CN115662500B

CN115662500B - 通过计算机模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体的方法

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Publication number: CN115662500B
Application number: CN202211293141.8A
Authority: CN
Inventors: 朱奕颖
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2042-10-21
Also published as: CN115662500A; WO2024083187A1

Abstract

本发明公开了通过计算机模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体的方法。所述方法通过计算机模拟使用相似质量同位素替换待定量的聚糖异构体的结构异构体中的同位素，得到化学式和质量发生微调改变(质量差小于0.2Da)的模拟聚糖异构体，同时基于质谱数据可对模拟后获得的结构异构体进行定量。实验证明，通过本发明所建立的方法对肝癌患者血清与正常人血清中鉴定得到的1218条糖肽中聚糖异构体的结构异构体进行区分和定量，最终糖肽无缺失值且获得315条糖肽在肝癌与正常人血清中的改变大于2.5倍。因此本发明所建立的方法可以有效地区分不同糖肽链接糖异构体，并且准确地无缺失值地对鉴定得到的糖肽均进行定量和差异分析。

Description

通过计算机模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及通过计算机模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体的方法。

背景技术

蛋白质糖基化是常见的翻译后修饰之一，大约50-70％的人类蛋白质是糖基化的，包括表面受体、细胞器驻留蛋白、分泌蛋白和运输蛋白。蛋白质糖基化是种非常重要的修饰，涉及许多生物过程，例如介导细胞附着、监测蛋白质折叠状态和促进蛋白质递送、刺激信号转导途径、影响蛋白质-蛋白质相互作用和改变蛋白质的溶解度。聚糖由基本结构单元单糖组成。一种单糖的分子内半缩醛基团和另一种单糖的羟基可以形成糖苷键。葡萄糖(Glu/Glc)、半乳糖(Gal)和甘露糖(Man)是立体异构体，称为己糖(Hex)。脱氧己糖(dHex)是羟基被氢原子取代的己糖，如岩藻糖(Fuc)。N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)均为N-乙酰己糖胺(HexNAc)。唾液酸是取代的九碳神经氨酸的总称，在哺乳动物中常见N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)。NeuAc广泛存在于人类蛋白质中，而NeuGc是非人类唾液酸，但已在猿类中发现。糖基化可以通过不同的糖苷键分为几个亚型：N-连接糖基化、O-连接糖基化、糖基化、C-连接糖基化和磷酸糖基化。常见的为糖苷键为N-连接糖基化的N-连接型聚糖(N-glycan database)与糖苷键为O-连接糖基化的O-连接型聚糖(O-glycan database)。N-连接寡糖附着在天冬酰胺(Asn)的氮原子上。O-连接糖基化是将糖连接到丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸中的氧原子上。N-连接型聚糖具有共同的五糖核心结构，且通常可分为三种不同的亚型：高甘露糖、复合物和杂合体。

