WO2020004904A1 - Rna 은 제자리 혼성화 방법을 통한 aimp2-dx2 신호 자동화 검출 방법 - Google Patents

Rna 은 제자리 혼성화 방법을 통한 aimp2-dx2 신호 자동화 검출 방법 Download PDF

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WO2020004904A1
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aimp2
signal
image
cell
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PCT/KR2019/007660
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고영일
김유식
김성훈
권남훈
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재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
서울대학교병원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for automated detection of AIMP2-DX2 signal through RNA in situ hybridization, and more specifically, RNA is a splicing variant of AIMP2 in a biological sample obtained from a subject using in situ hybridization. It relates to a method for automatically detecting the ratio of the AIMP2-DX2 signal.
  • the aminoacyltRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 2 (AIMP2) is a four-exon protein that acts to inhibit cancer. (Kim et. Al., Nature Reviews Cancer, 11: 708, 2011).
  • apoptosis inhibitory protein 2 cellular inhibitor
  • cIAP2 tumor necrosis factor receptor associated factor
  • AIMP2 is responsible for mediating the binding of these two proteins.
  • AIMP2 lacking exon 2 hereinafter 'AIMP2-DX2'
  • 'AIMP2-DX2' is unable to mediate the binding of these two proteins, which interferes with the transmission of apoptosis of abnormal cells or cancer cells, resulting in tumor cell death. Results in inhibition (Choi et. Al., PLoS Genetics, 7: e1001351, 2011).
  • p53 in the cell to check the state of the cell to progress the cell cycle, or to order to repair or kill abnormal cells
  • MDM2 mouse double minute 2
  • AIMP2 protects p53 from MDM2 in this process, inhibiting ubiquitination, thereby preventing its breakdown in cells.
  • AIMP2-DX2 is a mutant that loses p53 protection, it does not prevent the progression of abnormal cells or the cell cycle of cancer cells, which in turn prevents the growth and differentiation of cancer cells.
  • AIMP2-DX2 is considered to be an important indicator for judging whether the tumor is cancerous (tumorigenesis) and the prognosis of cancer, and it is known that AIMP2-DX2 expression level is high in patients with poor prognosis of cancer such as lung cancer. (J Cancer. 2017 May 12; 8 (8): 1347-1354.doi: 10.7150 / jca.18450.eCollection 2017.). Therefore, detecting the presence and amount of AIMP2-DX2 is a very useful way to diagnose cancer or to predict the prognosis of cancer. However, until now, no technology has been developed to detect AIMP2-DX2 quickly, accurately and sensitively.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop an automated method capable of detecting AIMP2-DX2 quickly and accurately, and as a result, a probe capable of detecting AIMP2-DX2 using RNA silver in situ hybridization (silver hybridization in situ)
  • the present invention was completed by developing an automated method for calculating the expression level of AIMP2-DX2 in a biological sample obtained from a subject.
  • an object of the present invention to provide an AIMP2-DX2 detection method comprising the following steps in order to provide information necessary for cancer diagnosis or prognosis prediction:
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • Another object of the present invention is to provide an automated method for calculating a cancer prognostic prediction, comprising the following steps, in order to provide information necessary for predicting the prognosis of a cancer patient:
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • the present invention provides an AIMP2-DX2 detection method comprising the following steps to provide information necessary for cancer diagnosis or prognostic prediction:
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • the present invention provides an automated method for calculating a cancer prognostic prediction, comprising the following steps, in order to provide information necessary for predicting the prognosis of a cancer patient:
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • the present invention provides an AIMP2-DX2 detection method comprising the following steps to provide information necessary for diagnosing or predicting cancer:
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • Cancers to be diagnosed of the present invention include, but are not limited to, colorectal cancer, cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer , Ovarian cancer, rectal cancer, stomach cancer, anal muscle cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer , Penile cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer or ureter cancer.
  • the present invention provides AIMP2-DX2 detection method comprising the following steps to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of cancer:
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • Cancers to be diagnosed of the present invention include, but are not limited to, colorectal cancer, cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer , Ovarian cancer, rectal cancer, stomach cancer, anal muscle cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer , Penile cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer or ureter cancer.
  • the sample may be used without limitation as long as it is collected from a subject to diagnose cancer, for example, cells or tissues obtained by biopsy, blood, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, various secretions, urine, stool And the like.
  • cells or tissues obtained by biopsy blood, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, various secretions, urine, stool And the like.
  • it may be, but is not limited to, a tissue or cell obtained from an organ suspected of a tumor.
  • the sample of the subject obtained in step (a) may be subjected to additional processing such as formalin fixation, paraffin embedding and the like.
  • tissue fixatives are generally classified into coagulated fixatives and non-coagulated fixatives.
  • the most commonly used tissue fixatives are formalin, which is a noncoagulant fixative. Formalin penetrates the tissue about 1 mm per hour to achieve tissue fixation, which has the advantage of less disruption of epitopes and cross-linking of proteins and peptides to maintain cell morphology.
  • the sample was fixed in formalin and embedded in paraffin.
  • sample of the present invention may preferably be a formalin fixed paraffin-embedded fragment (FFPE, paraffin-embedded tissue).
  • FFPE formalin fixed paraffin-embedded fragment
  • the "cell separated from the sample” means a cell separated according to a conventional method from the sample provided in step (a), or a cell contained in the tissue or fragment thereof, if the sample is a tissue or a fragment thereof. can do.
  • the AIMP2 transcript contains four exons (FIG. 1), and AIMP2-DX2, a splicing variant in which a second exon is deleted by this alternative splicing mechanism, is specifically a human cancer. It is found in many cells and tissues of cancer patients, and competitively binds to p53 to interfere with normal apoptosis-inducing activity of AIMP2, leading to tumor formation.
  • the AIMP2 transcript consists of 1222bp of base, which is shown in SEQ ID NO: 1.
  • AIMP2-DX2 of the present invention is a variant in which the region of exon 2 is deleted from the AIMP2 base sequence.
  • AIMP2-DX2 protein is a variant in which the region of exon 2 is deleted in the AIMP2 sequence, and the sequence of AIMP2 protein (312aa version: AAC50391.1 or GI: 1215669; 320aa version: AAH13630.1, GI: 15489023, BC013630.1) 312aa version: Nicolaides, NC, Kinzler, KW and Vogelstein, B. Analysis of the 5 'region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene, Genomics 29 (2), 329-334 (1995) // 320aa version : Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (26), 16899-16903 (2002)), of which correspond to exon 2 The region is deleted.
  • probe refers to nucleic acid fragments such as RNA or DNA corresponding to short bases of several hundred bases and hundreds of bases that can achieve specific binding with mRNA, and thus can be identified whether specific mRNAs are present.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. In one embodiment of the present invention an oligonucleotide probe was used.
  • the probe of the present invention may be modified within a range that does not affect the detection of AIMP2-DX2. That is, the sequence having homology with the oligonucleotide of the present invention should also be interpreted as being included in the probe of the present invention, and the sequence having homology has, for example, 80% or more homology with respect to a specific nucleotide sequence. Preferred sequences are.
  • the homology is preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, most preferably at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%. .
  • the sequence having homology may be a sequence consisting of the specific base sequence (100% homology), and one or more bases may be substituted, deleted, inserted, and / Or the added sequence (for example, 80% or more and less than 100% homology) may be sufficient.
  • the probe set includes oligonucleotides (specifically hybridized to the exon 1 region in the transcript of AIMP2) and 456 to 465 of the nucleotide sequences of SEQ ID NO.
  • oligonucleotides specifically hybridized to the exon 1 region in the transcript of AIMP2
  • Comprising an oligonucleotide (specific hybridization to exon 3) complementary to the first base preferably an AIMP2-DX2 detection probe complementary to the base represented by SEQ ID NO: 2, which specifically hybridizes with AIMP2-DX2 It is characterized by.
  • a probe for hybridization has a high signal-to-noise ratio and specificity because the longer the target region of the genome, the more probes can bind. In other words, the target site can be detected more accurately and with high intensity.
  • the probe of the present invention is designed to distinguish each of the exons in the AIMP2 transcript having a short nucleic acid sequence of about 200bp or less, and has a very high specificity.
  • Hybridization of the present invention means that the complementary single stranded nucleic acids form a double-stranded nucleic acid. Hybridization can occur when the complementarity between two nucleic acid strands is perfect or even when some mismatch base is present. The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on the hybridization conditions, and may be particularly controlled by temperature.
  • ISH in situ hybridization
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • CISH chromogenic in situ hybridization
  • SISH silver in situ hybridization
  • Silver in situ hybridization includes a metallographic detection scheme for the identification and localization of hybridized genomic target nucleic acid sequences.
  • Metallographic detection methods include the use of enzymes such as alkaline phosphatase in combination with water-soluble metal ions and redox-inactive substrates of the enzyme. Substrates are converted to redox-activators by enzymes, which reduce metal ions to form detectable precipitates (eg, US Patent Application Publication No. 2005/0100976, PCT Publication No. 2005 / 003777 and US Patent Application Publication No. 2004/0265922.
  • Metallographic detection schemes also include using oxidoreductases with water soluble metal ions, oxidizing agents and reducing agents to re-form detectable precipitates (see, eg, US Pat. No. 6,670,113).
  • Nucleic acid molecules can be detected by labeling the probes used in the methods of the invention using any marker or label molecule capable of binding to DNA.
  • labels for labeling include, but are not limited to, radioisotopes, enzyme substrates, cofactors, ligands, chemiluminescent materials, fluorophores, hapten, enzymes, and combinations thereof. Methods of label attachment and instructions for selecting a label suitable for different purposes are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 and Ausubel et al. , In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1998).
