WO2019156238A1 - 注入器及びそれを用いた注入対象への生体分子を含む溶液の注入方法 - Google Patents

注入器及びそれを用いた注入対象への生体分子を含む溶液の注入方法 Download PDF

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克哉 三木
真吾 跡部
洋 宮▲崎▼
理乃 鈴木
裕子 坂口
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株式会社ダイセル
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    • A61M5/2046—Media being expelled from injector by gas generation, e.g. explosive charge

Definitions

  • the present invention relates to an injector and a method for injecting a solution containing a biomolecule to an injection target using the injector.
  • a needleless syringe may be configured to inject an injection component by applying pressure to a storage chamber in which an injection solution is stored by pressurized gas, a spring, or electromagnetic force.
  • a configuration is adopted in which a plurality of nozzle holes are formed inside the syringe body, and a piston that is driven at the time of injection is arranged corresponding to each nozzle hole (Patent Document 1).
  • an injection solution is simultaneously ejected from a plurality of nozzle holes to achieve uniform injection into the subject. Then, a plasmid containing a luciferase gene is injected into a rat, and the cells can be transferred with high efficiency.
  • a pressurized gas as an injection power source of the injection solution in a needleless syringe.
  • a pressurization form in which a large pressure is instantaneously applied at the initial stage of injection and then the applied pressure is gradually reduced over 40 to 50 msec (Patent Document 2).
  • the present invention has been made under such circumstances, and when a solution containing a biomolecule is injected into the injection target, an injector with a large ratio of biomolecules that function in the injection target with respect to the injected biomolecule, Another object of the present invention is to provide a method for injecting a solution containing a biomolecule into an injection target using the injector.
  • the present inventors have determined that the biomolecule within a predetermined time from the injection start time of the solution containing the biomolecule ejected from the injector in an injector containing the solution containing the biomolecule.
  • the injection pressure rate which is a change in the injection pressure per unit time of the solution containing, and the injection pressure of the solution containing the biomolecule within a predetermined time from the injection start time of the solution containing the biomolecule.
  • the present inventors have found that the above-mentioned injector can solve the above-mentioned problems and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a solution containing a biomolecule is injected from the injector body into the injection target without performing injection through the predetermined structure in a state where the predetermined structure is inserted into the injection target.
  • An injection pressure rate which is a change in injection pressure per unit time of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to a time of 0.20 milliseconds is 7.0 ⁇ 10 3 MPa / Injector, and the injection pressure of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to 4.0 milliseconds is less than 25 MPa.
  • the injection pressure rate, which is a change in the injection pressure per unit time of the solution containing the biomolecule, from the injection start time of the solution containing the biomolecule to the time 0.20 milliseconds is 2.3 ⁇ 10 4.
  • the injection pressure becomes a bottom value immediately after the first peak injection pressure from the time when the first peak injection pressure of the solution containing the biomolecule decreases.
  • an injector having a large ratio of biomolecules that function in the injection target to the injected biomolecule and injection using the injector
  • a method of injecting a solution containing a biomolecule into a subject can be provided.
  • a value obtained by dividing the expression level (luminescence intensity) of the gene after injecting the plasmid DNA solution containing the gene into the pig by the injection amount of the plasmid DNA solution is a graph to show.
  • the present invention includes an invention of an injector (first invention) and an invention of a method of injecting a solution containing a biomolecule into an injection target using the injector (second invention).
  • a solution containing a biomolecule from an injector body without performing injection through the predetermined structure in a state where the predetermined structure is inserted into an injection target comprising: a container for storing a solution containing a biomolecule; and an injection port through which the pressurized solution containing the biomolecule flows and is injected into the injection target
  • An injection pressure rate that is a change in the injection pressure per unit time of the solution containing a biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to a time of 0.20 milliseconds. 0.0 ⁇ 10 3 MPa / second or more, and the injection pressure of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to 4.0 milliseconds is less than 25 MPa. is there.
  • the injection is a change in the injection pressure per unit time of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to the time 0.20 milliseconds.
  • the pressure speed is 7.0 ⁇ 10 3 MPa / second or more, and the injection pressure of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to 4.0 milliseconds is less than 25 MPa.
  • the injection pressure rate of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to the time 0.20 milliseconds is 7.0 ⁇ 10 3 MPa / second or more
  • the deformation of the injection target is expected to be greatly caused
  • the injection pressure of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to 4.0 milliseconds is less than 25 MPa, It is expected not to damage the infusion subject excessively.
  • the ratio of the biomolecule that functions in the injection target to the injected biomolecule can be increased.
  • the injection pressure rate of the solution containing the biomolecule from the injection start time of the solution containing the biomolecule to the time 0.20 milliseconds is preferably 2.3 ⁇ 10 4 MPa / second or more, more preferably 3.4 ⁇ 10 4 MPa / sec or more, further preferably 6.8 ⁇ 10 4 MPa / sec or more.
  • an upper limit is not restrict
  • the injection pressure of the solution containing the biomolecule from the start time of injection of the solution containing the biomolecule to 4.0 milliseconds is preferably 20 MPa or less, and is usually higher than 0 MPa, and the living body is injected into the injection target.
  • it Since it is expected to be a sufficient output for delivering a solution containing molecules, it is preferably 1.5 MPa or more, more preferably 5.0 MPa or more, and even more preferably 7.0 MPa or more. More preferably, it is 15 MPa or more.
