WO2019168300A1 - 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법 - Google Patents

합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2019168300A1
WO2019168300A1 PCT/KR2019/002146 KR2019002146W WO2019168300A1 WO 2019168300 A1 WO2019168300 A1 WO 2019168300A1 KR 2019002146 W KR2019002146 W KR 2019002146W WO 2019168300 A1 WO2019168300 A1 WO 2019168300A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
syngas
culture
metabolite
acid
glucose
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/002146
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김경헌
엄영순
김정연
김중석
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단, 한국과학기술연구원 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to US16/975,581 priority Critical patent/US11988651B2/en
Publication of WO2019168300A1 publication Critical patent/WO2019168300A1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7206—Mass spectrometers interfaced to gas chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/22—Devices for withdrawing samples in the gaseous state
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/497—Physical analysis of biological material of gaseous biological material, e.g. breath
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/497—Physical analysis of biological material of gaseous biological material, e.g. breath
    • G01N33/4977—Metabolic gas from microbes, cell cultures or plant tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/22—Devices for withdrawing samples in the gaseous state
    • G01N2001/2244—Exhaled gas, e.g. alcohol detecting
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers

Definitions

  • the present invention relates to a metabolite sampling and analysis method for metabolite analysis during syngas fermentation of syngas fermentation bacteria.
  • Syngas fermentation microorganisms generate and grow energy using metabolic circuits that are completely different from those of ordinary sugars as substrates (Richter H et al (2016) Energy Environ Sci vol. 9, pp. 2392- 2399), the type and amount of metabolites are significantly different. These metabolites can vary greatly in extraction efficiency depending on the nature of the extraction solvent and may show differences in metabolite profiling (Duportet X et al (2012) Metabolomics vol. 8, pp. 410-421; Canelas AB et al (2009) Anal Chem vol. 81, pp. 7379-7389). Such differences in metabolite profiling may limit or change the interpretation of biological or mechanisms.
  • the present inventors extract, quantify and quantify metabolites peculiar to syngas culture through glucose culture and syngas culture of syngas fermentation microorganism to analyze peculiar metabolites of syngas fermentation microorganism.
  • the present invention has been completed by establishing an optimal metabolite extraction solvent capable of extracting metabolites to the maximum on the basis of extraction efficiency and reproducibility in syngas culture.
  • an object of the present invention is to provide a kit for distinguishing the glucose culture of the syngas fermentation bacteria and the syngas culture.
  • an object of the present invention is to provide a method for analyzing metabolite differentiation for distinguishing between the glucose culture of the syngas fermentation bacteria and the syngas culture.
  • the present invention is a.
  • Palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, margaric acid, heptadecanoic acid, 1-monopalmitin, alanine, N-methylalanine Glucose of syngas fermentation bacteria comprising a quantification device for one or more metabolites selected from the group consisting of (N-methylalanine), adenosine, glycerol-1-phosphate and valine
  • kits for distinguishing between culture and syngas culture are kits for distinguishing between culture and syngas culture.
  • the present invention establishes an optimized metabolite sampling condition, i.e., ultrafast filtration under aerobic conditions, washing with an optimal volume of solvent, and an extraction solvent with excellent extraction efficiency.
  • Metabolite comparison analysis using GC / TOF MS partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), hierarchical clustering analysis (HCA), coefficient of variation (CV), Metabolic biomarkers to distinguish glucose culture from syngas fermentation and syngas fermentation using various statistical analyzes such as principal component analysis (PCA), receiver operating characteristic curve (ROC curve), and confidence interval analysis has the effect of providing.
  • the present invention is expected to be used for various mechanism studies through metabolite analysis of syngas fermentation bacteria.
  • it can be applied to the optimization of metabolite sampling methods of other microorganisms.
  • Glc_Exponential exponential metabolite analysis results in glucose culture of glucose synthesis and fermentation of syngas fermentation bacteria using PLS-DA
  • Glc_Stationary in glucose culture Analytical results of stagnant metabolites
  • CO_Exponential Analysis of exponential metabolites in syngas culture
  • CO_Stationary Results of stagnant metabolites in syngas culture, A: score plot
  • B loading plot.
  • Figure 2 shows the metabolite profile (Glc_Exponential: exponential metabolite analysis results in glucose culture of glucose synthesis and fermentation of syngas fermentation bacteria using HCA; Glc_Stationary: Metabolite analysis result; CO_Exponential: metabolite analysis result of exponential phase in syngas culture; CO_Stationary: metabolite analysis result of stagnant phase in syngas culture).
  • Figure 7 is a model that distinguishes glucose culture and syngas culture by the major 10 metabolites in the synthesis of glucose and syngas culture of syngas fermentation bacteria using PCA (Glc_Exponential: metabolite analysis results of the exponential phase in glucose culture ; Glc_Stationary: Analysis of stagnant metabolites in glucose culture; CO_Exponential: Analysis of exponential metabolites in syngas culture; CO_Stationary: Analysis of stagnant metabolites in syngas culture, A: score plot; B: loading plot) It is shown.
  • FIG. 8 is a verification of the PCA model that distinguishes the glucose culture and the syngas culture by using the ROC curve as a parameter of the glucose culture of the syngas fermentation bacteria and the 10 major metabolites in the syngas culture.
  • the present invention is palmitic acid (palmitic acid), stearic acid (stearic acid), arachidic acid (arachidic acid), margaric acid (heptadecanoic acid), 1-monopalmitin, alanine (alanine), N Syngas fermentation comprising a metering device for one or more metabolites selected from the group consisting of N-methylalanine, adenosine, glycerol-1-phosphate and valine
  • the present invention relates to a kit for distinguishing bacteria from glucose culture and syngas culture.
  • the present inventors extracted the metabolite using ultra-fast filtration and pure methanol in aerobic conditions, and extracted with GC / TOF MS. Glucose culture and syngas culture metabolite profile differences were compared and analyzed, and the difference was used to identify biomarkers to distinguish between glucose culture and syngas culture of syngas fermentation bacteria.
  • Glucose and syngas cultures of syngas fermentation bacteria were synthesized through partial minimum squared discrimination analysis (PLS-DA) when the samples were sampled in the glucose culture of the syngas fermentation bacteria and the exponent and stagnation phase of the synthesis gas culture.
  • PLS-DA partial minimum squared discrimination analysis
  • For each metabolite we selected five metabolites with the maximum positive and negative values based on the loading values of the PLS-DA model. Was selected as a novel biomarker candidate (Table 2).
  • Each metabolite showed a statistically significant difference in glucose culture and syngas culture of syngas fermentation bacteria, confirming that it is an appropriate candidate biomarker.
  • the HCA was performed to show the difference between the metabolite of the syngas fermentation and the metabolite of the syngas.
