WO2019203497A1 - 고갈성 항 cd4 단일클론항체를 포함하는 항암 t 세포치료제 보조용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

고갈성 항 cd4 단일클론항체를 포함하는 항암 t 세포치료제 보조용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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김선희
권병세
김영호
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Definitions

  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer or immunodeficiency comprising the step of inducing a temporary immunodeficiency in a cancer patient to inducing persistent immunodeficiency using a depleting anti-CD4 monoclonal antibody. It's about how to last.
  • the present invention relates to a composition for sustaining immunodeficiency or a composition for adjuvant anticancer T cells comprising a depleting anti-CD4 monoclonal antibody.
  • the invention also provides a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of cancer, including depleting anti-CD4 monoclonal antibodies, cancer antigen specific CD8 T cells, immunodeficiency inducing agents and IL-2 It is about.
  • T cell therapy More than 20 years after the concept of T cell therapy was first proposed, a method of separating and culturing TIL (tumor-infiltrating lymphocytes) from human cancer tissues was established. Thereafter, cancer antigen-specific CTLs (cytotoxic T lymphocytes) are isolated and used as T cell therapeutics.
  • TIL tumor-infiltrating lymphocytes
  • autologous antigens are proteins expressed higher in cancer cells than in normal cells, and are often essential for cancer cell growth and survival.
  • autologous cancers that are overexpressed in cancer cells such as human telomere reverse transcriptase (hTERT), Wilm's tumor antigen 1 (WT-1), NY-ESO-1, and Melanoma-associated antigen (MAGE) Antigens have been used as targets for the development of anticancer immunotherapy in a variety of ways.
  • hTERT human telomere reverse transcriptase
  • WT-1 Wilm's tumor antigen 1
  • NY-ESO-1 NY-ESO-1
  • MAGE Melanoma-associated antigen
  • the cancer cure ratio of cancer patients was extremely low by T cells targeting autologous cancer antigens, whereas cancer antigen specific T cell therapeutics showed a high cure rate.
  • T cells that recognize autoantigens with high affinity to remove the autoimmune disease are removed through an immunotolerance process. Therefore, T cells that recognize autologous antigens present in the body have a low affinity TCR (T cell receptor), so the anticancer effect is also lowered. This means that in order to cure cancer recurring in response to standard treatment, it is necessary to induce and increase the response of T cells to cancer antigens.
  • TCR T cell receptor
  • Korean Patent No. 10-1503341 provides a method for selectively separating CD8 + T cells specific for autologous cancer antigens present in an extremely low rate in the body and proliferating them in large quantities.
  • the present inventors studied whether the anticancer effect of T cells administered by extending the immunodeficiency phenomenon used in the use of T cell therapeutics can be enhanced, and through periodic administration of depletign anti-CD4 monoclonal antibody By continuously inducing partial lymphocyte depletion (lymphodepletion), it was confirmed that the anticancer effect of cell therapy using cancer antigen-specific T cells was maximized, and the present invention was completed.
  • the present inventors have made diligent efforts to provide a method for enhancing the anticancer effect of anticancer T cell therapy by maintaining the immunodeficiency state of cancer patients.
  • the depleted anti CD4 monoclonal antibody is used, the immunodeficiency state is sufficiently maintained. It was confirmed that the present invention was completed.
  • It provides a method for preventing or treating cancer, including.
  • Another object of the invention is i) inducing a transient immunodeficiency in cancer patients.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for sustaining immunodeficiency or a composition for adjuvant anticancer T cells comprising a depleting anti-CD4 monoclonal antibody.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical for use in the prevention or treatment of cancer, including depleting anti-CD4 monoclonal antibody, cancer antigen specific CD8 T cells, immunodeficiency inducing agents and IL-2 To provide a composition.
  • the present invention comprises the steps of: i) inducing a transient immunodeficiency in cancer patients;
  • the temporary immunodeficiency may be of radiation to anticancer drug administration.
  • the anticancer agent may be at least one selected from the group consisting of cyclophophamide and fludarabine.
  • the cancer antigen is hTERT (human telomere reverse transcriptase), WT-1 (Wilm's tumor antigen 1), NY-ESO-1, MAGE (Melanoma-associated antigen), CEA (Carcinoembryonic antigen ), CA-125, MUC-1 and MART-1 (Melanoma antigen recognized by T cells 1) may be any one or more autologous antigen selected from the group consisting of.
  • the persistent immunodeficiency may be composed of a depleting anti-CD4 monoclonal antibody.
  • the depleted anti-CD4 monoclonal antibody may be administered two or more times at intervals of about 5 days to 8 days.
  • the cancer of step i) may be any one selected from the group consisting of lung cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, brain cancer and sarcoma.
  • the present invention also provides a method of treating cancer, comprising the steps of: i) inducing a transient immunodeficiency in a cancer patient; And
  • It can provide a method for sustaining immunodeficiency comprising a.
  • the cancer of step i) may be any one selected from the group consisting of lung cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, brain cancer and sarcoma.
  • the depleted anti-CD4 monoclonal antibody may be administered two or more times at intervals of about 5 days to 8 days.
  • the present invention may also provide a composition for sustaining immunodeficiency comprising a depleting anti-CD4 monoclonal antibody.
  • the composition may be administered two or more times at intervals of about 5 to 8 days.
  • the duration of immunodeficiency may be about 10 days or more after treating the composition.
  • the present invention can also provide a composition for adjuvant anticancer T cell therapy comprising a depleting anti-CD4 monoclonal antibody.
  • the composition may be administered two or more times at intervals of about 5 to 8 days.
  • the cancer may be any one selected from the group consisting of lung cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, brain cancer and sarcoma.
  • the invention also provides pharmaceutical compositions for use in the prevention or treatment of cancer, including depleting anti-CD4 monoclonal antibodies, cancer antigen specific CD8 T cells, immunodeficiency inducing agents and IL-2. Can provide.
  • the anticancer agent may be at least one selected from the group consisting of cyclophophamide and fludarabine.
  • the lung cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, brain cancer and sarcoma may be any one selected from the group consisting of.
  • depleted anti CD4 monoclonal antibody of the present invention means a monoclonal antibody that eliminates or inhibits CD4 cells in lymphocytes.
  • anticancer T cell therapeutic agent composition of the present invention means a composition that improves, improves or enhances the anticancer effect of the anticancer T cell therapeutic agent.
  • partial immunodeficiency refers to the deficiency by eliminating or inhibiting only some immune cells among various immune cells.
  • cancer can be prevented by maximizing the anticancer effect of the cancer antigen-specific anticancer T cell therapeutic agent by maintaining an immunodeficiency state. Or for treating or sustaining an immunodeficiency state in cancer patients.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising the steps of: i) inducing a transient immunodeficiency in a cancer patient;
  • It provides a method for preventing or treating cancer comprising a.
  • the term 'temporary immunodeficiency' refers to temporarily lowering immunity of cancer patients through irradiation or anticancer agent administration, which may be an immune deficiency state for about 7 to 14 days.
