WO2019211937A1 - コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法 - Google Patents

コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法 Download PDF

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WO2019211937A1
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catechol
strain
transformant
ubid
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乾将行
平賀和三
須田雅子
久保田健
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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
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    • C12Y402/03004—3-Dehydroquinate synthase (4.2.3.4)
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present disclosure relates to a transformant of coryneform bacteria.
  • the present disclosure also relates to a method for producing a useful compound (for example, catechol) using the transformant.
  • Catechol is used as a raw material for fragrances, polymerization inhibitors, antioxidants, pharmaceuticals, and agricultural chemicals. Further, it is used as a raw material for a resist (photosensitive resin applied at the time of manufacturing a printed board), a release agent, an oxygen scavenger (activated carbon adsorbent), and a plating treatment agent. Catechol is mainly produced by an oxidation reaction using phenol as a raw material.
  • Catechol is present on the metabolic pathway of microorganisms. Catechol is produced by two-stage oxidation from benzene or decarboxylation to dihydroxybenzoic acid. Catechol is then decomposed by ortho- or meta-cleavage and incorporated into the TCA circuit.
  • Patent Documents 1 and 2 introduce Escherichia or Klebsiella microorganisms as hosts and introduce transketole, DAHP synthase, 3-dehydroquinate synthase, and introduce dehydroshikimate dehydratase and protocatechuate decarboxylase derived from Klebsiella pneumoniae
  • DAHP synthase 3-dehydroquinate synthase
  • dehydroshikimate dehydratase and protocatechuate decarboxylase derived from Klebsiella pneumoniae A technique for producing catechol from glucose using the transformed bacterium is disclosed.
  • Patent Document 3 aims to produce adipic acid and cis-cismuconic acid by microorganisms.
  • an example of catechol production using a strain having the same configuration as that of Patent Document 2 is disclosed.
  • Patent Documents 4 and 5 disclose a method for producing a compound using dehydroshikimic acid as a precursor, and propose a method for producing catechol by expressing protocatechuate decarboxylase derived from Klebsiellapneumoniae, Enterobacter cloacae, Lactobacillus plantarum or Clostridium butyricum. is doing.
  • a transformed bacterium in which 3,4-DHB decarboxylase derived from Enterobacter cloacae is expressed in Escherichia coli is used.
  • Patent Document 6 aims to produce three isomers of muconic acid.
  • an example of catechol production using a strain having the same configuration as that of Patent Document 2 is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 discloses a technique for producing catechol from glucose using a transformed bacterium in which a protocatechuate decarboxylase gene of Klebsiella pneumoniae is introduced into Escherichia coli.
  • Non-Patent Document 2 discloses a technique for producing catechol from glucose using a transformed bacterium in which an anthranilate 1,2-dioxygenase gene of Pseudomonas aeruginosa is introduced into Escherichia coli.
  • Non-Patent Document 3 discloses a technique for producing catechol from glucose using a transformed bacterium in which a protocatechuate decarboxylase gene of Klebsiella pneumoniae is introduced into Escherichia coli.
  • the present disclosure provides a microorganism capable of efficiently producing catechol using a saccharide as a raw material, and a method for efficiently producing catechol using the microorganism.
  • the disclosure provides for a host coryneform bacterium, (1) Lactobacillus rhamnosus decarboxylase gene ubiD, (2) Ortholog of the gene of (1) in the genus Lactobacillus, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Paenibacillus, Citrobacter, and Pantoea, and (3) the gene of (1) or (2) is encoded A transformant into which a gene selected from the group consisting of genes encoded by an enzyme having an amino acid sequence identity of 70% or more and an enzyme having decarboxylation activity is introduced, Characteristics of coryneform bacteria in which a mutation is introduced into the catechol 1,2-dioxygenase gene catA of the host coryneform bacterium and the protocatechuate dehydrogenase gene pcaHG, and the enzyme encoded by the two genes is reduced in function or defective.
  • a host coryneform bacterium (1) Lactobacillus rhamnosus decarboxylase gene ubiD
  • the coryneform bacterium transformant according to the present disclosure is reacted in a reaction solution in which at least one factor necessary for growth is removed or in a reaction solution under reducing conditions; And a step of recovering catechol in the reaction medium.
  • the production of catechol in coryneform bacteria can be made efficient.
  • the production rate and / or yield in the production of catechol can be improved.
  • FIG. 1 is a graph showing an example of catechol production of CAT21 strain.
  • FIG. 2 is an experimental example showing the high resistance of coryneform bacteria to catechol.
  • catechol productivity can be improved by expressing a predetermined decarboxylase in a coryneform bacterium introduced with a mutation that suppresses the degradation of protocatechuic acid and catechol. .
  • a predetermined decarboxylase By expressing the predetermined decarboxylase, it is presumed that the decarboxylation reaction of protocatechuic acid is enhanced and the productivity of catechol is improved.
  • the present disclosure may not be limited to this mechanism. According to the present disclosure, in one aspect, the production concentration and / or yield of catechol can be improved.
  • coryneform bacteria are a group of microorganisms defined in Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974), and are usually aerobic. There is no particular limitation as long as it grows under the desired conditions. Specific examples include Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, and the like. Among the coryneform bacteria, the genus Corynebacterium is preferable.
  • Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, Corynebacterium alkanolerity A cam (Corynebacterium alkanolyticum) etc. are mentioned. Of these, Corynebacterium glutamicum is preferable because it is safe and has high availability of xylooligosaccharides.
  • Suitable strains include Corynebacterium glutamicum R strain (FERMP-18976), ATCC13032 strain, ATCC13869 strain, ATCC13058 strain, ATCC13059 strain, ATCC13060 strain, ATCC13232 strain, ATCC13286 strain, ATCC13287 strain, ATCC13655 strain, ATCC13745 strain, ATCC13746 strain, Examples include ATCC13761 strain, ATCC14020 strain, ATCC31831 strain, MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233AB-41 (FERM BP-1498) and the like. Among these, R strain (FERM P-18976), ATCC13032 strain, and ATCC13869 strain are preferable.
  • strains are available from NBRC (NITE Biological Resource Center), ATCC (American Type Culture Collection), etc., which are microorganism preservation organizations. These microorganisms may be not only wild strains existing in nature, but also mutants or genetically modified strains thereof.
  • the transformant according to the present disclosure has a gene catA encoding an enzyme having a catechol 1,2-dioxygenase activity of the host coryneform bacterial genome and a protocatechuate dehydrogenase activity
  • a mutation is introduced into the gene pcaHG encoding the enzyme, and these two enzymes are reduced in function or deficient in function.
  • Examples of the mutation include base sequence substitution, deletion, and insertion. These mutations may be introduced in advance into a coryneform bacterium used as a host, or these mutations may be introduced in the process of producing a transformant according to the present disclosure.
  • a genetically modified strain that improves the production of protocatechuic acid may be used as the host coryneform bacterium (for example, International Publication WO2017 / 169399).
  • the decarboxylase introduced into the host coryneform bacterium is preferably an enzyme having decarboxylation activity against protocatechuic acid.
  • One of the forms of introducing an enzyme having decarboxylation activity against protocatechuic acid into coryneform bacteria is to introduce any of the following genes (1) to (3).
  • Lactobacillus rhamnosus decarboxylase gene ubiD (2) The ortholog of the gene of (1) in the genus Lactobacillus, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Paenibacillus, Citrobacter, and Pantoea.
  • the genes (1) to (3) are introduced into a host coryneform bacterium, a general gene recombination technique (for example, Michael R. Green & Joseph Sambrook, Molecular cloning, Coldspring Harbor Laboratory Press) is used. And can be carried out in the form of gene transfer using a plasmid vector or integration into a host coryneform bacterial chromosome.
  • introduction of a gene refers to introduction of the gene so that it can be expressed in a host in one or a plurality of embodiments.
  • ubiDX gene in order to introduce the ubiDX gene into a host coryneform bacterium, it is preferable to incorporate an appropriate promoter 5′-upstream of the gene, and it is more preferable to incorporate a terminator 3′-downstream of the gene.
  • Lactobacillus rhamnosus decarboxylase gene ubiD is registered in a database such as NCBI as LGG_02656 or LGG_RS12695 in one or a plurality of embodiments.
  • the decarboxylase gene introduced into the host may be the ubiD ortholog of Lactobacillus rhamnosus.
  • Orthologs of Lactobacillus rhamnosus ubiD include orthologs in the genus Lactobacillus, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Paenibacillus, Citrobacter, and Pantoea. From the viewpoint of improving the productivity of catechol, the genus Lactobacillus, Bacillus Orthologs of the genus and Enterobacter are preferred, orthologs of the genus Lactobacillus and Bacillus are more preferred, orthologs of the genus Lactobacillus are more preferred, and genes used in the examples are even more preferred.
