WO2019187299A1 - 試料分離デバイス、及び試料分離方法 - Google Patents

試料分離デバイス、及び試料分離方法 Download PDF

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liquid
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悠 石毛
足立　作一郎
貴洋 安藤
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株式会社日立製作所
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    • G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
    • G01N2035/1053—General features of the devices using the transfer device for another function for separating part of the liquid, e.g. filters, extraction phase

Definitions

  • the present disclosure relates to a sample separation device and a sample separation method.
  • Blood tests are quantitative and qualitative tests and analyzes of blood components, and are used for hospital diagnosis and regular health checkups.
  • biochemical tests and immunological tests which are part of blood tests, analysis is performed using a liquid component called plasma or serum obtained by removing blood cell components from blood as a sample. Therefore, there are blood cell separation procedures for separating blood cells from plasma or serum in these tests.
  • a method of centrifuging a blood collection tube containing several mL of blood has become the mainstream. Since the specific gravity of blood cells is larger than the specific gravity of plasma and serum, blood cells are separated in the lower part and plasma and serum are separated in the upper part.
  • a separation agent having a specific gravity between blood cells and plasma / serum may be used.
  • a blood test using a cartridge may be performed in the test in front of or near the patient's eyes, which is called Point-Of-Care Testing (POCT).
  • POCT Point-Of-Care Testing
  • centrifugation may be performed in the cartridge to separate blood cells.
  • centrifugation is performed using a U-shaped flow path, and the obtained plasma is used for analysis.
  • the present disclosure employs, for example, the configurations described in the claims.
  • the present specification includes a plurality of means for solving the above-described problems.
  • the sample separation device according to the present disclosure introduces a sample to be separated into the inside, performs centrifugation, and performs a desired operation after separation.
  • a sample separation device used to collect a liquid of A sample introduction unit for introducing a sample to be separated into a sample separation device;
  • a liquid level regulating unit connected to the sample introduction unit;
  • a first separation unit connected to the liquid level regulation unit;
  • a second separator connected to the first separator;
  • a third separator connected to the second separator;
  • a tubular channel is formed by at least the first separation part and the second separation part,
  • the opening of the sample introduction part and the opening of the liquid extraction part face the same direction
  • the first separation unit is configured such that gravity and a capillary force generated in a direction opposite to the gravity act on the sample after separation,
  • the horizontal cross-sectional area of the liquid level defining part is larger than the horizontal cross-sectional area of the first separating part, and when the separated sample reaches the lowermost part of the liquid level defining part by the capillary force, the capillary force against the separated sample
  • FIG. 1A is a diagram showing the appearance of the centrifuge 10.
  • FIG. 1B is a diagram illustrating an appearance of the rotor 13 of the centrifuge 10.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a schematic configuration example of a rotor 13 according to another embodiment of the centrifuge 10.
  • FIG. 2A is a diagram illustrating an appearance of the rotor 13 according to another embodiment. It is a figure showing an example of composition of sample separation device 100 by an embodiment of this indication.
  • 3A to 3D show a process before the introduced blood (sample) is separated into blood cell components. It is a flowchart for demonstrating the procedure of sample separation.
  • FIG. 5A is a diagram illustrating an external configuration example of the blood cell separation device 201.
  • FIG. 5B is a view showing a cross section of the blood cell separation device 201.
  • FIG. 4 is a diagram showing a procedure for blood cell separation using the blood cell separation device 201.
  • 5 is a diagram illustrating an example of a method for manufacturing the blood cell separation device 201.
  • FIG. 7 is a diagram showing a result of plasma separation performed in accordance with the procedure of FIG. 6 by making a prototype of the device of FIG. FIG.
  • 10 is a diagram showing the result of examining the relationship between the liquid volume and the liquid level by adding 10 to 30 ⁇ L of pure water to the plasma separation device. It is a figure which shows the result of having produced the plasma separation device which made the thickness of the small diameter side flow path discontinuously thick to 1.7 mm for blood of 20 ⁇ L, and performed plasma separation under the same conditions. It is a figure which shows the result of having performed plasma separation using the plasma separation device which has a diameter change part designed for blood volume of 10 microliters. It is a figure for demonstrating the phenomenon in which the height of an interface becomes inconsistent on the small diameter side and the large diameter side in the process that sedimentation of the blood cell by centrifugal force occurs independently in the right and left of an asymmetrical U-shaped channel.
  • FIG. 13A shows a 10 ⁇ L blood device
  • FIG. 13B shows a 20 ⁇ L blood device. It is a figure which shows the result of having prototyped the plasma separation device, extract
  • FIG. It is a figure which shows the example of 1 structure of the blood cell separation device 1601 which concerns on Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the example of 1 structure of the blood analyzer. It is a figure which shows an example of the measurement flow using the blood analyzer shown in FIG.
  • the feature of this method is to control the position of the liquid level by reducing the capillary force and balancing with gravity by increasing the diameter.
  • FIG. 13A shows a 10 ⁇ L blood device
  • FIG. 13B shows a 20 ⁇ L blood device. It is a figure which shows the result of having prototyped the plasma separation device, extract
  • the present disclosure relates to a sample separation device including a flow channel tube, and relates to a sample separation device having a liquid level defining portion.
  • a blood cell separation device for separating blood cells from blood and plasma and serum may be described as an example.
  • separating blood is one aspect.
  • the device of the present disclosure can be applied to liquids other than blood. For this reason, it should be noted that it may be referred to as a sample separation device.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a schematic configuration example of a centrifuge 10 used in an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 1A is a diagram showing the appearance of the centrifuge 10.
  • the centrifuge 10 includes a housing 11 and a rotor 13 that is accommodated in the housing 11 and rotates about a rotating shaft 12 (see FIG. 1A).
  • FIG. 1B is a diagram showing the appearance of the rotor 13 of the centrifuge 10.
  • FIG. 1C is a diagram illustrating a state before a centrifugal force is applied to the sample separation device 100.
  • FIG. 1D is a diagram showing a state when a centrifugal force is applied to the sample separation device 100.
  • the rotor 13 in FIG. 1 is a swing-type rotor, and includes a rotating shaft 12, a rotating plate 21 connected to the rotating shaft 12, and a plurality of movable buckets 22 provided on the rotating plate 21. (See FIG. 1B).
  • Each of the movable buckets 22 holds the sample separation device 100 and is configured to be rotatable about a support shaft (not shown).
  • the bucket 22 is substantially perpendicular to the turntable 21 (see FIG. 1B), and when the rotor 13 rotates, each bucket tip 221 gradually becomes horizontal due to centrifugal force (see FIG. 1). 1C).
  • the height at which the bucket tip 221 is lifted depends on the strength of the centrifugal force.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a schematic configuration example of the rotor 13 according to another embodiment of the centrifuge 10.
  • FIG. 2A is a diagram illustrating an appearance of the rotor 13 according to another embodiment.
  • the rotor 13 in FIG. 2 is an angle-type rotor, and includes a rotary shaft 12, a rotary disc 21 connected to the rotary shaft 12, and a plurality of buckets 22 provided on the rotary disc 21 (see FIG. 2). 2A). Each bucket 22 holds the sample separation device 100.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a configuration example of the sample separation device 100 according to the embodiment of the present disclosure.
  • 3A to 3D show a process before the introduced blood (sample) is separated into blood cell components.
  • the sample separation device 100 includes a U-shaped channel, and the width of the right channel 102 is wider (thickness, diameter, or The cross-sectional area is large).
  • the channel size is made different at the substantially central portion of the U-shaped channel, but it is not necessary to be the central portion, and it is more on the left side (closer to the sample inlet 103 On the right side (closer to the liquid component collection port 104 after separation).
  • FIG. 4 is a flowchart for explaining a sample separation procedure. Each step of the blood cell separation procedure will be described with reference to FIGS.
  • Step 401 As shown in FIG. 3B, a certain amount of blood (sample) 105 is introduced from the sample introduction port 103 on the left side of the flow path.
  • the amount of blood 105 to be introduced is determined in advance by, for example, the tube (flow path) size of the sample separation device 100.
  • Step 402 The sample separation device 100 introduced with blood is set in the rotor 13 shown in FIG. 1 or FIG. At this time, the sample separation device (U-shaped channel) 100 is arranged so that the bottom surface thereof is on the bottom surface side of the bucket 22.
  • Step 403 The rotor 13 of the centrifuge 10 is rotated.
  • a centrifugal force is applied to the sample separation device 100 in the bottom direction of the U-shaped channel.
  • the blood moves to the lower side of the U-shaped channel, and the upper surface of the blood is positioned at the same height in the left and right channels. Since the right channel width is wider, more blood is present in the right channel.
