WO2020008752A1 - 小型ｒｎａの抽出効率を改善するための組成物および方法 - Google Patents

小型ｒｎａの抽出効率を改善するための組成物および方法 Download PDF

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WO2020008752A1
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WO
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small rna
extraction efficiency
improving agent
rna extraction
efficiency improving
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PCT/JP2019/020838
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有純 菊池
卓宏 澤村
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社会医療法人大雄会
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the present invention relates to a small RNA extraction efficiency improving agent and a method for isolating RNA using the same.
  • MicroRNA is a small single-stranded non-coding RNA having a length of about 21 to 25 bases, and more than 20,000 types have been identified so far (http://mirbase.org/). These miRNAs have the function of binding to target mRNA and controlling the expression of mRNA, and have been shown to be involved in various biological processes such as cell proliferation, differentiation, and apoptosis. . It is expected that about 30% of human genes are regulated by miRNA. In recent years, it has been suggested that abnormal expression of miRNA affects the onset and pathology of various diseases including cancer (Non-Patent Documents 1 and 2). Since miRNA is contained in exosomes secreted from cells and is present in body fluids such as blood and urine, attention is paid to a minimally invasive liquid biopsy that diagnoses diseases by detecting and quantifying miRNAs in body fluids. Are gathering.
  • Real-time RT-PCR is a method suitable for making a diagnosis in a clinical setting because it can obtain a result in a short time of about several hours and can be carried out with a simple device.
  • it is necessary to isolate miRNA with high accuracy and high yield.
  • a boom method based on adsorbing a nucleic acid molecule to a silica carrier in the presence of a chaotropic salt is generally used (Non-Patent Document 3).
  • the object of the present invention is to solve the problems of the prior art and to provide a method for extracting miRNA from a biological sample with high yield and high precision by a safe and simple operation.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that the extraction efficiency of miRNA is significantly improved by adding a high molecular weight polyethylene glycol to a nucleic acid extract containing a chaotropic salt in the boom method.
  • high molecular weight polyethylene glycol is a solid at normal temperature and is a liquid having a very high viscosity even when heated and melted, there is a problem that it is difficult to weigh it with a pipette.
  • the present inventors have diligently studied a composition excellent in operability while maintaining the effect of improving the extraction efficiency of miRNA by high molecular weight polyethylene glycol. As a result, they have found that a mixture of polyethylene glycol and tetraethylene glycol dimethyl ether is excellent in operability and stability and can improve the extraction efficiency of miRNA to the same degree as high molecular weight polyethylene glycol.
  • the present invention provides a small RNA extraction efficiency improving agent comprising the following components: (a) polyethylene glycol, and (b) tetraethylene glycol dimethyl ether.
  • the polyethylene glycol preferably has an average molecular weight of 600 to 2,000.
  • the ratio of the component (a) to the component (b) is preferably 3: 7 to 6: 4.
  • the content of the component (a) is preferably 20 to 60% by volume, and the content of the component (b) is preferably 25 to 70% by volume.
  • the small RNA extraction efficiency improving agent further contains a chaotropic salt.
  • the chaotropic salt is preferably guanidine thiocyanate.
  • the small RNA extraction efficiency improving agent is preferably liquid in a temperature range of 15 to 35 ° C and has a viscosity that can be measured by a micropipette.
  • the present invention is a method for extracting small RNA from a sample, comprising: (i) preparing a sample containing the small RNA; and (ii) adding a chaotropic salt to the sample. (Iii) adding the small RNA extraction efficiency improving agent to the first mixture obtained in the step (ii), and (iv) the step (iii). Contacting the second mixed solution obtained by the above with a nucleic acid-binding carrier containing silica, whereby small RNA was bound to the nucleic acid-binding carrier, and (v) the small RNA was bound to the nucleic acid-binding carrier. Eluting the small RNA.
  • the present invention is a method for analyzing microRNA in a biological sample, the method comprising: (i) preparing a biological sample containing microRNA; Adding a solution containing a chaotropic salt to the first mixture, (iii) adding the above-mentioned small RNA extraction efficiency improving agent to the first mixture obtained in the step (ii), and (iv) Contacting the second mixture obtained in step (iii) with a nucleic acid-binding carrier containing silica, whereby the total RNA containing microRNAs binds to the nucleic acid-binding carrier, and (v) Eluting the total RNA bound to the nucleic acid binding carrier, and (vi) subjecting the microRNA in the total RNA obtained in the step (v) to quantitative RT-PCR.
  • Ri is to provide a method and a step of amplifying.
  • the biological sample is preferably a body fluid or a tissue section.
  • the concentration of the small RNA extraction efficiency improving agent in the second mixed solution is preferably 20 to 60% by volume.
  • the small RNA extraction efficiency improving agent according to the present invention has excellent operability and stability, and is capable of extracting total RNA including miRNA by adding it to a nucleic acid extract containing chaotropic salts in an already established boom method. Efficiency can be improved. Therefore, miRNA with high yield and high accuracy can be obtained by the same safe and simple operation as in the past, simply by applying the small RNA extraction efficiency improving agent according to the present invention to a commercially available general RNA extraction kit. Can be extracted.
  • the miRNA yield is improved, so that even low-expression miRNAs can be quantitatively analyzed with high accuracy.
  • the present invention is a small RNA extraction efficiency improving agent comprising the following components: (a) polyethylene glycol, and (b) tetraethylene glycol dimethyl ether.
  • RNA means RNA of about 10 nucleotides or more and less than 200 nucleotides in vivo. Examples include, but are not limited to, tRNA, rRNA, snRNA (small @ nuclear @ RNA), miRNA (microRNA), and the like. A preferred small RNA in the present embodiment is a miRNA.
  • polyethylene glycol (hereinafter also referred to as “PEG”) in the present embodiment
  • PEG polyethylene glycol
  • those having an arbitrary average molecular weight can be used.
  • the PEG can be used alone or in combination of two or more.
  • the PEG in the present embodiment is preferably PEG having an average molecular weight of 600 to 2,000, particularly preferably PEG having an average molecular weight of 1,000 to 2,000, and most preferably PEG1000, PEG1540 or PEG2000.
  • the component (a) PEG and the component (b) tetraethylene glycol dimethyl ether may be mixed in any ratio, for example, 1: 9, 2: 8, 3: 7, 4: 6, 5: 5, 6: 4, 7: 3, 8: 2, 9: 1 may be mixed, but preferably mixed in a ratio of 3: 7 to 6: 4, : 7 to 5: 5 is particularly preferred.
  • the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment contains the above components (a) and (b) in the above ratio, components other than the above components (a) and (b) are used in the present embodiment. It can be appropriately blended within a range that does not impair the effect. That is, the content of the component (a) PEG in the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment is preferably 20 to 60% (v / v) when the total volume of the small RNA extraction efficiency improving agent is 100%. ), And particularly preferably 45 to 55% (v / v).
  • the content of the component (b) tetraethylene glycol dimethyl ether in the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment is preferably 25 to 70% when the total volume of the small RNA extraction efficiency improving agent is 100% ( v / v), particularly preferably 40 to 60% (v / v).