  • orthologs of the genus Lactobacillus of the ubiD gene of Lactobacillus rhamnosus include the ubiD gene of Lactobacillus pentosus, the ubiD gene of Lactobacillus plantarum, the ubiD gene of Lactobacillus pobuzihii, and the ubiD gene of Lactobacillus composti.
  • the orthologs of the genus Bacillus of the ubiD gene of Lactobacillus rhamnosus include the ubiD gene of the Bacillus megaterium, the ubiD gene of Bacillus licheniformis, the ubiD gene of Bacillus trophaeus, the ubisp gene of Bacillus subtilis subsp.
  • the present invention is not limited to these.
  • Orthologs of the genus Enterobacter of the ubiD gene of Lactobacillus rhamnosus include, but are not limited to, the ubiD gene of Enterobacteraerogenes, the ubiD gene of Enterobacter cloacae, the ubiD gene of Enterobacter sakazakii, and the ubiD gene of Enterobacterhormaechei.
  • orthologs of the genus Escherichia of the ubiD gene of Lactobacillus hamrhamnosus include, but are not limited to, the ubiD gene of Escherichia coli W and the ubiD gene of Escherichia fergusonii.
  • orthologs of the genus Paenibacillus of the ubiD gene of Lactobacillus rhamnosus include the ubiD gene of Paenibacillus polymyxa, but are not limited thereto.
  • orthologs belonging to the genus Citrobacter of the ubiD gene of Lactobacillus rhamnosus include, but are not limited to, the ubiD gene of Citrobacter koseri.
  • An ortholog of the Pantoea genus of the ubiD gene of Lactobacillus rhamnosus includes, but is not limited to, the ubiD gene of Pantoea ⁇ ananatis.
  • the “orthologous gene” means a related gene encoding a protein having a homologous function existing in different organisms (for example, different species, different genera).
  • the decarboxylase gene to be introduced into the host is an enzyme having an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of the Lactobacillus rhamnosus ubiD gene or the enzyme encoded by the above-mentioned ortholog, and has a decarboxylation activity.
  • the encoded gene may be a gene encoded by the enzyme.
  • the amino acid sequence identity is 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 85% or more, from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • the ubiX gene in the same genome as the ubiD gene is introduced into the host coryneform bacterium together with the ubiD gene. Further, when the ubiH gene is present in the same genome as the ubiD gene, it is preferable to introduce the ubiH gene together with the ubiD gene and the ubiX gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • the ubiD gene and ubiX gene of Lactobacillus rhamnosus constitute an operon in this order, and in such a case, they are referred to as ubiDX gene in this disclosure.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiDX gene of Lactobacillus rhamnosus includes the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the ubiX gene is preferably introduced into the host coryneform bacterium together with the ubiD gene from the viewpoint of improving the productivity of the catechol. If there is a ubiH gene, the ubiH gene is preferably introduced into the host coryneform bacterium together with the ubiD gene and the ubiX gene.
  • the ubiX gene of Lactobacillus pentosus constitutes an operon with the ubiH gene separately from the ubiD gene (ubiHX gene).
  • ubiHX gene ubiHX gene
  • One or more embodiments of the ubiXH gene and ubiD gene of Lactobacillus pentosus include the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively.
  • the ubiD gene of Lactobacillus plantarum When the ubiD gene of Lactobacillus plantarum is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferable to introduce the ubiHX gene together with the ubiD gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol, as with Lactobacillus pentosus.
  • One or more embodiments of the ubiXH gene and ubiD gene of Lactobacillus plantarum include the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively.
  • the ubiD genes of Lactobacillus pobuzihii and Lactobacillus composti When the ubiD genes of Lactobacillus pobuzihii and Lactobacillus composti are introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiDX gene from the viewpoint of improving catechol productivity.
  • the ubiX gene of Bacillus megaterium the ubiX gene, ubiD, and ubiH constitute the operon in this order. In such a case, it is referred to as the ubiXDH gene in this disclosure.
  • the ubiD gene of Bacillus megaterium is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as the ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Bacillus megaterium includes the base sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Bacillus licheniformis When the ubiD gene of Bacillus licheniformis is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as the ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Bacillus licheniformis includes the base sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Bacillus atrophaeus is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as the ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Bacillus atrophaeus includes the base sequence of SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Bacillus subtilis subsp. Subtilis When the ubiD gene of Bacillus subtilis subsp. Subtilis is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as the ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or more embodiments of the ubiXDH gene gene of Bacillus subtilis subsp. Subtilis includes the base sequence of SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Bacillus subtilis subsp. Spizizenii When the ubiD gene of Bacillus subtilis subsp. Spizizenii is introduced into a host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or more embodiments of the ubiXDH gene gene of Bacillus subtilis subsp. Spizizenii includes the base sequence of SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Enterobacter aerogenes When the ubiD gene of Enterobacter aerogenes is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as the ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Enterobacter aerogenes includes the base sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Enterobacter cloacae is introduced into a host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Enterobacter cloacae includes the base sequence of SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Enterobacter sakazakii When the ubiD gene of Enterobacter sakazakii is introduced into a host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or more embodiments of the ubiXDH gene gene of Enterobacter sakazakii include the base sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Enterobacter hormaechei When the ubiD gene of Enterobacter hormaechei is introduced into a host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Enterobacter hormaechei includes the base sequence of SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Escherichia coli W When the ubiD gene of Escherichia coli W is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as the ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or more embodiments of the ubiXDH gene gene of Escherichia coli W include the base sequence of SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Escherichia fergusonii is introduced into the host coryneform bacterium, it is preferably introduced as the ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 20 in the Sequence Listing can be mentioned.
  • the ubiD gene of Paenibacillus polymyxa When the ubiD gene of Paenibacillus polymyxa is introduced into a host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Paenibacillus polymyxa includes the base sequence of SEQ ID NO: 21 in the sequence listing.
  • the ubiD gene of Citrobacter koseri When the ubiD gene of Citrobacter koseri is introduced into a host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Citrobacter koseri includes the base sequence of SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • the Pantoea ananatis ubiD gene When introducing the Pantoea ananatis ubiD gene into a host coryneform bacterium, it is preferably introduced as a ubiXDH gene from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • One or a plurality of embodiments of the ubiXDH gene gene of Pantoea ananatis includes the base sequence of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing.
  • the host coryneform bacterium is introduced with any of the genes (1) to (3) above, and the host genome catechol 1,2-dioxygenase (catA) and protocatechuate dehydrogenase (catA) and protocatechuate dehydrogenase ( The present invention relates to a transformant in which two enzymes of pcaHG) are reduced in function or deficient in function.
  • the transformant according to the present disclosure can efficiently produce catechol.
  • the transformant according to the present disclosure preferably has a ubiX gene and / or a ubiH gene introduced from the viewpoint of improving the productivity of catechol.
  • a further gene may be introduced or a gene deletion and / or mutation may be introduced for the production of catechol or its efficiency.
  • introduction or destruction of a gene that improves production of protocatechuic acid can be mentioned.
  • introduction of a gene that improves production of protocatechuic acid a gene encoding an enzyme having 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase activity (eg, aroG) and / or 3-dehydroquina Examples thereof include introduction of a gene encoding an enzyme having acid synthase activity (for example, qusB).
  • the transformant according to the present disclosure can be used for the production of catechol as one or a plurality of embodiments. Moreover, the transformant which concerns on this indication can be used for the production
  • the transformant according to the present disclosure can produce catechol with high efficiency using a saccharide as a raw material in a reaction solution not accompanied by cell growth. Therefore, in another aspect, the present disclosure is a step of reacting the coryneform bacterium transformant according to the present disclosure in a reaction solution in which at least one factor necessary for growth is removed or in a reaction solution under reducing conditions. And a method for producing catechol, comprising the step of recovering catechol in the reaction medium.
  • the transformant according to the present disclosure is grown and cultured under aerobic conditions.
  • the transformant according to the present disclosure can be cultured using a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • a carbon source for example, glucose or molasses can be used as a carbon source
  • a nitrogen source for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea, or the like can be used alone or in combination.
  • the inorganic salt for example, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate or magnesium sulfate can be used.
  • Culturing can usually be performed at a temperature of about 20 ° C. to about 60 ° C., preferably about 25 ° C. to about 35 ° C. under aerobic conditions such as aeration and shaking.
  • the pH during the culture is, for example, in the range of about 5 to 10, preferably about 7 to 8.
  • the pH during the culture can be adjusted by adding an acid or an alkali.
  • the carbon source concentration at the start of the culture is about 1 to 20% (W / V), preferably about 2 to 5% (W / V).
  • the culture period is usually about 1 to 7 days.
  • the cultured cells of the transformant according to the present disclosure are collected.
  • the method for recovering and separating the cultured cells from the culture obtained as described above is not particularly limited, and for example, a known method such as centrifugation or membrane separation can be used.
  • the collected cultured microbial cells may be treated, and the resulting microbial cell processed product may be used in the next step.
