多取代吡啶酮类衍生物及其在医药上的应用
技术领域
本发明涉及一种多取代吡啶酮类衍生物、其制备方法及含有其的药物组合物,以及用作酪氨酸激酶抑制剂的用途,特别是用于制备治疗与酪氨酸激酶活性相关的疾病的药物的用途。
背景技术
受体酪氨酸激酶(RTKs)为多域的跨膜蛋白,其功能为细胞膜外受体配体的传感器。当配体与受体的结合时,诱导受体在细胞膜表面二聚并激活膜内的激酶域,从而导致酪氨酸的磷酸化以及进一步激活下游一连串的信号传导通路。到目前为止,在人体基因库找到了近60个受体酪氨酸激酶,它们广泛地调节着细胞的新陈代谢过程,包括存活、生长、分化、增殖、粘连和死亡。
受体酪氨酸激酶TAM家族有三个成员Axl、Mer和Tyro3。TAM在体内有两个配体Gas 6和Protein S。TAM三成员均可与Gas 6结合,结合亲和力分别为Axl>Mer>Tyro3。Protein S仅能与Mer和Tyro3结合。TAM自身磷酸化后,产生信号传递,调控着包括细胞生存、诱导分化、移动和黏附等在内的各种细胞学反应,也控制着血管平滑肌稳态,血小板功能,微血栓稳定性及红血球形成等。不仅如此,TAM还在免疫和炎症方面发挥着关键作用。它促进凋亡细胞的吞噬,刺激NK细胞的诱导分化。
Axl是细胞存活、增殖、聚集、迁移和黏附的重要调节器。Axl在单核细胞、巨噬细胞、血小板、内皮细胞、小脑、心脏、骨骼肌、肝脏和肾脏等细胞及器官中都有广泛表达。同时,许多癌细胞、造血细胞、间质细胞和内皮细胞中的Axl基因都存在着超表达或异位表达现象。各类白血病和多数的实体瘤中,Axl的过度表达现象尤为突出。不仅如此,相对于正常的组织或者初期肿瘤,Axl在转移的或恶性肿瘤中的表达更高,其高表达与临床治疗疗效不佳密切相关。
受体酪氨酸激酶TAM家族三个成员之间,Axl和Tyro3具有最为相似的基因结构,而Axl和Mer具有最为相似的酪氨酸激酶域氨基酸序列。Axl是细胞存活、增殖、聚集、迁移和黏附的重要调节器。Axl在单核细胞、巨噬细胞、血小板、内皮细胞、小脑、心脏、骨骼肌、肝脏和肾脏等细胞及器官中都有广泛表达。特别是在许多癌细胞中,Axl基因都存在着超表达或异位表达现象。各类白血病和多数的实体瘤中,Axl的过度表达现象尤为突出。不仅如此,相对于正常的组织或者初期肿瘤细胞,Axl在转移的或恶性肿瘤细胞中的表达更高,其高表达与临床治疗疗效不佳密切相关。
Axl还在多种肿瘤细胞中参与由不同机制造成的耐药性。Axl激酶的超表达已经成为癌症患者呈现治疗耐药性的一个重要标志。通过对Axl受体酪氨酸激酶的抑 制可以降低肿瘤细胞促存活信号的活化、阻滞肿瘤的侵袭,增加靶向药物治疗和放、化疗的敏感度。
Mer最初是从类淋巴母细胞表达库里发现并确认为一类磷蛋白。它能调节巨噬细胞活化,促进凋亡细胞的吞噬,帮助血小板聚集,并维持体内血块的稳定。Mer在多种类型的癌症中会发生过度或异位表达,如白血病、非小细胞肺癌、黑色素瘤和前列腺癌等,导致若干典型的致癌信号传导途径的活化。
Tyro3在基于PCR克隆的研究中发现。虽然对其下游的信号传导途径有待于进一步考证,但PI3K-AKT以及RAF-MAPK信号通路的参与已被证实。
虽然几个替尼类酪氨酸激酶抑制剂,如卡博替尼(Cabozantinib)、克里唑替尼(Crizotinib)等含有Axl激酶抑制剂活性,但它们为多靶点分子,不具有选择性。因此,目前还没有TAM抑制剂新药供患者使用。
c-MET是一类具有自主磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体(RTKs)家族成员。c-MET受体在细胞含一个酪氨酸激酶催化域,有4个关键的调节酶活性的酪氨酸残基,形成几个信号传导蛋白的停泊位点,进而导致生物应答。c-MET最先是从人骨肉瘤衍生出的细胞系中分离出来的,主要是在上皮细胞上表达。在胚胎发育和成年时期,很多器官上皮细胞表面表达c-MET受体,包括肝、胰腺、前列腺、肾脏、肌肉和骨髓。
HGF是c-MET的唯一配体。当c-MET与其结合后,触发受体二聚化,从而激活c-MET胞质内蛋白激酶结构域中酪氨酸激酶,引起c-MET羧基末端酪氨酸(Tyrl349、Tyrl356)的自身磷酸化。c-MET激活招募衔接蛋白Gabl和Grb2,激活Shp2、Ras和ERK/MAPK,细胞质中的多种效应蛋白募集到磷酸化的羧基末端并被快速磷酸化,导致激活细胞内多种信号通路,如PI3K/AKT、Ras-Rac/Rho、MAPK及STAT3通路等,促进细胞变形、增殖、抗凋亡、细胞分离、运动和侵袭等多种生物学功能。
正常的HGF/c-MET信号通路在不同细胞以及细胞不同分化阶段参与多种生理过程,如胚胎发育过程中控制细胞的迁移,组织损伤后的修复等。但异常的c-MET失调包含过度表达、组成激酶持续激活、基因扩增、通过HGF旁分泌和自分泌激活、c-MET突变以及后继的改变等。异常的HGF/c-MET信号通路在肿瘤发生发展中起非常重要作用,能诱导肿瘤的生长、侵袭、耐药和存活。因此,有效地抑制肿瘤细胞中HGF/c-MET信号通路将会对多种癌症产生显著疗效。
因此,本发明研究开发了新的酪氨酸激酶抑制剂。其可以单独使用或与其它活性药物联合使用,为癌症的治疗提供新的手段和途径。
发明内容
本发明人经过潜心研究,设计合成了一系列含吡啶酮类化合物,其显示出酪氨酸激酶Axl和MET的抑制活性,可以被开发为治疗与酪氨酸激酶Axl和MET活性 相关的疾病的药物。
因此,本发明的目的是提供一种通式(I)所示的化合物,
或其内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式,或其可药用盐,
其中,
X和Y各自独立地选自C或N;
W和V各自独立地选自CH或N;
A和E各自独立地选自CH或N;
G
1、G
2和G
3各自独立地选自C、N、O或S原子;
R
1选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基或杂环基,所述烷基、烯基、炔基、环烷基或杂环基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、NR
aR
b、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
R
2选自氢、卤素、羟基、氧代基、氰基、烷基、环烷基、杂环基、NR
aR
bNHC(O)R
a、或NHS(O)
mR
a;所述烷基、环烷基、杂环基任选进一步被选自卤素、羟基、巯基、氰基、烷基、OR
a、SR
a、NR
aR
b、C(O)NR
aR
b的一个或多个基团取代;
R
3选自烯基、炔基、芳基或杂芳基,所述烯基、炔基、芳基或杂芳基任选进一步被R
a取代;
R
4选自氢、卤素、氰基、烷基、卤代烷基、烷氧基或卤代烷氧基;
R
5和R
6各自独立地选自氢、卤素、氰基、OR
a、SR
a、O(CH
2)
pNR
aR
b、O(CH
2)
pOR
a、NR
aR
b、C(O)R
a、C(O)OR
a、OC(O)R
a、C(O)NR
aR
b、OC(O)NR
aR
b;
或者R
5和R
6与相连接的原子一起形成氧杂环烷基,其中氧原子与苯环相连接;
R
7选自氢、卤素、NR
aR
b、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基;所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
每一个R
8各自独立地选自氢、卤素、NR
aR
b、烷基、环烷基、杂环基、芳基或 杂芳基;所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
R
9选自芳基或杂芳基;所述芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个Q基团取代;
Q选自卤素、烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、OR
a、SR
a、O(CH
2)
pNR
aR
b、O(CH
2)
pOR
a、NR
aR
b、C(O)R
a、C(O)OR
a、OC(O)R
a、C(O)NR
aR
b、OC(O)NR
aR
b;其中所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
R
10选自氢、卤素、烷基、NR
aR
b;所述烷基任选进一步被一个或多个卤素取代;
R
11选自氢、卤素、氰基、氨基、羟基、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基;所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
R
a和R
b各自独立地选自氢、卤素、羟基、硝基、氰基、氧代、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基,其中所述烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
或者R
a和R
b与他们连接的氮原子一起形成含氮杂环基,所述含氮杂环基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、氧代基、羟基、巯基、羧基、酯基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
m为1至4的整数;
n为0至4的整数;
p为1至6的整数;
通式(I)化合物中的任意一个或多个H原子任选进一步被D原子替代。
在本发明一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(I)所示的化合物,其为通式(II)所示的化合物,
或其内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式, 或其可药用盐,
其中,
R
1、R
2、R
3、R
4、R
9、R
10、X、Y、W、V、A、n如通式(I)所定义。
在本发明一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(I)所示的化合物,其为通式(III)所示的化合物,
或其内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式,或其可药用盐,
其中,
R
1、R
2、R
3、R
4、R
5、R
6、R
11、X、Y、W、V、A、E、n如通式(I)所定义。
在本发明一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(II)所示的化合物,其中,W和V为CH;A为N。
在本发明一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(II)所示的化合物,其为通式(IV)、通式(V)或通式(VI)所示的化合物,
其中,R
1、R
2、R
3、R
4、R
9、R
10、n如通式(I)所定义。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(IV)、(V)或(VI)所示的化合物,
其中,R
9选自芳基或杂芳基;优选C
6-C
10芳基或5至7元杂芳基,所述芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个Q基团取代;
Q选自烷基、环烷基、杂环基、OR
a、SR
a、O(CH
2)
pNR
aR
b、O(CH
2)
pOR
a、NR
aR
b、OC(O)R
a、OC(O)NR
aR
b;其中所述烷基、环烷基、杂环基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
R
a和R
b各自独立地选自氢、烷基,其中所述烷基任选进一步被选自卤素、环烷基、杂环基的一个或多个基团取代;
或者R
a和R
b与他们连接的氮原子一起形成含氮杂环基,优选5至7元含氮杂环基,所述含氮杂环基任选进一步被选自烷基的一个或多个基团取代;
p为1至6的整数。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(IV)、(V)或(VI)所示的化合物,其中,R
10为氨基。
在本发明一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(III)所示的化合物,其中,W和V为CH;E为CH且A为N。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(III)所示的化合物,其为通式(VII)、通式(VIII)或通式(IX)所示的化合物,
其中,R
1、R
2、R
3、R
4、R
5、R
6、R
11、n如通式(I)所定义。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(VII)、(VIII)、(IX)所示的化合物,其中,
R
5和R
6各自独立地选自氰基、OR
a、SR
a、O(CH
2)
pNR
aR
b、O(CH
2)
pOR
a、NR
aR
b、OC(O)R
a、C(O)NR
aR
b、OC(O)NR
aR
b;
或者R
5和R
6与相连接的原子一起形成氧杂环烷基,其中氧原子与苯环相连接;
R
a和R
b各自独立地选自氢、烷基,其中所述烷基任选进一步被选自卤素、环烷基、杂环基的一个或多个基团取代;
或者R
a和R
b与他们连接的氮原子一起形成含氮杂环基,优选5至7元含氮杂环基,所述含氮杂环基任选进一步被选自烷基的一个或多个基团取代;
p为1至6的整数。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(VII)、(VIII)、(IX)所示的化合物,其中,R
11为氢或氨基。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(I)所示的化合物,
其中,R
1选自卤素、烷基、烯基、环烷基或杂环基,所述烷基、烯基、环烷基或杂环基任选进一步被选自卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、羧基、酯基、氧代基、NR
aR
b、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的一个或多个基团取代;
R
a和R
b各自独立地选自氢或烷基;
或者R
a和R
b与他们连接的氮原子一起形成含氮杂环基,所述含氮杂环基任选进一步被选自烷基的一个或多个基团取代;
所述环烷基优选C
3-C
7环烷基,所述杂环基优选为5至7元杂环基;所述环烷基或杂环基更优选为:
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(I)所示的化合 物,
其中,R
2选自氢、氧代基、氰基、羟基、烷基、环烷基、杂环基;优选氧代基、氰基、羟基、烷基;所述烷基、环烷基、杂环基任选进一步被选自卤素、羟基、巯基、氰基、烷基、OR
a、SR
a、NR
aR
b、C(O)NR
aR
b的一个或多个基团取代;
R
a和R
b各自独立地选自氢、烷基,其中所述烷基任选进一步被选自卤素一个或多个基团取代;
或者R
a和R
b与他们连接的氮原子一起形成含氮杂环基,所述含氮杂环基任选进一步被选自烷基的一个或多个基团取代。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(I)所示的化合物,其中,R
3选自炔基、芳基或杂芳基,所述炔基、芳基或杂芳基任选进一步被R
a取代;
R
a选自氢、卤素、氰基、烷基、烷氧基、环烷基,其中所述烷基、烷氧基、环烷基任选进一步被选自卤素的一个或多个基团取代;
所述芳基优选C
6-C
10芳基,更优选苯基;
所述杂芳基优选5-10元杂芳基,更优选吡啶基、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噻二唑基。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(I)所示的化合物,其中,R
4选自氢、卤素、氰基、烷基、卤代烷基、烷氧基或卤代烷氧基,优选卤素;n为0至2的整数。
在本发明另一个优选的实施方案中,根据本发明所述的通式(I)所示的化合物,其中,化合物中的任意一个氢原子可以被氘原子替代。
本发明典型的化合物包括但不限于以下化合物:
或其内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式,或其可药用盐。
本发明进一步提供一种制备根据本发明所述的通式(I)所示的化合物的方法,其包括以下步骤:
频哪醇硼酸酯Ia与芳香溴化物(Br-Z)在催化剂和碱的存在下在溶剂中通过Suzuki偶联反应得到通式(I)化合物;所述催化剂优选Pd(dppf)
2,所述碱优选K
2CO
3,所述溶剂优选二氧六环和水;
其中,R
1、R
2、R
3、R
4、Z、X、Y、W、V、n如通式(I)所定义。
本发明进一步提供另一种制备根据本发明所述的通式(I)所示的化合物的方法,其包括以下步骤:
将羧酸化合物Ig与芳胺化合物Ic在偶联剂和碱的存在下发生偶联反应得到通式(I)化合物;所述偶联剂优选HATU,所述碱优选三乙胺;
其中,R
1、R
2、R
3、R
4、Z、X、Y、W、V、n如通式(I)所定义。
本发明进一步提供另一种制备根据本发明所述的通式(I)所示的化合物的方法,其包括以下步骤:
当R
2=CN时,
步骤1:羧酸(Ib)与芳香胺(Ic)在偶联剂和碱的存在下进行酰胺化反应,得到芳酰胺中间体(Id);所述偶联剂优选HATU,所述碱优选N,N-二异丙基乙胺;
步骤2:芳酰胺中间体(Id)在碱的存在下在溶剂中发生水解反应,得到羧酸中间体(Ie);所述碱优选LiOH,所述溶剂优选甲醇-水溶液;
步骤3:羧酸中间体(Ie)与氯化铵在催化剂和碱的作用下进行酰胺化反应,得到二甲酰胺中间体(If);所述催化剂优选PyBrOP,所述碱优选DIPEA;
步骤4:二甲酰胺中间体(If)在脱水剂和碱的共同作用下进行脱水反应,得到通式(I)化合物;其中所述脱水剂优选三氟乙酸酐,所述碱优选三乙胺;
其中,R
1、R
3、R
4、Z、X、Y、W、V、n如通式(I)所定义。
本发明进一步提供一种药物组合物,其包含根据本发明所述的通式(I)所示的化合物,以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明另一方面提供根据本发明所述的通式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物,在制备酪氨酸激酶抑制剂中的用途,其中所述酪氨酸激酶优选Axl、Mer、Tyro3、和c-MET。
本发明进一步提供根据本发明所述的通式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物,在制备治疗与酪氨酸激酶活性相关的疾病的药物中的用途;所述疾病可选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、直结肠癌、肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、软组织癌、白血病和淋巴癌,优选白血病、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌和直结肠癌,更优选更优选白血病、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、胃癌和直结肠癌。
本发明进一步提供一种根据本发明所述的通式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物,其用作酪氨酸激酶抑制剂的用途,其中所述酪氨酸激酶优选Axl、Mer、Tyro3、和c-MET。
本发明进一步提供一种根据本发明所述的通式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物,其用作药物,所述药物用于治疗与酪氨酸激酶活性相关的疾病;所述疾病可选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、直结肠癌、肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、软组织癌、白血病和淋巴癌,优选白血病、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌和直结肠癌,更优选更优选白血病、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、胃癌和直结肠癌。
一种治疗与酪氨酸激酶活性相关的疾病的方法,其包括向需要其的患者施用治疗有效量的根据本发明所述的通式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物,所述酪氨酸激酶优选Axl、Mer、Tyro3、和c-MET,所述疾病可选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、直结肠癌、肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、软组织癌、白血病和淋巴癌,优选白血病、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌和直结肠癌,更优选更优选白血病、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、胃癌和直结肠癌。
按照本发明所属领域的常规方法,本发明通式(I)所示的化合物可以与酸生成药学上可接受的酸式加成盐。所述酸包括无机酸和有机酸,特别优选盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。
按照本发明所属领域的常规方法,本发明通式(I)所示的化合物可以与碱生成药学上可接受的碱式加成盐。所述碱包括无机碱和有机碱,可接受的有机碱包括二乙醇胺、乙醇胺、N-甲基葡糖胺、三乙醇胺、氨丁三醇等,可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和氢氧化钠等。
含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式,例如片剂、糖锭剂、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊,或糖浆剂或酏剂。可按照本领域任何已知制备药用组合物的方法制备口服组合物,此类组合物可含有一种或多种选自以下的成分:甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂,以提供悦目和可口的药用制剂。片剂含有活性成分和用于混合的适宜制备片剂的无毒的可药用的赋形剂。这些赋形剂可以是惰性赋形剂,如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;造粒剂和崩解剂,例如微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉或藻酸;粘合剂,例如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯胶;和润滑剂,例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。这些片剂可以不包衣或可通过掩盖药物的味道或在胃肠道中延迟崩解和吸收,因而在较长时间内提供缓释作用的已知技术将其包衣。例如,可使用水溶性味道掩蔽物质,例如羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素, 或延长时间物质例如乙基纤维素、醋酸丁酸纤维素。
也可用其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊,或其中活性成分与水溶性载体例如聚乙二醇或油溶媒例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊提供口服制剂。
水混悬液含有活性物质和用于混合的适宜制备水混悬液的赋形剂。此类赋形剂是悬浮剂,例如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶;分散剂或湿润剂,可以是天然产生的磷脂例如卵磷脂,或烯化氧与脂肪酸的缩合产物,例如聚氧乙烯硬脂酸酯,或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物,例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxy cetanol),或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的缩合产物,例如聚环氧乙烷山梨醇单油酸酯,或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物,例如聚环氧乙烷脱水山梨醇单油酸酯。水混悬液也可以含有一种或多种防腐剂例如尼泊金乙酯或尼泊金正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂,例如蔗糖、糖精或阿司帕坦。
油混悬液可通过使活性成分悬浮于植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油,或矿物油例如液体石蜡中配制而成。油混悬液可含有增稠剂,例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入上述的甜味剂和矫味剂,以提供可口的制剂。可通过加入抗氧化剂例如丁羟茴醚或α-生育酚保存这些组合物。
通过加入水,适用于制备水混悬液的可分散粉末和颗粒可以提供活性成分和用于混合的分散剂或湿润剂、悬浮剂或一种或多种防腐剂。适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂如上所述。也可加入其他赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸保存这些组合物。
本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油,或矿物油例如液体石蜡或其混合物。适宜的乳化剂可以是天然产生的磷脂,例如大豆卵磷脂,和由脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯,例如山梨坦单油酸酯,和所述偏酯和环氧乙烷的缩合产物,例如聚环氧乙烷山梨醇单油酸酯。乳剂也可以含有甜味剂、矫味剂、防腐剂和抗氧剂。可用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制的糖浆和酏剂。此类制剂也可含有缓和剂、防腐剂、着色剂和抗氧剂。
本发明的药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒和溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射,将注射液或微乳注入患者的血流中。或者,最好按可保持本发明化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度,可使用连续静脉内递药装置。
本发明的药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的 形式。可按已知技术,用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液,例如在1,3-丁二醇中制备的溶液。此外,可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的,可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外,脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。
