WO2020045962A1 - 알츠하이머성 치매 진단용 펩타이드 바이오마커 - Google Patents

알츠하이머성 치매 진단용 펩타이드 바이오마커 Download PDF

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alzheimer
dementia
peptide
seq
antibody
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박성규
심규영
이건호
김병채
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Gwangju Institute of Science and Technology
Industry Foundation of Chonnam National University
Chosun University Industry Academic Cooperation Foundation
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Gwangju Institute of Science and Technology
Industry Foundation of Chonnam National University
Chosun University Industry Academic Cooperation Foundation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a diagnosis of Alzheimer's dementia of a peptide that binds to a specific autoantibody of an Alzheimer's dementia patient, and specifically includes a peptide consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 as an active ingredient.
  • Alzheimer's dementia diagnostic composition Diagnostic kits; Information providing method for diagnosing Alzheimer's dementia using the composition; And an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10, to a peptide that binds to a specifically increasing antibody in Alzheimer's dementia patients.
  • diagnostic methods used for diagnosing Alzheimer's disease include genetic tests, neuropsychological tests, cognitive function tests, cerebrospinal fluid tests, and brain imaging tests (MRI, PET).
  • Genetic testing is a test that detects the risk of Alzheimer's dementia by testing for an Alzheimer's dementia specific gene called ApoE4.
  • ApoE4 may increase the risk of dementia invention, but because it is not a decisive factor, it is difficult to diagnose Alzheimer's dementia by the test alone.
  • the neuropsychological test and cognitive function test is a method for measuring the degree of cognitive impairment of the patient through the questionnaire, there is a simple mental state test (MMSE), Montreal cognitive test (MoCA), SNSB.
  • the cerebrospinal fluid test is a method of extracting cerebrospinal fluid to quantitatively diagnose beta-amyloid or tau protein, which is known as an Alzheimer's trigger. May cause rejection.
  • Brain imaging tests (MRI, PET) is a method that analyzes the brain damage and beta-amyloid and tau proteins, MRI or PET imaging, and Alzheimer's triggers. Although it has high accuracy for diagnosis, it requires expensive equipment and expertise in imaging when Alzheimer's dementia is diagnosed, so there is a limitation in distribution and high diagnostic cost.
  • Alzheimer's factor As such, there are various techniques for diagnosing Alzheimer's dementia, but each technique has various limitations such as accuracy problems, cost problems, time problems, and physical pain.
  • the limitation of this prior art is that the Alzheimer's factor, beta-amyloid and tau protein, does not appear significant in the blood enough to be used for diagnosing dementia, and there is no limit to the fact that there is no biomarker for diagnosing Alzheimer's dementia available through blood There is this.
  • the present inventors have diligently studied to prepare a composition for diagnosing Alzheimer's disease that can use blood, and when using a peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10, the conventional Alzheimer's dementia diagnosis method has The present invention was completed by overcoming limitations due to cost, time, pain and side effects, and confirming that Alzheimer's dementia can be diagnosed through blood.
  • One object of the present invention is to provide a composition for diagnosing Alzheimer's dementia, comprising as an active ingredient a peptide consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10.
  • Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing Alzheimer's dementia, comprising as an active ingredient a peptide consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10.
  • Yet another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing Alzheimer's dementia, comprising detecting an antibody or measuring expression of an antibody in a sample using the composition from a sample isolated from an individual.
  • Yet another object of the present invention is to provide a peptide that binds to an antibody that is specifically increased in Alzheimer's dementia patients consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10.
  • Peptides consisting of one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 according to the present invention can specifically bind to antibodies that specifically increase in the blood of Alzheimer's dementia patients.
  • FIG. 1A and 1B show a volcano plot of peptides for Alzheimer's dementia specific antibodies (FIG. 1A: IgM, FIG. 1B: IgG). Peptides that target specifically increasing antibodies in Alzheimer's dementia are indicated in the right box.
  • ROC operating operating curve
  • 3A and 3B show AUC values through the ROC analysis of these combinations by selecting the top five AUC values among the peptides selected in FIGS. 2A and 2B, respectively.
  • Figures 5a and 5b is to select the top five peptides of the AUC value among the peptides selected in Figs. 2a and 2b, respectively, antibodies targeting each of the five peptides (Fig. 5a: IgM, Fig. 5b: IgG)
  • the MFI value of is shown as a dot plot.
  • Figures 6a and 6b is to select the top five peptides of the AUC value among the peptides selected in Figs. 2a and 2b, respectively, to determine the MFI value of the antibody (Fig. 6a: IgM, Fig. 6b: IgG) targeting these combinations It is represented by a dot plot.
  • Figure 7 shows a Pearson correlation coefficient analysis of the peptide of SEQ ID NO: 1 correlated with K-MMSE among the selected peptides.
  • one embodiment of the present invention provides a composition for diagnosing Alzheimer's dementia, comprising as an active ingredient a peptide consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10.
  • the peptide of the present invention may be a peptide consisting of one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 described in Table 1 below. Or a combination of five peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 or a combination of five peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 10, or a peptide 10 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 It may be a combination of species, but is not limited thereto.
  • Peptide sequence number Peptide amino acid sequence AUC value SEQ ID NO: 1 RGPLRQGRNTGAAGA 0.837 SEQ ID NO: 2 VFTAWMGLEFAYGDK 0.825 SEQ ID NO: 3 HKRIFGSHHPTHDLG 0.825 SEQ ID NO: 4 GRVWNVDMRRCDFSE 0.823 SEQ ID NO: 5 GQRDAPMVTHRPSPH 0.820 SEQ ID NO: 6 PPHVISYHSYPDAWD 0.867 SEQ ID NO: 7 SKGTDPTRTVWERPF 0.820 SEQ ID NO: 8 FLDMDQRPWNPFVWD 0.817 SEQ ID NO: 9 EHPHRDELQQRFFPD 0.817 SEQ ID NO: 10 SNLIRLKEFTDYLFF 0.814
  • the peptide may bind to autoantibodies that are specifically upregulated or downregulated in Alzheimer's dementia patients, specifically binding to IgG or IgM antibodies that specifically increase in Alzheimer's dementia patients, It is not limited to this.
