WO2020039631A1 - 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット - Google Patents

生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット Download PDF

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絵美 野崎
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    • C07D295/15—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
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Definitions

  • the present invention relates to a biodegradable compound having a structure that can be degraded in cells, and a lipid particle containing the same.
  • the invention also relates to compositions and kits for use in delivering active agents, such as nucleic acids, comprising the lipid particles.
  • Liposomes for the treatment of various diseases are being studied.
  • Liposomes are microscopic capsules composed of lipids and having a particle size on the order of nanometers.
  • Various liposomes can be encapsulated inside the liposomes, and they have excellent biocompatibility. It is an ideal material for selectively delivering an agent to a target site in a living body.
  • a giant unilamellar liposome (LUV) having an average particle diameter of 100 nm or more is generally used, and various materials have been developed as materials constituting the membrane.
  • LUV giant unilamellar liposome
  • Such liposomes can be composed of a single lipid.
  • the lipid used is a phospholipid having a head and a hydrophobic part bonded thereto, and the lipid associates to form a membrane to form a microcapsule capable of containing an active agent and the like.
  • a lipid mixture in order to impart excellent properties to the liposome, it is common to use a lipid mixture to construct it.
  • the lipid mixture contains a combination of a lipid having excellent biodegradability, a lipid that suppresses aggregation of the formed liposome, a lipid that has an effect of suppressing leakage of inclusions, and a lipid that has a membrane fusion effect.
  • a medical liposome specialized for gene transfer preferably satisfies high biodegradability, high biocompatibility, high active agent introduction, and low cytotoxicity. desirable.
  • lipids have been developed as such lipids, but there are a wide variety of biological conditions to be applied and diseases to be treated. It is desirable to increase the types of lipids that can be selected according to these conditions. Further, there is a need for a lipid capable of constituting a liposome having characteristics exceeding conventional liposomes.
  • the present embodiment provides a novel compound as a lipid capable of constituting a liposome, and a lipid particle, a composition and a kit using the same.
  • the lipid particle according to the embodiment is characterized by containing the above-mentioned compound.
  • composition according to the embodiment includes the lipid particles and a carrier.
  • the kit according to the embodiment includes the composition containing the lipid particles and an agent for introducing the lipid particles into cells.
  • FIG. 4 is a graph showing enzyme activity when lipid particles are used in MCF-7 cells according to Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 4 is a graph showing enzyme activities when lipid particles are used in Huh-7 cells according to Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 4 is a graph showing enzyme activity when lipid particles are used in Jurkat cells according to an example.
  • FIG. FIG. 3 is a graph showing enzyme activity when lipid particles are used in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) according to an example.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • 7 is a graph showing enzyme activity when lipid particles are used in MCF-7 cells, for comparison between Example 4-1 and Example 4-2.
  • 7 is a graph showing enzyme activity when using lipid particles in Huh-7 cells, for comparison between Example 4-1 and Example 4-2.
  • 7 is a graph showing enzyme activity when lipid particles are used in Jurkat cells, for comparison between Example 4-1 and Example 4-2.
  • 7 is a graph showing enzyme activity when lipid particles are used in MCF-7 cells for comparison between Example 4-2 and Example 4-3.
  • 7 is a graph showing enzyme activity when using lipid particles in Huh-7 cells, for comparison between Example 4-2 and Example 4-3.
  • C x ⁇ C y" and “C x" means the number of carbons in the molecule or substituent.
  • C 1 -C 6 alkyl means an alkyl having 1 or more and 6 or less carbons.
  • the alkyl halide refers to one in which one or more hydrogens in the alkyl are replaced by halogen such as fluorine.
  • fluoroaryl means that one or more hydrogens in the aryl is replaced by fluorine This is what has been replaced.
  • alkyl means a monovalent group obtained by removing one hydrogen from any carbon of an alkane.
  • alkyl encompasses straight or branched chain alkyl.
  • cycloalkyl means alkyl containing a cyclic structure. A cyclic structure in which a linear or branched alkyl is substituted is also referred to as cycloalkyl.
  • ⁇ ⁇ Alkele means a monovalent group obtained by removing one hydrogen from any carbon of an alkene.
  • the hydrocarbon group means a group containing monovalent or divalent or more carbon and hydrogen, and if necessary, oxygen or nitrogen.
  • the aliphatic group is a hydrocarbon group containing no aromatic ring, and may have any of a chain, branched or cyclic structure, and a combination thereof. Unless otherwise specified, the aliphatic group may contain an unsaturated bond. Further, unless otherwise limited, the aliphatic group may include a hetero atom such as nitrogen, oxygen, sulfur, selenium, fluorine, chlorine, and bromine. Further, the aliphatic group may be a monovalent group or a polyvalent group.
  • the aromatic hydrocarbon group includes an aromatic ring, and has an aliphatic hydrocarbon group as a substituent as necessary.
  • Tertiary nitrogen means nitrogen to which three carbons are bonded. Therefore, the tertiary nitrogen forms a tertiary amine structure having an electron donating property.
  • the compound according to the embodiment is a compound suitable as a lipid constituting the liposome. And it has a biodegradable group in its hydrophobic part and functions as a biodegradable lipid compound.
  • the head does not contain a cationic group, and when applied to a living body, has the characteristics of suppressing protein binding in cells and having low toxicity.
  • the liposome is composed of this lipid compound, the surface of the liposome becomes non-cationic, so that the liposome is less harmful to cells and the introduction rate of active agents such as nucleic acids is increased.
  • Such a lipid compound is represented by the following general formula (1).
  • Q in the formula may be referred to as a head and R may be referred to as a hydrophobic group.
  • head Q contains more than one tertiary nitrogen and no oxygen. Nitrogen constituting unsubstituted amino, quaternary ammonium or the like may be further contained as long as the effects of the embodiment are not impaired, but nitrogen other than the tertiary nitrogen is preferably not contained.
  • the head Q does not contain oxygen. Therefore, the head Q does not include structures such as oxy, hydroxy, carboxy, alkoxy, and carboxylate. Further, the head Q may contain an ionic group, but is preferably a neutral group containing no polar group.
  • Q can be represented by the following general formula (1-Q).
  • R Q1 is each independently alkyl
  • R Q2 is each independently hydrogen or alkyl
  • Any two of R Q1 and R Q2 may combine to form a nitrogen-containing alicyclic ring
  • q1 is a number of 1 to 4
  • q2 is a number from 0 to 4
  • the alkyl is preferably a C 1 -C 3 alkyl.
  • any two of R Q1 and R Q2 can combine to form a nitrogen-containing alicyclic ring.
  • the number of members of the nitrogen-containing alicyclic ring is not particularly limited, it is preferably 4 to 10, and more preferably 5 to 8.
  • the nitrogen-containing alicyclic ring constituted includes piperidine, piperazine, pyrrolidine, imidazolidine, hexamethyleneimine, homopiperazine, heptamethyleneimine and the like.
  • Such Q has, for example, the following structure. (In the formula, * represents the bonding position to —CHR 2 )
  • R represents a hydrophobic group, and two Rs may be the same or different.
  • the hydrophobic group contains a relatively long hydrocarbon chain.
  • These linking groups function as biodegradable groups when the compounds according to the embodiments are used in liposomes.
  • LR1 and LR2 may have a branched chain structure or a cyclic structure, but if they have a branched structure, the LR1 and LR2 preferably have a small number of side chains, and most preferably have a linear structure.
  • L R1 and L R2 are preferably represented by the following formulas (1-R1) and (1-R2), respectively.
  • -(CH 2 ) r1- (1-R1) —CH 2 —CH CH— (CH 2 ) r2 —H (1-R2) (wherein r1 is a number from 1 to 10, r2 is a number from 1 to 10)
  • r1 is preferably a number of 4 to 8, and the longest molecular chain contained in the hydrophobic group R is 8 atoms or more. Is preferred.
  • each part of the compound according to the embodiment has a structure as described above, but the compound according to the embodiment preferably has a structure represented by the following formulas (1-01) to (1-21). .
  • (1-01) and (1-02) are particularly preferable because excellent properties can be exhibited when used in liposomes.
  • the compounds according to the invention can be prepared by any method.
  • compounds (1-01) and (1-02) can be produced, for example, according to the following process chart.
  • a lipid particle is provided.
  • a typical example of the lipid particle is a liposome, but is not limited thereto, and includes a lipoplex complexed with a nucleic acid or the like.
  • the liposome may be a unilamellar liposome or a multilamellar liposome.
  • the lipid particle according to the embodiment contains the compound represented by the above formula (1). Further, it desirably further contains a lipid that forms a membrane and a lipid that can reduce aggregation.
  • any lipid generally used in liposomes can be used.
  • This lipid is preferably a lipid having excellent biodegradability.
  • lipids forming such a membrane include diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, ceramide, sphingomyelin, dihydrosphingomyelin, kephalin, and cerebroside.
  • the lipid forming the membrane used for the lipid particles is appropriately selected in consideration of the size of the target liposome, the stability of the liposome in a living body, and the like. Of these, diacylphosphatidylcholine and diacylphosphatidylethanolamine are preferred.
  • the length of the hydrocarbon chain of the acyl group contained in the lipid is preferably 10 to 20. This hydrocarbon chain may be a saturated hydrocarbon group or an unsaturated hydrocarbon group.
  • lipids are known to form such a membrane, for example, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (POPC), 1,2-di-O-octadecyl-3-trimethylammonium propane (DOTMA), 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium propane (DODAP), 1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium propane (14: 0 DAP), 1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium propane (16: 0 DAP), 1,2-distearoyl-3-dimethylammonium propane (18: 0 DAP), N- (4
  • DOPE, DOTAP or cholesterol is more preferred, and a combination of DOPE and cholesterol, a combination of DOTAP and cholesterol, and a combination of DOPE, DOTAP and cholesterol are particularly preferred. These can exert a membrane fusion effect in addition to the function of forming a membrane such as a liposome.
  • the lipid capable of reducing aggregation used in the embodiment exerts a function including aggregation of particles during the preparation of lipid particles.
  • Various lipids are known as such lipids, and any lipid lipid according to the embodiment can be selected and used.
  • examples of such lipids include polyethylene glycol (PEG) modified lipids, polyamide oligomers derived from omega-amino (oligoethylene glycol) alkanoic acid monomers (US Pat. No. 6,320,017), monosialogangliosides, and the like. Is mentioned. More specifically, ATTA lipids such as ATTA8-DPSE listed in US Pat. No. 6,320,017, US Pat. Nos. 5,820,873, 5,534,499, and The polyethylene glycol lipid conjugate described in US Pat. No. 5,885,613 can be used.
  • the PEG-modified lipid can form an anchoring lipid moiety on the surface of the lipid particle when the lipid particle is formed.
  • PEG-modified lipids include PEG-modified phosphatidylethanolamine, PEG-modified phosphatidic acid, PEG-ceramide conjugates (eg, C14 @ PEG-Cer or C20 @ PEG-Cer described in Japanese Patent No. 3,920,330).
  • PEG-modified dialkylamine PEG-modified 1,2-diacyloxypropan-3-amine
  • PEG-modified diacylglycerol eg, 1,2-dimyristoyl-sn-glycerol-methoxypolyethylene glycol; PEG-DMG
  • PEG-modified dialkyl Glycerol PEG-modified diacylglycerol and PEG-modified dialkylglycerol are particularly preferred.
  • lipid particles suitable for the purpose can be obtained. For example, it is possible to lose lipid particles faster by shortening the modifying group in the PEG-modified lipid, or to increase the residence time in plasma by increasing the modifying group. As a result, delivery of lipid particles to the target tissue may be improved in some cases.
  • the lipid particles can further contain other lipids.
  • Such other lipids can be arbitrarily selected from those commonly used in lipid particles. For example, relatively less toxic lipids can be combined to adjust toxicity.
  • a lipid having a specific structure can be combined to introduce a functional group for binding a ligand to the lipid particles.
  • lipid particles when lipid particles are used as liposomes, sterols, for example, cholesterol, may be contained as lipids for suppressing leakage of the inclusions.
  • a target agent can be coupled to the lipid particles.
  • any conventionally known method can be adopted.
  • the lipid particles according to the embodiment have the following formula (2): P- [XWYW'-Z] 2 (2) (Where P is alkyleneoxy containing one or more ether bonds in the main chain, X is each independently a divalent linking group containing a tertiary amine structure; W is each independently C 1 -C 6 alkylene; Y is each independently a divalent linking group selected from the group consisting of a single bond, an ether bond, a carboxylate bond, a thiocarboxylate bond, a thioester bond, an amide bond, a carbamate bond, and a urea bond; W ′ is each independently a single bond or C 1 -C 6 alkylene, and Z is each independently a fat-soluble vitamin residue, a sterol residue, or a C 12 -C 22 aliphatic hydrocarbon group.
  • a compound containing at least one biodegradable group selected from the group consisting of a carboxylate bond, a thiocarboxylate bond, a dithiocarboxylic acid bond, an amide bond, a carbamate bond, a carboxydioxy bond, and a urea bond.
  • a biodegradable group selected from the group consisting of a carboxylate bond, a thiocarboxylate bond, a dithiocarboxylic acid bond, an amide bond, a carbamate bond, a carboxydioxy bond, and a urea bond.
  • it further includes.
  • the compound represented by the formula (2) is also a biodegradable lipid compound.
  • the compound of the formula (1) By combining the compound of the formula (1) with the compound of the formula (2), it becomes possible to express a new function. For example, when the compound of formula (2) is applied to liposomes, the amount of nucleic acid encapsulated can be increased, and when the compound of formula (1) and the compound of formula (2) are applied to liposomes, gene therapy Or nucleic acid medicine, genomic diagnosis, etc.
  • P in formula (2) contains an ether linkage. That is, P contains at least one oxygen, which is bonded to two carbons.
  • the number of oxygens contained in P is not particularly limited, but preferably contains 1 to 2 oxygens.
  • the number of carbon atoms contained in P is not particularly limited, but the hydrocarbon chain contained in P preferably has 1 to 3 carbon atoms, and the total number of carbon atoms contained in P is 3 to 8 carbon atoms. preferable.
  • Preferred P includes the following.
  • X is a divalent linking group containing a tertiary amine structure, and is preferably selected from the group consisting of methylimino, 1,2-pyrrolidinediyl, and 1,3-pyrrolidinediyl.
  • this compound is used for the construction of liposomes, high cell membrane permeability is exhibited by the tertiary amine structure.
  • -WY-W'-Z forms a hydrophobic portion.
  • This hydrophobic part contains a biodegradable group.
  • the biodegradable group may be present in the structure as Y, or may be included in Z in some cases. That is, Z is a group derived from fat-soluble vitamins and sterols, and the carboxylic acid ester group or the like may be included in the structure. Further, the biodegradable group may be contained in both Z and Y, or either one may contain two or more biodegradable groups.
  • 'Y and W' are divalent groups connecting W and Z.
  • Y is a divalent linking group selected from the group consisting of a single bond, an ether bond, a carboxylic acid ester bond, a thiocarboxylic acid ester bond, a thioester bond, an amide bond, a carbamate bond, and a urea bond.
  • W ′ is a single bond or C 1 -C 6 alkylene.
  • Z is a fat-soluble vitamin residue, a sterol residue, or a C 12 -C 22 aliphatic hydrocarbon group. Of these, fat-soluble vitamin residues or sterol residues are preferred, and fat-soluble vitamin residues are more preferred.
  • a fat-soluble vitamin residue is a group derived from a fat-soluble vitamin.
  • Fat-soluble vitamins include, for example, retinol, retinal, ergosterol, 7-dehydrocholesterol, calciferol, corcalciferol, dihydroergocalciferol, dihydrotaxosterol, tocopherol, and tocotrienol. These fat-soluble vitamins have a terminal hydroxy.