可按用于直肠给药的栓剂形式给予本发明化合物。可通过将药物与在普通温度下为固体但在直肠中为液体,因而在直肠中会溶化而释放药物的适宜的无刺激性赋形剂混合来制备这些药物组合物。此类物质包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。
本领域技术人员熟知,药物的给药剂量依赖于多种因素,包括但并非限定于以下因素:所用特定化合物的活性、病人的年龄、病人的体重、病人的健康状况、病人的行被、病人的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合等。另外,最佳的治疗方式如治疗的模式、通式化合物的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。
本发明可以含有通式(I)所示的化合物,及其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物作为活性成分,与药学上可接受的载体或赋型剂混合制备成组合物,并制备成临床上可接受的剂型。本发明的衍生物可以与其他活性成分组合使用,只要它们不产生其他不利的作用,例如过敏反应等。本发明化合物可作为唯一的活性成分,也可以与其它治疗与酪氨酸激酶活性相关的疾病的药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、分开或相继给药来实现。
发明的详细说明
除非有相反陈述,在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团,其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团,优选含有1至12个碳原子的烷基,更优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基,及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基,非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异 丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的,当被取代时,取代基可以在任何可使用的连接点上被取代,所述取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“烯基”指由至少由两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的如上定义的烷基,例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等。烯基可以是取代的或非取代的,当被取代时,取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“炔基”指由至少由两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的如上定义的烷基,例如乙炔基、丙炔基、丁炔基等。炔基可以是取代的或非取代的,当被取代时,取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基,环烷基环包含3至20个碳原子,优选包含3至12个碳原子,更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等;多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
术语“螺环烷基”指5至20元的单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团,其可以含有一个或多个双键,但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元,更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺环烷基、双螺环烷基或多螺环烷基,优选为单螺环烷基和双螺环烷基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺环烷基。螺环烷基的非限制性实例包括:
术语“稠环烷基”指5至20元,系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳多环基团,其中一个或多个环可以含有一个或多个双键,但 没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元,更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基,优选为双环或三环,更优选为5元/5元或5元/6元双环烷基。稠环烷基的非限制性实例包括:
术语“桥环烷基”指5至20元,任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团,其可以含有一个或多个双键,但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元,更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基,优选为双环、三环或四环,更有选为双环或三环。桥环烷基的非限制性实例包括:
所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或杂环烷基环上,其中与母体结构连接在一起的环为环烷基,非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。环烷基可以是任选取代的或非取代的,当被取代时,取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基,其包含3至20个环原子,其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)
m(其中m是整数0至2)的杂原子,但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分,其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子,其中1~4个是杂原子;最优选包含3至8个环原子,其中1~3个是杂原子;最优选包含5至7个环原子,其中1~2或1~3个是杂原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基、吡喃基等,优选1、2、5-噁二唑基、吡喃基或吗啉基。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团,其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)
m(其中m是整数0至2)的杂原子,其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键,但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元,更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基,优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或 5元/6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括:
术语“稠杂环基”指5至20元,系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团,一个或多个环可以含有一个或多个双键,但没有一个环具有完全共轭的π电子系统,其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)
m(其中m是整数0至2)的杂原子,其余环原子为碳。优选为6至14元,更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基,优选为双环或三环,更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括:
术语“桥杂环基”指5至14元,任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团,其可以含有一个或多个双键,但没有一个环具有完全共轭的π电子系统,其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)
m(其中m是整数0至2)的杂原子,其余环原子为碳。优选为6至14元,更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基,优选为双环、三环或四环,更有选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括:
所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上,其中与母体结构连接在一起的环为杂环基,其非限制性实例包括:
杂环基可以是任选取代的或非取代的,当被取代时,取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、 杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团,优选为6至10元,例如苯基和萘基。更优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上,其中与母体结构连接在一起的环为芳基环,其非限制性实例包括:
芳基可以是取代的或非取代的,当被取代时,取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系,其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元,含1至3个杂原子;更优选为5元或6元,含1至2个杂原子;优选例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等,优选为咪唑基、噻唑基、吡唑基或嘧啶基、噻唑基;更有选吡唑基或噻唑基。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上,其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环,其非限制性实例包括:
杂芳基可以是任选取代的或非取代的,当被取代时,取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基),其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括:甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的,当被取代时,取代基优选为一个或多个以下基团,其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
术语“卤代烷基”指被一个或多个卤素取代的烷基,其中烷基如上所定义。
术语“卤代烷氧基”指被一个或多个卤素取代的烷氧基,其中烷氧基如上所 定义。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“氨基”指-NH
2。
术语“氰基”指-CN。
术语“硝基”指-NO
2。
术语“氧代基”指=O。
术语“羧基”指-C(O)OH。
术语“巯基”指-SH。
术语“酯基”指-C(O)O(烷基)或-C(O)O(环烷基),其中烷基和环烷基如上所定义。
术语“酰基”指含有-C(O)R基团的化合物,其中R为烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生,该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如,“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在,该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子,优选为最多5个,更优选为1~3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻,取代基仅处在它们的可能的化学位置,本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如,具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物,以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药,利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
“可药用盐”是指本发明化合物的盐,这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性,且具有应有的生物活性。
本发明化合物的合成方法
为了完成本发明的目的,本发明采用如下合成方案制备本发明的通式(I)化合物。
当X为CH且Y为N时,通过以下方案1制备作为通式(I)化合物的通式(IA)化合物。
方案1
步骤1:乙酰乙酸乙酯与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛直接缩合,得到(Z)-2-((二甲基氨基)亚甲基)-3-氧代丁酸乙酯(IA-1);
步骤2:(Z)-2-((二甲基氨基)亚甲基)-3-氧代丁酸乙酯(IA-1)在中与强碱作用形成烯醇钠盐中间体,然后与草酸二乙酯发生环化反应,得到4-氧代-4H-吡喃-2,5-二羧酸二乙酯(IA-2);所述溶剂优选无水四氢呋喃,所述强碱优选氢化钠;
步骤3:4-氧代-4H-吡喃-2,5-二羧酸二乙酯(IA-2)与胺(R
1NH
2)通过加成-缩合反应,得到N-R
1-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(IA-3);
步骤4:N-R
1-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(IA-3)被N-溴代丁二酰亚胺(NBS)溴代,得到N-R
1-3-溴-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(IA-4);
步骤5:N-R
1-3-溴-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(IA-4)与相应硼酸通过Suzuki偶联反应,得到N-R
1-3-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(IA-5);Suzuki反应优选碳酸钾为碱、Pd(dppf)Cl
2为催化剂、二氧六环/水为混合溶剂,反应温度为80℃;
步骤6:N-R
1-3-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(IA-5)在碱作用下 进行选择性水解,得到N-R
1-6-(乙氧基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(IA-6);所述碱优选氢氧化钠;
步骤7:N-R
1-6-(乙氧基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(IA-6)与溴代芳香胺在偶联剂和碱的存在下进行酰胺化反应,得到N-R
1-6-(乙氧基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-7);所述偶联剂优选HATU,所述碱优选N,N-二异丙基乙胺(DIPEA);
步骤8:对N-R
1-6-(乙氧基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺中间体(IA-7)的乙酯基团进行水解、酰胺化和脱水三步反应引入氰基(R
2),得到N-R
1-6-氰基-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-8);
步骤9:N-R
1-6-R
2-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-8)在钯催化作用下(优选Pd(dppf)
2,XPhOS为配体,醋酸钾为碱)与联硼酸酯进行suzuki反应形成硼酸酯中间体(IA-9);
步骤10:硼酸酯中间体IA-9与芳香溴化物通过Suzuki偶联反应,得到通式(IA)化合物;Suzuki反应条件优选催化剂:Pd(dppf)
2,碱:K
2CO
3,溶剂:二氧六环和水。
或者,通过以下方案2得到通式(IA)化合物。
方案2
步骤1:N-R
1-6-(乙氧基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(IA-6)与芳香胺在催化剂和碱的作用下进行酰胺化反应,得到N-R
1-6-(乙氧基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-10);所述催化剂优选HATU,所述碱优选N,N-二异丙基乙胺(DIPEA);
步骤2:在溶液中在碱的存在下将N-R
1-6-(乙氧基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-10)的乙酯水解,得到N-R
1-6-羧基-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-11);所述碱优选LiOH,所述溶液优选甲醇-水溶液;
步骤3:N-R
1-6-羧基-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-11)与氯化铵在 偶联剂和碱的作用下进行酰胺化反应,得到N-R
1-6-(氨基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-12);所述偶联剂优选PyBrOP,所述碱优选DIPEA;
步骤4:N-R
1-6-(氨基羰基)-5-R
3-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-芳酰胺(IA-12)在脱水剂和碱的共同作用下进行脱水反应,得到通式(IA)化合物(R
2为氰基);所述脱水剂优选三氟乙酸酐,所述碱优选三乙胺。
当X为N且Y为CH时,通过以下方案3制备作为通式(I)化合物的通式(IB)化合物。
方案3
步骤1:起始原料丙二酸酰胺乙酯在碱性介质中与2-羰基丁醛甲基缩醛进行缩合环化反应得到1-R
3-6-甲基-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸(IB-1);所述碱性介质优选EtONa/EtOH;
步骤2:碘乙烷在溶剂和碱的共同作用下,将1-R
3-6-甲基-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸(IB-1)中的羧基保护,得到1-R
3-6-甲基-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-2);所述溶剂优选NMP,所述碱优选Na
2CO
3;
步骤3:N-溴代丁二酰亚胺(NBS)同时通过亲电取代和过氧苯甲酸(BPO)引发的自由基取代,形成双溴代的1-R
3-6-溴甲基-5-溴-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-3);
步骤4:1-R
3-6-溴甲基-5-溴-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-3)在弱碱作用下进行选择性水解得到1-R
3-6-羟基甲基-5-溴-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-4);所述碱优选NaHCO
3;
步骤5:所得羟基甲基中间体(IB-4)进行氧化反应、酰胺化反应和脱水反应三步衍生化,引入氰基基团(即R
2为氰基),得到1-R
3-6-R
2-5-溴-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-5);
或者,
步骤4’,各种胺、醇和硫醇(醇和硫醇均需要在LiOH作用下)与1-R
3-6-溴甲基-5-溴-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-3)发生亲核取代反应,引入R
2,从而得到1-R
3-6-R
2-5-溴-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-5)(R
2=CH
2XR’);
步骤6:1-R
3-6-R
2-5-溴-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-5)与硼酸化合物进行Suzuki偶联反应,得到1-R
3-5-R
1-6-R
2-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-6);Suzuki偶联反应优选催化剂:Pd(dppf)Cl
2,碱:K
2CO
3,二氧六环/水为混合溶剂,反应温度80℃;
步骤7:1-R
3-5-R
1-6-R
2-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-6)在溶剂中在碱的作用下进行选择性水解,得到1-R
3-5-R
1-6-R
2-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸(IB-7);所述碱优选LiOH;所述溶剂优选甲醇/水;
步骤8:1-R
3-5-R
1-6-R
2-2-羰基-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(IB-7)与芳香胺进行酰胺化反应,从而得到通式(IB)化合物;所述酰胺化试剂优选HATU,并且优选使用TEA为碱,DMF为反应溶剂。
当X和Y均为N,且R
2为氧代基时,通过以下方案4制备作为通式(I)化合物的通式(IC)化合物。
方案4
步骤1:起始原料2-氨基次甲基丙酸二乙酯(IC-1)与异氰酸酯进行缩合反应得到相应的脲中间体(IC-2);
步骤2:脲中间体(IC-2)在碱性介质中发生自身环化反应得到3-R
3-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(IC-3);所述碱性介质优选EtONa/EtOH;
步骤3:烷基碘化物(R
1-I)在溶剂和碱的共同作用下,将R
1引入3-R
3-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(IC-3),从而得到1-R
1-3-R
3-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(IC-4);所述溶剂优选NMP,所述碱优选K
2CO
3;
步骤4:1-R
1-3-R
3-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(IC-4)在酸的作用下进行酸性水解,得到1-R
1-3-R
3-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸(IC-5);所述的酸优选HCl;
步骤5:1-R
1-3-R
3-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸(IC-5)与含硼酸取代基的芳香胺化合物通过酰胺偶联剂和碱共同作用形成相应含硼酸取代基酰胺中间体(IC-6);所述偶联剂优选HATU,所述碱优选TEA;
步骤6:含硼酸取代基酰胺中间体(IC-6)与溴代吡啶化合物进行Suzuki偶联反应,得到通式化合物(IC)化合物;Suzuki反应优选催化剂:Pd(dppf)Cl
2,碱:K
2CO
3,二氧六环/水为混合溶剂,反应温度80℃。
其中,R
1、R
2、R
3、R
4、W、V、Z、n如通式(I)所定义。
附图说明
图1为EBC-1非小细胞肺癌模型中本发明化合物组和溶剂对照组小鼠肿瘤体积的生长变化图。
图2为EBC-1非小细胞肺癌模型中本发明化合物组和溶剂对照组小鼠体重随治疗时间的变化图。
具体实施方式
进一步通过实施例来理解本发明的化合物及其制备,这些实施例说明了一些制备或使用所述化合物的方法。然而,要理解的是,这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和要求保护的本发明范围之内。
本发明化合物是利用便利的起始原料和通用的制备步骤来完成制备的。本发明给出了典型的或倾向性的反应条件,诸如反应温度、时间、溶剂、压力、反应物的摩尔比。但是除非特殊说明,其他反应条件也能采纳。优化条件可能随着具体的反应物或溶剂的使用而改变,但在通常情况下,反应优化步骤和条件都能得到确定。
另外,本发明中可能用到了一些保护基团来保护某些官能团避免不必要的反应。适宜于各种官能团的保护基以及它们的保护或脱保护条件已经为本领域技术 人员广泛熟知。例如T.W.Greene和G.M.Wuts的《有机制备中的保护基团》(第3版,Wiley,New York,1999和书中的引用文献)详细描述了大量的保护基团的保护或脱保护。
化合物和中间体的分离和纯化依据具体的需求采取适当的方法和步骤,例如过滤、萃取、蒸馏、结晶、柱层析、制备薄层板色谱、制备高效液相色谱或上述方法的混合使用。其具体使用方法可参阅本发明描述的实例。当然,其他类似的分离和纯化手段也是可以采用的。可以使用常规方法(包括物理常数和波谱数据)对其进行表征。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移以10
-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Brukerdps 400型核磁仪,测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d
6),氘代氯仿(CDCl
3),氘代甲醇(CD
3OD),内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用ACQUITY H-Class UPLC质谱仪(QDa Detector)(生产商:Waters)。
制备液相使用Waters 2545高效液相色谱仪(Waters 2489UV/可视检测器,2767样品MGR,单一C18,5μm 20mm x250mm)(生产商:Waters)。
微波反应使用引发剂+EU型微波反应器(生产商:Biotage)。
薄层层析硅胶板使用青岛海洋化工GF254硅胶板,薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm~0.2mm,薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm~0.5mm。
柱层析一般使用青岛海洋硅胶100~200目、200~300目硅胶为载体。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成,或可购买自网化商城、北京偶合、Sigma、百灵威、易世明、上海书亚、上海伊诺凯、安耐吉化学,上海毕得等公司。