  • the small RNA extraction efficiency improving agent preferably further contains a chaotropic salt as a component other than the components (a) and (b).
  • a chaotropic salt in the present embodiment is not limited to the following, but examples include guanidine thiocyanate, guanidine hydrochloride, sodium thiocyanate, sodium iodide, potassium iodide, and urea. In this embodiment, only one of these chaotropic salts or a mixture of two or more thereof can be used.
  • the chaotropic salt in the present embodiment is guanidine thiocyanate.
  • the concentration of the chaotropic salt added to the small RNA extraction efficiency improving agent can be appropriately selected, for example, in the range of 20 to 30% (w / v).
  • the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment may be appropriately blended with other components for further improving the small RNA extraction effect and / or improving the stability.
  • the other components include 1- (2-aminoethyl) piperazine, diethylenetriamine, and the like, and these can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the other component added to the small RNA extraction efficiency improving agent can be appropriately selected, for example, in the range of 0.01 to 5% (v / v).
  • the method for producing the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment is not particularly limited, and it can be produced by mixing the above components.
  • the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment has low viscosity and stability at room temperature, and can be weighed easily and accurately. That is, it is preferable that the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment is liquid in a temperature range of 15 to 35 ° C. and has a viscosity weighable by a micropipette.
  • the “viscosity” in the present embodiment can be determined using, for example, a rotational viscometer.
  • the viscosity of the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment is preferably 30 mPa ⁇ s or less, particularly preferably 20 mPa ⁇ s or less.
  • the small RNA extraction efficiency improving agent of the present embodiment can be used in combination with a commercially available RNA extraction kit based on the boom method, and by the same safe and simple operation as in the past, high yield and high precision small RNA Can be extracted.
  • the present invention provides, according to the second embodiment, a method for extracting small RNA from a sample, comprising: (i) preparing a sample containing small RNA; Adding a solution containing a chaotropic salt, (iii) adding the above-mentioned small RNA extraction efficiency improving agent to the first mixed solution obtained in the step (ii), and (iv) the step (iv) contacting the second mixture obtained in iii) with a nucleic acid-binding carrier containing silica, whereby small RNAs are bound to the nucleic acid-binding carrier, and (v) the nucleic acid-binding carrier is Eluting the bound small RNA.
  • a sample containing small RNA is prepared and used.
  • “Small RNA” in the present embodiment is the same as that defined in the first embodiment.
  • the “sample” in the present embodiment may be any sample containing small RNA, for example, a solution containing small RNA, a cell lysate, or the like.
  • the cell lysate may be prepared from any cells, for example, eukaryotic cells, prokaryotic cells, viruses, and the like.
  • the sample in the present embodiment may be a biological sample as described in detail in the third embodiment.
  • a solution containing a chaotropic salt is added to the sample containing the small RNA, whereby a first mixed solution is obtained.
  • the “chaotropic salt” in the present embodiment is the same as that defined in the first embodiment.
  • the concentration of the chaotropic salt in this embodiment may be in accordance with the general conditions of the boom method, and may be, for example, 0.1 to 10 M in the second mixed solution after adding the small RNA extraction efficiency improving agent, Preferably it may be in the range of 2.5-5M.
  • the solution containing a chaotropic salt in the present embodiment may contain a reducing agent, a surfactant and / or a buffer in addition to the chaotropic salt.
  • a reducing agent for example, 2-mercaptoethanol or dithiothreitol can be added preferably at a concentration of 25 to 150 mM.
  • the surfactant may be ionic or non-ionic, for example, SDS, CHAPS, Tween TM 20, Triton @ X-100 TM, NP-40 TM, and the like, preferably 0%. It can be added at a concentration of 1-10% (w / v). Any buffer may be used as long as it stabilizes the solution within the pH range of 6.0 to 9.0.
  • Tris, HEPES, PIPES, MOPS, or the like is preferably added at a concentration of 1 to 10 mM. it can.
  • a solution containing a chaotropic salt as described above is commercially available as a kit in combination with a nucleic acid-binding carrier described below.
  • a commercially available product can also be used.
  • High Pure MiRNA Isolation Kit (Roche Diagnostics), MagNA Pure Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics), RNeasy Mini Kit (Qiagen), miRNeasyKiMinKiMinKiMinKi MiniKiMinAi Thermo Fisher Scientific), PureLink ⁇ miRNA ⁇ Isolation ⁇ Kit (Thermo Fisher Scientific), FastGene ⁇ RNA ⁇ Premium ⁇ Kit (Japan Genetics), Nucleo ⁇ Spin ⁇ miRNA (Machray Nagel), mirVana ⁇ miRNA Etc. Kit (Thermo Fisher Scientific) are mentioned as preferable commercial products.
  • a small RNA extraction efficiency improving agent is added to the first mixed solution obtained above, thereby obtaining a second mixed solution.
  • the “small RNA extraction efficiency improving agent” in the present embodiment is the same as that defined in the first embodiment.
  • the small RNA extraction efficiency improving agent in this embodiment is preferably added at a concentration of, for example, 20 to 60% (v / v) in the second mixed solution after the small RNA extraction efficiency improving agent is added. It is particularly preferred to add at a concentration of 5050% (v / v).
  • the order in which the solution containing the chaotropic salt and the small RNA extraction efficiency improving agent are added can be changed mutually, or they can be added simultaneously. That is, a mixed solution in which a small RNA extraction efficiency improving agent is added to a sample containing small RNA is first prepared, and then a solution containing a chaotropic salt may be added to the obtained mixed solution, or a mixture containing small RNA may be added. A solution containing a chaotropic salt and a small RNA extraction efficiency improving agent may be simultaneously added to the sample.
  • the second mixed solution obtained above is brought into contact with a nucleic acid-binding carrier containing silica, whereby the RNA in the sample is bound to the nucleic acid-binding carrier.
  • a silica-based carrier generally used in the boom method can be used, and for example, silica beads, glass beads, silica wool, glass fibers, and the like can be used.
  • the silica beads may be beads made of only silica, or may be magnetic silica beads in which magnetic beads are coated with silica.
  • a nucleic acid binding carrier is commercially available as a kit in combination with a solution containing a chaotropic salt as described above, and in the present embodiment, such a commercially available product can also be used.
  • the contact between the mixture and the nucleic acid-binding carrier is performed, for example, by mixing the mixture and the nucleic acid-binding carrier in a container, or by passing the mixture through a column or the like filled with the nucleic acid-binding carrier. It can be carried out. Thereafter, the nucleic acid binding carrier is separated from the mixture and recovered.
  • the recovered nucleic acid-binding carrier may optionally contain a washing solution (for example, 70% (v / v), which does not solubilize RNA and can solubilize nonspecific binding substances before eluting the following RNA. v) the above aqueous solution containing ethanol).
  • a washing solution for example, 70% (v / v)
  • RNA v
  • RNA bound to the nucleic acid binding carrier is eluted.
  • Elution of RNA can be performed, for example, by contacting an eluate such as nuclease-free water or a buffer with a low salt concentration with a nucleic acid binding carrier containing silica.
