JP2022092968A - 脂質粒子の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 品質の向上した脂質粒子を得ることができる、脂質粒子の製造方法を提供することである。【解決手段】 実施形態の薬剤を内包する脂質粒子の製造方法は、薬剤を内包する脂質粒子を含む溶液を分速１℃以下の冷却速度で冷却することを含む。【選択図】図１

Description

本発明の実施形態は、脂質粒子の製造方法に関する。

細胞内に物質を送達する方法として目的の物質を脂質粒子に内包し、細胞に接触させる方法がある。脂質粒子の物質の内包量、内包率及びサイズ等の品質は、物質の細胞への送達効率及び物質による目的達成の効率に影響を与える。そのため、より品質の高い脂質粒子が得られる製造方法が求められている。

本発明が解決しようとする課題は、品質の向上した脂質粒子を得ることができる、脂質粒子の製造方法を提供することである。

実施形態の薬剤を内包する脂質粒子の製造方法は、薬剤を内包する脂質粒子を含む溶液を分速１℃以下の冷却速度で冷却することを含む。

図１は、実施形態に係る脂質粒子製造方法の一例を示すフローチャートである。 図２は、実施形態に係る脂質粒子の一例を示す断面図である。 図３は、実施形態に係る脂質粒子製造方法の手順の一例を示す図である。 図４は、実施形態に係る第１冷却工程及び第２冷却工程を含む脂質粒子製造方法の一例を示すフローチャートである。 図５は、実施形態に係る冷却工程における時間経過に伴う温度変化の一例を示すグラフである。 図６は、実施形態に係る凝縮工程を含む脂質粒子製造方法の一例を示すフローチャートである。 図７は、実施形態に係る濃縮工程を含む脂質粒子製造方法の一例を示すフローチャートである。 図８は、実施形態に係る脂質粒子製造方法に用いられる流路の一例を示す平面図である。 図９は、実施形態に係る脂質粒子品質向上方法の一例を示すフローチャートである。 図１０は、実施形態に係る第１冷却工程及び第２冷却工程を含む脂質粒子品質向上方法の一例を示すフローチャートである。 図１１は、例６の実験結果を示す顕微鏡写真及びそのトレース図である。

以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。

実施形態によれば、品質の向上した脂質粒子を得ることができる脂質粒子製造方法が提供される。実施形態の脂質粒子製造方法は、薬剤を内包する脂質粒子を含む溶液を分速１℃以下の速度で冷却する冷却工程を含む。

・脂質粒子
まず、実施形態に係る脂質粒子について説明する。図２に示すように、脂質粒子１は脂質分子が配列して形成された脂質膜からなり、中空の略球状である。脂質粒子１の内腔１ａに薬剤２が内包されている。脂質粒子１は例えば薬剤２を細胞内に送達するために用いられ得る。脂質粒子１は、細胞に接触させることで例えばエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ、薬剤２を細胞内に放出する。

脂質粒子１を構成する脂質膜は、単層の脂質膜又は二重層若しくは三重層等の複数層の脂質である。また、脂質粒子１は脂質膜が更に複数の層状になった多層構造であってもよい。

脂質粒子１は、１種類の脂質材料からなってもよいが、好ましくは複数種類の脂質材料からなる。脂質材料は、例えば、下記に例示するベース脂質と、第１の脂質化合物と、第２の脂質化合物のいずれかを少なくとも含むことが好ましい。

ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等であることが好ましい。ベース脂質は、例えば生体膜の主成分の脂質であってもよく、人工的に合成した脂質であってもよい。

例えば、ベース脂質として、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、
Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、又は
コレステロール、
或いはこれらの何れかの組み合わせ等を用いることが好ましい。

特にカチオン性脂質又は中性脂質の脂質を用いること好ましく、その含有量によって脂質粒子１の酸解離定数を調節することができる。カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いることが好ましく、中性脂質としてＤＯＰＥを用いることが好ましい。

ベース脂質は、脂質材料の全体に対して３０％～約８０％（モル比）含まれることが好ましい。或いは、１００％近くがベース脂質から構成されていてもよい。

第１の脂質化合物及び第２の脂質化合物は、生分解性脂質である。第１の脂質化合物はＱ－ＣＨＲ_２の式で表すことができる。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ_１２～Ｃ_２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。

脂質粒子１が第１の脂質化合物を含む場合、脂質粒子１の表面が非カチオン性となるため、細胞導入における障害が低減され、内包物の導入効率が高まり得る。

第１の脂質化合物として、例えば下記式で表される構造を有する脂質を用いれば導入効率がより優れているため好ましい。

特に、式（１－０１）の脂質化合物及び／又は式（１－０２）の脂質化合物を用いることが好ましい。

第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］_２の式で表すことができる。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ_１～Ｃ_６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ_１２～Ｃ_２２脂肪族炭化水素基である）。

第２の脂質化合物を含む場合、脂質粒子１への薬剤２の内包量が多くなり得る。

例えば、以下の構造を有する第２の脂質化合物を用いれば、薬剤２の内包量がより優れているため好ましい。

特に、式（２－０１）の化合物を用いることが好ましい。

以上に説明した第１及び第２の脂質化合物を含む脂質粒子１を用いた場合、薬剤２の内包量を増加させ、且つ薬剤２の細胞への導入効率を高めることが可能である。かつ導入した細胞の細胞死も低減することができる。