  • Alzheimer's dementia of the present invention means the symptoms of dementia caused by Alzheimer's disease.
  • the Alzheimer's disease refers to the most common degenerative brain disease causing dementia, first reported by Dr. Alzheimer's, Germany, and it is known that as Alzheimer's disease progresses, the overall cognitive function including memory is gradually weakened.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of a subject to a particular disease or disorder, determining whether the subject currently has a particular disease or disorder, the prognosis of the subject having a particular disease or disorder. determining prognosis, or therametrics (eg, monitoring the condition of an individual to provide information about treatment efficacy).
  • the selected 64 or 49 peptides are clearly defined as the Alzheimer's dementia population (AD) and the normal population (ND). It was confirmed that it can be divided (Fig. 4a and 4b).
  • microarray intensity (MFI) analysis confirmed that each of the five peptides selected and their combinations showed significant differences in MFI values between the AD and ND populations (FIGS. 5A, 5B and 6A, 5B). ).
  • composition of the present invention comprising a peptide consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 10 as an active ingredient is a target of an antibody that is specifically increased in Alzheimer's dementia patients, Alzheimer's dementia It was confirmed that the excellent diagnostic efficacy of.
  • all five peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 5 or all five peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 to 10 shows a very high AUC value, very significant Alzheimer's diagnostic efficacy It could be confirmed that it has.
  • kits for diagnosing Alzheimer's dementia comprising as an active ingredient a peptide consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs.
  • the kit of the present invention refers to a kit including the composition for diagnosing Alzheimer's dementia, and using the kit of the present invention, it may be determined that a patient with Alzheimer's dementia or the risk of developing Alzheimer's dementia.
  • the kit for diagnosing Alzheimer's dementia of the present invention includes one or more other constructs suitable for analytical methods as well as the peptide for measuring the detection or expression of autoantibodies, in particular IgM or IgG, which are specifically increased in Alzheimer's patients. Component compositions, solutions or devices may be included.
  • the kit of the present invention may include a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a coloring enzyme or a fluorescent substance, a coloring substrate, and the like for immunological detection of the antibody.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized with a polyester resin, a slide glass made of glass, and the like, and the chromase is peroxidase, alkaline.
  • the phosphatase Alkaline Phosphatase
  • the fluorescent material can be used FITC, RITC and the like
  • the colorant substrate liquid is ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ))
  • OPD ⁇ -phenylenediamine
  • TMB tetramethyl benzidine
  • Another aspect of the invention provides a method for providing information for diagnosing Alzheimer's dementia, comprising detecting an antibody in a sample or measuring expression thereof using the composition from a sample isolated from an individual.
  • the antibody may be an IgM or IgG antibody.
  • the peptide included in the composition may be any one or more of five peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5, and may include all five peptides.
  • the antibody is an IgG antibody, at least one of five peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 10 may be included and all five peptides may be included. But it is not limited thereto.
  • the term "individual" of the present invention refers to a subject for whom to diagnose Alzheimer's dementia or to predict the risk of developing it.
  • the subject may include any person, including a dog, a horse, a cow, a rat, a goat, a rabbit, a chicken, a duck, a goose, and any animal that may develop Alzheimer's dementia.
  • sample of the present invention refers to a sample such as tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine derived from the subject and capable of detecting autoantibodies specifically upregulated in Alzheimer's dementia. And the like, in particular, but not limited to, a blood sample isolated from an individual.
  • the information providing method of the present invention is a method for diagnosing Alzheimer's dementia or providing information for determining the risk of developing Alzheimer's. Or detecting an antibody in a sample isolated from the subject to determine the degree of up-regulation or down-regulation of the antibody; Or measuring the expression thereof.
  • the information providing method may further comprise comparing the expression level of the antibody with the expression level of the antibody in a sample isolated from the normal control.
  • the reference value for comparing the expression level of the antibody may be, but not limited to, the area under the curve (AUC) or the microarray intensity (MFI) of the receiver manipulation characteristic curve (ROC).
  • AUC area under the curve
  • MFI microarray intensity
  • ROC receiver manipulation characteristic curve
  • the degree of binding between the antibody and the composition in the sample isolated from the individual is measured, and when the individual shows an increased degree of binding compared to the normal control or is higher than a specific cut-off value, It may be determined that the patient has Alzheimer's dementia or the risk of developing Alzheimer's dementia is high.
  • the expression level of the antibody is higher than the expression level of the antibody in the sample isolated from the normal control, the subject may be determined to be Alzheimer's dementia, or the risk of developing Alzheimer's dementia.
  • Another aspect of the invention provides a peptide that binds to an antibody that specifically increases in Alzheimer's dementia patient, consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10.
  • the antibody may be an IgM or IgG antibody.
  • the peptide may be any one or more of five peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5, and when the antibody is an IgG antibody, the peptide is an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 6 to 10 At least one of five peptides consisting of.
  • Peptides of the invention can also be used as probes, which refers to labeled peptides capable of binding to specific autoantibodies in Alzheimer's dementia patients.
  • Another aspect of the invention provides the use of a peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10 for preparing a composition for diagnosing Alzheimer's dementia.
  • Another aspect of the invention provides the use of a polynucleotide encoding said peptide.
  • the peptide is as described above.
  • the serum samples used in the examples below are serum samples of 19 Alzheimer's dementia patients (experimental group, AD) obtained from Chosun University Hospital and Chungnam National University Medical School and 19 normal individuals (control, ND) of age matched with the experimental group. . In addition, because Alzheimer's dementia develops more frequently in women, all serum samples were obtained from women to reduce potential sexual bias. The clinical diagnosis of Alzheimer's dementia was based on criteria defined by the National Institute on Aging-Alzheimer's Association. To confirm the diagnosis of Alzheimer's dementia, all experimental (AD) and control (ND) subjects were subjected to magnetic resonance imaging or positron emission tomography using F-18 florbetaben (NeuraCeq TM). received.
