WO2020029112A1 - 脱硫化弧菌属菌测试组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Definitions

  • Another object of the present invention is to provide a method for testing Desulfovibrio spp. In a reservoir.
  • the above set of test bottles after adding the sample to be tested is cultured in an incubator at a temperature of 30 ° C, and the changes in the test bottles are observed after 7 days of cultivation, so that the number of Desulfovibrio spp.
  • each original reagent material is commercially available.
  • the wellhead produced fluids from Liaohe Oilfield, Cainan Oilfield, Shengli Oilfield, and Changqing Oilfield were selected, and the desulfurization of Vibrio spp. In the reservoir was determined by using the test bottle of Example 1. Some test data are shown in Table 1. The results of multiple tests showed that the black reservoir produced a large amount of black precipitate on the first day of the test bottle after inoculation, and the test bottle rarely appeared jumping and spaced growth.
  • the culture in the test bottle was cultured using the Hengate roller tube method, and identified by morphological, physiological, biochemical and genetic characteristics.
  • the bacteria isolated from Liaohe Oilfield, Cainan Oilfield, Shengli Oilfield, and Changqing Oilfield are basically Desulfovibrio spp. Desulfurization Vibrio and Alaska Desulfurization Vibrio showed that the test bottle was specific for the detection of Desulfovibrio.

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Abstract

一种脱硫化弧菌属菌测试组合物及其制备方法与应用。所述脱硫化弧菌属菌测试组合物包括：培养液，该培养液的组分包括硫酸镁、磷酸氢二钾、酵母浸粉、柠檬酸三钠、半胱氨酸盐酸盐和刃天青；储存液，该储存液的组分包括硫酸亚铁铵和抗坏血酸。测样前，储存液加入到培养液中，配成完整的测试瓶。上述脱硫化弧菌属测试瓶适用于油藏硫酸盐还原菌生态分布分析和微生物采油等领域。