第１及び第２の脂質化合物は、脂質材料の全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。

脂質材料は、脂質粒子１同士の凝集を防止する脂質を含むこともまた好ましい。例えば、凝集を防止する脂質は、ＰＥＧ修飾した脂質、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、オメガ－アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）又はモノシアロガングリオシド等を更に含むことが好ましい。このような脂質は、脂質粒子１の脂質材料全体に対して約１％～約１０％（モル比）で含まれることが好ましい。

脂質材料は、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子１に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロール等の内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を更に含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。

用いられる脂質の種類及び組成は、目的とする脂質粒子１の酸解離定数（ｐＫａ）若しくは脂質粒子１のサイズ、内包物の種類、或いは導入する細胞中での安定性等を考慮して適切に選択される。

例えば、脂質粒子１は、式（１－０１）若しくは式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含むことが好ましい。

薬剤２は、１種類の物質であってもよく、複数の物質を含んでもよい。薬剤２は脂質粒子に内包することができる何れの物質であってもよいが、例えば、薬剤２は活性成分として核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、他の有機化合物又は無機化合物等を含む。核酸の薬剤２は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又は他のヌクレオチドを含む核酸等であり、例えば特定の遺伝子のｍＲＮＡ、遺伝子をコードするＤＮＡ、遺伝子とプロモーター等の遺伝子を発現するためのその他の配列とを含む遺伝子発現カセットを含むＤＮＡ、ベクター等であり得る。薬剤２は、例えば疾患の治療薬又は診断薬等であってもよい。薬剤２は必要に応じて、例えばｐＨ調整剤、浸透圧調整剤及び／又は薬剤活性化剤等の試薬を更に含んでもよい。ｐＨ調整剤は、例えば、クエン酸等の有機酸及びその塩等である。浸透圧調整剤は、糖又はアミノ酸等である。薬剤活性化剤は、例えば活性成分の活性を補助する試薬である。

・脂質粒子の製造方法
次に実施形態に係る品質の向上した脂質粒子１の製造方法について説明する。本製造方法は、例えば図１に示すように次の工程を含む。
（Ｓ１）有機溶媒中に脂質を含む第１溶液と水性溶媒中に薬剤を含む第２溶液とを混合した混合液を得る混合工程、
（Ｓ２）混合液の有機溶媒の濃度を低下させることで脂質を粒子化して薬剤を内包した脂質粒子を生成する粒子化工程、及び
（Ｓ３）前記粒子化工程で得られた脂質粒子を含む溶液を分速１℃以下の速度で冷却する冷却工程。

以下、本製造方法の一例について図３を用いて詳細に説明する。

まず第１溶液３と第２溶液４とを用意する。第１溶液３は、有機溶媒５中に脂質６を含む。第２溶液４は、水性溶媒７中に薬剤２を含む。

有機溶媒５は、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、エーテル、クロロホルム、ベンゼン又はアセトン等である。脂質６は、上で説明した脂質粒子１の材料となる脂質である。有機溶媒５に含まれる脂質６の組成は、脂質粒子１を構成する所望の脂質の組成と同じ比率となるように設定されることが好ましい。有機溶媒５中の脂質６の濃度は、例えば０．１％～０．５％（重量）であることが好ましい。

水性溶媒７は、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液等である。薬剤２は、上述した何れかのものである。水性溶媒７は、薬剤の種類に応じて適切なものが選択される。水性溶媒７中の薬剤２の濃度は、例えば０．０１％～１．０％（重量）であることが好ましい。

次に、第１溶液３と第２溶液４とを混合する（混合工程Ｓ１）。例えば、第１溶液３と第２溶液４とを等量ずつ混合する。混合工程Ｓ１により混合液８が得られる。混合後、混合液８をよく撹拌することが好ましい。

次に粒子化工程Ｓ２において混合液８の有機溶媒５の濃度を低下させる。例えば、混合液８に水溶液を多量に添加することにより有機溶媒５濃度を相対的に低下させることが好ましい。例えば、混合液８の３倍量の水溶液を混合液８に添加する。水溶液として、第１溶液３に用いられる水性溶媒７と同じものを用いることができる。粒子化工程Ｓ２により脂質６が粒子化し、薬剤２を内包する脂質粒子１が生成し得る。その結果、脂質粒子１を含む溶液９が得られる。

次に粒子化工程Ｓ２で得られた脂質粒子１を含む溶液を冷却する（冷却工程Ｓ３）。

冷却工程Ｓ３は、溶液９に凍結保護剤を添加してから行ってもよい。凍結保護剤は、例えば、ジメチルスルホキシド、グリセロール又は糖の何れかを用いることができる。しかしながら凍結保護剤は糖以外の物質を用いる場合、溶液９の容量や粘度に与える影響が少ない好ましい。冷却直前の溶液９の凍結保護剤の含有量は１０％（体積比）以下であることが好ましい。

冷却工程Ｓ３は、所望の最終温度まで溶液９の溶媒が残存するように湿潤状態で行われ得る。例えば溶液９を密閉可能な容器に収容し、乾燥による溶媒の減少を防止して行うことが好ましい。容器は、例えば凍結保存用のチューブ、バイアル又はマイクロプレート等である。例えば、ザルスタット社又はコーニング社、Ｎｕｎｃ社等で販売している容器を用いることができる。しかしながら、容器は凍結に耐えるものであればこれらに限定されるものではない。