  • the treated microbial cells include those obtained by adding some treatment to cultured microbial cells, and examples include immobilized microbial cells obtained by immobilizing microbial cells with acrylamide or carrageenan.
  • the catechol production reaction by the cultured cells of the transformant according to the present disclosure collected or separated from the culture obtained as described above or the treated cells thereof is in a reaction solution not accompanied by cell growth
  • Any generation method of aerobic conditions and reducing conditions may be used.
  • the catechol generation method can be either a batch type or a continuous type.
  • not growing includes not substantially growing or hardly growing.
  • a reaction under aerobic conditions by using a reaction solution that lacks or restricts one or more of vitamins such as biotin and thiamine, which are essential compounds for the growth of microorganisms, and a nitrogen source, Proliferation can be avoided or suppressed.
  • the composition of the reaction solution is not defined because coryneform bacteria do not substantially grow.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction solution under reducing conditions is preferably about -200 mV to -500 mV, more preferably about -150 mV to -500 mV.
  • the reduction state of the reaction solution can be easily estimated with a resazurin indicator (decolorization from blue to colorless in the reduction state), but accurately using a redox potentiometer (for example, BROADLEY JAMES, ORPElectrodes) It can be measured.
  • the reaction solution it is preferable to maintain the reducing conditions immediately after adding the microbial cells or the processed product to the reaction solution until collecting the catechol, but at least when the catechol is collected, the reaction solution is in a reduced state. I just need it. It is desirable that the reaction solution be kept under reducing conditions for about 50% or more of the reaction time, more preferably about 70% or more, and even more preferably about 90% or more. In particular, the oxidation-reduction potential of the reaction solution is maintained at about -200 mV to -500 mV for a time of about 50% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 90% or more of the reaction time. More desirable.
  • the reaction solution contains an organic carbon source (for example, saccharides) that is a raw material for producing catechol.
  • organic carbon source include substances that can be used for biochemical reactions by the transformant according to the present disclosure.
  • the saccharide include monosaccharides such as glucose, xylose, arabinose, galactose, fructose or mannose, disaccharides such as cellobiose, sucrose, lactose or maltose, or polysaccharides such as dextrin or soluble starch. It is done. Of these, glucose is preferable.
  • the present disclosure in one aspect, reacting the coryneform bacterium transformant according to the present disclosure in a reaction solution in which at least one factor necessary for growth is removed or in a reaction solution under reducing conditions; And a step of recovering catechol in the reaction medium.
  • a known method used in a bioprocess can be used. Such known methods include salting out of catechol production solution, recrystallization method, organic solvent extraction method, esterification distillation separation method, chromatographic separation method or electrodialysis method. Can be determined.
  • the present disclosure may relate to the following: [1] In the host coryneform bacterium, (1) Lactobacillus rhamnosus decarboxylase gene ubiD, (2) Ortholog of the gene of (1) in the genus Lactobacillus, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Paenibacillus, Citrobacter, and Pantoea, and (3) the gene of (1) or (2) is encoded A transformant into which a gene selected from the group consisting of genes encoded by an enzyme having an amino acid sequence identity of 70% or more and an enzyme having decarboxylation activity is introduced, Characteristics of coryneform bacteria in which a mutation is introduced into the catechol 1,2-dioxygenase gene catA of the host coryneform bacterium and the protocatechuate dehydrogenase gene pcaHG, and the enzyme encoded by the two genes is reduced in function or defective.
  • Example 1 Construction of catechol production strains (1) Preparation and acquisition of chromosomal DNA Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976), Lactobacillus rhamnosus NBRC 3425, Lactobacilluspentosus JCM 1558, Lactobacillus plantarum NBRC 3070, Lactobacillus pobuzihii JCM 18084, Lactobacilluscomkka , Lactobacillus sakei subsp.sakei JCM 1157, Bacillus megaterium JCM 2506, Bacilluslicheniformis JCM 2505, Bacillus atrophaeus JCM 9070, Bacillus subtilis subsp.subtilis NBRC 14144, Bacillus subtilis subsp.
  • Chromosomal DNA of ATCC 49162, Escherichia coli W NBRC 13500, Escherichiafergusonii NBRC 102419, Paenibacillus polymyxa NBRC15309, Pantoea ananatis LMG 20103 is cultured according to the information of the strain obtaining agency, and then a DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) It was prepared Te. Chromosomal DNA of Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894D-5 and Citrobacterkoseri ATCC BAA-895D-5 was obtained from ATCC.
  • Table 1 shows primer sequences used for isolating the target enzyme gene.
  • a Veriti thermal cycler (Applied Biosystems) was used, and PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) was used as a reaction reagent.
  • the obtained DNA fragment was introduced into a cloning vector (pCRB209 [International Publication WO2012 / 033112], pCRB210 [International Publication WO2012 / 033112]) containing a PgapA promoter.
  • the markerless chromosomal gene transfer vector pCRA725 is a plasmid that cannot replicate in Corynebacterium glutamicum R.
  • the double crossover strain shows kanamycin sensitivity due to loss of the kanamycin resistance gene on pCRA725 and growth in a sucrose-containing medium due to loss of the sacR-sacB gene.
  • the markerless chromosome gene-introduced strain exhibits kanamycin sensitivity and sucrose-containing medium growth.
  • a PCA production-related gene chromosome introduction strain was constructed using the catechol production-related gene chromosome introduction plasmid and the chromosome gene disruption plasmid described above.
  • the protocatechuic acid-producing coryneform bacterium Corynebacterium glutamicum PCA3 strain [International Publication WO2017 / 169399] was used as the host strain.
  • the pcaHG gene disruption plasmid pCRG3 International Publication WO2017 / 169399
  • the qsuB gene chromosome introduction plasmid pCRB295 International Publication WO2017 / 169399
  • the aroG (S180F) gene chromosome introduction plasmid pCRB285 International Publication WO2017 / 169399
  • summary of this chromosome gene recombination was put together in Table 4 and Table 5, and was shown.
  • Corynebacterium glutamicum CAT21 is internationally deposited at the Patent Microorganism Depositary Center, Product Evaluation Technology Foundation, 2-5-8 ⁇ 122, Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818) (Date of international deposit under the Budapest Treaty: April 17, 2018, deposit number: NITE BP-02689).
  • Catechol production test in test tube, 10 mL scale
  • Catechol production test (in test tube, 10 mL scale) (Combination of destruction of protocatechuic acid degradation pathway and catechol degradation pathway)
  • CAT91 strain see Tables 5 and 6
  • Tables 5 and 6 is a catechol-producing strain constructed based on Corynebacterium glutamicum R strain Went by.
  • CAT91 strain with a final concentration of 50 ⁇ g / mL Kanamycin and 4% glucose A agar medium ((NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g , MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1ml, 0.02% (w / v) biotinsolution 1ml, 0.01 % (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g, and agar 15 g were dissolved in 1 L of distilled water] and left at 33 ° C.
  • agar medium ((NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5
  • the CAT91 strain grown on the above plate was transferred to a liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1ml, 0.02% ( w / v) biotinsolution 1ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g dissolved in 1L of distilled water]
  • the culture was shaken aerobically for 7-15 hours.
  • the culture was shaken aerobically for 48 hours.
  • the culture solution after 48 hours was centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ g, 5 minutes) to obtain a culture supernatant.
  • Metabolite concentrations in the culture supernatant are separated using a high-performance liquid chromatography system (Prominence HPLC system (manufactured by Shimadzu Corporation), COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II, 10% methanol and 0.1% phosphoric acid as the mobile phase. ). As a result, the strain produced 0.1 mM catechol after 48 hours.
  • Catechol production test in test tube, 10 mL scale
  • Catechol production experiment in an aerobic batch reaction using a test tube was conducted by the method described below using a CAT92 strain (see Tables 5 and 6), which is a catechol production strain constructed based on the CAT91 strain.
  • agar medium ((NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5
  • the CAT92 strain grown on the above plate was added to a liquid medium [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose.
  • the culture was shaken aerobically for 48 hours.
  • the culture solution after 48 hours was centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ g, 5 minutes) to obtain a culture supernatant.
  • Metabolite concentrations in the culture supernatant are separated using a high-performance liquid chromatography system (Prominence HPLC system (manufactured by Shimadzu Corporation), COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II, 10% methanol and 0.1% phosphoric acid as the mobile phase. ). As a result, the strain produced 18.4 mM catechol after 24 hours.
  • Example 4 Catechol production test (in test tube, 10 mL scale) (Effects of genes encoding enzymes with various protocatechuic acid decarboxylation activities on catechol production)
  • catechol-degrading enzyme based on protocatechuic acid producing strain Corynebacterium glutamicum PCA3 [International Publication WO / 2017/169399]
  • a strain LHglc1367 was constructed in which the gene coding for was disrupted (Table 5).