  • One example of a fat-soluble vitamin residue is one in which hydrogen has been eliminated from these hydroxys.
  • a group derived from a fat-soluble vitamin derivative can also be used.
  • the fat-soluble vitamin derivative is a compound in which the hydroxy contained in the fat-soluble vitamin is substituted with thiohydroxy, carboxy, thiocarboxy, or dithiocarboxy.
  • Particularly preferred among the fat-soluble vitamin residues are groups derived from retinol (vitamin A), tocopherol (vitamin E), or their carboxylic acid derivatives.
  • a sterol residue is a group derived from a sterol.
  • Sterols include, for example, cholesterol, stigmasterol, ⁇ -sitosterol, lanosterol, and ergosterol.
  • One example of a sterol residue is one in which hydrogen has been eliminated from the hydroxy of these sterols.
  • the sterol residue may have the same terminal group as the group derived from the fat-soluble vitamin derivative described above.
  • Particularly preferred sterol residues are groups derived from sterol, cholesterol, or their carboxylic acid derivatives.
  • the C 12 -C 22 aliphatic hydrocarbon group may be linear or branched, and may have a cyclic structure.
  • the aliphatic hydrocarbon group may contain an unsaturated bond, and if so, generally contains 6 or less, preferably 3 or less unsaturated bonds.
  • the aliphatic hydrocarbon group preferably has 12 to 18 carbon atoms, and more preferably 13 to 17 carbon atoms.
  • the compound of the formula (2) contains two [XWYW'-Z], and each of X, W, Y, W 'and Z is independent and may be the same. Although they may be different, it is preferable that they are the same and that the structure of the compound is the object.
  • Each site of the compound according to the embodiment has a structure as described above, and the compound according to the embodiment preferably has a structure represented by the following formulas (2-01) to (2-12). .
  • (2-01) to (2-04) are particularly preferable because excellent properties can be exhibited when used in combination with the compound of the formula (1) for liposomes.
  • the compound of the formula (2) can be produced, for example, according to the following process chart.
  • lipids are combined to form lipid particles, but the mixing ratio of each lipid constituting the lipid particles is adjusted according to the purpose and is not limited. However, based on the total number of moles of lipid used in the lipid particles, generally, A total of 25 to 75 mol% of the lipid compounds represented by the formulas (1) and (2), 25-75 mol% of lipid forming the membrane, 1 ⁇ 10mol% lipid which can reduce aggregation In general, a total of 30 to 60 mol% of the lipid compounds represented by the formulas (1) and (2) 30-65 mol% of lipid forming the membrane, 1 to 10 mol%, for example 2.5 mol%, of lipid capable of reducing aggregation It is.
  • the compounding ratio of the compound of the formula (1) or (2) to the lipid forming the membrane is preferably 1: 0.5 to 1: 3 on a molar basis, and 1: 0.75. More preferably, it is 1 : 1: 2.1.
  • any of the compounds represented by Formula (1) or (2) also functions as a lipid that forms a membrane, but in the embodiment, the “lipid that forms a membrane” is represented by Formula (1) or ( It does not include the compound of 2).
  • the lipid particles according to the embodiment may further include an active agent.
  • an active agent is a substance that can have a particular effect on a cell, tissue, organ, or subject. The specific effect may be any of a biological, physiological, or cosmetic effect.
  • Various active agents can be delivered to a target site in a living body by using the lipid particles according to the embodiments.
  • the active agent may be encapsulated inside the lipid particle, bound to the outer or inner lipid surface, or located within the lipid layer.
  • a typical example of an active agent is a nucleic acid, for example, a nucleic acid selected from the group consisting of a plasmid, an oligonucleotide, a polynucleotide, a small interfering RNA (siRNA), a microRNA (miRNA), a DNA, an aptamer, and a ribozyme.
  • a nucleic acid selected from the group consisting of a plasmid, an oligonucleotide, a polynucleotide, a small interfering RNA (siRNA), a microRNA (miRNA), a DNA, an aptamer, and a ribozyme.
  • antisense oligonucleotides antagomirs, aDNAs, plasmids, ribosomal RNAs (rRNAs), transfer RNAs (tRNAs), small nuclear RNAs (snRNAs), mRNAs and the like can also
  • the nucleic acid is an oligonucleotide having 15 to 50 or 20 to 30 linked nucleotide units.
  • the siRNA can be, for example, one containing 16 to 30 nucleotide units and having a double-stranded region.
  • the nucleic acid is an immunostimulatory oligonucleotide, a decoy oligonucleotide, a supermir, a miRNA mimetic, or a miRNA inhibitor.
  • Supermir is RNA or deoxyribonucleic acid DNA, or both, or a single-stranded, double-stranded, or partially double-stranded oligomer or polymer thereof, which is a denatured product thereof.
  • a miRNA mimic represents a group of molecules that can be used to mimic the gene silencing ability of one or more miRNAs.
  • miRNA mimic refers to a synthetic non-coding RNA that can enter the RNAi pathway and regulate gene expression (ie, a miRNA mimic is obtained by purifying from a source of endogenous miRNA). Is not obtained).
  • the form of the nucleic acids is not particularly limited.
  • the nucleic acid can be, for example, a single-stranded DNA or RNA, a double-stranded DNA or RNA, or a DNA-RNA hybrid. Examples of double-stranded RNA include siRNA.
  • Single-stranded nucleic acids include, for example, antisense oligonucleotides, riboenzymes, miRNAs, and triple-stranded oligonucleotides.
  • the lipid particle may further include a compound that binds to the nucleic acid.
  • a compound that binds to the nucleic acid include basic proteins or basic peptides, and preferably include protamine, histone, and salts thereof.
  • histones and their salts have the property of binding to nucleic acids and folding nucleic acid molecules.
  • Protamine has a property of binding to a nucleic acid and further involving the nucleic acid. Therefore, these compounds are effective for encapsulating nucleic acids in lipid particles.
  • the lipid particles according to the embodiment may further include a compound that regulates the expression of a nucleic acid in a cell. Adjusting the expression of the nucleic acid in the cell is preferable because the effect of visualization and cell death can be obtained for the cell to which the liposome has been delivered.
  • a compound that regulates the expression of a nucleic acid in a cell is preferable because the effect of visualization and cell death can be obtained for the cell to which the liposome has been delivered.
  • Such compounds include retinoic acid, cyclic adenosine monophosphate (cAMP), ascorbic acid, and the like.
  • the lipid particles according to the embodiment may contain lipoprotein, apolipoprotein, and the like.
  • therapeutic agents can be used as the active agent.
  • therapeutic agents include peptides, polypeptides, cytokines, growth factors, apoptosis factors, differentiation-inducing factors, cell surface receptors and their ligands, hormones, and the like. More specifically, therapeutic agents include anti-inflammatory compounds, antidepressants, stimulants, analgesics, antibiotics, contraceptives, antipyretics, vasodilators, angiogenesis inhibitors, cytovascular agents, Signaling inhibitors, cardiovascular drugs, oncology drugs, hormones, and steroids.
  • the active agent is introduced into the lipid particles at a higher introduction rate. It is also preferred that cell death due to cytotoxicity dependent on lipid properties is low.
  • nucleic acid was introduced using conventionally known lipid particles, the introduction rate was generally low and the rate of cell death due to cytotoxicity was high.
  • the nucleic acid introduction rate is high, and cell death can be reduced.
  • the introduction rate is about 10%, and the cell death by electroporation is 60 to 70%, whereas when the lipid particles according to the embodiment are used, It is reduced to 70% or more and 30% or less.
  • the lipid particles according to the embodiment can be formed in any size according to the purpose. However, when the lipid particles according to the embodiment are to be used for medical applications, the lipid particles are generally nano-sized particles. Specifically, the average particle diameter of the lipid particles according to the embodiment is generally 50 nm to 300 nm, preferably 50 nm to 200 nm.
  • the size of the lipid particles can be adjusted by any method. For example, sonication can reduce lipid particles. Also, the size can be adjusted by separating the lipid particles through a polycarbonate membrane or a ceramic membrane. In the embodiment, the average particle diameter of the lipid particles can be measured by, for example, a Zetasizer using a dynamic light scattering method.
  • the in vivo half-life (t 1/2 ) of the lipid particles according to embodiments is generally less than 3 hours, preferably less than 2 hours, particularly preferably less than 1 hour.
  • the in vivo half-life means, for example, the half-life in the liver, spleen, or plasma.
  • the compound of the formula (1) constituting the lipid has a biodegradable group
  • the compound has a half-life of, for example, less than 10% as compared with a lipid particle made of a lipid not containing a biodegradable group. Has become.
  • the lipid particles according to the embodiment can be manufactured by any conventionally known method.
  • Known methods for producing lipid particles and liposomes include a bang gum method, an organic solvent extraction method, a surfactant removal method, and a freeze-thaw method. These methods can also be employed.
  • a compound represented by the formula (1), a lipid forming a membrane, and a lipid capable of reducing aggregation are introduced into an organic solvent such as alcohol, and spontaneously generated by adding an aqueous buffer.
  • lipid particles can be formed. By combining an activator with this aqueous buffer, it is possible to introduce the activator into the lipid particles.
  • Lipid particles according to this embodiment can be used to deliver an active agent to cells.
  • delivery of active agents, such as nucleic acids, to cells is used in all fields, including genetic engineering, production of recombinant proteins, and medical techniques known as gene therapy and cytodiagnosis.
  • a composition for delivering an active agent to a cell comprising a lipid particle according to the embodiment, and a carrier.
  • a lipid particle according to an embodiment is provided for delivering an active agent to a cell.
  • a method for delivering an active agent to a cell comprising contacting a lipid particle according to an embodiment comprising the active agent with a cell (eg, administering the lipid particle to a subject).
  • a method is provided that includes:
  • the lipid particles comprise both a compound of the formula (1) and a compound of the formula (2), preferably the content of the compound of the formula (1) relative to the content of the compound of the formula (1) The molar ratio of the content of the compounds is less than 1.
  • the cells are tumor cells.
  • the subject is preferably an animal in need of such treatment, more preferably a mammal, and most preferably a human.
  • composition The lipid particles according to the present embodiment can be used as a composition.
  • a composition comprising the lipid particles of the present embodiment and a carrier is provided.
  • Such a composition is also applicable for pharmaceutical use.
  • the carrier can be arbitrarily selected from conventionally known carriers, and examples thereof include water, saline such as physiological saline, glycine aqueous solution, and buffer. Further, in addition to these carriers, glycoproteins such as albumin, lipoprotein, apolipoprotein, globulin and the like may be combined for the purpose of improving stability and the like.
  • compositions according to embodiments can be prepared by standard methods.
  • a physiological saline is generally used.
  • the carrier is preferably added after formation of the lipid particles.
  • an active agent such as a nucleic acid
  • compositions according to the embodiment may include an adjuvant as needed.
  • a pharmaceutically acceptable auxiliary agent such as a pH adjuster, a buffering agent, and a tonicity adjuster may be included as an auxiliary agent to bring the pharmaceutical composition closer to a physiological state. it can.
  • the auxiliary having such a function include sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, and hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid (HEPES).
  • HEPES hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid
  • compositions according to embodiments can also include a lipid protectant to improve storage stability.
  • Such protective agents include lipophilic free radical quencher, such as ⁇ -tocopherol, which suppresses damage by free radicals, and water-soluble chelators, such as ferrioxamine, which suppress peroxidation damage of lipids.
  • the above-mentioned activators and the like can be added to the composition.
  • the activator may be the same as or different from the activator combined with the lipid particles.
  • a compound that binds to the nucleic acid or a compound that regulates the expression of the nucleic acid can be added to the composition.
  • the concentration of the lipid particles contained in the composition according to the embodiment is not particularly limited, and the content of the lipid particles contained in the composition is generally 0.01 to 30% by mass, preferably 0.05 to 10% by mass. %.
  • the concentration of the lipid particles can be appropriately selected depending on the purpose.
  • compositions according to embodiments can be sterilized by conventional and well-known methods.
  • the sterilized composition can be packaged as a preparation that can be administered as it is, or can be dried and packaged.
  • the dried composition can be made into an administrable preparation by combining it with a sterile aqueous solution immediately prior to administration.
  • compositions according to embodiments can also be in kit form.
  • the kit according to the embodiment includes the above-described lipid particles and an introducing agent for introducing the lipid particles into cells, but the form is arbitrary.
  • a kit containing an active agent and a dispersion in which an active agent-free lipid particle is dispersed in a carrier and a kit containing the active agent in a separate container a kit containing the dried lipid particles, the active agent and the carrier in a separate container, and the like.
  • the dried lipid particles or lipid particle dispersion and the active agent can be made into separate products, so that the user can select each product according to the purpose. Reagents used for nucleic acid introduction can be combined with the kit.
  • the composition can be used for treating or diagnosing various diseases of humans or animals.
  • a therapeutic agent as an active agent to be combined with lipid particles
  • the therapeutic agent can be delivered to target cells, thereby enabling treatment.
  • nucleic acids can be delivered to cells and brought into contact with them to prevent or treat diseases.
  • nucleic acids include oligonucleotides, siRNA, plasmids, antisense, or ribozymes.
  • the lipid compounds according to these embodiments can efficiently and rapidly incorporate these nucleic acids. For example, it has been conventionally difficult to introduce RNA into lipid particles in a short time and safely, but by using the lipid compound according to the embodiment, it can be easily performed.
  • More effective cell targeting can be achieved by appropriately combining a lipid compound used for preparing lipid particles and a compound forming a membrane.
  • the combination of compound (1-01), compound (2-01), DOPE and cholesterol is useful for delivery to hepatoma cells by compound (1-01) or compound (1-02), DOTAP, and A combination of cholesterol can be suitably used for delivery to T cell leukemia cells, and a combination of compound (1-01), compound (2-01), DOTAP, DOPE and cholesterol can be suitably used for delivery to breast cancer cells. .
  • lipid compound used for preparing lipid particles and a compound forming a membrane by appropriately combining a lipid compound used for preparing lipid particles and a compound forming a membrane, more effective diagnosis, treatment and prevention can be performed.
  • the combination of compound (1-01), compound (2-01), DOPE and cholesterol is useful for diagnosing, treating and preventing liver cancer by compound (1-01) or compound (1-02), DOTAP And cholesterol are suitable for the diagnosis, treatment and prevention of T cell leukemia, and the combination of compound (1-01), compound (2-01), DOTAP, DOPE and cholesterol are suitable for the diagnosis, treatment and prevention of breast cancer Can be used.
  • the delivery of the nucleic acid can be performed either in vitro or in vivo.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered parenterally, ie, intraarticular, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, or intramuscular.
  • Intravenous or intraperitoneal administration of a pharmaceutical composition can also be by bolus injection.
  • the pharmaceutical preparation according to the embodiment can be applied directly to the target tissue to bring the pharmaceutical composition into contact with the target tissue.
  • administration to the meninges or the like by infusion or administration using an endoscopic instrument is also possible.
  • treatment with the pharmaceutical composition is generally performed at physiological temperature (about 37 ° C) for a period of 1 to 24 hours, preferably 2 to 8 hours.
  • the target cells are not particularly limited. For example, it may be a vertebrate cell, an invertebrate cell, or a plant cell. However, in a preferred embodiment, the cells are animal cells, more preferably mammalian cells, and most preferably human cells.
  • Synthesis Example 1 Synthesis of Compound (1-01) Compound (1-01) was synthesized according to the above-described production process. Specifically, the following operation was performed.
  • the Grignard reagent was added dropwise to a 1000 mL four-necked flask charged with ethyl formate (12.04 g, 162.49 mol, 1 eq.) And diethyl ether (165 mL) at 0 ° C. or lower over 1.5 hours.