  • labels used in the SISH in the present invention are, for example, peroxidase, ⁇ -D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isothiosia Fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin and radioactive material.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FITC fluorescein isothiosia Fluorescein isothiocyanate
  • RITC rhodamine isothiocyanate
  • alkaline phosphatase biotin and radioactive material.
  • a method of indirectly detecting the target protein using a protein G, Protein A or a secondary antibody to which a labeled substance is bound may also be used.
  • the HRP chromase was coupled to the probe to reduce silver ions.
  • Step (b) is a step of hybridizing by treating the probe set of the present invention comprising (i) oligonucleotide and (ii) oligonucleotide to the sample of the subject provided in step (a).
  • a known method generally used in the art may be used to further amplify the signal, preferably RNAscope (The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 14, No. 1, January 2012). Technology may be used, but is not limited to such.
  • RNA in situ hybridization can express intracellular mRNAs by the strong binding force of RNA-RNA hybridization.
  • RNA in situ hybridization is a very useful technique for observing the expression of mRNA directly in tissue sections, but it is not easily used because the method of each laboratory and the reliability of the result is weak.
  • Northern blots can distinguish the size of mRNA through electrophoresis, whereas RNA in situ hybridization can identify the distribution of mRNA in tissues, especially expression in specific cells.
  • Northern blots can concentrate all mRNAs through RNA separation and dense the membranes through blots to easily identify the presence of specific mRNAs.In RNA in situ hybridization, the amount of mRNA currently expressed in specific cells is observed.
  • the probe of the present invention can hybridize with each exon in the mRNA of AIMP2-DX2 with a very high specificity, it is used for RNA in situ hybridization analysis to quickly and accurately express and express the expression of AIMP2-DX2 in a specific cell. Can be detected.
  • the present invention can detect AIMP2-DX2 very quickly and accurately, as well as quantitatively determine the ratio by performing the in-situ hybridization method using a probe set and distinguishing the detected signal using a software program. .
  • the present invention can image and acquire an image with a suitable microscope.
  • the imaging may be used without limitation as long as it is a general optical microscope used in the art.
  • the present invention may further comprise the step of reacting the cells isolated from the sample with the cell staining solution.
  • This procedure is to stain the cells according to the cell staining method commonly performed in the art in order to visually observe the cells separated from the sample, it is possible to smoothly separate normal cells and cancer cells in the subsequent procedure. To make it work.
  • the cell staining solution may generally be a substance used for cell nucleus, cytoplasm or mitochondrial staining.
  • Preferred DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole), methylene blue, methane blue, acetcarmine, toluidine blue, hematoxylin or Hoechst, etc.
  • Eosin to stain the cytoplasm crystal violet or orange G, or Rhodamine 123 to stain the mitochondria, MitoTracker, Janus green B ), Tetrazolium salt, dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine (DASPMI), DASPEI (2- (4- (dimethylamino) styryl) -N-Ethylpyridinium Iodide), DiOC6 (3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide), DiOC7 (3,3,3) '-Diheptyloxacarbocyanine Iodide) or JC-1 (5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine chloride) and the like, but is not limited thereto.
  • it may be ematoxylin to stain the cell nucleus and eosin to stain the cytoplasm.
  • the order of performing the in situ hybridization method of the cells separated from the sample using the probe set and staining the cells with the cell staining solution is not particularly limited. That is, after performing the in situ hybridization method using the probe set, the cells may be stained with a cell staining solution, or vice versa, or they may be performed simultaneously.
  • step (c) is a step of separating an image of the cancer cell region that satisfies a specific threshold 1 from the image obtained by imaging in step (b) using a software program.
  • the software program used in the present invention is not limited as long as the cancer cell signal and the normal cell can be separated from the picked-up image, and the cancer cell signal and the AIMP2-DX2 signal can be distinguished, but for example, the vision level of Labview This can be done using Vision Development, Matlab, or a combination of LabVIEW and MATLAB, preferably using MATLAB software.
  • cancer cell regions may be separated from the extracted RGB image.
  • Threshold 1 of the present invention means a value that can be most clearly distinguished from normal cells and cancer cells by analyzing the image obtained in the step (b) according to the RGB profile.
  • the cancer cell region may be separated by setting the threshold value 1 from a predetermined RGB range through a preliminary experiment to separate the image satisfying the threshold value.
  • the RGB (R: 0 to 255, G: 0 to 255, B: 0 to 255) images of all ranges are extracted from the image obtained in step (b), and as a result, the cancer cells A total of three criteria were set, which showed the largest difference in the RGB profile of and normal cells.
  • the threshold value 1 may vary according to the type of labeling substance attached to the probe hybridizing with AIMP2-DX2 and the type of cell staining solution, and the value thereof may be determined by the experimenter through cancer cells and normal cells. It is possible to set the range of the threshold value 1 that can be identified most accurately.
  • the cancer cell image region may be automatically separated from the normal cell image region by automatically separating the image region satisfying the threshold 1 using the software program.
  • Step (d) of the present invention is a step of detecting a signal of AIMP2-DX2 from the cancer cell region image extracted from the step (c).
  • the threshold 2 refers to a value capable of analyzing the RGB profile of the extracted cancer cell region image and distinguishing the two types of signals most clearly in order to distinguish the cancer cell signal from the AIMP2-DX2 signal. .
  • step (d) may include separating the AIMP2-DX2 signal by setting a predetermined threshold value 2 from the RGB profile.
  • a threshold value 1 is used to set a criterion representing the greatest difference between the RGB signal of the cancer cell signal and the AIMP2-DX2 signal on an image in which normal cells and cancer cells are distinguished. That is, an image region satisfying all of Red ⁇ 181, Green ⁇ 181, Blue ⁇ 181, Red-Green> 30, and Blue-Green> 7 may be classified as AIMP2-DX2 signal, which is set to threshold 2. And the region satisfying this was detected from the cancer cell region image.
  • the threshold value 2 may vary depending on the type of labeling substance attached to the probe hybridizing with AIMP2-DX2 and the type of cell staining solution, and the value thereof may be determined by the experimenter through preliminary experiments with cancer cells and AIMP2-. You can set the range of Threshold 2 to best distinguish the DX2 signal.
  • the AIMP2-DX2 image region may be automatically separated from the cancer cell image region by automatically detecting an image region satisfying the threshold 2 using the software program.
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Total Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • the number of pixels determined to be cancer cells on the image is reported as a cancer cell signal and the number of pixels determined as an AIMP2-DX2 signal as an AIMP2-DX2 signal, and AIMP2- according to the following equation. Calculate DX2 degree.
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 signal / cancer cell signal) ⁇ 100
  • AIMP2-DX2 a splicing variant of AIMP2, is specifically found in human cancer cells and tissues of cancer patients, and thus the effects of diagnosis, progress analysis, prognosis prediction, and anti-cancer treatment by analyzing the expression level of AIMP2-DX2 Information useful for judgment and the like can be provided. That is, when the ratio of AIMP2-DX2 signal is quantified by analyzing the signals detected at each step, if the ratio of AIMP2-DX2 signal to cancer cell signal is higher, it is determined that the cancer is likely to be diagnosed or progress to cancer. Or predict the prognosis of a cancer patient.
  • the colorectal cancer tissue FFPE sample was analyzed by the FISH method.
  • fluorescence was overexpressed, and thus it was difficult to distinguish cancer cells from AIMP2-DX2 signals.
  • the AIMP2-DX2 signal was clearly distinguished, and thus AIMP2-DX2 signal could be clearly distinguished from cancer cells according to the method of the present invention, and thus it was confirmed that it could be easily and simply applied in clinical practice. .
  • the expression of AIMP2 shows different expression patterns according to tissues and the genetic characteristics of the subject, it is impossible to accurately diagnose cancer by simply quantifying the expression level of AIMP2-DX2.
  • the expression level of AIMP2-DX2 relative to the total cancer cells can be quantitatively confirmed in the same sample. It can provide useful information.
  • detecting the presence and amount of AIMP2-DX2 is not only useful for diagnosing cancer or predicting the prognosis of cancer, but also for determining the direction of treatment of cancer patients (such as selection of therapeutic drugs). It can also be a very important factor in setting it up.
  • the drug suitable for the patient can be selected in advance, thereby reducing the dropout rate caused by the wrong selection of the drug and increasing the drug compliance. It also avoids the time it takes for the drug to take effect and the risk of side effects the patient may experience.
  • the conventional method may cause errors in the diagnosis result according to the place, time, and experimenter. Therefore, in order to obtain a stable result, a method or an automated process requiring the involvement of the experimenter is preferably excluded.
  • the method of the present invention is obtained from a cancer patient. Since the expression rate of AIMP2-DX2 from one sample can be quantitatively detected by an automated system, it can be very useful in the field of companion diagnostics (CDx) for the treatment of cancer patients.
  • CDx companion diagnostics
  • the present invention provides an automated method for calculating cancer prognostic predictions comprising the following steps to provide information necessary for predicting the prognosis of a cancer patient:
  • AIMP2-DX2 (AIMP2-DX2 Signal / Cancer Cell Signal) ⁇ 100
  • the prognosis refers to the prospects for future symptoms or progresses determined by diagnosing a disease.
  • the prognosis usually refers to the metastasis or survival within a certain period of time after the onset or surgical procedure of cancer, and the prognostic diagnosis (prognosis or predictive diagnosis) is the direction of future treatment, especially whether or not chemotherapy is performed for cancer patients. This is a very important clinical challenge because it gives clues to.
