において、フィルターを２５枚以下、２３枚以下、２０枚以下、１８枚以下、１５枚以下使用する。一態様において、フィルターを１０枚－１５枚使用する。
　加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法において、「（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する。」
　理論に縛られるわけではないが、当該方法は、圧搾によりフィルターをもみほぐし、滲み出た液体（圧搾液）でフィルターに捕捉された粒子状物質（フィルターに付着した成分）をフィルターから脱離させ、滲み出た液体（圧搾液）に脱離した粒子状物質を溶解させる、というものである。「圧搾」の手段は、フィルターをもみほぐし、液体を滲み出させることができる手段であれば、特に限定されない。
　一態様において、（３）の工程を、
　（３－ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
　（３－ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
　（３－ｉｉｉ）（３－ｉ）と（３－ｉｉ）を組み合わせて行う。
　一態様において、工程（３－ｉ）の重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返してもよい。非限定的に、好ましくは、重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上、３回以上、４回以上繰り返す。
　一態様において、好ましくは、圧縮は０．０１ＭＰａ以上、０．1ＭＰ以上、０．５ＭＰ以上、２．０ＭＰ以上で行う。一態様において、好ましくは、圧縮を０．５ＭＰａ以下、２．０ＭＰａ以下、５．０ＭＰａ以下、１０．０ＭＰａ以下で行う。圧搾液の流動性が無くならない程度の圧力が望ましい。例えば０Ｍｐａより圧搾を開始し、徐々に圧搾の圧力を高めてもよい。圧搾は例えば、０ＭＰａ－１０．０ＭＰａの範囲で行う。工程（３－ｉ）の圧縮復帰を２回以上行う場合、各回の圧力は同じであっても異なってもよい。回を重ねる毎に徐々に圧搾の圧力を高めてもよい。
　一態様において、工程（３－ｉｉ）の重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返してもよい。非限定的に、好ましくは、工程（３－ｉｉ）を２回以上、３回以上、４回以上繰り返す。
　（３－ｉ）と（３－ｉｉ）は、単独で行ってもよく、あるいは、組み合わせてもよい。（３－ｉｉ）を（３－ｉ）と組み合わせることにより、（３－ｉ）の圧縮（加圧）の圧力、回数を減らすことができる。
　一態様において、（３－ｉ）および／または（３－ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうしてもよい。振とうの度合い（強度）は、非限定的に、振幅２ｃｍ～６ｃｍ、毎分１００～３００往復であってもよい。一態様において、４ｃｍ、毎分２００往復であってもよい。フィルターと抽出液とを振とうさせることによって、抽出液に振動する流れが生じ、当該流れが圧搾されたフィルターと衝突を繰り返すことによって抽出効果をさらに向上させることができる。
　一態様において、工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う。
　一態様において、工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる。
　一態様において、重ねたフィルターの厚さが所定の厚さ以下になるまで、工程（３）を繰り返すことが好ましい。好ましくは、工程（３）を行う前の１／２以下になるまで、１／３以下になるまで、１／４の以下になるまで、工程（３）を繰り返す。好ましくは、圧搾によりフィルターがぐちゃぐちゃになるまで工程（３）を繰り返す。
　加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法は、一態様において、工程（３）において溶媒を使用しない。一態様において、工程（３）において少量の両親媒性溶媒を加えてもよい。加える両親媒性溶媒の量は特に限定されない。一態様において、フィルター容積に対し４００％（重量／容積）以下、より好ましくは、２００％（重量／容積）以下である。一態様において、加える両親媒性溶媒の量は、０％（重量／容積）より多く、または１０％（重量／容積）以上である。
　両親媒性溶媒は、非限定的に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン等を含む。
　工程（３）において、溶媒を使用しない、または、少量の両親媒性溶媒のみしか使用しないことにより、例えば、後述するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験方法における溶媒の影響を排除した状態で、生体への種々の影響の検討できる。あるいは、溶媒を任意に添加することで溶媒の影響を把握することもでき、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うこともできる。液体タイプの電子たばこにおいては、原液（リキッド）と喫煙後に捕集されるエアロゾルの比較等の効果が得られる。
　工程（３）のあとに、さらに
　（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
　（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含んでもよい。
　遠心分離は、圧搾後もフィルターに残っている液体成分を分離できる程度であれば、強さ（回転数、時間）は特に限定されない。回転数は、例えば、１，０００ｒｐｍ－６，０００ｒｐｍ、好ましくは、３，５００ｒｐｍ－５，０００ｒｐｍである。時間は、例えば、１分以上、好ましくは、５分以上である。一態様において、例えば、４０００ｒｐｍ回転数で、５分の遠心分離を行っても良い。
　遠心分離によって得られた分離液を、工程（３）で得られた圧搾液と混合して抽出液とした。
　本明細書において、工程（３）で得られた液体を「圧搾液」または「抽出液」と呼称する。文意により「圧搾液」に遠心分離によって得られる「分離液」を混合したものを「抽出液」と呼称する場合もある。
　２．抽出容器
　本発明の第２の形態は、抽出容器に関する。抽出容器は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出するのに有用である。一態様において、抽出容器は、本明細書に記載の加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法に使用されうる。以下、本発明の第２の形態である「抽出容器」の第１から第５の実施形態について各々説明する。
（第１の実施形態）
　図１には、第１の実施形態に係る抽出容器１ａが示されている。抽出容器１ａは、第１の圧搾部材２ａと、第２の圧搾部材３ａとを備えている。
　第１の圧搾部材２ａは、略円柱状の凹部６を備えており、該凹部６の内側底面が第１の圧搾面４を形成している。第２の圧搾部材３ａは、第１の圧搾部材２ａの凹部６内に挿入可能に形成された先端部１１を有し、該先端部１１には、その側面外周に沿って溝９が形成され、該溝９には、凹部６の内側面と係合するようにＯリング１２が嵌合されている。すなわち、第２の圧搾部材３ａは、第１の圧搾部材２ａの凹部６内を液密に摺動可能に形成されている。
　第１の圧搾面４と、該第１の圧搾面４と対向するように配置された第２の圧搾部材の第２の圧搾面５とは、それらの間に収容部８を画成しており、該収容部８は、２枚以上のフィルター部材７を重ねた状態で収容可能である。なお、「抽出容器」を上記した本発明の第１の形態である「加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法」で使用する場合には、フィルター部材７として本発明の第１および第３の形態並びに実施例で説明されるフィルターを用いることができる。
　第２の圧搾部材３ａには、リザーバー１０が形成されており、該リザーバー１０は、該リザーバー１０から延在する細管１３を介して収容部８と連通している。細管１３には、第２の圧搾面４の近傍で、収容部８内の液体を収集しやすくするため、ラッパ状の開口部１４が形成されていてもよい。
　第２の圧搾部材３ａの第２の圧搾面５は、開口部１４以外の領域で、図２（ａ）に示されるように平面状に形成されてもよい。より好ましくは、図２（ｂ）に示されるように、開口部１４を中心として、径方向に放射状に複数の溝１５が形成される。
