WO2020076015A1 - 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정 배지를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정 배지를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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cancer
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inducing
composition
cell death
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김동익
김애경
한규현
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Sungkyunkwan University
Samsung Life Public Welfare Foundation
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Sungkyunkwan University
Samsung Life Public Welfare Foundation
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/33—Fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention is a composition for inducing cancer cell death, a medium composition for inducing cancer cell death or inducing inhibition of cancer cell proliferation, for treating or preventing cancer, comprising a conditioned medium prepared by culturing fibroblasts in a hypoxic environment It relates to a pharmaceutical composition and a method for preparing a composition for inducing cancer cell death.
  • Anticancer agents used as drug treatments are mainly synthesized by using monomolecular substances by organic or inorganic methods.
  • Traditional drug therapy in this way has many side effects, one of which is that the substance used as a drug is an artificially synthesized ex vivo derived substance, and the action point of an anti-cancer substance is to target an overexpressed protein.
  • Fibroblasts are cells, also called fibroblasts, and are cells unique to connective tissue that have ellipsoidal nuclei and spindle-like protoplasm characterized by good development of rough endoplasmic reticulum and Golgi. It also contains cells that fill the parenchymal cells in mesenchymal cells present in many internal organsviscera (collagen). It is known to have the ability to secrete the synthesis of interstitial substances such as proteoglycan, and to have a close relationship with myoplasts.
  • fibroblasts proliferate by serum or fibroblast growth factor (FGF), and when contact inhibition occurs, the shape deforms like a stone wall.
  • FGF fibroblast growth factor
  • fibroblasts when passage is repeated, it becomes 50s Almost known to die. It is used for screening of carcinoma by using the loss of function for contact inhibition of fibroblasts as described above, and studies of cell proliferation, especially growth factor. It is used a lot to study the signal transmission of.
  • the present inventors have shown the effect of inducing apoptosis specific to cancer cells, and while studying the naturally existing cells and proteins that have the potential to be used as anticancer agents, the fibroblast control medium prepared by culturing fibroblasts in a hypoxic culture environment While confirming that it is possible to induce apoptosis while inhibiting the proliferation of cancer cells, the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is a composition for inducing cancer cell death, a medium composition for inducing cancer cell death or inducing cancer cell proliferation inhibition, comprising a conditioned medium prepared by culturing a fibroblast in a hypoxic environment. It is to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for treatment or prevention and a composition for inducing cancer cell death.
  • the present invention provides a composition for inducing cancer cell death comprising a conditioned medium prepared by culturing fibroblasts in a hypoxic environment.
  • the present invention provides a method for inducing apoptosis of cancer cells, comprising treating the cancer cells with a conditioned medium prepared by culturing fibroblasts in a hypoxic environment.
  • the present invention provides a medium composition for inducing cancer cell death or inducing cancer cell proliferation inhibition, comprising a fibroblast culture medium cultured in a hypoxic environment.
  • the present invention provides a method for inducing cancer cell death or inhibiting cancer cell proliferation, comprising the step of treating a fibroblast culture medium cultured in a hypoxic environment with cancer cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer comprising the composition.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising administering the composition to an individual.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for inducing cancer cell death, including; culturing a fibroblast in a hypoxic environment to prepare a conditioned medium.
  • the conditioned medium prepared by culturing fibroblasts in the hypoxic environment of the present invention When used, it is possible to induce apoptosis while suppressing the proliferation of cancer cells, and thus can be used as an anticancer agent.
  • the use of the conditioned medium prepared by the method of the present invention can specifically kill only cancer cells without inducing the death of surrounding normal cells, and thus can be effectively used as a clinically applicable cancer treatment or prevention pharmaceutical composition. You can.
  • FIG. 1 is a diagram showing the experimental results confirming the ability to inhibit Hela cell proliferation that occurs when fibroblast control media cultured in hypoxic conditions for 48 hours (2 days) and 72 hours (3 days) (* P ⁇ 0.05 , ** P ⁇ 0.01).
  • Figure 2A is a diagram showing the results of the degree of apoptosis (apoptosis) of Hela cells through an annexin V analysis by medium culture medium, serum-free medium conditions, 21% normal oxygen conditions, 1% hypoxic conditions medium.
  • Figure 2B is a graph showing the degree of cell death (apoptosis) of Hela cells through Annexin V analysis by medium culture medium, serum-free medium condition, 21% normal oxygen condition, 1% hypoxic condition medium (Figure 2B) Is (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • Figure 3 is a diagram showing the results of measuring the Caspase3 / 7 activity of cancer cells by medium culture medium, serum-free medium condition, 21% normal oxygen condition, 1% hypoxic condition medium (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01) .
  • Figure 4 is a diagram showing the experimental results of measuring the mitochondrial membrane potential change of cancer cells by medium culture medium, serum-free medium condition, 21% normal oxygen condition, 1% hypoxic condition medium (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 ).
  • Figure 5A is a diagram showing the results of counting cancer cell cell cycles per medium culture medium, serum-free medium condition, 21% normal oxygen condition, and 1% hypoxic condition medium.