  • Korean Mini-Mental State Examination (K-MMSE) score was measured to evaluate the severity of dementia.
  • Chips of random peptide microarrays were coated with duplicates of 29,240 peptides (58,480 peptide spots).
  • FLAG (DYKDDDKAS) peptide and HA (YPYDVPDYAG) peptide were further coated with control peptide.
  • Coated microarrays were blocked with blocking buffer MB-070 (Rocland, Gilbertsville, PA, USA) for 30 minutes. The chip was then incubated for 45 minutes with goat anti-human IgM or IgG conjugated to DyLight680 diluted 1: 5000 at room temperature (RT). This was done to check the background between the secondary antibody and the peptide library in the plate.
  • the random peptide microarray data obtained by the above procedure was subjected to the following signal intensity correction process.
  • microarray data was removed from the background noise using Spotxel® microarray Image and Data Analysis software.
  • the background signal between the secondary antibody and peptide library was then removed based on the intensity of the averaged median.
  • Raw data between microarray chips was quantile normalized using the devtools package of R 3.4.0 software (R Development Core Team, 2017) to compensate for variations between chips.
  • microarray intensity fold change (ND / AD ⁇ 2) and Student's t between Alzheimer's dementia and normal individuals Peptide candidates were selected using the P-value ( ⁇ 5) using the test's t test.
  • IgM was specifically upregulated in Alzheimer's dementia patients by screening using fold change (ND / AD ⁇ 2) and P-value ( ⁇ 5) of 29,490 types of peptides identified by random peptide microarrays.
  • Peptides targeting the antibody ( FIG . 1A ) or IgG ( FIG. 1B ) were selected and indicated in red (right box Peptides).
  • 170 peptide candidate groups were selected for the IgM antibody and 144 peptide candidate groups were selected for the IgG antibody.
  • AUC receiver operating characteristic curve
  • the AUC value is a quantitative expression of the Alzheimer's diagnostic performance of a peptide marker that is a target of an antibody that is specifically increased in Alzheimer's dementia patients. Specifically, when the AUC value of the peptide marker is 0.75 or more, it can be considered to have a normal diagnostic performance, and when the AUC value is 0.80 or more, it has excellent diagnostic performance.
  • FIGS. 2A and 2B Peptides with an AUC value of 0.75 or greater were selected and shown in FIGS. 2A and 2B.
  • the portion marked in red (shaded) represents the selected peptide, and the portion marked in blue represents the unselected peptide.
  • 64 peptides were selected for IgM ( FIG. 2A ) and 49 peptides for IgG ( FIG. 2B ).
  • peptides having the highest AUC values were selected as peptides targeted by IgM or IgG antibodies specifically upregulated in Alzheimer's dementia patients.
  • the AUC values for the selected peptides, the sequence numbers of the selected peptides and the respective amino acid sequences are shown in Table 2 below.
  • the peptide marker of the present invention is a peptide that is a target of an antibody that is specifically increased in Alzheimer's dementia patients, and has excellent diagnostic performance in diagnosing the disease. You can check it.
  • the AUC value was calculated by ROC analysis for the markers of the five peptides selected for the IgM and IgG, respectively, and showed a very high AUC value. (IgM: 0.945, IgG: 0.892).
  • each peptide marker selected as well as a combination thereof can serve as a target of an antibody specifically upregulated in Alzheimer's dementia, having very good diagnostic performance.
  • Example 2 Confirmation of diagnostic efficacy of Alzheimer's dementia using selected peptide markers and combinations thereof
  • the selected 64 species (Fig. 4a) or 49 peptides (Fig. 4b) peptide markers are each specifically upregulated IgM, IgG type antibodies in patients with Alzheimer's dementia
  • AD Alzheimer's dementia population
  • ND normal population
  • the antibody was specifically upregulated in Alzheimer's dementia patients targeting the peptide marker.
  • Random peptide microarray intensity (MFI) values were analyzed in Dot Alzheimer's disease (AD) and normal subjects (ND). Here, it can be interpreted that the greater the difference between MFI values of Alzheimer's dementia patients and normal individuals, the better the diagnostic performance of the peptide marker.
  • Statistical tests for each peptide and combinations thereof were run through Student's t test. * Indicates p ⁇ 0.05, ** indicates p ⁇ 0.01, and *** indicates p ⁇ 0.001.
  • each of the five selected peptide markers showed significant differences in MFI values for Alzheimer's dementia patients (AD) and normal individuals (ND). You can check.
  • the peptide (UM # 1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 among the five peptides for IgM showed the largest difference in MF1 value, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 among the five peptides for IgG Since the peptide (UG # 1) has the largest difference in MF1 value, it can be confirmed that the peptide has the best diagnostic performance.
  • the combination of the five selected peptide markers can also be seen that the difference in MFI values for Alzheimer's dementia patients (AD) and normal individuals (ND) is remarkable have.
  • the selected peptide marker and a combination thereof may be a target of antibodies specifically upregulated in Alzheimer's dementia patients, it can be confirmed that it has excellent efficacy in the diagnosis of Alzheimer's dementia.
  • each of the peptide marker and dementia Correlations with K-MMSE scores used as a measure of severity, were analyzed.
  • the K-MMSE score is expressed as at least 0 to 30 points, the higher the score indicates a decrease in cognitive function.
  • the MFI value and K-MMSE score of the peptide (UM # 1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 showing the largest difference in the MFI value in Example 2-2 Indicates that r ⁇ ⁇ 0.5 and p ⁇ 0.001. That is, when the diagnosis of Alzheimer's using the peptide marker, it can be confirmed that K-MMSE score is very similar to the result of diagnosing Alzheimer's dementia. Through this, when using the selected peptide marker of the present invention, it can be confirmed that Alzheimer's dementia can be diagnosed to the extent that the existing Alzheimer's dementia diagnostic method.