糖基化的质谱分析比其他的蛋白翻译后修饰更困难，原因在于聚糖种类繁多，结构复杂。蛋白质糖基化的分析方法一般可分两大类，一是将聚糖从蛋白上酶解释放，再具体分析纯糖分子或多肽，另一类是直接分析糖肽，糖肽带有糖基链接位点的信息。因聚糖支链连接方式不同，存在结构异构体，在质谱上体现相同的母离子质量，分析难度很大。随着质谱技术的发展，二级甚至多级质谱的出现可以使糖分子进一步解离，从而解析结构异构体，也同时出现了很多糖分子或者糖肽的大规模搜索软件比如pGlyco，ProteinProspector，O-Pair。现阶段糖蛋白质组学已从定性走向定量化，即不但要鉴定不同组别蛋白上的糖基化类别，还要对不同糖基做定量。对质谱鉴定到的分子做大规模定量方法也一直在更新优化中。以肽段定量为例，从spectral counting(二级图谱数)，MS1 peak area到iTRAQ，TMT，再到用重同位素标记肽段做标准品进行精准定量，相应分析软件也在跟随着发展。质谱的data-dependent-analysis(DIA)是应用最广泛的扫谱模式，即取最高丰度的离子进行裂解并扫MS/MS谱图。其后用离子在不同样品中MS1的峰面积或峰高作为相对定量的依据是最简便也是应用最广泛的方法。因为DIA的扫谱原理，会出现缺失值，即一些肽段在一些样本中会被选择做二级MS/MS质谱，在另一些样本没有被选择到，导致即使肽段存在于样本中，但最后结果中没有二级谱图及定量数据。因为这一痛点，专门定量的软件如Progenesis，Skyline被设计开发出来。比如，Match-between-runs算法，即根据离子其他特性比如保留时间做峰提取，可以大幅减少缺失值提高重复性，很多软件更有可视化窗口可进行手动调整。但是对于糖肽，使用像Skyline这样的定量软件亦有一痛点，因为它们的开发基本上是用于一般的肽段分子带着固定质量的蛋白质修饰，没有专门为糖基复杂修饰定制。输入软件的信息需要包括鉴定到的肽段序列及修饰质量，软件仅靠修饰质量为标识符，不同糖肽链接糖异构体会被视作同一肽段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何基于质谱数据定量软件区分糖结构异构体和/或如何在质谱分析中定量糖结构异构体和/或如何基于质谱数据定量软件定量糖结构异构体。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了基于质谱数据对聚糖异构体进行定量分析的方法。所述方法可包括如下步骤：通过计算机模拟使用相似质量同位素替换待定量的聚糖异构体的结构异构体中的同位素，得到化学式和质量发生改变的模拟聚糖异构体；基于质谱数据对所述模拟聚糖异构体进行定量，得到所述不同结构异构体的定量结果。

所述模拟聚糖异构体的质量与所述待定量的聚糖异构体的质量的差值可小于等于0.2Da。

所述待定量的聚糖异构体可为同分异构体。

所述相似质量同位素可为质量差不超过0.05Da的同位素组合。如¹⁴N的相似质量同位素可为¹³C和¹H，¹⁶O的相似质量的同位素可为¹⁵N和¹H，¹⁵N的相似质量同位素可为¹²C和¹H。

上述方法中，以x为所述待定量的聚糖异构体中的每个结构异构体按照glycan ID号从小到大排序后的序号，所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n；所述计算机模拟根据所述待定量聚糖异构体的化学式中N和O的数量进行模拟，包括如下任一步骤：

A1)所述化学式中N的数量m大于或等于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中可去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da；

A2)所述化学式中N的数量m小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，但是N的数量m和O的数量k之和m+k大于或等于所述结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中可去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中可去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中可去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da；

A3)所述化学式中N的数量m和O的数量k之和m+k小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中可去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中可去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，直至去掉k个¹⁶O；再然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中可去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中可去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，同时在化学式中可去掉x-m-k-1个¹²C及x-m-k-1个¹H，增加x-m-k-1个¹⁵N得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da或m×0.008106Da+k×0.013019Da+(x-m-k-1)×0.0233Da。

所述待定量的聚糖异构体可包含n个结构异构体，n为自然数。

所述化学式中N的数量为m，m为自然数。

所述化学式中O的数量为k，k为自然数。

所述x可为所述待定量的聚糖异构体中的每个结构异构体按照glycan ID号从小到大排序后的序号。所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n。

所述glycan ID号可来源于GlycomeDB数据库(相关网址：www.glycome-db.org)。

所述质谱数据定量软件可为Skyline软件。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了定量分析质谱数据中包含聚糖异构体的糖肽的方法。所述方法可包括如下步骤：通过计算机模拟使用相似质量的同位素替换所述糖肽含有的聚糖异构体中的同位素，得到化学式和质量发生改变的模拟聚糖异构体，并获得包含模拟聚糖异构体的糖肽；基于质谱数据对包含所述模拟聚糖异构体的所述糖肽使用质谱数据定量软件进行定量，得到所述包含不同结构聚糖异构体的糖肽的定量结果。

所述模拟聚糖异构体的质量与所述聚糖异构体的质量的差值可小于等于0.2Da。

所述聚糖异构体可为同分异构体。

上述方法中，可以x为所述待定量的聚糖异构体中的每个结构异构体按照glycanID号从小到大排序后的序号，所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n；所述计算机模拟可根据所述待定量聚糖异构体的化学式中N和O的数量进行模拟，包括如下步骤：

A1)所述化学式中N的数量m大于或等于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da；

A2)所述化学式中N的数量m小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，但是N的数量m和O的数量k之和m+k大于或等于所述结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da；