  • 5B is a diagram showing the results of displaying cancer cells corresponding to each cell cycle of cancer cells according to the basic culture medium, serum-free medium conditions, 21% normal oxygen conditions, and 1% hypoxic conditions medium (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • FIG. 6 is a diagram showing the experimental results confirming the cancer cell killing effect confirmed in the control medium prepared by culturing fibroblasts with hypoxic concentration conditions of 1% and 5% (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • the present invention provides a composition for inducing cancer cell death, comprising a conditioned medium prepared by culturing fibroblasts in a hypoxic environment.
  • the present invention provides a method for inducing apoptosis of cancer cells, comprising treating the cancer cells with a conditioned medium prepared by culturing fibroblasts in a hypoxic environment.
  • fibroblast used in the present invention is a cell called fibroblast, which is also called a fibroblast, and is an indigenous cell of connective tissue, which is an elliptical nucleus and spindle characterized by good development of the rough endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Refers to the cell with the mercury protoplasm.
  • the term 'culture media' refers to a culture medium capable of supporting the growth and survival of cells under in vitro culture conditions, and includes all mediums used in the art suitable for culturing fibroblasts. Includes.
  • medium and culture conditions can be selected according to the type of cells.
  • the medium used for the culture is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally contains a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component.
  • CCMM cell culture minimum medium
  • Such cell culture media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI1640, F-10, F-12, ⁇ MEM ( ⁇ Minimal essential Medium), GMEM ( Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, etc., but are not limited to these.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basal Medium Eagle
  • RPMI1640 F-10, F-12
  • ⁇ MEM ⁇ Minimal essential Medium
  • GMEM Glasgow's Minimal essential Medium
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium etc., but are not limited to these.
  • conditioned medium used in the present invention means a culture supernatant obtained by culturing fibroblasts, or a fibroblast from which fibroblasts are removed, and "fibroblast culture supernatant", It can be used interchangeably with “fibroblast culture medium” or "fibroblast culture medium”.
  • the medium of the present invention may further include a nutrient mixture (Nutrient Mixture).
  • the nutritional mixture is a mixture containing various amino acids, vitamins, and inorganic salts commonly used in cell culture, and may be prepared by mixing the amino acid, vitamins, and inorganic salts, or a commercially produced nutritional mixture.
  • Commercially prepared nutrient mixtures include, for example, M199, MCDBllO, MCDB202, MCDB302, but are not limited thereto.
  • fibroblasts were cultured in a hypoxic environment to prepare a conditioned medium, and it was confirmed that the prepared conditioned medium exhibited anticancer activity.
  • the anti-cancer activity identified in one embodiment of the present invention is one or more activities selected from the group consisting of inhibiting cancer cell proliferation, inducing cancer cell death (apoptosis), and arresting cancer cell cycles.
  • apoptosis-inducing activity is due to an increase in caspase 3/7 activity or a decrease in mitochondrial membrane potential.
  • the “hypoxic” environmental condition refers to an oxygen concentration lower than the normal atmospheric oxygen concentration of 21%, and may be 0.5% to 7% oxygen concentration, preferably 0.7% to 5% oxygen concentration, , More preferably, it may be a culture condition containing an oxygen concentration of 1%.
  • the present invention provides a medium composition for inducing cancer cell death or inhibiting cancer cell proliferation, comprising a fibroblast culture medium cultured in a hypoxic environment.
  • the present invention provides a method for inducing cancer cell death or inhibiting cancer cell proliferation, comprising the step of treating a fibroblast culture medium cultured in a hypoxic environment with cancer cells.
  • the medium composition comprising the fibroblast culture medium cultured in the hypoxic environment of the present invention can induce the death of cancer cells by increasing the caspase 3/7 activity of the cancer cells treated with the composition or reducing mitochondrial membrane potential, It can be effectively used to induce cancer cell death.
  • the medium composition comprising the fibroblast culture medium cultured in the hypoxic environment of the present invention can detain the cell cycle of the treated cancer cells, and thus can be effectively used to suppress cancer cell proliferation.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the composition.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising administering the composition to an individual.
  • the term 'cancer' in the present invention refers to a group of diseases having a characteristic that cells can overproliferate and infiltrate into surrounding tissues when the normal apoptotic balance is broken.
  • the cancer of the present invention is brain tumor, benign astrocytoma, malignant astrocytoma, pituitary adenoma, meningioma, cerebral lymphoma, oligodendroma, intracranial endothelial, epithelial cell tumor, brain stem tumor, head and neck tumor, larynx cancer, oropharyngeal cancer, nasal / sinus cancer, nasopharyngeal cancer , Salivary gland cancer, hypopharyngeal cancer, thyroid cancer, thoracic tumor, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, thymic cancer, mediastinal tumor, esophageal cancer, breast cancer, male breast cancer, abdominal tumor, stomach cancer, liver cancer, gallbladder cancer, biliary cancer, pancreatic cancer
  • the pharmaceutical composition of the present invention in addition to a composition for inducing cancer cell death, including a culture medium prepared by culturing fibroblasts in a hypoxic environment, is a pharmaceutically acceptable carrier, that is, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, and dext. Rose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes and one or more of these components may be used in combination, and if necessary, may further include other conventional additives such as antioxidants and buffers.
  • a pharmaceutically acceptable carrier that is, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, and dext.
  • Rose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes and one or more of these components may be used in combination, and if necessary, may further include other conventional additives such as antioxidants and buffer
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and / or lubricants can be additionally added to formulate into injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets.
  • it can be preferably formulated according to each component using an appropriate method in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in the formulation, but is preferably formulated as an injection or inhalation.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered parenterally or orally, such as intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation or topical application depending on the desired method.