  • synthetic gas fermentation bacterium refers to Clostridium carboxidivorans , and specifically, Clostridium Carboxidivorans P7 ( Clostridium carboxidivorans P7).
  • syngas fermentation bacteria in glucose culture are alanine, N-methylalanine, adenosine, glycerol-1-phosphate and valine in metabolites.
  • syngas fermentation bacteria in syngas cultures include palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, heptadecanoic acid and 1-monopalmitin in metabolites.
  • (1-monopalmitin) tends to increase, but alanine, N-methylalanine, adenosine, glycerol-1-phosphate and valine decrease. It shows a tendency.
  • the increase or decrease tends to mean an increase or decrease in the metabolite concentration
  • the term “increase in the metabolite concentration” is a significant increase in the metabolite concentration compared to the glucose culture in syngas fermentation bacteria during syngas culture.
  • the term “reduction of metabolite concentration” means that the metabolite concentration in the syngas fermentation bacteria during syngas culture is significantly reduced to a measurable level.
  • the metering device included in the kit of the present invention may be a chromatography / mass spectrometer.
  • Chromatography used in the present invention is Gas Chromatography, Liquid-Solid Chromatography (LSC), Paper Chromatography (PC), Thin-Layer Chromatography (TLC) ), Gas-solid chromatography (GSC), liquid-liquid chromatography (Liquid-Liquid Chromatography, LLC), foam chromatography (Foam Chromatography (FC), emulsion chromatography (Emulsion Chromatography, EC), Gas-Liquid Chromatography (GLC), Ion Chromatography (IC), Gel Filtration Chromatograhy (GFC) or Gel Permeation Chromatography (GPC)
  • the chromatography used in the present invention may be a gas chromatography / time-of-flight mass spectrometry (GC / TOF MS) analyzer.
  • each component is separated in gas chromatography, and the components obtained through elemental composition as well as accurate molecular weight information using information obtained through TOF MS are identified.
  • the present invention also includes a method for analyzing metabolite differentiation for distinguishing the glucose culture from the syngas fermentation bacteria and the syngas culture.
  • the method of analyzing the metabolite differentiation is a method of analyzing the distinction between the exponent phase and the retention phase in glucose culture and the exponent phase and the retention phase in syngas culture, and, first, metabolite sampling including a quenching process and a metabolite extraction process. Go through the steps
  • Metabolite sampling involves fast filtration of anaerobic bacteria samples under aerobic conditions under aerobic conditions, washing the filtrate with water, and then using a solvent mixture of acetonitrile and water as a solvent, a mixed solvent of acetonitrile, methanol and water.
  • the water used for washing is preferably used in 3 parts by volume to 7 parts by volume with respect to 1 volume ratio of anaerobic bacteria, and the extraction solvent is a mixed solvent of water, 2-propanol and methanol in terms of extraction efficiency and reproducibility desirable.
  • it is more preferable to use a mixed solvent mixed with water: 2-propanol: methanol 2: 2: 5 (v / v / v).
  • 86 metabolites including amines, amino acids, sugars and sugar alcohols, fatty acids, phosphoric acids, organic acids and the like have been identified.
  • the metabolites extracted in the metabolite sampling step undergo the following analysis steps:
  • PLS-DA partial least squares regression analysis
  • the analysis method of the present invention is the step of converting the GC / TOF MS analysis results into statistically quantifiable numerical value by dividing the total analysis time by the unit time interval of the largest area or height of the chromatogram peaks appearing during the unit time Set the numerical value as a representative value for unit time.
  • the step of statistically verifying the difference between the two biological sample groups using the converted numerical value is performed by performing partial least squares regression (PLS-DA) metabolism representing a significant difference between the two biological sample groups.
  • PLS-DA partial least squares regression
  • Metabolite biomarkers distinguish glucose culture from syngas fermentation and syngas culture.
  • Metabolite biomarkers include palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, margaric acid, heptadecanoic acid, 1-monopalmitin, and alanine. , N-methylalanine, N-methylalanine, adenosine (adenosine), glycerol-1-phosphate (glycerol-1-phosphate) and valine (valine).
  • a positive loading value of Partial least squares discriminant analysis indicates an increasing tendency of metabolite biomarkers and a negative loading value indicates a decreasing tendency of metabolic biomarkers.
  • a positive loading value of the partial least squares regression method is determined to indicate an increasing tendency of metabolite biomarkers, and a negative loading value indicates a decreasing tendency of metabolite biomarkers.
  • a biomarker for distinguishing glucose from syngas fermentation of syngas fermentation bacteria and metabolites in syngas culture palmitic acid, stearic acid, arachidic acid (arachidic acid), margaric acid (heptadecanoic acid), 1-monopalmitin, alanine, N-methylalanine, adenosine, glycerol-1-phosphate -1-phosphate) and valine can be used.
  • the biomarkers are used in syngas fermentation bacteria during syngas culture, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, heptadecanoic acid and 1-monopalmitin.
  • (1-monopalmitin) tends to increase, but alanine, N-methylalanine, adenosine, glycerol-1-phosphate and valine decrease. May indicate a tendency.
  • C. carboxidivorans P7 was incubated in 2 ⁇ yeast extract, tryptone and glucose (YTG) medium (Table 1) to obtain species culture. Cells were harvested when OD 600 reached 2.0-2.5 (considered exponential). Cells were washed twice with modified P7 medium (Table 1) and seeded with 5 mL of modified P7 medium in a 25 mL serum bottle as the main culture (10%, v / v). For CO fermentation, add 1.5 bar to the headspace of the serum bottle using a gas mixture (10% H 2 , 70% CO, 20% CO 2 , v / v / v, Air Korea, Seoul, Korea) and add the cells 37 The cells were incubated at 200 ° C. and 200 rpm.
  • a gas mixture (10% H 2 , 70% CO, 20% CO 2 , v / v / v, Air Korea, Seoul, Korea
  • modified P2 medium (MP2) was used in the main culture in 25 mL serum bottles for glucose fermentation (Phillips JR, Atiyeh HK, Tanner RS, Torres JR, Saxena J, Wilkins MR, Huhnke RL. 2015. Butanol and hexanol production in Clostridium carboxidivorans syngas fermentation: medium development and culture techniques.Bioresour Technol 190: 114-121.). Cells were seeded in glucose medium and shaken at 37 ° C. at 200 rpm. All media was anaerobic prepared after purging with argon (99.9%, w / w).
  • Glucose cultures of syngas fermentation bacteria and metabolites in syngas cultures were extracted with methanol and processed using GC / TOF MS analysis.Amines, amino acids, sugars and sugar alcohols, fatty acids, phosphates 82 metabolites were identified, including organic acids and the like (Table 2).
  • PLS-DA and HCA were performed using 82 metabolites to compare the difference between metabolite profiling between glucose and syngas culture of syngas fermenting bacteria.