溶液９は、冷却工程Ｓ３の直前、１０℃～２５℃であることが好ましい。冷却は、分速１℃以下の速度で行われる。冷却終了時の溶液９の温度（最終温度）は少なくとも０℃以下であり、溶液９が凍結するまで冷却が行われることが好ましい。より好ましくは少なくとも－３０℃まで冷却される。最終温度は例えば－２０℃～－８５℃であってもよい。

冷却は、例えば冷却速度の調節が可能な冷却装置で行われる。冷却装置として、例えばプログラムフリーザーを用いることができる。例えばネッパジーン社で販売しているプログラムフリーザーを用いることができるが、冷却速度を調節できるものであればこれに限定されるものではない。

冷却速度の調節は溶液９の温度を基準として行われ得るが、例えば冷却装置の容器収容庫内の温度又は容器の温度測定しそれを溶液９の温度をみなしてもよい。この温度測定及び冷却速度調節は、冷却装置に備え付けられた温度計により自動的に行うことができる。

冷却工程Ｓ３は最終温度まで一定の速度で行われてもよいが、分速１℃以下の速度である限りにおいて途中で冷却速度を変更してもよい。冷却速度は、温度が低くなるにつれ遅くすることが好ましい。例えば、冷却工程Ｓ３は、図４及び図５に示すように、０．５＜ｖ≦１で冷却する第１冷却工程Ｓ３－１と、ｖ≦０．５で冷却する第２冷却工程Ｓ３－２とを含むことが好ましい。ここで、「ｖ」は冷却速度であり、単位は℃／分である。

図５に示すように、第２冷却工程Ｓ３－２は、第１冷却工程Ｓ３－１の後、連続して行われ得る。第２冷却工程Ｓ３－２に移行するときの温度ｎは、０℃～－１０℃の間の何れかの温度であることが好ましく、０℃とすることが好ましい。冷却速度ｖの変更は一回に限られるものではなく、複数回変更してもよい。

冷却工程Ｓ３の後、溶液９は、例えば容器に収容したまま、冷凍された状態で又は融解して保管又は運搬することができる。脂質粒子１の使用時には、溶液９は融解した状態、例えば０℃～４℃で用いられ得る。融解の方法及び加温速度は限定されるものではないが、例えば４℃の低温庫で３０分静置する方法で融解することが好ましい。ある実施形態においては、冷却工程Ｓ３は一度限り行われ、融解した後再冷却することなく製造工程を終了する。

以上に説明した製造方法によれば、冷却工程Ｓ３で分速１℃以下の穏やかな速度で冷却することにより、品質の向上した脂質粒子１を得ることができる。ここで、品質の向上とは、例えば、薬剤２の脂質粒子１からの漏出の防止、薬剤２の脂質粒子１への内包量の向上、薬剤２を内包する脂質粒子１の割合（内包率）の向上、脂質粒子１同士の凝集の低減及び防止、及び／又は脂質粒子のサイズのばらつきの軽減等を含む。

薬剤２の脂質粒子１からの漏出及び薬剤２の脂質粒子１への内包量は、例えば次の方法によって測定することができる。まず溶液９の一部を採取し、薬剤２の種類に応じた定量方法によって薬剤２を定量する。この定量値（Ａ）を脂質粒子外に存在する薬剤量（漏出量）とする。また、溶液９の別の一部を採取し、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００等）等の脂質粒子１を破壊する試薬を添加し、薬剤２の種類に応じた定量方法によって薬剤２を定量する。この定量値（Ｂ）を溶液９内の総薬剤量とする。次に、定量値（Ｂ）から定量値（Ａ）を差し引くことで、脂質粒子１に内包された薬剤２の量を算出することができる。薬剤２の種類に応じた定量方法は、公知の方法であればよく、例えば薬剤２が核酸である場合は、市販のＤＮＡ定量キット又はＲＮＡ定量キット等を用いることができる。

薬剤２を内包する脂質粒子１の割合（内包率）は、例え次の方法で測定することができる。まず、脂質粒子１内に入り込み薬剤２と結合して信号（例えば、蛍光等の光学的信号が好ましい）を発する試薬を溶液９に添加する。次に、溶液９に光を照射し側方散乱光を発する脂質粒子数を測定し、その数を全脂質粒子数とする。また、信号が観察された脂質粒子数を測定し、その数を薬剤２内包脂質粒子数とする。全脂質粒子数を薬剤２内包脂質粒子数で除することで薬剤２を内包する脂質粒子１の割合（内包率）を得ることができる。薬剤２が核酸である場合、試薬は例えばＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ又はＡｃｃｕＢｌｕｅ等を用いることができる。脂質粒子数の測定は、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）法によって行うことが可能である。例えば、ＮＴＡ法による解析は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（マルバーン）等の市販の計測機器によって行うことが可能である。

脂質粒子１の凝集は、例えば、溶液９の白濁率を計測することによって評価することが可能である。例えば、目視で溶液９を観察して白濁が生じていた場合に凝集が起きていると判定することができる。また、溶液９の濁度を分光光度計等で測定してもよい。濁度が高いほど、より凝集が生じていると判断される。凝集は生じていない方が好ましい。

脂質粒子１のサイズ及びサイズのばらつきは、例えば、動的光錯乱法を用いた粒子径測定装置、例えば、ゼータサイザー（マルバーン）等、又は電子顕微鏡を用いた観察等によって評価することが可能である。脂質粒子１の平均粒子径は約５０ｎｍ～約３００ｎｍであることが好ましく、約５０ｎｍ～約２００ｎｍであることがより好ましい。