　上述した通り第２の圧搾部材３ａは、第１の圧搾部材２ａの凹部６内を液密に摺動可能であるため、第１の圧搾部材２ａと第２の圧搾部材３ａとは、互いに対して相対移動、すなわち第１および第２の圧搾面４、５を接近させたり引き離したりすることが可能となる。この相対移動をもたらす、第１および第２の圧搾部材２ａ、３ａの駆動手段として、例えば図３に示される構成等が考えられる。
　図３に示されるように、駆動手段を備えた抽出容器１ａは、抽出容器１ａを収容するハウジング２０と、ハウジング２０の蓋部２１と、蓋部２１の中央部に形成されたネジ貫通孔２２と、内側面にネジ山が形成されたネジ貫通孔２２に螺合するネジロッド２３と、ネジロッド２３のハウジング２０から突出する側の端部に取り付けられたハンドル２４と、ネジロッド２３のハウジング２０内の端部を回転可能に軸支すると共に第２の圧搾部材３ａのリザーバー１０の開口頂部に固定された、ベアリング部２５と、を備えている。
　抽出容器１ａの第１の圧搾部材２ａは、ハウジング２０の底板にボルト３０により固定され、第２の圧搾部材３ａは、ベアリング部２５の張り出した底板２６にボルト３１により固定され、蓋部２１は、ハウジング２０にボルト３２により固定されている。
　ネジロッド２４がハウジング２０内に引き込まれる方向（図３のＡ方向）にハンドル２４を回転させるとき、Ａ方向に移動するネジロッド２４は、ベアリング部２５を介して第２の圧搾部材３ａを下方向に移動させる。このとき、第２の圧搾面５は第１の圧搾面４に接近するため、第１および第２の圧搾面４、５の間に配置されている、重ねた複数のフィルター部材７を圧縮させる。図３の駆動手段では、大きな直径のハンドル２４を用いたネジロッド２３のネジ孔２２内へのネジ込みに伴う圧力をフィルター部材７の圧縮力として利用できるため、大きい圧縮力を得ることができる。
　一方、ネジロッド２４がハウジング２０から引き出される方向（図３のＢ方向）にハンドル２４を回転させるとき、Ｂ方向に移動するネジロッド２４は、ベアリング部２５を介して第２の圧搾部材３ａを上方向に移動させる。このとき、第２の圧搾面５は第１の圧搾面４から離れていくため、第１および第２の圧搾面４、５の間に配置されている、重ねた複数のフィルター部材７は、上記の圧縮状態から復帰される。
　次に、図３に示される駆動手段を用いた抽出容器を用いてフィルター部材７から液体を抽出する方法を図１０のフローチャートを用いて説明する。
　図１０に示されるように、先ず、粒子状物質を捕捉した２枚以上のフィルター部材７を重ねて収容部８に配置する（ステップ１００）。
　次に、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を接近させ、重ねたフィルター部材７を圧縮させる（ステップ１０２）。図３に示される駆動手段を用いた場合、ステップ１０２は、上記したように、ネジロッド２４がハウジング２０内に引き込まれる方向（図３のＡ方向）にハンドル２４を回転させることによって行われる。
　次に、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を引き離して、重ねたフィルター部材７を圧縮状態から復帰させる（ステップ１０４）。図３に示される駆動手段を用いた場合、ステップ１０４は、上記したように、ネジロッド２４がハウジング２０から引き出される方向（図３のＢ方向）にハンドル２４を回転させることによって行われる。ステップ１０２の圧縮工程およびステップ１０４の復帰工程は、１つの圧縮―復帰サイクルとカウントされる。なお、圧縮および復帰の際の好ましい圧力としては、本発明の第１の形態で上述された圧力や、本発明の第３の形態で後述される圧力が用いられる。
　次に、ステップ１０２および１０４で実行された圧縮―復帰サイクルの回数がＭより少ないか否かを判定する（ステップ１０６）。ここでＭは２以上の整数に設定される。
　圧縮―復帰サイクルの回数がＭより少ない場合（ステップ１０６の肯定判定）、ステップ１０２に戻り、圧縮―復帰サイクルを再び繰り返す。圧縮―復帰サイクルを繰り返すことによって、フィルター部材７は圧搾され、捕捉された粒子状物質を含む液体が抽出される。この抽出液は、開口部１４から細管１３を通ってリザーバー１０へと浸出する。このとき第２の圧搾面５が図２（ｂ）に示されるように溝１５を備えている場合、抽出液は、よりスムーズに溝１５を通って開口部１４から細管１３を通り、リザーバー１０へと浸出する。
　圧縮―復帰サイクルの回数がＭに達した場合（ステップ１０６の否定判定）、次のステップ１０８に移行する。ステップ１０８では、リザーバー１０に浸出した抽出液を回収し、収容部８内のフィルター部材７にかけ戻しをする。このかけ戻し工程を１回とカウントする。リザーバー１０に浸出した抽出液の回収およびかけ戻しは、例えばピペット等を使用して行われる。また、抽出液を回収するときは、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を引き離した状態から接近した状態に戻すことによって、より多くの抽出液をリザーバー１０に浸出させてから行うのが好ましい。
　次に、ステップ１０８で実行された、かけ戻しの回数がＮより少ないか否かを判定する（ステップ１１０）。ここでＮは２以上の整数に設定される。
　抽出液のかけ戻しの回数がＮより少ない場合（ステップ１１０の肯定判定）、再びステップ１０２に戻り、圧縮―復帰サイクルをＭ回繰り返し、抽出液の回収およびかけ戻しを実行する。
　抽出液のかけ戻しの回数がＮに達した場合（ステップ１１０の否定判定）、リザーバー１０に浸出した抽出液をピペット等で最終的に回収する。回収された抽出液は微粒子物質の分析のために使用される。
　図１０のフローチャートにおいて、次の変更を適用することも可能である（以下に述べる他の実施形態においても同様である）。
　図１０のステップ１０２および１０４の圧縮―復帰サイクルの後に、抽出容器１ａを振とうさせる工程を追加することが可能である。抽出容器１ａを振とうさせる方向としては、例えば、圧搾面に沿った横方向（図３の例では、ネジロッド２３の軸方向に垂直な方向）が好ましいが、これに限定されるものではない。抽出容器１ａを振とうさせることによって、抽出液に振動する流れが生じ、当該流れが圧搾されたフィルター部材７と衝突を繰り返すことによって抽出効果をさらに向上させることができる。
　また、図１０のステップ１０２において、圧搾面４、５の接近による圧縮だけでなく、圧搾面４、５を互いに相対回転させる工程を追加してもよい。圧搾面４、５を互いに相対回転させることによって、重ねたフィルター部材７に、圧縮力だけでなく、ねじり力が加わり、液体の抽出効果をさらに向上させることができる。
　またさらに、図１０のステップ１０２において、「加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法」で上述した通り、両親媒性溶媒をフィルター部材７に加えて、圧縮を行ってもよい。勿論、溶媒を使用しない圧縮もあり得る。
　さらに、図１０の例では、Ｍ回の圧縮―復帰サイクル毎に、かけ戻し工程をＮ回行い、すなわち計Ｍ×Ｎ回の圧縮―復帰サイクルを行うようになっているが、圧縮―復帰サイクル内で、かけ戻し工程を実行してもよい。この場合、図１０のフローチャートでは、ステップ１０８がステップ１０４と１０６の間に移動し、ステップ１１０が削除されることになる。なお、かけ戻し工程のタイミングについては、これ以外にも適宜変更可能であり、本発明の実施形態は、圧縮―復帰サイクルとかけ戻し工程との任意の組み合わせを含むものである。
　また、図３に示された駆動手段では、人力によるハンドル２４の回転操作により圧搾を行っていたが、ハンドル２４に代えてモータ等の電動駆動手段を用いてもよい。また、圧電アクチュエータにより直接あるいは間接的に圧搾部材によるフィルター部材７の圧搾を行ってもよい。
　さらに、上記例では、第２の圧搾部材３ａを移動させていたが、第１の圧搾部材２ａを移動させても、或いは、第１および第２の圧搾部材の両方を移動させてもよい。
　さらにまた、ステップ１０６において、重ねたフィルター部材７の厚さが圧縮―復帰サイクルを開始する前の所定比率（例えば１／３）以下の厚さになるまで圧縮―復帰サイクルを続けるように条件を変更することもできる。
　抽出容器１ａに関しては、リザーバー１０が第２の圧搾部材３ａの内部に形成されていたが、リザーバー１０は第１の圧搾部材２ａの内部に形成されていてもよく、或いは、第１の圧搾部材２ａおよび第２の圧搾部材３ａの両方に形成されてもよい。
（第２の実施形態）
　第１の実施形態では、リザーバー１０に抽出液体を貯蔵した後、貯蔵された抽出液体をピペット等を用いて再びフィルター部材７にかけ戻すという作業を行っていた。第２の実施形態は、ピペットを用いずに抽出液を循環させる機構を備えた抽出容器に関しており、以下、図４を用いて説明する。なお、第１の実施形態と同様の構成要件については、同様の符号を附して詳細な説明を省略し、異なる部分についてのみ説明する。