  • the selected peptides of the present invention and combinations thereof are targeted to antibodies which are specifically increased in Alzheimer's dementia patients, enabling diagnosis through blood, and thus, the cost of the existing Alzheimer's diagnosis method It was confirmed that it can be used as an excellent diagnostic marker of Alzheimer's dementia, overcoming problems due to time, side effects, and the like.

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Abstract

본 발명은 알츠하이머성 치매 환자의 특이적인 자가항체와 결합하는 펩타이드의 알츠하이머성 진단 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물; 진단용 키트; 상기 조성물을 이용한 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보제공방법; 및 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진, 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 항체에 결합하는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 알츠하이머성 치매환자의 혈액 내에서 특이적으로 증가하는 항체와 특이적으로 결합할 수 있으므로, 혈액을 통한 진단이 불가능하였던 기존 알츠하이머성 치매 진단 방법의 한계점을 극복하고, 혈액을 기반으로 한 알츠하이머성 치매 진단에 이용될 수 있다.

Description

알츠하이머성 치매 진단용 펩타이드 바이오마커
본 발명은 알츠하이머성 치매 환자의 특이적인 자가항체와 결합하는 펩타이드의 알츠하이머성 치매 진단 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물; 진단용 키트; 상기 조성물을 이용한 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보제공방법; 및 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진, 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 항체에 결합하는 펩타이드에 관한 것이다.
전세계적으로 초고령화 현상으로 인한 치매 환자의 증가는 현재 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 2014년 국회예산정책저에 따르면 65세 이상의 치매 유병률은 2020년에 84만명, 2050년에 217만명으로 늘어날 것으로 예상되며, 이에 따라 치매로 인한 사회적 비용의 규모 역시 2013년 11조7000억원에서, 2030년 23조 1000억원, 2040년 34조 2000억원, 2050년 43조 2000억원으로 급격히 늘어날 것으로 예상된다고 한다.
현재, 알츠하이머성 치매 진단을 위해서 사용되고 있는 진단 방법에는 유전자 검사, 신경심리검사 및 인지기능 검사, 뇌척수액 검사, 뇌영상 검사(MRI, PET)가 있다. 유전자 검사는 ApoE4라는 알츠하이머성 치매 특이적 유전자에 대한 검사를 통해 알츠하이머성 치매 위험성을 감지하는 검사이다. 그러나, ApoE4라는 유전자는 치매 발명의 위험률을 높일 수는 있으나, 결정적인 인자가 아니기 때문에, 해당 검사만으로는 알츠하이머성 치매 진단이 어렵다. 또한, 신경심리검사 및 인지기능 검사는 설문지를 통해 환자의 인지장애 정도를 측정하는 방법으로, 간이 정신상태검사(MMSE), 몬트리올 인지검사(MoCA), SNSB 등이 있다. 이는 설문지 형태의 진단 방법으로서, 비용이 적게 들고 진단시 물리적 고통이 없다는 장점이 있으나, 반복된 검사로 인해 학습, 나이 및 학력 차이 등에 의한 결과 변화, 주관성 개입 등으로 인해 정확성에 문제가 생길 수 있으며, 결정적으로 해당 인지장애가 알츠하이머성 치매의 주요 인자인 베타-아밀로이드에 의한 인지장애인지, 다른 종류의 질환에 의한 것인지 확인할 수 없다는 문제가 있다. 또한, 뇌척수액을 통한 검사는 뇌척수액을 추출하여 알츠하이머 유발인자로 알려진 베타-아밀로이드 또는 타우 단백질을 정량 진단하는 방법으로서, 진단의 정확성은 높으나, 뇌척수액을 얻기 위한 척주 천자 방법은 환자에게 큰 고통을 줄 수 있어 거부감을 일으킬 수 있다. 또한, 시술에 있어서 전문성이 높지 않은 일반 병원에서는 이용하기 힘들며, 비용적인 한계도 존재한다. 뇌영상 검사(MRI, PET)는 MRI 또는 PET 영상촬영을 통해 뇌손상 정도 및 알츠하이머 유발인자인 베타-아밀로이드와 타우 단백질을 뇌에서 분석하는 방법이다. 진단에 대한 높은 정확성을 가지고 있으나, 알츠하이머성 치매 진단시 고가의 장비와 영상촬영에 대한 전문성을 요구하므로, 유통의 한계가 있고, 높은 진단 비용을 요구한다는 문제가 있다.
이와 같이, 현재 알츠하이머성 치매 진단을 위한 다양한 기술이 존재하나, 각각의 기술은 정확성 문제, 비용적 문제, 시간적 문제 및 육체적 고통의 수반 등 다양한 한계점이 존재한다. 이러한 종래기술의 한계점은 알츠하이머 유발인자인 베타-아밀로이드 및 타우 단백질이 치매 진단에 사용될 수 있을 정도로 혈액 내에서는 유의미하게 나타나지 않기 때문이며, 현재까지도 혈액을 통해 이용할 수 있는 알츠하이머성 치매 진단용 바이오마커가 없다는 한계점이 있다.
본 발명자들은 혈액을 이용할 수 있는 알츠하이머성 진단용 조성물을 제조하고자 예의 노력 연구한 결과, 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 사용하는 경우 기존의 알츠하이머성 치매 진단방법이 가진 비용적, 시간적, 고통 및 부작용 등에 따른 한계점을 극복하고, 혈액을 통해 알츠하이머성 치매를 진단할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 개체로부터 분리된 시료로부터 상기 조성물을 이용하여 시료 내 항체를 검출 또는 이의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 항체에 결합하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는 알츠하이머성 치매환자의 혈액 내에서 특이적으로 증가하는 항체와 특이적으로 결합할 수 있으므로, 혈액을 통한 진단이 불가능하였던 기존 알츠하이머성 치매 진단 방법의 한계점을 극복하고, 혈액을 기반으로 한 알츠하이머성 치매 진단에 이용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 알츠하이머성 치매 특이적 항체(도 1a: IgM, 도 1b: IgG)에 대한 펩타이드를 화산 도표(volcano plot)로 나타낸 것이다. 알츠하이머성 치매에서 특이적으로 증가하는 항체의 표적이 되는 펩타이드는 우측 박스에 표시하였다.