  • the injection pressure that reaches the bottom immediately after the first peak injection pressure is reached from the time when the first peak injection pressure of the solution containing the biomolecule starts to decrease.
  • the time to the time to perform is usually greater than 0 milliseconds and usually 6.0 milliseconds or less.
  • the proportion of biomolecules that function in the injection target can be increased.
  • the first peak injection pressure refers to the injection pressure at the earliest time among the times when the injection pressure of the solution containing biomolecules reaches the peak after the start of injection of the solution containing biomolecules.
  • the first decreasing region of the injection pressure of the solution containing the biomolecule means that the injection pressure of the solution containing the biomolecule decreases from the first peak injection pressure and reaches a bottom value immediately after the first peak injection pressure. This refers to the area where the injection pressure drops. Specifically, when the time is 6.0 milliseconds or less, it is expected that a solution containing a sufficient amount of biomolecules can be delivered without excessively penetrating the injection target due to a steep liquid flow. When the solution containing the biomolecule is injected into the injection target, the ratio of the biomolecule that functions in the injection target to the injected biomolecule can be increased.
  • the time is preferably 4.1 milliseconds or less, more preferably 1.0 milliseconds or less, further preferably 0.95 milliseconds or less, and 0.80 milliseconds. Or less, more preferably 0.40 milliseconds or less. Moreover, it is usually larger than 0 and preferably 0.30 milliseconds or longer.
  • the biomolecule injected into the injection target is not particularly limited as long as it functions in the injection target when injected into the injection target.
  • the biomolecule may be a natural product or may be artificially synthesized.
  • nucleic acid or derivative thereof nucleoside, nucleotide, or derivative thereof; amino acid, peptide, protein, or derivative thereof; lipid or derivative thereof; metal ion; low molecular compound or derivative thereof; antibiotic; vitamin or derivative thereof Etc.
  • nucleic acid it may be DNA or RNA, and they may contain genes.
  • free plasmid DNA containing a luciferase gene is used as a biomolecule, and the luciferase gene is used as a reporter gene.
  • the biomolecule injected into the injection target is fixed to a carrier such as a nanoparticle in a free form as long as the biomolecule exists stably and there is no adverse effect such as destroying the injection target to be injected.
  • the form may be sufficient and may be modified and the aspect is not specifically limited including a solvent.
  • the DNA contains a gene, it may be designed in a form in which the gene is contained in an expression cassette or expression vector.
  • the gene may be placed under the control of a promoter suitable for the type of injection target into which DNA is injected and the injection site.
  • a known genetic engineering technique can be used.
  • a mammalian expression vector pGL3 control vector Promega
  • Such plasmid vectors are known and can be obtained by those skilled in the art. Subcloning of expression vectors and recombinant vectors can be performed according to known methods.
  • the “front end side” means a side on which an injection port through which a solution containing a biomolecule is injected from the injector is disposed, Means the side opposite to the tip side of the injector, and these terms do not limit the specific location or position.
  • the injector according to the first aspect of the present invention provides a biomolecule from the injector body without performing injection through the predetermined structure in a state where the predetermined structure is inserted into the injection target.
  • a solution containing the liquid is injected into the injection target.
  • the injector according to the first aspect of the present invention is, for example, a device that guides a solution containing a biomolecule from the injector body to the injection target when the distance from the injector body to the injection target is large, for example, a catheter.
  • a predetermined structure such as the above may be included. Therefore, the injector according to the first aspect of the present invention may or may not include such a predetermined structure. If the predetermined structure is included, the predetermined structure is injected. A solution containing a biomolecule inserted into the subject is not injected into the injection subject.
  • the drive unit for pressurizing the solution containing the biomolecule is not particularly limited.
  • the pressurization may be, for example, a pressure generated when the pressure of the compressed gas is released, or may be a pressure generated by combustion of explosives ignited by the ignition device.
  • pressurization using electromagnetic force for example, pressurization by a linear electromagnetic actuator may be used.
  • at least the pressure generated by the combustion of the explosive ignited by the igniter is used, and may be used in combination with either one of the other two pressurization modes or both.
  • explosives include, for example, explosives (ZPP) containing zirconium and potassium perchlorate, titanium hydride and perchloric acid Gunpowder containing potassium (THPP), Gunpowder containing titanium and potassium perchlorate (TiPP), Gunpowder containing aluminum and potassium perchlorate (APP), Gunpowder containing aluminum and bismuth oxide (ABO), Aluminum and molybdenum oxide.
  • ZPP explosives
  • THPP gunpowder containing potassium
  • TiPP Gunpowder containing titanium and potassium perchlorate
  • APP Gunpowder containing aluminum and potassium perchlorate
  • ABO Aluminum and molybdenum oxide
  • It may be an explosive comprising any one of explosives containing (AMO), explosives containing aluminum and copper oxide (ACO), explosives containing aluminum and iron oxide (AFO), or a combination thereof.
  • the gas generating agent includes various gases used in single-base smokeless explosives, gas generators for airbags and gas generators for seat belt pretensioners. It is also possible to use a generator.
  • the solution containing the biomolecule is not contained in the filling chamber from the beginning, but the solution containing the biomolecule is introduced into the filling chamber via the nozzle having the injection port. Accommodates by aspiration.