  • Example 2 Major differences in glucose and syngas culture of syngas fermentation strains Metabolite selection
  • WiPM was selected as the optimal solvent based on extraction efficiency and reproducibility when extracting metabolites for metabolite analysis of syngas fermentation bacteria.
  • Example 4 main Metabolite Selection and verification of glucose culture and syngas culture using them
  • PCA model was generated to completely distinguish the glucose culture and the syngas culture of the syngas fermentation strain using 10 representative metabolites representing the difference in glucose culture and syngas culture of the syngas fermentation strain selected from Example 2.
  • FIG. 7 The PCA model generated with 10 metabolites was completely distinguished based on the PC1 axis, with a positive metabolite profile in syngas culture and a negative metabolite profile in glucose culture (FIG. 7A).
  • the loading plot was shown to show how 10 metabolites are involved in the PCA model (FIG. 7B).
  • the ROC curve was applied to see whether this classification model was statistically significant (FIG. 8).
  • PCA model for synthesizing glucose and syngas culture of syngas fermentation strain produced with 10 metabolites with 100% sensitivity, 100% specificity, and AUC 1.000 was proved to be statistically significant.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법에 관한 것으로, 대사체 샘플링을 위한 최적 조건을 확립하고, 선정된 대사체 바이오마커를 사용하여 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 구별할 수 있다.

Description

합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법
본 발명은 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법에 관한 것이다.
미생물에서 대사체 샘플링(metabolome sampling)의 중요성으로 인해 그람 음성 균인 사카로퍼거스 데그라단스, 대장균, 효모를 포함한 다양한 미생물에서 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 방법의 최적화 연구가 진행되고 있으며 이렇게 최적화된 대사체 샘플링 방법을 기반으로 대사체의 변화에 대한 다양한 메커니즘에 관한 연구들이 진행되고 있다(Rabinowitz JD and Kimball E. (2007) Anal Chem vol. 79, pp. 6167-6173; Shin MH et al (2010) Anal Chem vol. 82, pp. 6660-6666; Kim S et al (2013) Anal Chem vol. 85, pp. 2169-2176). 혐기성 균의 대사체 샘플링 방법의 경우 Clostridium acetobutylicum의 호기성 환경에서 메탄올을 이용한 대사체 추출법이 보고된 바 있지만(Lee SH et al (2014) Biotechnol Bioeng vol. 111, pp. 2528-2536), 탄소를 고정화하는 미생물의 경우엔 대사체 샘플링 방법의 최적화 연구가 보고된 바가 없다.
합성가스 발효 미생물은 일반적인 당류를 기질로 사용할 때의 대사회로와는 완전히 다른 대사회로를 이용하여 에너지를 생성하고 생장하기 때문에(Richter H et al (2016) Energy Environ Sci vol. 9, pp. 2392-2399), 대사물질의 종류 및 양이 크게 차이가 난다. 이러한 대사체는 추출 용매의 성질에 따라서 추출 효율이 크게 달라질 수 있으며, 대사체 프로파일링의 차이를 보일 수 있다(Duportet X et al (2012) Metabolomics vol. 8, pp. 410-421; Canelas AB et al (2009) Anal Chem vol. 81, pp. 7379-7389). 이러한 대사체 프로파일링의 차이는 생물학적 해석이나 메커니즘의 해석을 제한하거나 바꿀 수 있다.
따라서, 합성가스 발효 미생물의 합성가스 배양 시의 대사체 추출 효율을 높이고 재현성 있는 추출을 가능하게 하여, 생물학적 해석이나 메커니즘 해석의 오도를 줄일 수 있는 추출 용매의 최적화가 필요하다.
이에, 본 발명자들은 합성가스 발효 미생물의 특유의 대사체 분석을 위해 합성가스 발효 미생물의 포도당 배양 및 합성가스 배양을 통하여 합성가스 배양 특유의 대사체를 추출 및 정성, 정량하고, 이러한 탄소고정화 미생물의 합성가스 배양에서 대사체를 추출 효율 및 재현성을 기반으로 최대한으로 추출할 수 있는 최적의 대사체 추출 용매를 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 구별용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은
팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid), 1-모노팔미틴(1-monopalmitin), 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
호기 조건에서 합성가스 발효 균의 생체시료를 초고속 여과(fast filtration)하고, 여과물을 물로 세척한 다음, 추출 용매로 물, 2-프로판올 및 메탄올의 혼합용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위해 최적화된 대사체 샘플링 조건, 즉, 호기 조건에서 초고속 여과, 최적 용량의 용매를 이용한 세척, 추출 효율이 우수한 추출 용매를 확립하고, GC/TOF MS를 이용한 대사체 비교 분석, 부분최소제곱회귀법(partial least squares discriminant analysis; PLS-DA), 계층적 군집분석(hierarchical clustering analysis; HCA), 변동 계수(coefficient of variation; CV), 주성분 분석(principal component analysis; PCA), receiver operating characteristic curve(ROC curve), 신뢰구간 분석 등의 다양한 통계 분석을 이용해, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 발효를 구별할 수 있는 대사체 바이오마커를 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 합성가스 발효 균의 대사체 분석을 통한 다양한 메커니즘 연구에 이용될 것으로 기대한다. 또한 각 미생물에 맞는 최적의 대사체 샘플링 방법이 필요함을 입증함으로써 이를 이용하여 다른 미생물의 대사체 샘플링 방법의 최적화에 응용할 수 있다.
도 1은 PLS-DA를 이용한 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 각 단계(phase)에서의 대사체 프로파일(Glc_Exponential: 포도당 배양에서 지수기의 대사체 분석 결과; Glc_Stationary: 포도당 배양에서 정체기의 대사체 분석 결과; CO_Exponential: 합성가스 배양에서 지수기의 대사체 분석 결과; CO_Stationary: 합성가스 배양에서 정체기의 대사체 분석 결과, A: score plot; B: loading plot)을 나타낸 것이다.
도 2는 HCA를 이용한 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 각 단계(phase)에서의 대사체 프로파일(Glc_Exponential: 포도당 배양에서 지수기의 대사체 분석 결과; Glc_Stationary: 포도당 배양에서 정체기의 대사체 분석 결과; CO_Exponential: 합성가스 배양에서 지수기의 대사체 분석 결과; CO_Stationary: 합성가스 배양에서 정체기의 대사체 분석 결과)를 나타낸 것이다.
도 3은 PLS-DA를 이용한 합성가스 발효 균의 합성가스 배양에서 서로 다른 추출 용매를 사용하였을 때의 대사체 프로파일(50ACN (acetonitrile-water=1:1, v/v), AMW (acetonitrile-methanol-water=2:1:1, v/v/v), PM(pure methanol), WiPM(water-2-propanol-methanol=2:2:5, v/v/v, A, C: 합성가스 배양에서의 지수기, B, D: 합성가스 배양에서의 정체기)를 나타낸 것이다.