  • Step 404 The rotational speed of the rotor 13 of the centrifuge 10 is increased to further increase the centrifugal force. Then, as shown in FIG. 3D, the blood cell 106 and the plasma 107 and 108 are separated, and the interface between the blood cell and the plasma is positioned at the same height in the left and right flow paths.
  • Step 405 The rotation of the rotor 13 of the centrifuge 10 is stopped. Since the right channel width is wider, more plasma 108 is present in the right channel. After stopping the rotation, the plasma 108 present in the right channel is collected and used for analysis.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a configuration example of a blood cell separation device 201 using an asymmetric U-shaped channel (J-shaped channel) according to the first embodiment.
  • FIG. 5A is a diagram illustrating an external configuration example of the blood cell separation device 201.
  • FIG. 5B is a view showing a cross section of the blood cell separation device 201.
  • FIG. 5A a flow path is formed in the blood cell separation device 201, and a straight tube portion 203 that is thicker than the thin tube portion 202 is connected to a J-shaped thin tube portion 202.
  • the J-shape is considered in consideration of the ease of collecting plasma after blood cell separation.
  • one end of the thin tube portion 202 is called a blood inlet 204 and one end of the straight tube portion is called a plasma collection port 205.
  • FIG. 6 is a diagram showing a blood cell separation procedure using the blood cell separation device 201. Each step of blood cell separation will be described with reference to FIGS.
  • Step 401 blood 301 is introduced from the blood inlet 204.
  • FIG. 6A shows a case where blood is introduced until the capillary portion 202 is filled by capillary force.
  • the amount of blood 301 to be introduced varies as appropriate. Note that a certain amount of blood 301 may be introduced by a syringe or the like.
  • Step 402 A blood cell separation device 201 into which blood 301 has been introduced is set in the rotor 13 of the centrifuge 10.
  • the blood cell separation device 201 is set in a horizontal state.
  • the swing-type rotor 13 shown in FIG. 2 is adopted, the blood cell separation device 201 is placed in the bucket 22 with the downward direction in FIG. 6 facing downward (in a direction perpendicular to the rotary disk 21 of the rotor 13). set.
  • Step 403 The rotor 13 of the centrifuge 10 is rotated.
  • the centrifugal force may be applied by rotation equivalent to 500 g.
  • a centrifugal force is applied to the blood cell separation device 201 in the downward direction in the drawing of FIG.
  • the blood moves in the flow path by the centrifugal force, and the blood is introduced into the straight tube portion 203 as shown in FIG. 6B.
  • the upper surfaces of the blood in the narrow tube portion 202 and the straight tube portion 203 are substantially matched.
  • Step 404 In the state of step 403 (see FIG. 6B), the rotational speed of the rotor 13 is increased and the centrifugal force is increased (for example, equivalent to 1,100 g). Then the blood begins to separate.
  • Step 405 The rotation of the rotor 13 of the centrifuge 10 is stopped. Then, as shown in FIG. 6C, the blood is clearly separated into blood cells 302 and plasmas 303 and 304.
  • the blood cell 302 and the plasma 303, 304 are separated in both the narrow tube portion 202 and the straight tube portion 203. Since the cross-sectional area of the straight tube portion 203 is larger than the cross-sectional area of the thin tube portion 202, more blood exists in the right straight tube portion 203 in the state of FIG. 6B. Therefore, even in the state of FIG. 6C after separation, more plasma 304 is present on the right straight tube portion 203 side.
  • FIG. 6D shows a state where the separated plasma 304 is dispensed by the probe 305.
  • the probe 305 is connected to a liquid transport mechanism (not shown) such as a syringe pump.
  • a liquid transport mechanism such as a syringe pump.
  • the probe 305 is inserted into the straight tube unit 203 using a robot (not shown), and the plasma 304 is aspirated by a syringe pump (not shown). Then, the probe 305 is inserted into a separately prepared measurement cell, and the aspirated plasma is discharged. At that time, it is necessary to correctly recognize the liquid level of plasma 304 and the separation plane of plasma 304 and blood cell 302.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a method for manufacturing the blood cell separation device 201.
  • a member composed of a straight straight tube portion 401 and a thin tube portion 402 is prepared (see FIG. 7A).
  • the straight tube portion 401 and the thin tube portion 402 can be formed of a plastic tube such as polycarbonate.
  • the thin tube portion 402 is bent into a J shape (see FIG. 7B).
  • FIG. 7B By mounting on the rotor 13 in the state of FIG. 7B, a device having substantially the same effect as the blood cell separation device 201 of FIG. 5 is obtained.
  • the straight tube portion 401 and the thin tube portion 402 may be joined by melting one of the tubes with heat, or joined using an adhesive made of the same material as the tube. Also good.
  • a blood cell separation device may be formed by changing the shape of one tube.
  • the thin tube portion 402 may be formed by heating the tip of a tube constituting the straight tube portion 401 and extending the tube, or by expanding the tip of the tube constituting the thin tube portion 402. It may be formed. However, in this case, there is no joined portion between the straight tube portion 401 and the thin tube portion 402, but an inclination is formed at a portion where the straight tube portion 401 transitions to the thin tube portion 402.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of producing the device shown in FIG. 5 and performing plasma separation according to the procedure shown in FIG.
  • 20 ⁇ L of blood was introduced from the introduction port and 1100 g was applied for 10 minutes with a centrifugal separator, it was separated into blood cells and plasma as shown in FIG.
  • the plasma levels would coincide on the left and right sides of the flow path.
  • the liquid level on the narrow side of the J-shaped channel increased. This was assumed to be due to capillary forces. In the case of hydrophilicity, the capillary force increases as the diameter decreases, so that the liquid level on the narrow side rises until the difference in gravity is balanced between the right and left channels.
  • the relationship between the liquid volume and the liquid surface height was examined using an aqueous solution sample. 10-30 ⁇ L of pure water was added to the plasma separation device and observed (FIG. 9). In any amount, the liquid surface on the small diameter side was positioned higher than the liquid surface on the large diameter side, and the difference was 16.8 ⁇ 1.1 mm.
  • the rise of the liquid due to the capillary force in the capillaries is given by the following equation. Assuming that the liquid rising height h is a contact angle ⁇ (an angle formed by a liquid surface rising due to surface tension and a horizontal plane), a surface tension T, a tube diameter r, a liquid density ⁇ , and a gravitational acceleration g, Equation 1 become.
  • the difference in the height of rising on the small diameter side and the large diameter side is the height of the rising on the small diameter side.
  • the calculated value was 16.0 mm. Since the experimental results agreed with each other within the error range, it was concluded that the liquid rise was caused by capillary force.
  • the diameter of the pipe In order to suppress the rising of the liquid due to the capillary force, the diameter of the pipe should be increased at the location where it is desired to suppress the rising. This is hereinafter referred to as a diameter changing portion (liquid level defining portion).
  • a diameter changing portion liquid level defining portion
  • This structure is similar to the capillary stop valve often used in rotary cartridges, but its function is different.
  • the liquid flowing from the small diameter side stops due to the interfacial tension at the location where the diameter changes. Once the interfacial tension is overcome by applying a centrifugal force or the like and the liquid flows once, the interfacial tension is lost and the function as a valve is lost.
  • the device according to the present disclosure uses the balance between gravity and capillary force, and does not use the interfacial tension at the diameter changing portion.
  • the device after introducing blood into the device and centrifuging it, the device is placed vertically, and gravity acts on the liquid in the downward direction of the device, while the capillary force of the device capillaries acts on the liquid to raise the liquid. Try to. Since the gravity and the capillary force are balanced, the function of preventing the liquid from rising is maintained even if the liquid once flows and the surface of the flow path in the diameter change portion gets wet and the interface tension is lost. Therefore, there exists an advantage which may introduce
  • the diameter changing portion is formed by bending about 90 degrees (not a gradual change but a sudden change in diameter), but FIG. 19B and FIG. As described above, it may be an obtuse bend or a continuous bend (gradual change). As described above, unlike the capillary stop valve that uses the interfacial tension at the location where the diameter changes, the liquid surface position is controlled by reducing the capillary force and balancing with gravity by increasing the diameter.
  • FIG. 19 shows the features of this method.
  • a plasma separation device was produced in which the diameter of the small-diameter side channel was discontinuously increased to 1.7 mm, and plasma separation was performed under the same conditions (FIG. 10). Although the liquid surface on the small diameter side was positioned higher than the liquid surface on the large diameter side, the rising of the liquid surface on the small diameter side stopped at the point where the pipe became thick. The amount of plasma separated was 2.1 ⁇ L on the small diameter side and 7.7 ⁇ L on the large diameter side. The amount of plasma increased on both the left and right as compared with the case where there was no diameter change part. This is because the disturbance of the plasma separation interface is reduced by suppressing the rising of the liquid at the diameter changing portion.