実施形態の製造方法によれば、短時間、簡単な操作且つ低コストで品質の向上した脂質粒子が得られる。本方法によれば従来脂質粒子の製造において、品質の向上のために行われていた整粒工程、例えば脂質粒子のサイズを均一化するためのろ過、凝集を解消するため及び粒子径を小さくするための超音波処理、及び薬剤内包率を向上させるための脂質粒子の破壊及び粒子化の繰り返し等を省略することができる。本製造方法によれば全工程にかかる時間が例えば約１．５時間と短く、より早く品質の良好な脂質粒子を得ることができる。

本方法で製造した品質を向上した脂質粒子１を薬剤２の細胞への送達に用いることにより、薬剤２の細胞への送達効率が向上する。したがって、薬剤２による所望の効果が得られやすい。例えば薬剤２が細胞のゲノム内に組込まれる遺伝子等である場合、本方法で得られた脂質粒子１を用いることにより、効率よく遺伝子を導入した細胞、例えばゲノム改変細胞を作製することができる。

次に本製造方法に含まれ得る更なる工程について説明する。以下の説明において、「混合工程」、「粒子化工程」及び「冷却工程」は、先に説明したものと同様である。

薬剤２が核酸である場合、混合工程の前に、核酸凝縮ペプチドを用いて薬剤２を凝縮する凝縮工程を含んでもよい。このような製造方法は図６に示すように、凝縮工程Ｓ２０と、混合工程Ｓ２１と、粒子化工程Ｓ２２と、冷却工程Ｓ２３とを含む。

核酸凝縮ペプチドは、核酸を小さく凝縮することにより、脂質粒子１の粒径をより小さくすることができ、また脂質粒子１内により多くの核酸を内包することができる。その結果、脂質粒子１外に残留する核酸がより低減され得る。

好ましい核酸凝縮ペプチドは、例えば、カチオン性のアミノ酸を全体の４５％以上含むペプチドである。より好ましい核酸凝縮ペプチドは、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有し、他方の端が配列ＲＱＲＱＲ（第２のアミノ酸配列）を有する。第１のアミノ酸配列と第２アミノ酸配列との間には、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。他方の端は第２のアミノ酸配列に変えて、ＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有してもよい。

上記核酸凝縮ペプチドは、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号２）
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号３）。

更に、次のようなアミノ酸配列を有する核酸凝縮ペプチドを上記の何れかの核酸凝縮ペプチドと組み合わせて用いることもできる。このペプチドは、上記核酸凝縮ペプチドで凝縮した核酸凝縮体を更に凝縮することができる。

ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ
（Ｍ９）（配列番号４）
例えば、核酸（薬剤２）を含む溶液に核酸凝縮ペプチドを添加し、撹拌混合することによって凝縮された核酸（薬剤２）を含む第２溶液４を得ることができる。

以上の効果を奏することから薬剤２が核酸である場合は核酸凝縮ペプチドを用いることが好ましいが、用いる薬剤２の種類や使用量によっては核酸凝縮ペプチドを用いなくともよい。

更なる実施形態によれば、製造方法は、粒子化工程と冷却工程との間に溶液９内の脂質粒子１を濃縮する濃縮工程含んでもよい。このような製造方法は図７に示すように、混合工程Ｓ３１と、粒子化工程Ｓ３２と、濃縮工程Ｓ３３と、冷却工程Ｓ３４とを含む。

濃縮は、例えば溶液９から溶媒の一部及び／又は余った脂質材料と薬剤２とを除去することにより行われる。しかしながら本方法によれば薬剤２の内包率が優れているため薬剤２はほとんど残留することなく、薬剤２を内包しなかった脂質粒子１が崩壊したもの等が除去され得る。濃縮は、例えば限外ろ過することにより行うことができる。限外ろ過には、例えば細孔径２ｎｍ～１００ｎｍの限外ろ過フィルタを用いることが好ましい。例えばフィルタとしてＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５（メルク）等を用いることができる。濃縮後の溶液９の脂質粒子１の濃度は１×１０^１３個/ｍＬ～５×１０^１３個/ｍＬ程度であることが好ましい。

濃縮工程Ｓ３３を行うことにより純度及び濃度の高い脂質粒子溶液９を得ることができる。濃縮後の溶液９の脂質粒子１の濃度は１×１０^１３個/ｍＬ～５×１０^１３個/ｍＬ程度であることが好ましい。しかしながら濃縮工程は必ずしも行う必要はなく、濃縮前の希溶液９の状態で冷却工程を行うことも可能である。

更なる実施形態において、凝縮工程、混合工程、粒子化工程、濃縮工程及び冷却工程は、それぞれ流路を用いて行うことも可能である。図８は流路の一例を示す。図８の（ａ）は凝縮工程を行うための構成を有する第１流路１０１を示し、図８の（ｂ）は混合工程を行うための構成を有する第２流路１０２を示し、図８の（ｃ）は粒子化工程を行うための構成を有する第３流路１０３を示し、図８の（ｄ）は濃縮工程を行うための構成を有する第４流路１０４を示し、図８の（ｅ）は冷却工程を行うための構成を有する第５流路１０５を示す。

第１流路１０１はＹ字型の流路であり、分岐した一方の流路１１１の上流の端は、流路１１１に核酸凝縮ペプチドを含む凝縮剤を注入するための注入口１１２を備えるか、又は凝縮剤を収容するタンクと連結していてもよい。