  • the syringe portion is configured to be detachable.
  • a syringe 1 needleless syringe
  • the structure of the following embodiment is an illustration and the 1st invention of this invention is not limited to the structure of this embodiment.
  • front end side and proximal end side are used as terms representing a relative positional relationship in the longitudinal direction of the syringe 1.
  • the “front end side” represents a position closer to the distal end of the syringe 1, which will be described later, that is, a position closer to the injection port 31a. That is, the direction on the drive unit 7 side is shown.
  • this example is an example in which the combustion energy of the explosive ignited by the ignition device is used as the injection energy, and the DNA solution is used as the solution containing the biomolecule, but the first invention of the present invention is limited to this. Is not to be done.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of the syringe 1, and is also a cross-sectional view of the syringe 1 along its longitudinal direction.
  • the syringe 1 includes a syringe assembly 10 in which a subassembly composed of a syringe part 3 and a plunger 4 and a subassembly composed of a syringe body 6, a piston 5, and a drive part 7 are assembled together. , And is configured by being attached to a housing (syringe housing) 2.
  • the syringe assembly 10 is configured to be detachable from the housing 2.
  • the filling chamber 32 formed between the syringe part 3 and the plunger 4 included in the syringe assembly 10 is filled with the DNA solution, and the syringe assembly 10 is disposable every time the DNA solution is ejected. Is a unit.
  • a battery 9 for supplying electric power to an igniter 71 included in the drive unit 7 of the syringe assembly 10 is included on the housing 2 side.
  • the power supply from the battery 9 is performed by the user pressing the button 8 provided on the housing 2, so that the electrode on the housing 2 side and the electrode on the drive unit 7 side of the syringe assembly 10 are connected via the wiring. Will be done between.
  • the electrode on the housing 2 side and the electrode on the drive unit 7 side of the syringe assembly 10 are designed so that the shape and position of both electrodes are automatically contacted when the syringe assembly 10 is attached to the housing 2.
  • the housing 2 is a unit that can be used repeatedly as long as the electric power that can be supplied to the drive unit 7 remains in the battery 9. In the housing 2, when the power of the battery 9 is exhausted, only the battery 9 may be replaced and the housing 2 may continue to be used.
  • the explosive combustion in the igniter 71 is performed.
  • a gas generating agent or the like that burns with the combustion products generated by the above to generate gas can be disposed in the igniter 71 or in the through hole of the syringe body 6.
  • the configuration in which the gas generating agent is arranged in the igniter 71 is a known technique as disclosed in International Publication No. 01-031282, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-25950, and the like.
  • the gas generating agent a single base smokeless gunpowder composed of 98% by mass of nitrocellulose, 0.8% by mass of diphenylamine and 1.2% by mass of potassium sulfate can be mentioned. It is also possible to use various gas generating agents that are used in gas generators for airbags and gas generators for seat belt pretensioners. It is possible to change the combustion completion time of the gas generating agent by adjusting the size, size, and shape, particularly the surface shape of the gas generating agent when arranged in the through-hole.
  • the pressure transition applied to the solution can be a desired transition, that is, a transition in which the DNA solution can be appropriately injected into the injection target. In the first invention of the present invention, it is assumed that the gas generating agent used as necessary is also included in the drive unit 7.
  • the injection target in the first invention of the present invention may be any of a cell, a cell sheet, a tissue, an organ (organ), an organ system, an individual (living body), and the like, and is not limited. Moreover, about the upper hierarchy as said injection
  • a preferable infusion target includes the infusion subject derived from mammals.
  • a mammal individual living body
  • one or more tissues selected from the group consisting of intradermal, subcutaneous and skin muscles in the skin are ejected from the injector onto the skin surface of a mammal individual (living body).
  • the method of injecting can be adopted.
  • a system for injecting a solution containing a biomolecule from an injector into an injection target may be any of an in vitro system, an in vivo system, and an ex vivo system.
  • a second invention of the present invention is a method for injecting a solution containing a biomolecule into an injection target using the injector of the first invention.
  • the injector, the injection target, and the solution containing the biomolecule in the second invention of the present invention the above description of the first invention of the present invention is incorporated.
  • Example 1-1 Evaluation of injector injection pressure [Example 1-1]
  • the injector (nozzle diameter: 0.1 mm diameter) shown in FIG. 1 was filled with 100 ⁇ L of water, and the injection pressure in the injector from the pressurization of water by the combustion of the igniting agent until after injection was evaluated.
  • As the explosive 55 mg of an explosive (ZPP) containing zirconium and potassium perchlorate was used, and 40 mg of a single base smokeless explosive (hereinafter sometimes referred to as “GG”) was used as a gas generating agent.
  • ZPP an explosive
  • GG single base smokeless explosive
  • the injection force is distributed and applied to the diaphragm of the load cell arranged downstream of the nozzle, and the output from the load cell is Measured by a method in which the data is collected by the data collection display device through the detection amplifier and displayed and stored as the time-dependent power (N), and the power (N) is divided by the area of the nozzle opening.
  • N time-dependent power
  • FIG. 2 is a graph showing the time course of water injection pressure in each example.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the initial 0.20 millisecond graph in FIG. Table 1 shows each parameter.