  • a plasmid incorporating each gene was introduced into this strain to obtain a decarboxylase-introduced strain CAT01-CAT47 (Table 6). Each catechol productivity was compared. Each strain was applied to the A agar medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 4% glucose and allowed to stand in the dark at 33 ° C. for 15 hours. Each strain grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 10 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, and cultured at 33 ° C. for 7-15 hours. The culture was aerobically shaken.
  • the culture was aerobically shaken at 33 ° C. for 24 hours.
  • the culture solution after 24 hours was centrifuged (4 ° C., 15000 ⁇ g, 5 minutes), and the obtained supernatant was subjected to quantitative analysis of catechol by the high performance liquid chromatography system.
  • Table 7 The identity of the amino acid sequences in Table 7 is the result of comparison between the amino acid sequences encoded by the ubiD gene of Lactobacillusrhamnosus and amino acid sequences encoded by other ubiD genes.
  • Example 5 Catechol production test (jar fermenter, 400mL scale) (Examination of optimum production pH) Using the CAT21 strain (see Tables 5 to 7), a catechol production experiment in an aerobic batch reaction using a jar fermenter was performed by the method described below.
  • the CAT21 strain was inoculated into 10 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, followed by aerobic shaking culture at 33 ° C. for 18 hours.
  • the CAT21 strain was inoculated into 100 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, followed by aerobic shaking culture at 33 ° C. for 12 hours.
  • the cells grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 3000 xg, 10 minutes), and the resulting cells are placed in a jar fermenter culture tank of 1000 ml capacity at a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • Catechol production test (jar fermenter, 400mL scale) (Proliferation-independent production test)
  • a catechol production experiment in an aerobic batch reaction using a jar fermenter was performed by the method described below.
  • the CAT21 strain was inoculated into 10 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, followed by aerobic shaking culture at 33 ° C. for 18 hours.
  • the CAT21 strain was inoculated into 100 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, followed by aerobic shaking culture at 33 ° C. for 12 hours.
  • the cells grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 3000 xg, 10 minutes), and the resulting cells are placed in a jar fermenter culture tank of 1000 ml capacity at a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the cells grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 5000 xg, 10 minutes), and the cells are washed once with 0.9% aqueous sodium chloride solution, and then 100 g wet cells / L (medium volume) 250 ml reaction solution containing 10% glucose ((NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.01% (w / v) thiaminesolution 2 ml in 1 L of distilled water Catechol was generated using a 1000ml jar fermenter at 33 ° C, pH 7.0 (controlled by addition of 5.0N ammonia water), aeration rate 0.25L / min (air, 1vvm), DO5% Reaction was performed.
  • CAT21 strain produced 66 mM (7.25 g / l) catechol 27.5 hours after the start of the catechol production reaction. From this result, it was shown that this strain has very high catechol productivity in a reaction process that does not involve bacterial cell growth using an inorganic salt minimal medium.
  • the catechol productivity of the same strain is as follows. The productivity of Escherichia coli recombinant strain with high productivity reported so far is 38 mM (4.2 g / L) 36 hours. Reference 3) and 41 mM (4.5 g / L) 84 hours (non-patent document 2) were significantly exceeded.
  • Example 7 Catechol production test (jar fermenter) (Use of resin adsorption) Using the CAT21 strain (see Tables 5 to 7), a catechol production experiment combining aerobic batch reaction using a jar fermenter and resin adsorption was performed by the method described below.
  • the CAT21 strain was inoculated into 10 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, followed by aerobic shaking culture at 33 ° C. for 18 hours.
  • the CAT21 strain was inoculated into 100 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, followed by aerobic shaking culture at 33 ° C.
  • the cells grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 3000 xg, 10 minutes), and the resulting cells are placed in a jar fermenter culture tank of 1000 ml capacity at a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the cells grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 5000 xg, 10 minutes), and the cells are washed once with 0.9% aqueous sodium chloride solution, and then 100 g wet cells / L (medium volume) 300 ml reaction solution containing 10% glucose ((NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.01% (w / v) thiaminesolution in 1 L of distilled water Catechol produced using a 1000ml jar fermenter at 33 ° C, pH 7.0 (controlled by addition of 5.0N ammonia water), air flow 0.3L / min (air, 1vvm), DO5% Reaction was performed.
  • glucose ((NH
  • the flow path filled with the reaction solution from the jar fermenter was connected to the peristaltic pump, and the circulation of the culture solution was started simultaneously.
  • a cross-flow type filtration device micro-the pencil type module
  • a new peristaltic pump were arranged in the middle of the flow path, and the filtrate containing no cells was extracted.
  • This filtrate was passed through a column packed with 60 g of adsorption resin (SP850), and the flow-through solution was returned to the jar fermenter.
  • SP850 adsorption resin
  • the experiment after 48 hours was completed, and all the reaction liquid contained in the flow path was returned to the jar fermenter, and the volume was measured.
  • the metabolite concentration in the culture supernatant was analyzed by the high performance liquid chromatography system.
  • the metabolite adsorbed on the resin is extracted by passing water and then 100% ethanol, leaving the water extract as it is, drying the ethanol extract with an evaporator, dissolving in the same volume of water, and then Analyzed by liquid chromatography system. The results are shown in Table 9.
  • the total catechol substance amount was divided by the volume of the reaction solution to obtain the catechol production concentration.
  • CAT21 strain produced 135 mM (14.9 g / L) catechol in 48 hours.
  • the yield based on glucose consumed at that time was 18% (molar ratio).
  • Pseudomonas putida ATCC 700801 strain was applied to the LB agar medium and allowed to stand in the dark at 30 ° C. for 15 hours. Pseudomonas putida grown on the plate was inoculated into the LB liquid medium, and cultured under aerobic shaking at 30 ° C. for 13 hours. Saccharomyces cerevisiae NBRC2376 strain was applied to YEPD agar medium [2% polypeptone, 1% yeast extract, 2% glucose, and 1.5% agar], and allowed to stand at 30 ° C. for 20 hours in the dark.
  • Saccharomyces cerevisiae grown on the plate was inoculated into YEPD liquid medium [2% polypeptone, 1% yeast extract, and 2% glucose], and cultured with shaking at 30 ° C. for 13 hours.
  • Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 strain was applied to the LB agar medium and allowed to stand in the dark at 30 ° C. for 15 hours.
  • Rhodococcus erythropolis grown on the plate was inoculated into the LB liquid medium, and cultured under aerobic shaking at 30 ° C. for 13 hours.
  • coryneform bacterium has a narrower growth inhibition zone and relatively high resistance than any other bacterium. There was no clear difference between coryneform R strain and ATCC AT13032.
  • This disclosure is useful, for example, in the production of catechol.