  • Step 2 Under an argon atmosphere, the intermediate (1-01-1) (41.1 g, 146.53 mmol, 1 eq.) Dissolved in dichloromethane (330 mL) was charged into a 1000 mL flask, and triethylamine (59.31 g, 586.12 mmol, 4 eq.) And 4-dimethylaminopyridine (1.79 g, 14.65 mmol, 0.1 eq.) Were added. At ⁇ 5 ° C., methanesulfonyl chloride (33.57 g, 293.06 mmol, 2 eq.) was added dropwise.
  • a saturated aqueous ammonium chloride solution (1200 mL) was added to the reaction solution, stirred for 20 minutes, and 10% sulfuric acid (450 mL) was added to separate the layers. Subsequently, extraction was performed twice with diethyl ether (500 mL). The extracted organic layer was washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (500 mL) and a saturated saline solution (500 mL), and dried over sodium sulfate. After filtration and concentration, 25.3 g (89% yield) of intermediate (1-01-4) was obtained as a yellow oil.
  • the aqueous layer was extracted with dichloromethane (100 mL x 2), and a saturated saline solution (230 mL) was added to the combined organic layer, and 3% sodium sulfide was added dropwise until the color changed. 1 M hydrochloric acid was added until acidic, and the layers were separated. The organic layer was dried with sodium sulfate.
  • the crude product (14.7 g) obtained by filtration and concentration was purified by column chromatography (silica gel: 300 g, developing: chloroform ⁇ 2% methanol / 98% chloroform) to give the intermediate (1-01-7) as a pale yellow oil. 0.73 g (49% yield) was obtained.
  • the crude product (3.7 g) obtained by filtration and concentration was purified by column chromatography (silica gel 37 g, developing: hexane ⁇ 5% ethyl acetate / 95% hexane), and the intermediate (1-01-8) was converted into a pale yellow oil 1.62 g (yield 36%).
  • the aqueous layer was extracted three times with dichloromethane (20 mL), and the combined organic layers were dried over sodium sulfate.
  • the crude product (2.3 g) obtained by filtration and concentration was purified by column chromatography (silica gel: 25 g, developing: chloroform ⁇ 5% methanol / 95% chloroform) to give the target compound (1-01). 21 g (72% yield) were obtained.
  • Synthesis Example 2 Synthesis of Compound (2-01) Compound (2-01) was synthesized according to the above-described production process. Specifically, the following operation was performed.
  • the crude product was purified by column chromatography (15 g of NH silica gel, developing solution 50% hexane / chloroform) to obtain 348 mg of an intermediate (2-01-2 ) as a pale yellow transparent oil (yield 43%). ).
  • a core complex consisting of the vector DNA-DNA condensed peptide was prepared.
  • a vector DNA a plasmid into which a cytomegalovirus early promoter / enhancer, an Nluc gene, and a transcription termination signal were incorporated was used.
  • mHP-1 RQRQR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR: SEQ ID NO: 1
  • mHP-2 RRRRRR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR: SEQ ID NO: 2
  • a DNA condensed peptide solution (0.24 mg / ml, 10 mM HEPES, pH 7.3) was dispensed into a microtube (Proteosave SS (trade name) 1.5 ml, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). While stirring the dispensed peptide solution with a vortex mixer (1,500 rpm) (MSV-3500 (trade name), manufactured by BIOSAN), 200 ⁇ l of the vector DNA solution (0.15 mg / ml, 10 mM @HEPES, pH 7.3) was added. The mixture was added dropwise.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Liposome encapsulating the core complex was prepared by ethanol injection. 50 ⁇ l of each lipid solution having the mixing ratio shown in Table 1 was dispensed into a microtube (Proteo Save SS (trade name) 1.5 ml, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Here, a compound represented by the formula (R-01) was used as a compound used for comparison.
  • the fluorescence intensity (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 530 nm) of the solution was measured with a microtiter plate reader: Mitras LB-940 (trade name, manufactured by Bertole).
  • the DNA concentration was quantified using a calibration curve prepared with known concentrations of ⁇ DNA. From the obtained numerical values, the amount of liposome-encapsulated DNA was calculated as the amount of DNA per 1 mL of solution ( ⁇ g DNA / mL). The results are as shown in Table 2.
  • the liposome containing the compound of the formula (1-01) had a higher amount of encapsulated DNA than the liposome containing the compound of the formula (R-01). It was also confirmed that when the compound of the formula (2) was combined as a lipid compound, the amount of encapsulated DNA was increased.
  • the surface charge (zeta potential) of the liposome was measured with a Zetasizer (Zetasizer Nano ZS (trade name), manufactured by Malvern PANalytical). 30 ⁇ l of the liposome solution was dispensed into a cell for measuring zeta potential (DTS-1070 (trade name), manufactured by Malvern Panical), 870 ⁇ l of distilled water was added and mixed, and the cell was set on a Zetasizer to measure the zeta potential. did. The results obtained are as shown in Table 2.
  • the introduction of vector DNA into cells by liposomes was quantified by expression of the Nluc gene on the vector DNA.
  • the expression of the NLuc gene was evaluated by measuring the amount of luminescence with a microtiter plate reader: infinite F200 (product name, manufactured by Tecan).
  • the cells used were human T-cell leukemia cell line Jurkat, human breast cancer-derived cell line MCF-7, and human liver cancer-derived cell line Huh-7 (purchased from American Type Culture Collection). After 100 ⁇ L of a cell suspension at 1 ⁇ 10 6 cells / mL was seeded on a 96-well culture plate, 1 ⁇ L of a liposome solution shown in Table 1 was added.
  • the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 48 hours, and then the enzyme activity of NLuc was measured.
  • the enzyme activity of NLuc was measured using a NanoGlo Luciferase Assay System (product name, Promega) with a luminometer according to the manual attached to the kit. The obtained results were as shown in FIG. 1 (Jurkat), FIG. 2 (MCF-7), and FIG. 3 (Huh-7).
  • Nluc gene taken into cells by liposomes can be more easily taken up by adherent cells than by floating compounds by combining the compound of formula (2) with the lipid compound of formula (1). Indicated. Furthermore, by controlling the surface charge in the presence or absence of DOTAP, it was found that there was directivity to cells having different growth modes.
  • Synthesis Example 3 Synthesis of Compound (1-02) Compound (1-02) was synthesized according to the above-described production process. Specifically, the following operation was performed.
  • the Grignard reagent was added dropwise to a 1000 mL four-necked flask charged with ethyl formate (12.04 g, 162.49 mmol, 1.00 eq.) And diethyl ether (165 mL) at 0 ° C. or lower over 1.5 hours. After reacting at room temperature for 1 hour, acetone (100 mL) was added, and water (200 mL) and 10% sulfuric acid (267 mL) were sequentially added to carry out liquid separation. The aqueous layer was extracted with diethyl ether (300 mL), and the organic layer was dried over Na 2 SO 4 .
  • Step 2 Under an argon atmosphere, the intermediate (1-02-1) (41.1 g, 146.53 mmol, 1.00 eq.) Dissolved in dichloromethane (330 mL) was introduced into a 1000 mL flask, and tritylamine (59 .31 g, 586.12 mmol, 4.00 eq.) And 4-dimethylaminopyridine (1.79 g, 14.65 mmol, 0.10 eq.) Were added. At ⁇ 5 ° C., methanesulfonyl chloride (33.57 g, 293.06 mmol, 2.00 eq.) was added dropwise.
  • the crude product (30.3 g) obtained by filtration and concentration was purified by column chromatography (silica gel 304 g, developing: 5% ethyl acetate / 95% hexane) to obtain 22 (intermediate (1-02-5)) as a pale yellow oil. .13 g (87% yield) were obtained.
  • Step 6 Under an argon atmosphere, the intermediate (1-02-5) (22.13 g, 75.14 mmol, 1.00 eq.) was dissolved in dichloromethane (220 mL) in a 1000 mL flask, and tetrabromomethane (29.90 g, 90 .17 mmol, 1.20 eq.). At 0 ° C., triphenylphosphine (29.56 g, 112.71 mmol, 1.50 eq.) Dissolved in dichloromethane (63 mL) was added dropwise.
  • reaction solution was extracted with ethyl acetate (200 mL ⁇ 3 times), washed sequentially with a saturated aqueous NaHCO 3 solution (90 mL) and a saturated saline solution (90 mL), and the organic layer was dried over Na 2 SO 4 . After filtration and concentration, 7.31 g (66% yield) of intermediate (1-02-7) was obtained as an orange oil.
  • the extracted organic layer was washed with water (50 mL) and a saturated saline solution (50 mL), and dried over Na 2 SO 4 .
  • the crude product (11.4 g) obtained by filtration and concentration was purified by column chromatography (silica gel 100 g, eluant: hexane ⁇ 5% ethyl acetate / 95% hexane) to give the intermediate (1-02-11) as a colorless oil. 3.6 g (yield 90%) was obtained.
  • the crude product (3.17 g) obtained by filtration and concentration was purified by column chromatography (silica gel 32 g, developing: 5% ethyl acetate / 95% hexane) to give the intermediate (1-02-13) as a pale yellow oil. 1.12 g (35% yield) was obtained.
  • the crude product (1.92 g) obtained by filtration and concentration was purified by column chromatography (silica gel 20 g, eluant: hexane ⁇ 2% ethyl acetate / 98% hexane), and the intermediate (1-02-16) was slightly yellow oil. 77 mg (yield 5%) was obtained.
  • a core complex consisting of the vector DNA-DNA condensed peptide was prepared.
  • a vector DNA a plasmid into which a cytomegalovirus early promoter / enhancer, an Nluc gene, and a transcription termination signal were incorporated was used.
  • mHP-1 RQRQR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR: SEQ ID NO: 1
  • mHP-2 RRRRRR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR: SEQ ID NO: 2
  • a DNA condensed peptide solution (0.255 mg / ml, 10 mM HEPES, pH 7.3) was dispensed into a microtube (Proteo Save SS (trade name) 1.5 ml, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
  • 200 ⁇ l of the vector DNA solution (0.15 mg / ml, 10 mM HEPES, pH 7.3) while stirring the dispensed peptide solution with a vortex mixer (1, 500 rpm) (MSV-3500 (trade name), manufactured by BIOSAN). was added dropwise and mixed.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Liposome encapsulating the core complex was prepared by ethanol injection. 50 ⁇ l of a lipid solution having a mixing ratio shown in Table 3 was dispensed into a microtube (Proteo Save SS (trade name) 1.5 ml, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Reference Examples 2-1 and 2-2 in Table 3 are separate preparations having the same formulation as in Examples 1-2 and 1-4 described above.
  • the fluorescence intensity (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 530 nm) of the solution was measured with a microtiter plate reader: Mitras LB-940 (trade name, manufactured by Bertole).
  • the DNA concentration was quantified using a calibration curve prepared with known concentrations of ⁇ DNA. From the obtained numerical values, the amount of liposome-encapsulated DNA was calculated as the amount of DNA per 1 mL of solution ( ⁇ g DNA / mL). The results are as shown in Table 4. It was revealed that the liposome containing the compound of the formula (1-02) exhibited the same amount of the included DNA as the liposome containing the compound of the formula (1-01). It was also confirmed that when the compound of the formula (2-01) was combined, the amount of encapsulated DNA was increased.
  • the surface charge (zeta potential) of the liposome was measured with a Zetasizer (Zetasizer Nano ZS (trade name), manufactured by Malvern PANalytical). 10 ⁇ l of the liposome solution is dispensed into a cell for measuring zeta potential (DTS-1070 (trade name), manufactured by Malvern Panasonic), 890 ⁇ l of distilled water is added and mixed, and the cell is set on a Zetasizer to measure the zeta potential. did. The results obtained are as shown in Table 4.
  • the neutral lipid DOPE is used as the lipid forming the membrane (Reference Example 2-2 and Example 2-2), and the cationic lipid DOTAP is used for DOPE (Reference Example 2). -1 and Example 2-1), it was found that the latter can shift the zeta potential more positively.
  • the introduction of vector DNA into cells by liposomes was quantified by expression of the Nluc gene on the vector DNA.
  • the expression of the NLuc gene was evaluated by measuring the amount of luminescence thereof using a microtiter plate reader: infinite F200 (product name, manufactured by Tecan).
  • the cells used were human T-cell leukemia cell line Jurkat (purchased from American Type Culture Collection) and human peripheral blood mononuclear cell PBMC (purchased from Lonza Japan Co., Ltd.).
  • Jurkat was seeded on a 96-well culture plate with 100 ⁇ L of a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells / mL, and PBMC was seeded with 100 ⁇ L of a cell suspension of 5 ⁇ 10 6 cells / mL. The solution was added so that the DNA amount was 0.8 ⁇ g / well. After the addition, the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 48 hours, and then the enzyme activity of NLuc was measured. The enzyme activity of NLuc was measured using a NanoGlo Luciferase Assay System (product name, Promega) with a luminometer according to the manual attached to the kit. The obtained results were as shown in FIG.
  • a NanoGlo Luciferase Assay System product name, Promega
  • lipid compound of the formula (1-02) was confirmed to exhibit higher Nluc gene expression efficiency in Jurkat cells than the formula (1-01). Further, when the lipid compound of the formula (1-01) is selected from the formula (2-01) and DOPE as the lipid compound forming the membrane, the Nluc gene expression efficiency in PBMC cells is higher than that of the formula (1-02). It was confirmed that it showed.
  • RNA-encapsulated liposome containing lipid compound As a messenger RNA (mRNA), mRNA (OZ Biosciences) of a green fluorescent protein GFP which is a reporter gene was used. The RNA-encapsulated liposome was prepared by adding a GFP mRNA solution to a lipid solution having the mixing ratio shown in Table 5, suspending the solution by pipetting, gently adding 10 mM HEPES (pH 7.3), and centrifuging the solution. It was adjusted by washing and concentration by ultrafiltration. Here, a compound represented by the formula (R-01) was used as a compound used for comparison. Comparative Example R-3 is another preparation having the same formulation as Comparative Example R-1.
  • RNA-encapsulated RNA The amount of RNA encapsulated in the liposome was measured with a QuantiFluor RNA System kit (Promega). The measurement was performed according to the manual attached to the kit. Table 6 shows the measurement results of the RNA inclusion amount. In the RNA-encapsulated liposomes prepared with the lipid solutions having the mixing ratios shown in Table 5, no remarkable difference was observed in the amount of RNA included in the liposomes.
  • the surface charge (zeta potential) of the RNA-encapsulated liposome was measured using a Zetasizer (Zetasizer Nano ZS, manufactured by Malvern PANalytical).
  • the liposome solution was added to a cell for measuring zeta potential (DTS-1070, manufactured by Malvern Panalytical), diluted and mixed with distilled water, and then the cell was set at a predetermined position on a Zetasizer to measure the zeta potential.
  • the amount of encapsulated RNA and the average zeta potential of the RNA-encapsulated liposomes prepared in Table 5 were as shown in Table 6.
  • RNA introduction amount by liposome Introduction of RNA into cells by liposomes was quantified by expression of the GFP gene encoded by the RNA.
  • the expression of the GFP gene was evaluated by measuring the amount of fluorescence with a flow cytometer (FACSVerse, manufactured by BD Biosciences).
  • the cells used were a human T-cell leukemia cell line: Jurkat (purchased from American Type Culture Collection).
  • Jurkat cultured in a TexMACS medium manufactured by Gibco was collected by centrifugation, and then suspended in fresh TexMACS to 0.65 ⁇ 10 7 cells.
  • RNA introduction method As an RNA introduction method used for comparison, a lipofection using a lipofectamine reagent (Lipofectamine 3000, manufactured by Invitrogen) and an RNA introduction method by electroporation were performed. Introduction by lipofection was performed according to the manual attached to the reagent.
  • Jurkat was collected by centrifugation, OptiMEM (Gibco) was added, washed, and then collected by centrifugation again.