  • the device shown in FIG. 10 is designed to process 20 ⁇ L of blood (example).
  • Plasma separation was performed using a plasma separation device having a diameter change part designed for a blood volume of 10 ⁇ L (FIG. 11).
  • the rise of plasma is suppressed by the diameter changing portion.
  • the obtained plasma volume was 1.2 ⁇ 0.1 ⁇ L on the small diameter side and 3.9 ⁇ 0.4 ⁇ L on the large diameter side.
  • the height of the interface between plasma and blood cells did not match between the small diameter side and the large diameter side, and the large diameter side was located higher.
  • the device of FIG. 11 is designed to process 10 ⁇ L of blood (example).
  • the volume ratio of blood cells to plasma was 1: 1. Therefore, the interface between blood cells and plasma was 1.05 ⁇ L on the left side from the reference position and 3.85 ⁇ L on the right side from the reference position. Appears at the position of. On the left side from the reference position, the interface is located at the middle point because the thickness of the tube is constant.On the right side from the reference position, the interface is located on the larger diameter side than the middle because there are a small diameter part and a large diameter part. . Therefore, the interface is located higher on the large diameter side than on the small diameter side.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of a device that enables this. Make use of the fact that the plasma outlet has a large diameter part and a small diameter part, and make sure that the interface comes to the small diameter part. By doing so, it is possible to always collect only plasma only by arranging the probe slightly above the site where the diameter changes and aspirating the prescribed amount.
  • One point of device configuration is to prevent liquid from rising due to the diameter changing portion. If the flow volume below the height of the diameter changing portion is the collected blood volume, the liquid level at the plasma outlet is always the height of the diameter changing portion. Accordingly, the amount of liquid present in the large diameter portion of the plasma outlet is always constant, and it is not necessary to measure the liquid level when collecting with the probe.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of a plasma separation device.
  • FIG. 13A is for 10 ⁇ L of blood and
  • FIG. 13B is for 20 ⁇ L of blood.
  • a blood collection part also referred to as a liquid collection part
  • a liquid level regulation part diameter changing part
  • a separation part A a separation part B
  • a separation part C a separation part C
  • a plasma extraction part are defined. Since the liquid level defining portion has a horizontal cross section smaller than that of the separating portion A (gravity is applied from the top to the bottom of the drawing), the rising of the liquid stops near the connecting portion between the liquid level defining portion and the separating portion A.
  • the separation part B Assuming that the volume of blood cells after centrifugation in the whole blood is ⁇ , if B and C are set so as to satisfy the relationship (B + C) ⁇ ⁇ ⁇ B, the separation surface of blood cells and plasma is located in the separation part B. In the plasma extraction part, only plasma is present. According to the plasma separation model, the separation part A, the separation part B, and the separation part C cause plasma separation independently. Therefore, the blood cell volume after centrifugation is (B + C) ⁇ ⁇ on the separation part B and separation part C side. It becomes. If this value is the same as or smaller than B, the blood cells are contained in the separation part B, and only the supernatant plasma exists in the separation part C.
  • FIGS. 14B and 14D show a state where separation is performed by applying centrifugal force. As shown in FIGS. 14B and 14D, the separation interface was accommodated in the separation part B. When a specified amount of plasma was collected from the plasma extraction part with a probe, only plasma could be recovered.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating a configuration example of the blood cell separation device 1401 according to the second embodiment. Similar to the first embodiment (FIG. 5), the blood cell separation device 1401 is connected to the J-shaped narrow tube portion 1402 and the thin tube portion 1402, and is connected to the narrow tube portion 1402 and is thicker (having a larger cross-sectional area) 1403 It is equipped with. However, the difference from the first embodiment is that the horizontal cross section of the straight pipe portion 1403 has an elliptical shape.
  • the straight pipe part 1403 is an ellipse
  • various shapes are adopted. be able to.
  • the thickness of the flow path of the thin tube portion 1502 and the straight tube portion 1503 as viewed from the direction of the arrow X may be constant, or the U-shaped portion of the thin tube portion 1502 may be bent at a right angle. .
  • FIG. 16 is a diagram illustrating a configuration example of the blood cell separation device 1601 according to the third embodiment. Similar to the first embodiment (FIG. 2), the blood cell separation device 1601 includes a J-shaped narrow tube portion 1602, a straight tube portion 1603 connected to the thin tube portion 1602, and thicker (having a larger cross-sectional area) than the thin tube portion 1602. And a depression 1604 for connecting the capillary blood collection tube 1605 to the blood cell separation device 1601. A capillary blood collection tube 1605 can be detachably attached (set) to the recess 1604. That is, in the state where the capillary blood collection tube 1605 is set, substantially the same configuration and function as the blood cell separation device 201 according to the first embodiment (FIG. 2) can be exhibited.
  • FIG. 17 is a diagram showing a configuration example of a blood analyzer.
  • the blood analyzer includes, for example, a drive unit and a control unit.
  • the drive unit includes a centrifuge, a sample nozzle, a measurement cell, a reagent nozzle, and a reagent storage unit.
  • FIG. 18 is a diagram showing an example of a measurement flow using the blood analyzer shown in FIG.
  • a sample separation device in which the sample is introduced into the centrifuge is set (step 1801). Centrifugal force is applied to the sample separation device with a centrifuge to separate plasma into a plasma extraction part (step 1802). Plasma is collected from the plasma extraction portion of the sample separation device using the sample nozzle (step 1803).
  • FIG. 13 when the blood cell / plasma interface is located below the plasma extraction part, only the plasma can be collected from the plasma extraction part without worrying about the position of the blood cell / plasma interface. . Then, a certain amount of the collected plasma is discharged into the measurement cell (step 1804).
  • the reagent is collected using the reagent nozzle (step 1805), and a predetermined amount is discharged to the measurement cell (step 1806).
  • a reaction is caused by mixing the reagent and the sample (plasma), and the generated reaction is measured by some means such as optical or electrical (the configuration used for the measurement is not shown), and the concentration of the substance corresponding to the reagent is quantified ( Step 1807).
  • An embodiment of the present disclosure is a sample separation device used to introduce a sample to be separated into the inside, centrifuge, and collect a desired liquid after separation,
  • a sample introduction part blood collection part for introducing a sample to be separated into the sample separation device;
  • a liquid level regulating part diameter changing part) connected to the sample introduction part,
  • a first separation unit (separation unit A) connected to the liquid level regulation unit;
  • a second separation unit (separation unit B) connected to the first separation unit;
  • a tubular channel is formed by at least the first separation part and the second separation part,
  • the opening of the sample introduction part and the opening of the liquid extraction part face the same direction,
  • the first separation unit is configured such that gravity and a capillary force generated in a direction opposite to the gravity act on the sample after separation,
  • the sample separation device having such a configuration, it is possible to avoid a situation in which the amount of the sample after separation (for example, plasma) that can be taken out after sample separation rises and does not reach the desired amount. It becomes like this.
  • the sample separation device since the opening of the sample introduction part and the opening of the liquid extraction part face the same direction, the sample separation device is in a substantially vertical state (in FIG. 13, the blood collection part is on and the separation parts A and B are It is a premise that it is set in the centrifuge in a state of being below. That is, the sample separation device is not used in a horizontal state (in FIG. 13, the blood collection unit, the liquid level regulation unit, the separation unit A to C, the state where the plasma extraction unit is placed at the same height), The device is used so that gravity acts on the sample accommodated in the separation part (flow path) of the device.
  • the horizontal cross-sectional area of the connection portion between the second separation portion and the third separation portion is the smallest in the third separation portion.
  • the maximum value of the horizontal cross-sectional area of the liquid level defining portion is equal to or greater than the minimum value of the horizontal cross-sectional area of the third separation portion (see FIG. 13).
  • the third separation unit constitutes a part of the liquid extraction unit, and a portion of the liquid extraction unit from the connection with the second separation unit to the height of the liquid level of the sample after separation. Accounted for. At this time, the height of the lowermost part of the liquid level defining part is located between the uppermost part and the lowermost part of the liquid extraction part. Furthermore, the height of the lowermost part of the liquid level defining part is the same as the height of the liquid level of the sample after separation, which is the uppermost part of the third separation part.
  • the sample separation device when the capacity of the sample introduction part is V, the capacity of the first separation part is A, the capacity of the second separation part is B, and the capacity of the third separation part is C, A + B + C is V It is comprised so that it may become substantially equal.
  • a U-shaped or J-shaped flow path is formed by at least the first separation portion and the second separation portion.
  • the sample to be treated is, for example, blood, and the sample after separation taken out from the liquid extraction unit at this time is plasma.
