WO2020079878A1 - 糖鎖構造解析装置、及び糖鎖構造解析用プログラム - Google Patents

糖鎖構造解析装置、及び糖鎖構造解析用プログラム Download PDF

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WO2020079878A1
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mass
sialic acid
chain structure
binding mode
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PCT/JP2019/020413
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雅樹 村瀬
隆司 西風
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株式会社島津製作所
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    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/20—Identification of molecular entities, parts thereof or of chemical compositions
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
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    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H01J49/0036—Step by step routines describing the handling of the data generated during a measurement

Definitions

  • the present invention relates to a sugar chain structure analysis device for analyzing a sugar chain structure using mass spectrometry, and a sugar chain structure analysis program for analyzing a sugar chain structure on a computer.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a sugar chain structure analysis device capable of analyzing the structure of a sugar chain including the binding mode of sialic acid bound to a sugar chain, and a sugar chain structure analysis program.
  • the “sugar chain” as used herein includes not only an existing sugar chain but also a sugar chain in a state in which biomolecules such as proteins, peptides, lipids and nucleic acids are modified, that is, a modified sugar chain. Let's assume.
  • biomolecules such as proteins and peptides in the living body
  • biomolecules that have undergone sugar chain modification that are generated during the process of biosynthesis play an important role in life activity.
  • Many concrete reports have been made at the molecular level. From these facts, it is expected that clarifying the structures of sugar chains that modify biomolecules involved in various processes in life phenomena will be useful for elucidation of life phenomena and drug discovery / diagnosis.
  • Sialic acid which is a type of sugar, was thought to be an important substance in protein quality control, signal transduction in nerves, and cell-to-cell recognition, but recently, sialic acid residues have been attached to the ends of sugar chains. On the other hand, it is becoming clear that differences in binding modes are important for such biological activities. Therefore, understanding the binding mode of sialic acid to sugar chains is one of the important tasks in sugar chain structure analysis.
  • ⁇ 2,3 bond type and ⁇ 2,6 bond type are mainly known as sialic acid bond modes. It has been known that the binding mode changes with the canceration of cells, and it is expected that the binding mode will be used as a biomarker or for quality control of biopharmaceuticals.
  • sialic acid bond modes since there are no mass differences between sugar chain isomers containing sialic acid that differ only in the binding mode, it is difficult to determine the binding mode using a mass spectrometer that is widely used for sugar chain analysis.
  • sialic acid easily dissociates from sugar chains and is unstable, so that low detection sensitivity and quantitativeness have been problems. Therefore, it is strongly desired to develop a method capable of rapidly and accurately analyzing the binding mode of sialic acid.
  • a chemical modification method specific to the binding mode of the sialic acid is used.
  • a sugar having ⁇ 2,3-sialic acid is obtained by reacting a sample to be analyzed containing a sugar chain with a dehydration condensation agent containing an amine such as isopropylamine and carbodiimide.
  • a method is disclosed in which a lactone is produced as a chain modified product and an amide is produced as a sugar chain modified product having ⁇ 2,6-sialic acid.
  • some other chemical modification methods are described in the above literature.
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) -time-of-flight mass spectrometer is used to analyze the composition and structure of sugar chains treated by the chemical modification method specific to the sialic acid binding mode as described above. It is necessary to carry out mass spectrometry using (TOFMS) or the like and analyze the data collected by the computer with a computer.
  • TOFMS mass spectrometry using
  • some computer software is known for obtaining the sugar chain composition and its structure from the data obtained by mass spectrometry of sugar chains. Typical examples thereof include a glyco-peak finder "Glyco-peakfinder" (see Non-Patent Document 2) and a simglycan "SimGlycan” (registered trademark) (see Non-Patent Document 3).
  • the "Glyco-peak finder” allows you to change the composition of sugar chains whose masses match the mass-to-charge ratio value of the peak (hereinafter referred to as "ion peak”) on the mass spectrum obtained by actual measurement with a certain tolerance. This is a brute force examination of combinations of monosaccharides.
  • “SimGlycan” is a database search using the database originally built by the manufacturer of the software for the composition and structure of sugar chains corresponding to the mass-to-charge ratio of the peaks on the MS / MS spectrum obtained by actual measurement. It is what is sought by.
  • sugar chain analysis software it is possible to analyze sugar chain derivatives including modified sugar chains.
  • such software is not supposed to analyze a sugar chain modified product by a chemical modification method specific to the sialic acid binding mode. Therefore, for example, when performing a brute force search, a plurality of different modified products generated by the difference in the binding mode of sialic acid when a certain one type of sialic acid binding mode-specific chemical modification reagent is used are used. It is necessary to search for monosaccharide residues with different masses.
  • the user himself / herself needs to examine 2 ⁇ N modified sialic acids and additionally input them as monosaccharide residues to be searched.
  • the present invention was made to solve the above problems, and its main purpose is to analyze sialic acid based on mass spectrum data for a sample containing a sugar chain chemically modified in a sialic acid binding mode.
  • analyzing the sugar chain structure including the bond mode of the sugar chain structure analysis device and the computer, which can reduce the troublesome work such as setting the search conditions by the user and efficiently perform the analysis. It is to provide a program for sugar chain structure analysis.
  • the sugar chain structure analyzing apparatus made to solve the above-mentioned problems is a sialic acid-bonded sugar chain pretreated with a chemical modification reagent specific to a sialic acid binding mode, or A sugar chain structure analyzer for analyzing the structure of a sialic acid-binding sugar chain, based on mass spectrum data obtained by mass spectrometry of a sample containing a molecule modified with the sialic acid-bonding sugar chain, A condition setting unit for the user to set the ion species to be analyzed, the polarity of the charge of the ion species, and the mass variation factor that causes the mass variation of the sugar chain due to modification, A sugar chain core structure information acquisition unit for acquiring various sugar chains having a core structure composed of a plurality of types and a plurality of monosaccharide residues and mass information corresponding thereto, A theory for obtaining a sugar chain theoretical mass-to-charge ratio by increasing or decreasing the mass of various sugar chains acquired by the sugar chain core structure information acquisition unit
  • the theoretical mass calculation unit is a theoretical mass-to-charge ratio of sugar chains in which the mass is increased or decreased for each sialic acid binding mode corresponding to the chemical modification set by the sialic acid binding mode-specific chemical modification correspondence mass variation setting unit. Is to seek.
  • the sugar chain structure analysis program according to the first aspect of the present invention made to solve the above problems is a computer program for realizing a function in the sugar chain structure analysis device according to the first aspect. And was obtained by mass spectrometry of a sample containing a sialic acid-binding sugar chain pretreated with a chemical modification reagent specific to the sialic acid-binding mode or a molecule modified with the sialic acid-binding sugar chain.
  • a sugar chain structure analysis program for analyzing the structure of a sialic acid-binding sugar chain based on mass spectrum data, comprising: A condition setting function unit that allows a user to set an ion species to be analyzed, the polarity of the charge of the ion species, and a mass variation factor that causes the mass variation of the sugar chain by modification.
  • a sugar chain core structure information acquisition function unit that acquires various sugar chains having a core structure composed of a plurality of types and a plurality of monosaccharide residues and mass information corresponding thereto, For various sugar chains acquired by the sugar chain core structure information acquisition function unit, the sugar chain theoretical mass-to-charge ratio can be obtained by increasing or decreasing the mass based on the mass variation factor set by the condition setting function unit.
  • the theoretical mass calculation function section to be sought The sugar chain structure mass-to-charge ratio, a sugar chain structure estimation functional unit that estimates the structure of the sugar chain by checking the mass-to-charge ratio of the ion peak in the given mass spectrum data,
  • the condition setting function unit allows the user to perform sialic acid binding mode-specific chemical modification, which is a chemical modification specific to the binding mode of sialic acid, independently of other modifications. Let's set The theoretical mass calculation function unit obtains the theoretical mass-to-charge ratio of sugar chains in which the mass is increased or decreased for each sialic acid binding mode, corresponding to the set chemical modification specific to the sialic acid binding mode.
  • the sugar chain structure analysis program according to the first aspect is a program for operating a general-purpose personal computer, a higher-performance computer, a dedicated computer incorporated in various systems, or the like.
  • a program can be recorded in a non-transitory recording medium such as a CD-ROM, a DVD-ROM, a memory card, or a USB memory (dongle) and provided to the user.
  • a non-transitory recording medium such as a CD-ROM, a DVD-ROM, a memory card, or a USB memory (dongle)
  • it may be provided to the user in the form of data transfer via a communication line such as the Internet.