  • Prognostic predictions also include the patient's response to the disease treatment and the prediction of the course of treatment.
  • Steps (a) to (e) in the above method of the present invention are as described above.
  • step (f) is a step of calculating the predictive value of the cancer patient according to the% AIMP2-DX2 value calculated in the step (e), the larger the value of% AIMP2-DX2 is determined that the prognosis of the cancer is not good I mean.
  • the prognostic predictive value refers to a high risk group having a very poor prognosis of cancer, a medium risk group having a poor prognosis of cancer, and a low risk group having a poor prognosis of cancer.
  • the ratio of AIMP2-DX2 in the same sample can be detected quantitatively, can be automated, and the accuracy of the diagnosis results is excellent, and it can be applied to the clinic using FFPE samples. It can be very useful for classification diagnosis and prognosis prediction.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the production of AIMP2-DX2 transcripts and the process of splicing AIMP2-DX2 mRNA specifically targeted.
  • Figure 2 shows the results of microscopic observation of the silver precipitated signal that appears after hybridization of a sample (FFPE) obtained from a subject by treatment with the probe set of the present invention.
  • the dark red dot in the image means AIMP2-DX2.
  • Figure 3 is a flow chart for calculating the degree of AIMP2-DX2 by analyzing the SISH result data.
  • Figure 4 is a picture of loading AIMP2-DX2 SISH image on MATLAB.
  • FIG. 5 is a photograph of setting a threshold to separate cancer cells from normal cells on a MATLAB and leave a region of cancer cells.
  • 6 is a photograph of calculating the number of pixels by setting a threshold for measuring an AIMP2-DX2 signal on MATLAB.
  • FIG. 7 is a picture of calculating% AIMP2-DX2 using “total area” determined as cancer cells and “signal” determined as AIMP2-DX2 signals on MATLAB.
  • FISH fluorescent in situ hybridization method
  • FIG 10 shows the results of the AIMP2-DX2 fluorescence in situ hybridization method (FISH) at low laser intensity.
  • Sequence information of the AIMP2 transcript was obtained from Genebank RefSeq Accession number NM_006303.3 transcript, and a probe complementary to the base sequence of the desired exon among exons 1 to 4 of AIMP2 and AIMP2-DX2 was prepared by ACD cell diagnostics.
  • the produced probes were divided into sets as follows:
  • (Set 1) (i) an oligonucleotide complementary to bases 17-111 of the base sequence of SEQ ID NO: 1 labeled with a first fluorescent substance and an oligonucleotide complementary to bases 456-1182, and (ii) a second A probe set for detecting AIMP2 and AIMP2-DX2 comprising an oligonucleotide complementary to bases 222-453 of the base sequence of SEQ ID NO: 1 labeled with a fluorescent material,
  • Atto 550 which represents a first phosphor and red
  • Alexa 488 which represents a second phosphor
  • (Set 2) A probe set for detecting AIMP2-DX2 comprising an oligonucleotide complementary to the base represented by SEQ ID NO: 2.
  • the tissues of 25 patients with formalin fixed paraffin embedded colorectal cancer were prepared with 4 ⁇ l of thickness.
  • SISH was performed using a Basescope system (ACD, Inc., Hayward, California, US). After making the sections, the experiment was conducted within one week. Immediately before entering the experiment, the samples were heated in a drying oven at 60 ° C. for 1 hour and washed with xylene and 100% EtOH to deparaffinize. After all experiments were put in a humidification chamber to minimize the temperature change and to prevent drying. In the pretreatment process, hydrogen peroxide was treated at room temperature for 15 minutes, and placed in a target retrieval reagent, which was terminated at 98-102 ° C. for 14 minutes. After the treatment with proteinase III (proteinase III) was treated for 45 minutes at 40 °C.
  • ACD Basescope system
  • Proteinase-treated tissues were hybridized with AIMP2-DX2 probe at 40 ° C. for 2 hours.
  • amplifiers 1-6 were sequentially processed according to the manufacturer's protocol.
  • the final reactant of SISH is silver precipitate, which is continuously added with red A and red B, and the enzymatic chemical reaction of the colorant is carried out, where the red color is developed by the multi-linked amplifier simultaneously with silver ion (Ag +) reduction.
  • Gill's hematoxylin I counterstaining was performed for analysis on a general optical microscope. After counterstaining, the resultant was dried in a 60 ° C. drying oven for 15 minutes, coated with a Vectormounts (Vector Labs, Peterbourough, UK) solution, and covered with a cover slip and examined under an optical microscope.
  • Sections in which silver in situ hybridization was performed using the probe Set 2 were first read by pathology at Seoul National University Hospital's Pathology Department. The staining status and results of the tumor site were confirmed by optical microscopy (DMi8, Leica biosystems, Nussloch, Germany). .
  • the confirmed SISH sections were digitally scanned by scanning the entire X20 magnification with a tissue slide scanner (SCN400, Leica biosystems, Nussloch, Germany) and stored as electronic files.
  • SCN400 tissue slide scanner
  • hybridization with the target transcript in the cell occurred normally to confirm that the signal was visualized as a red dot, and a representative image was extracted and analyzed ( FIG. 2 ).
  • the present inventors partitioned the AIMP2-DX2 signal detection automation method using MATLAB software to automatically analyze the SISH result data according to the flow chart sequence of FIG. 3.
  • the AIMP2-DX2 SISH image obtained in Example 3 was loaded by pressing the load image button as shown in FIG. Before and after the image of the imported image appears in Figure 4. The more cancer cells in the image, the signal is naturally counted, so to correct this, the following steps were performed to distinguish between normal and cancer cells in the imported image. .
  • the threshold (threshold) 1 to distinguish the cancer cells in the entire picture can be set by a slide bar or a numeric input, after setting the threshold (threshold 1), the push button was pressed to leave only the cancer cells.
  • Threshold 1 The default value is 50, and the lower the threshold, the more strictly the image is judged that the cancer cell area is reduced compared to the higher.
  • the threshold 1 was designated using RGB data of normal cells and cancer cells. Finding the RGB profiles of cancer cells and normal cells, we set the range where the difference is most significant. As a result, in the present embodiment, red: 170 to 230, green: 145 to 215, blue: 160 to 220, red-green> 6, and blue-green> 6 were included.
  • the inventors set a threshold value of 50 to distinguish between normal cells and cancer cells, and smoothed the boundary. After pressing the push button after inputting the threshold value 1, as shown in FIG. 6, the normal cell region is divided into black and the cancer cell region is divided into red, so that only the cancer cell region is separated and extracted. . Then, the number of pixels of the determined cancer cells was calculated and expressed as the total area, and the AIMP2-DX2 SISH signal was measured below among the pixels determined to be the cancer cells.
  • a threshold 2 for measuring AIMP2-DX2 signal may be set as a slide bar or an input in an image obtained by separating only cancer cells, and a signal may be measured by pushing a push button.
  • the AIMP2-DX2 signal was also analyzed for the range where the RGB profiles of the cancer cell signal and the AIMP2-DX2 signal differed the most, and specified a threshold of 2, Red ⁇ 181, Green ⁇ 151, Blue ⁇ 181, Red-Green. > 30, Blue-Green> 7 conditions, it was confirmed that the threshold 2 that satisfies these conditions is 19.
  • the inventors set a threshold of 19 to distinguish between cancer cell signals and AIMP2-DX2 signals, and smoothed the boundaries (FIG. 7). Similarly, the lower the threshold, the more strictly the signal was judged to be relatively reduced signal area compared to the higher.
  • the number of pixels determined by the determined AIMP2-DX2 signal was calculated as “signal”, and the number of pixels determined as cancer cells was defined as “Total”.
  • the% AIMP2-DX2 value was calculated as (Signal / total) X 100 (%).
  • the calculated% AIMP2-DX2 value is a value representing the expression ratio of AIMP2-DX2 in the cancer cell region.
  • Example 2 the result of self-diagnosis by the doctor at the Seoul National University Hospital Pathology Department (Example 2) and% AIMP2-DX2 (signal / total) according to the method of Example 4 above were automatically performed.
  • the calculated results are shown in Table 1 and FIG. 8.
  • the automated% AIMP2-DX2 value according to the method of the present invention was confirmed to exhibit a certain tendency, as shown by the clinician's visual diagnosis. According to the method, it was confirmed that the expression rate of AIMP2-DX2 in cancer cells can be detected more accurately and quickly and automatically.
  • FISH Fluorescent In Situ Hybridization Method
  • Probe Set 1 prepared in Example 1, it was confirmed whether AIMP2 and AIMP2-DX2 could be detected automatically by Fluoroscent In situ hybridization in the same colorectal cancer tissue sample as in Example 2. PPIB and POLR2A detection probes with high fluorescence expression levels were used as positive controls.
  • the colon cancer tissue samples were fixed for 1 hour at room temperature using 4% paraformaldehyde (paraformaldehyde) after washing the culture medium using PBS.
  • Paraformaldehyde was washed with PBS and the cells were stored at 4 ° C. for at least one day in 70% EtOH.
  • the cells were sprinkled on the microscope slide and dried for 40 minutes at room temperature.
  • Cells were sequentially squeezed at 50% EtOH, 70% EtOH, and 100% EtOH on the slide, and then treated with Proteinase K for 30 minutes at 40 ° C. Proteinase-treated cells were hybridized with AIMP2 probe at 40 ° C. for 2 hours.
  • AMP1, AMP2, AMP3, and AMP4 were sequentially treated to attach the fluorescent material. Finally, the nuclei were labeled with DAPI and the cells were imaged with a Zeiss confocal microscope.