实施例中无特殊说明,反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
反应溶剂,有机溶剂或惰性溶剂各自表述为使用的该溶剂在所描述的反应条件下不参与反应,包括,如苯、甲苯、乙腈、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿、二氯甲烷、乙醚、甲醇、氮-甲基吡咯碄酮(NMP)、吡啶等。实施例中无特殊说明,溶液是指水溶液。
本发明中所描述的化学反应一般在常压下进行。反应温度在-78℃至200℃之间。反应时间和条件为,例如,一个大气压下,-78℃至200℃之间,大约1至24小时内完成。如果反应过夜,则反应时间一般为16小时。实施例中无特殊说明,反应的温度为室温,为20℃~30℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC),反应所使用的展开剂的体系有:A:二氯甲烷和甲醇体系,B:正己烷和乙酸乙酯体系,C:石油醚和乙酸乙酯体系,D:丙酮,溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括:A:二氯甲烷和甲醇体系,B:正己烷和乙酸乙酯体系,C:石油醚和乙酸乙酯体系,溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节,也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
缩略语
μL=微升;
μM=微摩尔;
NMR=核磁共振;
Boc=叔丁氧基羰基
br=宽峰
d=双峰
δ=化学位移
℃=摄氏度
dd=双双峰
DIPEA=二异丙基乙基胺
DMF=N,N-二甲基甲酰胺
DMSO=二甲亚砜
DCM=二氯甲烷
EA=乙酸乙酯
HATU=2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HPLC=高效液相
Hz=赫兹
IC
50=抑制50%活性的浓度
J=偶合常数(Hz)
LC-MS=液相色谱-质普联用
m=多重峰
M+H
+=母体化合物质量+一质子
mg=毫克
mL=毫升
mmol=毫摩尔
MS=质谱
m/z=质荷比
nM=纳摩尔
NBS=N-溴代琥珀酰亚胺
PE=石油醚
ppm=每百万分
PyBrOP=三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐
s=单峰
t=三重峰
TEA=三乙胺
TBDPS=叔丁基二苯基硅
TFA=三氟乙酸
THF=四氢呋喃
制备实施例1:6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(中间体a)的制备
步骤1:(Z)-2-((二甲基氨基)亚甲基)-3-氧代丁酸乙酯(a1)的制备
于0℃,将N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(1.72kg,14.4mol)滴加到含有乙酰乙酸乙酯(1.79kg,13.75mol)的反应瓶中(内温小于10℃)。反应混合物升至室温搅拌过夜,待反应完成后,将反应液减压浓缩,得到(Z)-2-((二甲基氨基)亚甲基)-3-氧代丁酸乙酯(2.54kg,红色油状物)。直接用于下一步反应。
LC-MS(ESI):m/z 186.2[M+H
+]。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.66(s,1H),4.22(q,J=7.1Hz,2H),3.24– 2.84(m,6H),2.31(s,3H),1.31(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤2:4-氧代-4H-吡喃-2,5-二羧酸二乙酯(a2)的制备
在含有无水四氢呋喃(700mL)的反应瓶中加入(Z)-2-((二甲基氨基)亚甲基)-3-氧代丁酸乙酯(150g,0.81mol)和草酸二乙酯(130g,0.89mol)。于80℃,向反应混合物中缓慢加入氢化钠(38.8g,0.97mol,60%),加毕,继续搅拌30分钟。待反应完全后冷却至室温,于0℃,用1N的稀盐酸(1800ml)淬灭,反应液用乙酸乙酯萃取(600mLx3),合并有机相。用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。粗产品通过乙醇:石油醚/1:10打浆得到4-氧代-4H-吡喃-2,5-二羧酸二乙酯(140g,黄色固体,收率:72%)。
LC-MS(ESI):m/z 241.1[M+H
+]。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.53(s,1H),7.18(s,1H),4.45–4.34(m,4H),1.39(dd,J=12.8,7.1Hz,6H)。
步骤3:1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(a3)的制备
在含有乙醇(1875mL)的反应瓶中加入4-氧代-4H-吡喃-2,5-二羧酸二乙酯(300g,1.25mol),将混合物冷却至0℃,搅拌下滴加异丙胺(73.8g,1.25mol),加毕,升至室温并继续搅拌30分钟后,回流过夜。待反应完成后,反应液减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解(200ml),并冷至0℃,滴加浓盐酸(104ml),搅拌约30分钟,过滤,滤饼用乙酸乙酯(600ml)冲洗,收集固体得到1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯盐酸盐(307.99g,白色固体,收率:70%)。
LC-MS(ESI):m/z 282.12[M+H
+]。
1HNMR(400MHz,DMSO-d
6)δ8.46(s,1H),6.77(s,1H),4.73–4.62(m,1H),4.37(d,J=7.1Hz,2H),4.24(q,J=7.1Hz,2H),1.44(d,J=6.6Hz,7H),1.35–1.21(m,6H)。
步骤4:3-溴-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(a4)的制备
在含有DMF(1500mL)的反应瓶中加入1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯盐酸盐(307g,1.09mol)。将反应物冷至0℃,缓慢滴加液溴(167.5ml,3.27mol)。加毕,继续搅拌30分钟。待反应完成后,将反应液滴加到含有亚硫酸氢钠的水中(7500mL),搅拌1小时,过滤,滤饼用水(2L)洗涤,收集滤饼,干燥,得到3-溴-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(236.69g,白色固体,收率:67.8%)。
LC-MS(ESI):m/z 360.07/362.07[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.25(s,1H),4.50(q,J=7.2Hz,2H),4.37(q,J=7.1Hz,2H),4.13(p,J=6.6Hz,1H),1.52(d,J=6.6Hz,6H),1.41(dt,J=22.2,7.1Hz,6H)。
步骤5:5-溴-6-(乙氧基羰基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(a5)的制备
在含有(1600mL)乙醇的反应瓶中加入3-溴-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(323.11g,0.9mol)。将反应物冷却至0℃,滴加氢氧化钠水溶液(160 mL水,1.06mol氢氧化钠),加毕并继续搅拌1小时。待反应完成后,用1.5N的稀盐酸(700mL)调节pH~7,有白色固体析出,继续搅拌30分钟。过滤,收集固体,干燥,得到5-溴-6-(乙氧基羰基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(271.2g,白色固体,收率:90.8%)。
LC-MS(ESI):m/z 331.95/333.91[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ14.71(s,1H),8.59(s,1H),4.56(q,J=7.1Hz,2H),4.28(hept,J=6.7Hz,1H),1.58(d,J=6.6Hz,6H),1.47(t,J=7.2Hz,3H)。
步骤6:6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(a)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(400mL)和水(100mL)的反应瓶中加入5-溴-6-(乙氧基羰基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(43.5g,0.13mol)、对氟苯硼酸(25.18g,0.18mol)、碳酸钾(71.8g,0.52mol)和Pd(dppf)Cl
2(475mg,0.065mmol)。密封,氮气置换三次,于85℃搅拌过夜。待反应液冷却至室温后,加水(600mL)和乙酸乙酯(200mL)稀释,过滤,静止分层。水相用浓盐酸调节PH约为6,白色沉淀产生,过滤,滤饼用水洗涤,干燥得到6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(a)(31g,白色固体,收率68%)。
LC-MS(ESI):m/z 348.10[M+H+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ15.73(s,1H),8.81(s,1H),7.37–7.22(m,4H),4.39(p,J=6.5Hz,1H),4.15(q,J=7.1Hz,2H),1.54(d,J=6.5Hz,6H),0.93(t,J=7.1Hz,3H)。
制备实施例2:6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(中间体b)的制备
采用与制备实施例1相同的方法,除了用甲胺水溶液代替异丙胺,制得6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(灰色固体,四步收率:38.5%)。
LC-MS(ESI):m/z 320.1[M+H
+]。
制备实施例3:1-环丁基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(中间体c)的制备
采用与制备实施例1相同的方法,除了用环丁胺代替异丙胺,制得1-环丁基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(白色固体,四步收率:80.9%)。
LC-MS(ESI):m/z360.1[M+H
+]。
制备实施例4:1-环丙基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(中间体d)的制备
采用与制备实施例1相同的方法,除了用环丙基胺代替异丙胺,制得1-环丙基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(灰色固体,四步收率:70.8%)。
LC-MS(ESI):m/z 346.3[M+H
+]。
制备实施例5:6-氰基-1-环丙基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体e)的制备
步骤1:5-((4-溴-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-甲酸乙酯(e1)的制备
在含有DMF(100mL)的反应瓶中加入1-环丙基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(d)(8.0g,23.2mmol)、4-溴-3-氟苯胺(4.0g,21.1mmol)、HATU(12g,31.6mmol)和DIPEA(5.4g,42.1mmol)。将混合物于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(100mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为PE:EA=5:1),得到5-((4-溴-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-甲酸乙酯(e1)(8.5g,黄色固体,收率:78%)。
LC-MS(ESI):m/z 517.05/519.06[M+H
+]。
步骤2:5-((4-溴-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(e2)的制备
于室温,在含有乙醇(100mL)的反应瓶中加入5-((4-溴-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-甲酸乙酯(e1)(8.5g,16.4mmol)、氢氧化锂一水合物(1.03g,24.6mmol)和水(25mL)。将混合物升温至70℃并搅拌过夜,待反应完成后,减压浓缩得到粗产品5-((4-溴-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(e2)(黄色固体)。其未经纯化直接用于下一步反应。
步骤3:N
5-(4-溴-3-氟苯基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(e3)的制备
于室温,在含有四氢呋喃(15mL)和氧氯化磷(15mL)的反应瓶中5-((4-溴-3-氟 苯基)氨基甲酰基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(e2)(2.2g,4.5mmol)。将混合物加热至回流搅拌30分钟,待反应完全后,减压浓缩得酰氯中间体。其未经纯化直接用于下一步反应。
于0℃,在含有四氢呋喃(20mL)和氨水(20mL)的反应瓶中加入酰氯中间体。加毕,反应液继续搅拌20分钟,待反应完成后,加入乙酸乙酯(30mL)稀释,有机相依次用水、饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:20)得到N
5-(4-溴-3-氟苯基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(e3)(1.5g,黄色固体,收率:68%)。
步骤4:N-(4-溴-3-氟苯基)-6-氰基-1-环丙基-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(e4)的制备
在含有无水四氢呋喃(20mL)的反应瓶中加入N
5-(4-溴-3-氟苯基)-1-环丙基-3-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(e3)(1.5g,3.1mmol)。反应液冷至0℃,依次加入三乙胺(2.5g,24.6mmol)和三氟甲磺酸酐(2.6g,12.2mmol)。加毕,反应液继续搅拌30分钟,待反应完成后,加入乙酸乙酯(100mL)稀释,有机相依次用水、饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:20)得到N-(4-溴-3-氟苯基)-6-氰基-1-环丙基-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(e4)(1.3g,黄色固体,收率:90.3%)。
步骤5:6-氰基-1-环丙基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(e)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(16mL)的反应瓶中加入N-(4-溴-3-氟苯基)-6-氰基-1-环丙基-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(e4)(1.3g,2.7mmol)、联硼酸频那醇酯(1.04g,4.1mmol)、乙酸钾(795mg,8.1mmol)、Pd
2(dba)
3(275mg,0.3mmol)和X-PHOS(257mg,0.54mmol)。密封,氮气置换三次,通过微波反应30分钟(90℃)。待反应液冷却至室温后,加水(100mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(100mL x3),合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:20)得到6-氰基-1-环丙基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(e)(800mg,灰白色固体,收率:55.9%)。
LC-MS(ESI):m/z 518.14[M+H
+]。
制备实施例6:6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体f)的制备
采用与制备实施例5相同的方法,除了用6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(a)代替1-环丙基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(d),制得6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(灰色固体,五步收率:25.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 520.21[M+H
+]。
制备实施例7:6-氰基-1-环丁基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体g)的制备
采用与制备实施例5相同的方法,除了用1-环丁基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(c)代替1-环丙基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(d),制得6-氰基-1-环丁基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(灰色固体,五步收率:29.6%)。
LC-MS(ESI):m/z 532.20[M+H
+]。
制备实施例8:5-溴-6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体h)的制备
步骤1:3-((4-氟苯基)氨基)-3-氧代丙酸乙酯(h1)的制备
在含有丙酮(300mL)的反应瓶中加入4-氟苯胺(30g,0.27mol)和三乙胺(28.7g,0.28mol)。将反应液冷却至0℃,搅拌下滴加3-氯-3-氧代丙酸乙酯(42.9g,0.28mol),加毕自然升至室温并继续搅拌过夜。待反应完全后,将反应液减压浓缩。残余物中加入500mL的水并搅拌2h,减压过滤,收集固体得到3-((4-氟苯基)氨基)-3-氧代丙酸乙酯(h1)(60g,黄色固体,收率:98.8%)。
LC-MS(ESI):m/z 226.07[M+H
+]。
步骤2:1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(h2)的制备
在含有乙醇(200mL)的反应瓶中加入3-(4-氟苯基)氨基)-3-氧代丙酸乙酯(h1)(30g,0.13mol)、4,4-二甲氧基丁-2-酮(21.1g,0.16mol)和20%的乙醇钠的乙醇溶液(166mL,0.43mol)。将反应混合物加热至80℃回流过夜,待反应完全后,将反应液减压浓缩。残余物中加入5M的盐酸至pH4~5,用二氯甲烷萃取(100mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,残余物用石油醚和乙酸乙酯的混合液(5:1,100mL)打浆,过滤,滤饼用石油醚洗涤,收集固体得产品1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(h2)(24g,黄色固体,收率:74.7%)。
LC-MS(ESI):m/z 248.12[M+H
+]。
步骤3:1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(h3)的制备
在含有NMP(150mL)的反应瓶中加入1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(h2)(16g,64.8mmol)、碳酸钠(7.6g,71.3mmol)和碘乙烷(11.1g,71.3mmol),于室温搅拌4小时。待反应完全后,加入水(300mL),用乙酸乙酯萃取(150mLx3)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩, 残余物通过乙醚(150mL)打浆纯化,得到1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(h3)(15g,黄色固体,收率:84.2%)。
LC-MS(ESI):m/z 276.10[M+H
+]。
步骤4:5-溴-6-(溴甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h4)的制备
在含有四氯化碳(150mL)的反应瓶中加入1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(h3)(15g,54.5mmol)、NBS(21.4g,120mmol)和BPO(660mg,2.72mmol)。反应液加热至70℃并搅拌24小时。待反应完全后,加入饱和硫代硫酸钠水溶液(200mL)猝灭反应,用二氯甲烷萃取(100mLx3)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=2:1),得到5-溴-6-(溴甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h4)(16.8g,黄色固体,收率:71.2%)。
LC-MS(ESI):m/z 431.94/433.93[M+H
+]。
步骤5:5-溴-1-(4-氟苯基)-6-(羟基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h5)的制备
在含有四氢呋喃(150mL)的反应瓶中加入5-溴-6-(溴甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h4)(16.8g,38.8mmol)和饱和的碳酸氢钠水溶液(150mL)。反应液加热至60℃并搅拌过夜。待反应完全后,用乙酸乙酯萃取(100mLx3)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=1:3),得到5-溴-1-(4-氟苯基)-6-(羟基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h5)(7.2g,黄色固体,收率:50.2%)。
LC-MS(ESI):m/z 369.95/371.95[M+H
+]。
步骤6:5-溴-1-(4-氟苯基)-6-甲酰基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(h6)的制备
在含有无水二氯甲烷(5mL)的反应瓶中加入草酰氯(208mg,1.64mmol),密封,氮气置换三次。反应液降温至-78℃后,缓慢滴加二甲基亚砜(176mg,2.26mmol),加毕并在此温度下搅拌20分钟,再缓慢滴加5-溴-1-(4-氟苯基)-6-(羟基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h5)(380mg,1.03mmol)的二氯甲烷溶液(5mL),加毕并在此温度下再搅拌30分钟。然后缓慢滴加三乙胺(520mg,5.15mmol)的二氯甲烷溶液,加毕并在此温度下搅拌继续30分钟。待反应完成后,缓满滴加水猝灭反应,用二氯甲烷萃取(10mLx3)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,得粗品5-溴-1-(4-氟苯基)-6-甲酰基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(h6)(380mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 367.94/369.95[M+H
+]。
步骤7:5-溴6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(h)的制备
在含有乙腈(50mL)的反应瓶中加入粗品5-溴-1-(4-氟苯基)-6-甲酰基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(h6)(7.2g,19.6mmol)、磷酸二氢钠(1.17g,9.8mmol)、双氧水(20mL)和亚氯酸钠(3.5g,39.2mmol)。反应液于室温搅拌过夜,待反应完成后,加水(100mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(50mLx3)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物用石油醚和乙酸乙酯的混合液(PE:EA=10:1,50mL)打浆纯化得5-溴-6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(h)(5.6g,黄色固体,收率:74.4%)。
LC-MS(ESI):m/z 383.99/385.97[M+H
+]。
制备实施例9:6-氰基-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体i)的制备
步骤1:5-溴-6-氨基甲酰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i1)的制备
在含有DMF(8mL)的反应瓶中加入5-溴-6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(h)(500mg,1.3mmol)、氯化铵(348mg,6.5mmol)、PyBrOP(760mg,1.6mmol)和DIPEA(503mg,3.9mmol)。反应液于室温搅拌1小时,待反应完成后,加饱和的碳酸氢钠水溶液(20mL)猝灭反应,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=1:3)得到5-溴-6-氨基甲酰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i1)(400mg,白色固体,收率: 80.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 383.01/385.03[M+H
+]。
步骤2:5-溴-6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i2)的制备