  • the sugar chain structure analysis program according to the above aspect can be installed in advance in the computer included in the system.
  • the molecule modified with a sialic acid-bonded sugar chain is, for example, a biomolecule such as a protein, peptide, lipid or nucleic acid modified with a sialic acid-bonded sugar chain.
  • a chemical modification reagent specific to the sialic acid binding mode which is a prerequisite in the present invention, is disclosed in, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, but is not limited thereto. If there is no specific chemical modification to distinguish at least two or more different binding modes of sialic acid such as ⁇ 2,3 bond type, ⁇ 2,6 bond type, and ⁇ 2,8 bond type. Good.
  • the type and method of the mass spectrometer for performing mass spectrometry on a sample containing sialic acid-bonded sugar chains and the like are not particularly limited, but, for example, an ion trap mass spectrometer, a linear ion trap mass spectrometer , TOF / TOF mass spectrometer, quadrupole-time of flight (Q-TOF) mass spectrometer, quadrupole-ion trap mass spectrometer, Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer, etc. are available. is there.
  • the condition setting unit displays a predetermined condition setting window on the screen of the display unit, and displays information input or selected on the window. Accept.
  • the user can set the ion species to be analyzed, the polarity of the charge of the ion species, and the mass variation factor as the search conditions for the sugar chain structure analysis.
  • the user can set a chemical modification specific to the binding mode of sialic acid independently of other modifications. That is, as modification of sugar chains, modification of reducing ends for fluorescent labeling and the like is often performed, but apart from this, it becomes possible to set information on chemical modification specific to the binding mode. ing.
  • the mass variation factor by chemical modification specific to the binding mode in an independent window or tab different from the main setting screen. Further, it is also possible to set a mass variation factor by chemical modification specific to the binding mode in one of the plurality of divided display areas arranged in one window.
  • the sugar chain core structure information acquisition unit acquires various sugar chains having a core structure composed of a plurality of monosaccharide residues and mass information corresponding thereto.
  • a method of brute force finding sugar chains that can be theoretically constructed and a database search using an existing sugar chain structure database. A method of asking for it is possible.
  • the sugar chain core structure information acquisition unit includes a total of sugar chain structures that are assumed under the constraints of the type and number of monosaccharide residues. It is possible to adopt a configuration in which various sugar chains having a core structure and mass information corresponding to the sugar chains are estimated by random estimation.
  • a sugar chain structure database in which various sugar chain structures and masses are recorded is further provided,
  • the sugar chain core structure information acquisition unit obtains various sugar chains having a core structure by searching the information stored in the sugar chain structure database based on the sugar chain mass information set by the user. It may be configured.
  • the sugar chain obtained by the sugar chain core structure information acquisition unit is in a state in which there is no modification or substitution, addition of a specific substance during ionization, or the like.
  • the theoretical mass calculation function unit increases or decreases the mass based on the mass variation factor set by the condition setting unit to calculate the theoretical mass-to-charge ratio of sugar chains when detected by mass spectrometry as ions. calculate.
  • the chemical modification is set in the mass variation setting section corresponding to the chemical modification specific to the sialic acid binding mode, the sugar whose mass is increased or decreased depending on the chemical modification is changed for each sialic acid binding mode. Calculate chain theoretical mass to charge ratio.
  • the mass of the sugar chain is increased by different masses for each of the two bond modes, and the N type becomes one core sugar chain structure
  • the sugar chain structure estimation function unit compares the calculated sugar chain theoretical mass-to-charge ratio with the mass-to-charge ratio of the ion peak in the given mass spectrum data. Then, those having a mass-to-charge ratio deviation within a predetermined allowable range are selected for each ion peak, and the sugar chain candidates corresponding to the ion peak are selected. As described above, the mass-to-charge ratio of two or more modified sugar chain ions whose sugar chain theoretical mass-to-charge ratio differs due to the difference in the sialic acid binding mode with respect to the sugar chain having the same original core structure can be obtained. , The correspondence between the two or more sugar chain ions and the ion peak can be obtained at one time.
  • the sugar chain structure analyzing apparatus preferably, further comprising a display processing unit for displaying information on the sugar chain structure estimated by the sugar chain structure estimating unit on a display unit,
  • the display processing unit may be configured to add and display information indicating the binding mode for each sialic acid.
  • character information or symbols indicating “ ⁇ 2,3-” and “ ⁇ 2,6-” are included. It may be displayed in addition to the sugar chain composition. This allows the user to grasp the difference in the binding mode of sialic acid at a glance.
  • the sialic acid binding mode-specific chemical modification-supporting mass variation setting unit can select a predetermined sialic acid binding mode-specific chemical modification, and other chemicals.
  • a mass variation value for each sialic acid binding mode can be input for the modification.
  • a plurality of mass-charge ratios having different mass-to-charge ratios depending on the difference in the binding mode of sialic acid contained in one type of sugar chain can be used.
  • the structure of a sugar chain (modified sugar chain) can be searched without excess or deficiency by setting one type of sialic acid binding mode-specific chemical modification and performing one analysis process.
  • the sugar chain structure analysis including the binding mode of sialic acid it is possible to reduce the troublesome work of the user such as setting troublesome search conditions.
  • the time required for the analysis processing can be shortened and the analysis throughput can be improved.
  • the present invention when using a chemical modification reagent specific to the main sialic acid binding mode, it suffices that the user use is selected from a plurality of options prepared in advance. There is no need for the user to manually check the amount of mass fluctuation etc. Therefore, the labor of the work is reduced, and the work error due to the manual input can be suppressed.
  • FIG. 1 is a schematic block configuration diagram of a sugar chain structure analysis system that is an embodiment of the present invention.
  • the flowchart of the analysis processing procedure in the sugar chain structure analysis system of the present embodiment The figure which shows an example of the tab for a user to set the sialic acid binding mode specific chemical modification in the sugar chain structure analysis system of a present Example.
  • FIG. 1 is a schematic block configuration diagram of the sugar chain structure analysis system of this example.
  • the present system includes a mass spectrometric unit 1 that performs measurement on a sample, a data analysis unit 2 that performs analysis processing, an input unit 3 and a display unit 4 that are user interfaces.
  • Prepare The data analysis unit 2 includes a data storage unit 21, a peak detection unit 22, and a sugar chain structure analysis unit 23.
  • the sugar chain structure analysis unit 23 includes an analysis condition setting unit 24 and a sugar chain core structure mass calculation unit 25.
  • the functional block includes a sugar chain theoretical mass to charge ratio calculation unit 26, a sugar chain structure estimation unit 27, and an estimation result display processing unit 28.
  • the analysis condition setting unit 24 includes a sialic acid binding mode-specific chemical modification condition setting unit 241 which is a characteristic of the present embodiment as a lower functional block, and the sugar chain theoretical mass-to-charge ratio calculation unit 26 includes the sialic acid binding.
  • the mode-specific chemical modification-compatible mass change calculation unit 261 is included as a lower functional block.
  • the mass spectrometric unit 1 may be of any type, but it is generally desirable that mass accuracy and mass resolution be high. Therefore, a time-of-flight mass spectrometer (TOFMS) or a Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer (FT-ICRMS) is used. ) Is useful.
  • TOFMS time-of-flight mass spectrometer
  • FT-ICRMS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer
  • ionization method in the mass spectrometer a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method, an electrospray ionization (ESI) method, a probe electrospray ionization (PESI) method, or the like can be used.
  • MALDI method is preferable in that valence ions are mainly generated.
  • ordinary mass spectrometry without ion dissociation operation is often sufficient for structural analysis of the sugar chain including the number of sialic acid modifying the sugar chain and the binding mode.
  • MS n analysis in which n is 2 or more to obtain MS n spectrum data.
  • CID collision induced dissociation
  • the mass spectrometric unit 1 may use a liquid chromatograph mass spectroscope (LC-MS) instead of the mass spectroscope alone, or the eluate separated into components by the liquid chromatograph is fractionated / fractionated. Then, a plurality of samples may be prepared, and each of the plurality of samples may be subjected to mass analysis by a mass spectrometer.
  • LC-MS liquid chromatograph mass spectroscope
  • the substance of the data analysis unit 2 is a general-purpose personal computer or a workstation with higher performance, and a dedicated data processing program installed in such a computer causes the computer to operate, as shown in FIG. The function of each functional block is realized.
  • This data processing program corresponds to the sugar chain structure analysis program according to the present invention.
  • the input unit 3 is a keyboard or pointing device (mouse or the like) attached to the computer
  • the display unit 4 is a monitor also attached to the computer.