  • the contact between the eluate and the nucleic acid-binding carrier can be performed in the same manner as the contact between the above-mentioned mixture and the nucleic acid-binding carrier.
  • the eluate is separated from the nucleic acid binding carrier and collected.
  • an automatic nucleic acid extraction device based on the boom method is commercially available, and the above-described series of operations in the method of the present embodiment can be performed using such a commercially available device and a kit attached thereto.
  • Examples of the automatic nucleic acid extraction device and the kit attached thereto that can be used in the method of the present embodiment include, for example, MagNA ⁇ Pure ⁇ 96 ⁇ Instrument and MagNA ⁇ Pure ⁇ 96 ⁇ Cellular ⁇ RNA ⁇ Large ⁇ Volume ⁇ Kit (Roche Diagnostics), Maxwell ⁇ RSC ⁇ InstrumentSCR Simply RNA Tissue Kit (Promega), kingfisher instrument and MagMAX mirVana Total RNA (Thermo Fisher Scientific), QIAcube and RNeasy Mini QIACube Kit (Qiagen) and the like.
  • the method of the present embodiment can use the same solution or nucleic acid-binding carrier as that used in the conventionally known boom method, except that a small RNA extraction efficiency improving agent is used, and the conditions for binding and elution of nucleic acids are also conventional. It can be carried out in the same manner as a known boom method. Therefore, according to the method of the present embodiment, small RNA can be extracted with high yield and high accuracy by the same safe and simple operation as in the past without the necessity of examining new conditions.
  • RNA isolated from a biological sample by the method of the present embodiment is useful for quantitative analysis of miRNA.
  • the present invention provides a method for analyzing microRNA in a biological sample, comprising: (i) preparing a biological sample containing microRNA; (Iv) adding a solution containing a chaotropic salt to a biological sample; (iii) adding the small RNA extraction efficiency improving agent to the first mixture obtained in the step (ii); Contacting the second mixture obtained in the step (iii) with a nucleic acid-binding carrier containing silica, whereby the total RNA containing microRNAs binds to the nucleic acid-binding carrier, v) eluting the total RNA bound to the nucleic acid-binding carrier, and (vi) quantitatively reducing the microRNA in the total RNA obtained in the step (v) by RT-
  • the method comprising the steps of amplifying by CR.
  • total RNA including microRNA is purified from a biological sample by the same procedure as in the method of the second embodiment.
  • the “chaotropic salt”, “small RNA extraction efficiency improving agent” and “nucleic acid binding carrier” in the present embodiment are the same as those defined in the second embodiment.
  • Micro RNA is a single-stranded non-coding RNA having a length of 21 to 25 bases existing in a living body. miRNA is produced through the following multi-step steps. First, the precursor pri-miRNA is transcribed from the miRNA gene. Next, the pri-miRNA is cleaved by Drosha in the nucleus to become a pre-miRNA. Next, the pre-miRNA is cleaved by Dicer in the cytoplasm to form a mature double-stranded miRNA, one of which is degraded and removed to generate a single-stranded miRNA.
  • the miRNA in the present embodiment means the miRNA that is the final product, and does not include an intermediate product.
  • the “biological sample” targeted by the method of the present embodiment may be any biological sample isolated from any living body, for example, animals such as mice, rats, rabbits, dogs, non-human primates, and humans It may be a tissue section, a cell or a body fluid isolated from an individual, but is not particularly limited.
  • Tissue sections or tissues from which cells are derived include, for example, brain, myocardium, skeletal muscle, lung, trachea, pharynx, salivary gland, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, pancreas, liver, gallbladder, blood vessels, kidney, bladder, ureter , Testis, prostate, ovary, uterus, bone marrow, lymph node, spleen, thymus, pituitary, thyroid, parathyroid, adrenal gland, skeletal muscle, abdominal cavity, skin, mammary gland and the like.
  • the biological sample in the present embodiment is preferably a body fluid or a tissue section, particularly preferably a human-derived body fluid or a tissue section.
  • the biological sample in the present embodiment can be obtained from an animal individual by a method well known to those skilled in the art.
  • the tissue section may be prepared from a tissue acutely isolated from an animal individual or prepared from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue (FFPET). May be done.
  • RT-qPCR quantitative RT-PCR
  • a method for quantitative analysis is well established, and based on a Cp value (also referred to as a Ct value) calculated from the result of real-time qPCR, for example, a target miRNA can be obtained by a ⁇ Ct method, a calibration curve method, or the like. It can be quantified.
  • Kits for amplifying miRNA by RT-qPCR are commercially available, and in the present embodiment, such commercially available products can also be used.
  • miRCURY LNA miRNA PCR Assays Qiagen
  • MyStiCp micro RNA RNA Quantitative PCR Sigma-Aldrich
  • Mirror-X miRNA qRT-PCR TB Green Green Kit TakaraBio RNA Fick
  • the method of the present embodiment is useful because a small RNA extraction efficiency improver can be used to extract even a low-expression miRNA without impairing the quantitative property, and the miRNA can be quantified with high accuracy. is there.
  • a standard sample containing miRNA was prepared by the following procedure.
  • Solution (100 nM) of miR-21 (5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 ′) (SEQ ID NO: 1) chemically synthesized using TE buffer (pH 8.0) containing 10 ng / ⁇ L salmon sperm DNA (Hokkaido System Science) was prepared.
  • BE Binding Enhancer
  • ethanol Wako Pure Chemical
  • 2-propanol Kanto Chemical
  • PEG600 Kanto Chemical
  • PEG1000 Kanto Chemical
  • PEG1540 Kanto Chemical
  • PEG2000 Kanto Chemical
  • TEGDME tetraethylene glycol dimethyl ether
  • cDNA was synthesized using Transscriptor First First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics).
  • a stem loop RT primer (5'-GTCAGAGGAGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCTCTCTCTGACTCAACA-3 ': SEQ ID NO: 2) was used.
  • the composition of the reaction solution was in accordance with the description of the instructions attached to the kit (1/2 scale).
  • the reverse transcription reaction was performed using an Applied Biosystems (trademark) 2720 thermal cycler under the following conditions.
  • Step 1 (1 cycle): 30 minutes at 16 ° C.
  • Steps 2 to 4 60 cycles: 30 seconds at 30 ° C., 30 seconds at 42 ° C., 1 second at 50 ° C.
  • Step 5 (1 cycle): 85 ° C., 5 minutes
  • Step 1 (1 cycle): 95 ° C. for 10 minutes
  • Steps 2 to 3 45 cycles: 95 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 30 seconds
  • compositions that improves extraction efficiency of miRNA (1)> While high-molecular-weight PEG can significantly improve the extraction efficiency of miRNA, it is difficult to accurately weigh it with a pipette because it is solid at normal temperature and has an extremely high viscosity even when heated and melted. Therefore, it was examined whether or not the above problem could be solved by mixing high molecular weight PEG and TEGDME. Compositions were prepared by mixing PEG 1540 and TEGDME at various ratios and incubated at 60 ° C. Thereafter, the viscosity was measured in a 50 ° C. incubator using a viscometer (VISCO-895, Atago). The measurement was performed in quintuple, and the average value ⁇ SD was used as the measured value. Further, the Cp value when each composition was added was calculated by the same procedure as in the above 1 (addition amount: 200 ⁇ L or 300 ⁇ L, duplicate measurement).