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Abstract

カテコールの生産性を向上できる微生物の形質転換体の提供。 一態様において、宿主のコリネ型細菌に　（１）Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ｕｂｉＤ、　（２）Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記（１）の遺伝子のオーソログ、及び　（３）前記（１）又は（２）の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が７０％以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子 からなる群から選択される遺伝子が導入された形質転換体であって、　宿主コリネ型細菌のカテコール１，２－ジオキシゲナーゼ遺伝子ｃａｔＡ、及び、プロトカテク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｐｃａＨＧに変異が導入され、前記２遺伝子がコードする酵素が機能低下又は機能欠損している、コリネ型細菌の形質転換体。

Description

コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法
　本開示は、コリネ型細菌の形質転換体に関する。本開示は、また、該形質転換体を用いる有用化合物（例えば、カテコール）の製造方法に関する。
　地球温暖化、および化石資源の枯渇問題を背景に、再生可能な資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料と並んで新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現に向けた重要な方策であることが認識され、注目されている。
　カテコールは香料、重合防止剤、抗酸化剤、医薬品、農薬の合成原料として使用される。また、レジスト（プリント基板製造時に塗布する感光性の樹脂）の剥離剤、脱酸素剤（活性炭吸着剤）、メッキ処理剤の原料として使用される。
　カテコールは、主にフェノールを原料として酸化反応により製造されている。しかし、上述の低炭素社会実現に向け、再生可能資源からの製造が切望されている。
　カテコールは、微生物の代謝経路上に存在する。ベンゼンからの2段階の酸化又はジヒドロキシ安息香酸に対する脱炭酸反応によりカテコールが生成する。その後カテコールはオルト開裂またはメタ開裂によって分解が進み、TCA回路に組み込まれる。
　特許文献１及び２はEscherichia属又はKlebsiella属の微生物を宿主としトランスケトレース、DAHPシンセース、3-デヒドロキネートシンセースを導入し、さらにKlebsiella pneumoniae由来のデヒドロシキメートデヒドラターゼ、プロトカテク酸デカルボキシラーゼを導入した形質転換菌を用いてグルコースからカテコールを製造する技術を開示する。
　特許文献３は微生物によるアジピン酸、シスシスムコン酸生産を目的としている。その検討過程で、特許文献２と同じ構成による株を用いたカテコール生産例を開示する。
　特許文献４および５はデヒドロシキミ酸を前駆体とする化合物の生産法を開示したもので、Klebsiellapneumoniae, Enterobacter cloacae, Lactobacillus plantarum またはClostridium butyricum 由来のプロトカテク酸デカルボキシラーゼを発現させることによるカテコール製造法を提案している。実施例では大腸菌にEnterobacter cloacae由来の3,4-DHB デカルボキシラーゼを発現させた形質転換菌を用いている。
　特許文献６はムコン酸の３種類の異性体の生産を目的としている。その検討過程で、特許文献２と同じ構成による株を用いたカテコール生産例を開示する。
　非特許文献１は大腸菌にKlebsiella pneumoniaeのプロトカテク酸脱炭酸酵素遺伝子を導入した形質転換菌を用いてグルコースからカテコールを製造する技術を開示する。
　非特許文献２は大腸菌にPseudomonas aeruginosaのanthranilate 1,2-dioxygenase遺伝子を導入した形質転換菌を用いてグルコースからカテコールを製造する技術を開示する。
　非特許文献３は大腸菌にKlebsiella pneumoniaeのプロトカテク酸脱炭酸酵素遺伝子を導入した形質転換菌を用いてグルコースからカテコールを製造する技術を開示する。
米国特許第5272073号明細書 特表平9-506242号公報 特表平9-505463号公報 米国特許第2012-0196339号明細書 米国特許第2013-0252294号明細書 特表2013-516196号公報
J. Am. Chem. Soc. (1995) 117:2395-2400 Microb. Cell Fact. (2014) 13:136 J. Am. Chem. Soc. (2005) 127:2874-2882
　生物学的方法によるカテコールの製造方法においては、実用化に向けてより一層の生産性の向上が期待されている。
　本開示は、一態様において、糖類を原料として、効率よくカテコールを製造できる微生物、及び、この微生物を用いて効率良くカテコールを製造する方法を提供する。
　本開示は、一態様において、宿主のコリネ型細菌に、
　（１）Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ｕｂｉＤ、
　（２）Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記（１）の遺伝子のオーソログ、及び
　（３）前記（１）又は（２）の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が７０％以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子
からなる群から選択される遺伝子が導入された形質転換体であって、
　宿主コリネ型細菌のカテコール１，２－ジオキシゲナーゼ遺伝子ｃａｔＡ、及び、プロトカテク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｐｃａＨＧに変異が導入され、前記２遺伝子がコードする酵素が機能低下又は機能欠損している、コリネ型細菌の形質転換体に関する。
　本開示は、その他の一態様において、本開示に係るコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含むカテコールの製造方法に関する。
　本開示によれば、一態様において、コリネ型細菌におけるカテコールの製造を効率化することができる。例えば、カテコールの生産における生産速度及び／又は収率を向上できる。
図１は、ＣＡＴ２１株のカテコール生産の様子の一例を示すグラフである。 図２は、コリネ型細菌の対カテコール耐性の高さを示す実験例である。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、プロトカテク酸及びカテコールの分解を抑制する変異が導入されたコリネ型細菌において、所定の脱炭酸酵素を発現させることでカテコールの生産性を向上できることを見出した。
　該所定の脱炭酸酵素を発現させることでプロトカテク酸の脱炭酸反応が亢進し、カテコールの生産性が向上すると推定される。ただし、本開示はこのメカニズムに限定されなくてもよい。
　本開示によれば、一態様において、カテコールの生産濃度及び／又は収率を向上させうる。
　［宿主］
　本開示において、所定の脱炭酸酵素を導入する宿主は、コリネ型細菌である。
　本開示において、コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔BargeysManual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
　コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacteriumglutamicum）、コリネバクテリウム　エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム　アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム　ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム　アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、安全でかつキシロオリゴ糖の利用能が高い点で、コリネバクテリウム　グルタミカムが好ましい。
　好適な菌株として、コリネバクテリウム　グルタミカムR株（FERMP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
　これらの菌株は、微生物保存機関であるNBRC（NITEBiological Resource Center）、ATCC（American Type Culture Collection）などで入手可能である。
　また、これら微生物は、自然界に存在する野生株だけでなく、その変異株、又は遺伝子組換え株であってもよい。
　カテコールの生産性を向上する観点から、本開示に係る形質転換体において、宿主コリネ型細菌ゲノムのカテコール１,２-ジオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子ｃａｔＡ、及び、プロトカテク酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子ｐｃａＨＧには変異が導入され、これら２つの酵素が機能低下又は機能欠損している。前記変異は、例えば、塩基配列の置換、欠失、挿入などが挙げられる。
　これらの変異は、宿主として使用するコリネ型細菌にあらかじめ導入されていてもよく、本開示に係る形質転換体を製造する過程でこれらの変異を導入してもよい。
　また、カテコールの生産性を向上する観点から、宿主のコリネ型細菌として、プロトカテク酸の産生が向上するような遺伝子改変株を使用してもよい（例えば、国際公開 WO2017/169399）。
　［脱炭酸酵素の導入］
　本開示において、宿主であるコリネ型細菌に導入される脱炭酸酵素は、プロトカテク酸に対する脱炭酸活性を有する酵素であることが好ましい。
　コリネ型細菌にプロトカテク酸に対する脱炭酸活性を有する酵素を導入する形態として、下記（１）～（３）の遺伝子のいずれかを導入することが挙げられる。
　（１）Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ｕｂｉＤ。
　（２）Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記（１）の遺伝子のオーソログ。
　（３）前記（１）又は（２）の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が７０％以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子。
　本開示において、上記（１）～（３）の遺伝子の宿主コリネ型細菌への導入にあたっては、一般的な遺伝子組換え技術（例えば、Michael R. Green & Joseph Sambrook, Molecular cloning, Coldspring Harbor Laboratory Pressに記載の方法）を用いて行うことができ、プラスミドベクターを用いた遺伝子導入、又は宿主コリネ型細菌染色体へ組み込む形態で実施することができる。
　本開示において、遺伝子の導入とは、一又は複数の実施形態において、該遺伝子が宿主内で発現可能に導入することをいう。
　例えば、宿主コリネ型細菌にｕｂｉＤＸ遺伝子を導入するには、適当なプロモーターを該遺伝子の5’-側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを3’-側下流に組み込むことがさらに好ましい。
　［Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ｕｂｉＤ］
　本開示において、Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ｕｂｉＤは、一又は複数の実施形態において、LGG_02656若しくはLGG_RS12695としてNCBIなどのデータベースに登録される。
　宿主に導入する脱炭酸酵素遺伝子は、前記Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤのオーソログであってもよい。Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤのオーソログとしては、Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属におけるオーソログが挙げられ、カテコールの生産性を向上する観点から、Lactobacillus属、Bacillus属及びEnterobacter属のオーソログが好ましく、Lactobacillus属及びBacillus属のオーソログがより好ましく、Lactobacillus属のオーソログがさらに好ましく、実施例で使用される遺伝子がさらにより好ましい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のLactobacillus属のオーソログとしては、LactobacilluspentosusのｕｂｉＤ遺伝子、Lactobacillus plantarumのｕｂｉＤ遺伝子、Lactobacillus pobuzihiiのｕｂｉＤ遺伝子、LactobacilluscompostiのｕｂｉＤ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のBacillus属のオーソログとしては、前記Bacillus megateriumのｕｂｉＤ遺伝子、Bacillus licheniformisのｕｂｉＤ遺伝子、BacillusatrophaeusのｕｂｉＤ遺伝子、Bacillus subtilis subsp. subtilisのｕｂｉＤ遺伝子、Bacillus subtilis subsp. spizizeniiのｕｂｉＤ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のEnterobacter属のオーソログとしては、EnterobacteraerogenesのｕｂｉＤ遺伝子、Enterobacter cloacaeのｕｂｉＤ遺伝子、Enterobacter sakazakiiのｕｂｉＤ遺伝子、EnterobacterhormaecheiのｕｂｉＤ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のEscherichia属のオーソログとしては、Escherichia coli WのｕｂｉＤ遺伝子、Escherichia fergusoniiのｕｂｉＤ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のPaenibacillus属のオーソログとしては、PaenibacilluspolymyxaのｕｂｉＤ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のCitrobacter属のオーソログとしては、Citrobacter koseriのｕｂｉＤ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のPantoea属のオーソログとしては、Pantoea ananatisのｕｂｉＤ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
　なお、本開示において「オーソログ遺伝子」とは、異なる生物（例えば、異なる種、異なる属）に存在する相同な機能を有するタンパクをコードする類縁遺伝子を意味する。
　宿主に導入する脱炭酸酵素遺伝子は、前記Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子又は上述したそのオーソログがコードする酵素のアミノ酸配列と同一性が７０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素であって、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子であってもよい。