  • the irradiation may be, but is not limited to, total body irradiation in the range of commonly available doses.
  • the anticancer agent may be included at a concentration of preferably 100 to 300 mg / Kg, more preferably at a concentration of 150 to 250 mg / Kg. If the anticancer agent is included at a concentration exceeding 300 mg / Kg, immunodeficiency or anticancer effect may be increased, but it may cause fatal effects in the body and cause side effects such as death.
  • the anticancer agent is preferably at least one selected from the group consisting of cyclophophamide and fludarabine, but may be used without limitation as long as it is an anticancer agent used for inducing immunodeficiency before T cell treatment.
  • the cancer antigen is encoded in the MAGE gene family, or is caused by gene displacement or mutation, cancer antigen, cancer antigen overexpressed cancer cell, carcinogenic virus antigen, tumor fetal antigen, prostate specific antigen, autologous cancer antigen to differentiation antigen Etc. means all cancer antigens.
  • an autocancerous antigen which may include human telomere reverse transcriptase (hTERT), Wil's tumor antigen 1 (WT-1), NY-ESO-1, Melanoma-associated antigen (MAGE), Carcinoembryonic antigen (CEA), It is preferable that at least one autocancerous antigen selected from the group consisting of CA-125, MUC-1 and MART-1 (Melanoma antigen recognized by T cells 1).
  • the cancer antigen specific CD8 T cells are preferably 1 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ l to 1 ⁇ 10 8
  • the cells may be administered at a concentration of 500 ⁇ l, but more preferably, may be administered at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 500 ⁇ l to 1 ⁇ 10 7 cells / 500 ⁇ l.
  • the IL-2 has an effect of proliferating a large amount of CD8 T cells and may be administered at a concentration of 5,000 to 50,000 IU, more preferably at a concentration of 7,000 to 20,000 IU.
  • the term 'continuous immunodeficiency' may mean maintaining the immunodeficiency state for a long time as compared to the temporary immunodeficiency, so that the immunodeficiency state may be maintained for about 10 days or more. More preferably, it is preferably about 15 days or more and 60 days or less, and most preferably about 20 days or more and 45 days or less.
  • the persistent immunodeficiency of the present invention preferably consists of a depleting anti-CD4 monoclonal antibody that can bind to CD4 T cells and induce its partial immunodeficiency. It is preferred to be administered two or more times at intervals of about 5 to 8 days, more preferably about 4 to 8 times at intervals of about 6 to 7 days, most preferably 5 to 6 times It is preferred to be administered. If administered once or less, side effects may occur that the percentage of CD8 T cells in the body decreases more rapidly than before administration of the depleted anti-CD4 monoclonal antibody. When administered at intervals of less than 4 days or more than 8 days, the immunodeficiency effect cannot be maintained stably and the efficiency is reduced.
  • the cancer is preferably any one selected from the group consisting of lung cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, brain cancer and sarcoma, but may be applied without limitation if it corresponds to solid cancer.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising the steps of: i) inducing transient immunodeficiency in cancer patients; And
  • the cancer and transient immunodeficiency have the same meaning as used in the cancer prevention or treatment method, and the description is replaced by the description.
  • the present invention also provides a composition for sustaining immunodeficiency to a composition for adjuvant anticancer T cells comprising a depleting anti-CD4 monoclonal antibody.
  • the duration of immunodeficiency may be maintained for at least about 10 days after the composition is treated.
  • it is preferably about 15 days or more and 60 days or less, and more preferably about 20 days or more and 45 days or less.
  • the immunodeficiency sustaining composition to the anticancer T cell therapeutic adjuvant composition is preferably administered two or more times at intervals of about 5 days to 8 days, more preferably about 4 to 8 times at intervals of about 6 to 7 days. It is preferably administered, most preferably from 5 to 6 times. If administered once or less, side effects may occur where the percentage of CD8 T cells in the body decreases more rapidly than before administration of the composition. When administered at intervals of less than 4 days or more than 8 days, the effect cannot be maintained stably and the efficiency is reduced.
  • the anticancer T cell therapeutic composition comprising the depleting anti-CD4 monoclonal antibody of the present invention can maximize the anticancer effect of the anticancer T cell therapy by maintaining the immunodeficiency phenomenon, In particular, the effect is more excellent when administered twice or more at intervals of about 5 to 8 days for cancer antigen specific T cell therapy.
  • the invention also provides pharmaceutical compositions for use in the prevention or treatment of cancer, including depleting anti-CD4 monoclonal antibodies, cancer antigen specific CD8 T cells, immunodeficiency inducing agents and IL-2. to provide.
  • the immunodeficiency inducing agent is used to induce transient immunodeficiency, and preferably at least one selected from the group consisting of cyclophophamide and fludarabine, but inducing immunodeficiency before T cell treatment.
  • Any anticancer agent used for the purpose can be used without limitation. Preferably it may be included in a concentration of 100 to 300 mg / Kg, more preferably may be included in a concentration of 150 to 250 mg / Kg. If the anticancer agent is included at a concentration exceeding 300 mg / Kg, immunodeficiency or anticancer effect may be increased, but it may cause fatal effects in the body and cause side effects such as death.
  • the IL-2 has an effect of proliferating a large amount of CD8 T cells and may be included at a concentration of 5,000 to 50,000 IU, more preferably at a concentration of 7,000 to 20,000 IU.
  • the depleted anti-CD4 monoclonal antibodies of the present invention bind to CD4 T cells and induce partial immunodeficiency thereof.
  • partial immunodeficiency may be maintained for about 5 to 7 days.
  • the cancer antigen of the present invention is hTERT (human telomere reverse transcriptase), WT-1 (Wilm's tumor antigen 1), NY-ESO-1, MAGE (Melanoma-associated antigen), CEA (Carcinoembryonic antigen), CA-125, MUC It is preferred that any one or more autologous antigens selected from the group consisting of -1 and MART-1 (Melanoma antigen recognized by T cells 1), but may be applied without limitation as long as the mutant proteins associated with cancer antigens.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention is preferably administered two or more times at intervals of about 5 to 8 days, and more preferably about 4 to 8 times at intervals of about 6 to 7 days. It is preferred that it is most preferably administered 5 to 6 times. If administered once or less, side effects may occur where the percentage of CD8 T cells in the body decreases more rapidly than before administration of the composition. When administered at intervals of less than 4 days or more than 8 days, the immunodeficiency effect cannot be maintained stably and the efficiency is reduced.
  • the immunodeficiency inducing agent of the present invention is preferably an anticancer agent, but is not limited thereto. It is used to induce transient immunodeficiency, and may preferably be included at a concentration of 100 to 300 mg / Kg, more preferably at a concentration of 150 to 250 mg / Kg. If the anticancer agent is included at a concentration exceeding 300 mg / Kg, immunodeficiency or anticancer effect may be increased, but it may cause fatal effects in the body and cause side effects such as death.
  • the anticancer agent of the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of cyclophophamide and fludarabine, but may be used without limitation as long as it is an anticancer agent used for the purpose of inducing immunodeficiency before T cell treatment. It is possible.