A3)所述化学式中N的数量m和O的数量k之和m+k小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，直至去掉k个¹⁶O；再然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，同时在化学式中去掉x-m-k-1个¹²C及x-m-k-1个¹H，增加x-m-k-1个¹⁵N得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da或m×0.008106Da+k×0.013019Da+(x-m-k-1)×0.0233Da所述聚糖异构体包含n个结构异构体，n为自然数。m为自然数。k为自然数。

所述x为所述聚糖异构体中的每个结构异构体按照glycan ID号从小到大排序后的序号，所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n。

所述glycan ID号可来源于GlycomeDB数据库(相关网址www.glycome-db.org)。

上述方法中，所述质谱数据定量软件可为Skyline软件。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了定量分析质谱数据中包含聚糖异构体的糖肽的装置。所述装置可包括如下模块：

B1)质谱数据获取模块：用于获取样本的质谱数据；

B2)糖肽鉴定模块：用于基于所述质谱数据鉴定得到样本含有的糖肽；

B3)糖肽定量模块：用于对所述糖肽进行定量。

B3)所述糖肽定量模块包括如下模块：

B3-1)聚糖异构体模拟模块：用于对所述糖肽含有的不同结构的聚糖异构体进行计算机模拟获得模拟聚糖异构体，并获得包含模拟聚糖异构体的糖肽；

B3-2)糖肽定量模块：用于对所述包含模拟聚糖异构体的糖肽使用质谱数据定量软件进行定量，获得包含聚糖异构体的糖肽的定量结果。

上述装置中，以x为所述待定量的聚糖异构体中的每个结构异构体按照glycan ID号从小到大排序后的序号，所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n。所述电脑模拟根据所述待定量聚糖异构体的化学式中N和O的数量进行模拟，通过包括如下步骤的方法建立：

C1)所述化学式中N的数量m大于或等于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da；

C2)所述化学式中N的数量m小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，但是N的数量m和O的数量k之和m+k大于或等于所述结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da；

C3)所述化学式中N的数量m和O的数量k之和m+k小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1(即n-1)，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，直至去掉k个¹⁶O；再然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，同时在化学式中去掉x-m-k-1个¹²C及x-m-k-1个¹H，增加x-m-k-1个¹⁵N得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da或m×0.008106Da+k×0.013019Da+(x-m-k-1)×0.0233Da。

所述聚糖异构体可包含n个结构异构体，n为自然数。m为自然数。k为自然数。

所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n。

所述glycan ID号来源于GlycomeDB数据库(相关网址www.glycome-db.org)。

上述装置中，所述质谱数据定量软件可为Skyline软件。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如上文任一所述方法的步骤。

本发明通过质谱分析肝癌患者血清与正常人血清中的含唾液酸的糖肽，用pGlyco软件搜索共鉴定到1218条糖肽。使用本发明所建立的通过计算机模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体方法，经过对1218条糖肽中的聚糖异构体进行质量微调加以区分，再用Skyline软件将鉴定到的糖肽全部做了定量，结果显示，糖肽无缺失值，最终获得315条糖肽在肝癌与正常人血清中的改变大于2.5倍。实验证明，本发明所建立的通过计算机模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体方法可以有效地区分不同糖肽链接糖异构体，同时准确地并且无缺失值地对鉴定得到的糖肽均进行定量和差异分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明采用电脑模拟(in silico)替换相似质量同位素的方法区别糖类结构异构体，使软件能区分异构体并且进行分别定量。

本发明采用电脑模拟(in silico)替换相似质量同位素的方法区别糖类结构异构体，使质谱数据定量软件能区分异构体并且对异构体分子进行分别定量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中的试剂或耗材来源如下：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸：Sigma-Aldrich 54457；