　アミノ酸配列の同一性は、カテコールの生産性を向上する観点から、７０％以上であって、７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がさらに好ましい。
　本開示において、ｕｂｉＤ遺伝子は、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＤ遺伝子とともに該ｕｂｉＤ遺伝子と同じゲノムにあるｕｂｉＸ遺伝子も宿主コリネ型細菌に導入されることが好ましい。また、該ｕｂｉＤ遺伝子と同じゲノムにｕｂｉＨ遺伝子が存在する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＤ遺伝子及びｕｂｉＸ遺伝子とともにｕｂｉＨ遺伝子も導入されることが好ましい。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子とｕｂｉＸ遺伝子はこの順でオペロンを構成しており、このような場合、本開示においてｕｂｉＤＸ遺伝子と表記する。Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤＸ遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１の塩基配列が挙げられる。
　Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＤＸ遺伝子として導入することが好ましい。　また、Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子のオーソログを宿主コリネ型細菌に導入する場合も、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＤ遺伝子とともにｕｂｉＸ遺伝子も宿主コリネ型細菌に導入されることが好ましく、ゲノムにｕｂｉＨ遺伝子があればｕｂｉＤ遺伝子及びｕｂｉＸ遺伝子とともにｕｂｉＨ遺伝子も宿主コリネ型細菌に導入されることが好ましい。
　Lactobacillus pentosusのｕｂｉＸ遺伝子は、ｕｂｉＤ遺伝子とは別個にｕｂｉＨ遺伝子とオペロンを構成する（ｕｂｉＨＸ遺伝子）。Lactobacillus pentosusのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＤ遺伝子とともにｕｂｉＨＸ遺伝子を導入することが好ましい。Lactobacillus pentosusのｕｂｉＸＨ遺伝子及びｕｂｉＤ遺伝子の一又は複数の実施形態として、それぞれ、配列表の配列番号２及び３の塩基配列が挙げられる。
　Lactobacillus plantarumのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合も、Lactobacillus pentosusと同様に、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＤ遺伝子とともにｕｂｉＨＸ遺伝子を導入することが好ましい。Lactobacillus plantarumのｕｂｉＸＨ遺伝子及びｕｂｉＤ遺伝子の一又は複数の実施形態として、それぞれ、配列表の配列番号４及び５の塩基配列が挙げられる。
　Lactobacillus pobuzihii及びLactobacilluscompostiのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合も、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＤＸ遺伝子として導入することが好ましい。Lactobacillus pobuzihii及びLactobacilluscompostiのｕｂｉＤＸ遺伝子の一又は複数の実施形態として、それぞれ、配列表の配列番号６及び７の塩基配列が挙げられる。
　Bacillus megateriumのｕｂｉＤ遺伝子は、ｕｂｉＸ遺伝子、ｕｂｉＤ及びｕｂｉＨがこの順でオペロンを構成しており、このような場合、本開示においてｕｂｉＸＤＨ遺伝子と表記する。Bacillus megateriumのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus megateriumのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１０の塩基配列が挙げられる。
　Bacillus licheniformisのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus licheniformisのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１１の塩基配列が挙げられる。
　Bacillus atrophaeusのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus atrophaeusのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１２の塩基配列が挙げられる。
　Bacillus subtilis subsp. subtilisのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus subtilis subsp. subtilisのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１３の塩基配列が挙げられる。
　Bacillus subtilis subsp. spizizeniiのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus subtilis subsp. spizizeniiのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１４の塩基配列が挙げられる。
　Enterobacter aerogenesのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Enterobacter aerogenesのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１５の塩基配列が挙げられる。
　Enterobacter cloacaeのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Enterobacter cloacaeのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１６の塩基配列が挙げられる。
　Enterobacter sakazakiiのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Enterobacter sakazakiiのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１７の塩基配列が挙げられる。
　Enterobacter hormaecheiのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Enterobacter hormaecheiのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１８の塩基配列が挙げられる。
　Escherichia coli WのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Escherichia coli WのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号１９の塩基配列が挙げられる。
　Escherichia fergusoniiのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Escherichia fergusoniiのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号２０の塩基配列が挙げられる。
　Paenibacillus polymyxaのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Paenibacillus polymyxaのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号２１の塩基配列が挙げられる。
　Citrobacter koseriのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Citrobacter koseriのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号２２の塩基配列が挙げられる。
　Pantoea ananatisのｕｂｉＤ遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸＤＨ遺伝子として導入することが好ましい。Pantoea ananatisのｕｂｉＸＤＨ遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号２３の塩基配列が挙げられる。
　［形質転換体］
　本開示は、一態様において、宿主コリネ型細菌に上記（１）－（３）のいずれかの遺伝子が導入され、かつ、宿主ゲノムのカテコール１,２-ジオキシゲナーゼ（ｃａｔＡ）及びプロトカテク酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃａＨＧ）の２つの酵素が機能低下又は機能欠損している形質転換体に関する。
　本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、カテコールを効率よく産生できる。
　本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、カテコールの生産性を向上する観点から、ｕｂｉＸ遺伝子及び／又はｕｂｉＨ遺伝子が導入されていることが好ましい。
　本開示に係る形質転換体は、カテコールの産生又はその効率化のために、さらなる遺伝子が導入されてもよく、遺伝子の欠失及び／又は変異が導入されもよい。
　カテコール産生の効率化の一又は複数の実施形態として、プロトカテク酸の産生を向上する遺伝子の導入や破壊が挙げられる。プロトカテク酸の産生を向上する遺伝子の導入の一例として、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（例えば、aroG）、及び／又は、３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（例えば、qusB）の導入が挙げられる。
　本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態として、カテコールの産生に使用できる。また、本開示に係る形質転換体は、その他の一又は複数の実施形態として、カテコールを中間体とする有機化合物の産生に使用できる。
　［カテコールの製造方法］
　本開示に係る形質転換体は、菌体増殖を伴わない反応液中で、糖類を原料として、カテコールを高効率で生産できる。
　よって、本開示は、その他の一態様において、本開示に係るコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含むカテコールの製造方法に関する。
　本発明に係るカテコールの製造方法においては、まず、上記の本開示に係る形質転換体を好気条件下で増殖培養する。
　本開示に係る形質転換体の培養は、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。培養には、炭素源として、例えばグルコース又は廃糖蜜等を、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム又は尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウム又は硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸又はビオチンもしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。
　培養は、通常、通気攪拌又は振盪等の好気的条件下、約20℃～約60℃、好ましくは、約25℃～約35℃の温度で行うことが出来る。培養時のpHは例えば5～10付近、好ましくは7～8付近の範囲であり、培養中のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養開始時の炭素源濃度は、約1～20%(W/V)、好ましくは約2～5%(W/V)である。また、培養期間は通常1～7日間程度である。
　ついで、本開示に係る形質転換体の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。
　回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものが挙げられ、例えば、菌体をアクリルアミド又はカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。
　上記の如くして得られる培養物から回収分離された本開示に係る形質転換体の培養菌体又はその菌体処理物によるカテコールの生成反応は、菌体増殖を伴わない反応液中であれば好気条件及び還元条件のいずれの生成方式を用いてもよい。カテコール生成方式は、回分式、連続式いずれの生成方式も可能である。
　本開示において、増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、好気条件の反応では微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、窒素源などの１種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を回避又は抑制できる。
　また、還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖しないため反応液の組成は規定されない。還元条件における反応液の酸化還元電位は、約-200mV～-500mVが好ましく、約-150mV～-500mVがより好ましい。反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY　JAMES社製、ORPElectrodes）を用いて測定できる。
　本開示においては、反応液に菌体又はその処理物を添加した直後からカテコールを採取するまで、還元条件を維持していることが好ましいが、少なくともカテコールを採取する時点で反応液が還元状態であればよい。反応時間の約50％以上、より好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約90%以上の時間、反応液が還元条件下に保たれていることが望ましい。なかでも、反応時間の約50%以上、より好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約90%以上の時間、反応液の酸化還元電位が約-200mV～-500mV程度に保たれていることがより望ましい。
　反応液には、カテコール生成の原料となる有機炭素源（例えば、糖類等）が含まれている。有機炭素源としては、本開示に係る形質転換体が生化学反応に利用できる物質が挙げられる。
　具体的には、糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖類、セロビオース、ショ糖、ラクトースもしくはマルトースなどの二糖類、又はデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。なかでも、グルコースが好ましい。
　よって、本開示は、一態様において、本開示に係るコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含むカテコールの製造方法に関する。