도 2a 및 도 2b는 각각 도 1a 및 도 1b에서 선별된 펩타이드(도 2a: n=170, 도 2b: n=144)의 ROC(Reciever operating curve) 분석을 통한 AUC 값을 나타낸 것이다. AUC ≥ 0.75를 기준으로 하여, 알츠하이머성 치매에서 특이적으로 증가하는 항체(도 2a: IgM, 도 2b: IgG)에 대한 타겟 펩타이드를 추가적으로 선별하였다(도 2a: n=64, 도 2b: n=49).
도 3a 및 도 3b는 각각 도 2a 및 도 2b에서 선별된 펩타이드 중 AUC 값 상위 5종의 펩타이드를 선별하여, 이들 조합의 ROC 분석을 통한 AUC 값을 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 도 2a 및 도 2b에서 선별된 알츠하이머성 치매 특이적인 펩타이드(도 2a: n=64, 도 2b: n=49)를 통한 계층 군집화(Hierarchical clustering) 분석 결과를 보여주는 히트맵이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 도 2a 및 도 2b에서 선별된 펩타이드 중 AUC 값 상위 5종의 펩타이드를 선별하여, 각각의 5종의 펩타이드를 타겟으로 하는 항체 (도 5a: IgM, 도 5b: IgG) 의 MFI 값을 점 도표(dot plot)로 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는 각각 도 2a 및 도 2b에서 선별된 펩타이드 중 AUC 값 상위 5종의 펩타이드를 선별하여, 이들 조합을 타겟으로 하는 항체 (도 6a: IgM, 도 6b: IgG) 의 MFI 값을 점 도표로 나타낸 것이다.
도 7은 선별된 펩타이드 중에서 K-MMSE와 상관성이 있는 서열번호 1의 펩타이드에 대한 피어슨 상관계수 분석을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 10로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 또는, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종의 조합 또는 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종의 조합일 수 있으며, 또는 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 10종의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종은 IgM을 표적으로 하며, 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종은 IgG를 표적으로 한다.
펩타이드 서열번호 펩타이드 아미노산 서열 AUC 값
서열번호 1 RGPLRQGRNTGAAGA 0.837
서열번호 2 VFTAWMGLEFAYGDK 0.825
서열번호 3 HKRIFGSHHPTHDLG 0.825
서열번호 4 GRVWNVDMRRCDFSE 0.823
서열번호 5 GQRDAPMVTHRPSPH 0.820
서열번호 6 PPHVISYHSYPDAWD 0.867
서열번호 7 SKGTDPTRTVWERPF 0.820
서열번호 8 FLDMDQRPWNPFVWD 0.817
서열번호 9 EHPHRDELQQRFFPD 0.817
서열번호 10 SNLIRLKEFTDYLFF 0.814
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 무작위 펩타이드 마이크로어레이 및 스튜던트 t-검정을 통해 얻은, 29,490 종의 펩타이드의 마이크로어레이 강도 배수 변화 및 P-값을 이용하여, 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 상향 조절되는 IgM 또는 IgG 항체를 표적으로 하는 펩타이드 후보군을 선별하였다 (도 1a, 1b). 이후, IgM 항체를 표적으로 하는 170종의 펩타이드 후보군 및 IgG 항체를 표적으로 하는 144종 펩타이드 후보군 중에서, 수신자 조작 특성 곡선(ROC)의 곡선하면적(AUC) 값을 이용하여, AUC 값이 0.75이상으로 나타난 보다 유의적인 펩타이드를 선별하였다. 최종적으로, IgM 항체를 표적으로 하는 64종의 펩타이드와 IgG 항체를 표적으로 하는 49종 펩타이드 중에서도 AUC 값이 상위 5종인 펩타이드를 각각 선별하였다 (도 2a, 2b 및 도 3a, 3b).
상기 펩타이드는 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 상향 조절 또는 하향 조절되는 자가항체에 결합하는 것일 수 있으며, 구체적으로는 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 IgG 또는 IgM 항체에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "알츠하이머성 치매"는 알츠하이머 질환에 의하여 유발된 치매 증상을 의미한다. 상기 알츠하이머성 질환은 독일의 알츠하이머 박사에 의하여 최초로 보고된, 치매를 유발하는 가장 일반적인 퇴행성 뇌질환을 의미하는데, 상기 알츠하이머 질환이 진행됨에 따라 기억력을 포함하는 전체적인 인지기능이 점진적으로 약화된다고 알려져 있다.
본 발명의 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 계층 군집화 분석을 수행하여, 상기 선별된 64종 또는 49종 펩타이드는, 실시예에서 구축된 연구집단을 알츠하이머성 치매 집단(AD)과 정상 개체 집단(ND)로 명확하게 구분할 수 있음을 확인하였다(도 4a 및 4b). 또한, 마이크로어레이 강도(MFI) 분석을 통해, 각각 선별된 5종의 펩타이드 및 이들의 조합은 AD 집단 및 ND 집단 간의 MFI 값의 유의적 차이를 나타냄을 확인하였다(도 5a, 5b 및 6a, 5b).
즉, 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 본 발명의 조성물은 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가되는 항체의 타겟이 되어, 알츠하이머성 치매의 우수한 진단 효능을 가짐을 확인할 수 있었다. 특히, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종을 모두 사용하거나 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종을 모두 사용하는 경우 매우 높은 AUC 값을 나타내어, 매우 유의적인 알츠하이머 진단 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 키트를 제공한다.