  • the blood cell volume ratio is ⁇
  • ⁇ it is desirable that (B + C) ⁇ ⁇ ⁇ B.
  • ⁇ is 0.518, 0.57, 0.62, or 0.67.
  • the liquid level defining part may be configured such that the horizontal cross-sectional area gradually decreases from at least a part of the liquid level defining part to the lowest part thereof.
  • the present embodiment also discloses a sample separation method in which a sample to be separated is introduced into a sample separation device, centrifuged, and a desired liquid after separation is collected.
  • the sample separation method is: A sample introduction unit for introducing a sample to be separated into the sample separation device, a liquid level defining unit connected to the sample introduction unit, a first separation unit connected to the liquid level defining unit, and a first separation unit A second separation part, a third separation part connected to the second separation part, and a liquid take-out part including the third separation part and connected to the third separation part.
  • the horizontal cross-sectional area is larger than the horizontal cross-sectional area of the first separation part, and at least the first separation part and the second separation part form a tubular flow path, and the opening of the sample introduction part and the opening of the liquid extraction part are: Preparing a sample separation device facing in the same direction, and introducing the sample into the sample introduction unit; Installing the sample separation device into which the sample has been introduced in the centrifuge so that the opening of the sample introduction part and the opening of the liquid extraction part are directed in the direction opposite to the direction of gravity action; Operating the centrifuge and applying a centrifugal force to the sample separation device; Stopping the application of centrifugal force by the centrifuge; In the state where the posture of the sample separation device is in a direction parallel to the rotation axis of the centrifuge, in the first separation unit, gravity and a capillary force generated in a direction opposite to the gravity are applied to the separated sample; , Reducing the action of the capillary force on the sample after separation at the bottom of the liquid level
  • Sample separation device 101 Left channel 102 Right channel 103 Sample inlet 104 Sample port for collecting liquid components after separation

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Abstract

遠心分離後の対象液体成分をより多く採取することを可能にする技術を提供する。本実施形態による試料分離デバイスは、内部に分離対象の試料を導入し、遠心分離し、分離後の所望の液体を採取するのに用いられる試料分離デバイスであって、分離対象の試料を試料分離デバイスに導入する試料導入部と、試料導入部と接続された液面規定部と、液面規定部と接続された第１分離部と、第１分離部と接続された第２分離部と、第２分離部と接続された第３分離部と、第３分離部を含み、第３分離部と接続されている液体取出部と、を備え、少なくとも第１分離部と第２分離部とによって管状流路が形成され、試料導入部の開口と液体取出部の開口とは、同一方向を向いており、第１分離部は、分離後の試料には重力と当該重力とは反対方向に生じる毛管力とが作用するように構成され、液面規定部の水平断面積は、第１分離部の水平断面積よりも大きく、分離後の試料が毛管力によって液面規定部の最下部に到達したときに分離後の試料に対する毛管力の作用を低下させるように構成される（図１３）。

Description

試料分離デバイス、及び試料分離方法
　本開示は、試料分離デバイス、及び試料分離方法に関する。
　血液検査は、血液成分の定量的・定性的な検査および分析であり、病院での診断や定期健康診断などに活用されている。血液検査の一部である生化学検査や免疫検査では、血液から血球成分を除いた血漿もしくは血清といわれる液体成分を試料として分析を行う。そのため、これらの検査では血球と血漿もしくは血清を分離する血球分離手順が存在する。
　一般的に、検査室で行われる血球分離では、数ｍＬの血液が入った採血管を遠心分離する方法が主流となっている。血球の比重が血漿・血清の比重よりも大きいため、血球が下部に、血漿・血清が上部に分離される。なお、分離状態をよくするため、比重が血球と血漿・血清の中間である分離剤を用いることがある。
　また、Point-Of-Care Testing (POCT)と言われる患者の目の前もしくは近くの検査では、カートリッジを用いた血液検査が行われることがある。その際、カートリッジ内で遠心分離を行い、血球分離をすることがある。例えば、特許文献１では、Ｕ字型の流路を用いて遠心分離を行い、得られた血漿を分析に用いている。
特開２００８－１８０５４３号公報
　しかしながら、特許文献１のＵ字型の流路を用いた遠心分離による血球分離では、Ｕ字型流路の左右でほぼ等しい量の血漿が分離され、その一方のみが分析に用いられる。このため、結果として精製された血漿の半分の量しか分析に用いることができず、より多くの血漿を分析対象として採取できることが望まれる。
　本開示はこのような状況に鑑みてなされたものであり、遠心分離後の対象液体成分をより多く採取することを可能にする技術を提供するものである。
　上記課題を解決するために、本開示は、例えば請求の範囲に記載の構成を採用する。本明細書は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例を挙げるならば、本開示による試料分離デバイスは、内部に分離対象の試料を導入し、遠心分離し、分離後の所望の液体を採取するのに用いられる試料分離デバイスであって、
　分離対象の試料を試料分離デバイスに導入する試料導入部と、
　試料導入部と接続された液面規定部と、
　液面規定部と接続された第１分離部と、
　第１分離部と接続された第２分離部と、
　第２分離部と接続された第３分離部と、
　第３分離部を含み、第３分離部と接続されている液体取出部と、を備え、
　少なくとも第１分離部と第２分離部とによって管状流路が形成され、
　試料導入部の開口と液体取出部の開口とは、同一方向を向いており、
　第１分離部は、分離後の試料には重力と当該重力とは反対方向に生じる毛管力とが作用するように構成され、