在含有乙腈(5mL)的反应瓶中加入5-溴-6-氨基甲酰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i1)(100mg,0.26mol)。待反应液降温至0℃,依次缓慢滴加三氟乙酸酐(103mg,0.52mol)和三乙胺(80mg,0.78mol)。反应液于0℃搅拌1小时,待反应完成后,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,得到粗品5-溴-6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i2)(96mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 364.95/366.98[M+H
+]。
步骤3:6-氰基-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体i)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(9mL)和水(3mL)的反应瓶中加入5-溴-6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i2)(100mg,0.27mmol)、甲基硼酸(164mg,2.7mmol)、碳酸钾(113mg,0.82mmol)和Pd(dppf)Cl
2.DCM(44mg,0.055mmol)。密封,氮气置换三次,于微波反应器中加热至100℃搅拌30分钟。待反应液冷却至室温后,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),弃去有机相。水相用1N的盐酸水溶液酸化至pH3~4,再用异丙醇和二氯甲烷的混合溶剂(15%的异丙醇)萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,得到粗品6-氰基-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体i)(30mg,黄色油状物,收率:40.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 273.08[M+H
+]。
制备实施例10:6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体j)的制备
采用与制备实施例9相同方法,除了用环丙基硼酸代替甲基硼酸,制得6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体j)(黄色油状物,一步收率:65.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 299.10[M+H
+]。
制备实施例11:6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体k)的制备
步骤1:6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(中间体k1)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(9mL)和水(3mL)的反应瓶中加入5-溴-6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i2)(100mg,0.27mmol)、异丙烯基硼酸频那醇脂(230mg,1.37mmol)、碳酸钾(113mg,0.82mmol)和Pd(dppf)Cl.DCM(44mg,0.055mmol)。密封,氮气置换三次,于微波反应器中加热至100℃搅拌30分钟。待反应液冷却至室温后,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=1:1)得到6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(中间体k1)(60mg,黄色油状物,收率:66.7%)。
LC-MS(ESI):m/z 327.14[M+H
+]。
步骤2:6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体k)的制备
在含有乙醇(3mL)的反应瓶中加入6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(中间体k1)(60mg,0.18mmol)。待反应液降温至0℃,缓慢滴加氢氧化钠的水溶液(1mL,10mg,0.24mmol),加毕,升温至室温并搅拌30分钟。待反应完全后,减压浓缩,得到粗品6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体k)(60mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 300.12[M+H
+]。
制备实施例12:5-溴-6-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体l)的制备
步骤1:5-溴-1-(4-氟苯基)-6-((甲氨基)甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(l1)的制备
在含有四氢呋喃(4mL)的反应瓶中加入5-溴-6-(溴甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h4)(300mg,0.75mmol)。待反应液降温至0℃,缓慢滴加甲氨水(0.5mL),加毕,升温至室温并搅拌1小时。待反应完全后,加入水稀释,用乙酸乙酯萃取(10mLx3)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=2:1),得到5-溴-1-(4-氟苯基)-6-((甲氨基)甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(l1)(250mg,黄色固体,收率:86.7%)。
LC-MS(ESI):m/z 383.13/385.10[M+H
+]。
步骤2:6-(((叔丁氧基羰基)甲基)氨基)(甲基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(l2)的制备
在含有二氯甲烷(4mL)的反应瓶中加入5-溴-1-(4-氟苯基)-6-((甲氨基)甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(l1)(250mg,0.65mmol)、Boc
2O(202mg,0.94mmol)和三乙胺(94mg,0.94mmol)。反应液于室温搅拌3小时。待反应完全后,减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=5:1),得到6-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)甲基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(l2)(230mg,黄色固体,收率:73.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 483.15/485.13[M+H
+]。
步骤3:5-溴-6-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体l)的制备
在含有乙醇(4.5mL)的反应瓶中加入6-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)甲基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(l2)(230mg,0.48mmol)。待反应液降温至0℃,缓慢滴加氢氧化钠的水溶液(1.5mL,25mg,0.62mmol),加毕,升温至室温并搅拌30分钟。待反应完全后,减压浓缩,得到粗品5-溴-6-(((叔丁氧基 羰基)(甲基)氨基)甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体l)(230mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 455.12/457.09[M+H
+]。
制备实施例13:6-((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体m)的制备
采用与制备实施例12相同方法,除了用氨水代替甲胺水溶液,制得6-((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体m)(黄色固体,三步收率:45.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 441.15/443.11[M+H
+]。
制备实施例14:5-溴-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体n)的制备
步骤1:5-溴-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体n)的制备
在含有甲醇(8mL)的反应瓶中加入5-溴-6-(溴甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(h4)(500mg,1.15mmol)。待反应液降温至0℃,缓慢滴加氢氧化锂的水溶液(1.4mL,241mg,5.75mmol),加毕,升温至室温并搅拌30分钟。待反应完全后,减压浓缩,得到粗品5-溴-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体n)(500mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 355.95/357.95[M+H
+]。
制备实施例15:4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p)的制备
步骤1:3-溴-5-碘吡啶-2-胺(中间体p1)的制备
在含有乙腈(100mL)的反应瓶中加入5-碘吡啶-2-胺(5.0g,22.73mmol)和NBS(4.0g,22.73mmol)。将反应混合物于50℃搅拌12小时,然后冷却至室温,过滤,减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA/20:1),得到3-溴-5-碘吡啶-2-胺(中间体p1)(2.5g,黄色固体,收率:36.8%)。
LC-MS(ESI):m/z299.35/301.31[M+H
+]。
步骤2:4-(4-(6-氨基-5-溴吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p2)的制备
于室温,在含有甲苯、乙醇和水的混合液(50mL,2:2:1)的反应瓶中加入3-溴-5-碘吡啶-2-胺(中间体p1)(2.5g,8.36mmol)、4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(北京偶合,3.78g,10.03mmol)、碳酸钠(2.66g,25.08mmol)、Pd(PPh
3)
4(483mg,0.42mmol)。密封,氮气置换三次,加热至80℃并搅拌12小时。待反应完全后,过滤,滤液用水(50mL)稀释,乙酸乙酯萃取(50mL×3),合并有机相。将有机相用饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA/1:1),得到4-(4-(6-氨基-5-溴吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p2)(2.8g,黄色固体,收率:79.4%)。
LC-MS(ESI):m/z422.24/424.21[M+H
+]。
步骤3:4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环和水的混合液(40mL,4:1)的反应瓶中加入4-(4-(6-氨基-5-溴吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p2)(2.8g,6.64mmol)、4-氨基-2-氟苯硼酸频那醇酯(上海毕得,1.88g,7.96mmol)、碳酸钾(2.75g,19.92mmol)、Pd(dppf)Cl
2.DCM(538mg,0.66mmol)。密封,氮气置换三次,加热至90℃并搅拌过夜。待反应完全后,过滤,滤液用水(50mL)稀释,乙酸乙酯萃取(50mL×3),合并有机相。将有机相用饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA/1:2),得到4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p)(2.3g,黄色固体,收率:77.1%)。
LC-MS(ESI):m/z453.43[M+H
+]。
制备实施例16:3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体q)的制备
采用与制备实施例15相同的方法,除了用1-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑(北京偶合)代替4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯,制得3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体q)(黄色固体,两步收率:68.8%)。
LC-MS(ESI):m/z298.17[M+H
+]。
制备实施例17:3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体r)的制备
采用与制备实施例15相同的方法,除了用1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑(北京偶合)代替4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯,制得3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体r)(黄色固体,两步收率:72.3%)。
LC-MS(ESI):m/z354.31[M+H
+]。
制备实施例18:3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-2-胺(中间体s)的制备
采用与制备实施例15相同的方法,除了用(3,4-二甲氧基苯基)硼酸(北京偶合)代替4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯,制得3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-2-胺(中间体s)(黄色固体,两步收率:79.1%)。
LC-MS(ESI):m/z340.22[M+H
+]。
制备实施例19:3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体t)的制备
采用与制备实施例15相同的方法,除了用1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑(北京偶合)代替4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯,制得3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体t)(黄色固体,两步收率:75.8%)。
LC-MS(ESI):m/z284.15[M+H
+]。
制备实施例20:3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体u)的制备
采用与制备实施例15相同的方法,除了用1-甲基-4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶(上海毕得)代替4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯,制得3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体u)(黄色固体,两步收率:32.4%)。
LC-MS(ESI):m/z367.33[M+H
+]。
制备实施例21:3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)的制备
采用与制备实施例15步骤1和2相同的方法,除了用1-乙基-1H-吡唑-4-硼酸频那醇酯代替4-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯。制得3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)(黄色固体,二步收率:43%)。
LC-MS(ESI):m/z 267.01,269.08[M+H
+]。
制备实施例22:3-溴-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(w)的制备
采用与制备实施例15步骤1和2相同的方法,除了用1-甲基-1H-吡唑-4-硼酸频那醇酯代替4-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯。制得3-溴-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(w)(黄色固体,二步收率:36%)。
LC-MS(ESI):m/z 253.01,255.08[M+H
+]。
制备实施例23:3-溴-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(x)的制备
采用与制备实施例15步骤1和2相同的方法,除了1-(四氢吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-硼酸频哪醇酯代替4-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯。制得3-溴-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(x)(黄色固体,二步收率:49%)。
LC-MS(ESI):m/z 323.18/325.14[M+H
+]。
制备实施例24:6-氰基-N-(2,5-二氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(y)的制备
采用与制备实施例5相同的方法,除了用6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(a)代替1-环丙基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(d),并且用4-溴-2,5-二氟苯胺代替4-溴-3-氟苯胺,制得6-氰基-N-(2,5-二氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(y)(黄色固体,五步收率:18%)。
LC-MS(ESI):m/z 538.25[M+H
+]。
制备实施例25:3-溴-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(z)的制备
采用与制备实施例15步骤1和2相同的方法,除了1-甲基-4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶(上海毕得)代替4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。制得3-溴-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(z)(黄色固体,二步收率:23%)。
LC-MS(ESI):m/z 336.22/338.18[M+H
+]。
制备实施例26:4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺盐酸盐(中间体aa)的制备
步骤1:4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二甲氧基喹啉(中间体aa1)的制备
于室温,在含有二苯醚(2000mL)的反应瓶中加入4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(300g,1.341mol)和2-氟-4-硝基苯酚(273g,1.743mol)。将反应液升温至140℃并搅拌24小时,待反应液冷却至室温后,有米白色固体析出。加入2000mL石油醚,继续搅拌2小时,然后将反应液过滤,滤饼用石油醚1000mL洗涤,收集固体得到4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二甲氧基喹啉(中间体aa1)(440g,米白色固体,收率:95.38%)。
LC-MS(ESI):m/z345.23[M+H
+]
步骤2:4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺盐酸盐(中间体aa)的制备
于室温,在含有甲醇(1500mL)的反应瓶中加入4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二甲氧基喹啉(300g,0.872mol)、钯/碳(30g,10%)和浓盐酸(72mL,0.872mol)。密封,氮气置换三次后,用氢气置换三次并搅拌36小时。加入1500mL甲醇并加热至60℃,直至固体完全溶解,过滤,滤液缓慢冷却至0℃,有大量固体析出。过滤,滤饼用1500mL乙酸乙酯洗涤,收集固体得到4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺盐酸盐(中间体aa)(290g,浅黄色固体,收率:94.9%)。
LC-MS(ESI):m/z315.27[M+H
+]。
制备实施例27:N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(bb)的制备
步骤1:2-((3-(4-氟苯基)脲基)亚甲基)丙二酸二乙酯(bb1)的制备
于室温,在含有(30mL)1,2-二氯乙烷的反应瓶中加入氨乙烯基丙二酸二乙酯(1.7g,9.1mmol)、异氰酸对氟苯基酯(1.37g,10mmol)和DIPEA(2.35g,18.2mmol)。密封,氮气置换三次,加热回流6小时。待反应完成后,反应液冷却至0℃,析出 固体,过滤,滤饼用乙醚洗涤,收集,干燥得到2-((3-(4-氟苯基)脲基)亚甲基)丙二酸二乙酯(bb1)(980mg,白色固体,收率:33.7%)。
LC-MS(ESI):m/z 325.1[M+H
+]。
步骤2:3-(4-氟苯基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(bb2)的制备
于室温,在含有(20mL)乙醇的反应瓶中加入2-((3-(4-氟苯基)脲基)亚甲基)丙二酸二乙酯(bb1)(980mg,3mmol)和乙醇钠(306mg,4.5mmol)。反应液搅拌1小时后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯(100mL)稀释,有机相依次用柠檬酸(200mL,1M)和饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为DCM:MeOH/10:1),得到3-(4-氟苯基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(bb2)(780mg,白色固体,收率:92.7%)。
LC-MS(ESI):m/z 279.1[M+H
+]。
步骤3:3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(bb3)的制备
于室温,在含有(10mL)DMF的反应瓶中加入3-(4-氟苯基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(bb2)(350mg,1.3mmol)、碳酸钾(538mg,4.5mmol)和2-碘代丙烷(660mg,3.9mmol)。将混合物升温至75℃搅拌过夜,待反应液冷却至室温后,用乙酸乙酯(50mL)稀释,有机相依次用水(100mL)和饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA/1:1),得到3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(bb3)(380mg,白色固体,收率:94.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 321.1[M+H
+]。
步骤4:3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸(bb4)的制备
于室温,在含有盐酸的1,4-二氧六环溶液(10mL,4M)的反应瓶中加入3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(bb3)(380mg,1.2mmol)和水(0.5mL)。将混合物加热至70℃搅拌5小时,待反应液冷却至室温后,减压浓缩得到3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸(bb4)。其未经纯化直接用于下一步反应。
LC-MS(ESI):m/z 293.1[M+H
+]。
步骤5:N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(bb)的制备
在含有DMF(6mL)的反应瓶中加入3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸(bb4)(300mg,1mmol)、4-氨基-2-氟苯硼酸频那醇酯(244mg,1mmol)、HATU(608mg,1.6mmol)和DIPEA(387mg,3mmol)。将混合物于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(50mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液 减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为PE:EA=5:1),得到N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(bb)(280mg,黄色固体,收率:53.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 512.3[M+H
+]。
制备实施例28:4-(4-氨基-2-氟苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc)的制备
步骤1:4-((((2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-亚基)甲基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(中间体cc1)的制备