이때, 상기 용어 "펩타이드", "알츠하이머성 치매", "진단" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 상기 알츠하이머성 치매 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미하며, 본 발명의 키트를 이용하여 알츠하이머성 치매 환자인 것으로 판단하거나 알츠하이머성 치매의 발병 위험을 예측할 수 있다. 본 발명의 알츠하이머성 치매 진단용 키트에는 알츠하이머성 환자에서 특이적으로 증가되는 자가항체, 특히 IgM 또는 IgG의 검출 또는 이의 발현을 측정하기 위한 상기 펩타이드 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96웰 플레이트, 폴리스테린 수지로 합성된 96웰 플레이트 및 유리로된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2´-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(ο-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 개체로부터 분리된 시료로부터 상기 조성물을 이용하여 시료 내 항체를 검출 또는 이의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 항체는 IgM 또는 IgG 항체일 수 있다.
상기 항체가 IgM 항체일 경우, 상기 조성물에 포함되는 펩타이드는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 펩타이드 5종을 모두 포함하고 있을 수 있다. 상기 항체가 IgG 항체일 경우, 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종 중 어느 하나 이상일 수 있으며 상기 펩타이드 5종을 모두 포함하고 있을 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "펩타이드", "알츠하이머성 치매", "진단" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"는 알츠하이머성 치매를 진단하거나 발병 위험을 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 알츠하이머성 치매가 발병될 수 있는 동물이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "시료"는 상기 개체로부터 유래되어 알츠하이머성 치매에서 특이적으로 상향 조절되는 자가항체를 검출할 수 있는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하며, 특히 개체로부터 분리된 혈액 샘플일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 정보제공방법은 알츠하이머성 치매를 진단하거나, 알츠하이머성 발병 위험을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 존재; 또는 항체의 상향-조절 또는 하향-조절되는 정도를 확인하기 위해 개체로부터 분리된 시료 내 항체를 검출; 또는 이의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 정보제공방법이다.
또한, 상기 정보제공방법은 상기 항체의 발현 수준을 정상 대조군으로부터 분리된 시료 내 항체의 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항체의 발현 수준을 비교하는 단계의 기준이 되는 값은 수신자 조작 특성 곡선(ROC)의 곡선하면적(AUC) 값 또는 마이크로어레이 강도(MFI) 값일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 경우, 개체로부터 분리된 시료 내 항체와 상기 조성물 간의 결합 정도를 측정하여, 정상 대조군에 비하여 증가된 결합 정도를 보이는 경우 또는 특정 컷-오프 값(cut-off value) 보다 높은 경우, 상기 개체가 알츠하이머성 치매 환자인 것으로 판단되거나 알츠하이머성 치매의 발병 위험이 높은 것으로 판단될 수 있다. 구체적으로는, 항체의 발현 수준이 정상 대조군으로부터 분리된 시료 내 항체의 발현 수준보다 높을 경우, 상기 개체가 알츠하이머성 치매 환자로 판단되거나, 알츠하이머성 치매의 발병 위험이 높은 것으로 판단될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진, 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 항체에 결합하는 펩타이드를 제공한다.
상기 항체는 IgM 또는 IgG 항체일 수 있다.
상기 항체가 IgM 항체일 경우, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 항체가 IgG 항체일 경우, 상기 펩타이드는 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 5종 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 용어 "펩타이드", "알츠하이머성 치매" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 펩타이드는 또한 프로브로 이용될 수 있으며, 상기 프로브는 알츠하이머성 치매 환자의 특이적인 자가항체와 결합을 이룰 수 있는, 라벨링(labeling)된 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 알츠하이머성 치매를 진단하기 위한 조성물을 제조하기 위한 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
상기 펩타이드에 대해서는 전술한 바와 같다.
실시예 1: 알츠하이머성 치매 특이적 자가항체를 표적으로 하는 펩타이드의 선별
실시예 1-1: 연구집단의 구축
하기 실시예에 이용된 혈청 샘플은 조선대학교 병원 및 충남대 의대로부터 수득된 19명의 알츠하이머성 치매 환자(실험군, AD) 및 상기 실험군과 나이가 일치하는 19명의 정상 개체(대조군, ND)의 혈청샘플이다. 또한, 여성에서 알츠하이머성 치매가 더 빈번하게 발병하기 때문에, 잠재적인 성적 편향성을 감소시키기 위해, 혈청 샘플은 모두 여성으로부터 수득하였다. 알츠하이머성 치매의 임상적 진단은 국립 노화-알츠하이머 협회(National Institute on Aging-Alzheimer's Association)에 의해 규정된 기준에 기초하였다. 알츠하이머성 치매의 진단을 확인하기 위해, 모든 실험군(AD) 및 대조군(ND) 개체는 F-18 florbetaben(NeuraCeq™)을 이용한 자기공명 이미지화(magnetic resonance imaging) 또는 양전자 단층촬영(positron emission tomography)을 받았다.
또한, 치매의 중증도를 평가하기 위해 한국형 간이-정신상태 검사(K-MMSE: Korean Mini-Mental State Examination) 점수를 측정하였다.
실시예 1-2: 무작위 펩타이드 마이크로어레이(Random peptide microarray)
무작위 펩타이드 마이크로어레이(Random peptide microarray)의 칩에 29,240종의 펩타이드를 이중(duplicate)으로 코팅하였다(58,480개의 펩타이드 스팟). FLAG(DYKDDDKAS) 펩타이드와 HA(YPYDVPDYAG) 펩타이드는 대조군 펩타이드로 추가 코팅하였다. 코팅된 마이크로어레이는 30분간 blocking buffer MB-070(Rocland, Gilbertsville, PA, USA)를 통해 블로킹 과정을 거쳤다. 이후, 칩은 상온(RT)에서 1:5000으로 희석된 DyLight680에 컨쥬게이트된 염소(goat) 항-인간 IgM 또는 IgG로 45분간 항온처리(incubation)를 하였다. 이는 2차 항체와 플레이트 내 펩타이드 라이브러리 간의 백그라운드를 체크하기 위해 진행하였다. 다음으로 PBS (pH 7.4)/0.05 % Tween 20/ 10% Rockland blocking buffer MB-070을 통해 1:500으로 희석된 환자 혈액 샘플을 4℃에서 16시간 동안 항온처리를 하였다. 칩은 다시 1:5000으로 희석된 2차 항체로 항온처리를 하였다. 마지막으로 대조군 펩타이드에 대한 DyLight680에 컨쥬게이트된 단클론성 항-HA 항체 및 DyLight800에 컨쥬게이트된 단클론성 항-FLAG 항체를 상온에서 45분간 항온처리를 하였다. 각각의 항온처리 단계 이후, 마이크로어레이 칩은 PBS (pH 7.4)/0.05 % Tween 20 buffer를 통해서 3번 세척하였고, 마이크로어레이 칩의 스캐닝은 LI-COR Odyssey Imaging System을 통해서 7/7 (레드/그린)의 스캐닝 강도로 진행하였다.