  • a PEG / TEGDME mixture (mixing ratio 1: 1) was prepared using PEG600, PEG1000 or PEG2000 instead of PEG1540, the viscosity was measured in the same manner as above, and the Cp value was calculated (addition amount: 200 ⁇ L). Or 300 ⁇ L, quintuple measurement).
  • composition 1 Based on PEG1540 / TEGDME (mixing ratio 1: 1) (composition 1), additional components: guanidine thiocyanate (hereinafter referred to as “GuSCN”) (Wako Pure Chemical), ethanol (Wako Pure Chemical), 1 Compositions 2 to 5 containing-(2-aminoethyl) piperazine (hereinafter referred to as “piperazine”) (Sigma-Aldrich) and / or diethylenetriamine (hereinafter referred to as “DETA”) (Sigma-Aldrich) 6 was prepared.
  • GuSCN guanidine thiocyanate
  • piperazine Sigma-Aldrich
  • DETA diethylenetriamine
  • RNA extraction from FFPET sample using high molecular weight PEG / TEGDME mixture Using a FFFET sample from a cancer patient instead of a standard sample, it was tested how much the high molecular weight PEG / TEGDME mixture can improve the efficiency of miRNA extraction from a biological sample.
  • FFPET sections (thickness: 5 ⁇ m) prepared from the large intestine collected from a colon cancer patient were collected from a slide glass into a microtube, 800 ⁇ L of xylene was added, and the mixture was incubated at room temperature for 5 minutes. Thereafter, 400 ⁇ L of ethanol was added and mixed, and the mixture was centrifuged at 13000 rpm for 2 minutes to remove the supernatant. 1000 ⁇ L of ethanol was added thereto, mixed again, centrifuged at 13000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was removed.
  • a miRNA was extracted by adding a high-molecular-weight PEG / TEGDME mixture in the same procedure as in 1 above, except that the obtained tissue lysate (150 ⁇ L) was used in place of the standard sample. -QPCR was performed to calculate the Cp value (addition amount: 200 ⁇ L or 300 ⁇ L, quintuple measurement).
  • composition containing high molecular weight PEG and TEGDME can significantly improve the extraction efficiency of miRNA, and was shown to be useful for more accurately quantifying miRNA.
  • RNA extraction from body fluid samples using high molecular weight PEG / TEGDME mixtures Using a serum sample from a healthy person instead of the standard sample, it was tested how much the high molecular weight PEG / TEGDME mixture can improve the efficiency of miRNA extraction from a body fluid sample.
  • a PEG1540 / TEGDME mixture (mixing ratio 1: 1) was added to extract miRNA, and miR-mRNA was extracted in the same procedure as in 1 above, except that the obtained supernatant (150 ⁇ L) was used instead of the standard sample.
  • RT-qPCR was performed on 21 to calculate the Cp value (addition amount: 200 ⁇ L or 300 ⁇ L, quintuple measurement).
  • MiR-21 is a tumor marker, and it is known that a body fluid sample derived from a healthy person contains only a very small amount. From the above results, the extraction efficiency of miRNA can be remarkably improved by using a high molecular weight PEG / TEGDME mixture even for such a low-expressed amount of miRNA, and reliable quantitative analysis by RT-qPCR becomes possible. It was shown to be.

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Abstract

下記の成分：（ａ）ポリエチレングリコール、および（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルを含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を提供する。

Description

小型ＲＮＡの抽出効率を改善するための組成物および方法
　本発明は、小型ＲＮＡの抽出効率改善剤およびそれを用いたＲＮＡの単離方法に関する。
　マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２１～２５塩基長の小さな一本鎖ノンコーディングＲＮＡであり、これまでに２万種類以上が同定されている（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）。これらｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡの発現を制御する機能を有しており、細胞の増殖、分化、アポトーシスなど、種々の生物学的プロセスに関与していることが明らかにされている。ヒト遺伝子の約３０％が、ｍｉＲＮＡによる発現調節を受けているものと予想されている。近年では、ｍｉＲＮＡの発現異常が、がんを含む様々な疾患の発症や病態に影響を及ぼしていることが示唆されている（非特許文献１、２）。ｍｉＲＮＡは、細胞から分泌されたエクソソームに包含されて血液や尿などの体液中に存在していることから、体液中のｍｉＲＮＡを検出・定量することにより疾患を診断する低侵襲のリキッドバイオプシーに注目が集まっている。
　ｍｉＲＮＡの簡易かつ迅速な定量方法として、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲが一般的に行われている。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、数時間程度の短い時間で結果を得ることができ、また、簡易な装置で実施できるため、臨床の現場において診断を行うのに適した方法である。ここで、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによりｍｉＲＮＡを検出・定量するためには、高精度かつ高収率でｍｉＲＮＡを単離する必要がある。全ＲＮＡを単離するための方法としては、カオトロピック塩の存在下で核酸分子をシリカ担体に吸着させることを基本原理とするブーム法が一般的である（非特許文献３）。しかし、ブーム法の通常の条件では、ｍｉＲＮＡのような低分子量ＲＮＡを低い効率でしか捕捉することができないため、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析のために十分な量のｍｉＲＮＡが得られないことが問題となっていた。したがって、従来方法と同様に容易でありつつ、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡの高い収率で抽出できる方法が望まれている。
落谷孝広, Drug Delivery System, Vol. 26, No.1, pp. 10-14 (2011) Rupaimoole, R. et al, Nat. Rev. Drug Discov., Vol. 16, No.3, pp. 203-222 (2016) Boom, R. et al., J. Clin. Microbiol., Vol. 28, No. 3, pp. 495-503 (1990)
　本発明は、従来技術の諸問題を解消し、安全かつ簡便な操作により、生体試料からｍｉＲＮＡを高収率かつ高精度に抽出する方法を提供することを目的としてなされたものである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、ブーム法において、カオトロピック塩を含む核酸抽出液に、高分子量ポリエチレングリコールを添加することにより、ｍｉＲＮＡの抽出効率が顕著に改善されることを見出した。しかし、高分子量ポリエチレングリコールは常温では固体であり、加温して融解させても極めて高粘度の液体であるため、ピペットによる秤量が困難であるという問題があった。
　そこで、本発明者らは、高分子量ポリエチレングリコールによるｍｉＲＮＡの抽出効率改善効果を維持しつつ、操作性に優れた組成物を鋭意検討した。その結果、ポリエチレングリコールとテトラエチレングリコールジメチルエーテルとの混合物が、操作性および安定性に優れ、かつ、高分子量ポリエチレングリコールと同程度にｍｉＲＮＡの抽出効率を改善できるものであることを見出した。