Pierce BCA试剂盒：ThermoFisher 23227；

二硫苏糖醇：Invitrogen 15508013；

碘乙酰胺：Sigma-Aldrich H4034；

胰酶：Promega V5113；

甲酸：Fisher A117-50；

固相萃取C18小柱：CDS 4215SD；

IMAC Fe-NTA：ThermoFisher A32992；

C18 stagetip：CDS Empore 2215。

本发明实施例中实验均设置两个重复。

实施例1、通过电脑模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体方法的建立

1.样本采集

采集肝癌患者和健康人全血，通过离心方式获得肝癌患者和健康人的血清样本。

2.唾液酸N-聚糖多肽的质谱鉴定与定量

2.1样本准备与质谱检测

2.1.1样本准备

2.1.1.1血清蛋白酶解

分别将肝癌患者和健康人的血清样本溶解在4X体积裂解液(溶液组成为：9M尿素，20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸)中，16000xg离心5分钟留取上清得到溶解的血清蛋白溶液，Pierce BCA试剂盒测定两个样本溶解的血清蛋白溶液中蛋白浓度。

之后取1mg溶解的血清蛋白溶液，加入二硫苏糖醇至终浓度4.5mM室温反应1小时；然后加入碘乙酰胺至终浓度10mM，避光室温反应半小时；按照质量比为酶：蛋白＝1:20(w:w)的比例加入胰酶，室温过夜得到血清蛋白酶解液。血清蛋白酶解液中加入甲酸至终浓度0.1％，使用固相萃取C18小柱脱盐得到纯化的血清蛋白酶解液后备用。

2.1.1.2富集唾液酸糖肽

使用Fe-NTA IMAC珠富集含唾液酸的糖肽。按照试剂盒说明书实验步骤流程，取0.5mg纯化的血清蛋白酶解液，与IMAC珠子混合一小时，洗脱后旋干重悬在0.1％甲酸溶液中，再用C18 stagetip除盐，旋干后重新溶解在50μL 0.1％甲酸中。

2.1.2质谱检测

LC-MS/MS：使用赛默飞U3000纳升流速超高效液相色谱(nanoUPLC)联用赛默飞三合一串联Orbitrap Eclipse质谱仪进行检测。50cm(100μm ID，1.9μm C18填料)的分析柱。液相中溶液A为0.1％甲酸水溶液，B为80％乙腈、0.1％甲酸水溶液。进样量为4μL，每个样本两次技术重复。液相梯度在90分钟内从4％升至50％。溶剂B的组成为80％乙腈、0.1％甲酸水溶液，流速0.3μL/分钟。

一级与二级质谱数据皆为高质量精度高灵敏度orbitrap质量分析器获得：一级扫描范围(m/z)＝800–2000；分辨率＝120,000；AGC＝200,000；最大注入时间＝100ms；包含电荷状态＝2-6；n次后动态排除，n＝1；动态排除持续时间＝15秒；质谱裂解方式设置为stepped HCD(NCE＝30％±10％)；二级隔离窗口＝2；分辨率＝15,000；AGC目标＝500,000；最大注入时间＝250ms。质谱扫描后生成raw文件，肝癌患者样本对应的raw文件命名为Cancer.raw，健康人样本对应的raw文件命名为Normal.raw。

2.2糖肽鉴定：

使用pGlyco 2.0软件(下载网址http://pfind.org/software/pGlyco/index.html)默认搜索参数，选择uniprot人类蛋白序列数据库及pGlyco在2020年使用的人类N-连接型聚糖数据库(N-glycan database)共包含8093个glycan ID的聚糖，Total FDR设置为1％。搜索后的糖肽鉴定数据为txt文件，命名为Cancer.txt(对应肝癌患者)及Normal.txt(对应健康人)。

2.3糖肽定量

2.3.1聚糖Glycan数据库格式转换

将聚糖Glycan数据库(N-glycan database)转换成质谱数据肽段定量软件Skyline(下载网址https://skyline.ms/project/home/software/skyline/begin.view)可接受的格式。

2.3.1.1聚糖格式转换

在步骤2.2得到的glycan数据库(N-glycan database)鉴定结果中，以Glycan ID127为例进行转换格式的描述：在原始Glycan数据库中Glycan ID 127的参数为“kind＝43100”意义为Hex＝4，HexNAc＝3，NeuAc＝1，NeuGc＝0，Fuc＝0，化学式为C59H96N4O43；在转换后的新格式中Glycan ID 127的参数为<static_modification,aminoacid＝"N",explicit_decl＝"true",formula＝"C59H96N4O43",name＝"127"/>。