　液面規定部の水平断面積は、第１分離部の水平断面積よりも大きく、分離後の試料が前記毛管力によって液面規定部の最下部に到達したときに分離後の試料に対する毛管力の作用を低下させるように構成される、試料分離デバイスである。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
　本開示によれば、遠心分離後の対象液体成分を血球の混入を抑制して簡便に採取することが可能となる。
本開示の実施形態で用いられる遠心分離機１０の概略構成例を示す図である。図１Ａは、遠心分離機１０の外観を示す図である。図１Ｂは、遠心分離機１０のローター１３の外観を示す図である。 遠心分離機１０の別形態によるローター１３の概略構成例を示す図である。図２Ａは、当該別形態のローター１３の外観を示す図である。 本開示の実施形態による試料分離デバイス１００の構成例を示す図である。図３Ａ～図３Ｄは、導入した血液（試料）が各血球成分に分離される前の過程を示している。 試料分離の手順を説明するためのフローチャートである。 実施例１に係る非対称Ｕ字型流路（Ｊ字型流路）を用いた血球分離デバイス２０１の構成例を示す図である。図５Ａは血球分離デバイス２０１の外観構成例を示す図である。図５Ｂは、血球分離デバイス２０１の断面を示す図である。 血球分離デバイス２０１を用いた血球分離の手順を示す図である。 血球分離デバイス２０１の製造方法の一例を示す図である。 図５のデバイスを試作し、図６の手順で血漿分離を行った結果を示す図である。 １０～３０μＬの純水を血漿分離デバイスに添加し、液量と液面高さの関係を調べた結果を示す図である。 ２０μＬの血液用に、小径側流路の太さを非連続的に１．７ｍｍに太くした血漿分離デバイスを作製し、同様の条件で血漿分離を行った結果を示す図である。 血液量１０μＬ向けに設計した径変化部を有する血漿分離デバイスを用いて、血漿分離を行った結果を示す図である。 遠心力による血球の沈降が非対称Ｕ字型流路の左右で独立して生じるとの過程で、界面の高さが小径側と大径側で不一致となる現象を説明するための図である。 血漿分離デバイスの例を示す図である。図１３Ａは１０μＬの血液用デバイス、図１３Ｂは２０μＬの血液用デバイスである。 血漿分離デバイスを試作し、１０μＬもしくは２０μＬの血液を採取し、遠心分離を行った結果を示す図である。 実施例２に係る血球分離デバイス１４０１の一構成例を示す図である。 実施例３に係る血球分離デバイス１６０１の一構成例を示す図である。 血液分析装置の一構成例を示す図である。 図１７で示す血液分析装置を用いた測定フローの一例を示す図である。 径が変化する箇所での界面張力を用いているキャピラリーストップバルブとは異なり、径が太くなることで毛管力を低下させて重力と均衡させることで液面の位置を制御する本方法の特徴を示す図である。
　本開示は、流路管で構成される試料分離デバイスであって、液面規定部を有する試料分離デバイスに関する。
　以下、添付図面を参照して本開示の実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本開示の原理に則った具体的な実施形態と実装例を示しているが、これらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。
　本実施形態では、当業者が本開示を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本開示の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
　なお、以下に説明する実施形態や実施例では、血液中の血球と血漿及び血清を分離するための血球分離デバイスを一例として説明することもあるが、血液を分離することは１つの態様であって、本開示のデバイスは血液以外の液体にも適用可能である。このため、試料分離デバイスと称する場合もあることに注意すべきである。
＜遠心分離機の構成＞
（i）全体構成
　図１は、本開示の実施形態で用いられる遠心分離機１０の概略構成例を示す図である。図１Ａは、遠心分離機１０の外観を示す図である。遠心分離機１０は、筺体１１と、筺体１１に収容され、回転軸１２を中心に回転するローター１３と、を備えている（図１Ａ参照）。
　図１Ｂは、遠心分離機１０のローター１３の外観を示す図である。図１Ｃは、試料分離デバイス１００に遠心力を作用させる前の状態を示す図である。図１Ｄは、試料分離デバイス１００に遠心力を作用させているときの状態を示す図である。
　図１のローター１３は、スイング式のローターであり、回転軸１２と、回転軸１２に接続された回転盤２１と、回転盤２１に設けられた複数の可動式バケット２２と、を備えている（図１Ｂ参照）。可動式バケット２２はそれぞれ、試料分離デバイス１００を保持するものであり、支持軸（図示せず）を中心に回転可能なように構成されている。バケット２２は、ローター１３が回転する前、回転盤２１とほぼ垂直の状態にあり（図１Ｂ参照）、ローター１３が回転すると遠心力により徐々に各バケット先端部２２１が水平な状態になる（図１Ｃ参照）。バケット先端部２２１がどのくらいの高さまで持ち上げられるかは遠心力の強さに依存する。
（ii）ローター１３の別の構成例
　図２は、遠心分離機１０の別形態によるローター１３の概略構成例を示す図である。図２Ａは、当該別形態のローター１３の外観を示す図である。
　図２のローター１３は、アングル式のローターであり、回転軸１２と、回転軸１２に接続された回転盤２１と、回転盤２１に設けられた複数のバケット２２と、を備えている（図２Ａ参照）。バケット２２はそれぞれ、試料分離デバイス１００を保持するものである。
＜試料分離デバイス１００の構成＞
　図３は、本開示の実施形態による試料分離デバイス１００の構成例を示す図である。図３Ａ～図３Ｄは、導入した血液（試料）が各血球成分に分離される前の過程を示している。
　図３Ａに示すように、試料分離デバイス１００は、Ｕ字型の流路で構成され、紙面に向かって左側の流路１０１よりも右側の流路１０２の幅が広く（太さ、径、或いは断面積が大きく）なっている。図３Ａに示される試料分離デバイス１００では、Ｕ字型の流路のほぼ中央部で流路サイズを異なるようにしているが、中央部である必要はなく、より左側（試料導入口１０３に近い方）、或いはより右側（分離後の液体成分の採取口１０４に近い方）にサイズが変化する箇所があっても良い。
＜試料（血球）分離の手順＞
　図４は、試料分離の手順を説明するためのフローチャートである。図３及び４を用いて、血球分離の手順の各工程について説明する。
（i）ステップ４０１
　図３Ｂに示すように、流路の左側の試料導入口１０３から一定量の血液（試料）１０５を導入する。導入される血液１０５の量は、例えば、試料分離デバイス１００の管（流路）サイズによって予め決められる。
（ii）ステップ４０２
　血液を導入した試料分離デバイス１００を、図１もしくは図２に示すローター１３にセットする。その際、試料分離デバイス（Ｕ字型流路）１００の底面がバケット２２の底面側に来るように配置する。
（iii）ステップ４０３
　遠心分離機１０のローター１３を回転させる。遠心分離機１０のローター１３を回転させると、試料分離デバイス１００にはＵ字型流路の底面方向に遠心力が加わる。すると、図３Ｃに示されるように、血液はＵ字型流路の下側に移動し、血液上面は左側と右側の流路で等しい高さに位置する。右側の流路幅のほうが広いので、右側の流路により多くの血液が存在する。
（iv）ステップ４０４
　遠心分離機１０のローター１３の回転数を増加させ遠心力をさらに強める。すると、図３Ｄに示されるように、血球１０６と血漿１０７及び１０８が分離し、血球と血漿の界面は左側と右側の流路で等しい高さに位置するようになる。
（v）ステップ４０５
　遠心分離機１０のローター１３の回転を停止させる。右側の流路幅の方が広いので、右側の流路により多くの血漿１０８が存在する。回転を停止させた後、右側の流路に存在する血漿１０８を採取し、分析に用いる。
＜実施例＞
　以下、上述の試料分離デバイス１００の各実施例について説明する。
（１）実施例１
　図５は、実施例１に係る非対称Ｕ字型流路（Ｊ字型流路）を用いた血球分離デバイス２０１の構成例を示す図である。図５Ａは血球分離デバイス２０１の外観構成例を示す図である。図５Ｂは、血球分離デバイス２０１の断面を示す図である。
　図５Ａに示されるように、血球分離デバイス２０１には流路が形成されており、Ｊ字型をした細管部２０２に、細管部２０２より太い直管部２０３が接続されている。Ｊ字型としたのは、血球分離後の血漿の採取し易さを考慮したものである。便宜上、ここでは、細管部２０２の一端を血液導入口２０４と、直管部の一端を血漿採取口２０５と呼ぶこととする。
　図６は、血球分離デバイス２０１を用いた血球分離の手順を示す図である。図４及び６を参照して、血球分離の各工程について説明する。
（i）ステップ４０１
　まず、血液導入口２０４から血液３０１を導入する。図６Ａでは、毛管力により細管部２０２が満たされるまで血液を導入した場合が示されている。ただし、導入する血液３０１の量は適宜変わるものである。なお、血液３０１は、シリンジなどで一定量を導入しても良い。
（ii）ステップ４０２