도 4는 HCA를 이용한 합성가스 발효 균의 합성가스 배양에서 서로 다른 추출용매를 사용하였을 때의 대사체 프로파일(50ACN: 아세토니트릴:물=1:1; AMW: 아세토니트릴:메탄올:물 = 2:2:1; PM: 순수 메탄올; WiPM: 물:2-프로판올:메탄올 = 2:2:5, A: 합성가스 배양에서의 지수기, B:합성가스 배양에서의 정체기)를 나타낸 것이다.
도 5는 피크 인텐시티를 이용한 합성가스 발효 균의 합성가스 배양에서 각 추출 용매에 따른 대사체 추출 효율 비교(50ACN (acetonitrile-water=1:1, v/v), AMW (acetonitrile-methanol-water=2:1:1, v/v/v), PM (pure methanol), WiPM (water-2-propanol-methanol=2:2:5, v/v/v, A: 합성가스 배양에서의 지수기, B:합성가스 배양에서의 정체기)를 나타낸 것이다.
도 6은 변동 계수(%CV)를 이용한 합성가스 발효 균의 합성가스 배양에서 각 추출 용매에 따른 대사체 추출 효율 비교(50ACN (acetonitrile-water=1:1, v/v), AMW (acetonitrile-methanol-water=2:1:1, v/v/v), PM (pure methanol), WiPM (water-2-propanol-methanol=2:2:5, v/v/v, A: 합성가스 배양에서의 지수기, B:합성가스 배양에서의 정체기)를 나타낸 것이다.
도 7은 PCA를 이용한 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 주요한 10개 대사체를 변수로 포도당 배양과 합성가스 배양을 구분하는 모델(Glc_Exponential: 포도당 배양에서 지수기의 대사체 분석 결과; Glc_Stationary: 포도당 배양에서 정체기의 대사체 분석 결과; CO_Exponential: 합성가스 배양에서 지수기의 대사체 분석 결과; CO_Stationary: 합성가스 배양에서 정체기의 대사체 분석 결과, A: score plot; B: loading plot)을 나타낸 것이다.
도 8은 ROC curve를 이용하여 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 주요한 10개 대사체를 변수로 포도당 배양과 합성가스 배양을 구분하는 PCA 모델을 검증한 것이다.
본 발명은 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid), 1-모노팔미틴(1-monopalmitin), 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 구별용 키트에 관한 것이다.
본 발명자들은 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 구별하는 바이오마커를 찾기 위해 호기성 조건에서 초고속 여과 후 물을 이용한 세척 및 순수 메탄올을 사용하여 대사체를 추출하고 GC/TOF MS를 이용하여 포도당 배양 및 합성가스 배양 대사체 프로파일 차이를 비교 분석하고, 이 차이를 이용하여 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 구별할 수 있는 바이오마커 발굴 연구를 수행하였다.
그 결과, 아민류, 아미노산류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 당류 등으로 구분할 수 있는 82종의 대사체를 동정하였다. 이 중 유기산류, 지방산류, 당류가 가장 많이 검출되었으며, 그 다음으로 아미노산류, 아민류, 인산류 등의 순서로 검출되었다.
합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 지수기 및 정체기에서 각각 샘플링하여 생체 시료를 비교하였을 때, 부분최소자승판별분석(PLS-DA)을 통해 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 대사체 프로파일의 명확한 차이를 확인하였으며, 각각의 대사물질에 대해, PLS-DA 모델의 로딩값을 기준으로 최대 양수값 및 최대 음수값을 갖는 대사물질을 각각 5종씩 선정하고 10종의 대사체를 신규 바이오마커 후보 물질로 선정하였다(표 2). 각각의 대사물질은 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양에서 통계적으로 확연한 차이를 보여, 적절한 후보 생체표지자임을 확인하였다. 또한 HCA를 시행하여, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 개별적인 대사물질의 차이를 보여주고자 하였다, 그 결과 각 배양별로 개별적인 대사물질의 확연한 차이를 확인하였다.
또한, 상기 후보 대상물질을 이용해 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구분하기 위하여 PCA를 이용한 모델을 만들었으며, 10종의 대사체를 이용해 생성한 모델이 각 배양 조건의 대사체를 완전히 구분한 결과를 보였다. 또한 이 모델에 ROC curve를 적용하여 검증을 시행하였다. 그 결과 높은 통계학적 유의미성을 띠어 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 대사체 구분에 적절함을 검증할 수 있었다.
본 명세서에서 용어 "합성가스 발효 균"은 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans)을 의미하며, 구체적으로 클로스트리디움 카르복시디보란스 P7(Clostridium carboxidivorans P7)을 포함한다.
특히, 포도당 배양에서의 합성가스 발효 균은 대사체 중에서 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)은 증가하는 경향을, 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라크산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid) 및 1-모노팔미틴(1-monopalmitin)은 감소하는 경향을 나타낸다.
또한, 합성가스 배양에서의 합성가스 발효 균은 대사체 중에서 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid) 및 1-모노팔미틴(1-monopalmitin)은 증가하는 경향을, 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)은 감소 경향을 나타낸다.
상기 증가 또는 감소 경향이란 대사체 농도의 증가 또는 감소를 의미하는 것으로, 용어 “대사체 농도의 증가”는 합성가스 배양 시의 합성가스 발효 균에서 포도당 배양 대비 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 본 명세서에서, 용어 “대사체 농도의 감소”는 합성가스 배양 시의 합성가스 발효 균에서 포도당 배양 대비 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 뜻한다.
본 발명의 키트에 포함된 정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기일 수 있다.
본 발명의 대사체는 가스 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성 성분을 확인한다.
본 발명은 또한 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 포함한다.
상기 대사체 차별성을 분석하는 방법은 포도당 배양 시의 지수기 및 정체기와 합성가스 배양 시의 지수기 및 정체기 간의 별성을 분석하는 방법으로써, 우선, 퀜칭 과정과 대사체 추출 과정을 포함하는 대사체 샘플링 단계를 거친다.
대사체 샘플링은 호기 조건에서 혐기성 균의 생체시료를 호기성 조건 하에서 초고속 여과(fast filtration)하고, 여과물을 물로 세척한 다음, 추출 용매로 아세토니트릴과 물의 혼합 용매, 아세토니트릴, 메탄올 및 물의 혼합 용매, 순수 메탄올, 또는 물, 2-프로판올 및 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 과정이다. 이때, 세척에 사용되는 물은 혐기성 균액 1 부피비에 대하여, 3 부피부 내지 7 부피부로 사용하는 것이 바람직하며, 추출용매로는 물, 2-프로판올 및 메탄올의 혼합 용매가 추출 효율 및 재현성 면에서 바람직하다. 특히, 물: 2-프로판올 : 메탄올 = 2:2:5 (v/v/v)로 혼합된 혼합 용매를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 86개의 대사체가 동정되었다.