  • the cancer is preferably any one selected from the group consisting of lung cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, liver cancer, prostate cancer, uterine cancer, brain cancer and sarcoma, but may be applied without limitation if it corresponds to solid cancer.
  • the depleting anti-CD4 monoclonal antibody of the present invention when used for anticancer treatment, the anticancer effect of cancer antigen-specific anticancer T cell therapeutics can be maximized by maintaining the immunodeficiency state of cancer patients. It is so effective.
  • the depleted anti CD4 monoclonal antibody or a composition comprising the same when administered two or more times at intervals of 5 to 8 days, the effect of maintaining an immunodeficiency state is more excellent.
  • Figure 1a shows that the treatment of Pmel-1 specific CD8 T cells (aPmel-1) in mice lacking T cells and B cells, the anticancer effect of aPmel-1 when adding systemic radioactivity and IL-2 administration Increase in size of the cancer cells.
  • 1B shows mice in each group at 18 and 90 days after treatment with the drug and the like.
  • FIG. 2A shows that cancer cell growth is slowed down by increasing the concentration of cyclophosphamide (CTX) and further administration of aPmel-1 and IL-2.
  • CX cyclophosphamide
  • Figure 2b shows that the survival rate of the rats increases due to the increase in the concentration of the cyclophosphamide (cycloxamide, CTX) and the additional administration of aPmel-1 and IL-2.
  • cyclophosphamide cycloxamide, CTX
  • Figure 2c shows the change in the number of cells of the inguinal lymph nodes according to the concentration of cyclophosphamide (cycloxamide, CTX).
  • Figure 2d shows the change in the number of cells of the spleen according to the concentration of the cyclophosphamide (cyclophosphamide, CTX).
  • Figure 3a shows the process of maintaining an immunodeficiency state for enhancing the anticancer effect of aPmel-1 using a depleting anti-CD4 monoclonal antibody (dCD4).
  • Figure 3b shows that the addition of a depleted anti-CD4 monoclonal antibody in the treatment of aPmel-1 increases the anticancer effect of aPmel-1 to further slow the growth of cancer cells.
  • FIG. 3C shows that the survival rate of mice is increased when depleted anti-CD4 monoclonal antibody is added upon aPmel-1 treatment.
  • Figure 3d shows the change in the proportion of CD8 cells administered in CD45 positive cells of mice additionally treated with a depleted anti-CD4 monoclonal antibody upon aPmel-1 treatment.
  • 3E shows that the total cell number and CD8 cell number of mice additionally treated with the depleted anti-CD4 monoclonal antibody were increased upon aPmel-1 treatment.
  • melanoma cancer cells were injected subcutaneously into the dorsal subcutaneous of RAG2 ⁇ / ⁇ mice lacking T cells or B cells to induce the formation of cancer tissues.
  • lymphocytes and spleens of Thy1.1 (Thymocyte antigen 1.1) + Pmel-1 (premelanosome protein-1) transgenic mice were harvested to make cell suspensions, and then anti-CD8 microbeads (Miltenyi biotec) were used.
  • CD8 T cells were isolated.
  • the isolated cells were suspended in a culture dish in suspension at a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml in RPMI1640 medium (Wellzine) containing 10% FBS (Fetal bovine serum).
  • Activated Pmel-1 CD8 T cells (aPmel-1) were prepared by adding hgp100 peptide (KVPRNQDWL, 25-33 amino acid of human gp100, peptron) at a concentration of 5 ⁇ g / ml for two days.
  • mice transplanted with only B16-F10 had a cancer cell size larger than 2000 mm 3 in 20 days.
  • Mice injected with activated aPmel-1 only showed slow growth of cancer tissue and survived for about 40 days.
  • IL-2 was administered in combination with aPmel-1, the growth of cancer tissues was slowed, and some mice survived up to 60 days.
  • aPmel-1 was administered after induction of transient immunodeficiency through radiotherapy, some mice survived up to 100 days and similar results were obtained with IL-2.
  • aPmel-1 was prepared in the same manner as in [Example 1].
  • aPmel-1 and IL-2 were administered in the same manner as in [Example 1] above.
  • 150, 200 and 300 mg / Kg of cyclophosphamide (2 days before aPmel-1 administration) cyclophosphamide (CTX) was induced by intraperitoneal injection.
  • C57BL / 6 mice were intraperitoneally injected once with 150, 200 and 300 mg / Kg of CTX, and the inguinal lymph nodes (Inguinal LN) and The spleens were harvested and single cell suspensions were counted.
  • mice transplanted with only B16-F10 and administered with PBS (NTs) exceeded 2000 mm 3 in cancer cells in 20 days and most died.
  • Mice given 150 mg / Kg of CTX slowed the growth of cancerous tissues and survived up to 35 days.
  • the addition of aPmel-1 and IL-2 the growth of cancer tissue was similar to that of CTX alone, and the maximum survival was only 40 days.
  • mice administered 200 mg / Kg of CTX the growth of cancer tissues was slowed more than that of 150 mg / Kg of CTX and survived up to 45 days.
  • aPmel-1 and IL-2 resulted in slower growth of cancerous tissues than in CTX alone, but after 40 days, they were of similar size and survived up to 50 days. .
  • mice administered 300 mg / Kg CTX the growth of cancer tissues was slowed down compared to the administration of 200 mg / Kg CTX and survived up to 60 days.
  • aPmel-1 and IL-2 were additionally administered, the growth of cancer tissues was significantly slower than that of CTX alone administration. Even after 60 days, the size of the cancer tissues was about 600mm3 and the survival rate was 40 It was confirmed to be%.
  • CTX the higher the concentration of CTX, the longer the duration of the temporary immunodeficiency effect was confirmed to increase the anticancer effect by aPmel-1.
  • CTX when CTX is administered more than 300 mg / Kg, it is rather toxic to rats and may cause death, which is not appropriate for the purpose of inducing temporary immunodeficiency. It was insignificant.
  • the concentration of CTX was 200 mg / Kg. However, it was confirmed that the period was short enough to obtain sufficient anticancer effect from aPmel-1.
  • experimental groups were prepared in the same manner as in [Example 2].
  • 200 ⁇ g of GK1.5 (depleting anti-CD4 monoclonal antibody) was intraperitoneally administered 5 times at 8 days from 10 days after B16-F10 transplantation (FIG. 3a).
  • GK1.5 depleting anti-CD4 monoclonal antibody
  • FIG. 3a To confirm the change in the number of CD8 T cells, blood was collected from each group of mice 10, 17, 24, 31 and 38 days after cancer cell administration, stained with anti-CD45, anti-CD8 and anti-Thy1.1 antibodies, and flow cytometric analysis. The ratio of Thy1.1 + CD8 + cells among the CD45 positive cells was analyzed. In particular, the ratio and number of CD8 T cells in each organ 20 days after cancer cell administration were analyzed.