　図４（ａ）に示されるように、第２の実施形態に係る抽出容器１ｂは、第１の圧搾部材２ｂと、第２の圧搾部材３ｂとを備えている。第２の圧搾部材３ｂは、第１の圧搾部材２ｂの凹部６内を液密に摺動可能に形成され、第１の圧搾面４と第２の圧搾面５とが、それらの間に収容部８を画成し、該収容部８は、２枚以上のフィルター部材７を重ねた状態で収容可能である点は第１の実施形態と同様である。
　第１の圧搾部材２ｂは、後述する循環用チューブのチューブコネクターとして機能する第１の空洞部４０を有し、第２の圧搾部材３ｂは、循環用チューブのチューブコネクターとして機能する第２の空洞部４５を有する。
　第１の空洞部４０には、３つの異なる直径を各々備えた、大径部４１、中径部４２および小径部４３が形成されている。大径部４１は、第１の圧搾部材２ｂの底部で開口すると共に、第１の圧搾部材２ｂの側面に切り欠きとして形成された循環用チューブの逃げ口４４と接続されている。小径部４３は、第１の圧搾面４で開口しており、これによって第１の空洞部４０は、収容部８と連通する。
　同様に、第２の空洞部４５には、３つの異なる直径を各々備えた、大径部４６、中径部４７および小径部４８が形成されている。大径部４６は、第２の圧搾部材３ｂの頂部で開口すると共に、第２の圧搾部材３ｂの側面に切り欠きとして形成された循環用チューブの逃げ口４９と接続されている。小径部４８は、第２の圧搾面５で開口しており、これによって第２の空洞部４５は、収容部８と連通する。
　図４（ｂ）には、循環用チューブ５０を抽出容器１ｂに装着した状態が示されている。図４（ｂ）に示されるように、循環用チューブ５０の一方の端部５１を第１の空洞部４０の大径部４１に挿入し、循環用チューブ５０の他方の端部５２を第２の空洞部４５の大径部４６に挿入することによって、循環用チューブ５０は抽出容器１ｂに装着される。循環用チューブ５０には、ペリスタポンプ５３が取り付けられている。ペリスタポンプ５３を駆動させることにより循環用チューブ５０の一方の端部５１から吸引すると、収容部８内の抽出液は第１の空洞部４０の小径部４３および中径部４２を経て循環用チューブ５０に吸引され、循環用チューブ５０内を通って他方の端部５２から排出され、第２の空洞部４５の中継部４７および小径部４８を経て再び収容部８内へと流入する。勿論、循環用チューブ５０の他方の端部５２から抽出液を吸引するようにすることも同様に可能である。ペリスタポンプ５３を駆動している間、抽出液が、圧搾されたフィルター部材７内を流動し、循環するので、液体の抽出効果をよりいっそう向上させることができる。
　第２の実施形態に係る抽出容器１ｂにも、例えば図３に示された駆動手段を取り付けてもよい。このとき、循環用チューブ５０の一方の端部５１を逃げ口４４で折り曲げることによって、循環用チューブの方向を変更することができる。よって、第１の圧搾部材２ｂの底面が例えば図３のハウジング２０に取り付けられていても、これを回避して循環用チューブ５０を適切に配置することができる。同様に、循環用チューブ５０の他方の端部５２を逃げ口４９で折り曲げることによって、第２の圧搾部材３ｂの頂部に例えば図３のベアリング部２５が取り付けられていても、これを回避して循環用チューブ５０を適切に配置することができる。
　第２の実施形態に係る抽出容器１ｂでは、第１の空洞部４０および第２の空洞部４５、特に、中径部４２、４７および小径部４３、４８が、第１の実施形態におけるリザーバー１０としての役割も果たすことになる。第２の実施形態では、第１の実施形態における、「抽出液のかけ戻し」を循環用ホース５０およびペリスタポンプ５３を用いて、より効率的かつ効果的に実行することが可能となる。
　第２の実施形態に係る抽出容器１ｂを用いて、図１０のフローチャートに従って、フィルター部材７から液体を抽出することができる。この場合、図１０のステップ１０８における「抽出液の回収およびフィルターへのかけ戻し」がペリスタポンプ５３による「循環用ホース５０および収容部８を通る抽出液の循環」に相当することとなる。また、ステップ１１０の「抽出液のかけ戻し回数」は、例えば、「所定時間ペリスタポンプ５３を駆動させて抽出液を循環させた」ことを１回とカウントする場合の回数、或いは、「抽出液を収容部８から循環用チューブ５０を介して収容部８へと一巡」したことを１回とカウントしてもよい。
　ステップ１１２では、抽出液の排出側にある循環用チューブ５０の端部５１および５２のいずれかを抽出容器１ｂから取り外し、取り外された当該端部からペリスタポンプ５３を用いて抽出液を例えば分析用の容器等に排出することにより、抽出液を最終的に回収する。
　上述のように第２の実施形態では、抽出効果が向上するので、例えばステップ１０６の閾値Ｍ、ステップ１１０の閾値Ｎを小さく設定することも可能となる。
（第３の実施形態）
　第１および第２の実施形態では、リザーバーが第１の圧搾部材或いは第２の圧搾部材の内部に形成されていた。第３の実施形態は、リザーバーがフィルター部材７の収容部８の外周に設けられている構成を有するもので、以下、図５および図６を用いて説明する。なお、第１の実施形態と同様の構成要件については、同様の符号を附して詳細な説明を省略し、異なる部分についてのみ説明する。
　図５には、第３の実施形態の第１の構成例に係る抽出容器１ｃが示されている。抽出容器１ｃは、第１の実施形態と同様に、第１の圧搾部材２ｃと、第２の圧搾部材３ｃとを備えている。第２の圧搾部材３ｃは、第１の圧搾部材２ｃの凹部６内を液密に摺動可能に形成され、第１の圧搾面４と第２の圧搾面５とが、それらの間に収容部８を画成し、該収容部８は、２枚以上のフィルター部材７を重ねた状態で収容可能である点は第１の実施形態と同様である。
　第３の実施形態では、収容部８の外周に空きスペースが存在しており、このスペース全体がリザーバー５４を形成している。リザーバー５４は、第１の圧搾面４の外周に形成された環状溝５５を有している。フィルター部材７がつぶされて液体が抽出されたとき、リザーバー５４のうちフィルター部材７の真横のスペース部分の体積が小さくなって抽出液を貯蔵できなくなり得るが、そのような場合でも、環状溝５５内に抽出液を貯蔵することが可能となる。
　図６には、第３の実施形態の第２の構成例に係る抽出容器１ｄが示されている。抽出容器１ｄは、第１の圧搾部材２ｄと、第２の圧搾部材３ｄとを備え、収容部８の外周にリザーバー５６を有する。抽出容器１ｄのリザーバー５６は、第１の構成例が第１の圧搾面４に環状溝５５が形成されていたのに対して、第２の圧搾面５の外周に環状溝５７を有している。それ以外の点は、第１の構成例と同様である。
（第４の実施形態）
　第１から第３の実施形態では、圧搾面４、５が平面として形成されていたが、本発明は、この例に限定されない。圧搾面が平面以外の例を第４の実施形態として、図７および図８を用いて説明する。
　図７には、第４の実施形態の第１の構成例に係る抽出容器１ｅが示されている。抽出容器１ｅは、図５に示される抽出容器１ｃと基本的な構成は同様であるが、第１の圧搾面４ｅおよび第２の圧搾面５ｅが平面ではなく、球面で構成されている。図７の例では、第１の圧搾面４ｅの球面が凹で、第２の圧搾面５ｅの球面が凸に形成されているが、その逆に構成してもよい。また、好ましくは、第１の圧搾面４ｅおよび第２の圧搾面５ｅの球面の半径は両圧搾面が嵌合可能に実質的に同一であるのがよい。なお、第４の実施形態でいう「球面」は全体的に凸状（若しくは凹状）の曲面であればよく、楕円面、放物面、双曲面等の他の２次曲面や、２次以上の高次曲面を用いてもよい。
　図８には、第４の実施形態の第２の構成例に係る抽出容器１ｆが示されている。抽出容器１ｆは、図６に示される抽出容器１ｄと基本的な構成は同様であるが、第１の圧搾面４ｆおよび第２の圧搾面５ｆが平面ではなく、錐形の斜面で構成されている。図８の例では、第１の圧搾面４ｆの錐形の斜面が凹で、第２の圧搾面５ｆの錐形の斜面が凸に形成されているが、その逆に構成してもよい。また、好ましくは、第１の圧搾面４ｆおよび第２の圧搾面５ｆの斜面角度は両圧搾面が嵌合可能に実質的に同一であるのがよい。
　第４の実施形態に係る第１および第２の圧搾面の形状は、第３の実施形態だけでなく、他の実施形態にも適用可能であることはいうまでもない。
（第５の実施形態）
　第５の実施形態は、注射器型の抽出容器に関するものであり、以下、図９を用いて説明する。
　図９に示されるように、第５の実施形態に係る抽出容器１ｇは、中空空間６ｇ（凹部）を有する、注射器型のシリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇと、ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇと、を備えている。
　シリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇは、中空空間６ｇ（凹部）を基端側空間６２と先端側空間（リザーバー）１０ｇとに仕切るように配置された、細孔（細管）を有する、ふるい部材６０と、抽出液を噴射するための管が形成された先端部６１と、を備えている。
　ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇには、その側面外周に沿って溝９が形成され、該溝９には、基端側空間６２の内側面と係合するようにＯリング１２が嵌合されている。すなわち、ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇは、シリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇの基端側空間６２を液密に摺動することができる。
　ふるい部材６０およびピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇは、それらの内側対向する面が第１の圧搾面４ｇおよび第２の圧搾面５ｇを各々形成している。第１の圧搾面４ｇおよび第２の圧搾面５ｇの間の基端側空間６２の少なくとも一部が、重ねたフィルター部材７の収容部８ｇを画成している。
　第５の実施形態に係る注射器型の抽出容器１ｇにおいても、ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇを、シリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇ内で摺動させることによって、収容部８ｇ内のフィルター部材７に対して、第１の実施形態の図１０で説明した圧縮―復帰サイクルを実行することができる。圧縮―復帰サイクルを受けたフィルター部材７から液体が抽出され、当該抽出液は、ふるい部材６０の細孔から先端側空間（リザーバー）１０ｇへと浸出する。このとき、抽出容器１ｇを先端部６１が下方向に向くように配置し、先端部６１の開口を閉鎖しておけば、先端側空間（リザーバー）１０ｇ内に抽出液を貯蔵することが可能となる。図１０のステップ１０８のかけ戻し工程においては、抽出容器１ｇを先端部６１が下方向に向くように逆に配置すれば、重力により先端側空間（リザーバー）１０ｇに貯蔵された抽出液は、ふるい部材６０の細孔を通過して、再び、フィルター部材７へとかけ戻される。
　第５の実施形態に係る抽出容器１ｇは、注射器型に構成されたため、非常に簡便に、圧縮―復帰サイクルおよびかけ戻し工程を実行することができ、操作性を大幅に向上させることができる。
　以上が本発明の各実施形態であるが、上記例にのみ限定されるものではなく、本発明の範囲内で任意好適に変更可能である。
　３．加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液
　本発明の第３の形態は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液に関する。
　一態様において、抽出液は、後述するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験等に供するのに有効な十分な濃度で、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む。「ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験等に供するのに有効な十分な濃度」とは、例えば、最高濃度において、所定の細胞毒性パラメータを用いて細胞毒性が５５±５％になるような濃度である。
　一態様において、抽出液に含まれる加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質は、水蒸気、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、メントール、フルクトース、グルコースおよび一酸化炭素から選択される物質の１以上を含む。好ましくは、抽出液は、これらの粒子状物質を加熱式喫煙物品の煙中に含まれる割合を反映する割合で含む。
　一態様において、抽出液は、「グリセリン＋ＰＧ＋水」を４０％（重量／重量）以上、好ましくは４５％（重量／重量）以上含む。
　一態様において、抽出液は溶媒を含まない。一態様において、抽出液は少量の両親媒性溶媒のみを含んでもよい。一態様において、抽出液は、４００重量％以下、好ましくは２００重量％以下の両親媒性溶媒を含んでもよい。溶媒を含まない、または、少量の両親媒性溶媒のみしか含まない抽出液は、例えば、後述するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験方法における溶媒の影響を避けることができる。さらに、溶媒を任意に添加することで溶媒の影響を把握することもでき、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うこともできる。
　一態様において、抽出液は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるためのものである。一態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験は、小核試験またはエームズ試験である。「ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験については、「４．ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法」において詳述する。
　４．ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法
　本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法にも関する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法は、本発明の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ことを含む。
　ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法は、細菌復帰突然変異試験（Ａｍｅｓ試験、エームズ試験）および小核試験（ＭＮ試験）、ニュートラルレッド試験等を含む。
　細菌復帰突然変異試験（Ａｍｅｓ試験、エームズ試験）は、アミノ酸要求性のサルモネラ菌と大腸菌の株を用いて点変異を検出する。この点変異には、１ないし２、３のＤＮＡ塩基対の置換、付加または欠失が係る。本試験の原則は、試験菌株の持つ突然変異が復帰して必須アミノ酸を合成する機能的な能力を回復した突然変異を検出することである。復帰細菌株は、親試験株が要求するアミノ酸非存在下で増殖する能力によって検出される。アミノ酸合成ができないように改良した菌が突然変異により菌が本来有しているアミノ酸合成ができるように復帰するという意味から細胞復帰突然変異試験と名付けられている。Ａｍｅｓ試験と呼称される場合もあるが、この名称は本試験を胚発した米国カルフォルニア大学のＡｍｅｓ教授に由来する。Ａｍｅｓ試験は、例えば、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「細菌復帰突然変異試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４７１）（１９９７年７月２１日採択）に従って行うことができる。
　小核試験（ＭＮ試験）は、間期細胞の細胞室内における小核（ＭＮ）の検出を目的とする遺伝毒性試験である。小核は無動原体染色体断片（セントロメアが欠如していること）、または細胞分裂後期に細胞の極への移動ができない染色体全体から生じる。本試験では、細胞分裂を行っている細胞に被験物質を暴露させ、暴露中または暴露後における当該化学物質の染色体異常誘発活性、または異数性誘発活性を検出する。ＭＮ試験は、例えば、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「ＩＮ ＶＩＴＲＯ哺乳類細胞小核試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４８７）（２０１４年９月２６日採択）に従って行うことができる。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１　無溶媒抽出法による加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の抽出
　本実施例では、無溶媒抽出法（ＳＥＰ）による加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の抽出による水回収率および主成分組成を調べた。