상기 대사체 샘플링 단계에서 추출된 대사체에 대해서는 다음의 분석 단계를 거친다:
추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계;
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계를 더 포함한다.
다음으로, 대사체의 프로파일링 차이를 비교하기 위해 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하고, 분석 및 검증한다.
일 구현예로서, 본 발명의 분석 방법은 GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정한다.
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계는 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 분석 및 검증한다.
대사체 바이오마커는 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별한다.
대사체 바이오마커는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid), 1-모노팔미틴(1-monopalmitin), 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)으로 구성된다.
부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타낸다.
부분최소제곱회귀법의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타내는 것으로 판정한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 대사체를 구별하기 위한 바이오마커로, 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid), 1-모노팔미틴(1-monopalmitin), 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)을 사용할 수 있다.
상기 바이오마커들은 합성가스 배양 시의 합성가스 발효 균에서, 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid) 및 1-모노팔미틴(1-monopalmitin)은 증가하는 경향을, 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)은 감소 경향을 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
참조예 1: 균주, 배지 및 배양 조건
C. carboxidivorans P7을 2x 효모 추출물, tryptone 및 포도당 (YTG) 배지(표 1)에서 배양하여 종 배양액을 수득하였다. 세포는 OD600이 2.0-2.5에 도달할 때 수확되었다 (지수 중간 단계로 간주). 세포를 변형된 P7 배지(표 1)로 2회 세척하고 주 배양물로서 25 mL 혈청 병에서 5 mL의 변형된 P7 배지로 접종하였다 (10%, v/v). CO 발효를 위해 기체 혼합물 (10% H2, 70% CO, 20% CO2, v/v/v, Air Korea, Seoul, Korea)을 사용하여 혈청 병의 헤드 스페이스에 1.5 bar를 가하고 세포를 37 ℃ 및 200 rpm에서 배양하였다. 포도당 발효를 위해 25 mL 혈청 병에서 5 mL의 변형된 P2 배지(MP2)를 주 배양에 사용하였다 (Phillips JR, Atiyeh HK, Tanner RS, Torres JR, Saxena J, Wilkins MR, Huhnke RL. 2015. Butanol and hexanol production in Clostridium carboxidivorans syngas fermentation: medium development and culture techniques. Bioresour Technol 190:114-121.). 세포를 포도당 배지에 접종하고 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 모든 배지는 아르곤 (99.9%, w/w)으로 퍼징한 후 혐기성으로 준비하였다.
Figure PCTKR2019002146-appb-T000001
하기 실시예에서 사용된 합성가스 발효 균주는 클로스트리디움 카르복시디보란스 P7(Clostridium carboxidivorans P7)이다.
실시예 1: PLS - DA와 HCA를 이용한 합성가스 발효 균주의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 지수기 및 정체기에서의 대사체 프로파일링
합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 지수기 및 정체기에서 각각 균액 2 ml를 샘플링하여 대기 중에서 초고속 여과 방법을 수행하고, 증류수 10 ml를 이용하여 세척하였다. 기존에 많이 사용되고 있는 순수 메탄올 10 ml을 추출 용매로 이용하여 여과물과 혼합 및 액체질소에 얼려서 대사활성을 정지시켰다. 이후 얼음 위에서 혼합액을 녹인 후 5분간 초음파 처리, 3분간 볼텍싱 한 후에 16,100 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 완전 건조하여 GC/TOF MS로 분석하였다.
합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 대사체를 메탄올을 이용하여 추출 및 GC/TOF MS 분석한 데이터를 프로세싱하였을 때, 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 82개의 대사체를 동정하였다(표 2).
합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양 시의 대사체 프로파일링 차이를 비교하기 위하여 82개의 대사체를 이용해 PLS-DA 및 HCA를 실시하였다.
PLS-DA의 결과에 따르면 지수기 및 정체기에 관계없이, 포도당 배양 시에는 t[1] 축을 기준으로 양수의 값을, 합성가스 배양 시에는 음수의 값을 나타내서 대사체 프로파일이 확연히 다름을 보였다(도 1, 표 3).
또한, HCA로 개별적인 대사물질의 증감을 살펴본 결과, 포도당 배양 시에는 HCA 상단의 대사체가, 합성가스 발효 시에는 HCA 중, 하단의 대사체가 높은 인텐시티를 보여서 확연히 다름을 보였다(도 2). 따라서 대사체 프로파일링의 차이가 크게 나타남을 확인하였다. 이를 통하여 합성가스 발효 균은 합성가스 배양 시 특유의 대사체 패턴을 가짐을 확인하였다.
Figure PCTKR2019002146-appb-T000002
Metabolites Loading 1 Loading 2
1,2,4-benzenetriol -0.136 -0.145
1-monopalmitin -0.168 0.086
1-monostearin -0.070 0.216
2-hydroxypyridine -0.100 -0.160
5-aminovalerate -0.025 0.118
adenosine 0.149 -0.065
adenosine-5-monophosphate 0.086 -0.082
adipate -0.109 0.175
alanine 0.174 0.009
arabitol -0.151 0.063
arachidic acid -0.176 -0.057
aspartate 0.107 -0.086
β-alanine -0.162 0.089
β-hydroxybutyrate -0.092 -0.133
capric acid -0.087 -0.210
carnitine -0.046 0.202
cellobiose 0.073 -0.115
citramalate 0.129 -0.049
cytindine-5-monophosphate -0.012 -0.039
fructose -0.123 0.075
fructose-6-phosphate 0.069 -0.065
fumarate -0.068 0.097
galactonate -0.086 0.098
galactose 0.072 0.020
γ-aminobutyrate -0.014 -0.020
glucose 0.118 -0.054
glucose-6-phosphate 0.095 -0.055
glutamate 0.148 -0.030
glycerate -0.077 0.110
glycerol -0.130 -0.174
glycerol-1-phosphate 0.149 -0.030
glycolate -0.109 -0.118
heptadecanoic acid -0.172 -0.006
hypoxanthine 0.036 -0.116
inosine 0.037 0.018
isoleucine 0.062 -0.142
lactate -0.094 -0.203
lactulose -0.058 0.120
lauric acid -0.162 -0.010
leucine 0.012 -0.191
lignoceric acid -0.080 0.162
linoleic acid -0.075 -0.048
lyxose -0.101 0.054
malate 0.051 -0.103
mannitol 0.034 0.190
mannose -0.068 0.126
myo-inositol 0.057 -0.042
myristic acid -0.124 0.164
nicotinamide 0.010 0.047
N-methylalanine 0.154 -0.057
octadecanol -0.135 -0.147
oleic acid -0.112 -0.032
ononitol -0.149 -0.031
O-phosphorylethanolamine -0.123 -0.026
ornithine -0.036 -0.093
oxalate -0.123 -0.087
oxoproline 0.077 -0.120
palatinitol -0.052 0.010
palmitic acid -0.182 -0.008
palmitoleic acid 0.141 -0.005
pelargonic acid -0.118 -0.186
pentadecanoic acid -0.132 -0.010
phenylacetate -0.121 0.119
phenylalanine -0.155 -0.059
phosphate -0.126 0.125
phthalic acid -0.059 -0.123
proline -0.142 -0.100
pyruvate -0.122 -0.174
serine -0.116 -0.149
squalene -0.020 0.046
stearic acid -0.179 0.029
succinate -0.017 0.039
sucrose 0.114 -0.080
terephthalic acid 0.109 -0.079
threitol -0.077 -0.165
threonine -0.069 -0.156
threose -0.140 -0.150
thymine -0.137 -0.079
uracil -0.117 -0.139
valine 0.149 -0.126
xanthine 0.132 -0.009
xylose -0.067 0.143
실시예 2: 합성가스 발효 균주의 포도당 배양 및 합성가스 배양에서 차이를 나타내는 주요 대사체 선정
합성가스 발효 균주의 포도당 배양 및 합성가스 배양에서 차이를 나타내는 대표적 대사물질을 선정하기 위하여 실시예 1로부터 나온 PLS-DA 분석 모델을 이용하여 모델의 양수의 로딩값 및 음수의 로딩값에서 최대의 값을 갖는 5개의 대사체를 각각 계산하고 총 대사체 10개를 선정하였다(표 4).