  • the dosage range varies according to the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity.
  • the daily dosage refers to the amount of the therapeutic substance of the present invention sufficient for treatment for a reduced disease state by being administered to an individual in need of treatment.
  • the effective amount of a therapeutic agent depends on the particular compound, disease condition and severity thereof, and the individual in need of treatment, which can be routinely determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the composition according to the present invention to the human body may vary depending on the patient's age, body weight, sex, dosage form, health condition, and degree of disease, and may be based on an adult patient having a body weight of 70 kg. In this case, it is generally 0.0001 to 1000 mg / day, preferably 1 to 500 mg / day, and may be dividedly administered once to several times a day at regular time intervals.
  • 'individual' refers to a subject in need of treatment of cancer, and more specifically, a human or non-human primate, a mouse, a rat, a dog, a cat, a horse, and a cow.
  • a human or non-human primate a mouse, a rat, a dog, a cat, a horse, and a cow.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for inducing cancer cell death, including; culturing a fibroblast in a hypoxic environment to prepare a conditioned medium.
  • the step of culturing the fibroblasts of the present invention in a hypoxic environment to prepare a conditioned medium includes culturing the fibroblasts at an oxygen concentration lower than the normal atmospheric oxygen concentration of 21%, wherein the hypoxic environment is 0.5% to 7% oxygen It may be a concentration environment, but preferably may be a 0.7% to 5% oxygen concentration environment, and more preferably refers to an oxygen concentration environment of 1%.
  • the medium used in the step of preparing the conditioned medium of the present invention is, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, ⁇ MEM ( ⁇ Minimal essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, etc. can be used, but are not limited to these.
  • composition for inducing cancer cell death through the production method of the present invention When the composition for inducing cancer cell death through the production method of the present invention is used, inhibition of cancer cell proliferation and cell cycle arrest of cancer cells can be effectively induced to kill the cancer cells treated with the composition.
  • the fibroblasts used in the experiment were cultured for 2 weeks or more under normal atmospheric oxygen concentration conditions (21% O 2 ) and hypoxic concentration conditions (1% and 5% O 2 ), and then fibroblasts cultured in each oxygen condition environment 2x10 5 Dog cells in DMEM medium (Dulbeco's Modified Eagle's Media) (Gibco, Grand NY, USA) with 10% FBS (Fetal Bovine Serum) (Gibco, Grand NY, USA) and 1% antibiotic (penicillin / streptomycin) (Gibco, Grand NY, USA) was added to a 100 mm culture plate to which 10 ml of the culture medium solution was added, and cultured for 5 days.
  • DMEM medium Dulbeco's Modified Eagle's Media
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • antibiotic penicillin / streptomycin
  • the cells were washed with 1 X PBS. Thereafter, 6 ml of DMEM without serum was added to the fibroblasts. After 24 hours, a medium was obtained, and the obtained medium was centrifuged at 300 g for 5 minutes. The supernatant was obtained and stored frozen at -80 ° C. Thereafter, in the following examples, the conditioned medium obtained in this example was used.
  • fibroblast control medium cultured under hypoxic conditions were added to each well of a 96-well white plate and cultured for 1 day. Thereafter, 100 ⁇ l of the fibroblast control medium obtained in Example 1 cultured under normal atmospheric oxygen concentration conditions (21% O 2 ) and low oxygen concentration conditions (1% O 2 ) was added to the medium. Thereafter, after incubation for 48 hours (2 days) and 72 hours (3 days), 100 ⁇ l of CellTiter-Glo assay 2.0 reagent (Promega, USA) was added and reacted for 10 minutes.
  • the basic culture medium means a basic culture medium to which 1% antibiotic, DMEM and 10% FBS are added
  • the serum-free medium condition adjustment medium refers to a culture medium of serum-free condition to which only 1% antibiotic and DMEM are added
  • the normal oxygen condition adjusting medium refers to a control medium obtained by culturing fibroblasts under normal oxygen conditions obtained in Example 1
  • the 1% hypoxic condition adjusting medium is used to control fibroblasts under 1% hypoxic conditions obtained in Example 1. It means the conditioned medium obtained by culturing.
  • fibroblast control medium prepared by culturing under hypoxic conditions can kill cancer cells.
  • Annexin V expression analysis was performed. 1.5x10 5 Hela cells were added to each well of a 6-well culture plate, and cultured for 1 day, obtained in Example 1 cultured under normal atmospheric oxygen concentration conditions (21% O 2 ) and low oxygen concentration conditions (1% O 2 ). 2 ml of fibroblast conditioned medium was added to the plate.
  • the Hela cells were cultured for 48 hours, and stained with FITC Annexin V apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, SanDiego, CA, USA), followed by a FACS Caliber flow cytometer ( Results were analyzed using Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), and the results are shown in 2A and 2B, respectively.
  • the basic culture medium means a basic culture medium to which 1% antibiotic, DMEM and 10% FBS are added
  • the serum-free medium condition adjustment medium refers to a culture medium of serum-free condition to which only 1% antibiotic and DMEM are added
  • the normal oxygen condition adjusting medium refers to a control medium obtained by culturing fibroblasts under normal oxygen conditions obtained in Example 1
  • the 1% hypoxic condition adjusting medium is used to control fibroblasts under 1% hypoxic conditions obtained in Example 1. It means the conditioned medium obtained by culturing.