　喫煙器（Ｂｏｒｇｗａｌｔ社製、製品名Ｓｍｏｋｉｎｇ　Ｍａｃｈｉｎｅ、製品番号ＲＭ２０Ｈ）を用いて、所定の吸引方式（吸引量５５ｍＬ／回、吸引時間：２秒／回、吸引間隔：３０秒）で、加熱式喫煙物品（熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるタイプ、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名　Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標） ＨｅａｔＳｔｉｃｋｓ（登録商標）ＳＭＯＯＴＨ ＲＥＧＵＬＡＲ、）を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ（登録商標）、ｉＱＯＳ２．４、フィリップモリス社）から煙を発生させた。煙成分をケンブリッジフィルター（ＣＦ）（Ｂｏｒｇｗａｌｔ社より入手）に吹き付けて捕集した。具体的には、１枚目のＣＦが５００－６５０ｍｇ／ｐａｄに達した時点で次のＣＦに交換し、これを繰り返すことにより、連続して１０～１５枚のＣＦに煙成分を捕集した。
　得られた１０～１５枚のＣＦを重ねて、ＣＦの最大寸法よりも２０ｍｍ大きい内寸法を有する密封加圧容器（図５、６、７、８）に収容した。収容されたＣＦに対して図１１に示したスケジュールで圧縮（ｐｒｅｓｓ、右向き矢印）および復帰（ｒｅｌｅａｓｅ、左向き矢印）を４回繰り返すことにより圧搾した。密封加圧容器内でＣＦと圧搾によりＣＦから出てくる圧搾液を特に振とうした。振とうは、４ｃｍ、毎分２００往復で行った。圧搾後、ＣＦを溶液外に取り出し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分）し、分離液を得た。圧搾液と分離液を混合して抽出液とした。
　圧縮復帰１回目－４回目の各回のＣＦの厚さ、抽出液量（ｍＬ）の変化を図１１に示す。図１１の結果は、３回実験を行った平均値である。本実験では、圧縮が過剰になると振とうの際に圧搾液の流動性がなくなるため、１０Ｍｐａが上限であった。
　本実施例において、粒子状物質を１０００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む抽出液が調製された。
　実施例２　無溶媒抽出法による加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の抽出における水回収率
　実施例１の抽出方法において、密封加圧容器内に８.０００ｍＬの水を添加し、上記抽出方法を用いた場合の水添加回収率を調べた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に記載の通り、水添加回収率は３回の平均で９１，５％で、溶液の回収率は９０％以上であった。これは従来の例えばＤＭＳＯを用いた抽出方法と同等の回収率である。
　実施例３　加熱式喫煙物品の煙から抽出された粒子状物質の主成分組成
　本実施例では、各種方法により加熱式喫煙物品の煙から抽出された粒子状物質の主成分組成を調べた。
　加熱式喫煙物品は、加熱式喫煙物品（熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるタイプ、ｉＱＯＳ、フィリップモリス社）を用いた。
　無溶媒抽出法（ＳＥＰ）は、実施例１と同様に行った。ＣＦは１２枚用い、圧縮復帰１回目－４回目は実施例１と同様に４回行った。
　イソプロパノール（ＩＰＡ）による抽出は、ＩＳＯ　４３８７：２０１７（非特許文献７）の７．９．１　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに従い行った。
　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（低濃度）による抽出はＨＣＩ　Ｒｅｇｉｍｅ　Ｔ－５０１（Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ　Ｏｆｆｉｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｔ－５０１　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ　Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｓｍｏｋｅ）（非特許文献８）に従い行った。
　連続抽出とは複数枚のガラス繊維フィルターを同一抽出液で抽出する作業をいう。１回の抽出で所定濃度に達しない場合連続抽出を実施する。ＤＭＳＯによる連続抽出を以下のように行った。
　ＤＭＳＯ連続抽出では、抽出された粒子状物質の濃度が最終的に２００ｍｇ／ｍＬになるように調製した。一枚目のＣＦの振とう抽出、遠心分離が終了した後、抽出液全量を新たなＣＦが入ったデュラン瓶に加え、振とう抽出・遠心分離を行う。本操作を所定の枚数分を繰返す。
　抽出された粒子状物質の主成分組成を、コレスタ推奨法８４番（非特許文献９）の方法により分析した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中、「ＰＧ」はプロピレングリコール、「Ｇ」はグリセリンである。ＳＥＰにより抽出された粒子状物質の主成分組成は、ＩＰＡ抽出，ＤＭＳＯ抽出（低濃度）と同様であり、ＳＥＰを加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の主成分を適切に抽出していることを示唆する。
　実施例４　細菌復帰突然変異試験および小核試験
　本実施例では、実施例３で得られた、無溶媒抽出法（ＳＥＰ）により抽出された加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いて、細菌復帰突然変異試験（Ａｍｅｓ試験、エームズ試験）および小核試験（ＭＮ試験）を行った。
　Ａｍｅｓ試験およびＭＮ試験の被験物質として、以下の試料を準備した。
　ＳＥＰ試料：ｉＱＯＳ（１０００ｍｇ／ｍＬ）（ＳＥＰ中溶媒：ＰＧ／Ｇ／水）（１．２％添加）
　ＤＭＳＯ抽出試料：ｉＱＯＳ（２００ｍｇ／ｍＬ）（ＤＭＳＯによる１０回連続抽出）（１％添加）（ＤＭＳＯによる通常の抽出では１００ｍｇ／ｍＬが限界）
　（１）Ａｍｅｓ試験
　Ａｍｅｓ試験は、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「細菌復帰突然変異試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４７１）（１９９７年７月２１日採択）に従って行った。具体的には、以下のように行った。
　国立医薬品食品衛生研究所（神奈川、日本）より取得した５種の試験用細菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７およびＴＡ１０２）を用いて、代謝活性系の存在下および非存在下で、総粒子状物質（ＴＰＭ）画分の変異原性を試験した。
　細菌培養物の約１×１０９の細胞、連続的に希釈した試験試料（ＳＥＰ試料またはＤＭＳＯ抽出試料）、および、フェノバルビタール／５，６－ベンゾフラボン誘導されたラットの肝臓ホモジェネートを含むＳ９ミックス若しくはＰＢＳを含む反応混合物を、３７℃±１℃で、２０分±１分インキュベートした。
　代謝活性化を伴わない試験において、陽性コントロールとして、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２には、フリルフルアミド（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を、ＴＡ１５３５にはアジ化ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を、そして、ＴＡ１５３７にはＩＣＲ－１９１（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ） を使用した。代謝活性化試験においては、ＴＡ１０２、ＴＡ１５３５には２－アミノアントラセン（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を、そして、ＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１５３７には、ベンゾピレン（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を使用した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯのみを使用した。
　インキュベーション後、反応混合物を融解した上層寒天（トップアガー）と混合し、最小グルコース寒天プレート上に播いた。プレートを３７℃±１℃で、４８－７２時間インキュベートし、１プレートあたりの復帰変異体を自動的に計数した。３つのプレートの結果に基づき、復帰変異体の平均数を計算した。独立に調製した試験試料を用いて２回または３回の独立した試験を行った。