　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、下記の成分：（ａ）ポリエチレングリコール、および（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルを含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を提供するものである。
　前記ポリエチレングリコールは、６００～２０００の平均分子量を有することが好ましい。
　前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の比率は、３：７～６：４であることが好ましい。
　前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤において、前記成分（ａ）の含有量が２０～６０容量％であり、前記成分（ｂ）の含有量が２５～７０容量％であることが好ましい。
　前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、カオトロピック塩をさらに含むことが好ましい。
　前記カオトロピック塩は、チオシアン酸グアニジンであることが好ましい。
　前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、１５～３５℃の温度範囲において液体であり、かつ、マイクロピペットにより秤量可能な粘度を有することが好ましい。
　また、本発明は、一実施形態によれば、試料から小型ＲＮＡを抽出するための方法であって、（ｉ）小型ＲＮＡを含む試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、小型ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した小型ＲＮＡを溶出するステップとを含む方法を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、生体試料中のマイクロＲＮＡを解析するための方法であって、（ｉ）マイクロＲＮＡを含む生体試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記生体試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した全ＲＮＡを溶出するステップと、（ｖｉ）前記ステップ（ｖ）により得られた全ＲＮＡ中のマイクロＲＮＡを定量的ＲＴ－ＰＣＲにより増幅するステップとを含む方法を提供するものである。
　前記生体試料は、体液または組織切片であることが好ましい。
　前記第２の混合液における小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の濃度は、２０～６０容量％であることが好ましい。
　本発明に係る小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、操作性および安定性に優れ、かつ、すでに確立されたブーム法において、カオトロピック塩を含む核酸抽出液に添加することにより、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出効率を改善することができる。そのため、市販されている一般的なＲＮＡ抽出用キットに本発明に係る小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を適用するのみで、従来と同様の安全かつ簡便な操作により、高収率かつ高精度でのｍｉＲＮＡの抽出が可能となる。
　また、本発明に係る方法によれば、ｍｉＲＮＡの収率が改善されることにより、低発現のｍｉＲＮＡについても高精度での定量分析が可能となる。
　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、第一の実施形態によれば、下記の成分：（ａ）ポリエチレングリコール、および（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルを含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤である。
　「小型ＲＮＡ」とは、生体内で作られる長さ約１０ヌクレオチド以上２００ヌクレオチド未満までのＲＮＡを意味する。例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態における好ましい小型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。
　本実施形態における成分（ａ）ポリエチレングリコール（以降、「ＰＥＧ」とも記載する）としては、任意の平均分子量のものを用いることができ、例えば、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００など用いることができる。また、本実施形態におけるＰＥＧは、これらの１種のみまたは２種以上を混合して用いることができる。本実施形態におけるＰＥＧは、好ましくは平均分子量が６００～２０００のＰＥＧであり、特に好ましくは平均分子量が１０００～２０００のＰＥＧであり、最も好ましくはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である。
　本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤において、成分（ａ）ＰＥＧと成分（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルは、任意の比率で混合されてよく、例えば１：９、２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、７：３、８：２、９：１の比率で混合されてよいが、３：７～６：４の比率で混合されることが好ましく、３：７～５：５の比率で混合されることが特に好ましい。
　本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、上記成分（ａ）および（ｂ）を上記比率で含有するものであれば、上記成分（ａ）および（ｂ）以外の成分を、本実施形態の効果を損なわない範囲で適宜配合することができる。すなわち、本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤における成分（ａ）ＰＥＧの含有量は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の総容量を１００％としたときに、好ましくは２０～６０％（ｖ／ｖ）であり、特に好ましくは４５～５５％（ｖ／ｖ）である。また、本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤における成分（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルの含有量は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の総容量を１００％としたときに、好ましくは２５～７０％（ｖ／ｖ）であり、特に好ましくは４０～６０％（ｖ／ｖ）である。
　本実施形態において、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、上記成分（ａ）および（ｂ）以外の成分として、カオトロピック塩をさらに含むことが好ましい。これにより、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を、より長期間安定的に常温で保存することができる。本実施形態におけるカオトロピック塩は、以下に限定されないが、例えば、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素などが挙げられる。本実施形態において、これらのカオトロピック塩の１種のみまたは２種以上を混合して用いることができる。好ましくは、本実施形態におけるカオトロピック塩は、チオシアン酸グアニジンである。小型ＲＮＡ抽出効率改善剤に添加されるカオトロピック塩の濃度は、例えば２０～３０％（ｗ／ｖ）の範囲で適宜選択することができる。
　本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、さらなる小型ＲＮＡ抽出効果の改善および／または安定性の向上のために、他の成分を適宜配合されてもよい。前記他の成分としては、例えば、１－（２－アミノエチル）ピペラジン、ジエチレントリアミンなどが挙げられ、これらの１種のみまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。小型ＲＮＡ抽出効率改善剤に添加される前記他の成分の濃度は、例えば０．０１～５％（ｖ／ｖ）の範囲で適宜選択することができる。
　本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の製造方法は、特に限定されず、上記成分を混合して製造することができる。
　本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、室温において低粘度かつ安定であり、容易かつ正確に秤量することができる。すなわち、本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、１５～３５℃の温度範囲において液体であり、かつ、マイクロピペットにより秤量可能な粘度を有することが好ましい。本実施形態における「粘度」は、例えば回転粘度計などを用いて求めることができる。本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の粘度は、好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以下であり、特に好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以下である。
　本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、ブーム法に基づく市販のＲＮＡ抽出用キットと組み合わせて用いることができ、従来と同様の安全かつ簡便な操作により、高収率かつ高精度で小型ＲＮＡを抽出することが可能である。
　すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、試料から小型ＲＮＡを抽出するための方法であって、（ｉ）小型ＲＮＡを含む試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、小型ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した小型ＲＮＡを溶出するステップとを含む方法である。
　本実施形態の方法では、小型ＲＮＡを含む試料を準備して使用する。本実施形態における「小型ＲＮＡ」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態における「試料」は、小型ＲＮＡを含む任意のものであってよく、例えば、小型ＲＮＡを含有する溶液や、細胞溶解物などであってよい。細胞溶解物は、任意の細胞から調製されたものであってよく、例えば、真核細胞、原核細胞、ウイルスなどから調製されることができる。また、本実施形態における試料は、第三の実施形態において詳述するような生体試料であってもよい。
　次いで、小型ＲＮＡを含む試料にカオトロピック塩を含む溶液を添加し、これにより、第１の混合液を得る。本実施形態における「カオトロピック塩」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態におけるカオトロピック塩の濃度は、ブーム法の一般的な条件に従えばよく、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加した後の第２の混合液において、例えば０．１～１０Ｍあってよく、好ましくは２．５～５Ｍの範囲であってよい。