  • FISH fluorescence in situ hybridization method
  • AIMP2-DX2 RNA FISH was attempted with low laser intensity according to the above results, but it was impossible to obtain meaningful images in most tissues (FIG. 10).
  • RNA FISH method is not a suitable method for detecting AIMP2-DX2 in colorectal cancer tissues using FFPE samples. Therefore, the FISH method is difficult to apply to clinical diagnosis.
  • the ratio of AIMP2-DX2 can be detected quantitatively and automatically in the same sample, the accuracy of the diagnosis result is excellent, and it can be applied clinically using the FFPE sample. It can be very useful for classification diagnosis, prognosis prediction, etc., so the industrial applicability is very good.

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Abstract

본 발명은 RNA 은 제자리 혼성화 방법을 통한 AIMP2-DX2 신호 자동화 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 RNA 은 제자리 혼성화 방법을 이용하여 피검체로부터 수득한 생물학적 시료에서 AIMP2의 플라이싱 변이체(splicing variant)인 AIMP2-DX2 신호의 비율을 자동으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면 동일 시료 내에서 AIMP2-DX2의 비율을 정량적으로 검출할 수 있고 자동화가 가능하며, 진단결과의 정확도가 우수할 뿐만 아니라 FFPE 시료를 사용하여 임상에 적용 가능하기 때문에, 암의 구분진단, 예후 예측 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

RNA 은 제자리 혼성화 방법을 통한 AIMP2-DX2 신호 자동화 검출 방법
본 출원은 2018년 6월 26일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0073640호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 RNA 은 제자리 혼성화 방법을 통한 AIMP2-DX2 신호 자동화 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 RNA 은 제자리 혼성화 방법을 이용하여 피검체로부터 수득한 생물학적 시료에서 AIMP2의 플라이싱 변이체(splicing variant)인 AIMP2-DX2 신호의 비율을 자동으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
“아미노 아실 전령리보핵산 합성효소복합체-상호작용 다기능 단백질 2(aminoacyltRNAsynthetase complex-interacting multifunctional protein 2, 이하 AIMP2)”은 4개의 엑손(exon)으로 구성된 단백질로, 암을 억제하는 기능을 세포 내에서 수행하고 있다 (Kim et. al., Nature Reviews Cancer, 11:708, 2011).
세포가 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-a)를 인지하게 되면,세포 내에서는 '종양괴사인자 수용체 관여 인자 2(tumor necrosisfactor receptor associated factor, 이하 TRAF2)와 '세포자멸 저해 단백질 2(cellular inhibitor of apoptosis protein 2, 이하 cIAP2)'가 결합하게 되고, 이 결합이 연쇄신호전달을 일으켜 비정상 세포 또는 암세포에 자멸 명령을 내리게 되는데, 이때 AIMP2는 이 두 단백질의 결합을 매개하는 역할을 담당한다. 하지만 엑손2가 결손된 AIMP2 (이하, 'AIMP2-DX2')는 이 두 단백질의 결합을 매개하지 못하기 때문에 비정상 세포 혹은 암세포의 자멸 명령을 전달하는데 방해를 일으키게 되고, 이는 결과적으로 종양세포 사멸의 억제를 가져오게 된다(Choi et. al., PLoS Genetics, 7:e1001351, 2011).
또한, 세포에는 p53이라는 단백질이 있어 세포의 상태를 점검하여 세포 주기를 진행시키거나, 비정상 세포의 복구 혹은 사멸 명령을 내리게 되는데, 이 단백질은 mouse double minute 2 (MDM2)에 의해 유비키틴화되어 분해됨으로써 세포 내 농도가 조절된다. AIMP2는 이 과정에서 p53을 MDM2로부터 보호하여 유비키틴화를 억제함으로써 세포 내에서 분해되는 것을 막는다. 하지만 AIMP2-DX2는 p53를 보호하는 기능을 상실한 돌연변이체이기 때문에 비정상 세포 혹은 암세포의 세포주기를 진행시키는 것을 막지 못하게 되고, 이는 결과적으로 암세포의 성장 및 분화를 막지 못하게 된다.
이와 같은 특성 때문에 AIMP2-DX2는 세포의 암화(tumorigenesis) 여부 및 암의 예후 (prognosis)를 판단하는데 중요한 표시물로 여겨지고 있으며, 폐암 등 암의 예후가 좋지 못한 환자에서 AIMP2-DX2 발현량이 높다고 알려져 있다(J Cancer. 2017 May 12;8(8):1347-1354. doi: 10.7150/jca.18450. eCollection 2017.). 따라서 AIMP2-DX2의 존재 여부 및 그 양을 검출해내는 것은 암을 진단하거나 암의 예후를 예측하는데 있어서 아주 유용한 길이다. 하지만 현재까지는 AIMP2-DX2를 빠르면서도 정확하게, 그리고 민감하게 검출 해낼 수 있는 기술이 개발되지 않고 있었다.
이에, 본 발명자는 AIMP2-DX2를 빠르면서도 정확하게 검출할 수 있는 자동화 방법을 개발하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, RNA silver in situ hybridization(은 제자리 혼성화)을 활용하여 AIMP2-DX2를 검출할 수 있는 프로브를 개발하였고, 이에 기초하여 피검체로부터 수득한 생물학적 시료에서 AIMP2-DX2의 발현량을 산출하는 자동화 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 AIMP2-DX2 검출 방법을 제공하는 것이다:
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
(c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
(e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
본 발명의 다른 목적은 암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 암 예후 예측치를 산출하는 자동화된(automated) 방법을 제공하는 것이다:
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
(c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
(e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
(f) 상기 %AIMP2-DX2의 값이 높을수록 암의 예후가 좋지 않은 것으로 암 예후 예측치를 산출하는 단계.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 AIMP2-DX2 검출 방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
(c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
(e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 암 예후 예측치를 산출하는 자동화된(automated) 방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
(c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
(e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
(f) 상기 %AIMP2-DX2의 값이 높을수록 암의 예후가 좋지 않은 것으로 암 예후 예측치를 산출하는 단계.
이하 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 AIMP2-DX2 검출 방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
(c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
(e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
본 발명의 진단 대상이 되는 암은 이에 제한되는 것은 아니나 대장암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 수뇨관 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
이하, 각 단계를 구체적으로 서술한다.
본 발명은 암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음의 단계를 포함하는 AIMP2-DX2 검출 방법:
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
(c) 상기 이미지에서 암세포를 분리하고 암세포 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 설정하는 단계;
(d) 상기 분리된 암세포에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하는 단계; 및
(e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
을 제공한다.
본 발명의 진단 대상이 되는 암은 이에 제한되는 것은 아니나 대장암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 수뇨관 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
이하, 각 단계를 구체적으로 서술한다.
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계
상기 시료는 암 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는, 종양으로 의심되는 장기에서 얻어진 조직 또는 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 (a) 단계에서 얻어진 피검체의 시료는 포르말린 고정, 파라핀 포매 등과 같은 추가적인 처리공정을 거칠 수 있다.
세포나 조직의 형태학적 관찰을 원활하게 하기 위해서는 검체의 고정 과정이 가장 중요하다. 고정이 잘된 조직은 세포의 소기관이 잘 유지되지만, 고정이 부족하면 형태학적 구조가 불완전하게 되고, 고정이 너무 지나치면 항원의 소실과 비특이적인 반응이 나타날 수 있기 때문이다. 통상적으로 조직 고정제는 응고형 고정제와 비응고형(변성형) 고정제로 구분되는데, 가장 많이 사용되고 있는 조직 고정제는 비응고형 고정제인 포르말린이다. 포르말린은 1시간에 1mm 정도 조직에 침투하면서 조직 고정을 이루는데, 항원결정부위(epitope)의 파괴가 적고 단백질과 펩타이드를 교차결합시키므로 세포의 형태가 잘 유지시킨다는 장점이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 시료를 포르말린에 고정하였고, 파라핀으로 포매하였다.
따라서, 본 발명의 시료는 바람직하게는 포르말린 고정 파라핀 포매 절편(FFPE, paraffin-embedded tissue)일 수 있다.
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
상기 “시료로부터 분리된 세포”란 상기 (a) 단계에서 제공된 시료에서 통상적인 방법에 따라 분리한 세포, 또는 상기 시료가 조직 또는 이의 절편인 경우에는 조직 또는 이의 절편 그 자체에 포함된 세포를 의미할 수 있다.
AIMP2 전사체는 4개의 엑손을 포함하는데(도 1), 이러한 AIMP2의 선택적 스플라이싱(Alternative splicing) 기작에 의하여 2번째 엑손이 결실되어 있는 스플라이싱 변이체인 AIMP2-DX2는 특이적으로 인간 암 세포와 암 환자의 조직에서 많이 발견되고, p53에 경쟁적으로 결합하여 정상적인 AIMP2의 세포 사멸 유도 활성을 방해함으로써 종양 형성을 유도한다.
본 발명에서 상기 AIMP2 전사체는 1222bp의 염기로 이루어져 있으며, 이를 서열번호 1에 나타내었다.
본 발명의 AIMP2-DX2는 AIMP2 염기 서열 중 엑손 2의 영역이 결실된 변이체이다.
AIMP2-DX2 단백질은 AIMP2 서열 중 엑손 2의 영역이 결실된 변이체로서, AIMP2 단백질의 서열(312aa version:AAC50391.1 또는 GI:1215669; 320aa version: AAH13630.1, GI:15489023, BC013630.1)은 문헌(312aa version: Nicolaides,N.C., Kinzler,K.W. and Vogelstein,B. Analysis of the 5' region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene, Genomics 29 (2), 329-334 (1995)// 320aa version: Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))에 기술되어 있으며, 이 중 엑손 2에 해당하는 영역이 결실된 단백질이다.