  • Example 2-1 Evaluation of gene expression using rats
  • the syringe used in Example 1-1 was filled with 30 ⁇ L of a plasmid pGL3-control vector (Promega) solution containing a luciferase gene (solvent: endotoxin-free TE buffer, final concentration: 1.0 mg / mL), It injected into the skin of the back of a female SD rat (10 weeks old).
  • a lysate prepared by diluting “Cell Culture Lysis ⁇ 5” of Luciferase assay system (Promega) 5 times and placing 1.5 mL in a 2 mL microtube.
  • Subcutaneous and cutaneous muscles were cut to a size of about 1 cm square and added to the lysate. Using dissecting scissors, finely chop the tissue into fine particles of 2 mm square or less in the lysate (the scissors were moved about 100 minutes about 2 minutes). Stir with a vortex mixer or ultrasonic cleaner for 10 seconds. did. Next, the microtube was frozen at ⁇ 80 ° C. or in a dry ice atmosphere for about 15 minutes. After confirming that it was frozen, it was left at room temperature for about 20 minutes and thawed. This freezing and thawing was repeated three times in total to promote cell destruction.
  • the sample was centrifuged (temperature 4 ° C., rotation speed 2000 rpm, time 5 min), and a supernatant was obtained.
  • the luciferase assay was performed using Lumitester C100 (Kikkoman Biochemifa Co., Ltd.).
  • Luciferase Assay Substrate of Luciferase assey system was returned to room temperature and opened, and 10 mL of Luciferase Assay Buffer returned to room temperature was added thereto. It was shaken lightly to avoid foaming, and it was confirmed that it was dissolved. 100 ⁇ L of this was added to the Lumi tube, and 20 ⁇ L of the serum sample to be measured was added.
  • Example 2-1 was the same as Example 2-1 except that the injector used in Example 1-2 was used.
  • Example 2-3 Example 2-1 was the same as Example 2-1 except that the injector used in Example 1-3 was used.
  • Example 2-4 Example 2-1 was the same as Example 2-1 except that the injector used in Example 1-4 was used.
  • FIG. 4 is a graph showing the value obtained by dividing the expression level (luminescence intensity) of the luciferase gene by the plasmid DNA injection amount in each Example.
  • the horizontal line in the graph indicates the average value.
  • Example 3-1 Evaluation of gene expression using pigs
  • the injector used in Example 1-1 was filled with 100 ⁇ L of a plasmid pGL3-control vector (Promega) solution containing a luciferase gene (solvent: endotoxin-free TE buffer, final concentration: 1 mg / mL) for female edible use.
  • the procedure was the same as in Example 2-1, except that the skin was injected into the abdomen of a pig (3 months old, weighing approximately 65 kg), and after 24 hours of breeding, intradermal tissue was used as a sample for luciferase assay.
  • FIG. 5 is a graph showing the value obtained by dividing the expression level (luminescence intensity) of the luciferase gene by the plasmid DNA injection amount in Example 3-1.
  • the horizontal line in the graph indicates the average value.

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Abstract