  • the data processing program can be stored in a non-transitory recording medium such as a CD-ROM, a DVD-ROM, a memory card, and a USB memory (dongle) and provided to the user. Alternatively, it may be provided to the user in the form of data transfer via a communication line such as the Internet.
  • a sample containing sugar chains is pretreated by chemical modification specific to the sialic acid binding mode, and the treated sample is treated.
  • Mass spectrometry is performed by the mass spectrometric section 1 to obtain mass spectrum data over a predetermined mass-to-charge ratio range.
  • the sialic acid binding mode-specific chemical modification is carried out by reacting a sugar chain sample in the presence of a dehydration condensing agent containing an amine and a carbodiimide, as described in Patent Document 1 and Non-Patent Documents. I shall.
  • a lactone is formed as a modified product when the sialic acid contained in the sugar chain is ⁇ 2,3 linked, and a modified product is formed when the sialic acid contained in the sugar chain is ⁇ 2,6 linked.
  • An amide is formed, and the masses of the modified products differ from each other even though the composition of the original sugar chain is the same.
  • the mass spectrum data obtained by the mass spectrometric analysis unit 1 for the sample processed by the above-mentioned chemical modification is input to the data analysis unit 2 and stored in the data storage unit 21.
  • the peak detection unit 22 detects peaks in the collected mass spectrum data according to a predetermined algorithm, acquires the mass-to-charge ratio value of each peak and the signal intensity, and creates a peak list. Then, the created peak list is temporarily stored in the data storage unit 21. This peak list becomes the data to be analyzed by the sugar chain structure analysis unit 23.
  • FIG. 3 is a diagram showing the main window 50 in a state where the “Sialic Acid Modification” setting tab 52, which is one of the tabs, is opened.
  • “Sialic Acid Modification” setting tab 52 "Data” setting tab, "Residue” setting tab, “Labelling” setting tab, "Ion Species” setting tab, "Salt Formation” setting tab, result display (in FIG.
  • a “Results”) tab is prepared, and the tab can be easily switched by clicking an arbitrary tab in the tab switching area 51.
  • the result display tab is a tab for displaying the analysis result of the sugar chain structure, and the other tabs are tabs for setting the analysis conditions and the like before executing the analysis and for instructing the execution of the analysis.
  • the “Data” setting tab is a tab for the user to select a peak list to be analyzed and to input a numerical value such as a mass tolerance of measurement data. This input determines the allowable error in collating the actually measured ion peak mass-to-charge ratio with the sugar chain theoretical mass-to-charge ratio, which will be described later.
  • the "Residue” setting tab is a tab for the user to set the types of sugars and the conditions of the number of each type when estimating the sugar chain composition.
  • “Residue” setting tab for example, as sugar types, hexose (Hexose), N-acetylhexosamine (N-Acetyl hexosamine), deoxyhexose (Deoxyhexose), N-acetylneuraminic acid (N-Acetyl neuraminic acid), N-glycolyl Monosaccharides containing sialic acid, such as neuraminic acid (N-Glycolyl neuraminic acid), KDN (2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid), and pentose (Pentose), and other molecules
  • selection of phosphorus and sulfur and the conditions of their number can be set. When the number is 0, it means that the sugar or molecule
  • the “Labelling” setting tab is a tab for the user to select the type of modification mainly by a label such as a fluorescent label.
  • a label such as a fluorescent label.
  • 2-aminobenzamide (2-Amino benzamide) or pyridylamine (Pyridylamin) can be selected as a labeling substance.
  • the “Ion Species” setting tab is a tab for the user to select the polarity, valence, and ion species of the ion when the sugar chain is ionized.
  • the “Labelling" setting tab as the ion species, protons (H +) added is in positive ion, a sodium ion (Na +) added, such as potassium ions (K +) additional selectable, in the negative ion proton (H - ) Desorption, chlorine ion (Cl ⁇ ) addition, phosphate ion (H 2 PO 4 ⁇ ) addition, etc. can be selected.
  • the “Salt Formation” setting tab is a tab for the user to set the replacement of the partial structure of the sugar chain without changing the valence.
  • substitution in which a proton is replaced with sodium, potassium, or lithium can be selected, and the upper limit of the number of substitutions can be specified.
  • unmodified (“None” in FIG. 3)
  • five types of predetermined sialic acid binding mode-specific chemical modifications and One of the undefined chemical modifications specific to the sialic acid binding mode (“Other modification” in FIG. 3) can be selected using radio buttons.
  • the information set in the setting target area 53 at that point is for saving the preset setting information. Saved to file.
  • the user clicks the “Load Settings” button 56 the information stored in the setting information storage file is automatically set in the setting target area 53.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a peak list set in the “Data” setting tab.
  • FIG. 6 is a setting example of each item when isopropylamine is used as a sialic acid binding mode-specific chemical modification reagent.
  • FIG. 7 is an example of sugar chain search conditions set on the “Residue” setting tab.
  • FIG. 7 means, for example, that a sugar chain containing a minimum of 3 and a maximum of 15 for hexose is brute force searched.
  • sialic acid it means that a sugar chain that does not contain N-acetylneuraminic acid or contains up to 5 sugar chains is brute-force searched.
  • the sugar chain structure analysis unit 23 receives this operation and the Will actually start the analysis process.
  • the glycan core structure mass calculation unit 25 obtains all possible glycan compositions by brute force combinations according to the glycan search conditions set on the “Residue” setting tab.
  • This sugar chain composition does not take into consideration the structure of sugar chains, such as the number of branches.
  • the theoretical mass of the sugar chain is calculated by adding the theoretical mass of the monosaccharide or the like for each assumed sugar chain composition (step S2). What is obtained here is the theoretical mass of the sugar chain before being ionized and without modification.
  • the sugar chain theoretical mass-to-charge ratio calculation unit 26 calculates the theoretical mass charges when each sugar chain having a different composition is ionized, modified, or substituted with an ionic species set as the above search condition.
  • the ratio is calculated (step S3). For example, when isopropylamine is used as the chemical modification reagent specific to the sialic acid binding mode as in the setting example shown in FIG. 6, the modification results in 13.0316 for ⁇ 2,3-sialic acid and ⁇ 2,6-sialic acid for ⁇ 2,3-sialic acid.
  • the acid increases the mass by 41.629.
  • the mass-to-charge ratio is increased by 13.0316 ⁇ n with respect to the mass-to-charge ratio of sugar chain ions.
  • the mass-to-charge ratio is increased by 41.0629 ⁇ n with respect to the mass-to-charge ratio of sugar chain ions.
  • the sugar chain structure estimating unit 27 compares the mass-to-charge ratio values (measured values) of the ion peaks listed in the given peak list with the theoretical mass-to-charge ratios (theoretical values) of the respective sugar chains calculated in step S3. And are sequentially compared. That is, the deviation between the measured value and the theoretical value of the mass-to-charge ratio value is calculated for each ion peak (step S4), and a sugar chain whose deviation falls within a preset tolerance is selected as a sugar chain corresponding to the ion peak. It is extracted as a structure candidate (step S5).
  • the number of theoretically estimated sugar chains (modified forms) is enormous, and thus it is general that a plurality of sugar chain structure candidates are associated with one ion peak.
  • the sugar chain contains sialic acid
  • the sugar chain structure corresponding to the sugar chain and having different theoretical mass-to-charge ratios contains information on the binding mode of sialic acid. That is, it has information indicating whether the sialic acid is ⁇ 2,3 bond type or ⁇ 2,6 bond type.
  • each sugar chain structure candidate is associated with information on the deviation of the mass-to-charge ratio. Therefore, the estimation result display processing unit 28 creates a screen of a sugar chain structure candidate including information on the binding mode of sialic acid for each ion peak, and when the user opens the result display tab, the sugar is displayed in the tab. A list of chain structure candidates is displayed (step S6).
  • FIG. 4 shows the estimation results of sugar chain structures for sugar chain ions when sialic acid binding mode-specific chemical modification was performed using isopropylamine. This result is the estimation result of the sugar chain structure under the conditions shown in FIGS. 5 to 7.
  • the first sugar chain composition candidate corresponding to the ion peak at m / z 2471.88 contains “Neu5Ac (a2,3)”, and thus a sugar chain having one ⁇ 2,3-sialic acid is used. is there.
  • the first sugar chain composition candidate corresponding to the ion peak at m / z 2499.92 contains both “Neu5Ac (a2,3)” and “Neu5Ac (a2,6)”, and therefore one ⁇ 2 , 6-sialic acid and one ⁇ 2,3-sialic acid.