본 발명에서 “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하였다.
본 발명의 상기 프로브는 AIMP2-DX2의 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드와 상동성을 갖는 서열도 본 발명의 상기 프로브에 포함되는 것으로 해석되어야 하며, 상기 상동성을 갖는 서열이란 특정한 염기서열에 대하여, 예를 들면 80% 이상의 상동성을 갖는 서열이 바람직하다. 상기 상동성은, 예를 들면 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다. 즉, 본 발명에 있어서, 상동성을 갖는 서열은, 상기 특정의 염기서열로 이루어지는 서열(상동성 100%)이어도 되고, 상기 특정의 염기서열에 대해서, 1염기 이상이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열(예를 들면 상동성이 80% 이상 100% 미만)이어도 된다.
본 발명에서 상기 프로브 세트는 서열번호 1의 염기서열 중 227 내지 248번째 염기와 상보적인 올리고뉴클레오티드(AIMP2의 전사체에서 엑손 1 영역에 특이적으로 혼성화) 및 서열번호 1의 염기서열 중 456 내지 465번째 염기와 상보적인 올리고뉴클레오티드(엑손 3에 특이적으로 혼성화)로 이루어져 있으며, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기와 상보적인 AIMP2-DX2 검출용 프로브로, AIMP2-DX2와 특이적으로 혼성화하는 것을 특징으로 한다.
일반적으로 혼성화를 위한 프로브의 경우, 유전체의 표적 부위의 길이가 길수록 보다 많은 수의 프로브가 결합할 수 있기 때문에 signal-to-noise 비율과 특이성이 높다. 즉, 표적 부위를 보다 정확하고 높은 강도로 감지할 수 있는 것이다. 한편, 본 발명의 상기 프로브는 불과 200bp 내외로 짧은 핵산서열을 갖는 AIMP2 전사체 내 각각의 엑손을 구분하여 정확하고 빠르게 검출할 수 있도록 제작된 것으로, 매우 높은 특이성을 지니고 있다.
본 발명의 “혼성화”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 상기 프로브 세트는 RNA 제자리 혼성화(In situ hybridization) 분석을 위해 사용될 수 있다. 제자리 혼성화(ISH)는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 형광 제자리 혼성화(FISH), 발색 제자리 혼성화(CISH) 또는 은 제자리 혼성화(SISH))를 포함하며, 바람직하게는 은 제자리 혼성화 분석을 위해 사용될 수 있다.
은 제자리 혼성화(SISH, silver in situ hybridization)는 혼성화된 게놈 표적 핵산 서열의 확인 및 국지화를 위한 금속조직 검출 계획을 포함한다. 금속조직 검출 방법은 알칼리 포스파타아제와 같은 효소를 수용성 금속 이온 및 효소의 산화환원-비활성 기질과 조합으로 사용하는 것을 포함한다. 기질은 효소에 의해 산화환원-활성제로 전환되며, 산화환원-활성제는 금속 이온을 환원시켜, 검출가능한 침전물이 형성되도록 한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호　2005/0100976, PCT 공개 번호 2005/003777 및 미국 특허 출원 공개 번호　2004/0265922 참조). 금속조직 검출 계획은 또한, 산화환원효소를 수용성 금속 이온, 산화제 및 환원제와 함께 사용하여, 검출가능한 침전물을 다시 형성시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제 6,670,113호 참조).
DNA에 결합할 수 있는 임의의 표시 또는 표지 분자를 사용하여 본 발명의 방법에서 사용된 프로브를 표지함으로써, 핵산 분자를 검출할 수 있다. 표지 부착을 위한 표지의 예로는 방사성 동위원소, 효소 기질, 보조인자, 리간드, 화학발광 물질, 형광단, 햅텐, 효소 및 이들의 조합물이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 표지 부착방법, 및 상이한 목적으로 적합한 표지를 선택하기 위한 지침은 예를 들면, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 및 문헌(Ausubel et al., In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1998)에서 발견될 수 있다.
본 발명에서 SISH에 사용되는 표지의 예로 예를 들어, 퍼옥시다제, β-D-갈락토시다제, 마이크로퍼옥시다제, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase: HRP), 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 로다민 아이소티오사이아네이트(rhodamine isothiocyanate: RITC), 알칼리 포스파타제, 바이오틴 및 방사성 물질을 포함한다. 또한, 표지된 물질이 결합한 항체를 사용하여 표적 단백질을 직접적으로 검출하는 방법 이외에, 단백질 G, 단백질 A 또는 표지된 물질이 결합한 2차 항체를 사용하여 표적 단백질을 간접적으로 검출하는 방법을 또한 이용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 HRP 발색효소를 프로브에 결합하여 은 이온을 환원시켰다.
추가적으로, SISH 절차에서 이용되는 바와 같은 특정 검출 방법에 관련된 추가적인 세부사항을 [Bourne, The Handbook of Immunoperoxidase Staining Methods, published by Dako Corporation, Santa Barbara, CA]에서 찾을 수 있다.
상기 단계 (b)는 (a)단계에서 제공된 피검체의 시료에 (i)올리고뉴클레오티드와 (ii) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 상기 프로브 세트를 처리하여 혼성화 시키는 단계이다. 상기 단계 (b)에서는 신호를 보다 증폭하기 위해 당업계에서 일반적으로 사용되고 있는 공지의 방법이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 RNAscope(The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 14, No. 1, January 2012) 기술이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
RNA 프로브를 이용한 제자리 혼성화는 RNA-RNA 혼성화의 강한 결합력에 의하여 세포내의 mRNA를 표시할 수 있다. RNA 제자리 혼성화는 조직 절편에서 직접 mRNA의 발현을 관찰할 수 있는 매우 유익한 기법이지만, 실험실마다 방법의 차이가 있으며 결과에 대한 신뢰성이 약하므로 쉽게 사용되지 못하고 있는 실정이다. 노던 블롯(Northern blot)은 전기영동을 통하여 mRNA의 크기를 구별할 수 있는 데 비하여, RNA 제자리 혼성화는 조직 내에서 mRNA의 분포, 특히 특정세포 내의 발현을 식별할 수 있다. 그리고 노던 블롯이 RNA 분리 과정을 통하여 모든 mRNA를 농축시키고 blot을 통하여 막에 밀집시켜 특정 mRNA의 존재를 쉽게 확인할 수 있는 데 비하여, RNA 제자리 혼성화 에서는 현재 특정 세포 내에서 발현되는 mRNA 양을 관찰하게 되므로 소량의 mRNA만을 생산하는 경우에 그 발현을 관찰하기 어렵게 된다. 그러나, 본 발명의 상기 프로브는 AIMP2-DX2의 mRNA 내 각각의 엑손과 매우 높은 특이도로 혼성화 할 수 있기 때문에, RNA 제자리 혼성화 분석에 활용되어 빠르고 정확하게 특정 세포 내 AIMP2-DX2의 발현여부 및 발현량을 검출할 수 있다.
즉, 본 발명은 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화 방법을 수행하고 소프트웨어 프로그램을 이용하여 검출되는 신호를 구분함으로써 AIMP2-DX2를 매우 빠르고 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그 비율을 정량적으로 파악할 수 있다.
본 발명은 상기 혼성화 과정이 끝난 후 적절한 현미경으로 이미지를 촬상 및 획득할 수 있다. 본 발명에서 상기 이미지화에는 당업계에서 사용되는 일반적인 광학현미경이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서는 상기 시료로부터 분리된 세포를 세포 염색 용액과 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 절차는 시료로부터 분리된 세포를 육안으로 관찰할 수 있도록 하기 위하여 당업계에서 통상적으로 수행되는 세포 염색방법에 따라 세포를 염색하는 것이며, 이후의 절차에서 정상 세포와 암 세포를 원활하게 분리할 수 있도록 하기 위함이다.
본 발명에서 상기 세포 염색 용액은 일반적으로 세포 염색에 사용되는 세포핵, 세포질 또는 미토콘드리아 염색에 사용되는 물질일 수 있다. 바람직하게 세포핵을 염색하는 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 메틸렌블루(methylene blue), 아세트산카민(acetocarmine), 톨루이딘블루(toluidine blue), 헤마톡실린(hematoxylin) 또는 Hoechst 등, 세포질을 염색하는 에오신(eosin), 크리스탈바이올렛(crystal violet) 또는 오렌지 G(orange G) 등, 또는 미토콘드리아를 염색하는 로다민 123(rhodamine 123), 미토트랙커(MitoTracker), 야누스그린 B(janus green B), 테트라졸리움염(tetrazolium salt), DASPMI(Dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine), DASPEI(2-(4-(dimethylamino)styryl)-N-Ethylpyridinium Iodide), DiOC6(3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide), DiOC7(3,3'-Diheptyloxacarbocyanine Iodide) 또는 JC-1(5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine chloride) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 세포핵을 염색하는 에마톡실린 및 세포질을 염색하는 에오신일 수 있다.
본 발명의 상기 단계 (b)에서, 시료로부터 분리된 세포를 상기 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화 방법을 수행하는 단계와 세포 염색 용액으로 세포를 염색하는 단계의 순서는 특별히 제한되지 않는다. 즉, 프로브 세트를 이용한 은 제자리 혼성화 방법을 수행한 후 세포 염색 용액으로 세포를 염색할 수 있으며, 또는 이와 반대의 순서일 수 있으며, 또는 이들을 동시에 수행할 수도 있다.