  • the basic culture medium means a basic culture medium to which 1% antibiotic, DMEM and 10% FBS are added
  • the serum-free medium condition adjustment medium refers to a culture medium of serum-free condition to which only 1% antibiotic and DMEM are added
  • the normal oxygen condition adjusting medium refers to a control medium obtained by culturing fibroblasts under normal oxygen conditions obtained in Example 1
  • the 1% hypoxic condition adjusting medium is used to control fibroblasts under 1% hypoxic conditions obtained in Example 1. It means the conditioned medium obtained by culturing.
  • the apoptosis marker caspase 3/7 activity increased in 1% hypoxic condition conditioned medium compared to the control serum-free medium conditioned medium. After 24 hours, it was confirmed that the activity was significantly increased. In particular, when 48 hours have elapsed, it was confirmed that the caspase 3/7 activity was increased by 2 times or more in the 1% hypoxic condition-adjusted medium as compared to the control-free serum-free medium condition.
  • the basic culture medium means a basic culture medium to which 1% antibiotic, DMEM and 10% FBS are added
  • the serum-free medium condition adjustment medium refers to a culture medium of serum-free condition to which only 1% antibiotic and DMEM are added
  • the normal oxygen condition adjusting medium refers to a control medium obtained by culturing fibroblasts under normal oxygen conditions obtained in Example 1
  • the 1% hypoxic condition adjusting medium is used to control fibroblasts under 1% hypoxic conditions obtained in Example 1. It means the conditioned medium obtained by culturing.
  • cancer cells were cultured in a control medium containing 21% normal oxygen condition and a culture medium containing 1% hypoxic condition compared to the control-free medium. It was confirmed that the mitochondrial membrane potential was significantly decreased. In particular, after 48 hours, it was confirmed that the membrane potential of cancer cells was significantly reduced when cultured in a 1% hypoxic condition-adjusted medium than a 21% normal-oxygen condition-adjusted medium.
  • the conditioned medium cultured in a hypoxic environment induced the death of cancer cells, thereby confirming a marked decrease in mitochondrial membrane potential.
  • the basic culture medium means a basic culture medium to which 1% antibiotic, DMEM and 10% FBS are added
  • the serum-free medium condition adjustment medium refers to a culture medium of serum-free condition to which only 1% antibiotic and DMEM are added
  • the normal oxygen condition adjusting medium refers to a control medium obtained by culturing fibroblasts under normal oxygen conditions obtained in Example 1
  • the 1% hypoxic condition adjusting medium is used to control fibroblasts under 1% hypoxic conditions obtained in Example 1. It means the conditioned medium obtained by culturing.
  • the M phase in which the cells divide during the cell cycle of the cultured cancer cells decreases and G0 / G1 phase without cell division And as the S phase is increased, it was confirmed that the effect of suppressing the overall proliferation of cancer cells due to the cell cycle deterrence effect can be exhibited comprehensively.
  • Example 7 Confirmation of hypoxic conditions under which an optimized cancer cell proliferation inhibitory effect of the fibroblast control medium is exhibited
  • fibroblast control medium cultured in the hypoxic conditions of Examples 2 to 6 an experiment was performed to confirm whether the cancer cell killing effect is the best when the hypoxic condition is to a certain extent.
  • Hela cells 1x10 4 cervical cancer cells, were added to each well of a 96-well white plate and cultured for 1 day. Thereafter, 100 ⁇ l of the fibroblast control medium obtained in Example 1 cultured under normal atmospheric oxygen concentration conditions (21% O 2 ) and low oxygen concentration conditions (1% O 2 ) was added to the medium. After incubation for 48 hours, hela cells were reacted for 10 minutes by adding 100 ⁇ l of CellTiter-Glo assay 2.0 reagent (Promega, USA).
  • the basic culture medium means a basic culture medium to which 1% antibiotic, DMEM and 10% FBS are added
  • the serum-free medium condition adjustment medium refers to a culture medium of serum-free condition to which only 1% antibiotic and DMEM are added
  • the normal oxygen condition adjusting medium refers to a control medium obtained by culturing fibroblasts under normal oxygen conditions obtained in Example 1
  • the 1% hypoxic condition adjusting medium is used to control fibroblasts under 1% hypoxic conditions obtained in Example 1.
  • Refers to a conditioned medium obtained by culturing, and a 5% hypoxic condition conditioned medium refers to a conditioned medium obtained by culturing fibroblasts under 5% hypoxic conditions obtained in Example 1.
  • the condition of the hypoxic concentration in which the anticancer effect is optimal is 1%.

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Abstract

본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지를 이용하면 암세포의 증식을 억제하면서 사멸을 유도할 수 있어, 항암제로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조한 조정 배지를 이용하면 주변 정상 세포의 사멸을 유도하지 않으면서 암세포만을 특이적으로 사멸시킬 수 있어 임상으로 바로 적용 가능한 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정 배지를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물 및 이의 제조 방법
본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자의 정상적인 제어가 이루어지지 않아 발생하는 질병, 대표적으로 암으로 통칭되는 질환에 대한 효과적이고 전통적인 치료 방법은 외과적으로 종양을 절제하여 제거하는 방법이 활용되고 있었으나, 원발성 암이 타 기관으로 전이가 되는 경우는 외과적 수술이 불가하여 항암 약물 치료 요법이 사용되었다. 약물 치료로 사용되는 항암제는 주로 단분자 물질을 유기적 또는 무기적 방법으로 합성하여 사용하고 있다. 이러한 방식의 전통적 약물 치료법은 많은 부작용을 수반하는데, 그 중 한 가지는 약물로 사용되는 물질이 인위적으로 합성된 생체 외부 유래 물질이라는 것과 항암 물질의 작용점이 이미 과다 발현된 단백질을 목적으로 한다는 점이다.