  • the binding mode is also displayed as information, so that the user can select not only the number of sialic acids contained in the sugar chain composition but also each sialic acid. It is also possible to obtain information on the binding mode of.
  • the chemical modification reagent used in the pretreatment for grasping the sialic acid binding mode is simply selected as one of the search conditions. Information on the binding mode of sialic acid as well as the number of sialic acids contained in the chain can be obtained.
  • a sugar chain structure having a core structure was presumed to be exhaustive under the limitation of the kind and the number of sugars and the like set in advance.
  • a sugar chain structure having a core structure may be obtained using a sugar chain structure database.
  • various sugar chain structures and mass information corresponding thereto are recorded in the sugar chain structure database, and the user searches the range of sugar chain masses instead of setting the conditions for estimating the sugar chain composition.
  • the sugar chain core structure mass calculation unit 25 may perform a database search with the set mass as a condition to estimate a sugar chain structure candidate that satisfies the condition.

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Abstract

本発明の一態様の糖鎖構造解析装置では、解析条件を設定するための複数のタブの一つをシアル酸結合様式特異的化学修飾に関する条件設定専用とし、主要な化学修飾試薬をユーザが選択できるようにしている。これら試薬が選択される場合、結合様式毎の質量変動は自動的に設定される。また、既定の化学修飾以外の化学修飾の使用時に、ユーザは結合様式毎の質量変動量を数値で入力すればよい。解析時には、一つの化学修飾に対応して結合様式によって異なるm/z値の複数の糖鎖構造候補の理論m/zと、実測のイオンピークのm/zと、の照合が一括して行われる。これにより、シアル酸結合様式特異的化学修飾試薬を用いた化学修飾によりシアル酸の結合様式を含む糖鎖の構造解析を行う際に、解析に伴うユーザの作業の手間を軽減し解析の効率を向上させることができる。

Description

糖鎖構造解析装置、及び糖鎖構造解析用プログラム
　本発明は、質量分析を利用して糖鎖の構造を解析する糖鎖構造解析装置、及びコンピュータ上で糖鎖の構造を解析するための糖鎖構造解析用プログラムに関し、さらに詳しくは、糖鎖に結合しているシアル酸の結合様式を含めた糖鎖の構造解析が可能である糖鎖構造解析装置、及び糖鎖構造解析用プログラムに関する。なお、ここでいう「糖鎖」は単独で存在する糖鎖のみならず、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸などの生体分子を修飾している状態の糖鎖、つまりは糖鎖の修飾体を含むものとする。
　生体内におけるタンパク質やペプチドなどの生体分子の生合成の過程は精緻に制御されている。そのため、生合成の過程で生成される糖鎖修飾を受けた生体分子は生命活動において重要な役割を担っていると考えられてきたが、近年、特に生理機能や疾患との関連について、糖鎖分子レベルでの具体的な報告が数多くなされている。こうしたことから、生命現象における様々な過程に関わる生体分子を修飾する糖鎖の構造を明らかにすることは、生命現象の解明や創薬・診断に役立つものと期待されている。
　糖の一種であるシアル酸はタンパク質の品質管理や神経における情報伝達、或いは細胞間の認識などにおいて重要な物質であると考えられていたが、最近、糖鎖の末端に対するシアル酸残基の付き方、つまりは結合様式の相違がそうした生体活動に重要であることが解明されつつある。そのため、糖鎖へのシアル酸の結合様式を把握することは、糖鎖構造解析における一つの重要な作業である。
　例えば、ヒトの場合、シアル酸の結合様式として、α２，３結合型とα２，６結合型とが主として知られている。その結合様式は細胞の癌化に伴って変化することが分かっており、結合様式をバイオマーカーとして利用したり、バイオ医薬品の品質管理等に利用したりすることが期待されている。しかしながら、結合様式のみが異なるシアル酸を含有する糖鎖異性体には質量差がないため、糖鎖分析に広く用いられている質量分析装置による結合様式の判別は難しい。また、一般に、シアル酸は糖鎖から解離し易く不安定であるため、検出感度や定量性の低さが課題であった。このため、迅速に且つ正確にシアル酸の結合様式を解析できる手法の開発が強く望まれている。
　こうしたことを背景として、シアル酸の構造を安定化し、且つ、結合様式の相違をスループットの高い質量分析装置で判別できるようにするために、シアル酸の結合様式に特異的な化学修飾の手法が開発されている。例えば、特許文献１、非特許文献１には、糖鎖を含む分析対象試料と、イソプロピルアミン等のアミン及びカルボジイミドを含む脱水縮合剤とを反応させることで、α２，３－シアル酸を有する糖鎖の修飾体としてラクトンを生成させるとともに、α２，６－シアル酸を有する糖鎖の修飾体としてアミドを生成させる手法が開示されている。また、上記文献には、いくつかの別の化学修飾法も記載されている。
　上述したようなシアル酸結合様式に特異的な化学修飾の手法で以て処理された糖鎖の組成や構造を解析するには、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）－飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦＭＳ）などを用いて質量分析を実施し、それにより収集されたデータをコンピュータで解析するという作業が必要である。糖鎖について質量分析により得られたデータから糖鎖組成やその構造を求めるためのコンピュータソフトウェアは、従来いくつか知られている。代表的なものとして、グリコ－ピークファインダ「Glyco-peakfinder」（非特許文献２参照）やシムグリカン「SimGlycan」（登録商標）（非特許文献３参照）などがある。
　「Glyco-peakfinder」は、実測で得られたマススペクトル上のピーク（以下「イオンピーク」という）の質量電荷比値に対し所定の許容誤差の下で質量が合致する糖鎖組成を、様々な単糖の組合せについて総当たり的に調べるものである。一方、「SimGlycan」は、実測で得られたＭＳ／ＭＳスペクトル上のピークの質量電荷比に対応する糖鎖の組成や構造を、そのソフトウェアの製造メーカが独自に構築したデータベースを用いたデータベース検索により求めるものである。
　こうした既存の糖鎖解析用ソフトウェアでは、糖鎖修飾体を含めた糖鎖誘導体の解析も可能である。しかしながら、そうしたソフトウェアでは、シアル酸結合様式に特異的な化学修飾手法による糖鎖修飾体の解析を行うことまでは想定されていない。そのため、例えば総当たり検索を行う場合には、或る一種類のシアル酸結合様式特異的化学修飾試薬を用いたときにシアル酸の結合様式の相違によって生成される複数の異なる修飾体を、複数種類の異なる質量を持つ単糖残基として探索する必要がある。Ｎ種類のシアル酸について、それぞれ２種類の結合様式を想定した場合、２×Ｎ個のシアル酸修飾体をユーザ自身が調べて探索対象の単糖残基として追加的に入力する必要がある。一般に、ユーザが検索対象として独自に追加できる単糖残基数にはソフトウェア上で上限が設けられており、必要な全ての種類のシアル酸の組合せを検索できるとは限らないことが問題となる。この場合に探索対象を増やすためには、検索条件を変えて複数の検索を実行する必要があり、多大な手間と時間が掛かる。また、修飾体の追加的な入力設定に手間が掛かるのみならず、設定ミスを引き起こし易いという問題もある。
特開２０１６－１９４５００号公報