(c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
본 발명에서 상기 단계 (c)는 소프트웨어 프로그램을 이용하여 상기 단계 (b)에서 촬상되어 수득된 이미지로부터 특정 임계값(threshold) 1을 만족하는 암세포 영역의 이미지를 분리해 내는 단계이다.
본 발명에서 사용하는 소프트웨어 프로그램은 촬상된 이미지로부터 암세포신호와 정상세포를 분리하고, 암세포신호와 AIMP2-DX2신호를 구분할 수 있는 것이면 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 랩뷰(Labview)의 비전 디벨롭먼트(Vision Development)나 매트랩(Matlab), 혹은 랩뷰와 MATLAB의 조합을 이용하여 수행될 수 있고, 바람직하게 MATLAB 소프트웨어를 사용할 수 있다.
특히 본 발명의 상기 단계 (c)에서는 소프트웨어 프로그램을 이용하여 상기 이미지로부터 RGB 이미지를 추출한 후, 추출된 RGB 이미지로부터 암세포 영역을 분리할 수도 있다.
본 발명의 임계값 1은 상기 단계 (b)에서 촬상되어 수득된 이미지를 RGB 프로파일에 따라 분석하여 정상세포와 암세포를 가장 명확하게 구별할 수 있는 값을 의미한다.
따라서, 상기 단계 (c)는 바람직하게는 예비 실험을 통해 미리 정해진 RGB 범위로부터 임계값 1을 설정하여 해당 임계값을 만족하는 이미지를 분리함으로써 암세포 영역을 분리해낼 수 있다.
본 발명은 일실시예에 따르면, 상기 단계 (b)에서 수득된 이미지로부터 모든 범위의 RGB(R:0~255, G:0~255, B:0~255) 이미지를 추출하고, 그 결과 암세포와 정상세포의 RGB 프로파일 결과값에 가장 큰 차이를 나타내는 총 3개의 기준을 설정하였다. 즉, Red:170~230, Green:145~215, Blue:160~220의 RGB 값을 가지며, Red-Green의 값이 6보다 크고, Blue-Green의 값이 6보다 큰 이미지 영역이 암세포로 구분이 될 수 있으며, 이를 검출할 수 있도록 임계값 1을 설정하였다.
본 발명에서 상기 임계값 1은 AIMP2-DX2와 혼성화하는 프로브에 부착된 표지물질의 종류, 세포 염색 용액의 종류에 따라 달라질 수 있으며 그 값은 개별적인 사안에 따라 실험자가 예비실험을 통해 암세포와 정상세포를 가장 정확하게 구분할 수 있는 임계값 1의 범위를 설정할 수 있다.
이후, 상기 임계값 1을 만족하는 이미지 영역을 상기 소프트웨어 프로그램을 이용하여 자동 분리함으로써 암세포 이미지 영역을 정상세포 이미지 영역으로부터 자동으로 분리할 수 있다.
(d) 분리된 암세포에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하는 단계
본 발명의 상기 단계 (d)는 상기 단계 (c)로부터 추출된 암세포 영역 이미지로부터 AIMP2-DX2의 신호를 검출하는 단계이다.
본 발명에서 상기 임계값(threshold) 2는 암세포 신호와 AIMP2-DX2 신호를 구분하기 위하여 상기 추출된 암세포 영역 이미지의 RGB 프로파일을 분석하고 두 종류의 신호를 가장 명확하게 구별할 수 있는 값을 의미한다.
따라서, 상기 단계 (d)는 RGB 프로파일로부터 정해진 임계값 2를 설정하여 AIMP2-DX2 신호를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 임계값 1로 정상세포와 암세포가 구별된 이미지 상에 암세포 신호와 AIMP2-DX2 신호의 RGB 프로파일 결과 가장 큰 차이를 나타내는 기준을 설정하였다. 즉, Red <181, Green <181, Blue <181, Red-Green > 30, 그리고 Blue-Green > 7을 모두 만족하는 이미지 영역이 AIMP2-DX2 신호인 것으로 구분될 수 있으며, 이를 임계값 2로 설정하고 이를 만족하는 영역을 상기 암세포 영역 이미지로부터 검출하였다.
본 발명에서 상기 임계값 2는 AIMP2-DX2와 혼성화하는 프로브에 부착된 표지물질의 종류, 세포 염색 용액의 종류에 따라 달라질 수 있으며 그 값은 개별적인 사안에 따라 실험자가 예비실험을 통해 암세포와 AIMP2-DX2 신호를 가장 정확하게 구분할 수 있는 임계값 2의 범위를 설정할 수 있다.
이후, 상기 임계값 2를 만족하는 이미지 영역을 상기 소프트웨어 프로그램을 이용하여 자동 검출함으로써 암세포 이미지 영역으로부터 AIMP2-DX2 이미지 영역을 자동으로 분리할 수 있다.
(e) 하기 식에 따라 전체 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 전체 암세포 신호) × 100
보다 구체적으로, 단계 (c) 및 (d)에 따라 이미지상에서 암세포로 판단된 픽셀의 갯수를 암세포 신호, AIMP2-DX2 신호로 판단된 픽셀 개수를 AIMP2-DX2 신호로 보고, 하기 식에 따라 AIMP2-DX2 정도를 계산한다.
% AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호/암세포 신호) × 100
상기 단계 (a) 내지 (e)에 대한 구체적인 과정 및 설명은 본 발명의 실시예에 자세히 기재되어 있다.
AIMP2의 스플라이싱 변이체인 AIMP2-DX2는 특이적으로 인간 암 세포와 암 환자의 조직에서 많이 발견되기 때문에 AIMP2-DX2의 발현 정도를 분석함으로써 암의 진단, 경과 분석, 예후 예측 및 항암 치료의 효과 판단 등에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 즉, 상기 각 단계에서 검출된 신호를 분석하여 AIMP2-DX2의 비율을 정량화 한 결과, 암세포 신호 대비 AIMP2-DX2 신호의 비율이 더 높게 나타난 경우, 암인 것으로 진단하거나, 암으로 진행할 가능성이 높은 것으로 판단하거나, 또는 암 환자의 예후를 예측해볼 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면 특정 피검체에서 수득한 동일 시료 내에서 AIMP2-DX2을 구분하여 검출할 수 있기 때문에, 상기 계산식에 따라 AIMP2-DX2의 비율을 정량화하는 것이 가능하다. 본 발명의 일비교예에서는 대장암 조직 FFPE 시료를 FISH 방법으로 분석한 결과, 형광이 과발현되어 암세포와 AIMP2-DX2 신호의 구분이 어려움을 확인하였고, 그에 따라 임상에서 적용이 어렵다는 것을 확인하였다. 그러나, SISH 방법으로 FFPE 시료를 분석한 결과 AIMP2-DX2 신호의 구분이 명확하여 암세포에서 AIMP2-DX2 신호를 본 발명의 방법에 따라 명확히 구별할 수 있어, 임상에서 쉽고 간편하게 적용할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 방법에 따라 산출된 전체 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2의 비율을 환자의 중증도, 환자의 예후, 항암 용법의 효과 등의 임상 정보와 조합함으로써, 암의 진단 및 예후 예측 등에 유용한 정보를 제공하는 것이 가능하게 되었다.
특히, AIMP2의 발현은 조직마다, 그리고 피검체의 유전적 특성에 따라 서로 다른 발현양상을 나타내기 때문에 단순히 AIMP2-DX2의 발현량을 절대적으로 정량하는 것만으로는 정확하게 암을 진단할 수 없다. 그러나, 본 발명의 방법을 이용하면 전체 암세포 대비 AIMP2-DX2의 발현 정도를 동일 시료 내에서 정량적으로 확인할 수 있기 때문에 보다 정확하고 빠르게 암조직의 AIMP2-DX2 발현 정도를 확인하고 이에 따른 구분진단을 하여 유용한 정보를 제공할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같이 AIMP2-DX2의 존재 여부 및 그 양을 검출해내는 것은 암을 진단하거나 암의 예후를 예측하는데 있어서 아주 유용할 뿐만 아니라, 암 환자의 치료 방향(치료 약물의 선정 등)을 설정함에 있어서도 매우 중요한 요소가 될 수 있다.
치료제에 대한 치료반응과 그 부작용을 미리 예측할 수 있다면, 환자에게 맞는 약물을 미리 선별하여 약물을 잘못 선택함으로 인하여 생기는 치료 탈락(dropout)률을 낮추고 약물의 순응도를 높일 수 있다. 또한, 약물의 효과가 나타나기까지 걸리는 시간과 환자가 겪을지도 모르는 부작용의 위험을 피해 갈 수 있다.
이러한 개념하에 여러 약물 반응성과 관련된 마커의 탐색이나 이를 활용한 상용의 체외진단 또는 동반진단 키트가 개발되고 있고, 그 중 몇 가지는 이미 상용화 되어 임상에서 활용되고 있다. 하지만, 이러한 방법들은 일반적으로 고도로 숙련된 실험자에 의하지 않으면 결과의 신뢰성이 떨어지는 경우가 많다. 이에 따라 일부의 경우 central lab 방식으로 환자의 시료를 정해진 과정에 따라서 서비스 제공회사에 제공하여야 비교적 의미있는 결과를 얻을 수 있는 경우도 있고, 실험실간 오차 (inter-laboratory variation), 실험자간 오차 (inter-observer variation), 실험시기간 오차(day-to-day variation)로 인해 전체적인 시스템의 신뢰성에 의문이 제기될 수 있기도 하다.