　遠心分離機１０のローター１３に、血液３０１を導入した血球分離デバイス２０１をセットする。図１に示される遠心分離機１０のローター１３を採用する場合には、血球分離デバイス２０１は水平にした状態でセットされる。一方、図２に示されるスイング式のローター１３を採用する場合には、図６の紙面下方向を下にして（ローター１３の回転盤２１と垂直な方向に）血球分離デバイス２０１をバケット２２にセットする。
（iii）ステップ４０３
　遠心分離機１０のローター１３を回転させる。例えば、５００ｇ相当の回転により遠心力を印加すると良い。血球分離デバイス２０１には、図６の紙面下方向に（ローター１３の回転盤２１と水平な方向に）遠心力が印加される。
　すると、遠心力により血液が流路内を移動し、図６Ｂに示されるように、直管部２０３に血液が導入される。このとき、破線で示したように、細管部２０２と直管部２０３で血液の上面がほぼ一致するようになる。
（iv）ステップ４０４
　ステップ４０３の状態（図６Ｂ参照）でローター１３の回転数を増大させ、遠心力を強める（例えば、１，１００ｇ相当）。すると、血液は分離し始める。
（v）ステップ４０５
　遠心分離機１０のローター１３の回転を停止させる。すると、図６Ｃに示されるように、血液は、血球３０２と血漿３０３及び３０４にはっきりと分離される。
　図６Ｃを参照すると、細管部２０２と直管部２０３の両方で血球３０２と血漿３０３、３０４が分離している。直管部２０３の断面積の方が細管部２０２の断面積よりも大きいので、図６Ｂの状態では右側の直管部２０３の方により多くの血液が存在する。そのため、分離後の図６Ｃの状態でも、右側の直管部２０３の側により多くの血漿３０４が存在することになる。
　図６Ｄは、分離後の血漿３０４をプローブ３０５によって分注する様子を示している。プローブ３０５は、例えばシリンジポンプなどの液体搬送機構（図示せず）に接続されている。例えば、図示しないロボットを用いてプローブ３０５を直管部２０３に挿入し、図示しないシリンジポンプにより血漿３０４を吸引する。そして、プローブ３０５を別途準備した測定セルに挿入し、吸引した血漿を吐出する。その際、血漿３０４の液面と血漿３０４と血球３０２の分離面を正しく認識する必要がある。
　図７は、血球分離デバイス２０１の製造方法の一例を示す図である。まず、まっすぐの形状の直管部４０１と細管部４０２からなる部材を準備する（図７Ａ参照）。直管部４０１及び細管部４０２は、ポリカーボネートなどのプラスティックチューブで構成することが可能である。次に、細管部４０２を曲げ、Ｊ字の形状とする（図７Ｂ参照）。図７Ｂの状態でローター１３に載置することで、実質的に図５の血球分離デバイス２０１と同様の効果を有するデバイスとなる。
　なお、図７では、直管部４０１と細管部４０２とは、何れか一方の管を熱で溶かすことにより接合しても良いし、管と同じ材料でできた接着剤を用いて接合しても良い。また、ここでは、径の異なる２つの管を接合しているが、１つの管の形状を変えることにより、血球分離デバイスを形成しても良い。例えば、直管部４０１を構成する管の先端を加熱し、管を伸ばすことにより細管部４０２を形成しても良いし、細管部４０２を構成する管の先端を膨らますことにより直管部４０１を形成しても良い。ただし、この場合、直管部４０１と細管部４０２の接合部分はないが、直管部４０１から細管部４０２に移行する部分に傾斜が形成されることになる。
　図８は、図５のデバイスを試作し、図６の手順で血漿分離を行った結果を示す図である。導入口から２０μＬの血液を導入し、遠心分離機で１１００ｇを１０分間印加したところ、図８のように血球と血漿に分離した。当初、血漿の液面は流路の左右で一致すると想定していた。しかしながら結果は、Ｊ字型流路の細い側の液面が高くなった。これは、毛管力によると想定された。親水性の場合、毛管力は径が細いほど大きく働くため、流路の左右で重力差と釣り合うまで細い側の液面が上昇する。
　検証のため、水溶液試料を用いて、液量と液面高さの関係を調べた。１０～３０μＬの純水を血漿分離デバイスに添加し観察した（図９）。いずれの量においても、小径側の液面が大径側の液面よりも高く位置し、その差は１６．８±１．１ｍｍであった。細管での毛管力による液のせり上がりは次の式で与えられる。液のせり上がり高さｈは、接触角θ（表面張力による液面の盛り上がりと水平面とがなす角度）、表面張力Ｔ、管直径ｒ、液密度ρ、重力加速度ｇとすると、式１のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　小径側と大径側でのせり上がり高さの差が小径側でのせり上がり高さである。血漿分離デバイスと同じ材質の平板での接触角６６度を用いると、計算値は１６．０ｍｍとなった。実験結果と誤差範囲内で一致したことから、液のせり上がりは毛管力により生じたと結論付けた。
　１１００ｇの遠心力が印加されている状態では、液のせり上がりはほとんど無くなる。これは、式において重力加速度が大きくなるとせり上がり高さが小さくなるためである。すなわち、観測された液のせり上がりは遠心分離終了後に生じたことを示している。遠心分離後の液の移動は血漿分離界面を乱し、分離能の低下をもたらすため、分離能の維持には液のせり上がりを抑制する必要がある。加えて、流路と血液の界面張力の変化によって液のせり上がり量が変化すると大径側の液面高さも変化するため、血漿の回収時に液面高さを考慮する必要が生じ、回収動作を煩雑にしてしまう。
　毛管力による液のせり上がりを抑制するには、せり上がりを抑止したい箇所で管の径を太くすれば良い。ここを以降は径変化部（液面規定部）と呼ぶ。この構造は回転式カートリッジでよく用いられるキャピラリーストップバルブと似ているものの、その働きは異なる。キャピラリーストップバルブでは、小径側から流れてきた液が、径が変化する箇所での界面張力により止まる。遠心力を引加するなどして界面張力に打ち勝ち液が一旦流れると、界面張力は失われるためバルブとしての機能を失う。一方、本開示によるデバイスでは重力と毛管力の均衡を利用したものであり、径変化部での界面張力を利用しているわけではない。つまり、血液をデバイスに導入して遠心分離した後、デバイスを縦にし、液に対してデバイスの下方向に重力が作用する一方、デバイス細管の毛管力が液に作用して液をせり上がらせようとする。この重力と毛管力とが均衡するため、一度液が流れて径変化部における流路表面が濡れて界面張力が失われても液のせり上がりを防止する機能は維持される。そのため、液を径変化部の径が太い側から導入してもよい利点がある。実際、設計したデバイスでは径が太い側から血液を導入する。
　なお、上記実施例では、径変化部は、図１９Ａのように、９０度程度の曲がり（漸次的な変化ではなく径が急に変化）で径変化部を作製したが、図１９Ｂや図１９Ｃのように、鈍角な曲がりであったり、連続的な曲がり（漸次的な変化）であってもよい。前述のように、径が変化する箇所での界面張力を用いているキャピラリーストップバルブとは異なり、径が太くなることで毛管力を低下させて重力と均衡させることで液面の位置を制御する本方法の特徴を、図１９は示している。
　小径側流路の太さを非連続的に１．７ｍｍに太くした血漿分離デバイスを作製し、同様の条件で血漿分離を行った（図１０）。小径側の液面が大径側の液面よりも高く位置したものの、小径側での液面のせり上がりは管が太くなる箇所で止まった。分離された血漿量は小径側で２．１μＬ、大径側で７．７μＬであった。径変化部が無い場合に比べて左右どちらにおいても血漿の量が増加した。これは、径変化部で液のせり上がりを抑制したことで、血漿分離界面の乱れが低減されたためである。なお、図１０に示すデバイスは、２０μＬの血液（例）を処理するために設計されたものである。
　血液量１０μＬ向けに設計した径変化部を有する血漿分離デバイスを用いて、血漿分離を行った（図１１）。径変化部によって血漿のせり上がりが抑制されている。同一形状の４つのデバイスにおいて、得られた血漿量は小径側で１．２±０．１μＬ、大径側で３．９±０．４μＬであった。血漿と血球の界面の高さは小径側と大径側で一致せず、大径側の方が高く位置していた。なお、図１１のデバイスは、１０μＬの血液（例）を処理するために設計されたものである。
　遠心力による血球の沈降が非対称Ｕ字型流路の左右で独立して生じると仮定すると、界面の高さが小径側と大径側で不一致となる現象を説明できる。図１２を用いてその減少について説明する。流路に血液１０μＬを導入した状態で遠心力を鉛直下向きに印加すると、血液の液面は水平方向に左右で一致することから、流路の最下部を基準（基準位置を０としている）にして小径側に２．１μＬ、大径側に７．９μＬの血液が存在した状態となる。遠心力の印加を継続すると、血球が沈降し血漿が分離される。今回実験に用いた血液では血球と血漿の量比は１：１であったことから、血球と血漿の界面は、基準位置から左側に１．０５μＬの位置、および基準位置から右側に３．８５μＬの位置に現れる。基準位置から左側では管の太さが一定のため中間点に界面が位置するのに対し、基準位置から右側では小径部と大径部があるため界面は中間よりも大径部側に位置する。そのため、界面は大径側が小径側に比べて高く位置する。遠心分離後は毛管力によるせり上がりで小径側に液が移動するものの、移動量は遠心分離中の小径側液面とキャピラリーストップバルブの間の容量である２．３μＬ－２．１μＬ＝０．２μＬにすぎない。結論として、小径側の分離界面はキャピラリーストップから１．０５μＬの箇所に位置することが、計算上導かれる。実験結果である小径側の血漿量１．２±０．１μＬと概ね一致した。