　最後に、上述のようにして反応培地で生成したカテコールを採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることが出来る。そのような公知の方法として、カテコール生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法又は電気透析法等があり、その分離精製採取法は適宜定めることが出来る。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、以下に関しうる；
　[1] 宿主のコリネ型細菌に、
　（１）Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ｕｂｉＤ、
　（２）Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記（１）の遺伝子のオーソログ、及び
　（３）前記（１）又は（２）の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が７０％以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子
からなる群から選択される遺伝子が導入された形質転換体であって、
　宿主コリネ型細菌のカテコール１，２－ジオキシゲナーゼ遺伝子ｃａｔＡ、及び、プロトカテク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｐｃａＨＧに変異が導入され、前記２遺伝子がコードする酵素が機能低下又は機能欠損している、コリネ型細菌の形質転換体。
　[2] カテコール生産能を有する、[1]に記載の形質転換体。
　[3] さらに、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び、３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された、[1]又は[2]に記載の形質転換体。
　[4] 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム　グルタミカムである、[1]から[3]のいずれかに記載の形質転換体。
　[5] 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム　グルタミカムR(FERMP-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である、[1]から[4]のいずれかに記載の形質転換体。
　[6] コリネバクテリウム　グルタミカムＣＡＴ２１株(受託番号：NITE BP-02689)形質転換体。
　[7] [1]から[6]のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含む、カテコールの製造方法。
　[8] [1]から[6]のいずれかに記載の形質転換体を用いて、反応液中で、グルコース、フルクトース、セロビオース、キシロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、デキストリン、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース及び可溶性澱粉からなる群より選ばれる糖類からカテコールへ変換し、該反応液よりカテコールを回収することを含む、[7]に記載のカテコールの製造方法。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　［実施例１］
　カテコール生産株の構築
　(1) 染色体DNAの調製・入手
　Corynebacterium glutamicum R(FERM P-18976)、Lactobacillus rhamnosus NBRC 3425、Lactobacilluspentosus JCM 1558、Lactobacillus plantarum NBRC 3070、Lactobacillus pobuzihii JCM 18084、Lactobacilluscomposti JCM 14202、Lactobacillus hokkaidonensis JCM18461、Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157、Bacillus megaterium JCM 2506、Bacilluslicheniformis JCM 2505、Bacillus atrophaeus JCM 9070、Bacillus subtilis subsp. subtilis NBRC 14144、Bacillus subtilis subsp. spizizenii NBRC 101239、Enterobacter aerogenes NBRC 13534、Enterobactercloacae NBRC 13535、Enterobacter hormaechei ATCC 49162、Escherichia coli W NBRC 13500、Escherichiafergusonii NBRC 102419、Paenibacillus polymyxa NBRC15309、Pantoea ananatis LMG 20103の染色体DNAは、菌株入手機関の情報に従って培養した後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて調製した。Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894D-5、Citrobacterkoseri ATCC BAA-895D-5の染色体DNAは、ATCCより入手した。
　(2) カテコール生産関連遺伝子発現プラスミドの構築
　目的の酵素遺伝子を単離するために用いたプライマー配列を表1に示す。PCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　得られたDNA断片を、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクター（pCRB209[国際公開 WO2012/033112]、pCRB210[国際公開 WO2012/033112]）に導入した。尚、Lactobacillus pentosusおよびLactobacillusplantarumのｕｂｉＤ遺伝子とｕｂｉＸＨ遺伝子は染色体上で異なる位置に配置されているため、別々にクローニングを行った後、同一プラスミドに乗せ換えた。
　導入したクローニングベクターと得られたプラスミド名を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　(3) Corynebacterium glutamicum R株染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築
　Corynebacterium glutamicum R株の染色体遺伝子をマーカーレスで破壊するために必要なDNA領域をPCR法により増幅した。各PCR断片はオーバーラップ領域により連結可能である。得られたDNA断片をマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドpCRA725[J. Mol.Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）]に導入した。得られた染色体遺伝子破壊用プラスミドを表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　(4) 染色体遺伝子組換えによるカテコール生産株の構築
　マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。プラスミドpCRA725に導入した染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
　上記方法により、上述したカテコール生産関連遺伝子染色体導入用プラスミド及び染色体遺伝子破壊用プラスミドを用いてPCA生産関連遺伝子染色体導入株を構築した。宿主菌株としてプロトカテク酸生産性コリネ型細菌Corynebacterium glutamicum PCA3株[国際公開 WO2017/169399]を使用した。また、pcaHG遺伝子破壊用プラスミドpCRG3[国際公開 WO2017/169399]、qsuB遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB295[国際公開 WO2017/169399]及びaroG(S180F)遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB285[国際公開 WO2017/169399]も使用した。尚、本染色体遺伝子組換えの概要は、表4および表5にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　(5) カテコール生産遺伝子発現プラスミド導入株の構築
　上述の染色体遺伝子組換え株にプロトカテク酸脱炭酸酵素を導入することによりカテコール生産株を構築した。また、対照実験用としてpCRB22（Appl Microbiol Biotechnol. 2015Jun;99(11):4679-89）を使用した。尚、本生産株の概要は、表6にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）CAT21は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに国際寄託した（ブダペスト条約に基づく国際寄託の受託日：2018年4月17日、受託番号：NITE BP-02689）。
　［実施例２］
　カテコール生産試験（試験管内、10mLスケール）
　(プロトカテク酸分解経路破壊、カテコール分解経路破壊の組み合わせ)
　コリネバクテリウム グルタミカムR株をベースとして構築した、カテコール生産株である、CAT91株（表5及び表6参照）を用いて、試験管を用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　CAT91株を終濃度50μg/mL カナマイシンと4%のグルコースを含んだA寒天培地[(NH2)2CO2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・7H2O0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O、0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7g、寒天 15gを蒸留水1Lに溶解]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖したCAT91株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだA液体培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O、0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した株を、終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだA液体培地10mlに初期菌体濃度OD610＝0.5となるように懸濁し、200mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離(4℃,15,000×g、5分)し、培養上清液を得た。培養上清液中の代謝物質濃度は、高速液体クロマトグラフィーシステム(Prominence HPLC装置(島津製作所製)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、移動相に10%メタノール、0.1%リン酸を用いて分離)により分析した。その結果、同株は48時間後、0.1mMのカテコールを生産した。
　［実施例３］
　カテコール生産試験（試験管内、10mLスケール）
　(プロトカテク酸分解経路破壊、カテコール分解経路破壊、DAHP合成酵素強化、プロトカテク酸合成酵素強化の組み合わせ)
　CAT91株をベースとして構築した、カテコール生産株である、CAT92株（表5及び表6参照）を用いて、試験管を用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　CAT92株を終濃度50μg/mL カナマイシンと4%のグルコースを含んだA寒天培地[(NH2)2CO2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・7H2O0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7g、寒天 15gを蒸留水1Lに溶解]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖したCAT92株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだA液体培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した株を、終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだA液体培地10mlに初期菌体濃度OD610＝0.5となるように懸濁し、200mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離(4℃,15,000×g、5分)し、培養上清液を得た。培養上清液中の代謝物質濃度は、高速液体クロマトグラフィーシステム(Prominence HPLC装置(島津製作所製)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、移動相に10%メタノール、0.1%リン酸を用いて分離) により分析した。その結果、同株は24時間後、18.4mMのカテコールを生産した。
　［実施例４］
　カテコール生産試験（試験管内、10mLスケール）
　（様々な生物由来プロトカテク酸脱炭酸活性を持つ酵素をコードする遺伝子のカテコール生産に対する影響）
　Corynebacterium glutamicum形質転換体によるカテコール生産におけるプロトカテク酸脱炭酸活性を持つ酵素をコードする遺伝子導入の効果を調べるため、プロトカテク酸生産株Corynebacterium glutamicum PCA3[国際公開WO/2017/169399]をベースとしてカテコール分解酵素をコードする遺伝子を破壊した株LHglc1367を構築した（表５）。この株に各遺伝子を組み込んだプラスミドを導入し、脱炭酸酵素導入株CAT01-CAT47を得た（表６)。それぞれのカテコール生産性を比較した。各株を終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖した各株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した各株を、終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに初期菌体濃度OD610=0.5となるように植菌し、200mgのCaCO3を加え33℃にて24時間、好気的に振とう培養を行った。24時間後の培養液を遠心分離し（4℃,15000×g、5分）、得られた上清液について前記高速液体クロマトグラフィーシステムによりカテコールの定量分析を行った。結果を表7に示す。
　なお、表7におけるアミノ酸配列の同一性は、LactobacillusrhamnosusのｕｂｉＤ遺伝子がコードするアミノ酸配列と、その他のｕｂｉＤ遺伝子がコードするアミノ酸配列との比較の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７の結果から、Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤＸ及びそのオーソログを導入することによりカテコールの生成量は増大することが示された。そのなかでも、Lactobacillus rhamnosusのｕｂｉＤＸ及びそれと相同性が高いもの（例えば、CAT21株、CAT41株、CAT24株）を用いた場合、カテコールの生産量がより一層向上することが示された。