섬유아세포(fibroblast)는 선유아세포(線維芽細胞)라고도 불리는 세포로, 결합조직의 고유세포로서 조면소포체와 골지체의 양호한 발육을 특징으로 하는 타원성인 핵과 방추상인 원형질을 갖춘 세포를 말한다. 많은 장기(臟器; internal organsviscera)에 존재하는 간질계세포(間質系細胞; mesenchymal cell)에서 실질세포(實質細胞; parenchymal cell)를 메꾸는 역할을 하는 세포도 포함하며, 교질(collagen)과 프로테오글리칸(proteoglycan) 등 세포간질물질합성 분비능이 있고, 근아세포(myoplast)와는 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.
또한 섬유아세포는 혈청 또는 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor: FGF) 등에 의해 증식하며, 접촉저지(contact inhibition)하면 돌담모양처럼 모양이 변형되며, 정성섬유아세포에서는 계대배양을 반복하는 경우 50대가 되면 거의 사멸하는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 섬유아세포의 접촉저지기능상실(接觸沮止機能喪失; loss of function for contact inhibition)을 이용하여 발암의 선별(screening)에 사용하고 있으며, 세포의 증식연구, 특히 증식인자(growth factor)의 신호전달을 연구하는 데 많이 사용하고 있다.
현재까지 많은 천연물 및 단백질 또는 펩티드성 항암제와 화학합성 항암제가 개발되어 사용되고 있으나, 대부분 생체 내 정상세포에도 영향을 나타내는 심각한 부작용을 나타낼 뿐만 아니라, 암종에 따라 또는 동일한 암종이라도 환자에 따라서 동일한 치료효과가 나타나지 않는 경우가 일반적이다. 이에 따라 전 세계적으로 이러한 문제점들을 해결한 신개념 항암제로서, 생체 내 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서도, 암세포만을 선택적으로 제거할 수 있으면서, 더 나아가 모든 종류의 암세포를 제거할 수 있는 항암제를 개발하기 위하여 많은 연구의 필요성이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 암세포에만 특이적인 사멸을 유도하는 효과를 나타내 항암제로 사용할 수 있는 가능성을 가진 자연적으로 존재하는 세포 및 단백질에 관해 연구하던 중 저산소 배양환경에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지가 암세포의 증식을 억제하면서 동시에 세포사멸(apoptosis)을 유도할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포의 사멸 유도 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 포함하는 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 암세포 사멸 유도 또는 암세포 증식 억제 유도 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 섬유아세포(fibroblast)를 저산소 환경에서 배양하여 조정 배지를 제조하는 단계;를 포함하는 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지를 이용하면 암세포의 증식을 억제하면서 사멸을 유도할 수 있어, 항암제로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조한 조정 배지를 이용하면 주변 정상 세포의 사멸을 유도하지 않으면서 암세포만을 특이적으로 사멸시킬 수 있어 임상으로 바로 적용 가능한 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 저산소 조건에서 배양한 섬유아세포 조정 배지를 48 시간(2일) 및 72 시간(3일) 동안 배양한 경우에 발생하는 Hela 세포 증식 억제능을 확인한 실험 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 2A는 기본 배양 배지, 무혈청 배지조건, 21% 정상산소 조건, 1% 저산소 조건 배지 별 아넥신 V 분석을 통한 Hela 세포의 세포사멸(apoptosis)의 정도를 나타낸 결과를 나타낸 도이다.
도 2B는 기본 배양 배지, 무혈청 배지조건, 21% 정상산소 조건, 1% 저산소 조건 배지 별 아넥신 V 분석을 통한 Hela 세포의 세포사멸(apoptosis)의 정도를 그래프화하여 나타낸 도(도 2B)이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 3은 기본 배양 배지, 무혈청 배지조건, 21% 정상산소 조건, 1% 저산소 조건 배지별 암세포의 Caspase3/7 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 4는 기본 배양 배지,무혈청 배지조건, 21% 정상산소 조건, 1% 저산소 조건 배지별 암세포의 미토콘드리아 막 포텐셜 변화를 측정한 실험 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 5A는 기본 배양 배지, 무혈청 배지조건, 21% 정상산소 조건, 1% 저산소 조건 배지 별 암세포 세포 주기를 계수한 결과를 나타낸 도이다.
도 5B는 암세포의 각각의 세포 주기에 해당하는 암세포를 기본 배양 배지, 무혈청 배지조건, 21% 정상산소 조건, 1% 저산소 조건 배지 별로 표시한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 6은 저산소 농도 조건을 1% 및 5%로 하고 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정 배지에서 확인한 암세포 사멸 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포의 사멸 유도 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "섬유아세포"란 섬유아세포(fibroblast)는 선유아세포(線維芽細胞)라고도 불리는 세포로, 결합조직의 고유세포로서 조면소포체와 골지체의 양호한 발육을 특징으로 하는 타원성인 핵과 방추상인 원형질을 갖춘 세포를 말한다.