第１流路１０１の分岐した他方の流路１１３の上流の端は、薬剤２を含む溶液を流路１１３に注入するための注入口１１４を備えるか、又は薬剤２を含む溶液を収容するタンクと連結していてもよい。

流路１１１に凝縮剤を流し、流路１１３に薬剤２を含む溶液を流すと、流路１１１と流路１１３とが合流する流路１１５内で凝縮剤と薬剤２を含む溶液とが混合される。混合により、凝縮された薬剤２を含む第２溶液４が得られる。流路１１５の下流の端は、第２流路１０２と連結しているか、又は第２溶液４を一度取り出す排出口が設けられていてもよい。

凝縮工程を行わない場合、第１流路１０１を用いなくともよい。

第２流路１０２はＹ字型の流路であり、分岐した一方の流路１２１の上流の端は、第１流路１０１を用いる場合は流路１１５と連結している。又は予め用意された第２溶液４を収容するタンクと連結していてもよい。

第２流路１０２の分岐した他方の流路１２２の上流の端は、第１溶液３を流路１２２に注入するための脂質注入口１２３を備えるか、又は予め用意された第１溶液３を収容するタンクと連結していてもよい。

流路１２１に第２溶液４を流し、流路１２２に第１溶液３を流すと、流路１２１と流路１２２とが合流する流路１２４内で第１溶液３と第２溶液４とが混合される。その結果、混合液８が得られる。流路１２４は例えば蛇行しており、この蛇行部を通過することで２つの溶液がよく撹拌される。流路１２４の下流の端は、第３流路１０３と連結されているか、又は混合液８を一度取り出す排出口が設けられていてもよい。

第３流路１０３はＹ字型の流路であり、分岐した一方の流路１３１の上流の端は、第２流路１０２の流路１２５と連結しているか、又は予め用意された混合液８を収容するタンクと連結していてもよい。

第３流路１０３の分岐した他方の流路１３２の上流の端は、水溶液を流路１３２に注入するための注入口１３３を備えるか、又は水溶液を収容するタンクと連結していてもよい。

流路１３１に混合液８を流し、流路１３２に水溶液を流すと、流路１３１と流路１３２とが合流する流路１３４内で混合液８に水溶液が混合される。その結果、脂質６が粒子化し、薬剤２が内包された脂質粒子１生成し、脂質粒子１を含む溶液９が得られる。流路１３５の下流の端は、第４流路１０４と連結されているか、又は脂質粒子１を含む溶液９を取り出す排出口が設けられていてもよい。

第４流路１０４は、流路１４１と、流路１４１の壁面に設けられたフィルタ１４２とを備える。流路１４１の上流の端は、第３流路１０３の流路１３５と連結しているか、又は予め用意された溶液９を収容するタンクと連結していてもよい。

フィルタ１４２は例えば流路１４１の一部の壁面に代えて設けられている。フィルタ１４２として上で説明した何れかの限外ろ過用のフィルタを用いることができる。

溶液９を流路１４１に流すことによって、残留した材料及び余分な溶媒等がフィルタ１４２を通過して流路１４１外に排出され、脂質粒子１は流路１４１内に残り下流へと流れることで溶液９が濃縮される。

流路１４１の下流の端は、第５流路１０５と連結されているか、又は溶液９を取り出す排出口が設けられていてもよい。

濃縮工程を行わない場合は第４流路１０４を用いなくともよい。

第５流路１０５は、流路１５１と、流路１５１の周囲に設けられた温度調節機構１５２とを備える。流路１５１の上流の端は、流路１３４若しくは流路１４１と連結しているか、又は予め用意された溶液９を収容するタンクと連結していてもよい。

温度調節機構１５２は、冷却工程を行うための所望の冷却速度で流路１５１内の溶液９を自動的に冷却するように構成され及び制御されている。また、冷却後に融解を行うように構成され及び制御されていてもよい。

流路１５１の下流の端は、冷却後の溶液９を回収するための排出口１５３を備えるか、又は溶液９を回収するためのタンクと連結されていてもよい。冷却後の溶液９は例えば更なる流路を介して排出口１５３又はタンクから回収され容器に収容され得る。

冷却工程は第５流路１０５で行わず、粒子化工程又は濃縮工程後に溶液９を容器に回収してその後に行ってもよい。その場合、容器は例えば制御された運搬機構で冷却装置に運搬されて冷却され得る。

上記の流路は、例えばマイクロ流路であり、幅１００μｍ～１０００μｍ程であることが好ましい。

流路内の液体の流れ、液体の流路内への注入、タンクからの液体の取り出し及び／又は溶液９の容器への収容等は、例えばこれらの操作が自動的に行われるように構成され及び制御されたポンプ又は押し出し機構等により行われ得る。

以上に説明した流路を用いることにより、自動で且つ密閉状態で簡単に品質の向上した脂質粒子を製造することができる。加えて、流路内の限られた空間で反応が行われることから成分同士が遭遇しやすく反応が起こりやすいため、より効率よく脂質粒子１を製造することが可能である。また用いられる溶液量が少量でよいことから、材料の節約になる。