本発明の課題は、注入対象に生体分子を含む溶液が注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合が大きい注入器、及び、前記注入器を用いて注入対象に生体分子を含む溶液を注入する方法の提供であり、該課題を、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、生体分子を含む溶液を収容する収容部と、加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、所定の条件を満たす、注入器で解決する。

Description

注入器及びそれを用いた注入対象への生体分子を含む溶液の注入方法
　本発明は、注入器及びそれを用いた注入対象への生体分子を含む溶液の注入方法に関する。
　生体等に薬液を注入する注入器として、注射針を介して注射を行う有針注射器、注射針を介することなく注射を行う無針注射器のほか、薬液を注入対象に輸送するために注射針や駆動源を備えたカテーテルなどが存在する。
　このうち無針注射器では、加圧ガスやバネ、電磁力により注射液が収容された収容室に対して圧力を加えることで注射成分を射出する構成が採られることがある。例えば、注射器本体の内部に複数のノズル孔が形成されるとともに、各ノズル孔に対応して射出時に駆動されるピストンを配置させる構成が採用されている（特許文献１）。この構成により、複数のノズル孔から注射液を同時に噴射させて対象への均一な注射を実現しようとしている。そして、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドをラットに注射し、高効率に細胞移入できている。
　また、無針注射器での注射液の射出動力源として、加圧ガスを利用する形態がある。例えば、射出初期に瞬間的に大きな加圧を行った後、40～50msecかけて加圧力を徐々に低減させていく加圧形態が例示されている（特許文献２）。
　しかし、注入器を用いて注入対象に生体分子を含む溶液が注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合が大きくなるために必要な、注入器からの該生体分子を含む溶液の射出条件に着目した報告はなされていない。
特開２００４－３５８２３４号公報 米国特許出願公開第２００５／００１０１６８号明細書
　本発明はこの様な状況下でなされたものであり、注入対象に生体分子を含む溶液が注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合が大きい注入器、及び、前記注入器を用いて注入対象に生体分子を含む溶液を注入する方法の提供を課題とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、生体分子を含む溶液を収容した注入器において、該注入器から射出される該生体分子を含む溶液の射出開始時刻から所定時間内の、該生体分子を含む溶液の単位時間当たりの射出圧力の変化である射出圧力速度、及び、該生体分子を含む溶液の射出開始時刻から所定の時間内の該生体分子を含む溶液の射出圧力に着目した結果、下記の注入器が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、生体分子を含む溶液を収容する収容部と、加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の単位時間当たりの射出圧力の変化である射出圧力速度が７．０×１０３ＭＰａ／秒以上であり、かつ、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から４．０ミリ秒までの前記生体分子を含む溶液の射出圧力が２５ＭＰａ未満である、注入器。
〔２〕前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の単位時間当たりの射出圧力の変化である射出圧力速度が２．３×１０４ＭＰａ／秒以上である、〔１〕に記載の注入器。
〔３〕前記生体分子を含む溶液の射出圧力の第一下降領域において、前記生体分子を含む溶液の第一ピーク射出圧力の下降開始時刻から前記第一ピーク射出圧力直後の底値となる射出圧力に到達する時刻までの時間が、６．０ミリ秒以下である、〔１〕又は〔２〕に記載の注入器。
〔４〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の注入器を用いて、注入対象に生体分子を含む溶液を注入する方法。
　本発明によれば、注入対象に生体分子を含む溶液が注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合が大きい注入器、及び、前記注入器を用いて注入対象に生体分子を含む溶液を注入する方法を提供できる。
本発明の第一の発明の一実施態様に係る注入器の概略構成を示す図である。 本発明の第一の発明の一実施態様に係る、充填した水の射出圧力の時間経過を示すグラフである。 本発明の第一の発明の一実施態様に係る、充填した水の射出圧力の時間経過を示すグラフである。 本発明の第二の発明の一実施態様に係る、ラットへ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ溶液を注入した後の該遺伝子の発現量（発光強度）を、該プラスミドＤＮＡ溶液の注入量で除した値を示すグラフである。 本発明の第二の発明の一実施態様に係る、ブタへ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ溶液を注入した後の該遺伝子の発現量（発光強度）を、該プラスミドＤＮＡ溶液の注入量で除した値を示すグラフである。
　本発明は、注入器の発明（第一の発明）、及び、前記注入器を用いて注入対象に生体分子を含む溶液を注入する方法の発明（第二の発明）を含む。
＜第一の発明＞
　本発明の第一の発明は、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、生体分子を含む溶液を収容する収容部と、加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の単位時間当たりの射出圧力の変化である射出圧力速度が７．０×１０３ＭＰａ／秒以上であり、かつ、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から４．０ミリ秒までの前記生体分子を含む溶液の射出圧力が２５ＭＰａ未満である、注入器である。
　本発明の第一の発明に係る注入器では、生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の単位時間当たりの射出圧力の変化である射出圧力速度が７．０×１０３ＭＰａ／秒以上であり、かつ、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から４．０ミリ秒までの前記生体分子を含む溶液の射出圧力が２５ＭＰａ未満であることにより、前記生体分子を含む溶液が注入対象に注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合を大きくすることができる。