  • the collected cells were suspended in OptiMEM at 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL, and then 0.5 ⁇ g of GFP RNA was added to 100 ⁇ L of the cell suspension, transferred to a cuvette electrode, and electroporated. .
  • Electroporation was performed using CUY21 EDIT II (BEX) under the following conditions.
  • FIG. 6 is a graph showing the measurement results. The vertical axis of the graph is relative fluorescence intensity.
  • the RNA-encapsulated liposomes prepared using the lipid solutions of Examples 3-1 and 3-2 exhibited a higher transfection amount than other RNA transfection methods, namely, transfection by lipofection and transfection by electroporation.
  • the liposome containing the lipid solution of Example 3-1 exhibited the highest transfection amount.
  • the introduction of vector DNA into cells by liposomes was quantified by expression of the Nluc gene on the vector DNA.
  • the expression of the NLuc gene was evaluated by measuring the amount of luminescence with a microtiter plate reader: infinite F200 (product name, manufactured by Tecan).
  • the cells used were human T-cell leukemia cell line Jurkat, human breast cancer-derived cell line MCF-7, and human liver cancer-derived cell line Huh-7 (purchased from American Type Culture Collection). After 100 ⁇ L of a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells / mL was seeded on a 96-well culture plate, 1 ⁇ L of a liposome solution shown in Table 7 was added. After the addition, the cells were cultured in an incubator at 37 ° C.
  • FIGS. 7 to 9 are graphs comparing Example 4-1 and Example 4-2.
  • FIG. 7 shows breast cancer cells (cell line MCF-7), and
  • FIG. 8 shows liver cancer cells (cell line Huh- 7),
  • FIG. 9 shows the expression efficiency of Nluc gene in leukemia cells (T-lymphocytes, cell line Jurkat).
  • the results shown in FIGS. 7 to 9 indicate that the compound (2-01) allows the vector DNA contained in the liposome to be more easily taken up by adherent cells than by floating cells.
  • FIGS. 10 and 11 are graphs comparing Example 4-2 and Example 4-3, wherein FIG. 10 shows breast cancer cells (cell line MCF-7), and FIG. 11 shows liver cancer cells (cell line Huh- 7 shows the expression efficiency of the Nluc gene in 7). From the results shown in FIGS. 10 and 11, it can be seen that in the liposome containing the combination of the compound (1-01) and the compound (2-01), cells having different growth modes depend on whether or not DOTAP is used to control the surface charge. It was found that directivity could be imparted to the liposome.

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Abstract

下記式（１）： Ｑ－ＣＨＲ２　（１） （式中、 Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、 Ｒは、生分解性基を含む脂肪族基である） で表される化合物が開示される。この化合物は、その他の脂質、凝集を低減できる脂質と組わせて脂質粒子とすることができる。さらにこの脂質粒子は、細胞に活性剤を送達する医薬組成物に適用することができる。

Description

生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット
　本発明は、細胞内で分解される構造を有する生分解性化合物と、それを含む脂質粒子に関する。また、本発明はその脂質粒子を含む、核酸のような活性剤の送達のために使用される組成物およびキットにも関する。
　各種の疾病治療を目的としたリポソームの検討が進められている。リポソームは、脂質で構成されるナノメーターオーダーの粒径を有する微小なカプセルであり、その内部に種々の化合物等を内包でき、また生体適合性などにも優れていることから、治療薬や活性剤を、生体内の標的部位に選択的に送達するのに理想的な材料である。このような目的には、一般的に平均粒子径が１００ｎｍ以上の、巨大な一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）が用いられるが、その膜を構成する材料については、種々の材料が開発されている。
　このようなリポソームは、単一の脂質で構成することが可能である。このような場合、例えば脂質は頭部とそれに結合した疎水性部とを有するリン脂質が用いられ、この脂質が会合して膜を形成して、活性剤等を内包できる微小なカプセルを構成する。しかしながら、リポソームに優れた特性を付与するために、それを構成するために脂質混合物が用いられるのが一般的である。そして、この脂質混合物は、生分解性に優れた脂質、形成されるリポソームの凝集を抑制する脂質、内包物の漏出抑制効果を有する脂質、膜融合効果を有する脂質などの組み合わせを含んでいる。
　そして、リポソームの特性をより向上させるために、それぞれの脂質について検討がなされている。例えば、遺伝子導入に特化された医療向けリポソームには、高い生分解性、高い生体適合性、高い活性剤導入性、および低い細胞毒性を満たすことが好ましく、そのようなリポソームを構成できる脂質が望ましい。
　このような脂質として種々の化合物が開発されているが、適用する生体の状態や治療しようとする疾病は多岐にわたっている。これらの条件に応じて、選択できる脂質の種類を増やすことが望ましい。さらには、従来のリポソームを超える特性を有するリポソームを構成できる脂質が求められている。
特許第５８９３６１１号 特許第６０９３７１０号
　上記の課題に対して、本実施形態は、リポソームを構成することができる脂質として、新規な化合物と、それを用いた脂質粒子ならびに組成物およびキットを提供するものである。
　本実施形態による化合物は、下記式（１）：
　Ｑ－ＣＨＲ２　　　　（１）
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
で表されることを特徴とするものである。
　また、実施形態による脂質粒子は、前記の化合物を含むことを特徴とするものである。
　また、実施形態による組成物は、前記脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とするものである。
　また、実施形態によるキットは、前記脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含む組成物を含むものである。
実施例および比較例による、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例および比較例による、ＭＣＦ－７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例および比較例による、Ｈｕｈ－７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例による、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例による、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例および比較例による、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いてＲＮＡを導入した場合の、ＲＮＡ発現量を示すグラフ。 実施例４－１と実施例４－２を比較するための、ＭＣＦ－７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例４－１と実施例４－２を比較するための、Ｈｕｈ－７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例４－１と実施例４－２を比較するための、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例４－２と実施例４－３を比較するための、ＭＣＦ－７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。 実施例４－２と実施例４－３を比較するための、Ｈｕｈ－７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
［定義］
　本実施形態において、～を用いて数値範囲を示した場合、特に限定されない限り、これらは両方の端点を含み、単位は共通である。例えば、１０～２５モル％は、１０モル％以上２５モル％以下を意味する。
　本実施形態において、「Ｃｘ～Ｃｙ」および「Ｃｘ」などの記載は、分子または置換基中の炭素の数を意味する。例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキルは、１以上６以下の炭素を有するアルキルを意味する。また、本実施形態においてハロゲン化アルキルとは、アルキル中の１つ以上の水素がフッ素などのハロゲンに置き換えられたものをいい、例えばフルオロアリールとは、アリール中の１つ以上の水素がフッ素に置き換えられたものをいう。
　本実施形態において、特に限定されない限り、アルキルとはアルカンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。そしてアルキルとの用語は直鎖状または分岐鎖状アルキルを包含する。さらに、シクロアルキルとは環状構造を含むアルキルを意味する。環状構造に直鎖状または分岐鎖状アルキルが置換したものもシクロアルキルと称する。
　また、アルケルとはアルケンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。
　また、炭化水素基とは、１価または２価以上の、炭素および水素を含み、必要に応じて、酸素または窒素を含む基を意味する。そして、脂肪族基とは、芳香環を含まない炭化水素基であって、鎖状、分岐鎖状、または環状のいずれの構造をとってもよく、またそれらの組み合わせであってもよい。また、特に限定されない限り、脂肪族記は不飽和結合を含んでいてもよい。さらに、特に限定されない限り、脂肪族基は、窒素、酸素、硫黄、セレン、フッ素、塩素、臭素などのヘテロ原子を含んでいてもよい。また、脂肪族基は、１価基であっても、多価基であってもよい。また、芳香族炭化水素基とは、芳香環を含み、必要に応じて脂肪族炭化水素基を置換基として有する。
　また、３級窒素とは、３つの炭素が結合している窒素を意味する。したがって、３級窒素は電子供与性を有する３級アミン構造を構成する。
［生分解性脂質化合物］
　実施形態による化合物は、リポソームを構成する脂質として適切な化合物である。そして、その疎水部に生分解性基を有しており、生分解性脂質化合物として機能するものである。そして、その頭部にはカチオン性基を含んでおらず、生体に適用した場合には細胞内でのタンパク質の結合が抑制され、毒性が低いという特徴を有している。また、リポソームがこの脂質化合物によって構成されると、リポソームの表面が非カチオン性となるため、細胞への障害性が低くなり、核酸等の活性剤の導入率が高くなる。
　このような脂質化合物は、下記一般式（１）で表されるものである。以下、式中のＱを頭部、Ｒを疎水性基と称することがある。
　Ｑ－ＣＨＲ２　　　　（１）
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
　実施形態による化合物のひとつの特徴は、頭部Ｑが３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まないことである。
　実施形態の効果を損なわない範囲で、非置換アミノや、４級アンモニウムなどを構成する窒素をさらに含んでいてもよいが、その３級窒素以外の窒素は含まないことが好ましい。また、頭部Ｑは酸素を含まない。従って、頭部Ｑには、オキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、アルコキシ、カルボキシラトなどの構造が含まれない。また、頭部Ｑはイオン性基を含むこともできるが、極性基を含まない中性基であることが好ましい。
　好ましいＱの一例は、下記一般式（１－Ｑ）で表すことができる。
ＲＱ１ ２Ｎ－（ＣＲＱ２ ２）ｑ１－ＮＲＱ１－（ＣＲＱ２ ２）ｑ２－＊　（１－Ｑ）
（式中、
ＲＱ１は、それぞれ独立に、アルキルであり、
ＲＱ２は、それぞれ独立に、水素またはアルキルであり、
ＲＱ１およびＲＱ２のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成してもよく、ｑ１は、１～４の数であり、
ｑ２は、０～４の数であり、
＊は、－ＣＨＲ２への結合位置を表す）
　ここで、アルキルはＣ１～Ｃ３アルキルであることが好ましい。
　また、ＲＱ１およびＲＱ２のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成することができる。含窒素脂環の構成員数は特に限定されないが、４～１０であることが好ましく、５～８であることが好ましい。典型的には、構成される含窒素脂環は、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ヘキサメチレンイミン、ホモピペラジン、ヘプタメチレンイミンなどが挙げられる。
　このようなＱは、例えば、以下のような構造を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、＊は－ＣＨＲ２への結合位置を表す）
　実施形態による化合物は、頭部に結合した、－ＣＨＲ２を有している。ここでＲは疎水性基を表し、二つのＲは同一であっても異なっていてもよい。疎水性基は、比較的長い炭化水素鎖を含むものが一般的である。そして、その一部にカルボキシラト等を含む連結基、具体的には－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基を含む。これらの連結基は、実施形態による化合物がリポソームに利用された場合に、生分解性基として機能する。
　好ましい疎水性基Ｒの一例は、下記式（１－Ｒ）で表すことができる。
－ＬＲ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－ＬＲ２　　（１－Ｒ）
（式中、
ＬＲ１はアルキレンであり、
ＬＲ２はアルケニルである）
　ＬＲ１およびＬＲ２は、分岐鎖構造や環状構造を有していてもよいが、分岐構造を有する場合には側鎖は少ないことが好ましく、直鎖状であることが最も好ましい。
　より具体的には、ＬＲ１およびＬＲ２が、それぞれ下記式（１－Ｒ１）および（１－Ｒ２）で表されるものであることが好ましい。
－（ＣＨ２）ｒ１－　　　（１－Ｒ１）
－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－（ＣＨ２）ｒ２－Ｈ　　　（１－Ｒ２）（式中、
ｒ１は、１～１０の数であり、
ｒ２は、１～１０の数である）
　ここで、疎水性基が十分な疎水性を発揮するために、ｒ１は４～８の数であることが好ましく、また疎水性基Ｒに含まれる、最も長い分子鎖が８原子以上であることが好ましい。
　実施形態による化合物の各部位は、上記したとおりの構造を有するものであるが、実施形態による化合物は、下記式（１－０１）～（１－２１）で表される構造を有するものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　これらのうち、（１－０１）および（１－０２）はリポソームに用いた場合に優れた特性を発揮することができるので特に好ましい。
［化合物の製造方法］
　本発明による化合物は任意の方法で製造することができる。例えば、化合物（１－０１）および（１－０２）は、例えば下記の工程図に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［脂質粒子］
　実施形態に寄れば脂質粒子が提供される。この脂質粒子の代表例はリポソームであるが、それに限定されず、核酸等と複合したリポプレックスなども包含される。またリポソームは、一枚膜リポソーム、多重層膜リポソームのいずれであってもよい。
　実施形態による脂質粒子は、上記した式（１）で表される化合物を含むものである。また、望ましくは膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含むものである。
　膜を形成する脂質とは、一般的にリポソームに用いられる脂質であれば、任意に用いることができる。この脂質は生分解性に優れた脂質であることが好ましい。
　このような膜を形成する脂質の具体例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドなどである。実施形態において脂質粒子に用いる膜を形成する脂質は目的とするリポソームのサイズや生体中におけるリポソームの安定性などを考慮して適切に選択される。これらのうち、ジアシルホスファチジルコリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミンは好ましいものである。ここで脂質に含まれるアシル基の炭化水素鎖の長さは１０～２０であることが好ましい。この炭化水素鎖は飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。
　このような膜を形成する脂質は種々のものが知られており、例えば、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０　ＤＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０　ＤＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０　ＤＡＰ）、
Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール
などを好ましいものとして挙げることができる。また、これらのうちＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、またはコレステロールがより好ましく、ＤＯＰＥとコレステロールの組み合わせ、ＤＯＴＡＰとコレステロールの組み合わせ、ＤＯＰＥとＤＯＴＡＰとコレステロールの組み合わせが特に好ましい。これらは、リポソーム等の膜を形成する機能に加えて、膜の融合効果も発揮することができる。
　実施形態に用いられる、凝集を低減できる脂質は、脂質粒子の調合中に粒子同士の凝集を含む機能を発揮するものである。このような脂質としては種々のものが知られており、実施形態による脂質粒子には任意のものを選択して用いることができる。このような脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、オメガ－アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）、モノシアロガングリオシドなどが挙げられる。より具体的には、米国特許第６，３２０，０１７号に挙げられている、ＡＴＴＡ８－ＤＰＳＥなどのＡＴＴＡ脂質や、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号、および同第５，８８５，６１３号に記載されているポリエチレングリコール脂質コンジュゲートを用いることができる。
　ＰＥＧ修飾脂質は、脂質粒子が形成されたときに、脂質粒子の表面にアンカリング脂質部分を形成することができる。このようなＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば特許第３９２０３３０号明細書に記載されているＣ１４　ＰＥＧ－ＣｅｒまたはＣ２０　ＰＥＧ－Ｃｅｒ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール（例えばト１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール－メトキシポリエチレングリコール；ＰＥＧ－ＤＭＧ）およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。このうち、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが特に好ましい。
　ＰＥＧなどの嵩高い修飾基を脂質表面に結合させる場合、修飾基と脂質粒子との結合が脂質粒子ないしリポソームの安定性に影響する。例えば米国特許第５，８２０，８７３号には、ＰＥＧ修飾脂質におけるアシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、および立体障害頭部基のサイズなどの特性が、脂質粒子の安定性に影響を及ぼすことを示している。したがってこれらの特性を調整することで、目的に応じた脂質粒子を得ることができる。例えば、ＰＥＧ修飾脂質における修飾基を短くすることによってより早く脂質粒子を喪失させたり、修飾基を長くすることによって、血漿中の滞留時間を長くすることなどが可能である。
その結果、脂質粒子の標的組織への送達を改善できる場合もある。