Description

脱硫化弧菌属菌测试组合物及其制备方法与应用 技术领域
本发明是关于一种脱硫化弧菌属菌测试组合物及其制备方法与应用，属于微生物检测技术领域。
背景技术
脱硫化弧菌属菌为硫酸盐还原菌，是一类广泛存在于厌氧环境、能以硫酸盐等氧化态硫化物，或元素硫(单质硫)作为电子受体还原为硫化合物的微生物。1895年，荷兰微生物学家拜叶林(Beijerinck)首次发现了硫酸盐还原菌并确定为脱硫化弧菌属。目前，合格发表的脱硫化弧菌属已有67种8亚种，是已发现的数量最多的硫酸盐还原菌，也是所有硫酸盐还原菌中研究最为热门的，最具有代表性。在极端的油藏环境中，脱硫化弧菌属是参与物质和能量循环的重要微生物，也是微生物驱油、微生物腐蚀及硫化氢成因研究的热点。然而，要深入地研究油藏中的脱硫化弧菌属，就必须准确快速地测定其数量，因此，研发快速检测脱硫化弧菌属菌数量的方法至关重要。
目前硫酸盐还原菌的快速检测方法很多，包括测试瓶法、镜检法、APS还原酶测定法、萤光检测法、选择电极法和生物发光法等。其中测试瓶法是一种非常适用于现场快速检测的硫酸盐还原菌的方法，但该测试方法尚未能有针对性的对脱硫化弧菌属进行检测。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种能快速检测脱硫化弧菌属菌的测试组合物。
本发明的另一目的在于提供一种脱硫化弧菌属菌测试组合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述脱硫化弧菌属菌测试组合物的应用。
本发明的另一目的在于提供一种测试油藏脱硫化弧菌属菌的方法。
一方面，本发明提供了一种脱硫化弧菌属菌测试组合物，其包括：
培养液，该培养液的组分包括硫酸镁、磷酸氢二钾、酵母浸粉、柠檬酸三钠、半胱氨酸盐酸盐和刃天青；
储存液，该储存液的组分包括硫酸亚铁铵和抗坏血酸。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物中，所述培养液是由所述组分与水混合后经充氮除氧、灭菌、冷却制成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物，所述培养液中，各组分浓度为：
七水硫酸镁0.01～1.0g/L、磷酸氢二钾0.01～0.02g/L、酵母浸粉0.5～1.0g/L、柠檬酸三钠4～12g/L、半胱氨酸盐酸盐0.4～0.6g/L和刃天青0.0005～0.002g/L，调节pH至6～8。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物中，所述培养液是用10M氢氧化钾调节pH至6～8。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物中，所述培养液是容装在厌氧管中。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物中，每支厌氧管容积15mL，培养液容装量8.8mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物中，所述储存液是由所述组分与水混合配制而成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物，所述储存液中，各组分浓度为：
硫酸亚铁铵0.8～3.2g/L，抗坏血酸0.2～0.3g/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脱硫化弧菌属菌测试组合物中，所述储存液是容装在灭过菌的厌氧瓶中。
另一方面，本发明还提供了一种制备所述的脱硫化弧菌属菌测试组合物的方法，该方法包括分别配制培养液和储存液的过程。进一步地，该方法还可包括将储存液加入到培养液中的过程，以现场配制成完成的即刻可用的测定瓶。
另一方面，本发明还提供了所述的脱硫化弧菌属菌测试组合物在测试油藏脱硫化弧菌属菌中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种测试油藏脱硫化弧菌属菌的方法，该方法包括：
将本发明所述的脱硫化弧菌属菌测试组合物中的储存液加入到培养液中，每8.8mL培养液加入0.2mL储存液，配成一个完整的测试瓶；
取多个测试瓶(1号、2号、3号、4号……)，用多支相同的无菌注射器，注入 1mL待测液到1号测试瓶内，充分震荡；另取一支无菌注射器从摇匀后的1号测试瓶内取出1mL液体注入到2号测试瓶内，充分震荡；再另取一支无菌注射器从摇匀后的2号测试瓶内取出1mL液体注入到3号测试瓶内，充分震荡；依次重复上述操作程序，直到最后一瓶；
把上述加入待测样后的一组测试瓶放在30℃温度的培养箱内培养，经过7天培养观察测试瓶内的变化，从而可判断脱硫化弧菌属的数量。
在本发明的一具体实施方案中，是按照以下操作配制完整的测试瓶：
在常温下分别称取七水硫酸镁0.01～1.0g/L、磷酸氢二钾0.01～0.02g/L、酵母浸粉0.5～1.0g/L、柠檬酸三钠4～12g/L、半胱氨酸盐酸盐0.4～0.6g/L和刃天青0.0005～0.002g/L，用10M氢氧化钾调节pH至6～8。分装至厌氧管(每管8.8mL)充氮除氧、15磅，121℃下灭菌20min、冷却待用。称取硫酸亚铁铵0.8～3.2g/L和抗坏血酸0.2～0.3g/L，溶解于1L的去离子水中用0.25μm无菌滤器注入灭过菌的空厌氧瓶中做成储存液(储存液不用时放入4℃冰箱保存)。测样前，加入0.2mL储存液到上述溶液，配成完整的测试瓶。
本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
本发明所生产的脱硫化弧菌属测试瓶能够快速准确地测定脱硫化弧菌属的菌数、操作简单、携带方便、适用于现场检测，可满足油藏微生物研究的要求。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得。
实施例1：脱硫化弧菌属测试瓶制作
首先，准确称取七水硫酸镁0.01g/L、磷酸氢二钾0.01g/L、酵母浸粉1.0g/L、柠檬酸三钠12g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L和刃天青0.001g/L，调节pH至6。分装至厌氧管(每管8.8mL)充氮除氧、15磅，121℃下灭菌20min、冷却待用。称取硫酸亚铁铵3.2g/L和抗坏血酸0.2g/L，溶解于1L的去离子水中用0.25μm无菌滤器注入灭过菌的空厌氧瓶中做成储存液(储存液不用时放入4℃冰箱保存)。测样前，加入0.2mL储存液到上述溶液，配成完整的测试瓶。
实施例2：实际测定操作步骤
根据待测样中脱硫化弧菌属的大致数量，将数个上述所制成的测试瓶排成一组，并依次编上序号1、2、3、4……；用数支相同的1mL无菌注射器，注入到1号测试瓶内，充分震荡10秒；另取一支无菌注射器从摇匀后的1号测试瓶内取出1mL液体注入到2号测试瓶内，充分震荡10秒；再另取一支无菌注射器从摇匀后的2号测试瓶内取出1mL液体注入到3号测试瓶内，充分震荡10秒；依次重复上述操作程序，一直到最后一瓶为止；注射过程中一旦发现测试瓶出现红色，则表明测试瓶内进入氧气(刃天青见氧变红)，该测试瓶废弃。把上述加入待测样后的一组测试瓶放在30℃温度的培养箱内培养，经过7天培养观察测试瓶内的变化(测试瓶中出现黑色沉淀)，判断脱硫化弧菌属测试瓶的变化数量。
实施例3：不同油藏脱硫化弧菌属测定
分别选取辽河油田、彩南油田、胜利油田和长庆油田井口采出液，利用实施例1的测试瓶进行油藏脱硫化弧菌属测定，部分试验数据如表1所示。多次试验结果表明，4个油藏采出液在接种后测试瓶第一天即可出现大量黑色沉淀，而且测试瓶中极少出现跳跃、间隔生长的现象。
表1不同油藏脱硫化弧菌属测定试验结果
Figure PCTCN2018099338-appb-000001
为验证该测试瓶测定的准确性，采用亨盖特滚管法对测试瓶中的培养物进行培养，通过形态学、生理生化特征和遗传学特征鉴定。分别从辽河油田、彩南油田、胜利油田和长庆油田分离到的菌基本上都是脱硫化弧菌属，如白蚁脱硫化弧菌、墨西哥脱硫化弧菌、嗜胺脱硫化弧菌、普通脱硫化弧菌和阿拉斯加脱硫化弧菌，表明该测试瓶对脱硫化弧菌属的检测具有专一性。
实施例4：与SRB-HX-7型测试瓶比对试验
SRB-HX-7型硫酸盐还原菌测试瓶是中国石油天然气集团公司根据《碎屑岩油藏注水水质推荐指标及分析方法》(SY/T 5329-94)(如今已经更改为《碎屑岩油藏注水水质指标及分析方法》(SY/T 5329-2012)，但所依据的测试方法并没有升级)开发的硫酸盐还原菌测定方法，是目前应用最广泛的硫酸盐还原菌测试瓶，但是该测试瓶对脱硫化弧菌属的专一性检测不准或者落伍。
分别选取长庆油田关130-150、关135-149和关125-175井口采出液同时进行本发明实施例1的测试瓶和SRB-HX-7型测试瓶的对比试验，部分试验数据如表2所示。本发明实施例1的测试瓶和SRB-HX-7型测试瓶对比结果显示，本发明实施例1的测试瓶较SRB-HX-7型测试瓶检测速度更快，另外，新测试瓶可以指示氧气浓度，弥补了SRB-HX-7型测试瓶的缺点。
表2新测试瓶与SRB-HX-7型测试瓶对比试验结果
Figure PCTCN2018099338-appb-000002
为验证两种测试瓶测定的准确性，同时采用亨盖特滚管法对本发明实施例1的测试瓶和SRB-HX-7型测试瓶中的培养物进行培养，通过形态学、生理生化特征和遗传学特征鉴定，从本发明实施例1的测试瓶中分离到的菌基本上都是脱硫化弧菌属菌种，包括普通脱硫化弧菌、耐冷脱硫化弧菌和阿拉斯加脱硫化弧菌。从SRB-HX-7型测试瓶中除分离到脱硫化弧菌属外，更多是梭菌属，如水井坊梭菌，以及柠檬杆菌属，如科泽氏柠檬杆菌和假柠檬杆菌属，如人类假柠檬杆菌。这表明本发明的测试瓶对脱硫化弧菌属的检测更具准确性。