・脂質粒子の品質を向上する方法
更なる実施形態によれば、脂質粒子の品質を向上する方法が提供される。本方法は、図９に示すように薬剤２を内包する脂質粒子１を含む溶液を分速１℃以下の速度で冷却する冷却工程Ｓ４１を含む。薬剤２を内包する脂質粒子１を含む溶液は、例えば予め製造されたものであり、上記脂質粒子の製造方法の冷却工程を除く工程を行って得られた溶液９であることが好ましいが、溶液９に更なる改変を加えた溶液、又は上記製造方法とは別の製造方法で得られた溶液等であってもよい。

薬剤２を内包する脂質粒子１を含む溶液は、水性溶媒と水性溶媒中に含まれた薬剤２を内包する脂質粒子１を含む。水性溶媒は、例えば水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液等である。溶液は、必要に応じて更なる成分を含んでもよい。

冷却工程Ｓ４１は、上記の冷却工程Ｓ３と同様の方法で行うことができ、また冷却工程Ｓ３と同様に目的の最終温度までの間に冷却速度を１回又は複数回変更してもよい。冷却工程Ｓ４１は、例えば図１０に示すように０．５＜ｖ≦１で冷却する第１冷却工程Ｓ４１－１と、ｖ≦０．５で冷却する第２冷却工程Ｓ４１－２とを含むことが好ましい。ここで、「ｖ」は冷却速度であり、ｖの単位は℃／分である。

以上に説明した品質向上方法によれば、冷却工程Ｓ４１で緩慢冷却を行うことにより、脂質粒子１の品質を向上することができる。ここで、品質の向上とは、例えば、薬剤２の脂質粒子１からの漏出の防止、薬剤２の脂質粒子１への内包量の向上、薬剤２を内包する脂質粒子１の割合（内包率）の向上、脂質粒子１同士の凝集の低減及び防止、及び／又は脂質粒子のサイズのばらつきの軽減等を含む。

［例］
以下に、実施形態に係る方法で脂質粒子を製造し、使用した例について説明する。

例１：冷却条件が異なる脂質粒子の評価
（混合工程）
ＦＦＴ１０：ＦＦＴ２０：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝３５：７０：２１：９．４：８８．５：９．４（モル比）の比率の６種類の脂質を１．２ｍｌのエタノールに溶解し第１溶液を得た。０．１ｍｇ／ｍｌのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）のｍＲＮＡ（以下、「ｎＬｕｃｍＲＮＡ」と称する）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）１．２ｍｌに溶解し、第２溶液を得た。両溶液を、マイクロ流路を使って混合し、ＲＮＡ－脂質混合液を作製した。

（粒子化工程）
混合工程で作製したＲＮＡ－脂質混合液２．４ｍｌに、７．２ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を添加することで混合液の有機溶媒濃度を相対的に低下させ、ｎＬｕｃｍＲＮＡを内包する脂質粒子を生成した。

（濃縮工程）
粒子化工程で得られた９．６ｍｌの希脂質粒子混合液を限外ろ過フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５、メルク）を用いて２４０μｌになるまで濃縮し、脂質粒子混合液とした。

（冷却工程）
濃縮工程で作製した脂質粒子混合液を、下記表１に示す４つの条件で冷却した。

２４時間後、各脂質粒子混合液を融解し、下記の手順で粒子径とゼータ電位を測定した。精製水（注射用水、大塚製薬）９００μｌで洗浄した粒子径測定専用キュベットに、精製水８９０μｌと脂質粒子溶液１０μｌを添加し混合した。この混合物についてゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳＰ、マルバーン）で粒子径測定モードにて粒子径と多分散指数（ＰｄＩ）を測定した。次に、１００％ＥｔＯＨ９００μｌで２回、精製水９００μｌで２回洗浄したゼータ電位測定専用キュベットに、粒子径測定した溶液を移し、ゼータ電位測定モードにてゼータ電位を測定した。

次に、脂質粒子混合液の内包ＲＮＡ濃度を下記の手順で測定した。内包ＲＮＡ濃度の測定は、ＲＮＡ定量キットであるＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅ３３１０、プロメガ）を用いて行った。１×ＴＥ緩衝液を調整し、そのＴＥ緩衝液を用いて１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（界面活性剤）とＲＮＡ Ｄｙｅ染色液（１×）とを調整した。

検量線作成用に、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘを含まない条件（Ａ）と、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘを含む条件（Ｂ）の試料を調製した。検量線作成用試料の調整量を以下の表２に示す。

次に、脂質粒子を含む混合液についてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘを含まない条件（Ａ）と、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘを含む条件（Ｂ）の試料を調製した。以下の表２及び表３にそれぞれ示す。

次に、検量線用試料及び脂質粒子混合液用の試料のＲＮＡの濃度を測定した。測定は、蛍光を用いた核酸検出装置であるＱｕａｎｔｕｓ^ＴＭＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用い、色素の蛍光強度から濃度を算出した。界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘを含まない条件（Ａ）の試料の測定結果から付着核酸量が得られ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘを含む条件（Ｂ）の試料の測定結果から、付着核酸量と内包核酸量との合計、即ち総核酸量が得られた。ここで、付着核酸量とは、脂質粒子外に存在する核酸の量である。検量線用の試料における結果からＲＮＡ量と蛍光強度との関係を示す検量線を作成した。検量線と脂質粒子混合液用試料における結果とを比較することにより、脂質粒子混合液の付着核酸量と内包核酸量とを算出した。付着核酸量は条件（Ａ）の値とし、内包核酸量は条件（Ｂ）の値から条件（Ａ）の値を引いた値とした。