　脂質粒子は、さらにその他の脂質を含むこともできる。このようなその他の脂質は、脂質粒子において一般的に用いられている物から任意に選択して用いることができる。例えば、毒性を調整するために、相対的に毒性の低い脂質を組み合わせることができる。また、脂質粒子に配位子を結合させるための官能基を導入するために、特定の構造を有する脂質を組み合わせることもできる。
　さらには脂質粒子をリポソームとして用いる場合には、その内包物の漏出を抑制するための脂質としてステロール、例えばコレステロールを含むこともできる。さらに脂質粒子に標的作用物質をカップリングさせることもできる。このような場合のカップリング方法は、従来知られている任意の方法を採用することができる。
　また、実施形態による脂質粒子は、下記式（２）：
　Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２　　　　（２）
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立にＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１～Ｃ６アルキレンであり、Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
で表され、
　構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含む化合物をさらに含むことが好ましい。
　式（２）で表される化合物も生分解性を有する脂質化合物である。式（１）の化合物に対して、式（２）の化合物を組み合わせることで、新たな機能を発現させることが可能となる。例えば、式（２）の化合物をリポソームに適用した場合、核酸の内包量を向上させることができ、式（１）の化合物と式（２）の化合物をリポソームに適用した場合には、遺伝子治療や核酸医療、ゲノム診断などへの応用しやすくなる。
　式（２）の化合物のひとつの特徴は、式（２）中のＰがエーテル結合を含むことである。すなわち、Ｐは少なくとも一つの酸素を含み、その酸素は二つの炭素と結合している。
Ｐが含む酸素の数は特に限定されないが、好ましくは１～２個の酸素を含む。また、Ｐが含む炭素の数も特に限定されないが、Ｐに含まれる炭化水素鎖は炭素数が１～３であることが好ましく、Ｐに含まれる炭素の総数が３～８個であることが好ましい。好ましいＰとして、以下のものが挙げられる。
　－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－
　－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－
　－（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｏ－（ＣＨ２）２－
　－（ＣＨ２）３－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－
　－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－
　このような構造を有することによって。立体構造の自由度が高くなる。この化合物をリポソームの構成に用いた場合、エーテル結合に含まれる酸素が、組み合わされる核酸等と水素結合を形成するため、核酸等の内包量が多くなる。
　また、Ｘは三級アミン構造を含む２価連結基であり、好ましくはメチルイミノ、１，２－ピロリジンジイル、および１，３－ピロリジンジイルからなる群から選ばれる。この化合物をリポソームの構成に用いた場合、三級アミン構造によって、高い細胞膜透過性が発揮される。
　式（２）中、－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚは、疎水部を構成している。この疎水部には生分解性基を含んでいる。ここで、生分解性基は、カルボン酸エステル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、チオカルボン酸エステル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－）、ジチオカルボン酸エステル結合（－Ｃ（＝Ｓ）－Ｓ－）、アミド結合（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、カルバメート結合（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボキシジオキシ結合（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、および尿素結合（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）からなる群から選ばれる。
　この生分解性基は、Ｙとして構造中に存在する場合の他、Ｚに含まれている場合もある。すなわち、Ｚが脂溶性ビタミンやステロールに由来する基であり、その構造中にカルボン酸エステル基などが含まれていてもよい。また生分解性基は、ＺとＹとの両方に含まれていてもよいし、またいずれかが２つ以上の生分解性基を含んでいてもよい。
　ＹおよびＷ’は、ＷとＺとを連結する２価基である。
　Ｙは、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基である。またＷ’は、単結合またはＣ１～Ｃ６アルキレンである。
　これらは元素を含まない単結合であってもよい。一方で、Ｚが生分解性基を含まない場合には、Ｙは生分解性基を含む。
　Ｚは、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である。これらのうち、脂溶性ビタミン残基またはステロール残基が好ましく、脂溶性ビタミン残基がより好ましい。
　脂溶性ビタミン残基は、脂溶性ビタミンから誘導される基である。脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、レチナール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、およびトコトリエノールが挙げられる。これらの脂溶性ビタミンは末端にヒドロキシを有する。脂溶性ビタミン残基の一例は、これらのヒドロキシから水素が脱離したものである。また、脂溶性ビタミン誘導体に由来する基を用いることもできる。この脂溶性ビタミン誘導体とは、脂溶性ビタミンに含まれるヒドロキシが、チオヒドロキシ、カルボキシ、チオカルボキシ、またはジチオカルボキシに置換された化合物である。これらの脂溶性ビタミン残基は、末端に－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、または－Ｃ（＝Ｓ）－Ｓ－を有する。脂溶性ビタミン残基のうち、特に好ましいものは、レチノール（ビタミンＡ）、トコフェロール（ビタミンＥ）、またはそれらのカルボン酸誘導体に由来する基である。
　ステロール残基は、ステロールから誘導される基である。ステロールとしては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、およびエルゴステロールが挙げられる。ステロール残基の一例は、これらステロールのヒドロキシから水素が脱離したものである。また、ステロール残基は、前記した脂溶性ビタミン誘導体に由来する基と同様の末端基を有していてもよい。特に好ましいステロール残基は、ステロール、コレステロール、またはそれらのカルボン酸誘導体に由来する基である。
　Ｃ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基は、直鎖状、分岐鎖状のいずれであってもよく、また環状構造を有していてもよい。また、脂肪族炭化水素基は、不飽和結合を含んでいてもよく、含む場合には一般に６個以下、好ましくは３個以下の不飽和結合を含む。脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１２～１８であり、より好ましくは１３～１７である。
　これらのＺのうち、紫外線を吸収する構造を含むものが好ましい。具体的にはシクロヘキセン構造を含むことが好ましい。このように紫外線を吸収する構造を含むことによって、この化合物を成分として含有する脂質粒子の光による劣化の軽減することができ、また脂質粒子の挙動解析が必要な場合に、その解析を容易にすることが可能となる。
　なお、式（２）の化合物は、二つの［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］を含み、それぞれのＸ、Ｗ、Ｙ、Ｗ’、Ｚは独立であって、同一であっても異なっていてもよいが、同一であって化合物の構造が対象であることが好ましい。
　実施形態による化合物の各部位は、上記したとおりの構造を有するものであるが、実施形態による化合物は、下記式（２－０１）～（２－１２）で表される構造を有するものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　これらのうち、（２－０１）～（２－０４）は、式（１）の化合物と組み合わせてリポソームに用いた場合に優れた特性を発揮することができるので特に好ましい。
　式（２）の化合物は、例えば下記の工程図に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　これらの脂質を組み合わせて脂質粒子が構成されるが、その脂質粒子を構成する各脂質の配合比は目的に応じて調整されるので、限定されるものではない。しかし、脂質粒子に用いられる脂質の総モル数を基準として、一般に、
式（１）および（２）で表される脂質化合物を合計２５～７５モル％、
膜を形成する脂質を２５～７５モル％、
凝集を低減できる脂質を、１～１０モル％
で配合されるのが一般的であり、好ましくは
式（１）および（２）で表される脂質化合物を合計３０～６０モル％、
膜を形成する脂質を３０～６５モル％、
凝集を低減できる脂質を、１～１０モル％、例えば２．５モル％
である。ここで、式（１）の化合物と、膜を形成する脂質とのバランスが重要であり、一方だけが存在しても活性剤の導入率が十分高くならない。このため、式（１）または（２）の化合物と、膜を形成する脂質との配合比は、モル数基準で１：０．５～１：３であることが好ましく、１：０．７５～１：２．１であることがより好ましい。
　なお、式（１）または（２）で表される化合物はいずれも、膜を形成する脂質としても機能するが、実施形態においては、「膜を形成する脂質」は、式（１）または（２）の化合物を包含しないものとする。
　実施形態による脂質粒子は、さらに活性剤を含むことができる。実施形態において活性剤とは、細胞、組織、器官、または被検体に特定効果を与えることのできる物質である。特定効果は、生物学的、生理学的、または美容的効果のいずれであってもよい。実施形態による脂質粒子を用いることで、さまざまな活性剤を生体内の目的部位に送達することができる。この活性剤は、脂質粒子の内部に封入されていても、外側または内側の脂質表面に結合していても、また脂質層の内部に配置されていてもよい。
　活性剤の典型的な例は核酸であり、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸が挙げられる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、ａＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｍＲＮＡなどを用いることもできる。異なる種類のＤＮＡやＲＮＡを組み合わせて用いてもよい。
　ｍｉＲＮＡとしては、ヌクレオチド単位が１７～２５個連結したｍｉＲＮＡを用いることができる。）。１つのより好ましい実施形態では、核酸はヌクレオチド単位が１５～５０個または２０～３０個連結したオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、例えば、ヌクレオチド単位を１６～３０個を含み、二本鎖領域を有するものあることができる。別の実施形態では、核酸は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スーパーｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣体、またはｍｉＲＮＡインヒビターである。スーパーｍｉｒとは、ＲＮＡもしくはデオキシリボ核酸ＤＮＡ、またはこれらの両方、あるいは、これらの変性体の一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーであって、ｍｉＲＮＡと実質的に同一のヌクレオチド配列を有するとともに、その標的に対してアンチセンスであるオリゴマーまたはポリマーを指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣する目的で用いることのできる分子群を表す。したがって、「ｍｉＲＮＡ模倣体」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入れるとともに、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡ模倣体は、内在性ｍｉＲＮＡの供給源から精製することによっては得られない）。
　核酸を脂質粒子に組み合わせる場合、核酸の形態は特に限定されない。この核酸は、例えば、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＲＮＡの例としてはｓｉＲＮＡが挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ酵素、ｍｉＲＮＡ、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
　実施形態による脂質粒子は、核酸を含む場合には、核酸と結合する化合物をさらに含むことができる。このような化合物としては、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドが挙げられ、好ましくはプロタミン、ヒストン、およびそれらの塩が挙げられる。たとえばヒストンおよびその塩は、核酸と結合し、核酸分子を畳み込む性質をもっている。またプロタミンは、核酸と結合し、さらにその核酸を巻き込む性質を持っている。このため、これらの化合物は脂質粒子に核酸を封入するのに有効である。
　また、実施形態による脂質粒子は、細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含むことができる。細胞内での核酸の発現を調整することによりリポソームが送達された細胞に対して、可視化や細胞死の効果が得られるので、好ましい。このような化合物としてはレチノイン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、アスコルビン酸などが挙げられる。
　また、実施形態による脂質粒子は、リポタンパク、アポリポタンパクなどを含んでいてもよい。
　活性剤として、その他の治療剤を用いることもできる。用いることのできる治療剤の具体例は、ペプチド、ポリペプチド、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、ホルモンなどが挙げられる。より具体的には、治療剤は、抗炎症化合物、抗うつ薬、興奮薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、血管新生阻害剤、細胞血管作動薬（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ　ａｇｅｎｔｓ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬、腫瘍薬、ホルモン、およびステロイドが挙げられる。
　脂質粒子に活性剤を組み合わせる場合、活性剤がより高い導入率で脂質粒子に導入されることが好ましい。また、脂質の特性に依存する細胞毒性による細胞死が低いことも好ましい。従来知られている脂質粒子を用いて核酸を導入した場合、一般的には導入率が低く、細胞毒性による細胞死の割合も高かった。これに対して、本実施形態による脂質粒子を用いた場合には、核酸の導入率が高く、細胞死も低減することができる。具体的には、従来の脂質粒子においては、導入率が１０％程度、エレクトロポレーションによる細胞死が６０～７０％であるのに対して、実施形態による脂質粒子を用いた場合には、それぞれ７０％以上、３０％以下に低減される。
　実施形態による脂質粒子は、目的に応じて任意の大きさに形成させることができる。しかしながら、実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いようとする場合には、脂質粒子はナノオーダーサイズの粒子とされるのが一般的である。具体的には、実施形態による脂質粒子の平均粒子径は、一般に５０ｎｍ～３００ｎｍであり、好ましくは５０ｎｍ～２００ｎｍである。脂質粒子のサイズは、任意の方法で調整することができる。例えば、超音波処理によって脂質粒子を小さくすることができる。また、ポリカーボネート膜やセラミック膜を透過させて、脂質粒子を分別することでサイズ調整をすることもできる。なお、実施形態において、脂質粒子の平均粒子径は、例えば動的光散乱法を用いたゼータサイザーによって測定することができる。
　また実施形態による脂質粒子のインビボ半減期（ｔ１／２）は、一般に３時間未満であり、好ましくは２時間未満、特に好ましくは１時間未満である。ここで、インビボ半減期とは、例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中の半減期を意味する。実施形態においては、脂質を構成する式（１）の化合物が生分解性基を有することによって、生分解性基を含まない脂質からなる脂質粒子に比較して、半減期が例えば１０％未満となっている。
［脂質粒子の製造方法］
　実施形態による脂質粒子は、従来知られている任意の方法で製造することができる。脂質粒子やリポソームを製造する方法としては、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などが知られており、それらを採用することもできる。また、例えば、式（１）で表される化合物、さらには膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とを、アルコールなどの有機溶媒に導入し、水性緩衝液を添加することで自然発生的に脂質粒子を形成させることもできる。この水性緩衝液に活性剤を組み合わせておくことで、脂質粒子に活性剤を導入することが可能である。
［脂質粒子の用途］
　本実施形態による脂質粒子は、活性剤を細胞へ送達するために使用することができる。特に核酸等の活性剤の細胞への送達は、遺伝子工学、組み換えタンパク質の生産、及び遺伝子治療や細胞診断として知られている医療技術など、あらゆる分野で用いられる。一つの実施形態では、実施形態による脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする、活性剤を細胞へ送達するための組成物が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための、実施形態による脂質粒子が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための方法であって、該活性剤を含む実施形態による脂質粒子を細胞に接触させる（例えば、前記脂質粒子を被験体に投与する）ことを含む方法が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための、請求項９～２２のいずれか１項に記載の脂質粒子の使用が提供される。一つの実施形態では、前記脂質粒子は、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含むものとされ、好ましくは、式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比は１未満とされる。一つの実施形態では、前記細胞は腫瘍細胞とされる。前記被験体は、好ましくはそのような処置を必要とする動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトとされる。これらの用途につき、以下に具体的に説明する。
［組成物］
　本実施形態による脂質粒子は、組成物として用いることができる。例えば、本実施形態の脂質粒子と担体とを含む組成物が提供される。このような組成物は医薬用途にも適用できるものである。
　担体としては、従来知られているものから任意に選択して用いることができるが、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液、緩衝液などが挙げられる。さらにこれらの担体に加え、安定性を改良するなどの目的で、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリンなどの糖タンパクを組合せてもよい。
　実施形態による組成物は、標準的な方法により調製することができる。担体としては、生理食塩水が用いられることが一般的である。食塩水またはその他の塩含有担体を含む組成物中では、担体は好ましくは、脂質粒子の形成の後に加える。したがって、脂質粒子と核酸などの活性剤を組み合わせた後に、その組成物を生理食塩水のような製薬学的に許容可能な担体で置換または希釈することが一般的である。
　実施形態による組成物は、必要に応じて補助剤を含んでもよい。たとえば、医薬用途の場合、製薬学的に許容可能な補助剤、例えばｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤などを補助剤として含めることで、医薬組成物を生理的状態に近づけることができる。このような機能を奏する補助剤としては、ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリド、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられる。また、実施形態による組成物は、貯蔵安定性を改良するための脂質保護剤を含むこともできる。このような保護剤としては、フリーラジカルによるダメージを抑制する、α－トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャーや、脂質の過酸化損傷を抑制するフェリオキサミンのような水溶性キレーターが挙げられる。
　その他、前記した活性剤などを組成物に添加することもできる。この活性剤は、脂質粒子に組み合わせた活性剤と同一のものであっても、異なったものであってもよい。また、核酸と結合する化合物や核酸の発現を調整する化合物を組成物に添加することもできる。
　実施形態による組成物中に含まれる脂質粒子の濃度は、特に限定されず、組成物中に含まれる脂質粒子の含有率は、一般に０．０１～３０質量％、好ましくは０．０５～１０質量％である。脂質粒子の濃度は、目的に応じて適切に選択することができる。
　実施形態による組成物は、従来の周知の方法によって滅菌することができる。滅菌された組成物は、そのまま投与可能な製剤として包装することのほか、乾燥させて包装することもできる。乾燥した組成物は、投与の直前に滅菌水溶液と組み合わせることで投与可能な調製物とすることができる。
　実施形態による組成物は、キット形態とすることもできる。実施形態によるキットは、前記した脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含むが、その形態は任意である。例えば活性剤を含まない脂質粒子を担体に分散させた分散物と活性剤とを個別容器に収容したキットや、乾燥させた脂質粒子と、活性剤と、担体とを個別容器に収容したキットなどが挙げられる。さらに、乾燥させた脂質粒子または脂質粒子分散物と、活性剤とを個別の製品とし、利用者が各製品を目的に応じて選択できるようにすることもできる。
　該キットには、核酸導入の際に使用する試薬を組み合わせることができる。
［医薬組成物の利用方法］
　実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いた場合、組成物は、ヒトまたは動物の各種疾病の治療または診断に用いることができる。例えば、脂質粒子と組み合わせる活性剤として治療剤を適用することで治療剤を目的細胞に送達することで治療が可能となる。