　詳細には、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の射出圧力速度が７．０×１０３ＭＰａ／秒以上であることにより、上記注入対象の変形が大きく引き起こされると期待され、また、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から４．０ミリ秒までの前記生体分子を含む溶液の射出圧力が２５ＭＰａ未満であることにより、注入対象を過度に損傷しないと期待される。その結果、前記生体分子を含む溶液が注入対象に注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合を大きくすることができる。
　このとき、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の射出圧力速度は２．３×１０４ＭＰａ／秒以上であることが好ましく、３．４×１０４ＭＰａ／秒以上であることがより好ましく、６．８×１０４ＭＰａ／秒以上であることがさらに好ましい。また、上限は特に制限されないが、例えば、７．５×１０４ＭＰａ／秒以下が挙げられる。
　また、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から４．０ミリ秒までの前記生体分子を含む溶液の射出圧力は２０ＭＰａ以下であることが好ましく、また、通常０ＭＰａよりも大きく、注入対象へ生体分子を含む溶液を送達する十分な出力であると期待されることから、１．５ＭＰａ以上であることが好ましく、５．０ＭＰａ以上であることがより好ましく、７．０ＭＰａ以上であることが更に好ましく、１５ＭＰａ以上であることがより更に好ましい。
　また、前記生体分子を含む溶液の射出圧力の第一下降領域において、前記生体分子を含む溶液の第一ピーク射出圧力の下降開始時刻から前記第一ピーク射出圧力直後の底値となる射出圧力に到達する時刻までの時間が、通常０ミリ秒より大きく、また、通常６．０ミリ秒以下であることにより、前記生体分子を含む溶液が注入対象に注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合を大きくすることができる。
　ここで、第一ピーク射出圧力とは、生体分子を含む溶液の射出開始後、前記生体分子を含む溶液の射出圧力がピークを迎える時刻のうちの最も早い時刻の射出圧力を指す。また、生体分子を含む溶液の射出圧力の第一下降領域とは、生体分子を含む溶液の射出圧力が、第一ピーク射出圧力から下降し、該第一ピーク射出圧力の直後の底値となるまでの射出圧力が下降する領域を指す。
　詳細には、該時間が６．０ミリ秒以下であることにより、急峻な液流により注入対象を過剰に貫通せずに十分量の生体分子を含む溶液が送達されると期待され、その結果、前記生体分子を含む溶液が注入対象に注入された場合に、注入された生体分子に対する注入対象において機能する生体分子の割合を大きくすることができる。
　このとき、該時間は、４．１ミリ秒以下であることが好ましく、１．０ミリ秒以下であることがより好ましく、０．９５ミリ秒以下であることが更に好ましく、０．８０ミリ秒以下であることがより更に好ましく、０．４０ミリ秒以下であることが格段に好ましい。また、通常０より大きく、０．３０ミリ秒以上であることが好ましい。
　本発明の第一の発明における、注入対象に注入される生体分子とは、注入対象に注入された際に該注入対象において機能するものであれば特に制限されない。また、該生体分子は天然物であってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、核酸又はその誘導体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、又はそれらの誘導体；アミノ酸、ペプチド、タンパク質、又はそれらの誘導体；脂質又はその誘導体；金属イオン；低分子化合物、又はその誘導体；抗生物質；ビタミン又はその誘導体等が挙げられる。核酸であれば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、それらは遺伝子を含んでもよい。後述の実施例では、生体分子として、ルシフェラーゼ遺伝子を含む遊離のプラスミドＤＮＡを用い、該ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いている。
　注入対象に注入される生体分子は、生体分子が安定して存在し、また、注入される注入対象を破壊するなどの悪影響がなければ、遊離の形態でもナノ粒子等の担体に固定されている形態でもよく、修飾されていてもよく、溶媒を含め、その態様は特に限定されない。
　ＤＮＡが遺伝子を含む場合には、発現カセットや発現ベクターに該遺伝子が含まれた形態で設計されること等が挙げられる。さらに、例えば、ＤＮＡが注入される注入対象の種類および注入部位に適したプロモーターの制御下に遺伝子が配置されていてもよい。すなわち、いずれの態様においても公知の遺伝子工学的手法を用いることができる。後述の実施例では、発現ベクターとして、哺乳類発現ベクターであるpGL3 control vector（プロメガ社製）を用いている。当該プラスミドベクターは公知であり、当業者であれば入手可能である。発現ベクター及び組換えベクターのサブクローニングは公知の方法に従って行うことができる。
（生体分子の機能）
　注入対象へ注入された生体分子に対する該注入対象において機能する生体分子の割合が大きいことの例としては、生体分子としてのＤＮＡが遺伝子を含む場合、該注入対象へ注入されたＤＮＡ量に対して該遺伝子の発現量が大きいことが挙げられる。その確認方法としては、例えば、後述の実施例のように、注入対象へのＤＮＡ溶液の注入後、該ＤＮＡ溶液の注入口を中心に所望の半径を有する円筒状に組織を採取し、公知の生物学的方法によりサンプルを調製し、該遺伝子の発現量アッセイにより確認できる。該遺伝子の種類等によって適宜公知の方法を用いることができるが、例えば、遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合には、ルシフェリンを基質として発光量をアッセイする例等が挙げられる。
　本発明の第一の発明に係る注入器において、「先端側」とは、注入器から生体分子を含む溶液が射出される射出口が配置されている側を意味し、「基端側」とは、注入器において先端側とは反対の側を意味するものであり、これらの文言は、特定の箇所や位置を限定的に指すものではない。
　本発明の第一の発明に係る注入器は、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入するものである。本発明の第一の発明に係る注入器は、例えば、注入器本体から注入対象までの距離が大きい場合等に、生体分子を含む溶液を注入器本体から注入対象まで誘導するもの、例えば、カテーテル等のような所定の構造物を含んでもよい。したがって、本発明の第一の発明に係る注入器とは、そのような所定の構造物を含んでも含まなくてもよいが、所定の構造物を含む場合には、該所定の構造物が注入対象内に挿入された状態で生体分子を含む溶液が該注入対象に注入されるものではない。