본 발명에서의 용어, '배지(culture media)'는 체외배양 조건에서 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 섬유아세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 "조정 배지(conditioned medium, CM)"란, 섬유아세포를 배양하여 수득된 배양액 자체, 또는 그로부터 섬유아세포가 제거된 배양 상층액을 의미하며, "섬유아세포 배양 상층액", "섬유아세포 배양액" 또는 "섬유아세포 배양 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 배지는 영양혼합물(Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양 혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양 혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 M199, MCDBllO, MCDB202, MCDB302 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서는 저산소 환경에서 섬유아세포를 배양하여 조정 배지를 제조하였으며, 상기 제조된 조정 배지가 항암활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 일 구체예에서 확인한 상기 항암 활성은 암세포 증식 억제, 암세포 사멸(apoptosis) 유도, 암세포 세포 주기 억류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 활성인 것을 확인하였다. 특히 본 발명에서는 세포 사멸 유도 활성이 caspase 3/7 활성 증가 또는 미토콘드리아 막 포텐셜 감소에 의한 것임을 확인하였다.
본 발명에 있어서 “저산소” 환경 조건은 정상 대기 산소 농도인 21%보다 낮은 산소 농도를 의미하는 것으로, 0.5% 내지 7% 산소 농도일 수 있으나, 바람직하게는 0.7% 내지 5% 산소 농도일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1%의 산소 농도를 포함하는 배양 조건일 수 있다.
또한, 본 발명은 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 포함하는, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 암세포 사멸 유도 또는 암세포 증식 억제 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포 배양액을 포함하는 배지 조성물은 상기 조성물이 처리된 암세포의 caspase 3/7 활성을 증가시키거나 또는 미토콘드리아 막 포텐셜을 감소시킴으로써 암세포의 사멸을 유도할 수 있는 바, 효과적으로 암세포 사멸 유도 용도로 활용할 수 있다. 또한 본 발명의 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포 배양액을 포함하는 배지 조성물은 처리된 암세포의 세포 주기를 억류시킬 수 있어 효과적으로 암세포 증식 억제 용도로 활용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서의 '암'이란 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말한다. 본 발명의 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 저산소 환경에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정 배지를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.0001 ~ 1000 ㎎/일, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.
본 발명에서 '개체'란 암의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한 본 발명은 섬유아세포(fibroblast)를 저산소 환경에서 배양하여 조정 배지를 제조하는 단계;를 포함하는 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 섬유아세포를 저산소 환경에서 배양하여 조정 배지를 제조하는 단계는 섬유아세포를 정상 대기 산소 농도인 21%보다 낮은 산소 농도에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 저산소 환경은 0.5% 내지 7% 산소 농도 환경일 수 있으나, 바람직하게는 0.7% 내지 5% 산소 농도 환경일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1%의 산소 농도 환경을 말한다.
본 발명의 조정 배지 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등을 사용할 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조 방법을 통한 암 세포 사멸 유도용 조성물을 이용하면 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 세포 주기 억류시켜 상기 조성물을 처리한 암세포의 사멸을 효율적으로 유도할 수 있다.
본 발명을 이하 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 섬유아세포(fibroblast) 배양을 통한 조정 배지의 제조
실험에 사용한 섬유아세포를 정상 대기 산소 농도 조건(21% O 2) 및 저산소 농도 조건(1% 및 5% O 2)에서 2주 이상 배양한 후, 각각의 산소 조건 환경에서 배양한 섬유아세포 2x10 5 개의 세포를 DMEM 배지(Dulbeco's Modified Eagle's Media)(Gibco, Grand NY, 미국)에 10% FBS (Fetal Bovine Serum)(Gibco, Grand NY, 미국) 및 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)(Gibco, Grand NY, 미국)를 첨가한 배양배지 용액 10ml을 첨가한 100mm 배양 플레이트에 seeding 하고 5일 동안 배양하였다. 이후, 섬유아세포의 세포 confluency가 90%가 될 때 1 X PBS로 세척하였다. 이후, 무혈청 조건의 DMEM 6ml를 섬유아세포에 첨가하였다. 24시간 이후, 배지를 수득하였으며, 수득한 배지를 300g로 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 수득하여 이를 -80℃에서 냉동보관하였다. 이후, 이하의 실시예에서는 본 실시예에서 수득한 조정 배지를 사용하였다.
실시예 2. 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 암세포 증식 억제능의 확인
저산소 농도 조건에서 배양한 섬유아세포 조정 배지가 암세포의 증식을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 96 웰 white 플레이트의 각 웰에 1x10 4 개의 자궁경부암 세포인 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O 2)과 저산소 농도 조건(1% O 2)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 이 후, 48 시간(2일) 및 72 시간(3일) 동안 배양 후 CellTiter-Glo assay 2.0 reagent (Promega, USA)를 100 ㎕ 첨가하고 10분 동안 반응시켰다. 반응 이후에 GLOMAX Multi Detection System (Promega BioSystems Sunnyvale, Inc. USA)으로 발광을 분석하였고, 분석을 수행한 결과를 도 1에 나타내었다. 기본 배양 배지는 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, 무혈청 배지조건 조정 배지는 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, 21% 정상산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미하고, 1% 저산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미한다.