　本実施形態におけるカオトロピック塩を含む溶液は、カオトロピック塩の他に、還元剤、界面活性剤および／または緩衝剤を含んでいてもよい。還元剤としては、例えば、２－メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールなどを、好ましくは２５～１５０ｍＭの濃度で添加することができる。界面活性剤は、イオン性または非イオン性のものであってよく、例えば、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（商標）、ＮＰ－４０（商標）などを、好ましくは０．１～１０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加することができる。緩衝剤としては、溶液をｐＨ６．０～９．０の範囲に安定化させるものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳなどを、好ましくは１～１０ｍＭの濃度で添加することができる。
　上記のようなカオトロピック塩を含む溶液は、以下に記載する核酸結合性担体とともに組み合わせたキットとして市販されており、本実施形態では、そのような市販品を使用することもできる。例えば、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＭａｇＮＡ　Ｐｕｒｅ　Ｃｏｍｐａｃｔ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＦａｓｔＧｅｎｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｅｍｉｕｍ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　ｍｉＲＮＡ（マッハライ・ナーゲル）、ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）などが好ましい市販品として挙げられる。
　次いで、上記により得られた第１の混合液に小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加し、これにより、第２の混合液を得る。本実施形態における「小型ＲＮＡ抽出効率改善剤」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態における小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加した後の第２の混合液において、例えば２０～６０％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することが好ましく、２５～５０％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することが特に好ましい。
　なお、本実施形態の方法において、カオトロピック塩を含む溶液および小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、添加する順番を相互に変更する、または、同時に添加することが可能である。すなわち、小型ＲＮＡを含む試料に小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加した混合液を最初に調製し、次いで、得られた混合液にカオトロピック塩を含む溶液を添加してもよいし、小型ＲＮＡを含む試料に対し、カオトロピック塩を含む溶液および小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を同時に添加してもよい。
　次いで、上記により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させ、これにより、試料中のＲＮＡを核酸結合性担体に結合させる。本実施形態における核酸結合性担体としては、ブーム法において一般的に使用されているシリカベースの担体を用いることができ、例えば、シリカビーズ、ガラスビーズ、シリカウール、ガラス繊維などを用いることができる。また、シリカビーズは、シリカのみからなるビーズであってもよいし、磁気ビーズがシリカによりコートされた磁気シリカビーズであってもよい。このような核酸結合性担体は、上記の通りカオトロピック塩を含む溶液とともに組み合わせたキットとして市販されており、本実施形態では、そのような市販品を使用することもできる。
　混合液と核酸結合性担体との接触は、例えば、混合液と核酸結合性担体とを容器内で混合することにより、または、核酸結合性担体を充填したカラムなどに混合液を通過させることにより行うことができる。その後、核酸結合性担体を混合液から分離し、回収する。
　なお、回収した核酸結合性担体は、任意で、以下のＲＮＡの溶出を行う前に、ＲＮＡを可溶化せず、かつ、非特異的結合物を可溶化できる洗浄液（例えば、７０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールを含む水溶液など）により洗浄されてもよい。
　次いで、核酸結合性担体に結合したＲＮＡを溶出する。ＲＮＡの溶出は、例えば、ヌクレアーゼフリーの水または低塩濃度の緩衝液などの溶出液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させることにより行うことができる。溶出液と核酸結合性担体との接触は、上記した混合液と核酸結合性担体との接触と同様に行うことができる。その後、核酸結合性担体から溶出液を分離し、回収する。
　なお、ブーム法に基づく自動核酸抽出装置が市販されており、本実施形態の方法における上記一連の操作を、そのような市販の装置およびそれに付属するキットを用いて行うこともできる。本実施形態の方法に使用できる自動核酸抽出装置およびそれに付属するキットとしては、例えば、ＭａｇＮＡ　Ｐｕｒｅ　９６　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＭａｇＮＡ　Ｐｕｒｅ　９６　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ＲＮＡ　Ｌａｒｇｅ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、Ｍａｘｗｅｌｌ　ＲＳＣ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＭａｘｗｅｌｌ　ＲＳＣ　ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（プロメガ）、ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＭａｇＭＡＸ　ｍｉｒＶａｎａ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＱＩＡｃｕｂｅおよびＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ＱＩＡｃｕｂｅ　Ｋｉｔ（キアゲン）などが挙げられる。
　本実施形態の方法は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を用いる以外は、従来公知のブーム法において使用されるものと同一の溶液や核酸結合性担体を使用でき、核酸の結合や溶出の条件も従来公知のブーム法と同様に実施できるものである。そのため、本実施形態の方法によれば、新たな条件検討を要することなく、従来と同様の安全かつ簡便な操作により、高収率かつ高精度で小型ＲＮＡを抽出することが可能である。
　また、本実施形態の方法を生体試料に適用すれば、従来公知のブーム法によっては困難であった低発現量のｍｉＲＮＡを、定量性を損なうことなく容易に抽出することが可能である。そのため、本実施形態の方法により生体試料から単離されたＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの定量分析のために有用である。
　すなわち、本発明は、第三の実施形態によれば、生体試料中のマイクロＲＮＡを解析するための方法であって、（ｉ）マイクロＲＮＡを含む生体試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記生体試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した全ＲＮＡを溶出するステップと、（ｖｉ）前記ステップ（ｖ）により得られた全ＲＮＡ中のマイクロＲＮＡを定量的ＲＴ－ＰＣＲにより増幅するステップとを含む方法である。
　本実施形態の方法では、第二の実施形態の方法と同様の手順により、生体試料からマイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡを精製する。本実施形態における「カオトロピック塩」、「小型ＲＮＡ抽出効率改善剤」および「核酸結合性担体」は、第二の実施形態において定義したものと同様である。
　「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、生体内に存在する２１～２５塩基長の一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、以下のような多段階ステップを経て生成される。最初に、ｍｉＲＮＡ遺伝子から前駆体であるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが転写される。次いで、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが核においてＤｒｏｓｈａにより切断されることによりｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとなる。次いで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが細胞質においてＤｉｃｅｒにより切断されることにより成熟型二本鎖ｍｉＲＮＡとなり、このうち一方のＲＮＡ鎖が分解除去されて一本鎖ｍｉＲＮＡが生成される。本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、この最終産物であるｍｉＲＮＡを意味し、中間産物を含まない。
　本実施形態の方法が対象とする「生体試料」は、任意の生体から単離された任意のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの動物個体から単離された、組織切片、細胞または体液などであってよいが、特に限定されない。組織切片または細胞が由来する組織としては、例えば、脳、心筋、骨格筋、肺、気管、咽頭、唾液腺、食道、胃、小腸、大腸、膵臓、肝臓、胆嚢、血管、腎臓、膀胱、尿管、精巣、前立腺、卵巣、子宮、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、下垂体、甲状腺、上皮小体、副腎、骨格筋、腹腔、皮膚、乳腺などが挙げられる。体液としては、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、胃液、膵液、胆汁、汗、涙、母乳、鼻汁、腸液などが挙げられる。本実施形態における生体試料は、好ましくは体液または組織切片であり、特に好ましくはヒト由来の体液または組織切片である。
　本実施形態における生体試料は、当業者に周知の方法により動物個体から得ることができる。また、生体試料として組織切片を用いる場合、組織切片は、動物個体から急性単離された組織から調製されたものであってもよいし、ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織（ＦＦＰＥＴ）から調製されたものであってもよい。