상기 과정에 의해 수득된, 무작위 펩타이드 마이크로어레이 데이터는 다음의 신호 강도의 보정 과정을 거쳤다. 우선, 마이크로어레이 데이터는 Spotxel® microarray Image and Data Analysis software를 통해서 백그라운드 노이즈를 제거하였다. 이후, 2차 항체와 펩타이드 라이브러리 간의 백그라운드 신호는 평균 중앙값(averaged median)의 강도를 기반으로 제거하였다. 마이크로어레이 칩 간의 미가공 데이터(raw data)는 칩 간의 변이(variation)를 보정하기 위해 R 3.4.0 software(R Development Core Team, 2017)의 devtools package를 통해서 quantile 정규화 과정을 진행하였다.
알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 항체의 표적이 되는 펩타이드 마커 선별을 위해, 알츠하이머성 치매 환자와 정상 개체 간의 마이크로어레이 강도 배수 변화(microarray intensity fold change) (ND/AD ≥ 2)와 스튜던트 t 검정(student's t test)을 이용한 P-값 (≤5)를 이용하여 펩타이드 후보군을 선별하였다.
그 결과, 무작위 펩타이드 마이크로어레이로 확인한 29,490 종류의 펩타이드의 배수 변화(ND/AD ≥ 2) 및 P-값 (≤5)을 이용한 선별을 통해, 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 상향 조절되는 IgM(도 1a) 또는 IgG(도 1b) 항체를 표적으로 하는 펩타이드를 선별하였으며, 이를 빨간색(우측 박스 Peptides)으로 표시하였다. 이를 통해, IgM 항체에 대하여 170개의 펩타이드 후보군을, IgG 항체에 대하여 144개의 펩타이드 후보군을 선별하였다.
실시예 1-3: 수신자 조작 특성 곡선(ROC: Reciever operation curve)의 분석
상기 실시예 1-2에서 선별된 펩타이드 후보군 중에서, ROC 곡선의 곡선하면적(AUC: area under the receiver operating characteristic curve) 값을 통해서 보다 유의적인 펩타이드 마커를 추가로 선별하였다. 이를 위해, R 3.4.0 software(R Development Core Team, 2017)의 pROC package를 통해서 각각의 펩타이드에 대한 AUC 값을 수치화하였고, AUC 값(≥ 0.75)를 기준으로 선별하였다.
본 발명의 실시예에서, AUC 값은 알츠하이머성 치매환자에서 특이적으로 증가되는 항체의 표적이 되는 펩타이드 마커의 알츠하이머성 진단 성능을 정량적으로 표현한 값이다. 구체적으로는, 펩타이드 마커의 AUC 값이 0.75 이상인 경우 보통의 진단 성능을 가지고, AUC 값이 0.80 이상인 경우 우수한 진단 성능을 가지는 것으로 볼 수 있다.
그 결과, AUC 값이 0.75 이상으로 나타난 펩타이드를 선별하였으며, 도 2a 및 도 2b에 이를 표시하였다. 빨간색(음영)으로 표시한 부분은 선별된 펩타이드를, 파란색으로 표시한 부분은 선별되지 않은 펩타이드를 의미한다. 구체적으로 IgM에 대해 64개의 펩타이드를(도 2a), IgG에 대해 49개의 펩타이드를(도 2b) 선별하였다.
추가적으로, 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 상향 조절되는 IgM 또는 IgG 항체의 타겟이 되는 펩타이드로 상기 펩타이드 중에서도 AUC 값이 상위 5종인 펩타이드를 각각 선별하였다. 선별된 펩타이드에 대한 AUC 값 및 선별된 펩타이드의 서열번호와 각각의 아미노산 서열은 하기 표 2에 나타낸다.
선별된 펩타이드는 최소 0.81 이상의 AUC　값을 가지며, 이를 통해 본 발명의 펩타이드 마커는 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가되는 항체의 표적이 되는 펩타이드로서, 상기 질환의 진단에 있어 우수한 진단 성능을 가짐을 확인할 수 있다.
펩타이드 서열번호 펩타이드 아미노산 서열 AUC 값 표적 항체 타입
서열번호 1 RGPLRQGRNTGAAGA 0.837 IgM
서열번호 2 VFTAWMGLEFAYGDK 0.825
서열번호 3 HKRIFGSHHPTHDLG 0.825
서열번호 4 GRVWNVDMRRCDFSE 0.823
서열번호 5 GQRDAPMVTHRPSPH 0.820
서열번호 6 PPHVISYHSYPDAWD 0.867 IgG
서열번호 7 SKGTDPTRTVWERPF 0.820
서열번호 8 FLDMDQRPWNPFVWD 0.817
서열번호 9 EHPHRDELQQRFFPD 0.817
서열번호 10 SNLIRLKEFTDYLFF 0.814
또한, 도 3a 및 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 IgM 및 IgG에 대해 각각 선별된 5종의 펩타이드가 조합된 마커에 대하여 ROC 분석을 통해 AUC 값을 계산한 결과, 매우 높은 AUC 값을 나타내었다(IgM: 0.945, IgG: 0.892).