于室温,在含有以乙醇(100mL)的反应瓶中加入4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(上海毕得,5g,27.6mmol)。将反应液升温至50℃并搅拌10分钟,再加入5-(甲氧基亚甲基)-2,2-二甲基-1,3-二恶烷-4,6-二酮(上海毕得,5.13g,27.6mmol)。将混合物继续升温至80℃并搅拌1小时,待反应冷却至室温,过滤,收集固体得到4-((((2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-亚基)甲基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(中间体cc1)(8g,棕色固体,收率:86.5%)。
LC-MS(ESI):m/z336.3[M+H
+]。
步骤2:4-羟基-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(中间体cc2)的制备
于室温,在含有二苯醚(100mL)的反应瓶中加入4-((((2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-亚基)甲基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(中间体cc1)(8g,23.9mmol)。 将反应液升温至200℃并搅拌8小时,待反应冷却至室温,过滤,收集固体得到4-羟基-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(中间体cc2)(5.2g,棕色固体,收率:93.4%)。
LC-MS(ESI):m/z234.1[M+H
+]。
步骤3:4-氯-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(中间体cc3)的制备
于室温,在含有二氯亚砜(20mL)的反应瓶中加入4-羟基-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(中间体cc2)(1g,4.29mmol)和DMF(0.1mL)。将反应液加热至回流并搅拌3小时,待反应冷却至室温后,将反应液减压浓缩。残余物于二氯甲烷(30mL)稀释,有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。得到粗产品4-氯-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(中间体cc3)(1.0g,棕色固体,收率:92.8%)。
LC-MS(ESI):m/z237.1/239.1[M+H
+]。
步骤4:4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc4)的制备
于室温,在含有THF(10mL)的反应瓶中加入4-氯-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(中间体cc3)(1g,3.98mmol)和氨水(33.0%,5mL)。密封,将反应液加热至80℃并搅拌过夜,待反应冷却至室温后,过滤,收集固体得到4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc4)(600mg,棕色固体,收率:63.9%)。
LC-MS(ESI):m/z236.2/238.2[M+H
+]。
步骤5:4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc5)的制备
于室温,在含有二苯醚(10mL)的反应瓶中加入4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc4)(600mg,2.39mmol)和2-氟-4-硝基苯酚(北京偶合,750mg,4.78mmol)。将反应液升温至140℃并搅拌10小时,待反应液冷却至室温后,有米白色固体析出。将反应液过滤,收集固体得到4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc5)(800mg,米白色固体,收率:93.7%)。
LC-MS(ESI):m/z358.2[M+H
+]
步骤6:4-(4-氨基-2-氟苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体m)的制备
于室温,在含有乙醇(15mL)和水(5mL)的反应瓶中加入4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体m5)(800mg,2.24mmol)、铁粉(627mg,11.2mmol)和氯化铵(1.3g,22.7mmol)。将反应液升温至80℃并搅拌1小时,待反应液冷却至室温后,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为DCM:MeOH/5:1),得到4-(4-氨基-2-氟苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc)(600mg,灰色固体,收率:81.7%)。
LC-MS(ESI):m/z328.3[M+H
+]
制备实施例29:1-(甲基-d
3)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(中间体dd)的制备
于室温,在含有乙腈(15mL)的反应瓶中加入4-吡唑硼酸频哪醇酯(上海毕得医药科技有限公司)(1.2g,0.5mmol),氘代碘甲烷(安耐吉化学)(1.7g,1mmol)和碳酸钾(1.7g,1mmol)。将反应液室温搅拌48小时,待反应完成后,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA/5:1),得到1-(甲基-d
3)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(中间体dd)(650mg,白色油状物,收率:50%)。
LC-MS(ESI):m/z212.23[M+H
+]
制备实施例30:3-溴-5-(1-(甲基-d
3)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体ee)的制备
采用与制备实施例15步骤1和2相同的方法,除了1-(甲基-d
3)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑代替4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。制得3-溴-5-(1-(甲基-d
3)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体ee)的制备(ee)(黄色固体,二步收率:35%)。
LC-MS(ESI):m/z 256.07/258.05[M+H
+]。
实施例1:N-(4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(1)的制备
步骤1:5-((4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代乙酯-1,4-二氢吡啶-2-羧酸甲酯(1a)的制备
在含有DMF(20mL)的反应瓶中加入6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(中间体(a)(625mg,1.8mmol)、3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-2-胺(s)(500mg,1.5mmol)、HATU(875mg,2.3mmol)和DIPEA(387mg,3.0mmol)。将混合物于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(60mLx3),合并有机相。有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:20),得到5-((4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(1a)(800mg,黄色固体,收率:81.2%)。
LC-MS(ESI):m/z 669.28[M+H
+]。
步骤2:5-((4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(1b)的制备
于室温,在含有乙醇(20mL)的反应瓶中加入5-((4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(1a)(800mg,1.2mmol)、氢氧化锂一水合物(67mg,1.6mmol)和水(5mL)。将混合物于70℃搅拌过夜,待反应完全后,减压浓缩得到粗产品5-((4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(1b)(黄色固体)。其未经纯化直接用于下一步反应。
LC-MS(ESI):m/z 641.3[M+H
+]。
步骤3:N
5-(4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(1c)的制备
于室温,在含有四氢呋喃(8mL)和氧氯化磷(4mL)的反应瓶中加入5-((4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(1b)(400mg,0.6mmol)。将混合物加热至回流30分钟,待反应完成后,减压浓缩得到酰氯中间体。其未经纯化直接用于下一步反应。于0℃,在含有四氢呋喃(10mL)和氨水(10mL)的反应瓶中滴加酰氯中间体。加毕,反应液继续搅拌20分钟,待反应完成后,加入乙酸乙酯(30mL)稀释,有机相依次用水,饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:10),得到N
5-(4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(1c)(280mg,黄色固体,收率:70.2%)。
LC-MS(ESI):m/z640.7[M+H
+]。
步骤4:N-(4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(1)的制备
在含有无水四氢呋喃(4mL)的反应瓶中加入N
5-(4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(6c)(100mg,0.16mol)。反应物冷却至0℃,依次加入三乙胺(130mg,1.3mmol)和三氟甲磺酸酐(126mg,0.6mol)。加毕,反应液继续搅拌30分钟,待反应完成后,加入氢氧化钾水溶液(5M,0.2mL),搅拌1小时后,加乙酸乙酯(50mL)稀释,有机相依次用水,饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到N-(4-(2-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(1)(30mg,黄色固体,收率:31%)。
LC-MS(ESI):m/z 622.2[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.55(s,1H),8.85(s,1H),8.29(d,J=2.5Hz,1H),7.90(dd,J=12.2,2.0Hz,1H),7.64–7.58(m,3H),7.48–7.36(m,4H),7.18–7.10(m,2H),6.97(d,J=8.4Hz,1H),5.67(s,2H),4.86(p,J=6.6Hz,1H),3.81(s,3H),3.76(s,3H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例2:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(2)的制备
步骤1:4-(4-(6-氨基-5-(4-(6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺基)-叔丁基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2a)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(8mL)和水(2mL)的反应瓶中加入4-(4-(6-氨基-5-溴吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(p2)(260mg,0.62mmol)、6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)(300mg,0.62mmol)、碳酸钾(256mg,1.85mmol)、和Pd(PPh
3)
4(285mg,0.25mmol)。密封,氮气置换三次,微波加热至90℃反应30分钟。待反应完成后,用水(50mL)稀释,乙酸乙酯萃取(30mL×3),合并有机相。将有机相用饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA/1:2),得到4-(4-(6-氨基-5-(4-(6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰氨基)-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2a)(290mg,黄色固体,收率:68.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 735.4[M+H
+]。
步骤2:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(2)的制备
于室温,在含有DCM(4mL)的反应瓶中加入4-(4-(6-氨基-5-(4-(6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰氨基)-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2a)(100mg,0.14mmol)和盐酸(1mL,4M)。反应液搅拌30分钟,待反应完成后,反应液减压浓缩。残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(2)(25mg,黄色固体,收率:29%)。
LC-MS(ESI):m/z 635.3[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.55(s,1H),8.84(s,1H),8.26(d,J=2.3Hz,1H),8.14(s,1H),7.90(dd,J=12.3,2.1Hz,1H),7.84(s,1H),7.64–7.58(m,2H), 7.56(d,J=2.4Hz,1H),7.46(dd,J=8.4,2.1Hz,1H),7.38(td,J=8.7,3.5Hz,3H),5.56(s,2H),4.86(p,J=6.6Hz,1H),4.35(tt,J=11.0,4.1Hz,1H),3.24(s,2H),2.92(td,J=12.5,3.0Hz,2H),2.16–2.09(m,2H),2.01(qd,J=12.1,4.2Hz,3H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例3:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(3)的制备
步骤1:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(3)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(8mL)和水(2mL)的反应瓶中加入3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)(80mg,0.3mmol)、6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)(186mg,0.36mmol)、乙酸钾(88mg,0.9mmol)、和Pd(PPh
3)
4(69mg,0.06mmol)。密封,氮气置换三次,微波加热至90℃反应30分钟。待反应完成后,用水(50mL)稀释,乙酸乙酯萃取(30mL×3),合并有机相。将有机相用饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(3)(35mg,黄色固体,收率:20%)。
LC-MS(ESI):m/z 580.2[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.55(s,1H),8.84(s,1H),8.24(d,J=2.4Hz,1H),8.09(s,1H),7.90(dd,J=12.3,2.1Hz,1H),7.77(d,J=0.8Hz,1H),7.63–7.58(m,2H),7.52(d,J=2.4Hz,1H),7.46(dd,J=8.4,2.0Hz,1H),7.38(tt,J=8.5,2.3Hz,3H),5.54(s,2H),4.86(p,J=6.6Hz,1H),4.10(q,J=7.3Hz,2H),1.63(d,J=6.6Hz,6H),1.38(t,J=7.3Hz,3H)。
实施例4:N-(4-(2-氨基-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(4)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用3-溴-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(w)代替3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(4)(15mg黄色固体,收率:56%)。
LC-MS(ESI):m/z 566.23[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.54(s,1H),8.84(s,1H),8.23(d,J=2.4Hz,1H),8.02(d,J=0.8Hz,1H),7.90(dd,J=12.3,2.0Hz,1H),7.77(d,J=0.8Hz,1H),7.63–7.58(m,2H),7.51(d,J=2.3Hz,1H),7.46(dd,J=8.4,2.1Hz,1H),7.38(td,J=8.7,2.0Hz,3H),5.55(s,2H),4.88–4.83(m,1H),3.82(s,3H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例5:N-(4-(2-氨基-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(5)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用3-溴-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(x)代替3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(5)(22mg,黄色固体,收率:42%)。
LC-MS(ESI):m/z 636.29[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.55(s,1H),8.84(s,1H),8.26(d,J=2.3Hz,1H),8.17(s,1H),7.90(dd,J=12.2,2.0Hz,1H),7.81(s,1H),7.64–7.58(m,2H),7.55(d,J=2.3Hz,1H),7.46(dd,J=8.4,2.1Hz,1H),7.38(td,J=8.7,2.4Hz,3H),5.55(s,2H),4.85(q,J=6.6Hz,1H),4.39–4.32(m,1H),3.99–3.92(m,2H),3.48(dd,J=11.6,2.6Hz,2H),2.02–1.90(m,4H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例6:N-(4-(2-氨基-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-2,5-二氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(6)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用6-氰基-N-(2,5-二氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(y)代替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f),并且3-溴-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(w)代替3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-2,5-二氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(6)(14mg黄色固体,收率:39%)。
LC-MS(ESI):m/z 584.23[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.86(s,1H),8.86(s,1H),8.42(dd,J=11.6,6.6Hz,1H),8.24(d,J=2.3Hz,1H),8.02(s,1H),7.77(d,J=0.8Hz,1H),7.66–7.58(m,2H),7.54(d,J=2.4Hz,1H),7.45–7.35(m,3H),5.69(s,2H),4.86(q,J=6.6Hz,1H),3.82(s,3H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例7:N-(4-(2-氨基-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(7)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用3-溴-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(z)代替3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(7)(12mg,黄色固体,收率:60%)。
LC-MS(ESI):m/z 649.3[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)12.54(s,1H),δ8.84(s,1H),8.24(s,1H),8.15(d,J=0.8Hz,1H),7.89(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.79(d,J=0.7Hz,1H),7.64–7.58 (m,2H),7.54(d,J=2.4Hz,1H),7.46(dd,J=8.4,2.0Hz,1H),7.38(td,J=8.7,3.3Hz,3H),5.54(s,2H),4.87(q,J=6.6Hz,1H),4.05(dq,J=10.1,5.3,4.7Hz,1H),2.84(d,J=11.2Hz,2H),2.20(s,3H),1.99(dtd,J=22.9,11.4,8.4Hz,6H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例8:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丁基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(8)的制备
采用与实施例2相同的方法,除了用6-氰基-1-环丁基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(g)代替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丁基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(8)(30mg,黄色固体,两步收率:43.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 647.34[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.52(s,1H),8.75(s,1H),8.27(dd,J=10.5,2.0Hz,2H),8.14(s,1H),7.90(dd,J=12.2,2.0Hz,1H),7.82(s,1H),7.58(ddd,J=9.8,6.0,3.1Hz,3H),7.46(dd,J=8.4,2.0Hz,1H),7.38(td,J=8.7,3.1Hz,3H),5.57(s,2H),5.03(q,J=8.7Hz,1H),4.27(s,1H),3.18(d,J=12.4Hz,3H),2.79(t,J=12.1Hz,2H),2.69–2.53(m,4H),2.06(d,J=13.0Hz,2H),1.86(td,J=10.2,5.2Hz,3H)。
实施例9:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丁基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(9)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用6-氰基-1-环丁基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(g)代 替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丁基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(9)(11mg,黄色固体,收率:69%)。
LC-MS(ESI):m/z 592.27[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.52(s,1H),8.75(s,1H),8.24(d,J=2.3Hz,1H),8.09(s,1H),7.90(dd,J=12.2,2.0Hz,1H),7.78(s,1H),7.61–7.55(m,2H),7.52(d,J=2.3Hz,1H),7.46(dd,J=8.4,2.0Hz,1H),7.42–7.35(m,3H),5.56(s,2H),5.03(q,J=8.6Hz,1H),4.11(q,J=7.3Hz,2H),2.67–2.57(m,3H),2.02–1.96(m,1H),1.87(dq,J=9.9,5.3Hz,2H),1.38(t,J=7.3Hz,3H)。
实施例10:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(10)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用6-氰基-1-环丙基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(e)代替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(10)(60mg,黄色固体,收率:46%)。