　次いで、得られた全ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡを、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（以下、「ＲＴ－ｑＰＣＲ」と記載する）により増幅する。ｍｉＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲで増幅するための方法はすでに確立されており、当分野において周知の方法を採用することができる。例えば、ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型として、目的のｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いてリアルタイムｑＰＣＲを行うことにより、目的のｍｉＲＮＡを増幅することができる。また、定量解析のための方法も十分に確立されており、リアルタイムｑＰＣＲの結果から算出されるＣｐ値（Ｃｔ値ともいう）に基づいて、例えばΔΔＣｔ法や検量線法などにより、目的のｍｉＲＮＡを定量することができる。
　ｍｉＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲにより増幅するためのキットは市販されており、本実施形態では、そのような市販品を使用することもできる。例えば、ｍｉＲＣＵＲＹ　ＬＮＡ　ｍｉＲＮＡ　ＰＣＲ　Ａｓｓａｙｓ（キアゲン）、ＭｙｓｔｉＣｐ　ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ（シグマ・アルドリッチ）、Ｍｉｒ－Ｘ　ｍｉＲＮＡ　ｑＲＴ－ＰＣＲ　ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）、ＴａｑＭａｎ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　ＡｓｓａｙｓおよびＴａｑＭａｎ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍｉＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）などが好ましい市販品として挙げられる。
　本実施形態の方法は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を用いることにより、低発現量のｍｉＲＮＡについても定量性を損なうことなく抽出することができ、高い精度でｍｉＲＮＡを定量することができるため有用である。
　以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜１．ｍｉＲＮＡの抽出効率を改善する化合物の探索＞
　ｍｉＲＮＡを含む標準試料を以下の手順により調製した。１０ｎｇ／μＬのサケ精子ＤＮＡ含有ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、化学合成したｍｉＲ－２１（５’－ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ－３’：配列番号１）（北海道システム・サイエンス）の溶液（１００ｎＭ）を調製した。得られたｍｉＲ－２１溶液（２．５μＬ）に、Ｋ５６２細胞（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）から抽出された全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を加え、蒸留水により１５０μＬに調製し、これを標準試料とした。
　標準試料からのｍｉＲＮＡの抽出は、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、キット付属の説明書に記載の「１カラムプロトコール」にしたがって行った。この際、キット付属のＢｉｎｄｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ（以下、「ＢＥ」と記載する）を添加する工程において、ＢＥ（２００μＬ）に代えて、以下の候補化合物：エタノール（和光純薬）、２－プロパノール（関東化学）、ＰＥＧ６００（関東化学）、ＰＥＧ１０００（関東化学）、ＰＥＧ１５４０（関東化学）、ＰＥＧ２０００（関東化学）、またはテトラエチレングリコールジメチルエーテル（以下、「ＴＥＧＤＭＥ」と記載する）（東京化成工業）（いずれも２００μＬ）を添加した。ＲＮＡの溶出は、１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒにより行った。
　次いで、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、ｃＤＮＡを合成した。プライマーには、ステムループＲＴプライマー（５’－ＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡ－３’：配列番号２）を用いた。反応液の組成は、キット付属の説明書の記載に準じた（１／２スケール）。逆転写反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）２７２０サーマルサイクラーを用いて、以下の条件により行った。
［反応条件］
・ステップ１（１サイクル）：１６℃　３０分
・ステップ２～４（６０サイクル）：３０℃　３０秒、４２℃　３０秒、５０℃　１秒
・ステップ５（１サイクル）：８５℃、５分
　得られた反応液をＴＥ緩衝液により５倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液とした。続いて、以下の条件により、ｍｉＲ－２１についてのリアルタイムＰＣＲを行った。反応および解析には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６　Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた。反応および解析を５重に行い、Ｃｐ値（平均値±ＳＤ）を算出した。
［反応液組成（１０μＬ）］
・ｃＤＮＡ溶液　　２．５μＬ
・２×ＦａｓｔＳｔａｒｔ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス）　　５μＬ
・１０μＭ　フォワードプライマー（５’－ＧＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’：配列番号３）　　０．２μＬ
・１０μＭ　リバースプライマー（５’－ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ－３’：配列番号４）　　０．２μＬ
・１０μＭ　ユニバーサルプローブライブラリー　プローブ＃８２（ロシュ・ダイアグノスティックス）　　０．２μＬ
・蒸留水　　残量
［反応条件］
・ステップ１（１サイクル）：９５℃　１０分
・ステップ２～３（４５サイクル）：９５℃　１０秒、６０℃　３０秒
　結果を表１に示す。ＢＥに代えてＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００を用いた場合には、ＢＥを用いた場合と比較して有意にＣｐ値が低下した。一方、ＰＥＧ６００またはＴＥＧＤＭＥを用いた場合には、ＢＥを用いた場合とほぼ同等であり、エタノールまたは２－プロパノールを用いた場合には、ＢＥを用いた場合と比較して有意にＣｐ値が上昇した。この結果から、高分子量ＰＥＧがｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できることが示された。
　表１．ｍｉＲ－２１（標準試料）についてのＣｐ値
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜２．ｍｉＲＮＡの抽出効率を改善する組成物の検討（１）＞
　高分子量ＰＥＧは、ｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できる一方で、常温では固体であり、加温して融解させても極めて高粘度であるため、ピペットによる正確な秤量が困難であった。そこで、高分子量ＰＥＧとＴＥＧＤＭＥを混合することにより、上記問題を解決できるかどうかを検討した。ＰＥＧ１５４０とＴＥＧＤＭＥとを種々の比率で混合した組成物を調製し、６０℃でインキュベートした。その後、５０℃のインキュベーター内において、粘度計（ＶＩＳＣＯ－８９５、アタゴ）を用いて粘度を測定した。測定は５重に行い、平均値±ＳＤを測定値とした。また、上記１と同様の手順により、各組成物を添加した場合のＣｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、２重測定）。
　結果を表２に示す。ＰＥＧ１５４０をＴＥＧＤＭＥと混合することにより、大幅に粘度が低下し、かつ、ＢＥよりも有意に低いＣｐ値が得られた。この結果から、ＰＥＧ１５４０：ＴＥＧＤＭＥ＝３：７～６：４の組成物が、ｍｉＲＮＡの収率を顕著に改善でき、かつ、操作性にも優れたものであることが示された。
　表２．ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ混合物の粘度およびＣｐ値
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらに、ＰＥＧ１５４０に代えて、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００またはＰＥＧ２０００を用いてＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物（混合比１：１）を調製し、上記と同様にして粘度を測定し、Ｃｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。
　結果を表３に示す。いずれの高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物も、ピペットで正確な秤量が可能な粘度（約３０ｍＰａ・ｓ以下）を有し、かつ、特に添加量を３００μＬとすることにより、ｍｉＲＮＡの収率を顕著に改善できるものであることが確認された。また、いずれの高分子量ＰＥＧを用いた混合物も、高分子量ＰＥＧ：ＴＥＧＤＭＥ＝３：７～６：４の範囲であれば、同程度に低いＣｐ値が得られた（データは省略）。
　表３．高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥの粘度およびＣｐ値
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜３．ｍｉＲＮＡの抽出効率を改善する組成物の検討（２）＞
　ＰＥＧ１０００／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）、ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）およびＰＥＧ２０００／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）は、調製後１時間程度で凝固した。そのため、使用時には加温により再融解させる必要があるが、１０回まで凝固・再融解を繰り返してＣｐ値を計測したところ、ほとんど変化は見られなかった（データは省略）。したがって、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物はいずれも十分な安定性を有することが確認されたが、常温で凝固せず、かつ、高いｍｉＲＮＡの抽出効率を有する組成物について、さらに検討した。
　ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）（組成物１）をベースに、追加の成分：チオシアン酸グアニジン（以下、「ＧｕＳＣＮ」と記載する）（和光純薬）、エタノール（和光純薬）、１－（２－アミノエチル）ピペラジン（以下、「ピペラジン」と記載する）（シグマ・アルドリッチ）、および／またはジエチレントリアミン（以下、「ＤＥＴＡ」と記載する）（シグマ・アルドリッチ）を配合した組成物２～６を調製した。
　表４．ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥベース組成物の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記１と同様の手順により、上記組成物を添加した場合のＣｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。