이를 통해, 선별된 각각의 펩타이드 마커뿐만 아니라, 이들의 조합은 알츠하이머성 치매에서 특이적으로 상향 조절되는 항체의 타겟으로서 작용하여, 매우 우수한 진단 성능을 가짐을 확인할 수 있다.
실시예 2: 선별된 펩타이드 마커 및 이의 조합를 이용한 알츠하이머성 치매의 진단 효능 확인
실시예 2-1: 계층 군집화 (Hierarchical clustering) 분석
상기 실시예 1-3에서 선별된 64종 또는 49종 펩타이드 마커의 알츠하이머성 치매의 진단 효능을 확인하기 위해, 계층 군집화 분석(Hierarchical clustering)을 수행하였다.
그 결과, 도 4a 및 4b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 선별된 64종 (도 4a) 또는 49종(도 4b) 펩타이드 마커는 각각 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 상향 조절되는 IgM, IgG 타입 항체의 타겟이 되어, 상기 연구 집단을 알츠하이머성 치매 집단(AD)과 정상 개체 집단(ND)으로 명확하게 구분할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2-2: MFI(Microarray intensity) 분석
상기 실시예 1-3에서 선별된 5종의 펩타이드 마커 및 이들의 조합의 알츠하이머성 치매의 진단 효능을 확인하기 위해, 상기 펩타이드 마커를 타겟으로 하는 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 상향 조절되는 항체의 무작위 펩타이드 마이크로어레이 강도(MFI: Microarray intensity) 값을 알츠하이머성 치매 환자(AD) 및 정상 개체(ND)에서 분석하여 점 도표(Dot plot)로 나타내었다. 여기에서, 알츠하이머성 치매 환자 및 정상 개체의 MFI 값의 차이가 클수록, 상기 펩타이드 마커의 진단 성능이 우수하다고 해석할 수 있다. 각각의 펩타이드 및 이들의 조합에 대한 통계 검사는 스튜던트 t 검정을 통해 진행하였다. *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001의 유의성을 나타낸다.
그 결과, 도 5a 및 5b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 선별된 5종의 각각의 펩타이드 마커는 알츠하이머성 치매 환자(AD) 및 정상 개체(ND)에 대한 MFI 값의 차이가 유의적으로 나타남을 확인할 수 있다.
특히, IgM에 대한 5종의 펩타이드 중 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(UM#1)가 MF1 값의 차이가 가장 크게 나타나며, IgG에 대한 5종의 펩타이드 중 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(UG#1)가 MF1 값의 차이가 가장 크게 나타나므로, 가장 우수한 진단 성능을 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 도 6a 및 6b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 선별된 5종의 펩타이드 마커의 조합 역시 알츠하이머성 치매 환자(AD) 및 정상 개체(ND)에 대한 MFI 값의 차이가 현저하게 나타남을 확인할 수 있다. 이를 통해, 상기 선별된 펩타이드 마커 및 이들의 조합은 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 상향 조절되는 항체의 타겟이 되어, 알츠하이머성 치매의 진단에 있어 우수한 효능을 가짐을 확인할 수 있다.
실시예 2-3: K-MMSE(Korean Mini-Mental State Examination) 점수와의 상관관계 분석
대표적으로, 상기 실시예 2-2에서 선별된 펩타이드 마커(UM#1)의 알츠하이머성 치매의 진단 효능을 검증하기 위해, 피어슨 상관계수 분석(Pearson's correlation coefficient)을 통해, 각각의 펩타이드 마커와 치매의 중증도를 평가하기 위한 척도로 이용되는 K-MMSE 점수와의 상관관계를 분석하였다. 참고적으로, K-MMSE 점수는 최소 0점 내지 최고 30점으로 표현되며, 그 점수가 높을수록 인지기능의 저하를 나타내는 것이다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 2-2에서 가장 큰 MFI 값의 차이를 나타낸, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드(UM#1)의 MFI 값과 K-MMSE 점수는 r≤ -0.5, p ≤ 0.001의 상관성을 가지고 있음을 나타낸다. 즉, 상기 펩타이드 마커를 이용하여 알츠하이머성 진단을 하는 경우, K-MMSE 점수를 통해 알츠하이머성 치매를 진단한 결과와 매우 유사함을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 선별된 펩타이드 마커를 이용하는 경우, 기존의 알츠하이머성 치매 진단 방법에 대등할 정도로 알츠하이머성 치매를 진단할 수 있음을 확인할 수 있는 것이다.
이상의 내용을 종합하면, 본 발명의 선별된 펩타이드 및 이들의 조합은 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가되는 항체의 타겟이 되어, 혈액을 통한 진단을 가능하게 하므로 기존의 알츠하이머 진단 방법이 가진 비용적, 시간적 문제 및 부작용 등에 따른 문제를 극복하고, 알츠하이머성 치매의 우수한 진단 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 5종 모두를 유효성분으로 포함하거나, 서열번호 6 내지 10의 펩타이드 5종 모두를 유효성분으로 포함하는 것인, 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 항체에 결합하는 것인, 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 IgM 또는 IgG인 것인, 진단용 조성물.
  5. 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 키트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 5종 모두를 유효성분으로 포함하거나, 서열번호 6 내지 10의 펩타이드 5종 모두를 유효성분으로 포함하는 것인, 알츠하이머성 치매 진단용 키트.
  7. 개체로부터 분리된 시료로부터, 제1항의 조성물을 이용하여 시료 내 항체를 검출 또는 이의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체의 발현 수준을 정상 대조군으로부터 분리된 시료 내 항체의 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체는 IgM 또는 IgG인 것인, 정보제공방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 항체의 발현 수준이 정상 대조군으로부터 분리된 시료 내 항체의 발현 수준보다 높을 경우, 상기 개체가 알츠하이머성 치매로 진단되는 것인, 정보제공방법.
  11. 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진, 알츠하이머성 치매 환자에서 특이적으로 증가하는 항체에 결합하는 펩타이드.
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