西風　隆司、ほか５名、「ディファレンティエイション・オブ・シアリル・リンケージ・アイソマーズ・バイ・ワン-ポット・サイアリック・アシッド・デリバタイゼイション・フォー・マス・スペクトロメトリ-ベースド・グリカン・プロファイリング（Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling）」、アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）、2017年、Vol.89、pp.2353-2360 マアース（K. Maass）、ほか４名、「グリコ-ピークファインダ　デ・ノボ・コンポジション・アナリシス・オブ・グリココンジュゲイツ（"Glyco-peakfinder" -De novo composition analysis of glycoconjugates）」、プロテオミクス（Proteomics）、2007年、Vol.7、No.24、pp.4435-4444 アプテ（A. Apte）、ほか１名、「バイオインフォマティックス・イン・グリコミクス：グリカン・キャラクタリゼイション・ウィズ・マス・スペクトロメトリック・データ・ユージング・シムグリカン（Bioinformatics in Glycomics: Glycan Characterization with Mass Spectrometric Data Using SimGlycan）」、ファンクショナル・グリコミック（Functional Glycomic）、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods in Molecular Biology）、ヒューマン・プレス（Humana Press）、2010年、pp.269-281
　本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主たる目的は、シアル酸結合様式に特異的な化学修飾を行った糖鎖を含む試料に対するマススペクトルデータに基づいて、シアル酸の結合様式を含む糖鎖構造を解析する際に、ユーザによる面倒な検索条件の設定などの作業の手間を軽減するとともに、解析を効率良く行うことができる糖鎖構造解析装置、及びコンピュータ用の糖鎖構造解析用プログラムを提供することである。
　上記課題を解決するために成された本発明の第１の態様に係る糖鎖構造解析装置は、シアル酸結合様式に特異的な化学修飾試薬を用いて前処理されたシアル酸結合糖鎖又は該シアル酸結合糖鎖により修飾された分子、を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータに基づいて、シアル酸結合糖鎖の構造を解析する糖鎖構造解析装置であって、
　解析対象のイオン種、該イオン種の電荷の極性、及び、修飾によって糖鎖の質量変動を生じる質量変動因子、をユーザが設定するための条件設定部と、
　複数種類で且つ複数個の単糖残基で構成されるコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを取得する糖鎖コア構造情報取得部と、
　前記糖鎖コア構造情報取得部で取得された種々の糖鎖に対し、前記条件設定部で設定された質量変動因子に基づいて質量を増加又は減少させることで糖鎖理論質量電荷比を求める理論質量算出部と、
　前記糖鎖理論質量電荷比を、与えられたマススペクトルデータにおけるイオンピークの質量電荷比と照合することで、糖鎖の構造を推定する糖鎖構造推定部と、
　を備え、前記条件設定部は、質量変動因子の一つとしてシアル酸の結合様式に特異的な化学修飾を他の修飾とは独立にユーザが設定することが可能であるシアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定部を有し、
　前記理論質量算出部は、前記シアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定部で設定された化学修飾に対応してシアル酸結合様式毎に質量を増加又は減少させた糖鎖理論質量電荷比を求めるものである。
　また上記課題を解決するために成された本発明の第１の態様に係る糖鎖構造解析用プログラムは、上記第１の態様に係る糖鎖構造解析装置における機能を実現するためのコンピュータプログラムであり、シアル酸結合様式に特異的な化学修飾試薬を用いて前処理されたシアル酸結合糖鎖又は該シアル酸結合糖鎖により修飾された分子、を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータに基づいて、シアル酸結合糖鎖の構造を解析するための糖鎖構造解析用プログラムであって、コンピュータを、
　解析対象のイオン種、該イオン種の電荷の極性、及び、修飾によって糖鎖の質量変動を生じる質量変動因子、をユーザに設定させる条件設定機能部と、
　複数種類で且つ複数個の単糖残基で構成されるコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを取得する糖鎖コア構造情報取得機能部と、
　前記糖鎖コア構造情報取得機能部により取得された種々の糖鎖に対し、前記条件設定機能部により設定された質量変動因子に基づいて質量を増加又は減少させることで糖鎖理論質量電荷比を求める理論質量算出機能部と、
　前記糖鎖理論質量電荷比を、与えられたマススペクトルデータにおけるイオンピークの質量電荷比と照合することで糖鎖の構造を推定する糖鎖構造推定機能部と、
　して動作させ、前記条件設定機能部は、質量変動因子の一つとしてシアル酸の結合様式に特異的な化学修飾であるシアル酸結合様式特異的化学修飾を他の修飾とは独立にユーザに設定させ、
　前記理論質量算出機能部は、設定された前記シアル酸結合様式特異的化学修飾に対応して、シアル酸結合様式毎に質量を増加又は減少させた糖鎖理論質量電荷比を求めるものである。
　なお、上記第１の態様に係る糖鎖構造解析用プログラムは、汎用パーソナルコンピュータ、より高性能なコンピュータ、又は、各種のシステムに組み込まれた専用のコンピュータ、などを動作させるプログラムである。こうしたプログラムは、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、メモリカード、ＵＳＢメモリ（ドングル）などの、非一時的な記録媒体に収録されてユーザに提供されるようにすることができる。或いは、インターネットなどの通信回線を介したデータ転送の形式で、ユーザに提供されるようにすることもできる。もちろん、ユーザがシステムを新規に購入する場合、該システムに含まれるコンピュータに上記態様に係る糖鎖構造解析用プログラムを予め組み込んでおくこともできる。
　本発明において、シアル酸結合糖鎖により修飾された分子とは例えば、シアル酸結合糖鎖により修飾されたタンパク質、ペプチド、脂質、核酸などの生体分子である。また、本発明において前提となる、シアル酸結合様式に特異的な化学修飾試薬を用いた前処理は、例えば特許文献１、非特許文献１に開示されているものであるが、それに限るものでなく、例えばα２，３結合型、α２，６結合型、さらにはα２，８結合型などの少なくとも２以上の異なるシアル酸の結合様式を識別するための特異的な化学修飾を行うものであればよい。
　また、シアル酸結合糖鎖等を含む試料に対して質量分析を行うための質量分析装置の種類や方式は、特に限定されないが、例えば、イオントラップ型質量分析装置、リニアイオントラップ型質量分析装置、ＴＯＦ／ＴＯＦ型質量分析装置、四重極－飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ型）質量分析装置、四重極－イオントラップ型質量分析装置、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置などが利用可能である。
　本発明の第１の態様に係る糖鎖構造解析装置において、条件設定部は例えば表示部の画面上に所定の条件設定用ウインドウを表示し、該ウインドウ上で入力されたり選択されたりした情報を受け付ける。このとき、糖鎖構造解析のための検索条件として、解析対象であるイオン種、該イオン種の電荷の極性、及び、質量変動因子、をユーザが設定できるようになっており、特に、質量変動因子の一つとしてシアル酸の結合様式に特異的な化学修飾を他の修飾とは独立にユーザが設定できるようになっている。即ち、糖鎖への修飾としては、蛍光標識などのための還元末端への修飾などもしばしば行われるが、これとは別に、結合様式に特異的な化学修飾についての情報を設定できるようになっている。
　具体的には例えば、メインの設定画面とは異なる、独立したウインドウやタブで、結合様式に特異的な化学修飾による質量変動因子を設定可能とすることができる。また、一つのウインドウ内に配置された、複数に分割された表示領域のうちの一つにおいて結合様式に特異的な化学修飾による質量変動因子を設定可能とすることもできる。
　解析が開始されると、まず糖鎖コア構造情報取得部は、複数の単糖残基で構成されるコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを取得する。コア構造を有する糖鎖の情報を得るために、具体的には、理論的に構成可能である糖鎖を総当たり的に求めていく方法と、既存の糖鎖構造データベースを用いたデータベース検索により求める方法とが考えられる。
　即ち、本発明に係る糖鎖構造解析装置の一実施態様として、前記糖鎖コア構造情報取得部は、単糖残基の種類とその数の制約条件の下で想定される糖鎖構造を総当たり的に推定してコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを求める構成とすることができる。
　また別の実施態様として、各種の糖鎖構造と質量とが収録されている糖鎖構造データベースをさらに備え、