　また、調製後２５℃にて１時間経過した上記組成物（１ｍＬ）を目視で観察し、凝固が見られるかどうかを確認した。
［判定基準］
　凝集を認めない（凝固しない）：　－
　一部に凝集物を認める（部分的に凝固する）：　±
　凝集を認める（完全に凝固する）：　＋
　結果を表５に示す。ＧｕＳＣＮを添加した組成物は、常温で凝固しなかった。なお、常温で一週間以上経過した組成物でも結果は同様であった（データは省略）。また、ＧｕＳＣＮとともに、エタノール、ピペラジンおよび／またはＤＥＴＡを組み合わせて添加することにより、より低いＣｐ値が得られた。これらの結果から、ＧｕＳＣＮ、エタノール、ピペラジンおよび／またはＤＥＴＡを加えることにより、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物のＲＮＡ抽出効率および安定性をさらに改善できることが示された。
　表５．ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥベース組成物のＣｐ値および凝固
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜４．高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いたＦＦＰＥＴ試料からのＲＮＡ抽出＞
　標準試料に代えて、がん患者由来のＦＦＰＥＴ試料を用いて、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物が生体試料からのｍｉＲＮＡ抽出効率をどの程度改善できるかを試験した。
　大腸がん患者から採取された大腸から調製されたＦＦＰＥＴ切片（厚さ５μｍ）をスライドガラスからマイクロチューブに回収し、８００μＬのキシレンを加え、室温で５分間インキュベートした。その後、４００μＬのエタノールを加えて混合し、１３０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を除去した。１０００μＬのエタノールを加えて再度混合し、１３０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を除去した。その後、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）に付属の１８０μＬのＰａｒａｆｆｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒおよび７０μＬのプロテイナーゼＫ溶液を加え、５６℃で３０分インキュベート後、９０で３０分インキュベートした。
　標準試料に代えて、得られた組織溶解液（１５０μＬ）を用いた以外は、上記１と同様の手順により、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を添加してｍｉＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ－２１についてのＲＴ－ｑＰＣＲを実施し、Ｃｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。
　結果を表６に示す。いずれの高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いた場合も、ＢＥを用いた場合と比較して有意にＣｐ値が低下した。この結果から、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物がＦＦＰＥＴ試料からのｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できるものであることが示された。
　表６．ＦＦＰＥＴ試料から抽出されたＲＮＡ中に含まれるｍｉＲ－２１のＣｐ値
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　このように、高分子量ＰＥＧとＴＥＧＤＭＥとを含む組成物は、ｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できるものであり、ｍｉＲＮＡをより正確に定量するために有用であることが示された。
＜５．高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いた体液試料からのＲＮＡ抽出＞
　標準試料に代えて、健常者由来の血清試料を用いて、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物が体液試料からのｍｉＲＮＡ抽出効率をどの程度改善できるかを試験した。
　５人の健常者から全血を採取し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血清を回収した。得られた血清は、速やかに－８０℃で凍結保存した。血清１ｍＬに、２０ｍｇ／ｍＬに調製したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ　Ｇｒａｄｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を１００μＬ加え、７２℃で１０分間インキュベートした。その後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。
　標準試料に代えて、得られた上清（１５０μＬ）を用いた以外は、上記１と同様の手順により、ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ混合物（混合比１：１）を添加してｍｉＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ－２１についてのＲＴ－ｑＰＣＲを実施し、Ｃｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。
　結果を表７に示す。一般に、Ｃｐ値＝３５前後がＲＴ－ｑＰＣＲにおける定量限界とされており、Ｃｐ値が３５を超えると、Ｃｐ値のばらつきが大きくなり、定量精度の信頼性を欠くものとして判断される。ここで、ＢＥを用いた場合には、Ｃｐ値が３５を大きく超え、かつ、標準偏差も１を超え、定量的な信頼性に乏しい結果しか得られなかった。これに対し、ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いた場合には、特に、添加量を３００μＬとすることにより、Ｃｐ値を大きく低下させることができ、かつ、標準偏差も十分に小さく、信頼性のある定量解析結果を得ることができた。
　ｍｉＲ－２１は腫瘍マーカーであり、健常者由来の体液試料には極めて少量しか含まれていないことが知られている。以上の結果から、このような低発現量のｍｉＲＮＡについても、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いることにより、ｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善でき、ＲＴ－ｑＰＣＲによる信頼性のある定量解析が可能となることが示された。
　表７．血清試料から抽出されたＲＮＡ中に含まれるｍｉＲ－２１のＣｐ値
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (11)

  1. 　下記の成分：
    　（ａ）ポリエチレングリコール、および
    　（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテル
    を含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
  2. 　前記ポリエチレングリコールが、６００～２０００の平均分子量を有する、請求項１に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
  3. 　前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の比率が３：７～６：４である、請求項１または２に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
  4. 　前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤において、前記成分（ａ）の含有量が２０～６０容量％であり、前記成分（ｂ）の含有量が２５～７０容量％である、請求項１～３のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
  5. 　カオトロピック塩をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
  6. 　前記カオトロピック塩がチオシアン酸グアニジンである、請求項５に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
  7. 　１５～３５℃の温度範囲において液体であり、かつ、マイクロピペットにより秤量可能な粘度を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
  8. 　試料から小型ＲＮＡを抽出するための方法であって、
    　（ｉ）小型ＲＮＡを含む試料を準備するステップと、
    　（ｉｉ）前記試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、
    　（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、請求項１～７のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、
    　（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、小型ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、
    　（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した小型ＲＮＡを溶出するステップと
    を含む方法。
  9. 　生体試料中のマイクロＲＮＡを解析するための方法であって、
    　（ｉ）マイクロＲＮＡを含む生体試料を準備するステップと、
    　（ｉｉ）前記生体試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、
    　（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、請求項１～７のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、
    　（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、
    　（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した全ＲＮＡを溶出するステップと、
    　（ｖｉ）前記ステップ（ｖ）により得られた全ＲＮＡ中のマイクロＲＮＡを定量的ＲＴ－ＰＣＲにより増幅するステップと
    を含む方法。
  10. 　前記生体試料が体液または組織切片である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記第２の混合液における小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の濃度が２０～６０容量％である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
     
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