　全ての細菌株＋Ｓ９の組み合わせにおいて、再現可能なように、復帰変異体が用量依存的増加し、そして、試験試料の１以上の濃度において、１以上のうちＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１０２が溶媒コントロールに対し少なくとも２倍増加するか、もしくは、試験試料の１以上の濃度において、ＴＡ１５３５およびＴＡ１５３７が溶媒コントロールに対し少なくとも３倍増加する場合に、その試料は変異原性である、と評価した。
　試験試料間で免疫原性を比較するために、ＪＭＰ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１０．０．２（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用いて、用量曲線の直線部分に対する線形回帰分析に基づき、勾配パラメーター（即ち、一次係数）を計算した。
　（２）ＭＮ試験
　ＭＮ試験は、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「ＩＮ　ＶＩＴＲＯ哺乳類細胞小核試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４８７）（２０１４年９月２６日採択）に従って行った。具体的には、以下のように行った。
　Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入したＣＨＯ±Ｕ細胞系を分析に用いた。細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補足したＤＭＥＭ中、３７℃±２℃で５％ＣＯ２インキュベーター内に維持した。
　代謝活性化を伴わない短期間曝露、代謝活性化を伴う短期間曝露および代謝活性化を伴わない長期間曝露、の３種類の処理スケジュールにおいて総粒子状物質（ＴＰＭ）画分を分析した。
　細胞縣濁液（２×１０４細胞／ウェル）を処理前に２４時間±３時間、プレインキュベートした。短期間曝露のために、細胞培養物を、Ａｒｃｏｌｏｒ１２５４－誘導されたラットの肝臓ホモジェネートを含むＳ９ミックスを伴い、または、伴わずに、試験試料（ＳＥＰ試料またはＤＭＳＯ抽出試料）で３時間±１５分処理した。試験試料の除去後、細胞を２１時間±１時間インキュベートした。長期間曝露のために、代謝活性化系の非存在下で、細胞を２４時間±１時間インキュベートした。陽性コントロールとして、代謝活性化非存在の場合には、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、そして、、代謝活性化存在の場合には、シクロフォスファミド（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を適用した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯのみを使用した。
　氷酢酸／メタノール（１：９９、ｖ／ｖ）の溶液で細胞を固定し、エタノール／水（７０％、ｖ／ｖ）の溶液で洗浄し、そして、ＤＡＰＩ溶液およびＣｅｌｌＭａｓｋオレンジ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）で染色した。
　染色した細胞を含む全てのウェルをＡｒｒａｙ　Ｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によってスキャンした。２０００細胞あたり（１０００細胞／スライド、２重培養）小核化した細胞の数を計数し、小核細胞頻度（％ＭＮ）を計算した。実験は独立に２回行った。
　各試料の遺伝毒性をＭａｔｓｕｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｐｏｌｌｕｔ．　６４，　１２１－１３２（非特許文献１０）に記載された方法に従って評価した。コクラン－アーミテージ２項検定を用いて、ＭＮ頻度の用量依存性を調べた。フィッシャーの正確検定を用いて、併行した溶媒コントロールに対して、試験試料の１以上の濃度において、ＭＮ頻度が有意に増加するかを評価した。
　双方の統計検定の結果が、２つの独立した実験において有意であり、そして再現可能な場合、試験試料を遺伝毒性がある、と判定した。試験試料間の遺伝毒性の比較のために、ＭＮ頻度が最高値に達する濃度までのデータで、ロジスティック回帰分析を行った。ロジスティック計数の勾配パラメーターを遺伝毒性活性として同定した。ＪＭＰ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１０．０．２（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用いてデータ分析を行った。
　（３）結果
　図１２は、Ａｍｅｓ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）　ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、試料添加前の生細胞数に対する試料添加後の生細胞数（細胞復帰突然変異を起こした細胞）の割合（％）をプロットしたものである。
　図１３は、ＭＮ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）　ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、小核（ＭＮ）の発生頻度（ＭＮ誘発が生じた）割合（％）をプロットしたものである。
　ＤＭＳＯ抽出試料を用いた場合、ＭＮ試験に関するＯＥＣＤガイドライン、ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４８７の項目２８に「最大濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じる程度のものとする。」「被験物質の濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じるものから、ほとんどまたはまったく細胞毒性をしめさないものまでの範囲をカバーできるように選択する必要がある。」と記載されているところ、細胞毒性４０％程度までしか曝露できなかった（図１２、通常）。用量２０００μｇ　ＴＰＭｅｑ．／ｍｌより高い用量はＤＭＳＯ溶媒の細胞毒性が混在し得る添加用量２％を超えるためである。そして、ＤＭＳＯ抽出試料を用いた場合、ＭＮ誘発のダウンターンまでは確認できなかった。（図１３、通常、）。いずれも、ＭＮ試験としては不十分な結果である。
　これに対し、ＳＥＰによる試料を用いた場合、ほぼ細胞毒性１００％まで曝露可能であった（図１２、ＳＥＰ）。そして、ＭＮ誘発についてもピーク～ダウンターンが確認できた（図１３、ＳＥＰ，用量６０００μｇ　ＴＰＭ　ｅｑ．／ｍｌより高用量）。ＭＮ試験に関するＯＥＣＤガイドライン、ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ　ＴＧ４８７の項目２８には、「最大濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じる程度のものとする。」「被験物質の濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じるものから、ほとんどまたはまったく細胞毒性をしめさないものまでの範囲をカバーできるように選択する必要がある。」と記載されている。ＳＥＰによる試料を用いることにより、よりＯＥＣＤガイドラインに準拠した試験実施が可能であることがわかった。
　実施例５　ニュートラルレッド取込活性試験
　（１）材料等
　（試験試料）
　紙巻きたばこ試料：ケンタッキーリファレンスシガレット（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）３Ｒ４Ｆは、研究目的でケンタッキー大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）のタバコおよび健康研究機関（Ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって提供されてきたフィルタ付きシガレットである（特表２００８－５４４９３８より一部改変）。
　加熱型喫煙物品：