　前記糖鎖コア構造情報取得部は、ユーザにより設定された糖鎖の質量情報に基づいて前記糖鎖構造データベースに収録されている情報を検索することにより、コア構造を有する種々の糖鎖を求める構成としてもよい。
　糖鎖コア構造情報取得部で得られる糖鎖は、修飾や置換、イオン化の際の特定物質の付加などが無い状態のものである。これに対し理論質量算出機能部は、条件設定部により設定された質量変動因子に基づいて質量を増加又は減少させることで、イオンとして質量分析により検出されるときの糖鎖の理論質量電荷比を計算する。このとき、シアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定部で化学修飾が設定されている場合には、その化学修飾に対応してシアル酸結合様式毎に異なる質量を増加又は減少させた糖鎖理論質量電荷比を算出する。例えばα２，３結合型とα２，６結合型とを識別可能な化学修飾であれば、その二つの結合様式それぞれに異なる質量だけ糖鎖の質量が増加し、１種類のコア糖鎖構造にＮ個のシアル酸が含まれる場合に、Ｎ＋１(＝N+2ＣN）個の異なる糖鎖理論質量電荷比が求まることになる。
　糖鎖構造推定機能部は、上記算出された糖鎖理論質量電荷比を、与えられたマススペクトルデータにおけるイオンピークの質量電荷比と照合する。そして、質量電荷比の偏差が所定の許容範囲に収まるものをイオンピーク毎に選択して、そのイオンピークに対応する糖鎖の候補とする。上述したように、元のコア構造が同一である糖鎖に対しシアル酸結合様式の相違によって糖鎖理論質量電荷比が相違する二つ以上の修飾後の糖鎖イオンの質量電荷比が求まるから、その二つ以上の糖鎖イオンとイオンピークとの対応を一度に求めることができる。
　また本発明に係る糖鎖構造解析装置において、好ましくは、前記糖鎖構造推定部により推定された糖鎖構造の情報を表示部に表示させる表示処理部をさらに備え、
　該表示処理部は、推定された糖鎖構造にシアル酸が含まれていて結合様式の識別が可能である場合に、シアル酸毎に結合様式を示す情報を付加して表示させる構成とするとよい。
　具体的には、α２，３結合型とα２，６結合型との識別が可能な化学修飾の場合には、「α２，３－」と「α２，６－」を示す文字情報や記号などが糖鎖組成に付加されて表示されるものとすることができる。これにより、ユーザはシアル酸の結合様式の相違を一目で把握することができる。
　なお、本発明に係る糖鎖構造解析装置において、前記シアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定部は、既定のシアル酸結合様式特異的化学修飾を選択可能であるとともに、それ以外の化学修飾についてシアル酸結合様式毎の質量変動値を入力可能であるものとすることができる。
　これにより、ユーザが、一般に頻用される既定のシアル酸結合様式特異的化学修飾を使用する場合には、簡単な選択操作のみでシアル酸結合様式特異的化学修飾を選択することができる。また、あまり一般的でない、又は従来は使用されていないシアル酸結合様式特異的化学修飾を使用する場合でも、シアル酸結合様式毎の質量変動値を直接入力することで、そうした化学修飾に対応する糖鎖構造の推定を実施することができる。
　本発明によれば、シアル酸の結合様式に特異的な化学修飾を使用した糖鎖構造解析において、一種の糖鎖に含まれるシアル酸の結合様式の相違に応じて異なる質量電荷比の複数の糖鎖（糖鎖修飾体）の構造を、１種類のシアル酸結合様式特異的化学修飾の設定及び一度の解析処理によって過不足なく探索することができる。それにより、シアル酸の結合様式を含めた糖鎖構造解析における、ユーザによる面倒な検索条件の設定などの作業の手間を軽減することができる。また、解析処理に要する時間を短縮し、解析のスループットを向上させることができる。
　また本発明によれば、主要なシアル酸の結合様式に特異的な化学修飾試薬を用いる場合に、予め用意された複数の選択肢の中からユーザが使用するものを選択しさえすればよく、ユーザ自身が質量変動量等を調べて手入力する必要がない。そのため、作業の手間が軽減されるとともに、手
入力による作業ミスも抑えることができる。
本発明の一実施例である糖鎖構造解析システムの概略ブロック構成図。 本実施例の糖鎖構造解析システムにおける解析処理手順のフローチャート。 本実施例の糖鎖構造解析システムにおいてシアル酸結合様式特異的化学修飾をユーザが設定するためのタブの一例を示す図。 本実施例の糖鎖構造解析システムにおける糖鎖構造推定結果の表示例を示す図。 解析対象とされるイオンピークの質量電荷比値の一例を示す図。 ユーザにより設定された検索条件の一例を示す図。 コア糖鎖構造を総当たり的に求める際の制約条件の一例を示す図。
　まず本発明の一実施例である糖鎖構造解析システムについて、添付図面を参照して説明する。
　図１は、本実施例の糖鎖構造解析システムの概略ブロック構成図である。図１に示すように、本システムは、試料に対して測定を実行する質量分析部１と、解析処理を実行するデータ解析部２と、ユーザインターフェイスである入力部３及び表示部４と、を備える。データ解析部２は、データ格納部２１と、ピーク検出部２２と、糖鎖構造解析部２３とを含み、糖鎖構造解析部２３は、解析条件設定部２４、糖鎖コア構造質量計算部２５、糖鎖理論質量電荷比計算部２６、糖鎖構造推定部２７、及び、推定結果表示処理部２８を機能ブロックとして含む。さらに、解析条件設定部２４は、本実施例に特徴的であるシアル酸結合様式特異的化学修飾条件設定部２４１を下位の機能ブロックとして含み、糖鎖理論質量電荷比計算部２６はシアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変化算出部２６１を下位の機能ブロックとして含む。
　質量分析部１は特にその方式を問わないが、一般に質量精度や質量分解能が高いことが望ましいことから、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦＭＳ）、或いはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置（ＦＴ－ＩＣＲＭＳ）などが有用である。また、質量分析装置におけるイオン化法としては、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法のほか、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、探針エレクトロスプレーイオン化（ＰＥＳＩ）法などを用いることもできるが、１価イオンの発生が主であるという点でＭＡＬＤＩ法が好適である。
　また、後述するように、糖鎖を修飾しているシアル酸の数や結合様式を含めた糖鎖の構造解析には、イオンの解離操作を伴わない通常の質量分析で十分であることが多いが、例えば糖鎖が結合しているペプチド等の構造解析を行うには、ｎが２以上であるＭＳn分析を実行してＭＳnスペクトルデータを取得するのが一般的である。その場合には、質量分析部１としては、イオントラップやコリジョンセルなど、衝突誘起解離（ＣＩＤ）等によりイオンを解離させる機能を有する質量分析装置を用いる。
　また、質量分析部１は質量分析装置単独ではなく、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を用いてもよいし、或いは、液体クロマトグラフで成分分離された溶出液を分取・分画して複数の試料を調製し、その複数の試料をそれぞれ質量分析装置で質量分析する構成でもよい。
　本システムにおいて、データ解析部２の実体は汎用のパーソナルコンピュータ又はより性能の高いワークステーションであり、そうしたコンピュータにインストールされた専用のデータ処理用プログラムを該コンピュータにおいて動作させることで図１に示したような各機能ブロックの機能が実現される。このデータ処理用プログラムが本発明に係る糖鎖構造解析用プログラムに相当する。この場合、入力部３はコンピュータに付設されたキーボードやポインティングデバイス（マウスなど）であり、表示部４は同じくコンピュータに付設されたモニタである。上記データ処理用プログラムは、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、メモリカード、ＵＳＢメモリ（ドングル）などの、非一時的な記録媒体に収録されてユーザに提供されるようにすることができる。或いは、インターネットなどの通信回線を介したデータ転送の形式で、ユーザに提供されるようにすることもできる。
　本実施例のシステムにより糖鎖構造解析を実行する際には、糖鎖を含む試料（糖鎖試料）に対しシアル酸結合様式特異的化学修飾による前処理を実施し、その処理済みの試料を質量分析部１で質量分析することにより、所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルデータを取得する。ここでは一例として、シアル酸結合様式特異的化学修飾は、特許文献１、非特許文献に記載されているような、アミン及びカルボジイミドを含む脱水縮合剤の存在下で糖鎖試料に対する反応を実施するものとする。この場合、糖鎖に含まれるシアル酸がα２，３結合型である場合には修飾体としてラクトンが形成され、糖鎖に含まれるシアル酸がα２，６結合型である場合には修飾体としてアミドが形成され、元の糖鎖の組成は同じでも修飾体の質量は互いに相違する。上述したような化学修飾による処理済みの試料に対し質量分析部１で得られたマススペクトルデータがデータ解析部２に入力され、データ格納部２１に保存される。