이와 같이 종래의 방법은 장소, 시간, 실험자에 따라서 진단 결과에 오류가 생길 우려가 있어 안정적인 결과를 얻기 위하여 실험자의 관여가 가급적 배제된 방법이나 자동화 과정이 필요한데 본 발명의 상기 방법은 암 환자로부터 수득한 시료로부터 AIMP2-DX2의 발현율을 자동화된 시스템으로 정량적으로 검출할 수 있기 때문에 암 환자의 치료를 위한 동반진단(companion diagnostics, CDx) 분야에서 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
다른 한편, 종래보고에 따르면 암 환자에서 AIMP2-DX2의 발현율이 높을수록 암의 예후, 특히 전체생존율(overall survival) 및 무진행 생존율(progression-free survival)이 좋지 않은 것으로 확인된 바 있다(Journal of Cancer 2017, Vol. 8).
따라서, 본 발명은 암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 암 예후 예측치를 산출하는 자동화된(automated) 방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
(c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
(e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
%AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
(f) 상기 %AIMP2-DX2의 값이 높을수록 암의 예후가 좋지 않은 것으로 암 예후 예측치를 산출하는 단계.
본 발명에서 상기 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정 기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻하며, 예후 예측 진단(예후 진단 또는 예측 진단)은 특히 암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다. 예후 예측은 질환 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함한다.
본 발명의 상기 방법에서 (a) 내지 (e) 단계는 전술한 바와 같다.
한편, 상기 (f) 단계는 상기 (e) 단계에서 산출된 %AIMP2-DX2 값에 따라 암 환자의 예후 예측치를 산출하는 단계로서, %AIMP2-DX2의 값이 클수록 암의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 예후 예측치란 암의 예후가 매우 좋지 못한 고위험군, 암의 예후가 좋지 못한 중위험군, 암의 예후가 나쁘지 않은 저위험군을 구분하는 것을 의미하며, 상기 암의 예후가 좋지 않다는 것은 암 환자의 전체 생존(overall survival), 무진행 생존(progression-free survival), 무병생존(disease-free survival)의 확률이 낮고 암의 전이, 재발 또는 전이성 재발의 확률이 큰 것을 의미하며, 바람직하게는 전체 생존(overall survival), 무진행 생존(progression-free survival) 및 무병생존(disease-free survival)의 확률이 낮은 것을 의미한다.
본 발명의 방법에 따르면 동일 시료 내에서 AIMP2-DX2의 비율을 정량적으로 검출할 수 있고 자동화가 가능하며, 진단결과의 정확도가 우수할 뿐만 아니라 FFPE 시료를 사용하여 임상에 적용 가능하기 때문에, 암의 구분진단, 예후 예측 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 AIMP2-DX2의 전사체의 생성 및 AIMP2-DX2 mRNA가 특이적으로 표적되어 스플라이싱 되는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 피검체로부터 수득한 시료(FFPE)에 본 발명의 프로브 세트를 처리하여 혼성화 한 후 나타나는 은 침전 신호를 현미경으로 관찰한 결과이다.(이미지의 진붉은색 점이 AIMP2-DX2를 의미한다.)
도 3은 SISH 결과 데이터를 분석하여 AIMP2-DX2 정도를 계산하는 플로우 차트이다.
도 4은 MATLAB 상에서 AIMP2-DX2 SISH 이미지를 불러오는 사진이다.
도 5은 MATLAB 상에서 암세포와 정상세포를 구분하여 암세포의 영역을 남기기 위해 임계값(Threshold)를 설정하는 사진이다.
도 6는 MATLAB 상에서 AIMP2-DX2 시그널 측정을 위해 임계값을 설정하여 픽셀수를 계산하는 사진이다.
도 7은 MATLAB 상에서 암세포로 판단된 “total area”와 AIMP2-DX2 시그널로 판단된 “signal”을 이용하여 %AIMP2-DX2 를 계산하는 사진이다.
도 8은 AIMP2-DX2 정도로 암 위험도를 진단한 결과이다.
도 9는 프로브 set 1을 이용하여 형광 제자리 혼성화 방법(FISH)을 수행한 결과 및 이를 MATLAB 상에 적용하여본 결과이다.
도 10은 낮은 레이저 강도로 AIMP2-DX2 형광 제자리 혼성화 방법(FISH)을 수행한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
프로브 세트의 제작
AIMP2 전사체의 서열정보를 Genebank RefSeq Accession number NM_006303.3 transcript에서 입수하여 AIMP2 및 AIMP2-DX2의 엑손 1 내지 4 중 목적하는 엑손의 염기서열과 상보적인 프로브를 ACD cell diagnostics에 의뢰하여 제작하였다.
상기 제작된 프로브를 다음과 같은 구성으로 세트를 구분하였다:
(Set 1) (i) 제1의 형광물질로 표지된 서열번호 1의 염기서열 중 17 내지 111번째 염기와 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 456 내지 1182번째 염기와 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 (ii) 제2의 형광물질로 표지된 서열번호 1의 염기서열 중 222 내지 453번째 염기와 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 AIMP2 및 AIMP2-DX2 검출용 프로브 세트,
상기 Set 1 프로브 세트에서 제1의 형광물질은 적색을 나타내는 Atto 550, 제2의 형광물질은 녹색을 나타내는 Alexa 488을 사용하였다.
(Set 2) 서열번호 2로 표시되는 염기와 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 AIMP2-DX2 검출용 프로브 세트.
<실시예 2>
은 제자리 혼성화(SISH)을 이용한 암세포에서의 AIMP2-DX2 검출
상기 실시예 1에서 제작한 프로브 Set 2을 이용하여 실제 암 세포에서 AIMP2-DX2를 은 제자리 혼성화(Silver In situ hybridization) 방법으로 검출할 수 있는지 여부를 확인하였다.
먼저, 포르말린 고정 파라핀 포매 (formalin fixed paraffin embedded) 대장암 환자 25명의 조직을 4㎕ 두깨로 절편을 제작하였다.
SISH는 Basescope 시스템 (ACD, Inc., Hayward, California, US)을 사용하여 시행하였다. 절편을 제작 한 뒤 1주일 이내에 실험을 진행하였으며, 실험에 들어가기 직전에 60℃도 건조오븐에 1시간동안 가열해주고 xylene과 100% EtOH에 세척하여 탈파라핀화 (deparaffinize)시켜주었다. 이 후 진행되는 모든 실험은 가습챔버에 넣고 진행하여 온도변화를 최소화하고 건조되지 않도록 하였다. 전처리 과정으로 과산화수소를 15분간 상온에서 처리하고 표적회수용액 (target retrieval reagent)에 넣어 98-102℃에서 14분간 끊여주었다. 이후 단백질분해효소Ⅲ (proteinase Ⅲ)를 처리하여 전처리를 40℃에서 45분간 처리해주었다.
Proteinase 처리가 된 조직에 AIMP2-DX2 프로브를 40℃에서 2시간 동안 혼성화하였다. 혼성화된 후에는 증폭제 1-6을 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 차례로 처리해주었다. SISH의 최종반응물은 은 침전물인데, 연속적으로 red A, red B 가 첨가되면서 발색제의 효소 화학반응이 이뤄지고, 여기서 은 이온(Ag+) 환원과 동시에 다중 결합된 증폭제에서 붉은색 발색이 이루어져 붉은은 점으로 가시화되었다. 이후 일반 광학현미경에서 해석하기 위해 Gill’s hematoxylin I 대조염색 하였다. 대조염색 후 60℃ 건조 오븐에 15분간 건조시키고 벡타마운트 (Vector Labs, Peterbourough, UK) 용액을 도포 후 커버슬립으로 덮어 광학현미경으로 검경하였다.
프로브 Set 2를 이용하여 은 제자리 혼성화를 수행한 절편은 먼저 서울대학교병원 병리과에서 병리 판독을 받아 종양부위의 염색 상태와 결과를 광학현미경 (DMi8, Leica biosystems, Nussloch, Germany) 다중 육안 검경으로 확인하였다.
확인한 SISH 절편은 조직 슬라이드 스캐너 (SCN400, Leica biosystems, Nussloch, Germany) 로 X20 배율 전면을 디지털 스캔하여 전자 파일로 보관하였다. SISH 결과로 세포 내 표적 전사체와 혼성화가 정상적으로 일어나 붉은 점으로 신호가 가시화 되는 것을 확인하고 대표 이미지를 추출하여 분석을 수행하였다( 도 2).
<실시예 4>
은 제자리 혼성화(SISH) 결과 분석
본 발명자들은 도 3의 flow chart 순서에 따라 SISH 결과 데이터를 자동으로 분석하기 위하여, MATLAB software를 이용하여 AIMP2-DX2 신호 검출 자동화 방법을 구획하였다.
먼저, MATLAB software (버전 R2012a; 더매스웍스, 인크.(The MathWorks, Inc.) 실행 후, 도 4에 나타나듯이 load image 버튼을 눌러 상기 실시예 3에서 수득한 AIMP2-DX2 SISH 이미지를 불러왔다. 도 4에서 불러온 이미지의 작업 전, 후 이미지가 나타난다. 이미지에 암세포가 많이 찍혔을수록 signal이 당연히 세지므로, 이를 보정하기 위하여 불러온 이미지에서 정상세포와 암세포를 구분하기 위하여 하기 단계를 실행하였다.