LC-MS(ESI):m/z 578.3[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.44(s,1H),8.68(s,1H),8.24(d,J=2.3Hz,1H),8.09(s,1H),7.88(dd,J=12.2,2.0Hz,1H),7.78(s,1H),7.58(ddd,J=8.6,5.4,2.5Hz,2H),7.51(d,J=2.4Hz,1H),7.46(dd,J=8.4,2.1Hz,1H),7.38(td,J=8.6,6.3Hz,3H),5.56(s,2H),4.10(q,J=7.2Hz,2H),3.94(tt,J=7.3,3.8Hz,1H),2.92(td,J=12.5,3.0Hz,2H),1.38(t,J=7.3Hz,4H),1.27–1.22(m,3H)。
实施例11:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(11)的制备
采用与制备实施例2相同的方法,除了用6-氰基-1-环丙基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(e)代替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-环丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(11)(56mg,黄色固体,两步收率:37.6%)。
LC-MS(ESI):m/z 633.36[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.43(s,1H),8.68(s,1H),8.26(d,J=2.3Hz,1H),8.14(s,1H),7.88(dd,J=12.2,2.0Hz,1H),7.83(s,1H),7.61–7.54(m,3H),7.46(dd,J=8.4,2.0Hz,1H),7.38(td,J=8.7,6.8Hz,3H),5.55(s,2H),4.33(s,1H),3.96–3.93(m,1H),3.25(s,1H),2.10(s,2H),2.00(d,J=7.8Hz,3H),1.42(s,2H),1.26–1.21(m,3H)。
实施例12:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(12)的制备
步骤1:4-(4-(6-氨基-5-(4-(6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰氨基)-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(12a)的制备
于0℃,在含有DMF(4mL)的反应瓶中加入6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体j)(25mg,0.084mmol)、4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p)(38mg,0.084mmol)、HATU(41mg,0.11mmol)和DIPEA(33mg,0.25mmol)。将混合物搅拌1小时,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:20),得到4-(4-(6-氨基-5-(4-(6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰氨基)-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(12a)(25mg,黄色固体,收率:40.6%)。
LC-MS(ESI):m/z733.41[M+H
+]。
步骤2:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(12)的制备
在含有DCM(3mL)的反应瓶中加入4-(4-(6-氨基-5-(4-(6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰氨基)-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(12a)(25mg,0.034mmol)和盐酸的二氧六环溶液(4N,1.5mL)。反应液于室温搅拌30分钟,待反应完全后,减压浓缩,残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(12)(10mg,黄色固体,收率:50.6%)。
LC-MS(ESI):m/z633.37[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.93(s,1H),9.06(d,J=11.4Hz,1H),8.89(d,J=10.7Hz,1H),8.37(d,J=2.5Hz,2H),8.19(s,1H),8.12(s,1H),8.03(s,1H),7.96(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.74–7.69(m,2H),7.60–7.47(m,5H),4.50–4.44(m,1H),3.08(d,J=11.9Hz,2H),2.28–2.05(m,6H),2.04–1.95(m,1H),1.19–1.14(m,2H),0.93(dt,J=7.0,3.3Hz,2H)。
实施例13:N-(4-(2-氨基-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(13)的制备
采用与实施例12相同的方法,除了用3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体u)代替4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p),制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(13)(黄色固体,一步收率:18.4%)。
LC-MS(ESI):m/z647.34[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.85(s,1H),8.25(d,J=2.4Hz,1H),8.15(s,1H),8.11(s,1H),7.87(dd,J=12.1,2.1Hz,1H),7.79(s,1H),7.74–7.69(m,2H),7.56–7.46(m,4H),7.38(t,J=8.4Hz,1H),5.53(s,2H),4.06(dt,J=10.7,5.7Hz,1H),2.84(d,J=11.0Hz,2H),2.20(s,3H),2.09–1.91(m,7H),1.16(dt,J=8.3,3.3Hz,2H),0.94(dt,J=6.9,4.8Hz,2H)。
实施例14:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(14)的制备
采用与实施例12相同的方法,除了用3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体q)代替4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p),制得N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(14)(黄色固体,一步收率:20.3%)。
LC-MS(ESI):m/z578.36[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.85(s,1H),8.24(d,J=2.3Hz,1H),8.11(s,1H),8.08(s,1H),7.87(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.77(s,1H),7.74–7.69(m,2H),7.50(ddd,J=10.6,5.9,2.5Hz,4H),7.38(t,J=8.4Hz,1H),5.54(s,2H),4.10(q,J=7.3Hz,2H),2.10(td,J=8.3,4.2Hz,1H),1.38(t,J=7.3Hz,3H),1.21–1.14(m,2H), 0.98–0.92(m,2H)。
实施例15:N-(4-(2-氨基-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(15)的制备
采用与实施例12相同的方法,除了用3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体t)代替4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p),制得N-(4-(2-氨基-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(15)(黄色固体,一步收率:22.4%)。
LC-MS(ESI):m/z564.37[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.85(s,1H),8.23(d,J=2.3Hz,1H),8.11(s,1H),8.02(s,1H),7.87(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.76(s,1H),7.74–7.68(m,2H),7.50(td,J=7.8,7.0,2.2Hz,4H),7.38(t,J=8.4Hz,1H),5.54(s,2H),3.82(s,3H),2.10(ddd,J=8.3,5.1,3.3Hz,1H),1.20–1.13(m,2H),0.94(dt,J=6.9,4.8Hz,2H)。
实施例16:N-(4-(2-氨基-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(16)的制备
采用与实施例12相同的方法,除了用3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体r)代替4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p),制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(16)(黄色固体,一步收率:17.8%)。
LC-MS(ESI):m/z634.41[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.85(s,1H),8.25(d,J=2.4Hz,1H),8.17(s, 1H),8.11(s,1H),7.87(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.80(s,1H),7.74–7.69(m,2H),7.55–7.47(m,4H),7.38(t,J=8.4Hz,1H),5.54(s,2H),4.34(dt,J=10.9,4.7Hz,1H),3.98–3.92(m,2H),3.48(dd,J=11.6,2.6Hz,2H),2.12–2.06(m,1H),1.96(td,J=12.7,8.0Hz,4H),1.20–1.14(m,2H),0.97–0.92(m,2H)。
实施例17:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(17)的制备
采用与实施例12相同的方法,除了用6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体k)代替6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体j),制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(17)(黄色固体,两步步收率:9.3%)。
LC-MS(ESI):m/z633.38[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.78(s,1H),8.54(s,1H),8.26(d,J=2.3Hz,1H),8.13(s,1H),7.89(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.81(s,1H),7.76–7.71(m,2H),7.55–7.47(m,4H),7.39(t,J=8.4Hz,1H),5.55(s,2H),5.51(t,J=1.6Hz,1H),5.43(s,1H),4.21-4.27(m,1H),3.15(d,J=12.2Hz,2H),2.76(d,J=12.4Hz,2H),2.18(s,3H),2.02(t,J=13.8Hz,3H),1.90(t,J=11.7Hz,2H)。
实施例18:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-6-氰基-1-(4-氟苯基)-5甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(18)的制备
采用与实施例14相同的方法,除了用6-氰基-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体i)代替6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体j),制得N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯 基)-6-氰基-1-(4-氟苯基)-5甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(18)(黄色固体,一步收率:30.1%)。
LC-MS(ESI):m/z552.33[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.89(s,1H),8.61(s,1H),8.24(d,J=2.3Hz,1H),8.08(s,1H),7.88(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.77(d,J=0.8Hz,1H),7.72–7.67(m,2H),7.54–7.46(m,4H),7.39(t,J=8.4Hz,1H),5.54(s,2H),4.10(q,J=7.3Hz,2H),2.45(s,3H),1.38(t,J=7.3Hz,3H)。
实施例19:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-6-((甲基氨基)甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(19)制备
采用与实施例12相同的方法,除了用5-溴-6-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体l)代替6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体j),并且用3-(4-氨基-2-氟苯基)-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(中间体q)代替4-(4-(6-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体p),制得N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-6-((甲基氨基)甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(19)(黄色固体,两步收率:40.2%)。
LC-MS(ESI):m/z634.25/635.21[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.85(s,1H),8.58(s,1H),8.23(d,J=2.4Hz,1H),8.08(s,1H),7.87(dd,J=12.2,2.1Hz,1H),7.77(s,1H),7.55(ddt,J=8.0,5.1,2.6Hz,2H),7.52–7.43(m,4H),7.36(t,J=8.4Hz,1H),5.53(s,2H),4.09(t,J=7.3Hz,2H),2.09(s,3H),1.38(t,J=7.3Hz,3H)。
实施例20:N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(20)的制备
采用与制备实施例2相同的方法,除了用N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(bb)代替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-异丙基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(20)(66mg,白色固体,两步收率:37%)。
LC-MS(ESI):m/z627.2[M+H+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.05(s,1H),8.69(s,1H),8.25(d,J=2.3Hz,1H),8.13(s,1H),7.86(dd,J=12.3,2.1Hz,1H),7.80(s,1H),7.54(d,J=2.4Hz,1H),7.48–7.41(m,3H),7.36(ddd,J=8.9,6.6,2.5Hz,3H),5.53(s,2H),4.78(p,J=6.8Hz,1H),4.26–4.21(m,1H),3.16–3.11(m,2H),2.72(td,J=12.4,2.6Hz,3H),2.06–1.99(m,2H),1.90–1.82(m,2H),1.43(d,J=6.8Hz,6H)。
实施例21:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(21)的制备
步骤1:5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(21a)的制备
在含有DMF(30mL)的反应瓶中加入6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(b)(800mg,2.51mmol)、4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺(aa)(790mg,2.51mmol)、HATU(1.43g,3.77mmol)和DIPEA(973mg,7.53mmol)。将混合物于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(30mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:CM=1:20),得到5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(21a)(1.4g,黄色固体,收率:90.4%)。
LC-MS(ESI):m/z 616.3[M+H
+]。
步骤2:5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(21b)的制备。
于室温,在含有乙醇(16mL)的反应瓶中加入5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(21a)(1.4g,2.27mmol)、氢氧化锂一水合物(150mg,3.57mmol)和水(4mL)。将混合物升温至70℃并搅拌2小时,待反应完全后,减压浓缩,得到粗产品5-((4-((6,7- 二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(21b)(1.4g,灰色固体)。其未经纯化直接用于下一步反应。
LC-MS(ESI):m/z 588.3[M+H
+]。
步骤3:N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二羧基酰胺(21c)的制备
于室温,在含有四氢呋喃(8mL)和氧氯化磷(4mL)的反应瓶中加入5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2-羧酸(21b)(200mg,0.3mmol)。将混合物加热至回流30分钟,待反应完成后,减压浓缩得到酰氯中间体。其未经纯化直接用于下一步反应。
于0℃,在含有四氢呋喃(10mL)和氨水(10mL)的反应瓶中滴加酰氯中间体。加毕,反应液继续搅拌20分钟,待反应完成后,加入乙酸乙酯(50mL)稀释,有机相依次用水、饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:10),得到N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(21c)(118mg,黄色固体,收率:59.1%)。
LC-MS(ESI):m/z 587.2[M+H
+]。
步骤4:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(21)的制备
在含有无水四氢呋喃(4mL)的反应瓶中加入N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶2,5-二甲酰胺(21c)(54mg,0.1mol)。反应物冷却至0℃,依次加入三乙胺(81mg,0.8mmol)和三氟甲磺酸酐(84mg,0.4mol)。加毕,反应液继续搅拌30分钟,待反应完成后,加入乙酸乙酯(30mL)稀释,有机相依次用水、饱和的食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,静置过夜,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到6-氰基-N-(4-((6,7-二甲基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(21)(18.4mg,黄色固体,收率:35.2%)。
LC-MS(ESI):m/z 569.2[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.58(s,1H),8.98(s,1H),8.48(d,J=5.2Hz,1H),8.34(s,1H),8.04(dd,J=12.9,2.4Hz,1H),7.60–7.54(m,2H),7.53(d,J=2.5Hz,1H),7.46(t,J=8.9Hz,1H),7.42–7.36(m,3H),6.48(dd,J=5.2,1.0Hz,1H),4.09(s,3H),3.95(d,6H)。
实施例22:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-环丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(22)的制备
采用与实施例21相同的方法,除了用1-环丙基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(d)代替6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(b),制得6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-环丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(22)(38mg,黄色固体,四步收率:18%)。
LC-MS(ESI):m/z595.2[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.43(s,1H),8.67(s,1H),8.48(d,J=5.2Hz,1H),8.04(dd,J=12.8,2.4Hz,1H),7.63–7.50(m,4H),7.49–7.35(m,4H),6.48(d,J=5.2Hz,1H),3.95(d,6H),3.48(d,J=11.0Hz,1H),1.41(d,J=3.9Hz,2H),1.25(s,2H)。
实施例23:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-环丁基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(23)的制备
采用与实施例21相同的方法,除了用1-环丁基-6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(c)代替6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(b),制得6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-环丁基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(23)(25mg,黄色固体,四步收率:21%)。
LC-MS(ESI):m/z 609.2[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.52(s,1H),8.74(s,1H),8.48(d,J=5.2Hz,1H),8.06(dd,J=12.9,2.4Hz,1H),7.61–7.51(m,4H),7.46(t,J=8.9Hz,1H),7.43–7.35(m,3H),6.49(d,J=5.4Hz,1H),5.03(q,J=8.4Hz,1H),3.95(d,J=1.8Hz,6H),2.68–2.53(m,4H),1.87(dq,J=9.9,5.3Hz,2H)。
实施例24:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(24)的制备
采用与实施例21相同的方法,除了用6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(a)代替6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(b),制得6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(24)(38mg,黄色固体,四步收率:23%)。
LC-MS(ESI):m/z 597.3[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.54(s,1H),8.84(s,1H),8.48(d,J=5.2Hz,1H),8.06(dd,J=12.9,2.4Hz,1H),7.64–7.58(m,2H),7.56–7.51(m,2H),7.45(t,J=8.9Hz,1H),7.42–7.35(m,3H),6.49(dd,J=5.2,1.1Hz,1H),4.85(h,J=6.6Hz,1H),3.95(d,J=2.2Hz,6H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例25:6-氰基-N-(4-((6-氰基-7-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(25)的制备