Figure PCTKR2019002146-appb-T000003
실시예 3: 합성가스 발효 균의 대사체 분석을 위한 최적의 추출 용매 선정
합성가스 발효 균의 합성가스 배양 시의 지수기 및 정체기에서 대사체 샘플을 얻기 위하여 호기 조건에서 2 mL의 균액을 샘플링 후 초고속 여과 방법을 사용한 뒤 10 mL의 물로 세척하여 합성가스 발효 균의 각 단계에서 대사체를 얻은 뒤 50ACN(acetonitrile-water=1:1, v/v), AMW(acetonitrile-methanol-water=2:1:1, v/v/v), PM(pure methanol), WiPM(water-2-propanol-methanol=2:2:5, v/v/v)의 용매를 각각 10 ml씩 추출 용매로 이용하여 여과물과 혼합 및 액체질소에 얼려서 대사활성을 정지시켰다. 이후 얼음 위에서 혼합액을 녹인 후 5분간 초음파 처리, 3분간 볼텍싱 한 후에 16,100 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 완전 건조하여 GC/TOF MS로 분석하였다. GC/TOF-MS로 분석하여 추출 효율을 비교 분석하였다.
합성가스 발효 균의 합성가스 배양 시의 대사체를 4종류의 서로 다른 추출용매를 이용하여 추출 및 GC/TOF MS 분석한 데이터를 프로세싱하였을 때, 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 86개의 대사체를 동정하였다(표 5).
도 3, 도 4 및 표 6에 나타난 바와 같이, 각 단계에서 모두 추출 용매에 따라서 대사체 프로파일링의 차이가 나는 것을 확인할 수 있었으며, 추출 효율 또한 다름을 확인할 수 있었다. 합성가스 발효 균의 지수기 및 정체기에서 정성 및 상대적으로 정량 분석된 피크 인텐시티가 WiPM에서 가장 높아, 종합적인 대사체의 추출 효율이 WiPM에서 가장 높음을 볼 수 있었다 (도 5).
또한 합성가스 발효 균의 지수기 및 정체기에서 추출 용매에 따른 재현성을 살펴보면, %CV 값이 WiPM에서 모두 최저의 수치를 기록하여, 재현성이 제일 높음을 알 수 있었다(도 6). 이를 통하여 합성가스 발효 균의 대사체 분석을 위한 대사체 추출 시에 추출 효율 및 재현성에 기반한 최적 용매로 WiPM을 선정하였다.
Figure PCTKR2019002146-appb-T000004
Metabolites Exponential _ Loading 1 Exponentia l_ Loading 2 Stationary _ Loading 1 Stationary _ Loading 2
1,2,4-benzenetriol -0.139 -0.004 -0.043 0.132
1,5-anhydroglucitol -0.087 -0.141 -0.165 -0.103
1-monopalmitin -0.160 0.019 0.054 -0.189
1-monostearin -0.089 -0.093 0.171 -0.137
2-hydroxypyridine -0.140 0.153 -0.144 -0.138
2-hydroxyvalerate -0.045 -0.259 -0.064 -0.145
2-ketoadipate -0.081 -0.025 -0.124 -0.036
3-hydroxypropionate -0.137 -0.011 0.083 -0.178
3-hydroxypyridine -0.153 0.036 -0.152 -0.133
5-aminovaleric acid -0.133 -0.025 -0.111 -0.170
adipate -0.133 -0.152 -0.107 -0.043
alanine 0.135 -0.021 0.051 0.093
arabitol -0.125 -0.101 -0.031 -0.079
arachidic acid -0.111 -0.150 -0.153 0.097
aspartate 0.023 0.013 -0.030 -0.077
β-alanine -0.129 0.138 0.035 -0.181
β-hydroxybutyrate -0.074 0.110 -0.006 -0.049
capric acid -0.145 0.123 -0.196 0.073
carnitine -0.094 -0.177 0.047 -0.123
cellobiose -0.114 0.194 0.080 -0.206
fructose -0.119 -0.028 -0.108 -0.071
fucose -0.113 0.102 0.078 -0.059
fumarate -0.043 -0.137 -0.194 -0.035
galactonate -0.041 -0.070 0.000 -0.051
galactose -0.054 -0.108 -0.153 -0.117
γ-aminobutyrate -0.122 0.086 0.099 -0.185
glucose -0.050 -0.119 -0.150 -0.122
glutamate 0.030 0.087 -0.099 -0.126
glycerate -0.139 -0.070 -0.160 -0.100
glycerol -0.155 0.061 -0.172 0.102
glycerol-1-phosphate 0.044 0.151 -0.040 -0.102
glycolate -0.138 0.117 -0.190 -0.057
heptadecanoic acid -0.160 0.001 -0.076 -0.046
hypoxanthine 0.041 -0.053 0.024 0.072
isoleucine 0.079 0.035 0.045 0.074
lactate -0.137 0.095 -0.135 0.011
lactulose -0.062 -0.120 0.023 -0.011
lauric acid -0.155 0.017 -0.182 0.068
leucine 0.081 0.041 0.005 0.085
levoglucosan -0.091 -0.176 -0.036 0.003
lignoceric acid -0.134 0.045 0.151 -0.109
linoleic acid -0.122 0.067 -0.039 0.076
lyxose -0.064 -0.059 -0.092 -0.051
malate -0.118 0.113 -0.166 -0.043
mannitol -0.125 -0.095 -0.122 0.010
mannose -0.068 -0.110 -0.103 -0.065
methionine 0.066 0.036 -0.040 -0.002
myo-inositol -0.094 0.107 0.011 -0.129
myristic acid -0.154 -0.022 -0.195 0.070
nicotinamide -0.031 -0.122 -0.021 -0.050
octadecanol -0.167 0.030 -0.018 -0.145
oleic acid -0.110 -0.025 -0.105 -0.007
ononitol -0.075 -0.015 -0.062 0.051
ornithine 0.019 -0.077 0.013 -0.045
oxalate -0.144 0.100 0.043 -0.212
oxamate -0.127 0.166 -0.119 -0.053
oxoproline -0.105 0.190 0.022 -0.216
palmitic acid -0.131 -0.132 -0.202 0.028