　［実施例５］
　カテコール生産試験（ジャーファーメンター、400mLスケール）
　（生産至適pHの検討）
　CAT21株（表5～表7参照）を用いて、ジャーファーメンターを用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。
　CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,3000×g,10分)により集菌し、得られた菌体を、1000ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、終濃度50μg/mLカナマイシンと8%のグルコース、及び消泡剤(アデカノール L126)3g/Lを含有する培養液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 25μl、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]400mlにOD610=0.2となるように懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターにより33℃、5.0Nアンモニア水の添加によるpH維持制御、通気量0.4L/min(air、1vvm)、溶存酸素濃度(DO)10%（大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として）の条件において24時間通気撹拌培養を行った。培養上清液中の代謝物質濃度は、前記の高速液体クロマトグラフィーシステムにより分析した。その結果を表8に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　CAT21株は、ｐH7.0を維持して培養した場合、培養開始24時間後に、60mMのカテコールを生成し、検討したpHの中でもっとも高い濃度を示した。また、pH8.0を維持して培養した場合はカテコールの生産濃度は24時間後の時点で0mMだった。これらの結果から、同株を用いてカテコール生産させる場合はpHを7.0付近にしたときに最も高い生産性を示すことが分かった。
　［実施例６］
　カテコール生産試験（ジャーファーメンター、400mLスケール）
　（増殖非依存型の生産試験)
　CAT21株（表５～表７参照）を用いて、ジャーファーメンターを用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。
　CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,3000×g,10分)により集菌し、得られた菌体を、1000ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、終濃度50μg/mLカナマイシンと8%のグルコース、及び消泡剤(アデカノール L126)3g/Lを含有する培養液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 25μl、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]400mlにOD610=0.2となるように懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターにより33℃、pH7.0(5.0Nアンモニア水の添加により制御)、通気量0.4L/min(air、1vvm)、溶存酸素濃度(DO)5%（大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として）の条件において18時間通気撹拌培養を行った。
　上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,5000×g,10分)により集菌し、菌体を0.9%塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、100g湿菌体/L(培地体積あたり湿菌体重量として5%)となるように、10%グルコースを含む250ml反応液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.01%(w/v) thiaminesolution 2mlを蒸留水1Lに溶解]に懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターを用いて33℃、pH7.0(5.0N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.25L/min(air、1vvm)、DO5%の条件においてカテコール生成反応を行った。培養上清液中の代謝物質濃度は、前記の高速液体クロマトグラフィーシステムにより分析した。その結果を図1に示す。
　図1に示すとおり、CAT21株は、カテコール生成反応開始27.5時間後に、66mM(7.25g/l)のカテコールを生成した。この結果から、同株は、無機塩最少培地を用いる菌体増殖を伴わない反応プロセスにおいて、非常に高いカテコール生産性を有することが示された。同株のカテコール生産性は、糖からの発酵法による生産性としては、これまでに報告されている生産性の高いEscherichia coli組換え株の生産性38mM(4.2g/L) 36時間(非特許文献3)および41mM(4.5g/L)84時間（非特許文献2）を大幅に上回った。
　［実施例７］
　カテコール生産試験（ジャーファーメンター）
　（樹脂吸着の利用)
　CAT21株（表5～表7参照）を用いて、ジャーファーメンターを用いた好気バッチ反応と樹脂吸着を組み合わせたカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。
　CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,3000×g,10分)により集菌し、得られた菌体を、1000ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、終濃度50μg/mLカナマイシンと8%のグルコース、及び消泡剤(アデカノール L126)3g/Lを含有する培養液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 25μl、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]400mlにOD610=0.2となるように懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターにより33℃、pH7.0(5.0Nアンモニア水の添加により制御)、通気量0.4L/min(air、1vvm)、溶存酸素濃度(DO)5%（大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として）の条件において18時間通気撹拌培養を行った。
　上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,5000×g,10分)により集菌し、菌体を0.9%塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、100g 湿菌体/L(培地体積あたり湿菌体重量として5%)となるように、10%グルコースを含む300ml反応液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.01%(w/v)thiaminesolution 2mlを蒸留水1Lに溶解]に懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターを用いて33℃、pH7.0(5.0Nアンモニア水の添加により制御)、通気量0.3L/min(air、1vvm)、DO5%の条件においてカテコール生成反応を行った。その際ジャーファーメンターからあらかじめ反応液を満たした流路とペリスタポンプを接続し、培養液の循環を同時に開始した。流路の途中にクロスフロー型ろ過装置(マイクローザペンシル型モジュール)と新たなペリスタポンプを配置し、菌体を含まないろ過液の抜き取りを行った。このろ過液を60gの吸着樹脂(SP850)を詰めたカラムに通し、フロースルー液はジャーファーメンターに戻した。48時間後の実験を終了し、流路に含まれる反応液を全てジャーファーメンターに戻し容量を測定した。培養上清液中の代謝物質濃度は、前記の高速液体クロマトグラフィーシステムにより分析した。樹脂に吸着した代謝物質は水、次いで100%エタノールを通液することで抽出し、水抽出液はそのままで、エタノール抽出液はエバポレーターで乾固させ、同体積の水に溶解した後に前記の高速液体クロマトグラフィーシステムにより分析した。その結果を表9に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　合計のカテコール物質量を反応液の体積で割ることでカテコール生産濃度とした。その結果CAT21株は48時間で135mM(14.9g/L)のカテコールを生産した。その際の消費グルコースに対する収率は18%(モル比)だった。
　糖からの発酵法によるカテコール生産で吸着樹脂を併用した例としては、Escherichia coli組換え株を用いた77mM(8.5g/L)、収率7% 36時間(非特許文献3)が報告されているが、CAT21株のカテコール生産性は濃度、収率ともにこれを大幅に上回った。
　［参考例１］
　コリネ型細菌が他の微生物より高いカテコール耐性を示すことの検証
　コリネ型細菌Corynebacterium glutamicum,大腸菌Escherichia coli,酵母Saccharomyces cerevisiae,シュードモナスPseudomonas putida, ロドコッカスRhodococcus erythropolisについて、寒天培地上でのクロスストリークアッセイによりカテコールへの耐性を比較した。
　Corynebacterium glutamicum R株およびATCC 13032株を4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃で15時間暗所に静置した。上記のプレート上で増殖したコリネバクテリウムグルタミカムを2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて13時間、好気的に振とう培養を行った。
Escherichia coli K-12 MG1655株をLB寒天培地[1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム、及び1.5%寒天]に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したEscherichia coliをLB液体培地[1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、及び0.5%塩化ナトリウム]に植菌し、37℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
　Pseudomonas putida ATCC 700801株を前記LB寒天培地に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したPseudomonas putidaを前記LB液体培地に植菌し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
　Saccharomyces cerevisiae NBRC2376株をYEPD寒天培地[2%ポリペプトン、1%酵母エキス、2%グルコース、及び1.5%寒天]に塗布し、30℃、20時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したSaccharomyces cerevisiaeをYEPD液体培地[2%ポリペプトン、1%酵母エキス、及び2%グルコース]に植菌し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
　Rhodococcus erythropolis ATCC 27854株を前記LB寒天培地に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したRhodococcus erythropolisを前記LB液体培地に植菌し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
　以上のように前培養を行った各株を4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に線状に均一それぞれ塗布し、これと交差するようにプレートの中心に25%のカテコールを含ませたろ紙を上から置いた。30℃または26℃で24時間暗所に静置した後、ろ紙からの増殖阻害範囲を比較することで耐性の比較を行った。その結果を図2に示す。
　図2に示すとおり、コリネ型細菌は他のどの菌よりも増殖阻止域が狭く、耐性が比較的高いことが示された。また、コリネ型細菌のR株とATCC 13032株では明確な違いはなかった。
　本開示は、例えば、カテコールの製造に有用である。

Claims (7)

  1. 　宿主のコリネ型細菌に、
    　（１）Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ｕｂｉＤ、
    　（２）Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記（１）の遺伝子のオーソログ、及び
    　（３）前記（１）又は（２）の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が７０％以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子
    からなる群から選択される遺伝子が導入された形質転換体であって、
    　宿主コリネ型細菌のカテコール１，２－ジオキシゲナーゼ遺伝子ｃａｔＡ、及び、プロトカテク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｐｃａＨＧに変異が導入され、前記２遺伝子がコードする酵素が機能低下又は機能欠損している、コリネ型細菌の形質転換体。
  2. 　カテコール生産能を有する、請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　さらに、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び、３－デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された、請求項１又は請求項２に記載の形質転換体。
  4. 　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム　グルタミカムR(FERM P-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の形質転換体。
  5. 　コリネバクテリウム　グルタミカムＣＡＴ２１株(受託番号：NITEBP-02689)形質転換体。
  6. 　請求項１から請求項５のいずれかに記載の形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含む、カテコールの製造方法。
  7. 　請求項１から請求項５のいずれかに記載の形質転換体を用いて、反応液中で、グルコース、フルクトース、セロビオース、キシロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、デキストリン、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース及び可溶性澱粉からなる群より選ばれる糖類からカテコールへ変換し、該反応液よりカテコールを回収することを含む、請求項６に記載のカテコールの製造方法。
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