  • mice transplanted with only B16-F10 and administered with PBS exceeded 2000 mm 3 in cancer cells in 20 days and most died.
  • PBS PBS
  • mice treated with aPmel-1 CD8 T cells and IL-2 began to grow rapidly from day 25 and survived for about 50 days.
  • cancer cells grew slightly from 35 days, but slowed up to 8 times compared to before the depleted anti-CD4 monoclonal antibody, and even after 60 days, 500 Not over.
  • the size of cancer cells was reduced by more than 100 mm 3 and 20% of mice survived for 60 days or more. Increased over.
  • the CD8 T cells CTX in the case of administration of only aPmel-1 number of CD8 T cells compared with the increase of about 2.5 times, and particularly the administration of Thy1.1 + CD8 + T cells than (gray bars) C57BL / 6 mice, the CD8 T cells (Thy1.1 - CD8 + T cells, black bars) were found to increase significantly.
  • the proportion of CD8 T cells in the spleen also increased similarly to the results of the inguinal lymph nodes.
  • Thy1.1 + CD8 + T cells In the case of infiltrating CD8 T cells (TIL) in cancer tissues, the ratio of Thy1.1 + CD8 + T cells was high when CTX and aPmel-1 were administered only, but additionally administered depleted anti-CD4 monoclonal antibody The proportion of Thy1.1 - CD8 + T cells was found to be higher.
  • sustained partial immunodeficiency through persistent anti-CD4 monoclonal antibody depletion promotes in vivo proliferation of administered CD8 T cells as well as cancer-specific CD8 T cells.
  • aPmel-1 seems to be able to enhance.
  • various cancer patients such as T-cell therapeutics, may be more effective in preventing various cancers. Or it can be effectively used in the industries related to the treatment, the industrial applicability is large.

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Abstract

본 발명은 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 포함하는 항암 T 세포 치료제 보조용 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다. 따라서, 본 발명의 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 조성물의 경우 면역결핍상태를 유지함으로써 암항원 특이적 항암 T 세포 치료제의 항암효과를 극대화할 수 있으므로 효과적이다. 또한 상기 조성물을 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 경우 효과가 더욱 우수하다.

Description

고갈성 항 CD4 단일클론항체를 포함하는 항암 T 세포치료제 보조용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 2018년 04월 17일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0044411호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계 내지 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 이용하여 지속적 면역결핍을 유도하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법 내지 면역결핍 지속방법에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 면역결핍 지속용 조성물 내지 항암 T 세포치료제 보조용 조성물에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody), 암항원 특이적 CD8 T 세포, 면역결핍 유도제 및 IL-2를 포함하는 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물에 대한 것이다.
T 세포를 이용하여 암을 치료한다는 개념은 1960년대 중반에 처음 제안되었지만, 연구초기에는 암세포를 인식하는 T 세포의 분리를 위한 실용적인 방법들이 없어 암항원을 면역주사한 동물로부터 T 세포를 분리하는 방식을 사용하였다. T 세포치료제의 개념이 처음 제안된지 20여년 후에야, 사람의 암조직으로부터 TIL(종양침윤림프구; tumor-infiltrating lymphocyte)을 분리 및 배양하는 방법이 확립되었다. 그 후, 암항원 특이적 CTL(세포독성 T 림프구; cytotoxic T lymphocyte)들을 분리하여 T 세포치료제로서 사용하고 있다.
다양한 암항원 중 자가암항원은 정상세포에 비해 암세포에서 높게 발현되는 단백질로 암세포의 성장 및 생존에 필수적인 단백질인 경우가 많다. 따라서 인간 텔로미어 역전사 효소(human telomere reverse transcriptase; hTERT), 빌름스 종양항원(Wilm's tumor antigen 1; WT-1), NY-ESO-1, MAGE(Melanoma-associated antigen)와 같은 암세포에서 과발현되는 자가암항원들은 다양한 방식으로 항암면역치료제 개발을 위한 표적으로 사용되어 왔다. 그러나 암항원 특이적 T 세포치료제가 높은 완치 비율을 나타내는 것에 비해, 자가암항원을 표적하는 T 세포에 의해서는 암환자의 완치비율이 극히 낮은 것으로 나타났다. 이에 자가암항원을 인식하는 여러 종류의 클론을 포함하는 다클론 CD8 T 세포를 사용하거나 암의 여러 암항원을 표적하는 CD4 및 CD8 T 세포를 포함하는 TIL 세포를 사용하는 방법 등이 시도되고 있다.
체내에서는 자가면역질환 발생을 차단하기 위해 자가항원을 높은 친화력으로 인식하는 T 세포를 면역관용(tolerance) 과정을 통하여 제거한다. 따라서 체내에 존재하는 자가암항원을 인식하는 T 세포들은 근본적으로 낮은 친화력의 TCR(T 세포 수용체; T cell receptor)을 가지게 되므로 그 항암효과 역시 낮아지게 된다. 이는 표준치료에 불응하여 재발한 암을 완치하기 위해서는 암항원에 대한 T 세포의 반응을 유도 및 증가시킬 필요가 있음을 의미한다.
낮은 항암효과를 나타내는 자가암항원 특이적 T 세포의 한계를 극복하기 위한 방법으로, 대부분의 항암 T 세포치료제는 화학항암제 투여를 통해 일시적 면역결핍을 유도한 후 T 세포를 투여함으로써 항암효과를 극대화하고 있다. 화학항암제 투여를 통한 일시적 면역결핍(lymphopenia)은 T 세포 성장인자의 생체내 농축, 면역억제 세포의 제거 및 투여된 T 세포의 항상성 증식(homeostatic proliferation)을 촉진하는 효과를 가지고 있다. 그러나 화학항암제에 의한 일시적 면역결핍현상은 7일 내지 14일 정도만 유지되고 있어, 투여된 T 세포의 항암효과는 시간이 지날수록 감소하는 문제점이 있다.