将所有聚糖(包括非异构体聚糖和异构体聚糖)进行格式转换，将得到的文件保存为regular glycans.txt文件。

2.3.1.2异构体聚糖格式转换

将具有相同化学式和质量的聚糖同分异构体的质量进行微调改变，即通过计算机模拟，使用相似质量的同位素替换聚糖异构体中的同位素，得到化学式和质量发生改变的模拟聚糖异构体。改变聚糖异构体的化学式后，其质量(分子量)会有很小的变化，可以据此在后续分析软件中可以将聚糖异构体区分开，并在分析最后依此规则再找到原始的聚糖异构体，在最终结果输出中使用原始的聚糖异构体原始的化学式及结构。具体步骤如下：

找出所有具有相同质量的聚糖异构体(n个)，按glycan ID号从小到大排列顺序，序号记为x(x为从1开始连续计数至n中的任一自然数)，并根据以下规则使用计算机模拟(In silico)微调(质量变化小于0.2Da)改变聚糖同分异构体的化学式和质量：

Ⅰ.化学式中N的数量(m)大于或等于结构异构体数量减1(即n-1)的聚糖异构体：对于排序为x的异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及¹H，与原聚糖异构体质量相比，质量增加(x-1)×0.008106Da；

Ⅱ.化学式中N的数量(m)小于结构异构体的数量减1(即n-1),但是N的数量(m)O的数量(k)之和(m+k)大于或等于结构异构体数量减1(即n-1)的聚糖异构体：对于排序为x的异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da；

Ⅲ.化学式中N的数量(m)和O的数量(k)之和(m+k)小于结构异构体数量减1(即n-1)的聚糖异构体：对于排序为x的异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，直至去掉k个¹⁶O；再然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，同时在化学式中去掉x-m-k-1个¹²C及x-m-k-1个¹H，增加x-m-k-1个¹⁵N得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da或m×0.008106Da+k×0.013019Da+(x-m-k-1)×0.0233Da。

例如表1中所示，鉴定得到人血清糖肽包含具有相同的化学式C90H146N6O65和相同的质量2350.83035Da的6个聚糖异构体(n＝6)修饰具有不同的结构(化学式中存在足够量N：N的数量(m＝6)大于结构异构体数量减1(即m＞n-1＝5))，糖ID(glycan ID)分别为1266-1273(ID排序序号分别为1-6)。计算机模拟改变化学式后聚糖异构体的质量有了很小的变化：

对于ID排序序号x为1的聚糖(glycan ID为1266)：化学式和质量未被进行模拟，未发生变化；

对于ID排序序号x为2的聚糖(glycan ID为1267)：计算机模拟后，化学式由C90H146N6O65变为了C90H147N5O65C’1，即在化学式中去掉(2-1)个即1个¹⁴N，增加(2-1)个即1个¹³C及1个¹H，与原聚糖异构体质量相比，质量增加了(2-1)×0.008106Da；

对于ID排序序号x为3的聚糖(glycan ID为1269)：计算机模拟后，化学式由C90H146N6O65变为了C90H148N4O65C’2，即在化学式中去掉(3-1)个即2个¹⁴N，增加(3-1)个即2个¹³C及2个¹H，与原聚糖异构体质量相比，质量增加了(3-1)×0.008106Da；

对于ID排序序号x为4的聚糖(glycan ID为1270)：计算机模拟后，化学式由C90H146N6O65变为了C90H149N3O65C’3，即在化学式中去掉(4-1)个即3个¹⁴N，增加(4-1)个即3个¹³C及3个¹H，与原聚糖异构体质量相比，质量增加了(4-1)×0.008106Da；

对于ID排序序号x为5的聚糖(glycan ID为1272)：计算机模拟后，化学式由C90H146N6O65变为了C90H150N2O65C’4，即在化学式中去掉(5-1)个即4个¹⁴N，增加(5-1)个即4个¹³C及4个¹H，与原聚糖异构体质量相比，质量增加了(5-1)×0.008106Da；

对于ID排序序号x为6的聚糖(glycan ID为1273)：计算机模拟后，化学式由C90H146N6O65变为了C90H151N1O65C’5，即在化学式中去掉(6-1)个即5个¹⁴N，增加(6-1)个即5个¹³C及5个¹H，与原聚糖异构体质量相比，质量增加了(6-1)×0.008106Da。