　以上の検討により、カートリッジ設計のために重要な２つの発見が得られた。１つは、Ｊ字型流路の小径部側に径変化部を設けることで、毛管力による液のせり上がりを抑制できることである。もう１つは、全血を遠心分離した際に、Ｊ字型流路の左右で独立して分離が生じるという血漿分離モデルである。
　本開示は、一滴の微量血液から血漿を簡便に取り出すことを可能にする技術を提供する。図１１のような血漿分離の場合、血漿を針状のプローブでの採取では、界面の位置を正確に把握した上で精密な動作でプローブを駆動させる必要がある。これが界面の位置を気にすることなくプローブを挿入して吸引するだけでよくなれば、プローブ関係の装置構成を簡素に出来る。図１３はそれを可能にするデバイスの一例を示す図である。血漿取り出し口が大径部と小径部になっていることを利用し、界面が小径部に必ず来るようにする。そのようにすれば、プローブを径が変化する部位より若干上に配置させ、規定量を吸引させるだけで、常に血漿のみを採取することが可能となる。
　デバイス構成の１つのポイントは、径変化部による液せり上がりを防止することである。径変化部の高さより下の流路容量を採取血液容量とすれば、血漿取り出し口での液面が常に径変化部の高さとなる。従って、血漿取り出し口の大径部に存在する液体の量は常に一定となり、プローブでの採取の際に液面を計測する必要が無くなる。
　図１３は、血漿分離デバイスの例を示す図である。図１３Ａは１０μＬの血液向け、図１３Ｂは２０μＬの血液向けである。図１３に示すように、採血部（液体採取部とも呼ぶ）、液面規定部（径変化部）、分離部Ａ、分離部Ｂ、分離部Ｃ、および血漿取り出し部が規定されている。液面規定部は、分離部Ａよりも水平（重力は図面上から下に加わるとする）断面積が小さいため、液のせり上がりは液面規定部と分離部Ａの接続部付近で止まる。分離部Ａ、Ｂ、およびＣの容量をそれぞれ、Ａ、Ｂ、およびＣとし、採血部容量をＶとすると、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＝Ｖとなるように設計すれば、液面規定部と同じ水平面に血漿取出部側の液面が位置するようになる。製造の誤差などによりＡ＋Ｂ＋Ｃ＝Ｖの関係が若干ずれたとしても、図左側の液面が液面規定部と分離部Ａの接続部付近に規定されるので、血漿取出部での液面もほぼ一定となる。その結果、プローブで血漿を採取する際に、血漿液面を検知する必要が無くなる。
　デバイス構成のもう１つのポイントは、Ｊ字型流路での血漿分離モデルに基づき、血漿取出部に血漿のみが分離されるようにした点である。血漿と血球の分離界面は、血球の割合により変化する。この血球の割合はヘマトクリット値と言われ、正常値での最大値は５１．８％である。実際の分離界面は、血球の間に隙間があるため、この値の１割から３割増し程度（１割増し程度の場合：α＝０．５７、２割増し程度の場合：α＝０．６２、３割増し程度の場合：α＝０．６７）になる。すなわち、分離後の血球容量は最大で７０％程度となる。分離界面が必ず血漿取り出し口側の小径部に来るためには、血漿取り出し口側の容積に対して、小径部が７０％とすればよい。
　血液全体に占める遠心分離後の血球の容積をαとすると、（Ｂ＋Ｃ）×α≦Ｂの関係となるようにＢおよびＣを設定すれば、血球と血漿の分離面が分離部Ｂに位置し、血漿取出部は血漿のみが存在するようになる。血漿分離モデルによれば、分離部Ａと分離部Ｂおよび分離部Ｃでは独立して血漿分離が発生するため、分離部Ｂおよび分離部Ｃ側では遠心分離後の血球容量は（Ｂ＋Ｃ）×αとなる。この値がＢと同じか小さければ血球は分離部Ｂ内に収まり分離部Ｃには上澄みの血漿のみが存在することになる。その結果、プローブで血漿を採取する際に、血漿と血球の界面を検知する必要が無くなる。すなわち、図１３のデバイスであれば、プローブを血漿取出部に挿入し容量Ｃと同じか小さい量だけ吸引すれば血漿のみを吸引することが可能であり、プローブによる血漿採取動作を簡便なものにできる。
　血漿分離デバイスを試作し、１０μＬもしくは２０μＬの血液を採取し、遠心分離を行った。図１４Ａおよび図１４Ｃはそれぞれ１０μＬもしくは２０μＬの血液を採取した状態を、図１４Ｂおよび図１４Ｄは遠心力の引加により分離を行った状態を示す。図１４Ｂおよび図１４Ｄのように分離界面が分離部Ｂに収まった。プローブで血漿取出部から血漿を規定量採取したところ、血漿のみを回収できた。
（２）実施例２
　図１５は、実施例２に係る血球分離デバイス１４０１の一構成例を示す図である。血球分離デバイス１４０１は、実施例１（図５）と同様に、Ｊ字型をした細管部１４０２と、細管部１４０２と接続され、細管部１４０２より太い（断面積が大きい）直管部１４０３と、を備えている。ただし、実施例１との違いは、直管部１４０３の水平断面が楕円形状をなしている点である。
　なお、ここでは直管部１４０３の水平断面が楕円形である例を挙げているが、直管部１４０３は、細管部１４０２よりも断面積が大きければ、その形状には様々なものを採用することができる。例えば、図１８のように、細管部１５０２及び直管部１５０３の流路の矢印Ｘ方向から見た厚みが一定であったり、細管部１５０２のＵ字部が直角に折れ曲がっていたりしてもよい。
（３）実施例３
　図１６は、実施例３に係る血球分離デバイス１６０１の一構成例を示す図である。血球分離デバイス１６０１は、実施例１（図２）と同様に、Ｊ字型をした細管部１６０２と、細管部１６０２に接続され、細管部１６０２より太い（断面積が大きい）直管部１６０３と、キャピラリー採血管１６０５を血球分離デバイス１６０１に接続するための窪み１６０４と、を備えている。窪み１６０４には、キャピラリー採血管１６０５を着脱自在に取り付ける（セットする）ことができるようになっている。すなわち、キャピラリー採血管１６０５がセットされた状態で、実質的に実施例１（図２）に係る血球分離デバイス２０１と同様の構成かつ機能を発揮することができるようになっている。
　図１７は、血液分析装置の一構成例を示す図である。血液分析装置は、例えば、駆動部と、制御部とを備えている。駆動部は、遠心分離機と、検体ノズルと、測定セルと、試薬ノズルと、試薬収容部と、を備えている。
　図１８は、図１７で示す血液分析装置を用いた測定フローの一例を示す図である。遠心分離機に試料を導入した試料分離デバイスをセットする（ステップ１８０１）。遠心分離機で試料分離デバイスに遠心力を印加し、血漿を血漿取出部に分離する（ステップ１８０２）。検体ノズルを用いて試料分離デバイスの血漿取出部から血漿を採取する（ステップ１８０３）。ここで、図１３に示すように血球と血漿の界面が血漿取出部よりも下部に位置している場合、血球と血漿の界面の位置を気にすることなく血漿取出部から血漿のみを採取できる。そして、採取した血漿を測定セルに一定量吐出する（ステップ１８０４）。試薬ノズルを用いて試薬を採取し（ステップ１８０５）、測定セルに一定量吐出する（ステップ１８０６）。試薬と検体（血漿）の混合により反応が生じ、生じた反応を光学的もしくは電気的など何らかの手段で測定し（測定に用いる構成は図示せず）、試薬に対応する物質の濃度を定量する（ステップ１８０７）。なお、遠心分離機の替わりに試料分離デバイス配置部を備えてもよく、その場合、本装置以外で遠心分離を行ったものを試料分離デバイス配置部に配置する。
＜まとめ＞
（i）本開示による試料分離デバイスを用いて試料（例えば、血液）を各液体成分（血球、血漿、及び血清）に分離すれば、試料の上面が遠心力の働く方向に垂直な面となるため、断面積の大きな流路側により多くの液体成分が集まることになる。その結果、断面積の大きな流路側に半分以上の所望の液体成分（例えば、血漿）を溜めることができる。この断面積の大きな側で得られた所望の液体成分（血漿）を分析に用いることで、従来法よりも多くの所望の液体成分（血漿）を分析に用いることができるようになる。結果として、必要な試料（血液）の量を低減することができ、ひいては試料を提供する者（血液を採取される患者など）の負担を軽減することできるようになる。
（ii）本開示の実施形態は、内部に分離対象の試料を導入し、遠心分離し、分離後の所望の液体を採取するのに用いられる試料分離デバイスであって、
　分離対象の試料を前記試料分離デバイスに導入する試料導入部（採血部）と、
　試料導入部と所接続された液面規定部（径変化部）と、
　液面規定部と接続された第１分離部（分離部Ａ）と、
　第１分離部と接続された第２分離部（分離部Ｂ）と、
　第２分離部と接続された第３分離部（分離部Ｃ）と、
　第３分離部を含み、第３分離部と接続されている液体取出部（血漿取出部）と、を備え、
　少なくとも第１分離部と第２分離部とによって管状流路が形成され、
　試料導入部の開口と前記液体取出部の開口とは、同一方向を向いており、
　第１分離部は、分離後の試料には重力と当該重力とは反対方向に生じる毛管力とが作用するように構成され、
　液面規定部の水平断面積は、第１分離部の水平断面積よりも大きく、分離後の試料が前記毛管力によって前記液面規定部の最下部に到達したときに前記分離後の試料に対する前記毛管力の作用を低下させるように構成される、試料分離デバイスについて開示する。このような構成を有する試料分離デバイスを用いることにより、試料分離後に試料がせり上がってしまって取り出せる分離後試料（例えば、血漿）の分量が所望の量に満たないという事態を回避することができるようになる。なお、試料導入部の開口と前記液体取出部の開口とは、同一方向を向いているため、当該試料分離デバイスはほぼ垂直な状態（図１３において、採血部が上で分離部ＡおよびＢが下となる状態）で遠心分離機にセットされることが前提である。つまり、当該試料分離デバイスは水平状態（図１３において、採血部、液面規定部、分離部ＡからＣ、血漿取出部が同一の高さに置かれた状態）にして用いられるのではなく、当該デバイスの分離部（流路）に収容される試料に重力が作用するように当該デバイスは使用される。