palmitoleic acid -0.098 0.112 -0.092 0.023
pelargonic acid -0.139 0.108 -0.199 0.057
pentadecanoic acid -0.138 -0.041 -0.074 -0.007
phenylacetate -0.090 0.117 0.095 -0.205
phenylalanine 0.069 0.058 -0.097 -0.036
phosphate -0.027 -0.182 -0.045 -0.206
phthalate -0.151 0.035 0.116 -0.086
proline -0.006 0.148 0.135 -0.137
putrescine -0.069 0.216 0.057 -0.192
pyrrole-2-carboxylate 0.004 0.091 -0.043 -0.178
pyruvate -0.142 0.025 -0.125 -0.090
salicylate -0.040 0.072 -0.018 -0.060
serine -0.112 0.098 -0.094 -0.021
squalene -0.101 0.082 0.071 -0.100
stearic acid -0.145 -0.128 -0.186 0.012
succinate -0.133 0.107 -0.061 -0.212
sucrose -0.044 0.003 -0.092 -0.007
terephthalic acid -0.150 0.032 -0.117 -0.084
threitol -0.123 -0.071 0.016 0.036
threonine 0.111 0.151 0.031 0.073
threose -0.085 -0.227 0.004 0.169
thymine 0.076 0.195 0.071 -0.074
tryptophan 0.061 0.064 0.018 -0.076
uracil 0.110 -0.024 0.164 -0.124
urea 0.140 0.040 0.113 -0.044
valine 0.089 0.038 0.111 0.085
xylose -0.092 -0.140 -0.014 -0.124
polysiloxane -0.050 -0.066 -0.185 0.047
실시예 4: 주요 대사체 선정 및 이를 이용하여 포도당 배양과 합성가스 배양 구별 검증
실시예 2로부터 선정된 합성가스 발효 균주의 포도당 배양 및 합성가스 배양에서 차이를 나타내는 대표적 10개의 대사체를 이용하여 합성가스 발효 균주의 포도당 배양과 합성가스 배양을 완전히 구분하기 위하여 PCA 모델을 생성하였다(도 7). 10개의 대사체로 생성된 PCA 모델은 PC1 축을 기반으로 합성가스 배양 시의 대사체 프로파일은 양수를, 포도당 배양 시의 대사체 프로파일은 음수를 띠며 완전히 구분되었다 (도 7A). 10개의 대사체가 PCA 모델에 어떻게 관여하는지 보여주기 위하여 loading plot을 이용하여 나타내었다 (도 7B). 또한, 이러한 구분 모델이 통계학적으로 유의미한지 살펴보기 위하여 ROC curve를 적용하였다(도 8). 그 결과 sensitivity 100%, specificity 100%, AUC 1.000으로 10개의 대사체로 생성된 합성가스 발효 균주의 포도당 배양과 합성가스 배양 구분을 위한 PCA 모델이 통계학적으로 매우 유의미함을 검증할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid), 1-모노팔미틴(1-monopalmitin), 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양의 구별용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    정량 장치는 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기인 키트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    포도당 배양에서의 합성가스 발효 균은 대사체 중에서 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)은 증가하는 경향을, 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid) 및 1-모노팔미틴(1-monopalmitin)은 감소하는 경향을 나타내는 키트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    합성가스 배양에서의 합성가스 발효 균은 대사체 중에서 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid) 및 1-모노팔미틴(1-monopalmitin)은 증가하는 경향을, 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)은 감소 경향을 나타내는 키트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    혐기성 발효 균은 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans)인 키트.
  6. 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
    호기 조건에서 합성가스 발효 균의 생체시료를 초고속 여과(fast filtration)하고, 여과물을 물로 세척한 다음, 추출 용매로 물, 2-프로판올 및 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 분석 방법은 추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계; GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계를 더 포함하는, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것인, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계는 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 분석 및 검증하는 것인, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타내는 것인, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    대사체 바이오마커는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 마르가르산(heptadecanoic acid), 1-모노팔미틴(1-monopalmitin), 알라닌(alanine), N-메틸알라닌(N-methylalanine), 아데노신(adenosine), 글리세롤-1-인산(glycerol-1-phosphate) 및 발린(valine)으로 구성된 것인, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서,
    혐기성 발효 균은 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans)인, 합성가스 발효 균의 포도당 배양과 합성가스 배양을 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법.