　　サンプルＡ＝加熱型喫煙物品の内部に挿入された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成されるタイプ、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名　Ｍａｒｌｂｏｌｏ　ｆｏｒ　ｉＱＯＳ　ＲＥＧＵＬＡＲ（商標））を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ２．４（登録商標））、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社製）を用いた。
　　サンプルＢ＝加熱型喫煙物品の外周に配置された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成されるタイプ、を専用の加熱式喫煙具を用いた。
　サンプルＣ＝加熱型喫煙物品Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）　Ｒｅｇｕｌａｒｆｏｒ　Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈ（日本たばこ産業株式会社製）を，同封のカートマイザーと専用の喫煙具（Ｐｌｏｏｍ（登録商標）　Ｔｅｃｈ）を用いた。試料は次の調湿・調和を開始する直前まで４℃で保存した。
　（調湿・調和）全ての試料は，定法ＩＳＯ３４０２:１９９９（非特許文献５）に従い，調湿・調和した。
　（吸引条件）定法ＨＣＩ
　（吸引終了）定法ＩＳＯ４３８７：２０１７（非特許文献７）
　（煙・エアロゾル捕集）
　ＳＥＰ法により捕集したＡＣＭ（ａｅｒｏｓｏｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｍａｓｓ）（非燃焼型のシガレットより発生したエアロゾルの量）を、ケンブリッジフィルターとともに電子天秤で秤量し，ケンブリッジフィルターの風袋を差し引いてＡＣＭ重量を得た。
　（煙・エアロゾルの抽出）
　慣用法において、ＣＦＰに捕集された煙の総粒子状物・エアロゾル捕集物は，慣用法に沿って濃度１００ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯを添加し、抽出した。
　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験試料の調製）
　慣用法により抽出した煙・エアロゾルのＤＭＳＯ抽出溶液は，本実施例で予め秤量したＴＰＭ・ＡＣＭ重量に換算して１００ｍｇ／ｍＬとなるようＤＭＳＯ溶媒を加えて調整した。
　ＳＥＰ法により抽出した煙・エアロゾル液は，調整せずｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験試料とした。
　（２）ニュートラルレッド取込活性試験
　ニュートラルレッド取込活性試験は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用い，操作手順はＨｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ　Ｏｆｆｉｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｔ－５０２，Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｒｅｄ　Ｕｐｔａｋｅ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ　Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｓｍｏｋｅ　（Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａ，　２００４ｃ）（非特許文献１１）に従って行った。
　１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補足したハムＦ１２栄養素混合培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）において、３７℃±２℃で５％ＣＯ２インキュベーター内に維持した。
　ＣＨＯ－Ｋ１細胞懸濁液（１．０×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルマイクロタイタープレート中、２４時間±２時間、プレインキュベートした。細胞を総粒子物質（ＴＰＭ）画分で２４時間処理した。陽性コントロールとして、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた。ＴＰＭまたはＧＶＰ試験の溶媒コントロールとして、各々、ＤＭＳＯまたはＣＭＦ－ＰＢＳ（ｃａｌｃｉｕｍ－ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｆｒｅｅ－ＰＢＳ）のみ用いた。
　１回の実験において、１試験試料あたり、３個の９６ウェルプレートを分析した。上記のように処理した細胞を、１８μｇ／ｍＬのニュートラルレッド染料を含む培地で３時間インキュベートした。対で、細胞を１％ホルマリンで１－２分、固定した。固定剤を除去した後、１％（ｖ／ｖ）を含む酢酸５０％エタノールを添加することにより、生細胞により取り込まれたニュートラルレッド染料を抽出し、マイクロプレートリーダー用いて、５４０ｎｍの吸光度を測定した。独立した実験を３回行った。
　各処理レベルの細胞毒性を、同時併行の溶媒コントロールとの相対吸光度として表した。弛緩試料間の細胞毒性活性の比較のためのＩＣ５０値を算出するために、ロジスティック係数を用いた最小二乗法に基づき、相対吸光度と濃度の間の関係について非線形回帰分析を行った。吸光度が、同時併行の溶媒コントロールの値の５０％まで減少した時点の、有効濃度の逆推定により、ＩＣ５０値を算出した。ＪＭＰ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１０．０．２（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用いて計算を行った。
　結果を図１４に示す。図１４は、横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットしたものである。慣用法（ＤＭＳＯ）を１回（図１４Ａ）、ＳＥＰ法を３回（図１４Ｂ－図１４Ｄの３回の独立した試験）を行った。
　ＤＭＳＯ抽出試料を用いた場合、紙巻きたばこ試料についてはニュートラルレッド取込活性がほぼ消失する程度まで曝露できた。一方、加熱型喫煙物品試料については、サンプルＡ加熱型喫煙物品ｉＱＯＳおよびサンプルＢ加熱型喫煙物品Ｂいずれについてもニュートラルレッド取込活性７０％程度までしか曝露できなかった（図１４Ａ）。加熱型喫煙物品Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈについては、ニュートラルレッド取込活性は変化がなかった（図１４Ａ）。いずれの加熱型喫煙物品試料においても、ＤＭＳＯ抽出試料を調整できる技術的限界はＴＰＭ１０００μｇ／ｍｌであった。
　これに対し、ＳＥＰ法による試料を用いた場合、加熱型喫煙物品試料は、サンプルＡ加熱型喫煙物品ｉＱＯＳおよびサンプルＢ加熱型喫煙物品Ｂいずれについても、ニュートラルレッド取込活性が消失する程度まで曝露できた（図１４Ｂ，同Ｃ，同Ｄ）。サンプルＣ加熱型喫煙物品Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈについては、ニュートラルレッド取込活性９０％程度まで曝露できた（図１４Ｂ，同Ｃ，同Ｄ）。ＳＥＰ法は、抽出原理的に加熱型喫煙物品が発生するエアロゾルの原液を抽出する方法であるが、Ｐｌｏｏｍ　Ｔｅｃｈ試料の原液でもＴＰＭ２００００μｇ／ｍｌが上限であるからである。すなわち、ＳＥＰ法により得られた試料で、加熱型喫煙物品のエアロゾル成分を試料としたニュートラルレッド取込活性試験が完遂できることが示された。図１４で明らかなとおり、加熱型喫煙物品の内部に挿入された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成される加熱型喫煙物品、加熱型喫煙物品の外周に配置された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成される加熱型喫煙物品、インフューズド型加熱型喫煙物品、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うことができた。
　　１ａ～１ｆ　　抽出容器
　　２ａ～２ｆ　　第１の圧搾部材
　　３ａ～３ｆ　　第２の圧搾部材
　　４、４ｅ、４ｆ、４ｇ　　第１の圧搾面
　　５、５ｅ、５ｆ、５ｇ　　第２の圧搾面
　　６、６ｇ　　凹部
　　７　　重ねたフィルター部材
　　８、８ｇ　　収容部
　　９　　溝
　１０、１０ｇ、（４０、４５）、５４　　リザーバー
　１１　　第２の圧搾部材の先端部
　１２　　Ｏリング
　１３　　細管