　また、本実施形態による試料分離デバイスでは、第２分離部と第３分離部との接続部の水平断面積が第３分離部において最小となっている。また、液面規定部の水平断面積の最大値が第３分離部の水平断面積の最小値以上となっている（図１３参照）。このようにすることにより、第２分離部と第３分離部との接続部に毛管力を作用させることができ、第１分離部に作用する毛管力の影響によって第３分離部から第２分離部に引き込まれる分離後試料の量を減少させることが可能となる。
　図１３からも分かるように、第３分離部は、液体取出部の一部を構成し、液体取出部において、第２分離部との接続部から分離後の試料の液面の高さまでの部分を占めている。また、このとき、液面規定部の最下部の高さは、液体取出部の最上部と最下部との間に位置している。さらに、液面規定部の最下部の高さは、第３分離部の最上部である分離後の試料の液面の高さと同じとなっている。このため、試料分離デバイスは、試料導入部の容量をＶ、第１分離部の容量をＡ、第２分離部の容量をＢ、第３分離部の容量をＣとしたとき、Ａ＋Ｂ＋ＣがＶとほぼ等しくなるように構成されている。このような関係（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＝Ｖ）が満足するように試料分離デバイスを構成することにより、分離後試料のせり上がりを液面規定部の最下部と第１分離部との接続部付近で止めることが可能となる。
　当該試料分離デバイスにおいて、少なくとも第１分離部と第２分離部とによってＵ字形状或いはＪ字形状の流路が形成されるようにすることが好ましい。
　処理対象の試料は例えば血液であり、このとき液体取出部から取り出される分離後の試料は、血漿である。そして、血球容積率をαとしたとき、（Ｂ＋Ｃ）×α≦Ｂであることが望ましい。ここで、αは、０．５１８、０．５７、０．６２、あるいは０．６７である。このようにすることにより、血球と血漿の分離面を第３分離部に位置させることができ、血漿取出部から血漿のみを取り出すことができるようになる。
　なお、第３分離部を、第３分離部と第２分離部との接続部に向かって水平断面積が漸次的に減少するように構成するようにしてもよい。また、液面規定部を、少なくとも液面規定部の一部からその最下部まで水平断面積が漸次的に減少するように構成するようにしてもよい。
（iii）本実施形態は、試料分離デバイスの内部に分離対象の試料を導入し、遠心分離し、分離後の所望の液体を採取する試料分離方法も開示する。当該試料分離方法は、
　分離対象の試料を試料分離デバイスに導入する試料導入部と、試料導入部と接続された液面規定部と、液面規定部と接続された第１分離部と、第１分離部と接続された第２分離部と、第２分離部と接続された第３分離部と、第３分離部を含み、第３分離部と接続されている液体取出部と、を備え、液面規定部の水平断面積が、第１分離部の水平断面積よりも大きく、少なくとも第１分離部と第２分離部とによって管状流路が形成され、試料導入部の開口と液体取出部の開口とは、同一方向を向いている、試料分離デバイスを用意し、試料導入部に前記試料を導入することと、
　試料を導入した前記試料分離デバイスを、試料導入部の開口と液体取出部の開口が重力作用方向とは逆方向に向くように、遠心分離機に設置することと、
　遠心分離機を動作させ、試料分離デバイスに遠心力を印加することと、
　遠心分離機による遠心力の印加を停止することと、
　試料分離デバイスの姿勢を遠心分離機の回転軸と平行な方向にした状態で、第１分離部において、分離後の試料に重力と当該重力とは反対方向に生じる毛管力とを作用させることと、
　液面規定部の最下部において分離後の試料に対する前記毛管力の作用を低下させることと、
　液体取出部から、分離後の試料を取り出すことと、を含んでいる。
１００　試料分離デバイス
１０１　左側の流路
１０２　右側の流路
１０３　試料導入口
１０４　分離後の液体成分の採取口

Claims (11)

  1. 　内部に分離対象の試料を導入し、遠心分離し、分離後の所望の液体を採取するのに用いられる試料分離デバイスであって、
    　前記分離対象の試料を前記試料分離デバイスに導入する試料導入部と、
    　前記試料導入部と接続された液面規定部と、
    　前記液面規定部と接続された第１分離部と、
    　前記第１分離部と接続された第２分離部と、
    　前記第２分離部と接続された第３分離部と、
    　前記第３分離部を含み、前記第３分離部と接続されている液体取出部と、を備え、
    　少なくとも前記第１分離部と前記第２分離部とによって管状流路が形成され、
    　前記試料導入部の開口と前記液体取出部の開口とは、同一方向を向いており、
    　前記第１分離部は、分離後の試料には重力と当該重力とは反対方向に生じる毛管力とが作用するように構成され、
    　前記液面規定部の水平断面積は、前記第１分離部の水平断面積よりも大きく、前記分離後の試料が前記毛管力によって前記液面規定部の最下部に到達したときに前記分離後の試料に対する前記毛管力の作用を低下させるように構成される、試料分離デバイス。
  2. 　請求項１において、
    　前記第２分離部と前記第３分離部との接続部の水平断面積は、前記第３分離部において最小であり、
    　前記液面規定部の水平断面積の最大値は、前記第３分離部の水平断面積の最小値以上である、試料分離デバイス。
  3. 　請求項２において、
    　前記第３分離部は、前記液体取出部の一部を構成し、前記液体取出部において、前記第２分離部との接続部から前記分離後の試料の液面の高さまでの部分を占めており、
    　前記液面規定部の最下部の高さは、前記液体取出部の最上部と最下部との間に位置しており、
    　前記液面規定部の最下部の高さは、前記第３分離部の最上部である前記分離後の試料の液面の高さと同じであり、
    　前記試料導入部の容量をＶ、前記第１分離部の容量をＡ、前記第２分離部の容量をＢ、前記第３分離部の容量をＣとしたとき、Ａ＋Ｂ＋ＣがＶとほぼ等しくなるように構成された、試料分離デバイス。
  4. 　請求項１において、
    　少なくとも前記第１分離部と前記第２分離部とによってＵ字形状或いはＪ字形状の流路が形成された、試料分離デバイス。
  5. 　請求項３において、
    　前記試料は血液であり、
    　前記液体取出部から取り出される前記分離後の試料は、血漿である、試料分離デバイス。
  6. 　請求項５において、
    　血球容積率をαとしたとき、
    　（Ｂ＋Ｃ）×α≦Ｂである、試料分離デバイス。
  7. 　請求項６において、
    　αは、０．５１８、０．５７、０．６２、あるいは０．６７である、試料分離デバイス。
  8. 　請求項１において、
    　前記第３分離部は、前記第３分離部と前記第２分離部との接続部に向かって水平断面積が漸次的に減少するように構成されている、試料分離デバイス。
  9. 　請求項１において、
    　前記液面規定部は、少なくとも前記液面規定部の一部から前記最下部まで水平断面積が漸次的に減少するように構成されている、試料分離デバイス。
  10. 　試料分離デバイスの内部に分離対象の試料を導入し、遠心分離し、分離後の所望の液体を採取する試料分離方法であって、
    （i）前記分離対象の試料を前記試料分離デバイスに導入する試料導入部と、前記試料導入部と接続された液面規定部と、前記液面規定部と接続された第１分離部と、前記第１分離部と接続された第２分離部と、前記第２分離部と接続された第３分離部と、前記第３分離部を含み、前記第３分離部と接続されている液体取出部と、を備え、前記液面規定部の水平断面積が、前記第１分離部の水平断面積よりも大きく、少なくとも前記第１分離部と前記第２分離部とによって管状流路が形成され、前記試料導入部の開口と前記液体取出部の開口とは、同一方向を向いている、試料分離デバイスを用意し、前記試料導入部に前記試料を導入することと、
    （ii）前記試料を導入した前記試料分離デバイスを、前記試料導入部の開口と前記液体取出部の開口が重力作用方向とは逆方向に向くように、遠心分離機に設置することと、
    （iii）前記遠心分離機を動作させ、前記試料分離デバイスに遠心力を印加することと、（iv）前記遠心分離機による前記遠心力の印加を停止することと、
    （v）前記試料分離デバイスの姿勢を前記遠心分離機の回転軸と平行な方向にした状態で、前記第１分離部において、分離後の試料に重力と当該重力とは反対方向に生じる毛管力とを作用させることと、
    （vi）前記液面規定部の最下部において前記分離後の試料に対する前記毛管力の作用を低下させることと、
    （vii）前記液体取出部から、前記分離後の試料を取り出すことと、
    を含む試料分離方法。
  11. 　請求項１０において、
    　前記試料分離デバイスの姿勢を前記遠心分離機の回転軸と平行な方向にした状態は、前記試料導入部の開口と前記液体取出部の開口が重力作用方向とは逆方向に向いた状態である、試料分離方法。
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