　例えば、各種の核酸を細胞に送達して接触させて疾患の予防又は治療をすることが可能である。このような核酸としては、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、アンチセンス、またはリボザイムが挙げられる。これらの実施形態による脂質化合物は、これらの核酸を効率かつ迅速に取り込むことができる。例えば、ＲＮＡを短時間に、かつ安全に脂質粒子に導入することは、従来は難しかったが、実施形態による脂質化合物を用いることによって、それが容易に行うことが可能となる。
　脂質粒子の調製に用いる脂質化合物や膜を形成する化合物を適切に組み合わせることによって、より効果的な細胞ターゲティングも可能となる。具体的には、化合物（１－０１）、化合物（２－０１）、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、肝癌細胞への送達に、化合物（１－０１）または化合物（１－０２）、ＤＯＴＡＰ、およびコレステロールの組み合わせはＴ細胞性白血病細胞への送達に、化合物（１－０１）、化合物（２－０１）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、乳がん細胞への送達に、好適に用いることができる。
　また、脂質粒子の調製に用いる脂質化合物や膜を形成する化合物を適切に組み合わせることによって、より効果的な診断、治療および予防も可能となる。具体的には、化合物（１－０１）、化合物（２－０１）、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、肝癌の診断、治療および予防に、化合物（１－０１）または化合物（１－０２）、ＤＯＴＡＰ、およびコレステロールの組み合わせはＴ細胞性白血病の診断、治療および予防に、化合物（１－０１）、化合物（２－０１）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、乳がんの診断、治療および予防に好適に用いることができる。
　また、核酸の送達は、インビトロまたはインビボのいずれで行うことができる。インビボ投与の方法としては、医薬組成物は、好ましくは非経口投与、すなわち、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が採用される。医薬組成物の静脈内投与または腹腔内投与を、ボーラス注入によって行うこともできる。
　また、実施形態による医薬調製物を標的組織に直接塗布して、医薬組成物を標的組織に接触させることもできる。また、点滴による髄膜等への投与、内視鏡器具による投与も可能である。
　特定の実施形態では、医薬組成物による処理は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、１～２４時間、好ましくは２～８時間の期間で行われる。インビトロによる適用において、対象となる細胞は特に限定されない。例えば、脊椎動物の細胞であっても、非脊椎動物の細胞であっても、あるいは植物の細胞であってもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
［合成例１］　化合物（１－０１）の合成
　前記した製造プロセスに従って、化合物（１－０１）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。
第１工程
　アルゴン雰囲気下、５００ｍＬフラスコにマグネシウム（１７．３８ｇ、７１４．９６ｍｏｌ、４．４ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）とヨウ素（７ｍｇ）を仕込んだ。９－ブロモノン－１－エン（１００．００ｇ、４８７．４７ｍｏｌ、３ｅｑ．）を室温下で数滴滴下した後、還流させながら２　時間かけて滴下した。室温で一晩熟成させ、滴下漏斗にグリニャール試薬をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で洗い込みながら移した。ギ酸エチル（１２．０４ｇ、１６２．４９ｍｏｌ、１ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）を仕込んだ１０００ｍＬ４つ口フラスコに、０℃以下で１．５時間かけてグリニャール試薬を滴下した。
　１時間室温で反応させた後、アセトン（１００ｍＬ）を加え、水（２００ｍＬ）と１０％硫酸水溶液（２６７ｍＬ）を順次添加して分液した。水層をジエチルエーテル（３００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（７２．１ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７２１ｇ、展開：ヘキサン→３％酢酸エチル／９７％ヘキサン）で精製し、白色固体として中間体（１－０１－１）を４１．１ｇ（収率９８％）得た。
第２工程
　アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬフラスコに中間体（１－０１－１）（４１．１ｇ、１４６．５３ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をジクロロメタン（３３０ｍＬ）に溶解させて投入し、トリエチルアミン（５９．３１ｇ、５８６．１２ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン（１．７９ｇ、１４．６５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ．）を加えた。－５℃でメタンスルホニルクロリド（３３．５７ｇ、２９３．０６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を滴下した。室温で１時間攪拌後、氷水（１７．６ｍＬ）でクエンチした。続いて、１Ｎ塩酸（３０ｍＬ）と水（３００ｍＬ）、飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して、橙色オイルとして中間体（１－０１－２）を４９．６ｇ（収率９４％）得た。
第３工程
　アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬフラスコにＤＭＦ（３００ｍＬ）とシアン化ナトリウム（１３．５６ｇ、２７６．６５ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を仕込んだ。ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解した中間体（１－０１－２）（４９．６ｇ、１３８．３２ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を添加し、５５℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水（５００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（８００ｍＬ）で３回で抽出を繰り返した。抽出した有機層を水（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（８４．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０１２ｇ　展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間耐３を２８．１ｇ（収率７０％）を得た。
第４工程
　アルゴン雰囲気下、２０００ｍＬフラスコに中間体（１－０１－３）（２８．１ｇ、９７．０６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とヘキサン（２８０ｍＬ）を仕込んだ。－７０℃で１Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ－Ｈ）のｎ－ヘキサン溶液（１９４．１３ｍＬ、１９４．１３ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を滴下し、室温下で３０分攪拌させた。０℃に氷冷し、メタノール（１４ｍＬ）でクエンチした。この反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液（１２００ｍＬ）を加えて２０分攪拌し、１０％硫酸（４５０ｍＬ）を加えて分液した。続いてジエチルエーテル（５００ｍＬ）で２回で抽出した。抽出した有機層を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して黄色オイルとして中間体（１－０１－４）を２５．３ｇ（収率８９％）を得た。
第５工程
　１０００ｍＬフラスコに中間体（１－０１－４）（２５．３ｇ、８６．５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とメタノール（２５３ｍＬ）を仕込んだ。０℃で水素化ホウ素ナトリウム（１．１６ｇ、３０．２７ｍｍｏｌ、０．３５ｅｑ．）を少しずつ加え、室温下で終夜攪拌した。反応液に酢酸（７ｍＬ）をｐＨ４になるまで加えた。水（１６０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（４００ｍＬ）で３回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３０．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０４ｇ　展開：５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１－０１－５）を２２．１３ｇ（収率８７％）得た。
第６工程
　アルゴン雰囲気下、１０００ｍＬフラスコに中間体（１－０１－５）（２２．１３ｇ、７５．１４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をジクロロメタン（２２０ｍＬ）で溶かし、テトラブロモメタン（２９．９０ｇ、９０．１７ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ．）を加えた。０℃でジクロロメタン（６３ｍＬ）に溶かしたトリフェニルホスフィン（２９．５６ｇ、１１２．７１ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を滴下した。室温下で１　時間攪拌後、反応液を濃縮して得た粗体（２１．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ　展開：ヘキサン）で精製し無色透明オイルとして中間体（１－０１－６）を１４．５ｇ（収率５４％）を得た。
第７工程
　１０００ｍＬフラスコに６（５ｇ、１３．９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を入れ、クロロメタン（２３０ｍＬ）とアセトニトリル（２３０ｍＬ）に溶かし、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）　（１４５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、Ｒｕ＝４０％）を添加した。１０℃以下で水（１１５ｍＬ）に溶かした過ヨウ素酸ナトリウム（２９．９２ｇ、１３９．８９ｍｍｏｌ、１０ｅｑ．）を滴下し、室温下で終夜攪拌した。反応終了後、水（２３０ｍＬ）を加え、分液した。水層をジクロロメタン（１００ｍＬ×２　回）で抽出して合わせた有機層に飽和食塩水（２３０ｍＬ）を加え、色が変わるまで３％硫化ナトリウムを滴下した。１Ｍ塩酸を酸性になるまで加え、分液した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１４．７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３００ｇ　展開：クロロホルム→２％　メタノール／９８％クロロホルム）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１－０１－７）を２．７３ｇ（収率４９％）を得た。
第８工程
　１００ｍＬフラスコに７（２．７３ｇ、６．９４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をジクロロメタン（４５ｍＬ）に溶かし、シス－２－ノネン－１－オル（２．４１ｇ、１６．９３ｍｍｏｌ、２．４４ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン（８５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ．）、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４．３９ｇ、３４．０１ｍｍｏｌ、４．９ｅｑ．）　を仕込んだ。その後、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチル－カルボジイミド塩酸塩（３．２５ｇ、１６．９３ｍｍｏｌ、２．４４ｅｑ．）を加え、室温下で終夜攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン（４５ｍＬ）で希釈し、水（４５ｍＬ）、１Ｍ　塩酸（９０ｍＬ）、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（９０ｍＬ）、飽和食塩水（９０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３．７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３７ｇ　展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し、中間体（１－０１－８）を微黄色オイルとして１．６２ｇ（収率３６％）得た。
第９工程
　５０ｍＬ　のオートクレーブに８　（１．６２ｇ、２．５２ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をＴＨＦ（３０ｍＬ）で溶かし、Ｎ，Ｎ，Ｎ’トリメチルエチレンジアミン（５．１６ｇ、５０．４８ｍｍｏｌ、２０ｅｑ．）と炭酸カリウム（１．２６ｇ、９．０９ｍｍｏｌ、３．６ｅｑ．）を仕込んだ。５５℃に加温して６日間反応させた。反応終了後、反応液を室温に戻して、ジクロロメタン（６０ｍＬ）で希釈し、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。水層をジクロロメタン（２０ｍＬ）で３回抽出して、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（２．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２５ｇ　展開：クロロホルム→５％メタノール／９５％クロロホルム）で精製し微黄色オイルとして、目的の化合物（１－０１）１．２１ｇ（収率７２％）を得た。
［合成例２］　化合物（２－０１）の合成
　前記した製造プロセスに従って、化合物（２－０１）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。
　アルゴン雰囲気下、２００ｍＬフラスコ中ニトリエチレングリコール５．００ｇ（３３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１４．３９ｍＬ（１１２ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（５０ｍＬ）を導入した。０℃でメタンスルホニルクロライド７．９７ｍＬ（１０３ｍｍｏｌ）を滴下後、室温で１時間撹拌した。続いて、エタノール１０ｍＬを滴下し、未反応のメタンスルホニルクロライドを処理した後、濾過した。濾過後の反応液を５０ｍＬのジクロロメタンで４回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。乾燥後の反応液を濾過した後、濃縮して、橙色オイル状の中間体（２－０１－１）を８．２１ｇ得た（収率８１％）。
　次に、１００ｍＬフラスコに中間体（２－０１－１）を８４２ｍｇ（２．７５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３を９５０ｍｇ（６．８７ｍｍｏｌ）およびアセトニトロル１５ｍＬを導入した。室温で１５分撹拌後、３－（メチルアミノ）－１－プロパノール７３５ｍｇ（８．２５８ｍｍｏｌ）を滴下した。７０℃に保温しながら一晩撹拌した。反応液を放冷後、不溶物を濾過により除去した。濾液を濃縮して粗製物７２０ｍｇを得た。この粗製物を、カラムクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル１５ｇ、展開液５０％ヘキサン／クロロホルム）により精製して、微黄色透明オイル状の中間体（２－０１－２）を３４８ｍｇ得た（収率４３％）。
　３０ｍＬナスフラスコに中間体（２－０１－２）を３００ｍｇ（１．０３ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン１０ｍＬを導入し、レチノイン酸７７０ｍｇ（２．５６ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン５０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミドハイドロクロライド５９０ｍｇ（３．０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。続いて反応液を１０ｍＬの水で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。乾燥後の反応液を濾過した後、濃縮して、粗製物２．１ｇを得た。この粗製物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｇ、展開液５０％ヘキサン／クロロホルムおよびクロロホルム）により精製して、濃橙色オイル状の化合物（２－０１）を２６２ｍｇ得た（収率２９％）。
（脂質化合物を含むＤＮＡ／ペプチド・コア複合体内包リポソームの調製）
　ベクターＤＮＡ溶液とＤＮＡ凝縮ペプチドを用いて、ベクターＤＮＡ－ＤＮＡ凝縮ペプチドからなるコア複合体を調製した。ベクターＤＮＡとして、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー、Ｎｌｕｃ遺伝子、転写終結シグナルを組込んだプラスミドを使用した。ＤＮＡ凝縮ペプチドとして、ｍＨＰ－１（ＲＱＲＱＲ－ＹＹ－ＲＱＲＱＲ－ＧＧ－ＲＲＲＲＲＲ：配列番号１）とｍＨＰ－２（ＲＲＲＲＲＲ－ＹＹ－ＲＱＲＱＲ－ＧＧ－ＲＲＲＲＲＲ：配列番号２）を１：３の割合で混合した混合物を使用した。
　マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、ＤＮＡ凝縮ペプチド溶液（０．２４　ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）１００μｌを分注した。分注したペプチド溶液をボルテックスミキサー（１，５００ｒｐｍ）（ＭＳＶ－３５００（商品名）、ＢＩＯＳＡＮ社製）で撹拌しながら、ベクターＤＮＡ溶液（０．１５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）２００μｌを滴下して混合した。
　コア複合体を内包するリポソームは、エタノール注入法で調製した。マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、表１に示された配合比の脂質溶液を、それぞれ５０μｌ分注した。ここで、比較に用いる化合物として、式（Ｒ－０１）で表される化合物を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　分注した脂質溶液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、コア複合体５０μｌを滴下して混合した。滴下後、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）４００μｌを穏やかに添加して、ベクターＤＮＡ内包リポソームを調製した。更に１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を４００μｌ加え、穏やかに混合した後、限外濾過スピンカラム（ＰＴ－１０１４（商品名）、株式会社アプロサイエンス製）を用いて、遠心によるバッファー交換と濃縮をおこない、１００μＬのコア複合体内包リポソーム（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を調製した。
［内包ＤＮＡ量の評価］
　得られたリポソームについて、内包ＤＮＡ量の測定を行った。測定は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でおこなった。０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（商品名）を含むＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液９５μＬに、リポソーム溶液５．０μＬを加えて穏やかに縣濁した。室温に３０分間静置した後、溶液にＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液で２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液１００μＬを加えてよく混合した。室温に５分間静置した後、溶液の蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）をマイクロタイタープレートリーダー：Ｍｉｔｈｒａｓ　ＬＢ－９４０（商品名、ベルトール社製）で測定した。
ＤＮＡ濃度は、既知濃度のλＤＮＡで作成した検量線を用いて定量した。得られた数値から、リポソーム内包ＤＮＡ量を、溶液１ｍＬあたりのＤＮＡ量（μｇ　ＤＮＡ／ｍＬ）として算出した。結果は表２に示した通りである。
　式（１－０１）の化合物を含むリポソームは、式（Ｒ－０１）の化合物を含むリポソームより、内包ＤＮＡ量が高いことが明らかとなった。また、脂質化合物として式（２）の化合物を組み合わせると内包ＤＮＡ量が多くなることも確認された。
［リポソーム表面電荷の測定］
　リポソームの表面電荷（ゼータ電位）を、ゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳ（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）で測定した。ゼータ電位測定用セル（ＤＴＳ－１０７０（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）にリポソーム溶液３０μｌを分注し、蒸留水８７０μｌを加えて混合した後、セルをゼータサイザーにセットしてゼータ電位を測定した。得られた結果は表２に示すとおりであった。
　膜を形成する脂質として、中性脂質であるＤＯＰＥのみ使用した場合（実施例１－４）と、ＤＯＰＥに対してカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰを組み合わせた場合（実施例１－６）とを比較すると、後者のほうがゼータ電位をよりプラス側にシフトさせることができることがわかった。
［リポソームによるベクターＤＮＡ導入量の測定］