各条件の測定結果を下記表４に示す。

条件１（比較例１）の凍結を行わない条件、および条件２（比較例２）の急速冷却条件では内包された核酸の漏出率がそれぞれ５９．８％及び４５．４％であった。それに対して条件３（実施例１）および条件４（実施例２）の緩慢冷却条件では漏出率がそれぞれ２０．６％及び２７．２％であり顕著に抑制された。

例２：冷却・融解条件が異なる脂質粒子の評価
例１に示す方法で混合工程～濃縮工程を行って脂質粒子混合液を作製した。

その後、下記表５に示す条件で冷却工程を行った後、例１と同じ方法で粒子径、ゼータ電位及びＲＮＡ濃度を測定した。

各条件の測定結果を表６に示す。

条件１（比較例３）の凍結を行わない条件では、内包された核酸の漏出率が５８％であった。それに対して条件２（実施例３）の緩慢冷却条件では、漏出率が２９％であり顕著に抑制された。緩慢冷却を行った場合、実施例４のように再凍結を行っても核酸の漏出率は上がらず、脂質構造の安定性が保持された。

例３：冷却工程の有無による脂質粒子のＲＮＡ内包脂質粒子率の評価
例１に示す方法で混合工程～濃縮工程を行って脂質粒子混合液を作製した。内包するＲＮＡとしてｎＬｕｃｍＲＮＡ又はｉＣａｓｐａｓｅ９ｍＲＮＡを使用した。

脂質粒子混合液の一部を、０℃まで１℃／分で冷却し、０℃以下は０．５℃／分で－３０℃まで冷却し、－３０℃で一晩以上保管した後、氷上で融解し安定化脂質粒子混合液とした。

脂質粒子混合液（冷却工程無し）と安定化脂質粒子混合液（冷却工程あり）とからそれぞれ１μｌ分取し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）で１００倍に希釈し、０．００５％（ｖ／ｖ）になるように、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）色素を添加し、３０分暗所で静置した。同溶液に含まれる粒子数を、ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００で測定した。同溶液に４８８ｎｍのレーザー光を照射し、側方散乱光をもつ粒子をトラッキングすることで、粒子個数を計測し、総脂質粒子数とした。同じ溶液に対してレーザー光を照射し蛍光フィルタを通した蛍光を持つ粒子のみをトラッキングすることで、ＲＮＡが内包されている粒子個数を測定し、核酸内包脂質粒子数とした。核酸内包脂質粒子数の総脂質粒子における割合を算出し、内包脂質粒子率とした。結果を表７に示す。

内包脂質粒子率は、冷却工程無しの場合ｉＣａｓｐａｓｅ９（比較例４）で２３．３％、ｎＬｕｃ（比較例５）で１０．３％であった。対して、冷却工程ありの場合ｉＣａｓｐａｓｅ９（実施例５）で５７．６％、ｎＬｕｃ（実施例６）で６２．５％であった。従って、内包ＲＮＡの種類に関わらず、冷却工程を含む作製方法で作製した脂質粒子の方が、核酸が内包されている脂質粒子の割合が高くなることが明らかとなった。

例４：冷却条件が異なる自殺遺伝子を内包した脂質粒子の殺細胞率の測定
例１に示す方法で混合工程～濃縮工程を行って脂質粒子混合液を作製した。内包するＲＮＡとしてｉＣａｓｐａｓｅ９ ｍＲＮＡを使用した。その後、下記表６に示す条件で冷却工程を行った後、Ｊｕｒｋａｔ細胞へ添加した。

ヒトＴ細胞性腫瘍細胞Ｊｕｒｋａｔは、ＡＴＣＣより購入して使用した。Ｊｕｒｋａｔは、ＴｅｘＭＡＣＳ培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で培養した。細胞は３、４日ごとに、培養液を新鮮な培地で２．５～５倍に希釈して継代した。

細胞培養液からＪｕｒｋａｔ細胞を遠心で回収し、ＴｅｘＭＡＣＳに０．６５×１０^７細胞となるように懸濁した。４８ウェル培養プレートにウェルあたり細胞懸濁液を１５０μｌ、ＴｅｘＭＡＣＳを１５０μｌ加えて穏やかに混合した後、上記の各条件の脂質粒子（１．０μｇ／ウェル）を添加して、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で培養した。

培養２４時間後、１０ｍＭ ＣＩＤを添加し、更に２４時間後、７－ＡＡＤとＡｎｎｅｘｉｎ分子とを蛍光抗体によって染色し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で分析した。７－ＡＡＤ（＋）／Ａｎｎｅｘｉｎ（＋）細胞を死細胞として、殺細胞率を算出した。結果は表９に示す。

条件１（比較例４）の殺細胞率が９０％であったのに対し、条件２（実施例４）では９５％であった。したがって、実施形態の冷却方法によれば内包された核酸による効果がより効率よく得られることが分かった。

また、この実験において条件１（比較例６）の脂質粒子の内包核酸濃度は１９３ｎｇ／μｌであり、条件２（実施例７）では３０４ｎｇ／μｌであった。そのため１μｇの細胞投与有効成分核酸量を細胞に与えるために細胞に投与した脂質粒子溶液の液量は、条件１（比較例６）において５．２μｌであり、条件２（実施例７）において３．２μｌであった。したがって、条件２（実施例７）は脂質粒子の投与量を低減できることも明らかとなった。