　１４　　ラッパ状の開口部
　２０　　ハウジング
　２１　　蓋部
　２２　　ネジ貫通孔
　２３　　ネジロッド
　２４　　ハンドル
　２５　　ベアリング部
　２６　　ベアリング部の張り出した底板
　３０、３１、３２　　ボルト
　４０　　第１の空洞部（リザーバー、チューブコネクタ）
　４５　　第２の空洞部（リザーバー、チューブコネクタ）
　４１、４６　　大径部
　４２、４７　　中径部
　４３、４８　　小径部
　４４、４９　　循環用チューブの逃げ口
　５０　　循環用チューブ
　５１　　循環用チューブ５０の一方の端部
　５２　　循環用チューブ５０の他方の端部
　５３　　ペリスタポンプ
　５５　　環状溝
　６０　　ふるい部材
　６１　　先端部
　６２　　基端側空間

Claims (34)

  1. 　加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法であって、
    　（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
    　（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
    　（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
    ことを含む、前記方法。
  2. 　（３）の工程を、
    　（３－ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
    　（３－ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
    　（３－ｉｉｉ）（３－ｉ）と（３－ｉｉ）を組み合わせて行う
    ことによって行う、請求項１に記載の方法。
  3. 　（３－ｉ）の前記重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
  4. 　（３－ｉ）および／または（３－ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうする、請求項２に記載の方法。
  5. 　（３－ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
  6. 　工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う、請求項１－５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる、請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　フィルターを３枚以上使用する、請求項１－７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　フィルターを１０枚－１５枚使用する、請求項１－８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　重ねたフィルターの厚さが工程（３）を行う前の１／３以下になるまで、工程（３）を繰り返す、請求項１－９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　工程（３）において溶媒を使用しない、請求項１－１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　工程（３）において、フィルター容積に対して０％（重量／容積）より多く、４００％（重量／容積）以下の量の両親媒性溶媒を加える、請求項１－１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　圧縮を１０ＭＰａ以下で行う、請求項１－１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　フィルターがガラス繊維フィルターである、請求項１－１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　フィルターが、定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有するフィルターである、請求項１－１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　さらに、
    　（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
    　（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
    ことを含む、請求項１－１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　２枚以上のフィルターを重ねた状態で収容可能な収容部と、
    　前記収容部に重ねた状態で収容されたフィルターを圧搾する１または複数の圧搾部材と、
    　前記収容部と連通するリザーバーと
    を含む、抽出容器。
  18. 　前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面の形状が、平面、錐形の斜面または凸状若しくは凹状の曲面、のいずれかである、請求項１７の抽出容器。
  19. 　前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面が２面ある、請求項１７または１８の抽出容器。
  20. 　２つの前記圧搾面が互いに回転摺動する、請求項１９の抽出容器。
  21. 　前記リザーバーが、前記収容部の上方および下方の少なくともいずれかに配置される、請求項１７－２０に記載の抽出容器。
  22. 　前記リザーバーが前記収容部の外周に設けられている、請求項１７－２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
  23. 　前記リザーバーは前記圧搾面の少なくとも１つを貫通する細管を通して前記収容部と連通している、請求項１７－２１のいずれか１項に記載の抽出容器。
  24. 　前記圧搾部材の圧搾面に溝が設けられている、請求項１７－２３のいずれか１項に記載の抽出容器。
  25. 　前記圧搾部材を２つ有し、該２つの圧搾部材は各々の圧搾面を対向させた状態で移動可能であり、
    　前記２つの圧搾部材の各々対向する圧搾面の間の空間が前記収容部を画成する、請求項１７－２４のいずれか１項に記載の抽出容器。
  26. 　前記２つの圧搾部材のうち一方が凹部を有し、該凹部の内側底面が圧搾面を形成し、
    　前記２つの圧搾部材のうち他方がその圧搾面を前記内側底面に向けた状態で前記凹部内を液密に摺動可能である、請求項２５に記載の抽出容器。
  27. 　注射器型のシリンダー部材と、
    　前記シリンダー部材の中空空間を基端側空間と先端側空間とに仕切るように配置された、細孔を有するふるい部材と、
    　前記シリンダー部材の前記基端側空間を液密に摺動可能なピストン部材と、
    を備え、
    　前記ふるい部材および前記ピストン部材は、それらの内側対向する面が圧搾面を各々形成して前記圧搾部材を構成し、
    　前記ピストン部材の圧搾面と前記ふるい部材の圧搾面との間の前記基端側空間の少なくとも一部が前記収容部を画成し、
    　前記先端側空間が前記リザーバーを画成する、
    　請求項１７－２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
  28. 　リザーバーに回収された抽出液が流動または循環される、請求項１７－２７のいずれか１項に記載の抽出容器。
  29. 　請求項１－１６のいずれか１項に記載の方法に使用するための請求項１７－２８のいずれか１項に記載の抽出容器。
  30. 　請求項１－１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液。
  31. 　溶媒を含まない、請求項３０に記載の抽出液。
  32. 　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるための請求項３０または３１に記載の抽出液。
  33. 　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの毒性試験が、小核試験またはエームズ試験である、請求項３２に記載の抽出液。
  34. 　請求項１－１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法。
     
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