대한민국 등록특허 제 10-1503341호에서는 체내에서 극히 낮은 비율로 존재하는 자가암항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 선택적으로 분리하고 이를 대량으로 증식하는 방법을 제공하고 있다. 다만 면역결핍현상을 개선하여 항암제의 항암효과를 증진시키고자 하는 연구에 대하여는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 T 세포치료제 사용시 활용되는 면역결핍현상을 연장하여 투여되는 T 세포의 항암효과를 높일 수 있는지 연구하였으며, 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depletign anti-CD4 monoclonal antibody)의 주기적 투여를 통해 부분적인 림프구고갈(lymphodepletion)을 지속적으로 유도함으로써 암항원 특이적 T 세포를 이용한 세포치료의 항암효과를 극대화 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 암 환자의 면역결핍상태를 유지시킴으로써 항암 T 세포치료제의 항암효과를 증진시키는 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 사용하는 경우 면역결핍 상태를 충분히 지속시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계;
ii) 암항원 특이적 CD8 T 세포 및 IL-2 를 투여하는 단계; 및
iii) 지속적 면역결핍을 유도하는 단계;
를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계; 및
ii) 상기 일시적 면역결핍이 유도된 암 환자에게 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 투여하는 단계;
를 포함하는 면역결핍 지속방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 면역결핍 지속용 조성물 내지 항암 T 세포치료제 보조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody), 암항원 특이적 CD8 T 세포, 면역결핍 유도제 및 IL-2를 포함하는 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계;
ii) 암항원 특이적 CD8 T 세포 및 IL-2 를 투여하는 단계; 및
iii) 지속적 면역결핍을 유도하는 단계;
를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 일시적 면역결핍은 방사선 조사 내지 항암제 투여로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 시클로포스파미드(cyclophophamide) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암항원은 hTERT(human telomere reverse transcriptase), WT-1(Wilm's tumor antigen 1), NY-ESO-1, MAGE(Melanoma-associated antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), CA-125, MUC-1 및 MART-1(Melanoma antigen recognized by T cells 1)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 자가암항원인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 지속적 면역결핍은 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 고갈성 항 CD4 단일클론항체는 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명은 또한 i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계; 및
ii) 상기 일시적 면역결핍이 유도된 암 환자에게 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 투여하는 단계;
를 포함하는 면역결핍 지속방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 고갈성 항 CD4 단일클론항체는 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 면역결핍 지속용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물을 처리하는 경우 면역결핍 지속기간은 조성물을 처리한 후 약 10일 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 항암 T 세포치료제 보조용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명은 또한 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody), 암항원 특이적 CD8 T 세포, 면역결핍 유도제 및 IL-2를 포함하는 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 시클로포스파미드(cyclophophamide) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명의 용어 "고갈성 항 CD4 단일클론항체"은 림프구 중 CD4 세포를 제거 내지 억제하는 단일클론항체를 의미한다.
본 발명의 용어 "항암 T 세포치료제 보조용 조성물"은 항암 T 세포치료제에 의한 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시키는 조성물을 의미한다.
본 발명의 용어 "부분적인 면역결핍"은 다양한 면역세포 중에서 일부 면역세포만을 제거 내지 억제하여 결핍시키는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 항암 T 세포치료제의 항암효과 증진을 위하여 일시적인 면역결핍을 유도하였으나 그 기간이 짧아 세포치료제의 효과가 미미하다는 문제점이 있었다. 이를 극복하기 위한 방안으로서 면역결핍현상을 개선하여 항암제의 항암효과를 증진시키고자 하는 연구에 대하여는 보고된 바 없다.
본 발명에 따른 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 조성물의 경우 면역결핍상태를 유지함으로써 암항원 특이적 항암 T 세포 치료제의 항암효과를 극대화할 수 있으므로 암을 예방 또는 치료하거나, 암 환자의 면역결핍 상태를 지속시키는데에 효과적이다.
따라서, 본 발명은 i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계;
ii) 암항원 특이적 CD8 T 세포 및 IL-2 를 투여하는 단계; 및
iii) 지속적 면역결핍을 유도하는 단계;
를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 ‘일시적 면역결핍’은 방사선 조사 내지 항암제 투여를 통하여 암 환자의 면역을 일시적으로 저하시키는 것을 의미하며, 이는 약 7일 내지 14일 동안 면역결핍 상태가 나타나는 것일 수 있다.
상기 방사선 조사는 통상적으로 사용 가능한 용량의 범위에서 전신방사선 조사(total body irradiation)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 항암제는 바람직하게 100 내지 300 mg/Kg의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 150 내지 250 mg/Kg 의 농도로 포함될 수 있다. 만일 항암제가 300 mg/Kg을 초과하는 농도로 포함되는 경우 면역결핍 내지 항암 효과가 상승할 수 있으나, 체내에 치명적으로 작용하여 사망 등의 부작용이 발생할 수 있다.
상기 항암제는 시클로포스파미드(cyclophophamide) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상인 것이 바람직하나, T 세포치료 전 면역결핍을 유도하는 목적으로 사용되는 항암제라면 제한없이 사용가능하다.
상기 암항원은 MAGE 유전자 패밀리에 코드되거나, 유전자 변위 내지 돌연변이에 의해 발생하는 암항원, 암세포의 과잉으로 발현되는 암항원, 발암 바이러스 항원, 종양 태아 항원, 전립선 특이적 항원, 자가암항원 내지 분화 항원 등 모든 암항원을 의미한다. 그러나 바람직하게는 자가암항원일 수 있으며, 이는 hTERT(human telomere reverse transcriptase), WT-1(Wilm's tumor antigen 1), NY-ESO-1, MAGE(Melanoma-associated antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), CA-125, MUC-1 및 MART-1(Melanoma antigen recognized by T cells 1)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 자가암항원인 것이 바람직하다.
상기 암항원 특이적 CD8 T 세포는 바람직하게 1×105 cells/500㎕ 내지 1×108 cells/500㎕ 농도로 투여될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 1×106 cells/500㎕ 내지 1×107 cells/500㎕ 농도로 투여될 수 있다. 상기 IL-2는 CD8 T 세포를 대량으로 증식시키는 효과가 있으며 5,000 내지 50,000 IU 농도로 투여될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 7,000 내지 20,000 IU 농도로 투여될 수 있다.
상기 ‘지속적 면역결핍’은 일시적 면역결핍에 비하여 장기간 면역결핍 상태를 유지하는 것을 의미하여 약 10일 이상 면역결핍 상태가 유지되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 약 15일 이상 60일 이하인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 약 20일 이상 45일 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 지속적 면역결핍은 CD4 T 세포와 결합하여 이의 부분적인 면역결핍을 유도할 수 있는 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)로 이루어지는 것이 바람직하다. 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 6일 내지 7일 간격으로 약 4회 내지 8회 투여되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 5회 내지 6회 투여되는 것이 바람직하다. 만일 1회 이하로 투여하게 된다면 체내 CD8 T 세포 비율이 고갈성 항 CD4 단일클론항체을 투여하기 전 보다 오히려 더 빠르게 감소하는 부작용이 발생할 수 있다. 4일 이하 또는 8일 이상의 간격으로 투여하는 경우 면역결핍효과가 안정적으로 유지될 수 없어 그 효율성이 떨어지게 된다.
상기 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 고형암에 해당한다면 제한없이 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계; 및
ii) 상기 일시적 면역결핍이 유도된 암 환자에게 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 투여하는 단계;
를 포함하는 면역결핍 지속방법을 제공한다.
상기 암 및 일시적 면역결핍은 상기 암 예방 또는 치료방법에서 사용된 의미와 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
또한, 본 발명은 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 면역결핍 지속용 조성물 내지 항암 T 세포 치료제 보조용 조성물을 제공한다.
상기 면역결핍 지속용 조성물을 처리하는 경우 면역결핍 지속기간은 조성물을 처리한 후 약 10일 이상 유지될 수 있다. 바람직하게는 약 15일 이상 60일 이하인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 20일 이상 45일 이하인 것이 바람직하다.