도 5에 나타나듯이, 전체 사진에서 암세포를 구분하는 임계값(threshold) 1을 슬라이드 바 또는 숫자 입력으로 정할 수 있으며, 임계값(threshold) 1을 정한 뒤 push button을 눌러 암세포만을 남겼다. 임계값(threshold) 1 기본 수치는 50이며, 임계값(threshold)가 낮을수록 이미지를 더 엄격하게 판단하여 높을 때에 비해 상대적으로 암세포 면적이 줄어드는 것을 확인하였다. 상기 임계값(threshold) 1은 정상세포와 암세포의 RGB 데이터를 이용해 지정하였다. 암세포와 정상세포의 RGB 프로파일을 찾아 가장 차이가 나타나는 범위를 설정하였다. 그 결과, 본 실시예에서는 red : 170~230, green : 145~215, blue : 160~220, red-green >6, blue-green >6 조건에 해당하였으며, 이러한 조건을 만족하는 임계값(threshold) 1이 50임을 확인하였다. 이에, 발명자들은 임계값 50을 설정하여 정상세포와 암세포를 구분하고, 경계를 매끄럽게 하였다. 상기 임계값 1을 입력한 후 push button을 누르면, 도 6에 서 확인할 수 있는 바와 같이 정상세포 영역은 검정색으로, 암세포 영역은 붉은색으로 구분이 되어 암세포 영역만이 분리되어 추출된 것을 확인할 수 있다. 그 후, 판단된 암세포의 픽셀 수를 계산하여 total area로 나타내고, 상기 암세포로 판단된 픽셀 중에서 AIMP2-DX2 SISH signal을 이하 측정하였다.
도 6에 나타나듯이, 암세포만을 분리하여 추출한 이미지에서 AIMP2-DX2 신호(signal) 측정을 위한 임계값(threshold) 2을 슬라이드 바 또는 입력으로 설정할 수 있으며, push button을 눌러 신호를 측정할 수 있다. AIMP2-DX2 신호 또한 암세포 신호와 AIMP2-DX2 신호의 RGB 프로파일이 가장 차이가 나타나는 범위를 분석하여, 임계값(threshold) 2를 지정하였는데, Red < 181, Green < 151, Blue < 181, Red - Green >30, Blue - Green > 7 조건에 해당하였으며, 이러한 조건을 만족하는 임계값(threshold) 2가 19임을 확인하였다. 이에 발명자들은 임계값 19를 설정하여 암세포 신호와 AIMP2-DX2 신호를 구분하고, 경계를 매끄럽게 하였다(도 7). 마찬가지로, 임계값(threshold)이 낮을수록 더 엄격하게 signal로 판단하여 높을 때에 비해 상대적으로 signal 면적이 줄어듦을 확인하였다.
판단된 AIMP2-DX2 신호로 판단된 픽셀 수를 계산하여 "signal"로 정하고, 암세포로 판단된 픽셀의 개수를 “Total”로 정의하였다.
도 7에 나타나듯이, %AIMP2-DX2 값은 (Signal / total) X 100 (%) 로 계산하였다.
즉, 계산된 %AIMP2-DX2 값은 암세포 영역 중 AIMP2-DX2의 발현비율을 나타내는 값이다.
그 다음으로, 총 25개의 대장암 조직 샘플에서, 서울대학교병원병리과에서 의사가 육안으로 자체진단한결과(실시예 2) 및 상기 실시예 4 방법에 따라 %AIMP2-DX2 (signal/total)를 자동 계산한 결과를 하기 표 1 및 도 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2019007660-appb-img-000001
표 1 및 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 임상의가 육안으로 진단한 결과와 마찬가지로 본 발명의 방법에 따라서 자동화된 %AIMP2-DX2 값이 일정한 경향성을 나타내는 것으로 확인인 되었으며, 이를 통해 본 발명의 방법에 따라 암세포에서 AIMP2-DX2의 발현 비율을 보다 정확하고, 신속하게 자동적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<비교예 1>
형광 제자리 혼성화 방법(FISH)을 이용한 암 세포에서의 AIMP2 및 AIMP2-DX2 검출
상기 실시예 1에서 제작한 프로브 Set 1을 이용하여 실시예 2와 동일한 대장암 조직샘플에서 AIMP2 및 AIMP2-DX2를 형광 제자리 혼성화 방법(Fluoroscent In situ hybridization)으로 자동 검출할 수 있는지 여부를 확인하였다. 양성 대조군(positve control)로 형광 발현량이 높은 PPIB 및 POLR2A 검출 probe를 사용하였다.
구체적으로, 대장암 조직 샘플은 PBS을 이용하여 배양액을 씻어준 후 4%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 이용하여 상온에서 1시간동안 고정시켰다. 파라포름알데히드를 PBS로 씻어내고 세포를 70% EtOH에 최소 하루를 4℃에 보관하였다. 세포를 microscope slide위에 뿌리고 상온에서 40여분간 건조하여 부착시켰다. Slide위에 세포를 50% EtOH, 70% EtOH, 그리고 100% EtOH에서 순차적으로 씼어준 후 40℃에서 30분간 Proteinase K를 처리하였다. Proteinase 처리가 된 세포에 AIMP2 프로브를 40℃에서 2시간 동안 혼성화 하였다. 세포를 Wash buffer로 씻어준 후, AMP1, AMP2, AMP3, 그리고 AMP4를 순차적으로 처리하여 형광물질을 부착하였다. 마지막으로 DAPI로 세포핵을 표기하고 세포를 Zeiss 공 초점 현미경으로 이미지화 하였다.
이에 대한 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 프로브 Set 1를 이용하여 형광 제자리 혼성화 방법(FISH)을 수행한 결과 높은 자가 형광을 나타내어 분석이 불가능하였다. 형광 발현량이 높아 positive control로 쓰이는 PPIB와 POLR2A probe를 사용하여 비교하였음에도 불구하고 조직 전체에서 강한 형광을 보이며, AIMP2-DX2에 대한 특이적인 형광 패턴을 찾기 어려웠다.
이에 더하여, 위 결과에 따라 낮은 레이저 강도로 AIMP2-DX2 RNA FISH를 시도하였으나, 대부분 조직에서 의미 있는 이미지를 얻는 것이 불가능하였다.(도 10 )
이러한 문제로 RNA FISH 방법은 FFPE 시료를 이용하여 AIMP2-DX2 를 대장암 조직에서 검출하는데 적합한 방법이 아니며, 그에 따라 FISH 방법은 임상 진단에 적용하기 어려움을 확인하였다.
본 발명의 방법에 따르면 동일 시료 내에서 AIMP2-DX2의 비율을 정량적으로 검출할 수 있고 자동화가 가능하며, 진단결과의 정확도가 우수할 뿐만 아니라 FFPE 시료를 사용하여 임상에 적용 가능하기 때문에, 암의 구분진단, 예후 예측 등에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (10)

  1. 암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 AIMP2-DX2 신호의 검출 방법:
    (a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
    (c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
    (d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
    (e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
    %AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 단계 (b)에서 상기 시료로부터 분리된 세포를 세포 염색 용액과 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포 염색 용액은 세포핵을 염색하는 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 메틸렌블루(methylene blue), 아세트산카민(acetocarmine), 톨루이딘블루(toluidine blue), 헤마톡실린(hematoxylin) 또는 Hoechst; 세포질을 염색하는 에오신(eosin), 크리스탈바이올렛(crystal violet) 또는 오렌지 G(orange G); 및 미토콘드리아를 염색하는 로다민 123(rhodamine 123), 미토트랙커(MitoTracker), 야누스그린 B(janus green B), 테트라졸리움염(tetrazolium salt), DASPMI(Dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine), DASPEI(2-(4-(dimethylamino)styryl)-N-Ethylpyridinium Iodide), DiOC6(3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide), DiOC7(3,3'-Diheptyloxacarbocyanine Iodide) 또는 JC-1(5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 프로브 세트는 서열번호 2로 표시되는 염기와 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 AIMP2-DX2 검출용 프로브 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 얻어진 이미지로부터 RGB 영상을 추출하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 임계값 1 및 2는 각각 하기 조건에 따른 RGB 신호값을 만족하는 것을 특징으로 하는 방법:
    [임계값 1]
    Red: 170~230, Green: 145~215, Blue: 160~220, Red-Green >6 및 Blue-Green >6
    [임계값 2]
    Red <181, Green <151, Blue <181, Red-Green >30 및 Blue-Green >7
  6. 제1항에 있어서, 상기 시료는 포르말린 고정 파라핀 포매 절편(FFPE)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암은 대장암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 수뇨관 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 암 예후 예측치를 산출하는 자동화된(automated) 방법:
    (a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료로부터 분리된 세포 내 AIMP2-DX2를 프로브 세트를 이용하여 은 제자리 혼성화(silver in situ hybridization)하고, 신호를 유발하여 촬상하여 이미지화하는 단계;
    (c) 미리 정해진(pre-determined) 임계값 1을 적용하여 상기 이미지에서 암 세포 영역의 이미지를 분리하는 단계;
    (d) 상기 분리된 암세포 영역에서 AIMP2-DX2 신호를 선정하기 위해, 미리 정해진 임계값 2를 설정하고 적용하는 단계; 및
    (e) 하기 식에 따라 암세포 신호에 대한 AIMP2-DX2 신호의 상대적인 비율을 계산하는 단계.
    %AIMP2-DX2 = (AIMP2-DX2 신호 / 암세포 신호) × 100
    (f) 상기 %AIMP2-DX2의 값이 높을수록 암의 예후가 좋지 않은 것으로 암 예후 예측치를 산출하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 예후는 전체 생존(overall survival), 무진행 생존(progression-free survival) 및 무병생존(disease-free survival)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 암은 대장암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 수뇨관 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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