采用与实施例21相同的方法,除了用4-(4-氨基-2-氟苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(中间体cc)代替4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺盐酸盐(中间体aa),以及除了用6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(a)代替6-(乙氧基羰基)-5-(4-氟苯基)-1-甲基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-羧酸(b),制得6-氰基-N-(4-((6-氰基-7-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(25)(30mg,黄色固体,四步收率:19.3%)。
LC-MS(ESI):m/z 592.21[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.57(s,1H),8.84(s,1H),8.81(s,1H),8.77(d,J=5.3Hz,1H),8.08(dd,J=12.8,2.3Hz,1H),7.66–7.48(m,5H),7.42–7.35(m, 2H),6.63(dd,J=5.3,1.1Hz,1H),4.86(p,J=6.6Hz,1H),4.08(s,3H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
实施例26:6-(氨基甲基)-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(26)制备
步骤1:((3-溴-5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(26a)的制备
在含有DMF(3mL)的反应瓶中加入4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺(中间体aa)(77mg,0.22mmol)、6-((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-5-溴-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体m)(80mg,0.18mmol)、HATU(102mg,0.27mmol)和DIPEA(70mg,0.54mmol)。反应液于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:10),得到((3-溴-5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(26a)(50mg,黄色固体,收率:37.7%)。
LC-MS(ESI):m/z737.11/739.17[M+H
+]。
步骤2:((5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(26b)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(4mL)和水(1mL)的反应瓶中加入((3-溴-5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(26a)(50mg,0.07mmol)、甲基硼酸(40mg,0.70mmol)、碳酸钾(28mg,0.21mmol)和Pd(dppf)Cl
2.DCM(10mg,0.014mmol)。密封,氮气置换三次,于微波反应器中加热至100℃搅拌40分钟。待反应液冷却至室温后,加水(15mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(15mL x3),合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:10),得到((5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(26b)(20mg,黄色固体,收率:42.5%)。
LC-MS(ESI):m/z673.30[M+H
+]。
步骤3:6-(氨基甲基)-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(26)的制备
在含有DCM(3mL)的反应瓶中加入((5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(26b)(20mg,0.03mmol)和盐酸的二氧六环溶液(4N,1.5mL)。反应液于室温搅拌30分钟,待反应完全后,减压浓缩,残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到6-(氨基甲基)-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(26)(9mg,白色固体,收率:52.3%)。
LC-MS(ESI):m/z573.25[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.23(s,1H),8.50–8.45(m,2H),8.04(dd,J=13.0,2.5Hz,1H),7.55–7.50(m,4H),7.47–7.40(m,4H),6.47(dd,J=5.2,1.1Hz,1H),3.95(d,J=2.2Hz,6H),2.34(s,3H)。
实施例27:(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-6-((甲基氨基)甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(27)制备
采用与实施例26相同的方法,除了用5-溴-6-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)甲基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体l)代替5-溴-6-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体m),制得(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-6-((甲基氨基)甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(27)(黄色固体,三步收率:16.8%)。
LC-MS(ESI):m/z587.35[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.23(s,1H),8.49–8.44(m,2H),8.04(dd,J=12.9,2.5Hz,1H),7.58–7.48(m,4H),7.46–7.39(m,4H),6.47(dd,J=5.3,1.1Hz,1H),3.95(d,J=2.4Hz,6H),3.26(s,2H),2.34(s,3H),2.04(s,3H)。
实施例28:5-甲基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(28)的制备
步骤1:5-溴-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体28a)的制备
在含有DMF(5mL)的反应瓶中加入4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺盐酸盐(中间体aa)(126mg,0.40mmol)、5-溴-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体n)(130mg,0.36mmol)、HATU(180mg,0.47mmol)和DIPEA(140mg,1.0mmol)。反应液于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并有机相。将有机相用 饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:10),得到5-溴-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体28a)(160mg,黄色固体,收率:68.1%)。
LC-MS(ESI):m/z652.11/654.08[M+H
+]。
步骤2:5-甲基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(28)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(8mL)和水(2mL)的反应瓶中加入5-溴-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体28a)(60mg,0.09mmol)、甲基硼酸(30mg,0.45mmol)、碳酸钾(36mg,0.27mmol)和Pd(dppf)Cl
2.DCM(15mg,0.018mmol)。密封,氮气置换三次,于微波反应器中加热至100℃搅拌40分钟。待反应液冷却至室温后,加水(15mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(15mL x3),合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到5-甲基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(甲氧基甲基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(28)(15mg,黄色固体,收率:28.3%)。
LC-MS(ESI):m/z588.20[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.19(s,1H),8.52–8.47(m,2H),8.04(dd,J=12.9,2.4Hz,1H),7.53(s,2H),7.46–7.40(m,6H),6.50–6.47(m,1H),4.03(s,2H),3.95(d,J=2.3Hz,6H),3.01(s,3H),2.33(s,3H)。
实施例29:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29A)和5-溴-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29B)的制备
步骤1:5-溴-6-氨基甲酰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体9a)的制备
在含有乙醇(4.5mL)的反应瓶中加入5-溴-6-氨基甲酰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸乙酯(i1)(210mg,0.55mmol)。待反应液降温至0℃,缓慢滴加氢氧化钠的水溶液(1.5mL,28.5mg,0.71mmol),加毕,升温至室温并搅拌30分钟。待反应完全后,减压浓缩,得到粗品5-溴-6-氨基甲酰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体29a)(210mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 355-12/357.08[M+H
+]。
步骤2:3-溴-N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(中间体29b)的制备
在含有DMF(5mL)的反应瓶中加入4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺盐酸盐(中间体aa)(193mg,0.62mmol)、5-溴-6-氨基甲酰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体29a)(200mg,0.56mmol)、HATU(320mg,0.84mmol)和DIPEA(218mg,1.68mmol)。反应液于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:10),得到3-溴-N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4- 基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(中间体29b)(260mg,黄色固体,收率:71.3%)。
LC-MS(ESI):m/z651.21/653.17[M+H
+]。
步骤3:5-溴-6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29c)的制备
在含有乙腈(5mL)的反应瓶中加入3-溴-N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(中间体29b)(140mg,0.22mol)。待反应液降温至0℃,依次缓慢滴加三氟乙酸酐(180mg,0.84mol)和三乙胺(130mg,0.84mol)。反应液于0℃搅拌1小时,待反应完成后,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,得到粗品5-溴-6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29c)(130mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 633.18/633.14[M+H
+]。
步骤4:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29A)和5-溴-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29B)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(3mL)和水(1mL)的反应瓶中加入5-溴-6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(28c)(40mg,0.065mmol)、甲基硼酸(37mg,0.65mmol)、碳酸钾(30mg,0.20mmol)和Pd(dppf)Cl
2.DCM(10mg,0.013mmol)。密封,氮气置换三次,于微波反应器中加热至100℃搅拌40分钟。待反应液冷却至室温后,加水(15mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(15mL x3),合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29A)(4mg,黄色固体,收率:7.1%)和5-溴-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(29B)(副产物)(黄色固体,15mg)。
29A:LC-MS(ESI):m/z569.25[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.89(s,1H),8.60(s,1H),8.48(d,J=5.2Hz,1H),8.04(dd,J=12.8,2.5Hz,1H),7.74–7.66(m,2H),7.59(ddd,J=8.9,2.5,1.1Hz,1H),7.54–7.44(m,4H),7.41(s,1H),6.48(dd,J=5.2,1.1Hz,1H),3.95(d,J=2.4Hz,6H),2.45(s,3H)。
29B::LC-MS(ESI):m/z624.07,626.06[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ12.23(s,1H),8.72(d,J=6.2Hz,1H),8.16(d,J=18.5Hz,1H),8.08(dd,J=13.6,2.3Hz,1H),7.70(s,1H),7.48(s,1H),7.44–7.34(m,2H),7.28–7.22(m,2H),7.16(ddt,J=7.0,5.1,2.7Hz,2H),6.84(d,J=6.1Hz,1H),4.01(d,J=3.2Hz,6H)。
实施例30:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(30)的制备
步骤1:3-溴-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30a)的制备
在含有DMF(10mL)的反应瓶中加入5-溴-6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体h)(1.5g,3.90mmol)、碳酸钾(809mg,5.86mmol)和碘乙烷(910mg,5.86mmol)。于室温搅拌6小时。待反应完全后,加入水(50mL),用乙酸乙酯萃取(20mLx3)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=2:1),得到3-溴-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30a)(1.3g,黄色固体,收率:80.9%)。
LC-MS(ESI):m/z 412.15/414.11[M+H
+]。
步骤2:1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-(丙-1-烯-2-基)-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30b)的制备
于室温,在含有1,4-二氧六环(16mL)和水(4mL)的反应瓶中加入3-溴-1-(4-氟苯基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30a)(300mg,0.73mmol)、异丙烯基 硼酸频那醇脂(611mg,3.64mmol)、碳酸钾(302mg,2.19mmol)和Pd(dppf)Cl.DCM(60mg,0.073mmol)。密封,氮气置换三次,于微波反应器中加热至100℃搅拌30分钟。待反应液冷却至室温后,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为PE:EA=1:1),得到1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-(丙-1-烯-2-基)-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30b)(220mg,黄色固体,收率:80.7%)。
LC-MS(ESI):m/z 374.27[M+H
+]。
步骤3:1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30c)的制备
在含有甲醇(4mL)的反应瓶中加入1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-(丙-1-烯-2-基)-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30b)(220mg,0.59mol)、钯/碳(55mg,25%)和乙酸(8mg,0.12mol)。密封,氮气置换三次后,用氢气置换三次并搅拌30分钟。过滤,滤液减压浓缩,得到粗产品1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30c)(200mg,白色固体,收率:91.4%)。
LC-MS(ESI):m/z376.30[M+H
+]。
步骤4:6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(30d)的制备
在含有乙醇(4.5mL)的反应瓶中加入1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二羧酸二乙酯(30c)(200mg,0.53mmol)。待反应液降温至0℃,缓慢滴加氢氧化钠的水溶液(1.5mL,28.5mg,0.71mmol),加毕,升温至室温并搅拌30分钟。待反应完全后,减压浓缩,得到粗品6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(30d)(200mg,黄色固体,收率:100%)。
LC-MS(ESI):m/z 348.27[M+H
+]。
步骤5:5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(30e)的制备
在含有DMF(5mL)的反应瓶中加入4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯胺盐酸盐(中间体aa)(193mg,0.62mmol)、6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(30d)(200mg,0.56mmol)、HATU(320mg,0.84mmol)和DIPEA(218mg,1.68mmol)。反应液于室温搅拌30分钟,待反应完全后,加入饱和的碳酸氢钠溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂为MeOH:DCM=1:10),得到5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(30e)(220mg,黄色固体,收率:60.7%)。
LC-MS(ESI):m/z644.36[M+H
+]。
步骤6:5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-羧酸(30f)的制备
在含有乙醇(4.5mL)的反应瓶中加入5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-羧酸乙酯(30e)(220mg,0.34mmol)、氢氧化锂一水合物(22mg,0.51mmol)和水(1.5mL)。反应液于70℃搅拌12小时。待反应完全后,减压浓缩,残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):10%~100%),得到5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-羧酸(30f)(80mg,白色固体,收率:38.2%)。
LC-MS(ESI):m/z 616.35[M+H
+]。
步骤7:N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(30g)的制备
在含有DMF(3mL)的反应瓶中加入5-((4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)氨基甲酰基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2-羧酸(30f)(80mg,0.13mmol)、碳酸氢铵(103mg,1.3mmol)、PyBrOP(91mg,0.20mmol)和DIPEA(50mg,0.39mol)。反应液于室温搅拌1小时,待反应完成后,加饱和的碳酸氢钠水溶液(10mL)猝灭反应,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱液为DCM:CH3OH=10:1)得到N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(30g)(20mg,白色固体,收率:25.0%)。
LC-MS(ESI):m/z615.34[M+H
+]。
步骤8:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(30)的制备
在含有乙腈(2mL)的反应瓶中加入N
5-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-3-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-2,5-二甲酰胺(30g)(12mg,0.02mol)。待反应液降温至0℃,依次缓慢滴加三氟乙酸酐(11mg,0.06mol)和三乙胺(12mg,0.12mol)。反应液于0℃搅拌1小时,待反应完成后,加水(10mL)稀释,用乙酸乙酯萃取(10mLx3),合并的有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,残余物通过制备HPLC纯化(C18,乙腈/水(0.1%甲酸):20%~100%),得到6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(30)(8mg,黄色固体,收率:67.0%)。
LC-MS(ESI):m/z 597.33[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.85(s,1H),8.60(s,1H),8.48(d,J=5.2Hz,1H),8.05(dd,J=12.8,2.5Hz,1H),7.75–7.69(m,2H),7.59(ddd,J=8.8,2.5,1.1Hz,1H),7.54–7.45(m,4H),7.41(s,1H),6.49(dd,J=5.3,1.1Hz,1H),3.95(d,J=2.7 Hz,6H),2.00(q,J=7.0,6.5Hz,1H),1.33(d,J=6.8Hz,6H)。
实施例31:6-氰基-5-环丙基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(31)的制备
采用与实施例30中步骤5相同的合成方法,除了用6-氰基-5-环丙基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体j)替代6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(30d),制得6-氰基-5-环丙基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(31)(黄色固体,5.6mg,收率:16.5%)。
LC-MS(ESI):m/z595.33[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.84(s,1H),8.48(d,J=5.2Hz,1H),8.10(s,1H),8.03(dd,J=12.8,2.5Hz,1H),7.75–7.68(m,2H),7.61–7.56(m,1H),7.55–7.44(m,4H),7.41(s,1H),6.48(dd,J=5.2,1.0Hz,1H),3.95(d,J=3.1Hz,6H),2.10(td,J=8.3,4.1Hz,1H),1.19–1.13(m,2H),0.93(dt,J=6.8,4.8Hz,2H)。
实施例32:6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(32)的制备