PCT/KR2019/002146 2018-02-28 2019-02-21 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법 WO2019168300A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/975,581 US11988651B2 (en) 2018-02-28 2019-02-21 Metabolome sampling and analysis method for analyzing metabolome during synthetic gas fermentation of synthetic gas fermentation microorganisms

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180024259A KR102069868B1 (ko) 2018-02-28 2018-02-28 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법
KR10-2018-0024259 2018-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019168300A1 true WO2019168300A1 (ko) 2019-09-06

Family

ID=67805122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/002146 WO2019168300A1 (ko) 2018-02-28 2019-02-21 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11988651B2 (ko)
KR (1) KR102069868B1 (ko)
WO (1) WO2019168300A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102069868B1 (ko) * 2018-02-28 2020-01-23 고려대학교 산학협력단 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법
CN112858525B (zh) * 2021-03-04 2023-03-24 山西农业大学 一种应用低共熔溶剂提取检测水产品有害物质残留的方法
CN113311076A (zh) * 2021-07-02 2021-08-27 上海应用技术大学 一种基于醛类化合物快速区分不同品种大米的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100818202B1 (ko) * 2006-12-22 2008-03-31 한국과학기술원 미생물의 성장에 필수적인 대사산물의 스크리닝 방법
JP2011007628A (ja) * 2009-06-25 2011-01-13 National Institute Of Technology & Evaluation 新規化合物の同定法
KR20150146032A (ko) * 2014-06-20 2015-12-31 고려대학교 산학협력단 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 처리 방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5221477A (en) * 1992-06-05 1993-06-22 The Dow Chemical Company Apparatus and method for reversed permeation membrane extraction of compounds from sample solutions
US5445966A (en) * 1993-04-20 1995-08-29 Northeastern University Extractive hydrogenation for chemical analyses
US20040241721A1 (en) * 2003-05-08 2004-12-02 Gjerde Douglas T. Open channel solid phase extraction systems and methods
JP5091861B2 (ja) * 2005-07-25 2012-12-05 メタノミクス ゲーエムベーハー クロマトグラフィー／マススペクトロメトリーを用いてサンプルを分析する手段と方法
EP2329064A1 (en) * 2008-09-11 2011-06-08 The Ohio State University Research Foundation Electro-spun fibers and applications therefor
KR20150143499A (ko) * 2013-03-14 2015-12-23 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 라퀴니모드 나트륨의 결정 및 이의 개선된 제조방법
WO2014153081A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Bottle pressurization delivery system
US10278617B1 (en) * 2013-03-15 2019-05-07 Invoy Holdings, Llc Method and apparatus for sensing ammonia in breath
JP6193004B2 (ja) * 2013-06-14 2017-09-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 吸着材及びそれを用いた分析システム
US10267811B2 (en) * 2015-06-19 2019-04-23 Amy J. Reisinger Rapid and sensitive method of forensic toxicology in post-mortem subjects using oral fluid testing
US10753952B2 (en) * 2015-06-19 2020-08-25 Amy J. Reisinger Rapid and sensitive method of forensic toxicology in post-mortem subjects and in live and post-mortem animals using oral fluid testing
WO2019028011A1 (en) * 2017-08-01 2019-02-07 Gerald Thomas METHODS AND SYSTEMS FOR DETECTION OF ALDEHYDE
EP4154975A1 (en) * 2017-12-21 2023-03-29 Waters Technologies Corporation Solid phase extraction methods for enhanced removal of phospholipids from biological samples
KR102069868B1 (ko) * 2018-02-28 2020-01-23 고려대학교 산학협력단 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100818202B1 (ko) * 2006-12-22 2008-03-31 한국과학기술원 미생물의 성장에 필수적인 대사산물의 스크리닝 방법
JP2011007628A (ja) * 2009-06-25 2011-01-13 National Institute Of Technology & Evaluation 新規化合物の同定法
KR20150146032A (ko) * 2014-06-20 2015-12-31 고려대학교 산학협력단 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 처리 방법

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMADOR-NOGUEZ, D. ET AL.: "Metabolome Remodeling during the Acidogenic-Solventogenic Transition in Clostridium acetobuiy licum", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 77, no. 22, 2011, pages 7984 - 7997, XP002698028 *
FERNANDEZ-NAVEIRA, A ET AL.: "Glucose bioconversion profile in the syngas-metabolizing species Clostridium carboxidivorans", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 244, 2017, pages 552 - 559, XP085199158 *
LEE, JAE IN ET AL.: "GC/MS-based metabolomic analysis of Yersinia enterocolitica and its growth media", JOURNAL OF AGRICULTURE & LIFE SCIENCE, vol. 49, no. 4, 31 July 2015 (2015-07-31), pages 199 - 207 *
RICHTER, H ET AL., ETHANOL PRODUCTION IN SYNGAS-FERMENTING CLOSTRIDIUM LJUNGDAHLII IS CONTROLLED BY THERMODYNAMICS RATHER THAN BY ENZYME EXPRESSION, vol. 9, 2016, pages 2392 - 2399, XP055634903 *
SABRA, W. ET AL.: "Fermentation of mixed substrates by Clostridium pasteurianum and its physiological, metabolic and proteomic characterizations", MICROB CELL FACT., vol. 15, no. 114, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 1 - 14, XP055634900 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11988651B2 (en) 2024-05-21
KR102069868B1 (ko) 2020-01-23
US20200393427A1 (en) 2020-12-17
KR20190103618A (ko) 2019-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019168300A1 (ko) 합성가스 발효 균의 합성가스 발효 시의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법
Zhou et al. Metabolome profiling reveals metabolic cooperation between Bacillus megaterium and Ketogulonicigenium vulgare during induced swarm motility
Vargha et al. Optimization of MALDI-TOF MS for strain level differentiation of Arthrobacter isolates
Hsu et al. MALDI-TOF MS identification of anaerobic bacteria: assessment of pre-analytical variables and specimen preparation techniques
Dickinson et al. Species differentiation of a diverse suite of Bacillus spores by mass spectrometry-based protein profiling
Faron et al. Multicenter evaluation of the Bruker MALDI Biotyper CA system for the identification of clinical aerobic gram-negative bacterial isolates
Rodriguez-Temporal et al. Evaluation of MALDI biotyper interpretation criteria for accurate identification of nontuberculous mycobacteria
WO2018199530A2 (ko) 대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법
French et al. Diagnosis of pulmonary tuberculosis by detection of tuberculostearic acid in sputum by using gas chromatography-mass spectrometry with selected ion monitoring
CN112662727A (zh) 一种基于绝迹稀释培养组的功能微生物高通量分析和选育方法
CN106133149A (zh) 微生物分析
Shen et al. Quantitative metabolic network profiling of Escherichia coli: An overview of analytical methods for measurement of intracellular metabolites
WO2022203350A1 (ko) 머신러닝 모델을 이용하여 아토피 유무를 판별하는 방법 및 진단장치
Fernández-Esgueva et al. Use of MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) for identification of Mycobacterium species isolated directly from liquid medium
Pranada et al. MALDI Biotyping for microorganism identification in clinical microbiology
Bächli et al. Impact of MALDI-TOF MS identification on anaerobic species and genus diversity in routine diagnostics
US20220235392A1 (en) Metabolomic Characterization of Microorganisms
KR101596145B1 (ko) 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 처리 방법
Diop et al. Characterization of a novel Gram‐stain‐positive anaerobic coccus isolated from the female genital tract: Genome sequence and description of Murdochiella vaginalis sp. nov.
Sun et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry combined with UF-5000i urine flow cytometry to directly identify pathogens in clinical urine specimens within 1 hour
CN111735871A (zh) 用于大肠杆菌与志贺菌甄别的试剂盒
WO2022057943A1 (zh) 一种基于maldi-tof ms的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法
CN112051321B (zh) 结合氘水培养和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析的快速抗生素敏感性测试方法
CN113984948A (zh) 基于voc标志物的幽门螺旋杆菌感染的联合诊断模型及其建立方法和应用
Luo et al. Isolation, Identification, and Fermentation Medium Optimization of a Caproic Acid‑Producing Enterococcus casseliflavus Strain from Pit Mud of Chinese Strong Flavor Baijiu Ecosystem

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19760227

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19760227

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1