상기 면역결핍 지속용 조성물 내지 항암 T 세포 치료제 보조용 조성물은 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 6일 내지 7일 간격으로 약 4회 내지 8회 투여되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 5회 내지 6회 투여되는 것이 바람직하다. 만일 1회 이하로 투여하게 된다면 체내 CD8 T 세포 비율이 조성물을 투여하기 전 보다 오히려 더 빠르게 감소하는 부작용이 발생할 수 있다. 4일 이하 또는 8일 이상의 간격으로 투여하는 경우 효과가 안정적으로 유지될 수 없어 그 효율성이 떨어지게 된다.
따라서, 본 발명의 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 항암 T 세포 치료제 보조용 조성물은 면역결핍현상을 유지시킴으로서 항암 T 세포치료제의 항암효과를 극대화 시킬 수 있으며, 특히 암항원 특이적 T 세포치료제에 대하여 약 5일 내지 8일의 간격으로 2회 이상 투여되는 경우 효과가 더욱 우수하다.
본 발명은 또한 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody), 암항원 특이적 CD8 T 세포, 면역결핍 유도제 및 IL-2를 포함하는 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 면역결핍 유도제는 일시적인 면역결핍을 유도하기 위하여 사용되며, 시클로포스파미드(cyclophophamide) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상인 것이 바람직하나, T 세포치료 전 면역결핍을 유도하는 목적으로 사용되는 항암제라면 제한없이 사용가능하다. 바람직하게는 100 내지 300 mg/Kg의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 150 내지 250 mg/Kg 의 농도로 포함될 수 있다. 만일 항암제가 300 mg/Kg을 초과하는 농도로 포함되는 경우 면역결핍 내지 항암 효과가 상승할 수 있으나, 체내에 치명적으로 작용하여 사망 등의 부작용이 발생할 수 있다. 상기 IL-2는 CD8 T 세포를 대량으로 증식시키는 효과가 있으며 5,000 내지 50,000 IU 농도로 포함될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 7,000 내지 20,000 IU 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 고갈성 항 CD4 단일클론항체는 CD4 T 세포와 결합하여 이의 부분적인 면역결핍을 유도한다. 상기 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 1회 투여하는 경우 약 5일 내지 7일 동안 부분적인 면역결핍 상태가 유지될 수 있다.
본 발명의 상기 암항원은 hTERT(human telomere reverse transcriptase), WT-1(Wilm's tumor antigen 1), NY-ESO-1, MAGE(Melanoma-associated antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), CA-125, MUC-1 및 MART-1(Melanoma antigen recognized by T cells 1)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 자가암항원인 것이 바람직하나, 암항원과 관련된 돌연변이 단백질이라면 제한없이 적용될 수 있다.
본 발명의 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 6일 내지 7일 간격으로 약 4회 내지 8회 투여되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 5회 내지 6회 투여되는 것이 바람직하다. 만일 1회 이하로 투여하게 된다면 체내 CD8 T 세포 비율이 조성물을 투여하기 전 보다 오히려 더 빠르게 감소하는 부작용이 발생할 수 있다. 4일 이하 또는 8일 이상의 간격으로 투여하는 경우 면역결핍효과가 안정적으로 유지될 수 없어 그 효율성이 떨어지게 된다.
본 발명의 상기 면역결핍 유도제는 항암제인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이는 일시적인 면역결핍을 유도하기 위하여 사용되며, 바람직하게는 100 내지 300 mg/Kg의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 150 내지 250 mg/Kg 의 농도로 포함될 수 있다. 만일 항암제가 300 mg/Kg을 초과하는 농도로 포함되는 경우 면역결핍 내지 항암 효과가 상승할 수 있으나, 체내에 치명적으로 작용하여 사망 등의 부작용이 발생할 수 있다.
본 발명의 상기 항암제는 시클로포스파미드(cyclophophamide) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상인 것이 바람직하나, T 세포치료 전 면역결핍을 유도하는 목적으로 사용되는 항암제라면 제한없이 사용가능하다.
상기 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 고형암에 해당한다면 제한없이 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 항암치료에 사용하는 경우 암 환자의 면역결핍상태를 유지함으로써 암항원 특이적 항암 T 세포 치료제의 항암효과를 극대화할 수 있으므로 효과적이다. 또한 상기 고갈성 항 CD4 단일클론항체 내지 이를 포함하는 조성물을 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 경우 면역결핍상태를 유지하는 효과가 더욱 우수하다.
도 1a는 T 세포와 B 세포가 결여된 생쥐에 Pmel-1 특이적 CD8 T 세포(aPmel-1)을 처리할 경우, 전신방사능 처리와 IL-2 투여를 추가하는 경우 aPmel-1의 항암효과가 증가하여 암세포의 크기가 감소하는 것을 나타낸다.
도 1b는 상기 약물 등을 처리한 후 18일 및 90일째 되는 때에 각 그룹의 쥐를 나타낸다.
도 2a는 시클로포스파미드(cyclophosphamide, CTX)의 투여 농도의 증가 및 aPmel-1과 IL-2의 추가적인 투여로 인해 암세포의 성장이 둔화되는 것을 나타낸다.
도 2b는 시클로포스파미드(cyclophosphamide, CTX)의 투여 농도의 증가 및 aPmel-1과 IL-2의 추가적인 투여로 인해 쥐의 생존률이 높아지는 것을 나타낸다.
도 2c는 시클로포스파미드(cyclophosphamide, CTX)의 투여농도에 따른 사타구니 림프절의 세포수 변화를 나타낸다.
도 2d는 시클로포스파미드(cyclophosphamide, CTX)의 투여농도에 따른 비장의 세포수 변화를 나타낸다.
도 3a는 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody, dCD4)를 이용하여 aPmel-1의 항암효과 증진을 위한 면역결핍상태를 유지시키는 과정을 나타낸다.
도 3b는 aPmel-1 처리시 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 추가하는 경우 aPmel-1의 항암효과가 증가하여 암세포의 성장이 더욱 둔화되는 것을 나타낸다.
도 3c는 aPmel-1 처리시 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 추가하는 경우 쥐의 생존률이 증가함을 나타낸다.
도 3d는 aPmel-1 처리시 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 추가적으로 처리한 쥐의 CD45 양성세포 중에서 투여된 CD8 세포의 비율 변화를 나타낸다.
도 3e는 aPmel-1 처리시 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 추가적으로 처리한 쥐의 총 세포수 및 CD8 세포수가 증가하였음을 나타낸다.
[실시예 1]
CD8 T 세포 단독의 항암효과 확인
항암효과가 있는 다른 면역세포들을 제외하고 암항원 특이적 CD8 T 세포 단독의 항암효과를 평가하고자 하였다.