　データ解析部２においてピーク検出部２２は収集されたマススペクトルデータについて所定のアルゴリズムに従ってピークを検出し、各ピークの質量電荷比値と信号強度とを取得してピークリストを作成する。そして、作成したピークリストをデータ格納部２１に一旦保存する。このピークリストが糖鎖構造解析部２３による解析対象のデータとなる。
　糖鎖構造解析を行う際に、ユーザが入力部３から所定の操作を行うと、この操作を受けて解析条件設定部２４は表示部４の画面上にメインウインドウを表示する。メインウインドウは切替え可能な複数のタブから構成される。図３は、タブの一つである「Sialic Acid Modification」設定タブ５２が開かれた状態のメインウインドウ５０を示す図である。この「Sialic Acid Modification」設定タブ５２のほか、「Data」設定タブ、「Residue」設定タブ、「Labelling」設定タブ、「Ion Species」設定タブ、「Salt Formation」設定タブ、結果表示（図３では「Results」）タブが用意されており、タブ切替領域５１において任意のタブをクリックすることで簡単にタブの切替えが行える。
　結果表示タブは糖鎖構造の解析結果を表示するタブであり、それ以外のタブは解析の実行前に解析の条件等を設定したり解析の実行を指示したりするためのタブである。
　各タブについて、概略的に説明する。
　「Data」設定タブは、ユーザが解析対象のピークリストを選択するとともに、測定データの質量許容誤差等の数値を入力するためのタブである。この入力により、後述する、実測のイオンピークの質量電荷比と糖鎖理論質量電荷比とを照合する際の許容誤差が決まる。
　「Residue」設定タブは、糖鎖組成を推定する際の糖等の種類とその種類毎の個数の条件とをユーザが設定するためのタブである。「Residue」設定タブでは、例えば糖の種類として、ヘキソース（Hexose）、Ｎアセチルヘキソサミン（N-Acetyl hexosamine）、デオキシヘキソース（Deoxyhexose）、Ｎアセチルノイラミン酸（N-Acetyl neuraminic acid）、Ｎグリコリルノイラミン酸（N-Glycolyl neuraminic acid）、ＫＤＮ（2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid）、ペントース（Pentose）などのシアル酸を含む単糖類や、そのほかの分子としてリンや硫黄などについての選択とそれらの個数の条件が設定可能となっている。なお、個数を０とした場合には、その糖や分子を含まないことを意味する。
　「Labelling」設定タブは、主として蛍光標識等のラベル標識による修飾の種類をユーザが選択するためのタブである。「Labelling」設定タブでは、例えば、標識物質として２－アミノベンズアミド（2-Amino benzamide）やピリジルアミン（Pyridylamin）などが選択可能となっている。
　「Ion Species」設定タブは、糖鎖がイオン化したときのイオンの極性、価数、及び、イオン種をユーザが選択するためのタブである。「Labelling」設定タブでは、イオン種として、正イオンではプロトン（Ｈ+）付加、ナトリウムイオン（Ｎａ+）付加、カリウムイオン（Ｋ+）付加などが選択可能であり、負イオンではプロトン（Ｈ-）脱離、塩素イオン（Ｃｌ-）付加、リン酸イオン（Ｈ2ＰＯ4 -）付加などが選択可能となっている。
　「Salt Formation」設定タブは、価数変化を伴わない糖鎖の部分構造の置換をユーザが設定するためのタブである。「Salt Formation」設定タブでは、プロトンがナトリウム、カリウム、又はリチウムに置き換わる置換が選択可能であり、さらにその置換の数の上限が指定可能となっている。
　シアル酸結合様式特異的化学修飾条件設定部２４１により表示される、図３に示した「Sialic Acid Modification」設定タブ５２は、シアル酸結合様式特異的化学修飾の種類をユーザが選択するためのタブである。「Sialic Acid Modification」設定タブ５２では、図３に示すように、設定対象領域５３において、非修飾（図３中の「None」）、５種類の既定のシアル酸結合様式特異的化学修飾、及び未定義のシアル酸結合様式特異的化学修飾（図３中の「Other modification」）のうちの一つが、ラジオボタンを用いて選択可能となっている。５種類の既定のシアル酸結合様式特異的化学修飾についてはそれぞれ、二つの結合様式、つまりはα２，３結合とα２，６結合とにそれぞれ対応して既知である化学式の変化に基づく質量変動量（図３中の「Mass Change」）が定義されている。これにより、イソプロピルアミンなどの比較的高い頻度で利用される化学修飾については、ユーザが簡便に選択することができる。
　また、既定の化学修飾以外の、未定義の化学修飾試薬を用いる場合には、「Other Modification」を選択したうえで、ユーザはα２，３結合とα２，６結合とにそれぞれ対応する化学式の変化に基づく質量変動量を数値で入力する。これにより、ここで想定されていない新規な或いはあまり一般的でない化学修飾試薬が使用されるときでも、簡便な作業で以て解析を進めることができる。なお、図３に示した「Sialic Acid Modification」設定タブ５２上でユーザが「Default」ボタン５４をクリック操作すると、設定対象領域５３内の情報が予め指定されているファイルに登録されているデフォルト状態に戻る。
　また、「Sialic Acid Modification」設定タブ５２上でユーザが「Save Settings」ボタン５７をクリック操作すると、その時点において設定対象領域５３内で設定されている情報が、予め指定されている設定情報保存用ファイルに保存される。一方、ユーザが「Load Settings」ボタン５６をクリック操作すると、設定情報保存用ファイルに保存されている情報が設定対象領域５３内に自動的に設定される。これにより、例えば、簡単な操作で、過去に実施した解析と同じ条件での解析を行うことができる。
　ユーザは、上述したようにメインウインドウ５０の各タブにおいて解析条件について適宜の設定を行う（ステップＳ１）。図５は「Data」設定タブで設定されるピークリストの例を示す図である。図６は、イソプロピルアミンをシアル酸結合様式特異的化学修飾試薬として用いた場合の各項目の設定例である。また図７は、「Residue」設定タブ上で設定される糖鎖検索条件の一例である。図７は例えば、ヘキソースについては最小３個、最大１５個を含む糖鎖を総当たり的に探索することを意味している。また、シアル酸については、Ｎアセチルノイラミン酸を含まないか或いは最大５個まで含む糖鎖を総当たり的に探索することを意味している。
　「Sialic Acid Modification」設定タブ５２（又は他の設定タブ）上でユーザが「Analyze」ボタン５５をクリック操作すると、この操作を受けて糖鎖構造解析部２３は、設定されている解析条件の下で実際に解析処理を開始する。
　即ち、まず糖鎖コア構造質量計算部２５は、「Residue」設定タブ上で設定された糖鎖検索条件に従って総当たり的な組み合わせにより、想定される糖鎖組成を全て求める。この糖鎖組成は糖鎖の構造、例えば分枝数などを考慮しないものである。そして、想定した糖鎖組成毎に、単糖等の理論質量を加算することで糖鎖の理論質量を計算する（ステップＳ２）。ここで求まるのは、修飾等がなされない状態で、且つイオン化される前の糖鎖の理論質量である。
　糖鎖理論質量電荷比計算部２６は、組成が相違する各糖鎖に対し、上記の検索条件として設定されているイオン種へのイオン化、修飾、或いは置換などが行われたときの理論質量電荷比を計算する（ステップＳ３）。例えば、図６に示した設定例にあるようにシアル酸結合様式特異的化学修飾試薬としてイソプロピルアミンが使用された場合、修飾により、α２，３－シアル酸では１３．０３１６、α２，６－シアル酸では４１．０６２９だけ質量が増加する。そこで、α２，３－シアル酸をｎ個含む糖鎖では、糖鎖イオンの質量電荷比に対し１３．０３１６×ｎだけ質量電荷比を増加させる。他方、α２，６－シアル酸をｎ個含む糖鎖では、糖鎖イオンの質量電荷比に対し４１．０６２９×ｎだけ質量電荷比を増加させる。ラベル修飾や置換についても同様である。したがって、同じ糖鎖組成の一つの糖鎖から、修飾や置換の相違により、複数の理論質量電荷比が算出される。即ち、糖鎖に少なくとも１個のシアル酸が含まれる場合、そのシアル酸の結合様式の相違が理論質量電荷比に反映される。
　次いで糖鎖構造推定部２７は、与えられたピークリストに挙げられているイオンピークの質量電荷比値（実測値）と、ステップＳ３で算出された各糖鎖の理論質量電荷比（理論値）とを順次照合する。即ち、イオンピーク毎に、質量電荷比値の実測値と理論値との偏差を計算し（ステップＳ４）、その偏差が予め設定された許容誤差に収まる糖鎖をそのイオンピークに対応する糖鎖構造候補として抽出する（ステップＳ５）。通常、理論的に推定された糖鎖（修飾体）の数は膨大であるから、一つのイオンピークに複数の糖鎖構造候補が対応付けられるのが一般的である。糖鎖にシアル酸が含まれる場合、その糖鎖に対応する互いに異なる理論質量電荷比を示す糖鎖構造はシアル酸の結合様式の情報を含む。つまりは、そのシアル酸がα２，３結合型であるかα２，６結合型であるかを示す情報を有している。
　イオンピーク毎に一又は複数の糖鎖構造候補が抽出され、各糖鎖構造候補には質量電荷比の偏差の情報が対応付けられている。そこで推定結果表示処理部２８は、イオンピーク毎に、シアル酸の結合様式の情報を含む糖鎖構造候補の一覧の画面を作成し、ユーザが結果表示タブを開いたときに、そのタブに糖鎖構造候補の一覧を表示する（ステップＳ６）。