根据模拟后得到的聚糖异构体的质量，在后续分析软件中可以将聚糖异构体区分开。

表1.原始聚糖异构体在进行电脑模拟微调化学式的前后对比

注：C'代表重标¹³C

使用电脑模拟转换所有glycan数据库中的聚糖异构体后，将得到的文件保存新数据库为shifted glycans.txt文件。

2.3.2糖肽格式转换

将在pGlyco数据库中搜索鉴定得到糖肽，将搜索得到的糖肽结果文件(txt格式)转换成pepXML文件。具体pepXML文件中每个糖肽的参数设置如下：

a.提取搜索得到的糖肽结果文件名称、搜索软件、……等文件信息放在pepXML文件开头，如：</analysis_summary>,<msms_run_summary,base_name＝"Cancer",raw_data＝".raw",raw_data_type＝".raw">,<fragment_mass_type＝"monoisotopic",precursor_mass_type＝"monoisotopic",search_engine＝"pGlyco">。其中，analysis_summary代表分析摘要，msms_run_summary代表二级质谱分析摘要，base_name代表基础名称，raw_data代表原始数据名称，raw_data_type代表原始数据类型，fragment_mass_type代表裂解质量类型，precursor_mass_type代表母离子质量类型，search_engine代表搜索软件。

b.在<analysis_summary>aminoacid_modification段落定义修饰，在pGlyco糖肽搜索结果中找到这一文件中的所有修饰，然后转化格式为<aminoacid_modification，aminoacid＝"X"，description＝"XX"，mass＝"XX.XXXXXXXX"，massdiff＝"XX.XXXXXXXX"，variable＝"Y/N"/>。其中，aminoacid_modification为氨基酸修饰，aminoacid为被修饰氨基酸，Massdiff为修饰基团的质量，mass为massdiff+氨基酸残基质量；variable为可变修饰，description为功能描述。

所有常见修饰定义，比如：

<aminoacid_modification，aminoacid＝"C"，massdiff＝"57.02146374"，mass＝"160.030648219",variable＝"N"，description＝"Carboaminomethyl"/>。

所有糖基的定义，比如：

<aminoacid_modification，aminoacid＝"N"，description＝"GlycanID1270"，mass＝"2464.873277"，massdiff＝"2350.83035"，variable＝"Y"/>。

c.将搜索得到的糖肽结果按质谱(MS/MS)图谱编号scan No.对应填入搜索总结(search summary)部分，包括assumed_charge(假设电荷)，precursor_neutral_mass(前体中性质量)，scan(扫描)，probability(可能性)，calc_neutral_pep_mass(计算得到的中性肽段质量)，protein info(蛋白信息)等。

例如：

其中，修饰部分是从pGlyco搜索得到的糖肽结果中找到关于修饰的列，找到修饰的位置以及具体修饰，转换成pepXML文件形式，即mod_aminoacid_mass position(肽段上氨基酸的顺序位置)＝"X"、mass(修饰氨基酸的质量)＝"XXXX.XXXXXXXX"。比如糖肽搜索结果中“1,Carbamidomethyl[C]”，转换成pepXML文件后展示的形式为<mod_aminoacid_massposition＝"1"，mass＝"160.030648219"/>。

而聚糖的修饰按照步骤2.3.1中得到的regular glycans.txt文件或者shiftedglycans.txt文件中的糖基修饰质量进行添加。

d.将两个转换后的文件名(肝癌患者或健康人数据对应转换后的结果，Cancer或者Normal)改为与数据库搜索得到的糖肽结果文件(Cancer或者Normal)相同，文件扩展名改为pep.xml。将它们标记在不同的文件夹中。

2.3.3质谱扫描文件格式转换

通过MSconvert软件(下载网址https://proteowizard.sourceforge.io/)将步骤2.1.2得到的原始raw文件(文件名为Cancer.raw或Normal.raw)转换为mzXML格式。