　本発明の第一の発明に係る注入器において、生体分子を含む溶液を加圧するための駆動部は特に制限されない。加圧は、例えば、圧縮ガスの圧力が解放される際に生じる圧力によってもよいし、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力によってもよい。また、電磁力を用いた加圧、例えば、リニア電磁アクチュエータによる加圧によってもよい。好ましくは、少なくとも、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力を用いる態様であり、さらには、上記他の２つの加圧態様のいずれか、または両者と併用してもよい。
　加圧として、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力を用いる態様を採用する場合、火薬としては、例えば、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）、水素化チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴＨＰＰ）、チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴｉＰＰ）、アルミニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＡＰＰ）、アルミニウムと酸化ビスマスを含む火薬（ＡＢＯ）、アルミニウムと酸化モリブデンを含む火薬（ＡＭＯ）、アルミニウムと酸化銅を含む火薬（ＡＣＯ）、アルミニウムと酸化鉄を含む火薬（ＡＦＯ）のうち何れか一つの火薬、又はこれらのうち複数の組み合わせからなる火薬であってもよい。これらの火薬の特徴としては、その燃焼生成物が高温状態では気体であっても常温では気体成分を含まないため、点火後燃焼生成物が直ちに凝縮を行う。
　また、ガス発生剤の発生エネルギーを射出エネルギーとして利用する場合、ガス発生剤としては、シングルベース無煙火薬や、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。
　本発明の第一の発明に係る注入器では、充填室には当初から生体分子を含む溶液が収容されているのではなく、射出口を有するノズルを介して生体分子を含む溶液を充填室内に吸引することにより収容する。このように、充填室への充填操作を必要とする構成を採用することで、必要とする任意の生体分子を含む溶液を注入対象に注入することが可能となる。そのため、本発明の第一の発明に係る注入器では、シリンジ部は着脱可能に構成されている。
　以下に、図面を参照して本発明の第一の発明における一実施形態に係る注入器の例として、注射器１（無針注射器）について説明する。なお、以下の実施形態の構成は例示であり、本発明の第一の発明はこの実施の形態の構成に限定されるものではない。なお、注射器１の長手方向における相対的な位置関係を表す用語として、「先端側」及び「基端側」を用いる。当該「先端側」は、後述する注射器１の先端寄り、すなわち射出口３１ａ寄りの位置を表し、当該「基端側」は、注射器１の長手方向において「先端側」とは反対側の方向、すなわち駆動部７側の方向を表している。また、本例示は、点火装置によって点火される火薬の燃焼エネルギーを射出エネルギーとして、また、ＤＮＡ溶液を、生体分子を含む溶液として用いる例示であるが、本発明の第一の発明はこれに限定されるものではない。
（注射器１の構成）
　図１は、注射器１の概略構成を示す図であり、注射器１のその長手方向に沿った断面図でもある。注射器１は、シリンジ部３とプランジャ４とで構成されるサブ組立体と、注射器本体６とピストン５と駆動部７とで構成されるサブ組立体とが一体に組み立てられた注射器組立体１０が、ハウジング（注射器ハウジング）２に取り付けられることで構成される。
　上記の通り、注射器組立体１０は、ハウジング２に対して脱着自在となるように構成されている。注射器組立体１０に含まれるシリンジ部３とプランジャ４との間に形成される充填室３２にはＤＮＡ溶液が充填され、そして、当該注射器組立体１０は、ＤＮＡ溶液の射出を行う度に使い捨てられるユニットである。一方で、ハウジング２側には、注射器組立体１０の駆動部７に含まれる点火器７１に電力供給するバッテリ９が含まれている。バッテリ９からの電力供給は、ユーザがハウジング２に設けられたボタン８を押下する操作を行うことで、配線を介してハウジング２側の電極と、注射器組立体１０の駆動部７側の電極との間で行われることになる。なお、ハウジング２側の電極と注射器組立体１０の駆動部７側の電極とは、注射器組立体１０がハウジング２に取り付けられると、自動的に接触するように両電極の形状および位置が設計されている。またハウジング２は、バッテリ９に駆動部７に供給し得る電力が残っている限りにおいて、繰り返し使用することができるユニットである。なお、ハウジング２においては、バッテリ９の電力が無くなった場合には、バッテリ９のみを交換しハウジング２は引き続き使用してもよい。
　また、図１に示す注射器本体６内には、特に追加的な火薬成分は配置されていないが、ピストン５を介して注射液にかける圧力推移を調整するために、点火器７１での火薬燃焼によって生じる燃焼生成物によって燃焼しガスを発生させるガス発生剤等を、点火器７１内や注射器本体６の貫通孔内に配置することもできる。点火器７１内にガス発生剤を配置する構成は、国際公開公報０１－０３１２８２号や特開２００３－２５９５０号公報等に開示されているように既に公知の技術である。また、ガス発生剤の一例としては、ニトロセルロース９８質量％、ジフェニルアミン０．８質量％、硫酸カリウム１．２質量％からなるシングルベース無煙火薬が挙げられる。また、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。貫通孔内に配置されるときのガス発生剤の寸法や大きさ、形状、特に表面形状を調整することで、該ガス発生剤の燃焼完了時間を変化させることが可能であり、これにより、ＤＮＡ溶液にかける圧力推移を所望の推移、すなわち注入対象にＤＮＡ溶液が適切に注入され得る推移とすることができる。本発明の第一の発明では、必要に応じて使用されるガス発生剤なども駆動部７に含まれるものとする。
（注入対象）
　本発明の第一の発明における注入対象は、例えば、細胞、細胞シート、組織、器官（臓器）、器官系、個体（生体）等のいずれであってもよく制限はない。また、前記注入対象として上の階層については、それに含まれる下の階層を対象とするものであってよい。すなわち、例えば、組織を注入対象とする場合、該組織に含まれる細胞を注入対象としてよく、該組織に含まれる細胞間マトリックスを注入対象としてもよく、両者を注入対象としてもよい。
　好ましい注入対象としては、哺乳動物由来の前記注入対象が挙げられる。より好ましくは、哺乳動物個体（生体）の皮膚であり、さらに好ましくは、皮膚内の皮内、皮下及び皮筋からなる群から選択される一以上の組織である。この場合、注入器から哺乳動物個体（生体）の皮膚表面に生体分子を含む溶液を射出し、該皮膚表面から該皮膚内の皮内、皮下及び皮筋からなる群から選択される一以上の組織に注入する方法を採用できる。