구체적으로, 2×105 개의 B16-F10 흑색종 암세포를 T 세포 또는 B 세포가 결핍된 RAG2-/- 생쥐의 등쪽 피하로 주사하여 암조직의 형성을 유도하였다. 동시에 Thy1.1(Thymocyte antigen 1.1)+Pmel-1(premelanosome protein-1) 형질전환 생쥐의 림프절 및 비장을 수거하여 세포현탁액을 만든 후, 항 CD8 마이크로비드(anti-CD8 microbead; Miltenyi biotec)을 이용하여 CD8 T 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 10% FBS(Fetal bovine serum; 소태아 혈청)가 포함된 RPMI1640 배지(웰진)에 2×106 cells/㎖ 농도로 현탁하여 배양접시에 분주하였다. hgp100 펩타이드(KVPRNQDWL, 25-33 amino acid of human gp100, 펩트론)을 5㎍/㎖ 농도로 첨가하여 이틀간 배양함으로써 활성화된 Pmel-1 CD8 T 세포(aPmel-1)를 준비하였다.
aPmel-1를 투여하는 군에는, aPmel-1을 PBS로 두 번 세척한 후 2×106 cells/500㎕/mice 농도로 정맥주사를 통해 상기 RAG2-/- 생쥐에 B16-F10 이식 5일째 투여하였다. 일시적 면역결핍을 유도하는 군에는 Pmel-1 CD8 T 세포 투여 6시간 전에 6Gy의 방사선을 전신에 조사하여(total body irradiation, TBI) 유도하였다. IL-2를 투여하는 군에는, aPmel-1 투여 후 10,000 IU의 재조합 인간 IL-2(recombinant human IL-2)를 3일 동안 하루에 한번씩 복강주사하였다.
그 결과, [도 1a]에 나타나는 바와 같이, B16-F10만을 이식한 생쥐(Control)들은 20일 만에 암세포의 크기가 2000mm3을 초과하였다. 활성화된 aPmel-1만을 정맥주사한 생쥐의 경우에는 암조직의 성장이 둔화되었으며 약 40일 정도 생존하는 것으로 나타났다. aPmel-1과 함께 IL-2를 투여할 경우, 암조직의 성장은 더욱 둔화되어 일부 생쥐는 최대 60일까지 생존하였다. 방사능 처리를 통해 일시적 면역결핍을 유도한 후 aPmel-1을 투여할 경우, 일부 생쥐는 100일까지 생존하였으며, IL-2를 함께 투여한 경우에도 유사한 결과가 나타났다.
또한, [도 1b]에 나타나는 바와 같이, 암세포 투여 18일째 각 실험군의 생쥐들의 암조직 크기를 분석하였을 때 방사선 조사와 함께 aPmel-1 및 IL-2까지 투여한 실험군에서 암조직이 거의 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 약 60일이 경과하자 암 조직이 성장하기 시작하였으며 약 90일이 경과한 시점에서는 암 조직이 상당히 성장하여 육안으로도 무리없이 확인할 수 있었다. 이는 aPmel-1에 의한 강한 면역반응으로 자가면역질환의 일종인 백반증(vitiligo) 현상까지 관찰되었음에도 불구하고 B16-F10 암세포는 이를 회피하여 다시 성장하고 있음을 시사한다. 따라서 투여된 aPmel-1 만으로는 B16-F10을 완전하게 제거할 수 없는 것으로 판단하였다.
[실시예 2]
CD8 T 세포의 항암효과 확인 및 일시적 면역결핍유도제의 첨가농도 결정
상기 [실시예 1]에서 aPmel-1 단독으로는 암세포를 완전히 제거할 수 없음을 확인하였으므로, 이를 극복하기 위해서는 T 세포 등 다른 면역세포의 활성이 필요할 것으로 예상하였다. 따라서 정상적인 면역체계에서 암항원 특이적 CD8 T 세포의 항암효과의 확인과 함께 일시적 면역결핍유도제의 첨가농도를 결정하고자 하였다.
구체적으로, 2×105 개의 B16-F10 흑색종 암세포를 C57BL/6 생쥐의 등쪽 피하로 주사하여 암조직의 형성을 유도하였다. 동시에 상기 [실시예 1]과 같은 방법으로 aPmel-1를 준비하였다. aPmel-1과 IL-2는 상기 [실시예 1]과 동일한 방법으로 투여하였으며, 일시적 면역결핍을 유도하는 경우에는, aPmel-1 투여 이틀 전 150, 200 및 300 mg/Kg의 시클로포스파미드(cyclophosphamide, CTX)를 복강주사하여 유도하였다. 또한, CTX의 첨가농도에 따른 일시적 면역결핍 유지기간을 확인하기 위하여는, C57BL/6 생쥐에 150, 200 및 300 mg/Kg의 CTX를 1회 복강주사하고 상기 생쥐의 사타구니 림프절(Inguinal LN) 및 비장을 수거하여 단일세포화(single cell suspension)한 후 그 세포수를 계수하였다.
그 결과, [도 2a] 및 [도 2b]에 나타나는 바와 같이, B16-F10만을 이식하고 PBS를 투여받은 생쥐(NT)들은 20일만에 암세포의 크기가 2000mm3을 초과하였으며 대부분 사망하였다. 150 mg/Kg의 CTX를 투여한 생쥐의 경우, 암조직의 성장이 둔화되고 최대 35일까지 생존하였다. aPmel-1와 IL-2를 추가로 투여하여도 암조직의 성장은 CTX를 단독으로 투여한 경우와 유사하고, 최대 생존일도 40일에 그쳤다. 200 mg/Kg의 CTX를 투여한 생쥐의 경우, 암조직의 성장이 150 mg/Kg의 CTX를 투여한 경우에 비하여 더욱 둔화되어 최대 45일까지 생존하였다. aPmel-1와 IL-2를 추가로 투여할 경우, 암조직의 성장이 CTX 단독투여의 경우보다 더 둔화되는 것으로 나타났으나, 40일이 경과한 후에는 비슷한 크기가 되었으며 최대 50일까지 생존하였다. 300 mg/Kg CTX를 투여한 생쥐의 경우, 암조직의 성장이 200 mg/Kg의 CTX를 투여한 경우에 비하여 더욱 둔화되어 최대 60일까지 생존하였다. aPmel-1와 IL-2를 추가로 투여할 경우, 암조직의 성장은 CTX 단독투여의 경우보다 유의적으로 둔화되어 60일이 경과하여도 암조직의 크기는 약 600㎣에 그쳤으며 생존률도 40%인 것으로 확인하였다.
CTX의 첨가농도가 높아질수록 일시적 면역결핍효과가 유지되는 기간이 길어져 aPmel-1에 의한 항암효과가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 다만, CTX를 300 mg/Kg 이상 투여하는 경우 오히려 쥐에 독성을 나타내어 사망하게 할 수 있어 일시적 면역결핍 유도목적으로 적절하지 않았으며, 150 mg/Kg의 CTX를 투여한 경우에는 일시적 면역결핍 효과가 미미하였다. [도 2c] 및 [도 2d]에서 나타나는 바와 같이, 200 mg/Kg의 CTX를 투여하여도 면역결핍효과가 약 2주 정도 유지되는 것을 확인하였으므로 CTX의 첨가농도는 200 mg/Kg으로 하였다. 다만, aPmel-1로부터 충분한 항암효과를 얻기에는 기간이 짧은 것을 확인하였다.