도 1에서 확인한 바와 같이, 각 배지 조건에서 2일 동안 hela 세포를 배양한 경우, 배양배지의 대조군인 무혈청 배지조건 조정 배지 대비 21% 정상산소 조건 조정 배지 및 1% 저산소 조건 조정 배지에서 hela 세포의 증식이 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 1% 저산소 조건 조정 배지는 대조군인 무혈청 배지조건 조정 배지 보다 암세포의 증식이 1/3정도 수준으로까지 감소한 것이 확인되었으며, 21% 정상산소 조건 조정 배지와 비교한 경우에 암세포 증식 수준은 약 1/2 이하로 감소된 것을 확인하였다. 상기와 같은 조정 배지의 암세포 증식 억제능은 3일 동안 배양한 경우에 두드러지게 나타났는데, 21% 정상산소 조건 조정 배지 및 1% 저산소 조건 조정 배지에서 배양한 경우 hela 세포의 증식 억제가 2일 동안 배양한 경우보다 더욱 나타났으며, 특히 1% 저산소 조건 조정 배지에서는 암세포의 증식억제능이 현저하게 나타났다. 종합적으로 저산소 환경에서 섬유아세포를 배양한 경우에 있어서 그 배양 배지는 암세포 증식 억제능력이 더욱 우수하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 아넥신 V를 통한 암세포 사멸 효과의 확인
저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지가 암세포를 사멸시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 아넥신 V 발현 분석을 수행하였다. 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 1.5x10 5 Hela 세포를 넣고 하루 동안 배양 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O 2)과 저산소 농도 조건(1% O 2)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 2 ml를 플레이트에 첨가하였다. 이 후, 48 시간 동안 Hela 세포를 배양하고 이를 FITC 아넥신(Annexin) V apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, SanDiego, CA, USA) 으로 염색한 후, 세포자동해석분리장치(FACS) Caliber flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 결과를 분석하였고, 그 결과를 각각 2A 및 도 2B에 나타내었다. 기본 배양 배지는 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, 무혈청 배지조건 조정 배지는 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, 21% 정상산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미하고, 1% 저산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미한다.
도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, 아넥신 V 분석을 통하면 세포의 세포사멸을 확인할 수 있는데, 기본 배양 배지 및 무혈청 배지 조건에서 배양한 경우 암세포가 사멸이 거의 없어 생존한 세포의 수가 대부분인 것을 확인하였다. 다만, 초기 세포 사멸(early apoptosis)은 무혈청 배지조건 조정 배지 대비 21% 정상산소 조건 조정 배지 및 1% 저산소 조건 조정 배지에서 배양한 Hela 세포에서 유의하게 나타나는 것을 확인하였다. 후기 세포 사멸 즉 사멸한 암세포(late apoptosis/dead)는 특히 저산소 환경에서 배양한 1% 저산소 조건 조정 배지의 경우에 21% 정상산소 조건 조정 배지 대비 사멸한 암세포의 수가 현저하게 상승한 것을 확인할 수 있었는데, 약 3배 이상 증가한 것이 확인되었다. 이를 통하여 저산소 환경에서 배양한 조정 배지는 암세포의 세포 사멸을 유도하고, 최종적으로는 암세포의 사멸까지 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 caspase 3/7 활성 분석을 통한 암세포 사멸 효과의 확인
저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지에서 배양한 암세포의 caspase 3/7 활성을 확인함으로써 상기 조정 배지가 암세포의 사멸을 유도하는지 확인하는 실험을 수행하였다. 96 웰 white 플레이트의 각 웰에 1x10 4 개의 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O 2)과 저산소 농도 조건(1% O 2)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 12, 24, 48시간 동안 상기 배지에서 배양한 후 Caspase-Glo 3/7 Assay(Promega, USA)를 100 ㎕ 첨가한 후에 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 GLOMAX Multi Detection System (Promega BioSystems Sunnyvale, Inc. USA)으로 발광을 분석하였으며, 상기 분석을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. 기본 배양 배지는 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, 무혈청 배지조건 조정 배지는 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, 21% 정상산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미하고, 1% 저산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미한다.
도 3에서 확인한 바와 같이, 조정 배지에서 배양을 시작하여 12시간이 경과한 후에는 세포사멸 마커인 caspase 3/7 활성이 대조군인 무혈청 배지조건 조정 배지 대비 1% 저산소 조건 조정 배지에서 증가하였으며, 24시간이 경과한 후에 보다 현저하게 그 활성이 증가된 것을 확인하였다. 특히 48시간이 경과된 경우에는 대조군인 무혈청 배지조건 조정 배지 대비 1% 저산소 조건 조정 배지에서 caspase 3/7 활성이 2배 이상 증가된 것을 확인하였다. 이에, 섬유아세포를 저산소 환경에서 배양하여 제조된 조정 배지에서 암세포를 배양시키면 세포 사멸인자인 caspase 3/7의 활성이 현저하게 증가한 것을 확인하여, 상기 조정 배지를 통하면 암세포를 현저하게 세포 사멸시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 미토콘드리아 막 포텐셜(Mitochondria membrane potential) 분석을 통한 암세포 사멸 효과의 확인
세포 사멸이 발생하면 미토콘드리아의 막 포텐셜의 변화가 발생한다. 이에, 저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지가 암세포를 사멸시킬 수 있는지 여부를 미토콘드리아 막 포텐셜 분석을 통하여 확인하는 실험을 수행하였다. 96 웰 black 플레이트의 각 웰에 1x10 4 개의 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O 2)과 저산소 농도 조건(1% O 2)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 12, 24 및 48시간 동안 상기 배지에서 배양한 후 Orange Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK)을 처리하였고, 이 후 Mithras 2LB 943 Multimode Reader (Berthold Biotechnologies, Bad Wildad. Germany)로 형광(Ex/Em = 540/590 nm)의 조건에서 그 결과를 분석하였고, 이를 도 4에 나타내었다. 기본 배양 배지는 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, 무혈청 배지조건 조정 배지는 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, 21% 정상산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미하고, 1% 저산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미한다.