　リポソームによる細胞へのベクターＤＮＡの導入は、ベクターＤＮＡ上のＮｌｕｃ遺伝子の発現により定量化した。ＮＬｕｃ遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー：　ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００（製品名、Ｔｅｃａｎ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒト乳がん由来の細胞株ＭＣＦ－７、ヒト肝臓がん由来の細胞株Ｈｕｈ－７（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を使用した。９６穴培養プレートに、１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ播種した後、表１に示されるリポソーム溶液を１μＬ添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、ＮＬｕｃの酵素活性を測定した。ＮＬｕｃの酵素活性は、ＮａｎｏＧｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（製品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は図１（Ｊｕｒｋａｔ）、図２（ＭＣＦ－７）、図３（Ｈｕｈ－７）に示すとおりであった。
　式（１）の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物を選択することで、比較に用いた（Ｒ－０１）よりも高いＮｌｕｃ遺伝子発現効率を示すことが確認できた。
　また、リポソームにより細胞内に取り込まれたＮｌｕｃ遺伝子発現効率は、式（１）の脂質化合物に式（２）の化合物を組み合わせることで、浮遊性よりも付着性の細胞に取り込まれやすくなることが示された。さらにＤＯＴＡＰの有無で表面電荷を制御することにより、増殖様式の異なる細胞へ指向性があることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
［合成例３］　化合物（１－０２）の合成
　前記した製造プロセスに従って、化合物（１－０２）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。
第１工程
　アルゴン雰囲気下、５００ｍＬフラスコにマグネシウム（１７．３８ｇ，７１４．９６ｍｍｏｌ，４．４０ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）とヨウ素（７ｍｇ）を仕込んだ。９－ブロモノン－１－エン（１００．００ｇ，４８７．４７ｍｏｌ，３．００ｅｑ．）を室温下で数滴滴下した後、還流させながら２　時間かけて滴下した。室温で一晩熟成させ、滴下漏斗にグリニャール試薬をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で洗い込みながら移した。ギ酸エチル（１２．０４ｇ，１６２．４９ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）を仕込んだ１０００ｍＬ４つ口フラスコに、０℃以下で１．５　時間かけてグリニャ－ル試薬を滴下した。１時間室温で反応させた後、アセトン（１００ｍＬ）を加え、水（２００ｍＬ）と１０％硫酸（２６７ｍＬ）を順次添加して分液した。水層をジエチルエーテル（３００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（７２．１ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７２１ｇ，展開：ヘキサン→３％酢酸エチル／９７％ヘキサン）で精製し、白色固体として中間体（１－０２－１）を４１．１ｇ（収率９８％）得た。
第２工程
　アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬ　フラスコに中間体（１－０２－１）（４１．１ｇ，１４６．５３ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（３３０ｍＬ）で溶解させて投入し、トリチルアミン（５９．３１ｇ，５８６．１２ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン（１．７９ｇ，１４．６５ｍｍｏｌ，０．１０ｅｑ．）を加えた。－５℃でメタンスルホニルクロリド（３３．５７ｇ，２９３．０６ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を滴下した。室温で１時間攪拌後、氷水（１７．６ｍＬ）でクエンチした。続いて、１Ｎ塩酸（３０ｍＬ）と水（３００ｍＬ）、飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して、橙色オイルとして中間体（１－０２－２）を４９．６ｇ（収率９４％）得た。
第３工程
　アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬ　フラスコにＤＭＦ（３００ｍＬ）とシアン化ナトリウム（１３．５６ｇ，２７６．６５ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を仕込んだ。ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解した中間体（１－０２－２）４９．６ｇ，１３８．３２ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を添加し、５５℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水（５００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（８００ｍＬ×３　回）で抽出した。抽出した有機層を水（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（８４．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０１２ｇ、展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１－０２－３）を２８．１ｇ（収率７０％）を得た。
第４工程
　アルゴン雰囲気下、２０００ｍＬ　フラスコに中間体（１－０２－３）（２８．１ｇ，９７．０６ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）とヘキサン（２８０ｍＬ）を仕込んだ。－７０℃で１Ｍ　ＤＩＢＡＬ－ｎ－ヘキサン（１９４．１３ｍＬ，１９４．１３ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を滴下し、室温下で３０分攪拌させた。０℃に氷冷し、メタノール（１４ｍＬ）でクエンチした。この反応液に飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１２００ｍＬ）を加えて２０　分攪拌し、１０％Ｈ２ＳＯ４（４５０ｍＬ）を加えて分液した。続いてジエチルエーテル（５００ｍＬ×２回）で抽出した。抽出した有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して黄色オイルとして中間体（１－０２－４）を２５．３ｇ（収率８９％）を得た。
第５　工程
　１０００ｍＬフラスコに中間体（１－０２－４）（２５．３ｇ，８６．５ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）と、メタノール（２５３ｍＬ）を仕込んだ。０℃で水素化ホウ素ナトリウム（１．１６ｇ，３０．２７ｍｍｏｌ，０．３５ｅｑ．）を少しずつ加え、室温下で終夜攪拌した。反応液に酢酸（７ｍＬ）をｐＨ４になるまで加えた。水（１６０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（４００ｍＬ×３回）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３０．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０４ｇ、展開：５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１－０２－５）を２２．１３ｇ（収率８７％）得た。
第６工程
　アルゴン雰囲気下、１０００ｍＬ　フラスコに中間体（１－０２－５）（２２．１３ｇ，７５．１４ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（２２０ｍＬ）で溶かし、テトラブロモメタン（２９．９０ｇ，９０．１７ｍｍｏｌ，１．２０ｅｑ．）を加えた。０℃でジクロロメタン（６３ｍＬ）に溶かしたトリフェニルホスフィン（２９．５６ｇ，１１２．７１ｍｍｏｌ，１．５０ｅｑ．）を滴下した。室温下で１　時間攪拌後、反応液を濃縮して得た粗体（２１．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ、展開：ヘキサン）で精製し無色透明オイルとして中間体（１－０２－６）を１４．５ｇ（収率５４％）を得た。
第７工程
　アルゴン雰囲気下で、２００ｍＬ　フラスコにエタノール　（９０ｍＬ）、２０％エトキシナトリウム（溶媒：エタノール）（５０．５５ｇ，１４８．５７ｍｍｏｌ，５．９０ｅｑ．）を仕込み、６５℃に加熱した。次いで、マロン酸ジエチル（２４．２０ｇ，　１５１．０９ｍｍｏｌ，６．００ｅｑ．）、中間体（１－０２－６）（９ｇ，２５．１８ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を加え、一晩加熱環流した。反応終了後、１０℃以下で１Ｎ塩酸（９０ｍＬ）を加え、クエンチした。反応液を酢酸エチル（２００ｍＬ×３回）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（９０ｍＬ）、飽和食塩水（９０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮し、橙色オイルとして中間体（１－０２－７）を７．３１ｇ（収率６６％）を得た。
第８工程
　２００ｍＬ　フラスコに中間体（１－０２－７）（７．３１ｇ，１６．７４ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）、ジメチルスルホキシド（７０ｍＬ）、塩化ナトリウム（９．７８ｇ，１６７．４０ｍｍｏｌ）を仕込み、一晩加熱環流した。反応終了後、反応液を濃縮して得た粗体（２１．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ　展開：ヘキサン→２％酢酸エチル／９８％ヘキサン）で精製し中間体（１－０２－８）を淡黄色オイルとして４．７ｇ（収率５１％）得た。
第９　工程
　アルゴン雰囲気下、２００ｍＬ４つ口フラスコにリチュムアルミニウムハイドライド　（７３４ｍｇ，１９．３４ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．）とＴＨＦ（４０ｍＬ）を仕込んだ。０℃でＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させた中間体（１－０２－８）（４．７ｇ，３４．５４ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を滴下し、室温で一晩反応させた。０℃に氷冷し、水（３．３ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム（０．８ｍＬ）でクエンチした。この反応液に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えてセライト濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）でセライトを洗浄した。濾液を濃縮して得た粗体（４．９ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、展開：５％酢酸エチル９５％ヘキサン）で精製し中間体（１－０２－９）を無色オイルとして３．８６ｇ（収率９３％）得た。
第１０工程
　アルゴン雰囲気下で、１００ｍＬ　フラスコに中間体（１－０２－９）（３．８６ｇ，１１．９７ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（３０ｍＬ）で溶解させて投入し、トリエチルアミン（４．８４ｇ，４７．８７ｍｍｏｌ，４．００ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン（１４６ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ，０．１０ｅｑ．）を加えた。－５℃でメタンスルホニルクロリド（２．７４ｇ，２３．９３ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を滴下した。室温で１時間攪拌後、氷水（１７．６ｍＬ）でクエンチした。続いて、１Ｎ塩酸（１０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して中間体（１－０２－１０）を褐色オイルとして、４．７９ｇ（収率９９％）得た。
第１１工程
　アルゴン雰囲気下で、１００ｍＬフラスコにＤＭＦ（２８ｍＬ）とシアン化カリウム（１．１７ｇ，２３．９４ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を仕込んだ。ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した中間体（１－０２－１０）（４．７９ｇ，１１．９７ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を添加し、５５℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３回）で抽出した。抽出した有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１１．４ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し中間体（１－０２－１１）を無色オイルとして、３．６ｇ（収率９０％）得た。
第１２工程
　アルゴン雰囲気下で、１００ｍＬフラスコに中間体（１－０２－１１）（３．６ｇ，　１０．８６ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）とヘキサン（３６ｍＬ）を仕込んだ。－７０℃で１Ｍ　ＤＩＢＡＬ－ｎ－ヘキサン（２１．７１ｍＬ，２１．７１ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）　を滴下し、室温下で３０　分攪拌させた。０℃に氷冷し、メタノール（１．６ｍＬ）でクエンチした。この反応液に飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１５０ｍＬ）を加え２０分攪拌し、１０％　硫酸（５０ｍＬ）を加えて分液した。続いてジエチルエーテル（５０ｍＬ×２回）で抽出した。抽出した有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して中間体（１－０２－１２）を黄色オイルとして、３．２ｇ（収率８８％）得た。
第１３工程
　１００ｍＬ　フラスコに中間体（１－０２－１２）（３．２ｇ，　９．５６ｍｍｏｌ，　１．００ｅｑ．）とメタノール（３２ｍＬ）を仕込んだ。０℃で水素化ホウ素ナトリウム（１２７ｍｇ，　３．３５ｍｍｏｌ，０．３５ｅｑ．）を少しずつ加え、室温下で一晩攪拌した。反応液に酢酸（１ｍＬ）をｐＨ４になるまで加えた。水（３０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン　（３０ｍＬ×３回）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３．１７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３２ｇ、展開：５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し中間体（１－０２－１３）を淡黄色オイルとして、１．１２ｇ（収率３５％）得た。
第１４工程
　アルゴン雰囲気下で、３０ｍＬ　フラスコに中間体（１－０２－１３）（１ｇ，　２．９７ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（１０ｍＬ）で溶かし、テトラブロモメタン（１．１８ｇ，３．５７ｍｍｏｌ，１．２０ｅｑ．）を加えた。０℃でジクロロメタン（５ｍＬ）に溶かしたトリフェニルホスフィン（１．１７ｇ，４．４６ｍｍｏｌ，１．５０ｅｑ．）を滴下した。室温下で１時間攪拌後、反応液を濾過濃縮して得た粗体（７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７０ｇ、展開：ヘキサン）で精製し中間体（１－０２－１４）を無色透明オイルとして、１．１２ｇ（収率９４％）得た。
第１５工程
　２００ｍＬフラスコに中間体（１－０２－１４）（１．１２ｇ，２．８０ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を入れ、ジクロロメタン（５１ｍＬ）とアセトニトリル（５１ｍＬ）に溶かし、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２９ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ，Ｒｕ＝４０％）を添加した。１０℃以下で水（５１ｍＬ）に溶かした過ヨウ素酸ナトリウム（５．９９ｇ，２８．０ｍｍｏｌ，１０．００ｅｑ．）を滴下し、１０℃以下で一晩攪拌した。反応終了後、水５１ｍＬ）を加え、分液した。有機層に飽和食塩水（５０ｍＬ）を加え、色が変わるまで３％Ｎａ２Ｓ水溶液を滴下した。１Ｎ塩酸を酸性になるまで加え、分液した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過濃縮して得た粗体（５．２４ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、展開：クロロホルム→５％メタノール／９５％クロロホルム）で精製し中間体（１－０２－１５）を微黄色オイルとして、１．０５ｇ（収率８６％）得た。
第１６工程
　１００ｍＬフラスコに中間体（１－０２－１５）（１．００ｇ，２．３０ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶かし、シス－２－ノネン－１－オル（７９７ｍｇ，５．６０ｍｍｏｌ，２．４４ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン（２８ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ，０．１０ｅｑ．）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．４５ｇ，１１．２５ｍｍｏｌ，４．９０ｅｑ．）　を仕込んだ。その後、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチル－カルボジイミド塩酸塩（１．０７ｇ，５．６０３ｍｍｏｌ，　２．４４ｅｑ．）　を加え、室温下で一晩攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン（３０ｍＬ）で希釈し、水（３０ｍＬ）、１Ｎ塩酸（３０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水（３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４　で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１．９２ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２０ｇ、展開：ヘキサン→２％酢酸エチル／９８％ヘキサン）で精製し中間体（１－０２－１６）を微黄色オイルとして、７７ｍｇ（収率５％）得た。
第１７工程
　５０ｍＬのオートクレーブに中間体（１－０２－１６）（７７ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をＴＨＦ（３ｍＬ）で溶かし、１－メチルピペラジン（２２５ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ，２０．００ｅｑ．）と炭酸カリウム（５６ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ，３．６ｅｑ．）を仕込んだ。５５℃に加温して６日間反応させた。反応終了後、反応液を室温に戻して、ジクロロメタン（６ｍＬ）で希釈し、水（５ｍＬ）を加えて分液した。水層をジクロロメタン（６ｍＬ×３回）で抽出して合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１０８ｍｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１ｇ、展開：クロロホルム→１０％メタノール／９０％クロロホルム）で精製し、濃黄色オイルとして化合物（１－０２）を５４ｍｇ（収率６８％）得た。
［脂質化合物を含むＤＮＡ／ペプチド・コア複合体内包リポソームの調製］
　ベクターＤＮＡ溶液とＤＮＡ凝縮ペプチドを用いて、ベクターＤＮＡ－ＤＮＡ凝縮ペプチドからなるコア複合体を調製した。ベクターＤＮＡとして、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー、Ｎｌｕｃ遺伝子、転写終結シグナルを組込んだプラスミドを使用した。ＤＮＡ凝縮ペプチドとして、ｍＨＰ－１（ＲＱＲＱＲ－ＹＹ－ＲＱＲＱＲ－ＧＧ－ＲＲＲＲＲＲ：配列番号１）とｍＨＰ－２（ＲＲＲＲＲＲ－ＹＹ－ＲＱＲＱＲ－ＧＧ－ＲＲＲＲＲＲ：配列番号２）を４：１の割合で混合した混合物を使用した。
　マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、ＤＮＡ凝縮ペプチド溶液（０．２５５　ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）１００μｌを分注した。分注したペプチド溶液をボルテックスミキサー（１ ，５００ｒｐｍ）（ＭＳＶ－３５００（商品名）、ＢＩＯＳＡＮ社製）で撹拌しながら、ベクターＤＮＡ溶液（０．１５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）２００ μｌを滴下して混合した。
　コア複合体を内包するリポソームは、エタノール注入法で調製した。マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、表３に示された配合比の脂質溶液を、それぞれ５０μｌ分注した。なお、表３中の参照例２－１および２－２は、前記した実施例１－２および１－４と同処方による別調製物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　分注した脂質溶液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、コア複合体５０μｌを滴下して混合した。滴下後、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）９００μｌを穏やかに添加して、コア複合体内包リポソームを調製した。限外濾過フィルター（ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ－５０（商品名）、メルク株式会社製）を用いて、遠心によるバッファー交換と濃縮を行い、コア複合体内包リポソーム３２ｍｌを６００μｌに調製した。
［内包ＤＮＡ量の評価］