　図４は、イソプロピルアミンを用いてシアル酸結合様式特異的化学修飾を行った場合の糖鎖イオンに対する糖鎖構造の推定結果である。この結果は、図５～図７に示した条件の下での糖鎖構造の推定結果である。
　例えば、図４においてm/z ２４７１．８８のイオンピークに対応する１番目の糖鎖組成候補は「Neu5Ac(a2,3)」を含むから、α２，３－シアル酸を１個有する糖鎖である。また、m/z ２４９９．９２のイオンピークに対応する１番目の糖鎖組成候補は、「Neu5Ac(a2,3)」と「Neu5Ac(a2,6)」とを共に含むから、１個のα２，６－シアル酸と１個のα２，３－シアル酸を有する糖鎖である。このように、糖鎖組成にシアル酸が含まれる場合には、その結合様式が情報として併せて表示されるから、ユーザはその糖鎖組成に含まれるシアル酸の個数だけでなく、各シアル酸の結合様式の情報も得ることができる。
　以上のように本実施例の糖鎖構造解析システムにおけるデータ解析部２では、シアル酸結合様式を把握するために前処理用いた化学修飾試薬を検索条件の一つとして単に選択するだけで、糖鎖に含まれるシアル酸の数だけでなくシアル酸の結合様式の情報を得ることができる。
　なお、上記実施例の糖鎖構造解析システムでは、予め設定された糖等の種類や個数の制限の下で総当たり的にコア構造を有する糖鎖構造を推定していたが、予め作成された糖鎖構造データベースを用いてコア構造を有する糖鎖構造を求めてもよい。その場合、各種の糖鎖構造とそれに対応する質量情報とを糖鎖構造データベースに収録しておき、ユーザは糖鎖組成を推定する際の条件を設定する代わりに糖鎖質量の範囲を探索条件として設定する。糖鎖コア構造質量計算部２５は設定された質量を条件としてデータベース検索を実行し、条件を満たす糖鎖構造候補を推定すればよい。
　また、上記実施例はあくまでも本発明の一例にすぎず、上記記載の変形例以外でも、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
１…質量分析部
２…データ解析部
２１…データ格納部
２２…ピーク検出部
２３…糖鎖構造解析部
２４…解析条件設定部
２４１…シアル酸結合様式特異的化学修飾条件設定部
２５…糖鎖コア構造質量計算部
２６…糖鎖理論質量電荷比計算部
２６１…シアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変化算出部
２７…糖鎖構造推定部
２８…推定結果表示処理部
３…入力部
４…表示部
５０…メインウインドウ
５１…タブ切替領域
５２…「Sialic Acid Modification」設定タブ
５３…設定対象領域
５４…「Default」ボタン
５５…「Analyze」ボタン
５６…「Load Settings」ボタン
５７…「Save Settings」ボタン

Claims (10)

  1. 　シアル酸結合様式に特異的な化学修飾試薬を用いて前処理されたシアル酸結合糖鎖又は該糖鎖により修飾された分子を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータに基づいて、シアル酸結合糖鎖の構造を解析する糖鎖構造解析装置であって、
    　解析対象のイオン種、該イオン種の電荷の極性、及び、修飾によって糖鎖の質量変動を生じる質量変動因子、をユーザが設定するための条件設定部と、
    　複数種類の複数個の単糖残基で構成されるコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを取得する糖鎖コア構造情報取得部と、
    　前記糖鎖コア構造情報取得部で取得された種々の糖鎖に対し、前記条件設定部で設定された質量変動因子に基づいて質量を増加又は減少させることで糖鎖理論質量電荷比を求める理論質量算出部と、
    　前記糖鎖理論質量電荷比を、与えられたマススペクトルデータにおけるイオンピークの質量電荷比と照合することで糖鎖の構造を推定する糖鎖構造推定部と、
    　を備え、前記条件設定部は、質量変動因子の一つとしてシアル酸の結合様式に特異的な化学修飾を他の修飾とは独立にユーザが設定することが可能であるシアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定部を有し、
    　前記理論質量算出部は、前記シアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定部で設定された化学修飾に対応してシアル酸結合様式毎に質量を増加又は減少させた糖鎖理論質量電荷比を求めることを特徴とする糖鎖構造解析装置。
  2. 　請求項１に記載の糖鎖構造解析装置であって、
    　前記糖鎖コア構造情報取得部は、単糖残基の種類とその数の制約条件の下で想定される糖鎖構造を総当たり的に推定してコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを求める、ことを特徴とする糖鎖構造解析装置。
  3. 　請求項１に記載の糖鎖構造解析装置であって、
    　各種の糖鎖構造と質量とが収録されている糖鎖構造データベースをさらに備え、
    　前記糖鎖コア構造情報取得部は、ユーザにより設定された糖鎖の質量情報に基づいて前記糖鎖構造データベースに収録されている情報を検索することにより、コア構造を有する種々の糖鎖を求める、ことを特徴とする糖鎖構造解析装置。
  4. 　請求項１に記載の糖鎖構造解析装置であって、
    　前記糖鎖構造推定部により推定された糖鎖構造の情報を表示部に表示させる表示処理部をさらに備え、
    　該表示処理部は、推定された糖鎖構造にシアル酸が含まれていて結合様式の識別が可能である場合に、シアル酸毎に結合様式を示す情報を付加して表示させる、ことを特徴とする糖鎖構造解析装置。
  5. 　請求項１に記載の糖鎖構造解析装置であって、
    　前記シアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定部は、既定のシアル酸結合様式特異的化学修飾を選択可能であるとともに、それ以外の化学修飾についてシアル酸結合様式毎の質量変動値を入力可能であるものである、ことを特徴とする糖鎖構造解析装置。
  6. 　シアル酸結合様式に特異的な化学修飾試薬を用いて前処理されたシアル酸結合糖鎖又は該糖鎖により修飾された分子を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータに基づいて、シアル酸結合糖鎖の構造を解析するための糖鎖構造解析用プログラムであって、コンピュータを、
    　解析対象のイオン種、該イオン種の電荷の極性、及び、修飾によって糖鎖の質量変動を生じる質量変動因子、をユーザに設定させる条件設定機能部と、
    　複数種類の複数個の単糖残基で構成されるコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを取得する糖鎖コア構造情報取得機能部と、
    　前記糖鎖コア構造情報取得機能部により取得された種々の糖鎖に対し、前記条件設定機能部により設定された質量変動因子に基づいて質量を増加又は減少させることで糖鎖理論質量電荷比を求める理論質量算出機能部と、
    　前記糖鎖理論質量電荷比を、与えられたマススペクトルデータにおけるイオンピークの質量電荷比と照合することで糖鎖の構造を推定する糖鎖構造推定機能部と、
    　として動作させ、前記条件設定機能部は、質量変動因子の一つとしてシアル酸の結合様式に特異的な化学修飾を他の修飾とは独立にユーザに設定させ、
    　前記理論質量算出機能部は、設定されたシアル酸結合様式に特異的な化学修飾に対応してシアル酸結合様式毎に質量を増加又は減少させた糖鎖理論質量電荷比を求めることを特徴とする糖鎖構造解析用プログラム。
  7. 　請求項６に記載の糖鎖構造解析用プログラムであって、
    　前記糖鎖コア構造情報取得機能部は、単糖残基の種類とその数の制約条件の下で想定される糖鎖構造を総当たり的に推定してコア構造を有する種々の糖鎖とそれに対応する質量情報とを求める、ことを特徴とする糖鎖構造解析用プログラム。
  8. 　請求項６に記載の糖鎖構造解析用プログラムであって、
    　前記糖鎖コア構造情報取得機能部は、ユーザにより設定された糖鎖の質量情報に基づいて、各種の糖鎖構造と質量とが収録されている糖鎖構造データベースに収録されている情報を検索することにより、コア構造を有する種々の糖鎖を求める、ことを特徴とする糖鎖構造解析用プログラム。
  9. 　請求項６に記載の糖鎖構造解析用プログラムであって、
    　前記糖鎖構造推定機能部により推定された糖鎖構造の情報を表示部の画面上に表示させる表示処理機能部をさらに有し、
    　該表示処理機能部は、推定された糖鎖構造にシアル酸が含まれていて結合様式の識別が可能である場合に、シアル酸毎に結合様式を示す情報を付加して表示させる、ことを特徴とする糖鎖構造解析用プログラム。
  10. 　請求項６に記載の糖鎖構造解析用プログラムであって、
    　前記シアル酸結合様式特異的化学修飾対応質量変動設定機能部は、既定のシアル酸結合様式特異的化学修飾を選択可能であるとともに、それ以外の化学修飾についてシアル酸結合様式毎の質量変動値を入力可能である、ことを特徴とする糖鎖構造解析用プログラム。
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