例５．緩慢凍結条件の違いによる融解時の凝集発生の観察
例１に示す方法で混合工程～濃縮工程を行って脂質粒子混合液を作製した。その後、下記表１０に示す条件で、冷却工程を行い、融解時の反応液内の白濁（凝集）を目視で確認した。脂質粒子は各条件につき１０個のサンプルを作製し、観察を行った。

その結果、条件１（実施例８）では凝集が観察されなかったが、条件２（実施例９）では３つのサンプルで凝集が観察された。したがって、冷却工程は－３０℃まで行うことが好ましいことが明らかとなった。

例６ 冷却工程の条件が異なる脂質粒子の形状観察
例１に示す方法で混合工程～濃縮工程を行って脂質粒子混合液を作製した。内包するＲＮＡとしてｉＣａｓｐａｓｅ９ｍＲＮＡを使用した。その後、表１１に示す条件で冷却工程を行った後、低電圧透過型顕微鏡で形状の観察を行った。

各条件で作製した脂質粒子混合液を３μＬ、銅製グリッドに厚さ約１５ｎｍのカーボン膜が張られた支持膜付きグリッド上に滴下した。２分間静置後、キムワイプで余分な溶液を吸い取り、３０分間デシケータ内で観察試料を乾燥させた。乾燥した試料を、低電圧の透過型電子顕微鏡（ＬＶＥＭ５、Ｄｅｌｏｎｇ Ａｍｅｒｉｃａ社、加速電圧は５ｋＶ）で観察した。観察で得られた画像及びそのトレース図を図１１に示す。透過型電子顕微鏡から得られた条件１（比較例５）の画像を（ａ）に、そのトレース図を（ｂ）に示す。条件２（実施例７）の画像を（ｃ）に、そのトレース図を（ｄ）に示す。条件１（比較例７）では、粒径が２００ｎｍを超える大きなサイズの脂質粒子が多数観察され、脂質粒子の大きさにばらつきがあり、また脂質粒子の外周が不明瞭である。サイズの大きな脂質粒子の生成の一因として脂質粒子同士で凝集や融合が起こったことが考えられる。一方条件２（実施例１０）では、脂質粒子の外周が明瞭で脂質粒子構造が安定化しており、脂質粒子の粒子径は２００ｎｍ未満ほどでより均一である。このことから、実施形態の冷却方法によればサイズが均一化し、脂質粒子の凝集が防止され、品質が向上することが明らかとなった。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

１…脂質粒子、２…薬剤、３…第１溶液、４…第２溶液、５…有機溶媒、
６…脂質、７…水性溶媒、８…混合液、９…溶液、
ｎ…温度、ｖ…冷却速度。

Claims (16)

1. 薬剤を内包する脂質粒子の製造方法であって、
   前記薬剤を内包する前記脂質粒子を含む溶液を分速１℃以下の速度で冷却することを含む、脂質粒子の製造方法。
2. 前記冷却で、前記溶液を少なくとも－３０℃まで冷却する、請求項１に記載の方法。
3. 前記冷却は、０．５＜ｖ≦１で冷却する第１冷却と、ｖ≦０．５で冷却する第２冷却とを含み、前記ｖは冷却速度であり、単位は℃／分である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第１冷却は前記溶液の温度が０℃に達するまで行い、前記第２冷却は、前記第１冷却の後連続して行われる、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記冷却の直前に、前記溶液に凍結保護剤を添加することを更に含む、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド、糖、グリセロールのいずれかである、請求項５に記載の方法。
7. 前記冷却の直前の前記溶液中の前記凍結保護剤の含有量が１０％（体積比）以下である、請求項５又は６に記載の方法。
8. 薬剤を内包する脂質粒子を製造する方法であって、
   前記方法は、
   有機溶媒中に脂質を含む第１溶液と水性溶媒中に前記薬剤を含む第２溶液とを混合した混合液を得ることと、
   前記混合液の前記有機溶媒濃度を低下させることで前記脂質を粒子化して前記薬剤を内包した前記脂質粒子を生成することと、
   前記脂質粒子の生成により得られた前記脂質粒子を含む溶液を分速１℃以下の速度で冷却することと
   を少なくとも含む脂質粒子の製造方法。
9. 前記冷却で、前記溶液を少なくとも－３０℃まで冷却する、請求項８に記載の方法。
10. 前記冷却は、０．５＜ｖ≦１で冷却する第１冷却と、ｖ≦０．５で冷却する第２冷却とを含み、前記ｖは冷却速度であり、単位は℃／分である、請求項８又は９に記載の方法。
11. 前記第１冷却は前記溶液の温度が０℃に達するまで行い、前記第２冷却は、前記第１冷却の後連続して行われる、請求項８～１０の何れか１項に記載の方法。
12. 前記冷却の直前に、前記溶液に凍結保護剤を添加することを更に含む、請求項８～１１の何れか１項に記載の方法。
13. 前記凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド、糖、グリセロールのいずれかである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記冷却の直前の前記溶液中の前記凍結保護剤の含有量が１０％（体積比）以下である、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記薬剤は核酸であり、
    前記混合の前に前記薬剤を凝縮することを更に含む、請求項８～１４の何れか１項に記載の方法。
16. 前記脂質粒子の生成後、前記冷却の前に、前記溶液に含まれる前記脂質粒子を濃縮することを更に含む、請求項８～１５の何れか１項に記載の方法。

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