　得られたリポソームについて、内包ＤＮＡ量の測定を行った。測定は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でおこなった。０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（商品名）とヘパリンナトリウム塩（シグマアルドリッチジャパン合同会社）を含む Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液９９．５μＬに、リポソーム溶液０．５μＬを加えて穏やかに縣濁した。室温に３０分間静置した後、溶液にＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液で２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液１００μＬを加えてよく混合した。室温に５分間静置した後、溶液の蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）をマイクロタイタープレートリーダー：Ｍｉｔｈｒａｓ　ＬＢ－９４０（商品名、ベルトール社製）で測定した。
　ＤＮＡ濃度は、既知濃度のλＤＮＡで作成した検量線を用いて定量した。得られた数値から、リポソーム内包ＤＮＡ量を、溶液１ｍＬあたりのＤＮＡ量（μｇ　ＤＮＡ／ｍＬ）として算出した。結果は表４に示した通りである。
　式（１－０２）の化合物を含むリポソームは、式（１－０１）の化合物を含むリポソームと、同等の内包ＤＮＡ量を示すことが明らかとなった。また、式（２－０１）の化合物を組み合わせると、内包ＤＮＡ量が多くなることも確認された。
［リポソーム表面電荷の測定］
　リポソームの表面電荷（ゼータ電位）を、ゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳ（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）で測定した。ゼータ電位測定用セル（ＤＴＳ－１０７０（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）にリポソーム溶液１０μｌを分注し、蒸留水８９０μｌを加えて混合した後、セルをゼータサイザーにセットしてゼータ電位を測定した。得られた結果は表４に示すとおりであった。
膜を形成する脂質として、中性脂質であるＤＯＰＥを使用した場合（参照例２－２および実施例２－２）と、ＤＯＰＥに対してカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰを使用した場合（参照例２－１および実施例２－１）とを比較すると、後者のほうがゼータ電位をよりプラス側にシフトさせることができることがわかった。
［リポソームによるベクターＤＮＡ導入量の測定］
　リポソームによる細胞へのベクターＤＮＡの導入は、ベクターＤＮＡ上のＮｌｕｃ遺伝子の発現により定量化した。ＮＬｕｃ遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー：ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００（製品名、Ｔｅｃａｎ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）、ヒト末梢血単核球細胞ＰＢＭＣ（ロンザジャパン株式会社より購入）を使用した。９６穴培養プレートに、Ｊｕｒｋａｔは１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ、ＰＢＭＣは５×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ、播種した後、表１に示されるリポソーム溶液を、ＤＮＡ量が０．８μｇ／ウェルになるように添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、ＮＬｕｃの酵素活性を測定した。ＮＬｕｃの酵素活性は、ＮａｎｏＧｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（製品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は、図４（Ｊｕｒｋａｔ）、図５（ＰＢＭＣ）に示すとおりであった。
式（１－０２）の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物としてＤＯＴＡＰを選択すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、式（１－０１）よりも高いＮｌｕｃ遺伝子発現効率を示すことが確認できた。また、式（１－０１）の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物として式（２－０１）とＤＯＰＥを選択すると、ＰＢＭＣ細胞において、式（１－０２）よりも高いＮｌｕｃ遺伝子発現効率を示すことが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
［脂質化合物を含むＲＮＡ内包リポソーム］
［ＲＮＡ内包リポソームの調整］
　メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質ＧＦＰのｍＲＮＡ（ＯＺ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＲＮＡ内包リポソームは、ＧＦＰ　ｍＲＮＡ溶液を、表５に示された配合比の脂質溶液に加え、ピペッティングで縣濁した後、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄・濃縮して調整した。ここで、比較に用いる化合物として、式（Ｒ－０１）で表される化合物を用いた。なお、比較例Ｒ－３は、比較例Ｒ－１と同処方による別調製物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［内包ＲＮＡ量の測定］
　リポソームに内包されたＲＮＡ量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ　ＲＮＡ　Ｓｙｓｔｅｍ　キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。測定は、キット添付のマニュアルに従った。ＲＮＡ内包量の測定結果を表６に示した。表５の配合比の脂質溶液で調整したＲＮＡ内包リポソームにおいては、リポソームの内包ＲＮＡ量に顕著な違いは見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
［リポソーム表面電荷の測定］
　ＲＮＡ内包リポソームの表面電荷（ゼータ電位）は、ゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）で測定した。リポソーム溶液をゼータ電位測定用セル（ＤＴＳ－１０７０、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）に加えて、蒸留水で希釈・混合した後、セルをゼータサイザーの所定の位置にセットしてゼータ電位を測定した。表５で調整したＲＮＡ内包リポソームの内包ＲＮＡ量と平均ゼータ電位は、表６に示すとおりであった。
［リポソームによるＲＮＡ導入量の測定］
　リポソームによる細胞へのＲＮＡの導入は、ＲＮＡがコードするＧＦＰ遺伝子の発現により定量化した。ＧＦＰ遺伝子の発現は、その蛍光量をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ，　ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株：Ｊｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を使用した。ＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で培養したＪｕｒｋａｔを遠心で回収した後、０．６５×１０７細胞となるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに縣濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液とＴｅｘＭＡＣＳを各１５０μＬを加えた。その後、表５に記載したＲＮＡ内包リポソームで、ＧＦＰ　ＲＮＡ量を０．５μｇ／ウェルとなるようにウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。ここで、比較に用いるＲＮＡ導入方法として、リポフェクタミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたリポフェクションと、エレクトロポレーションとによるＲＮＡ導入方法をおこなった。リポフェクションによる導入は、試薬に添付されたマニュアルに従って行った。エレクトロポレーションによる導入は、Ｊｕｒｋａｔを遠心で回収し、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて洗浄後、再度遠心で細胞を回収した。回収した細胞をＯｐｔｉＭＥＭに１．０×１０７細胞／ｍＬとなるように縣濁後、１００μＬの細胞縣濁液に０．５μｇのＧＦＰ　ＲＮＡを加えてキュベット電極に移し、エレクトロポレーションをおこなった。エレクトロポレーションは、ＣＵＹ２１　ＥＤＩＴ　ＩＩ（ＢＥＸ）を使用し、以下の条件でおこなった。
＜ポアリングパルス（Ｐｐ）条件＞
Ｐｐ，　２２５Ｖ；　Ｐｐ　ｏｎ，　２．５ｍｓ；　Ｐｐ　ｏｆｆ，　５０．０ｍｓ
＜ドライビングパルス（Ｐｄ）条件＞
Ｐｄ，　２０Ｖ；　Ｐｄ　ｏｎ，　５０．０ｍｓ；　Ｐｄ　ｏｆｆ，　５０．０ｍｓ；　５サイクル；　Ｃａｐａｃｉｔｏｒ、１４１６．３μＦ
　ＧＦＰ　ＲＮＡを導入した細胞を４８時間培養した後、細胞を回収して１％　ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含むリン酸緩衝液ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターで、細胞のＧＦＰ蛍光強度（緑色蛍光強度）を測定した。図６に、測定結果をグラフで示した。グラフの縦軸は、相対蛍光強度とした。この結果、実施例３－１および３－２の脂質溶液を用いて調製したＲＮＡ内包リポソームは、他のＲＮＡ導入方法、すなわちリポフェクションによる導入とエレクトロポレーションによる導入よりも高い導入量を示した。また、ＲＮＡ内包リポソームでは、実施例３－１の脂質溶液を含むリポソームが最も高い導入量を示すことが明らかになった。
［リポソームによるベクターＤＮＡ導入量の測定］
　実施例１－３、１－４および１－６に従って、ＮＬｕｃを発現するプラスミドを含むコア複合体内包リポソーム（実施例４－１、４－２および４－３）を作製した。該リポソームを構成する脂質溶液の組成と表面電荷の測定結果を、以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　リポソームによる細胞へのベクターＤＮＡの導入は、ベクターＤＮＡ上のＮｌｕｃ遺伝子の発現により定量化した。ＮＬｕｃ遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー：　ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００（製品名、Ｔｅｃａｎ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒト乳がん由来の細胞株ＭＣＦ－７、ヒト肝臓がん由来の細胞株Ｈｕｈ－７（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を使用した。９６穴培養プレートに、１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ播種した後、表７に示されるリポソーム溶液を１μＬ添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、ＮＬｕｃの酵素活性を測定した。ＮＬｕｃの酵素活性は、ＮａｎｏＧｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（製品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は図７～１１に示すとおりであった。
　図７～９は、実施例４－１と実施例４－２とを比較したグラフであり、図７は乳がん細胞（細胞株ＭＣＦ－７）、図８は肝臓がん細胞（細胞株Ｈｕｈ－７）、図９は白血病細胞（Ｔ－リンパ球、細胞株Ｊｕｒｋａｔ）におけるＮｌｕｃ遺伝子の発現効率を示す。図７～９に示される結果から、化合物（２－０１）の配合により、リポソームに含まれるベクターＤＮＡは、浮遊性細胞よりも付着性細胞に取り込まれやすくなることが示された。
　図１０および１１は、実施例４－２と実施例４－３とを比較したグラフであり、図１０は乳がん細胞（細胞株ＭＣＦ－７）、図１１は肝臓がん細胞（細胞株Ｈｕｈ－７）におけるＮｌｕｃ遺伝子の発現効率を示す。図１０および１１に示される結果から、化合物（１－０１）と化合物（２－０１）の組合せを含有するリポソームにおいて、表面電荷の制御にＤＯＴＡＰを使用するか否かにより、増殖様式の異なる細胞へ指向性を該リポソームに付与できることがわかった。
　以上の通り、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の組み合わせ、省略、置き換え、変更などを行うことが可能である。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

Claims (40)

  1. 　下記式（１）
    　Ｑ－ＣＨＲ２　　　　（１）
    （式中、
    Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
    Ｒは、それぞれ独立にＣ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
    で表されることを特徴とする化合物。
  2. 　前記Ｑが、下記式（１－Ｑ）：
    ＲＱ１ ２Ｎ－（ＣＲＱ２ ２）ｑ１－ＮＲＱ１－（ＣＲＱ２ ２）ｑ２－＊　（１－Ｑ）（式中、
    ＲＱ１は、それぞれ独立に、アルキルであり、
    ＲＱ２は、それぞれ独立に、水素またはアルキルであり、
    ＲＱ１およびＲＱ２のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成してもよく、ｑ１は、１～４の数であり、
    ｑ２は、０～４の数であり、
    ＊は、－ＣＨＲ２への結合位置を表す）
    で表される、請求項１に記載の化合物。
  3. 　前記Ｑが、下記：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、＊は－ＣＨＲ２への結合位置を表す）
    に示される構造のいずれかである、請求項１または２に記載の化合物。
  4. 　前記Ｒが、下記式（１－Ｒ）：
    －ＬＲ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－ＬＲ２　　（１－Ｒ）
    （式中、
    ＬＲ１はアルキレンであり、
    ＬＲ２はアルケニルである）
    で表される、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. 　前記ＬＲ１および前記ＬＲ２が、それぞれ下記式（１－Ｒ１）および（１－Ｒ２）：
    －（ＣＨ２）ｒ１－　　　（１－Ｒ１）
    －ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－（ＣＨ２）ｒ２－Ｈ　　　（１－Ｒ２）
    （式中、
    ｒ１は、１～１０の数であり、
    ｒ２は、１～１０の数である）
    で表される請求項４に記載の化合物。
  6. 　前記ｒ１が４～８の数である、請求項５に記載の化合物。
  7. 　前記Ｒに含まれる、最も長い分子鎖が８原子以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物。
  8. 　下記式（１－０１）～（１－２１）で表される、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載された化合物を含む脂質粒子。
  10. 　下記式（２）：
    　Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２　　　　（２）
    （式中、
    Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
    Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
    Ｗは、それぞれ独立にＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
    Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
    Ｗ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
    Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
    で表され、
    　構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含む化合物をさらに含む、請求項９に記載の脂質粒子。
  11. 　前記Ｐが、３～８個の炭素および１～２個の酸素を含む、請求項１０に記載の脂質粒子。
  12. 　前記Ｘが、それぞれ独立に、メチルイミノ、１，２－ピロリジンジイル、および１，３－ピロリジンジイルからなる群から選ばれる、請求項１０または１１に記載の脂質粒子。
  13. 　前記Ｚが、脂溶性ビタミン残基またはステロール残基である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の脂質粒子。
  14. 　膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含む請求項９～１３のいずれか１項に記載の脂質粒子。
  15. 　前記の膜を形成する脂質が、
    １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
    １，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
    １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
    １，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
    １，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０　ＤＡＰ）、
    １，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０　ＤＡＰ）、
    １，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０　ＤＡＰ）、
    Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
    １，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
    １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
    １，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
    １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、および
    コレステロール、
    からなる群から選択され、
    　前記凝集を低減できる脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質である、請求項１４に記載の脂質粒子。
  16. 　活性剤をさらに含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の脂質粒子。
  17. 　前記活性剤が、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸である、請求項１６に記載の脂質粒子。
  18. 　前記活性剤が、少なくとも一種のＤＮＡと、少なくとも一種のＲＮＡとの組み合わせを含む、請求項１６に記載の脂質粒子。
  19. 　核酸と結合する化合物をさらに含む、請求項１７または１８に記載の脂質粒子。
  20. 　前記核酸と結合する化合物が、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドである、請求項１９に記載の脂質粒子。
  21. 　前記核酸と結合する化合物が、プロタミンまたはヒストンである、請求項１９または２０に記載の脂質粒子。
  22. 　細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の脂質粒子。
  23. 　請求項９～２２のいずれか１項に記載の脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする組成物。
  24. 　請求項９～２２のいずれか１項に記載の脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする、活性剤を細胞へ送達するための組成物。
  25. 　前記脂質粒子が、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. 　式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項２５に記載の組成物。
  27. 　前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 　活性剤を細胞へ送達するための、請求項９～２２のいずれか１項に記載の脂質粒子。
  29. 　式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項２８に記載の脂質粒子。
  30. 　式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項２９に記載の脂質粒子。
  31. 　前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の脂質粒子。
  32. 　活性剤を細胞へ送達するための方法であって、該活性剤を含む請求項９～２２のいずれか１項に記載の脂質粒子を細胞に接触させることを含む、方法。
  33. 　前記脂質粒子を被験体に投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 　前記脂質粒子が、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 　式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項３４に記載の方法。
  36. 　前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 　活性剤を細胞へ送達するための、請求項９～２２のいずれか１項に記載の脂質粒子の使用。
  38. 　前記脂質粒子が、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項３７に記載の使用。
  39. 　式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項３８に記載の使用。
  40. 　前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の使用。
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