도 4에서 확인한 바와 같이, 조정 배지에서 배양을 시작하여 24시간이 경과한 후에 대조군인 무혈청 배지조건 조정 배지 대비 21% 정상산소 조건 조정 배지 및 1% 저산소 조건 조정 배지에서 배양한 경우에 암세포의 미토콘드리아 막 포텐셜이 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 특히 48시간이 경과된 후에는 21% 정상산소 조건 조정 배지 보다 1% 저산소 조건 조정 배지에서 배양한 경우에 암세포의 막 포텐셜이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 저산소 환경에서 배양한 조정 배지는 암세포의 사멸을 유도하여 미토콘드리아 막 포텐셜의 현저한 감소를 확인할 수 있었다.
실시예 6. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 암세포의 세포 주기 억류 효과의 확인
저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지가 암세포의 세포주기를 억류시켜 세포의 증식을 억제시킬 수 있는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 1.5x10 5 개의 Hela 세포를 넣고 하루 동안 배양한 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O 2)과 저산소 농도 조건(1% O 2)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 2 ml를 플레이트에 첨가하였다. 이후 24시간 동안 배양한 후 Hela 세포를 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide)(Abcam, Cambridge, UK)로 염색한 후, FACSVerse™ flow cytometer (BD, USA)로 분석을 수행하였으며, 배지 별 암세포 세포 주기를 계수한 결과를 도 5A에, 암세포의 각각의 세포 주기에 해당하는 암세포를 배지별로 표시한 결과를 도 5B에 나타내었다. 기본 배양 배지는 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, 무혈청 배지조건 조정 배지는 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, 21% 정상산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미하고, 1% 저산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미한다.
도 5A 및 5B에서 확인한 바와 같이, 21% 정상산소 조건 조정 배지 보다 1% 저산소 조건 조정 배지를 처리하여 배양한 경우에 Hela cell에서 G0/G1기는 다소 증가하였으나, S기 및 G2/M기에 해당하는 세포의 수는 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 암세포는 정상세포 대비 현저한 세포 증식이 특징으로 나타나는데, 저산소 환경에서 배양한 조정 배지에서 암세포를 배양하면 배양한 암세포의 세포 주기 중 세포가 분열하는 M기가 감소함과 동시에 세포 분열이 없는 G0/G1기 및 S기가 증가하는바, 세포 주기 억류 효과가 나타나 암세포의 전체적인 증식이 억제되는 효과가 종합적으로 나타날 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 섬유아세포 조정 배지의 최적화된 암세포 증식억제 효과가 나타나는 저산소 농도 조건의 확인
상기 실시예 2 내지 6의 저산소농도 조건에서 배양한 섬유아세포 조정 배지에 있어서, 저산소 농도 조건이 어느 정도인 경우에 암세포 사멸효과가 가장 우수한지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 96 웰 white 플레이트의 각 웰에 1x10 4 개의 자궁경부암 세포인 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O 2)과 저산소 농도 조건(1% O 2)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 48시간 동안의 배양 이후, hela 세포를 CellTiter-Glo assay 2.0 reagent (Promega, USA)를 100 ㎕ 첨가하여 10분간 반응시켰다. 이 후 GLOMAX Multi Detection System (Promega BioSystems Sunnyvale, Inc. USA)으로 발광을 분석하였고, 이를 분석한 실험 결과를 도 6에 나타내었다. 기본 배양 배지는 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, 무혈청 배지조건 조정 배지는 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, 21% 정상산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미하고, 1% 저산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미하며, 5% 저산소 조건 조정 배지는 실시예 1에서 수득한 5% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정 배지를 의미한다
도 6에서 확인한 바와 같이, 저산소 농도 조건 중 1% 산소 농도 조건 조정 배지가 5% 산소 농도 조건 조정 배지보다 유의할 정도로 암세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이에, 항암효과가 최적으로 나타나는 저산소 농도의 조건은 1%인 것을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 저산소 환경은 0.5% 내지 7%의 산소를 포함하는 배양 조건인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조정 배지는 항암 활성을 나타내는 것인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항암 활성은 암세포 증식 억제, 암세포 사멸(apoptosis) 유도 및 암세포 세포 주기 억류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 활성인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암세포 사멸 유도 활성은 caspase 3/7 활성 증가 또는 미토콘드리아 막 포텐셜 감소에 의한 것인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
  6. 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 포함하는, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 섬유아세포(fibroblast)를 저산소 환경에서 배양하여 조정 배지를 제조하는 단계;를 포함하는 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법.
  10. 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정 배지(conditioned medium)를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포의 사멸 유도 방법.
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