采用与实施例30中步骤5相同的合成方法,除了用6-氰基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体k)代替6-(乙氧基羰基)-1-(4-氟苯基)-5-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(30d),制得6-氰基-N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-5-(丙-1-烯-2-基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(32)(黄色固体,13mg,收率:19.8%)。
LC-MS(ESI):m/z595.32[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ11.77(s,1H),8.57–8.50(m,2H),8.06(dd,J= 12.8,2.5Hz,1H),7.78–7.69(m,2H),7.61(dt,J=8.9,1.7Hz,1H),7.57–7.45(m,4H),7.43(s,1H),6.55(d,J=5.4Hz,1H),5.51(t,J=1.6Hz,1H),5.44(s,1H),3.96(d,J=2.8Hz,6H),2.18(s,3H)。
实施例33:N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-2,5-二氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(33)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用6-氰基-N-(2,5-二氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(y)代替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f)。制得N-(4-(2-氨基-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-2,5-二氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(33)(25mg黄色固体,收率:35%)。
LC-MS(ESI):m/z 598.13[M+H
+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.86(s,1H),8.86(s,1H),8.25(d,J=2.3Hz,1H),8.08(d,J=0.8Hz,1H),7.77(d,J=0.8Hz,1H),7.64–7.58(m,2H),7.55(d,J=2.3Hz,1H),7.45–7.36(m,3H),5.68(s,2H),4.87(p,J=6.5Hz,1H),4.11(q,J=7.2Hz,2H),1.63(d,J=6.6Hz,6H),1.38(t,J=7.3Hz,3H)。
实施例34N-(4-(2-氨基-5-(1-甲基-d3-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-2,5-二氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(34)的制备
采用与实施例3相同的方法,除了用6-氰基-N-(2,5-二氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(y)代替6-氰基-N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(f),并且用3-溴-5-(1-(甲基-d3)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(ee)代替3-溴-5-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(v)。制得N-(4-(2- 氨基-5-(1-甲基-d3-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-2,5-二氟苯基)-6-氰基-5-(4-氟苯基)-1-异丙基-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺(34)(32mg黄色固体,收率:46%)。
LC-MS(ESI):m/z 587.28[M+H+]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.86(s,1H),8.86(s,1H),8.42(dd,J=11.6,6.6Hz,1H),8.24(d,J=2.4Hz,1H),8.02(d,J=0.8Hz,1H),7.77(d,J=0.8Hz,1H),7.65–7.57(m,2H),7.54(d,J=2.4Hz,1H),7.47–7.36(m,3H),5.69(s,2H),4.88(h,J=6.7Hz,1H),1.63(d,J=6.6Hz,6H)。
本发明化合物的生物学评价
测试例1:本发明化合物对激酶Axl和c-MET的酶活性抑制(IC
50)的评价实验
本试验使用迁移率改变法(Mobility shift assay),测试化合物在ATP浓度分别为相应激酶Km下的抑制活性。对照品为孢碱(staurosporine)和卡博替尼(Cabozantinib)。
测试化合物的浓度从10μM开始,10倍稀释。测试结果(IC
50)为两次独立实验的平均值。
试验材料:
激酶Axl(Carna,Cat.No.08-107,Lot.No.06CBS-3408),激酶cMET(Carna,Cat.No.08-151,Lot.No.10CBS-1118M),底物肽FAM-P2(GL Biochem,Cat.No.112394,Lot.No.P131014-XP112394),底物肽FAM-P22(GL Biochem,Cat.No112393,Lot.No.P130408-ZB112393),ATP(Sigma,Cat.No.A7699-1G,CAS No.987-65-5),DMSO(Sigma,Cat.No.D2650,Lot.No.474382),EDTA(Sigma,Cat.No.E5134,CAS No.60-00-4),HEPES(Sigma,Cat.No.V900477-500G,CAS No.7365-45-9,Lot.No.WXBC4716V),DTT(Sigma,Cat.No.D0632-25g,CAS No.3483-12-3,Lot.No.SLBF3964V),Brij-35(Sigma,Cat.No.B4184,Lot No.018K61251),96孔板(Corning,Cat.No.3365,Lot.No.22008026),384孔板(Corning,Cat.No.3573,Lot.No.12608008),孢碱(Staurosporine)(MCE,Cat.No.HY-15141,Lot.No.19340),卡博替尼(根据专利WO 201101763A1公开的方法制备)。
实验步骤:
1)缓冲液配制:50mM HEPES,pH 7.5,0.00015%Brij-35。
2)对照品卡博替尼和测试样品配制:将卡博替尼和本发明实施例化合物在100%DMSO中配制成梯度浓度,并用上述缓冲液稀释成10%DMSO,加入384孔板。例如,化合物起始浓度为10uM,则用100%DMSO配制成500uM,并梯度稀释10个浓度,再用缓冲液稀释10倍,配成含10%DMSO的化合物中间稀释体,转移5ul至384孔板。
3)将Axl和c-MET酶分别用以下缓冲液稀释成最佳浓度:50mM HEPES,pH 7.5,0.00015%Brij-35,2mM DTT。转移10ul至384孔板中,与化合物于室温 共孵育10-15分钟。
4)将底物用以下缓冲液稀释成最佳浓度:50mM HEPES,pH 7.5,0.00015%Brij-35,10mM MgCl
2,Km下的ATP。加入10ul至384孔板起始反应,并于28℃反应1小时。
试验中各试剂的反应浓度如下表1所示。
表1
5)用Caliper Reader(Perkin Elmer)读取转化率,计算抑制率为两次测试平均值。
6)用XL-fit软件拟合IC
50。
本发明化合物对Axl和c-MET激酶的抑制活性如下表2所示。
表2:本发明化合物对酪氨酸激酶Axl和c-MET活性抑制的IC
50值
由上表2可知,本发明化合物能够有效地抑制Axl和MET激酶的活性。与阳性对照药物卡博替尼相比,部分发明化合物展现出更高的活性抑制能力。
测试例2:本发明化合物对酪氨酸激酶Mer和Tyro3活性抑制(IC
50)的评价实验
本试验使用酶学HTRF方法测试化合物在ATP浓度分别为相应激酶Km下的抑制活性。对照品为RXDX-106。测试化合物的浓度从10μM开始,3倍稀释,设置两个复孔。
试验材料:
激酶Mer(Carna,Cat.No.08-108,Lot.No.14CBS-0421H),Tyro3(Carna,Cat.No.08-109,Lot.No.08CBS-1186H)。HTRF激酶-TK试剂盒(Cisbio,Cat.No.62TK0PEC),该试剂盒包括:生物素-TK底物冻干粉(Cisbio,Cat.No.61TK0BLC,Lot.No.07A),链霉亲和素-XL665(Cisbio,Cat.No.610SAXLG,Lot.No.126A),TK抗体-穴状化合物(Cisbio,Cat.No.610SAXLG,Lot.No.04A),检测缓冲液(包括EDTA)(Cisbio,Cat.No.62TK0PEC,Lot.No.12A)。ATP(Sigma,Cat.No.A7699-5G,CAS No.34369-07-8,Lot.No.SLBQ6014V),DMSO(Sigma,Cat.No.D5879-1L,Lot.No.SHBH9944),HEPES(Sigma,Cat.No.V900477-500G,CAS No.7365-45-9,Lot.No.WXBC4716V),MgCl
2(Sigma,Cat.No.208337-1KG,Lot.No.MKBX9508V),EGTA(Sigma,Cat.No.E3889-100g,CAS 67-42-5,CAS No.7786-30-3,Lot.No.SLBG8546V),NP-40(北京鼎国,Cat.No.DH218,Lot.No.36R00160),DTT(Sigma,Cat.No.D0632-25g,CAS No.3483-12-3,Lot.No.SLBF3964V),化合物板(Labcyte,Cat.No.LP0200,Lot.No.0006386836),试验板(Greiner,Cat.No.784075,Lot.No.E16123HM),对照品RXDX-106(根据专利WO2013074633公开的方法制备)。
实验步骤:
1)缓冲液配制:50mM HEPES,10mM MgCl
2,1mM EGTA,0.01%NP-40,2mM DTT。
2)对照品和测试样品配制:将RXDX-106和本发明化合物用DMSO溶解成10mM并使用DMSO稀释到1mM或适当浓度,使用BRAVO(Agilent)进行倍比系列稀释。使用ECHO 555(Labcyte)从化合物板(Labcyte-LP0200)转移100nl到试 验板(Greiner-784075)。DMSO最终浓度为1%。
3)Mer和Tyro3分别用检测缓冲液(Cisbio,Cat.No.62TK0PEC,Lot.No.12A)稀释成0.5nM和1.2nM。转移5ul到384孔板中,与本发明化合物在22-25℃孵育30分钟。Mer和Tyro3最终浓度分别为0.25nM和0.6nM。
4)用HEPES、NaN
3、BSA和Orthovanadate配成的1X激酶缓冲液将生物素-TK底物和ATP分别稀释成最终浓度的两倍浓度。底物和ATP的混合物加入5ul到384孔板起始反应,并于22-25℃反应1小时。
试验中各试剂的反应浓度如下表3所示。
表3
5)链霉亲和素-XL665和TK抗体-穴状化合物用检测缓冲液稀释成250nM和0.5nM。加入10ul到384孔板起始反应,并于22-25℃反应1小时。链霉亲和素-XL665和TK抗体-穴状化合物最终浓度为125nM和0.25nM。
6)用Envision Reader(PerkinElmer)读取665nm和615nm波长下的荧光强度。
7)用XLfit软件拟合化合物IC
50。
本发明化合物对酪氨酸激酶Mer和Tyro3的抑制活性如下表4所示。
表4:本发明化合物对酪氨酸激酶Mer和Tyro3活性抑制的IC
50值
由上表4可知,本发明化合物能够有效地抑制Mer和Tyro3激酶的活性。与对照品RXDX-106相比,部分发明化合物展现出更高的活性抑制能力。
测试例3:本发明化合物在EBC-1细胞上活性抑制能力
试验方法:使用Promega公司的
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒评估化合物对EBC-1细胞增殖的抑制活性。
仪器:Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪,Thermo Scientific公司的Model 311 Series CO
2培养箱,Thermo Scientific公司的Model 1300 Series A2生物安全柜,Olympus公司的CKX41SF倒置显微镜,Countstar公司的IC1000细胞计数仪,SIEMENS公司的KK25E76TI冰箱,其林贝尔公司的QB-9001微孔板快速振荡器。
试验材料:胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司,货号#10099-141,批号#1966174C),
荧光细胞存活测试试剂(Promega公司,货号#G7572,批号#0000310975),96孔透明平底黑壁细胞培养板(Thermo Fisher公司,货号#,批号#1207365),RPMI1640培养基(GE公司,货号#SH30809.01,批号#AD17321266),MEM培养基(GE公司,货号#SH30024.01,批号#AC10232463),NEAA(Thermo Fisher公司,货号#11140-050,批号#1872982),对照品卡博替尼(根据专利WO201101763A1公开的方法合成),EBC-1细胞(来源为南京科佰生物科技有限公司,EBC-1是人肺癌鳞癌细胞,完全培养基为MEM+10%FBS+0.01mM NEAA,培养条件为37℃、5%CO
2、95%湿度,生长倍增时间约为32小时,传代比例为1:6)。
试验步骤:复苏EBC-1细胞时,细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10%FBS的RPMI1640培养基混匀,1000转/分钟离心5分钟,弃上清。取5mL完全培养基重悬细胞沉淀,置于底面积25cm
2的细胞培养瓶中,放入37℃、95%湿度和5%CO
2的细胞培养箱中培养。细胞融合率达到80%左右时进行细胞传代。细胞传代时,直接将旧细胞悬液吹打均匀后,保留1/6细胞悬液,加入5mL新的完全培养基,吹打均匀后,细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞融合率再次达到80%左右时进行细胞铺板。细胞铺板时,参照细胞传代方法,保留1/6细胞悬液继续培养,将剩余5/6细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法,使用Countstar公司的IC1000细胞计数仪检测细胞活力,确保细胞活力在90%以上。使用完全培养基配制密度为3.33×10
4个活细胞/mL的细胞悬液,加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中,使细胞培养板(第0天板和待测药板)中细胞密度为3000个活细胞/孔。设置不含细胞、不含化合物、只含完全培养基的对照组;设置不含化合物、含细胞的对照组。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。加化合物时,将本发明化合物和对照品卡博替尼用DMSO溶解,进行梯度稀释,得到10倍溶液。加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中,使化合物起始浓度为10μM,相邻浓度稀释倍数为3.16倍,细胞培养板中DMSO含量为0.1%。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。检测时,融化CellTiter-Glo 试剂(即
荧光细胞存活测试试剂,Promega公司,货号#G7572,批号#0000310975),并将细胞板移至室温平衡30分钟,加100μL的CellTiter-Glo试剂至细胞板每个孔中,在其林贝尔公司的QB-9001微孔板快速振荡器上振动5分钟使细胞充分裂解,将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号,用Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
受试样品:本发明实施例化合物和卡博替尼(阳性对照化合物)。
数据分析:使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率:
细胞存活率(%)=(Lum
待测药-Lum
培养液对照)/(Lum
细胞对照-Lum
培养液对照)×100%,
其中Lum指多功能酶标仪读出的待测药板各孔的冷光数值。
使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据,利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线,并由此计算IC
50值。
本发明化合物在EBC-1细胞上的活性抑制能力如下表5所示。
表5:本发明化合物在EBC-1细胞上活性抑制能力(IC
50值)
化合物 |
IC
50(nM)
|
实施例2 |
24 |
实施例3 |
22 |
实施例4 |
30 |
实施例6 |
13 |
实施例7 |
27 |
实施例10 |
208 |
实施例11 |
91 |
实施例12 |
98 |
实施例15 |
190 |
实施例18 |
298 |
实施例20 |
106 |
实施例21 |
109 |
实施例22 |
84 |
实施例23 |
74 |
实施例24 |
45 |
实施例25 |
115 |
实施例26 |
132 |
实施例29A |
82.7 |
卡博替尼 |
37 |
由上表5可知,本发明化合物能够有效地抑制EBC-1细胞的活性。与阳性对 照药物卡博替尼相比,本发明化合物展现出相近抑制能力。同时由于EBC-1为c-MET驱动的肺癌细胞系,因此本发明化合物对EBC-1细胞活性进一步验证了它们对c-MET激酶靶点的抑制作用。
测试例4:本发明化合物在Ba/F3 Axl细胞上活性抑制能力
试验方法:使用Promega公司的
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒评估化合物对Ba/F3 Axl细胞增殖的抑制活性。
仪器:Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪,Thermo Scientific公司的Model 311 Series CO
2培养箱,Thermo Scientific公司的Model 1300Series A2生物安全柜,Olympus公司的CKX41SF倒置显微镜,Countstar公司的IC1000细胞计数仪,SIEMENS公司的KK25E76TI冰箱,其林贝尔公司的QB-9001微孔板快速振荡器。
试验材料:胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司,货号#10099-141,批号#1966174C),
荧光细胞存活测试试剂(Promega公司,货号#G7572,批号#0000310975),96孔透明平底黑壁细胞培养板(Thermo Fisher公司,货号#,批号#1207365),RPMI1640培养基(GE公司,货号#SH30809.01,批号#AD17321266),Murine IL-3(PeproTech公司,货号#213-13,批号#120948),rhGas6(R&D Systems公司,货号#885-GSB,批号#DFGX0417081),对照品bemcentinib(别名BGB324,上海毕得医药科技有限公司,货号#BD559084批号#AQU341),Ba/F3 Axl细胞(由康源博创生物科技(北京)有限公司构建,完全培养基为RPMI1640+10%FBS+100ng/mL rhGas6,培养培养条件为37℃、5%CO
2、95%湿度,生长倍增时间约为20小时,传代比例为1:10;参考Oncogene.2009;28:3442–3455,Oncotarget.FASEB J.2017;31(4):1382–1397)。
试验步骤:复苏Ba/F3 Axl细胞时,细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10%FBS的RPMI1640培养基混匀,1000转/分钟离心5分钟,弃上清。取5mL完全培养基重悬细胞沉淀,置于底面积25cm
2的细胞培养瓶中,放入37℃、95%湿度和5%CO
2的细胞培养箱中培养。细胞密度为2×10
6个活细胞/mL时进行细胞传代。细胞传代时,直接将旧细胞悬液吹打均匀后,保留1/10(即0.5mL)细胞悬液,加入4.5mL新的完全培养基,吹打均匀后,细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞融合率再次达到2×10
6个活细胞/mL时进行细胞铺板。细胞铺板时,参照细胞传代方法,保留1/10(即0.5mL)细胞悬液继续培养,将剩余细胞悬液置于15mL离心管中,离心后弃上清,使用5mL完全培养基重悬细胞。用台盼蓝排斥法,使用Countstar公司的IC1000细胞计数仪检测细胞活力,确保细胞活力在90%以上。使用完全培养基配制密度为5.56×10
4个活细胞/mL的细胞悬液,加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中,使细胞培养板(第0天板和待测药板)中细胞密度为5000个活细胞/孔。设置不含细胞、不含化合物、 只含完全培养基的对照组;设置不含化合物、含细胞的对照组。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。加化合物时,将本发明化合物和对照品bmcentinib用DMSO溶解,进行梯度稀释,得到10倍溶液。加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中,使化合物起始浓度为100nM,相邻浓度稀释倍数为3.16倍,细胞培养板中DMSO含量为0.1%。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。检测时,融化CellTiter-Glo试剂(即
荧光细胞存活测试试剂,Promega公司,货号#G7572,批号#0000310975),并将细胞板移至室温平衡30分钟,加100μL的CellTiter-Glo试剂至细胞板每个孔中,在其林贝尔公司的QB-9001微孔板快速振荡器上振动5分钟使细胞充分裂解,将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号,用Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
受试样品:本发明实施例化合物和bemcentinib(阳性对照化合物)。
数据分析:使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率:
细胞存活率(%)=(Lum
待测药-Lum
培养液对照)/(Lum
细胞对照-Lum
培养液对照)×100%,
其中Lum指多功能酶标仪读出的待测药板各孔的冷光数值。
使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据,利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线,并由此计算IC
50值。
本发明化合物在Ba/F3 Axl细胞上的活性抑制能力如下表6所示。
表6:本发明化合物在Ba/F3 AXL细胞上的活性抑制能力(IC
50值)
化合物 |
IC
50(nM)
|
实施例3 |
0.29 |
实施例4 |
0.57 |
实施例6 |
0.49 |
实施例21 |
0.29 |
实施例24 |
0.36 |
实施例33 |
0.23 |
实施例34 |
0.28 |
bemcentinib |
26.9 |
如上表6所示,与对照品bemcentinib相比,本发明化合物表现出了更高的对Ba/F3 Axl细胞增殖的抑制能力。
测试例5:本发明化合物在模型小鼠肿瘤细胞异位移植试验中的体内抗肿瘤活性测试
将人源非小细胞肺癌肿瘤细胞株EBC-1(ATCC)3×10
6个细胞接种于BALB/c-nude模型小鼠(北京安凯毅博,雌性,10只)皮下。当肿瘤在小鼠皮下生长至175.5mm
3时,小鼠灌胃给予待测试样品。
将小鼠分为阴性溶剂对照组和本发明化合物组(实施例3化合物)(30mg/kg),每组5只。溶剂对照组给予10%solutol HS-15。其配制方法:将10ml solutol HS-15加入到90ml ddH
2O中,震荡涡旋混匀成10%的solutol HS-15。本发明化合物组为将实施例3化合物溶于10%solutol HS-15中,配成1mg/mL浓度的溶液给予。溶剂对照组和本发明化合物组均为灌胃给药,每天给药一次,持续28天,给药体积为每克体重10ul。
开始给药后,每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤大小计算公式:
肿瘤体积(mm
3)=0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径
2)。
抗肿瘤疗效是基于治疗中肿瘤的生长曲线(即每次测量的肿瘤体积相对于其治疗天数)和相对肿瘤体积来评估。其中,相对肿瘤抑瘤率(TGI)按下列公式计算:
相对肿瘤抑制率TGI(%):TGI=1-T/C(%)。
T/C%为相对肿瘤增值率,即在某一时间点,本发明化合物组和溶剂对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为本发明化合物组和溶剂对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)。T/C%=T
RTV/C
RTV×100%(T
RTV:本发明化合物组的平均RTV;C
RTV:溶剂对照组的平均RTV。
相对肿瘤体积RTV:RTV=Vt-V0,V0为分组时该动物的肿瘤体积,Vt为给药后该动物的肿瘤体积。
图1显示本发明化合物组和溶剂对照组小鼠肿瘤体积的生长变化。如图所示,本发明化合物能够有效地抑制肿瘤细胞在模型小鼠体内的生长,抑瘤率(TGI)高达108%。
图2显示本发明化合物组和溶剂对照组小鼠体重随治疗时间的变化。如图所示,荷瘤小鼠在实验过程中体重没有显著变化,显示本发明化合物具有良好的安全性和耐受性。
本发明通过实验证明了本发明化合物能够有效抑制Axl、Mer、Tyro3或c-MET等酪氨酸激酶的活性,并且能够高度抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长。因此,本发明化合物在治疗与Axl、Mer、Tyro3或c-MET等酪氨酸激酶相关的疾病,特别是在治疗癌症方面,将会具有广阔的应用前景。