2.3.4总结果Excel报告的建立

建立模版，把pGlyco糖肽鉴定结果转为最终集合糖肽定性定量结果。报告中包括步骤2.2pGlyco糖肽鉴定的报告Cancer.txt/Normal.txt及步骤2.3.1改变的聚糖质量shifted glycans.txt：Gene name基因名称，Protein name蛋白名称，Accession蛋白在数据库中编号，kD蛋白质量，Site糖修饰位点，GlyID糖编号，Glycan糖组成成分，Glymass正常糖质量，Calc.m/z理论糖肽荷质比，PlausibleStruct糖可能的结构，Peptide带糖修饰的肽段序列，Charge带电荷数，GlycoPeptide修饰肽段序列(将pGlyco搜索结果中原本以J代替的修饰天冬氨酸改回到N，并在修饰氨基酸后加正常修饰质量[+XXXX.XXX]，这种修饰肽段格式可被Skyline接受)，Shift GlycoPeptide(同GlycoPeptide，但根据shifted glycans的规律把修饰聚糖换成改变的质量)，PPM(糖肽质量改变)，Total area(Cancer,Normal)糖肽的峰面积包括肝癌患者与健康人对照(此项为下步骤2.3.5预留，先留空)。

2.3.5糖肽定量

通过Skyline(MacCoss Lab)软件进行糖肽定量，具体步骤为：

a.创建skyline项目，保存文件名为test，找到三个skyline文件，扩展名为sky，sky.view，skyd；右键单击test.sky文件，然后选择用记事本打开；打开步骤2.3.1.1得到的“regular glycans.txt”文件，复制其中的完整的糖链质量列表插入到static_modification参数部分。此步骤为导入modification定义。

b.Skyline参数设置如下：

肽段设置Peptide Settings：解离酶Digestion Enzyme胰酶Trypsin；离子转换设置Transition Setting：前体离子电荷Precursor Charge 2，3，4，5，6，7，离子电荷数IonCharges 1，2，3，4，5，6，离子类型Ion Types y,b,p；分辨能力(匹配质谱MS1设置)：Resolving Power 120,000at 200m/z。

c.保存Skyline文件test，双击名为test.sky文件，使用步骤2.3.2转换后得到的pep.xml文件，在test.sky文件Peptide Settings-Library选项卡下正常创建一个库(cutoff score为0)。

d.回步骤2.3.4报告中列举每条糖肽质量改变的具体数值(ppm)，从小到大进行排序。对于正常聚糖质量肽(不包含聚糖异构体，ppm＝0)的糖肽列表复制并粘贴到test.sky主界面左侧中，确保所有肽段与谱库光谱匹配，导入原始文件并照常手动调整峰值，导出最终报告。

e.对于质量改变的糖肽(包含聚糖异构体并进行了电脑模拟质量改变)，重新建立Skyline文件并且命名为shifted test，重复a-c(在a步骤导入modificaton定义，同时在c步骤建库时改用步骤2.3.1.2得到的“shifted glycans.txt”文件以及步骤2.3.2中得到的改变质量的pepXML文件)。在2.3.4报告中将糖肽分为0-10ppm和10-50ppm两列，在Transition Settings-Full Scan标签下调整mass accuracy，分别分析。确保所有肽段与谱库光谱匹配，导入原始文件并照常手动调整峰值，导出两份Skyline糖肽峰面积报告。

f.合并正常质量(ppm＝0)，改变质量0<ppm<10、10<ppm<50的糖肽峰面积的定量报告。可以根据不同项目的需要调整质量改变阈值。最后将峰面积通过对应糖肽序列查找粘贴到步骤2.3.4的总报告Total area列中，并最终删除shifted GlycoPeptide及PPM列。

综上，通过质谱分析肝癌患者血清与正常人血清中的含唾液酸的糖肽，用pGlyco软件搜索共鉴定到1218条糖肽，但由于糖肽中的糖基修饰存在同分异构体，无法准确地并且无缺失值地对鉴定得到的糖肽均进行定量和差异分析；使用本发明所建立的通过计算机模拟替换相近质量同位素区分聚糖结构异构体方法，经过对糖肽中的聚糖异构体进行质量微调加以区分，再用Skyline软件将鉴定到的糖肽全部做了定量；结果显示，糖肽无缺失值，最终发现315条糖肽在肝癌与正常人血清中的改变大于2.5倍。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.基于质谱数据对聚糖异构体进行定量分析的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：通过计算机模拟使用相似质量同位素替换待定量的聚糖异构体的结构异构体中的同位素，得到化学式和质量发生改变的模拟聚糖异构体；基于质谱数据对所述模拟聚糖异构体进行定量，得到不同结构异构体的定量结果；