[실시예 3]
CD4 고갈(depletion)이 Pmel-1 CD8 T 세포의 항암효과에 미치는 영향
고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 이용하여 지속적으로 부분적인 면역결핍을 유도하는 경우, 암항원 특이적 CD8 T 세포의 항암효과에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자 하였다. 이와 함께 투여한 Thy1.1+Pmel-1 CD8+ T 세포수 및 암환자 고유의 CD8 T 세포수에 변화가 발행하였는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 [실시예 2]와 동일한 방법으로 실험군들을 준비하였다. 지속적인 면역결핍을 유도하는 경우에는 B16-F10 이식 후 10일째부터 200㎍의 GK1.5(고갈성 항 CD4 단일클론항체, depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 8일 간격으로 5회 복강 투여하였다(도 3a). CD8 T 세포 수의 변화를 확인하기 위해서는 암세포 투여 후 10, 17, 24, 31 및 38일 째에 각 실험군 생쥐로부터 채혈하여 항-CD45, 항-CD8 및 항-Thy1.1 항체로 염색하고 유세포 분석을 통해 CD45 양성세포 중에서 Thy1.1+CD8+ 세포의 비율을 분석하였다. 특히, 암세포 투여 후 20일째 각 장기에서 CD8 T 세포의 비율 및 숫자를 분석하였다.
그 결과, [도 3b] 및 [도 3c]에 나타나는 바와 같이, B16-F10만을 이식하고 PBS를 투여한 생쥐(PBS)들은 20일만에 암세포의 크기가 2000mm3을 초과하였으며 대부분 사망하였다. 200 mg/Kg CTX 투여 후 aPmel-1 CD8 T 세포 및 IL-2를 투여한 생쥐는 25일째부터 암세포가 급격히 성장하기 시작하였으며, 약 50일까지 생존하였다. 동일한 조건에 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 투여할 경우, 암세포가 35일부터 미미하게 성장하기는 하였으나 고갈성 항 CD4 단일클론항체 투여 전과 비교하여 최대 8배 이상 둔화되어 60일이 경과하여도 500㎣가 넘지 않았다. 또한 생쥐의 60%가 60일 이상 생존하였다. 이는 300 mg/Kg의 CTX를 투여하고 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 투여하지 않은 경우(도 2b)와 비교하여도 암세포의 크기가 100㎣ 이상 감소하였으며 60일 이상 생존한 쥐의 비율도 20% 이상 증가하였다.
또한, [도 3d]에 나타나는 바와 같이, 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 지속적으로 투여하는 경우 Thy1.1+CD8+ T세포의 비율이 투여하지 않은 경우에 비하여 높은 수준으로 유지되었다. 추가적으로, 고갈성 항 CD4 단일클론항체 투여를 중단한 후, 4일 내지 5일 이후부터 Thy1.1+CD8+ T세포의 비율이 점진적으로 감소하였다.
특히, [도 3e]에 나타나는 바와 같이 사타구니 림프절(TDLN)의 경우, CTX와 aPmel-1을 투여한 경우에 비하여 고갈성 항 CD4 단일클론항체(dCD4)를 추가로 투여하는 경우 총 세포수가 증가하였다. 이 중 CD8 T 세포는, CTX와 aPmel-1만을 투여한 경우에 비하여 CD8 T 세포수가 약 2.5배 증가하였으며, 특히 투여된 Thy1.1+CD8+ T 세포(회색 막대)보다 C57BL/6 생쥐의 CD8 T 세포(Thy1.1-CD8+ T 세포, 검은색 막대)가 크게 증가한 것으로 확인되었다. 비장(spleen) 내 CD8 T 세포의 비율 역시 상기 사타구니 림프절의 결과와 유사하게 증가하였다.
암조직 내 침윤된 CD8 T 세포(TIL)의 경우, CTX와 aPmel-1만을 투여한 경우 Thy1.1+CD8+ T 세포의 비율이 높게 나타났지만, 고갈성 항 CD4 단일클론항체를 추가로 투여한 경우 Thy1.1-CD8+ T 세포의 비율이 더 높은 것으로 나타났다.
결과적으로, 항 CD4 단일클론항체 고갈(anti-CD4 depletion)을 통해 지속적으로 부분적인 면역결핍을 유지해줄 경우, 투여된 CD8 T 세포의 생체내 증식을 촉진할 뿐 아니라, 암환자 고유의 CD8 T 세포의 증식을 유도함으로써 T 세포치료제인 aPmel-1의 항암효과를 증진시킬 수 있는 것으로 판단된다.
본 발명에서 제공하는 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 이용한 면역결핍 지속효과는 경우 다양한 암 환자에게 T 세포치료제 등 다양한 항암치료의 효과가 보다 충분히 발생할 수 있게 하여 암 예방 또는 치료와 관련된 산업에 효과적으로 이용될 수 있으므로 산업상 이용가능성이 크다.

Claims (20)

  1. i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계;
    ii) 암항원 특이적 CD8 T 세포 및 IL-2 를 투여하는 단계; 및
    iii) 지속적 면역결핍을 유도하는 단계;
    를 포함하는 암 예방 또는 치료방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 일시적 면역결핍은 방사선 조사 내지 항암제 투여로 이루어지는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항암제는 시클로포스파미드(cyclophophamide) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암항원은 hTERT(human telomere reverse transcriptase), WT-1(Wilm's tumor antigen 1), NY-ESO-1, MAGE(Melanomaassociated antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), CA-125, MUC-1 및 MART-1(Melanoma antigen recognized by T cells 1)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 자가암항원인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 지속적 면역결핍은 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 고갈성 항 CD4 단일클론항체는 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 i)의 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
  8. i) 암 환자에게 일시적 면역결핍을 유도하는 단계; 및
    ii) 상기 일시적 면역결핍이 유도된 암 환자에게 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 투여하는 단계;
    를 포함하는 면역결핍 지속방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단계 i)의 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역결핍 지속방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 일시적 면역결핍은 방사선 조사 내지 항암제 투여로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역결핍 지속방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 고갈성 항 CD4 단일클론항체는 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것을 특징으로 하는 면역결핍 지속방법.
  12. 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 면역결핍 지속용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것을 특징으로 하는 면역결핍 지속용 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 조성물을 처리하는 경우 면역결핍 지속기간은 조성물을 처리한 후 약 10일 이상인 것을 특징으로 하는 면역결핍 지속용 조성물.
  15. 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody)를 포함하는 항암 T 세포치료제 보조용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 약 5일 내지 8일 간격으로 2회 이상 투여되는 것을 특징으로 하는 항암 T 세포치료제 보조용 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암 T 세포치료제 보조용 조성물.
  18. 고갈성 항 CD4 단일클론항체(depleting anti-CD4 monoclonal antibody), 암항원 특이적 CD8 T 세포, 면역결핍 유도제 및 IL-2를 포함하는 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역결핍 유도제는 시클로포스파미드(cyclophophamide) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 뇌암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
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