Claims (12)

  1. 一种脱硫化弧菌属菌测试组合物，其包括：
    培养液，该培养液的组分包括硫酸镁、磷酸氢二钾、酵母浸粉、柠檬酸三钠、半胱氨酸盐酸盐和刃天青；
    储存液，该储存液的组分包括硫酸亚铁铵和抗坏血酸。
  2. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述培养液是由所述组分与水混合后经充氮除氧、灭菌、冷却制成。
  3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述培养液中，各组分浓度为：
    七水硫酸镁0.01～1.0g/L、磷酸氢二钾0.01～0.02g/L、酵母浸粉0.5～1.0g/L、柠檬酸三钠4～12g/L、半胱氨酸盐酸盐0.4～0.6g/L和刃天青0.0005～0.002g/L，调节pH至6～8。
  4. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述培养液是容装在厌氧管中。
  5. 根据权利要求4所述的组合物，其中，每支厌氧管容积15mL，培养液容装量8.8mL。
  6. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述储存液是由所述组分与水混合配制而成。
  7. 根据权利要求1或6所述的组合物，其中，所述储存液中，各组分浓度为：
    硫酸亚铁铵0.8～3.2g/L，抗坏血酸0.2～0.3g/L。
  8. 根据权利要求1或6所述的组合物，其中，所述储存液是容装在灭过菌的厌氧瓶中。
  9. 一种制备权利要求1～8任一项所述的脱硫化弧菌属菌测试组合物的方法，该方法包括分别配制培养液和储存液的过程。
  10. 根据权利要求9所述的方法，该方法还包括将储存液加入到培养液中的过程。
  11. 权利要求1～8任一项所述的脱硫化弧菌属菌测试组合物在测试油藏脱硫化弧菌属菌中的应用。
  12. 一种测试油藏脱硫化弧菌属菌的方法，该方法包括：
    将权利要求1～8任一项所述的脱硫化弧菌属菌测试组合物中的储存液加入到培养液中，每8.8mL培养液加入0.2mL储存液，配成一个完整的测试瓶；
    取多个测试瓶(1号、2号、3号、4号……)，用多支相同的无菌注射器，注入 1mL待测液到1号测试瓶内，充分震荡；另取一支无菌注射器从摇匀后的1号测试瓶内取出1mL液体注入到2号测试瓶内，充分震荡；再另取一支无菌注射器从摇匀后的2号测试瓶内取出1mL液体注入到3号测试瓶内，充分震荡；依次重复上述操作程序，直到最后一瓶；
    把上述加入待测样后的一组测试瓶放在30℃温度的培养箱内培养，经过7天培养观察测试瓶内的变化。
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