所述模拟聚糖异构体的质量与所述待定量的聚糖异构体的质量的差值小于等于0.2Da；

以x为所述待定量的聚糖异构体中的每个结构异构体按照glycan ID号从小到大排序后的序号，所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n；所述计算机模拟根据所述待定量聚糖异构体的化学式中N和O的数量进行模拟，包括如下步骤或如下任一步骤：

A1)所述化学式中N的数量m大于或等于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da；

A2)所述化学式中N的数量m小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1，但是N的数量m和O的数量k之和m+k大于或等于所述结构异构体的数量减1，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da；

A3)所述化学式中N的数量m和O的数量k之和m+k小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，直至去掉k个¹⁶O；再然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，在化学式中去掉x-m-k-1个¹²C及x-m-k-1个¹H，增加x-m-k-1个¹⁵N得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da或m×0.008106Da+k×0.013019Da+(x-m-k-1)×0.0233Da；

所述待定量的聚糖异构体包含n个结构异构体，n为自然数；m为自然数；k为自然数。

2.定量分析质谱数据中包含聚糖异构体的糖肽的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：通过计算机模拟使用相似质量的同位素替换所述糖肽含有的聚糖异构体中的同位素，得到化学式和质量发生改变的模拟聚糖异构体，并获得包含模拟聚糖异构体的糖肽；基于质谱数据对包含所述模拟聚糖异构体的所述糖肽使用质谱数据定量软件进行定量，得到所述包含不同结构聚糖异构体的糖肽的定量结果；

所述模拟聚糖异构体的质量与所述聚糖异构体的质量的差值小于等于0.2Da；

以x为待定量的聚糖异构体中的每个结构异构体按照glycan ID号从小到大排序后的序号，所述序号是一个自然数，所述排序从1开始连续计数至n；所述计算机模拟根据所述待定量聚糖异构体的化学式中N和O的数量进行模拟，包括如下步骤或如下任一步骤：

A3)所述化学式中N的数量m和O的数量k之和m+k小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，直至去掉k个¹⁶O；再然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，同时在化学式中去掉x-m-k-1个¹²C及x-m-k-1个¹H，增加x-m-k-1个¹⁵N得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da或m×0.008106Da+k×0.013019Da+(x-m-k-1)×0.0233Da；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述质谱数据定量软件为Skyline软件。

4.定量分析质谱数据中包含聚糖异构体的糖肽的装置，其特征在于：所述装置包括如下模块：

B1)质谱数据获取模块：用于获取样本的质谱数据；

B3)糖肽定量模块：用于对所述糖肽进行定量；

B3)所述糖肽定量模块包括如下模块：

B3-2)糖肽定量模块：用于对所述包含模拟聚糖异构体的糖肽使用质谱数据定量软件进行定量，获得包含聚糖异构体的糖肽的定量结果；

C1)所述化学式中N的数量m大于或等于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da；

C2)所述化学式中N的数量m小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1，但是N的数量m和O的数量k之和m+k大于或等于所述结构异构体的数量减1，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da；

C3)所述化学式中N的数量m和O的数量k之和m+k小于所述聚糖异构体的结构异构体的数量减1，对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉x-1个¹⁴N，增加x-1个¹³C及x-1个¹H，直至去掉m个¹⁴N；然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，直至去掉k 个¹⁶O；再然后对于排序序号为x的结构异构体，在化学式中去掉m个¹⁴N，增加m个¹³C及m个¹H，并且在化学式中去掉x-m-1个¹⁶O，增加x-m-1个¹⁵N和x-m-1个¹H，同时在化学式中去掉x-m-k-1个¹²C及x-m-k-1个¹H，增加x-m-k-1个¹⁵N得到所述模拟聚糖异构体，与所述待定量聚糖异构体相比，所述模拟聚糖异构体的质量增加(x-1)×0.008106Da或m×0.008106Da+(x-m-1)×0.013019Da或m×0.008106Da+k×0.013019Da+(x-m-k-1)×0.0233Da；

5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述质谱数据定量软件为Skyline软件。

6.一种存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如权利要求1所述方法的步骤。

7.一种存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如权利要求2所述方法的步骤。