　また、注入器から注入対象に生体分子を含む溶液を注入する場合の系としては、in vitro系、in vivo系、ex vivo系をはじめ、いずれであってもよい。
　また、哺乳動物としては特に制限されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ等が挙げられる。また、注入対象によっては、哺乳動物としてヒトを除く態様も挙げられる。
＜第二の発明＞
　本発明の第二の発明は、第一の発明の注入器を用いて、注入対象に生体分子を含む溶液を注入する方法である。
　本発明の第二の発明における注入器、注入対象、生体分子を含む溶液については、上記した本発明の第一の発明の説明を援用する。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。
（注入器の射出圧力の評価）
［実施例１－１］
　図１に示す注入器（ノズル径：直径０．１ｍｍ）に、１００μＬの水を充填し、点火薬の燃焼による水の加圧から射出後までの注入器内の射出圧力を評価した。火薬として、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）を５５ｍｇ用い、ガス発生剤として、シングルベース無煙火薬（以下、「ＧＧ」と称することがある。）を４０ｍｇ用いた。
　射出圧力の測定は、特開2005-21640号公報に記載の測定方法のように、射出の力を、ノズルの下流に配置されたロードセルのダイアフラムに分散して与えるようにし、ロードセルからの出力は、検出増幅器を介してデータ採取表示装置にて採取されて、時間毎の射出力（Ｎ）として表示、記憶されるという方法によって測定し、該射出力（Ｎ）をノズル口の面積で除して算出した。
［実施例１－２］
　ＺＰＰを３５ｍｇ用いたこと以外は、実施例１－１と同様にした。
［実施例１－３］
　ＺＰＰを１５ｍｇ用いたこと以外は、実施例１－１と同様にした。
［実施例１－４］
　ＺＰＰを２５ｍｇ用いたこと以外は、実施例１－１と同様にした。
　図２は、各実施例における、水の射出圧力の時間経過を示すグラフである。また、図３は、図２における初期０．２０ミリ秒間のグラフを拡大したものである。また、表１に各パラメータを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ラットを用いた遺伝子発現評価）
［実施例２－１］
　上記実施例１－１で用いた注入器に、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGL3-control vector（プロメガ社製）溶液３０μＬ（溶媒：エンドトキシンフリーＴＥバッファ、終濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）を充填し、雌性ＳＤラット（１０週齢）の腰背部の皮膚に注入した。
　Luciferase assay system（プロメガ社）の「Cell Culture Lysis×５」を５倍希釈して２ｍＬマイクロチューブに１．５ｍＬ入れた溶解液を準備し、注射口を中心として皮内から皮筋（すなわち、皮内、皮下及び皮筋）までの組織を約１ｃｍ角のサイズで切り取り、該溶解液へ添加した。解剖用ハサミを用いて、溶解液内で組織が２ｍｍ角以下の細かい粒子になるまで細かく切り刻み（約２分、１００回程度ハサミを動かした。）、１０秒間ボルテックスミキサー又は超音波洗浄器で攪拌した。次に、マイクロチューブを－８０℃又はドライアイス雰囲気に約１５分入れて凍結した。凍結したことを確認し、室温下に約２０分放置し解凍した。この凍結と解凍を計３回繰り返し、細胞の破壊を促した。その後、サンプルを遠心分離（温度４℃、回転数２０００ｒｐｍ、時間５ｍｉｎ）し、上清を取得した。
　ルシフェラーゼアッセイはルミテスターＣ１００（キッコーマンバイオケミファ株式会社製）を用いて行った。まず、Luciferase assey systemのLuciferase Assay Substrateを室温に戻して開封し、その中に室温に戻したLuciferase Assay Bufferを１０ｍＬ加えた。泡立てないように軽く振りまぜ、溶解していることを確認した。これをルミチューブに１００μＬ添加し、測定する血清サンプルを２０μＬ添加した。約２０秒以内にルミテスターの測定室にサンプルを入れて測定をし、発光強度を取得した。該発光強度は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量と相関する。
［実施例２－２］
　上記実施例１－２で用いた注入器を用いたこと以外は、実施例２－１と同様にした。
［実施例２－３］
　上記実施例１－３で用いた注入器を用いたこと以外は、実施例２－１と同様にした。
［実施例２－４］
　上記実施例１－４で用いた注入器を用いたこと以外は、実施例２－１と同様にした。
　図４は、各実施例における、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量（発光強度）をプラスミドＤＮＡ注入量で除した値を示すグラフである。グラフ中の横線は平均値を示す。
（ブタを用いた遺伝子発現評価）
［実施例３－１］
　上記実施例１－１で用いた注入器に、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGL3-control vector（プロメガ社製）溶液１００μＬ（溶媒：エンドトキシンフリーＴＥバッファ、終濃度：１ｍｇ／ｍＬ）を充填し、雌性食用ブタ（３ヵ月齢、体重約６５ｋｇ）の腹部の皮膚に注入しその24時間飼育後に、ルシフェラーゼアッセイのサンプルとして皮内組織を用いたこと以外は、実施例２－１と同様にした。
　図５は、実施例３－１における、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量（発光強度）をプラスミドＤＮＡ注入量で除した値を示すグラフである。グラフ中の横線は平均値を示す。
　１・・・・注射器
　２・・・・ハウジング
　３・・・・シリンジ部
　４・・・・プランジャ
　５・・・・ピストン
　６・・・・注射器本体
　７・・・・駆動部
　８・・・・ボタン
　９・・・・バッテリ
　１０・・・・注射器組立体
　３１・・・・ノズル部
　３１ａ・・・射出口
　３２・・・・充填室
　７１・・・・点火器

Claims (4)

  1. 　注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、
    　生体分子を含む溶液を収容する収容部と、
    　加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、
    　を備え、
    　前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の単位時間当たりの射出圧力の変化である射出圧力速度が７．０×１０３ＭＰａ／秒以上であり、かつ、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から４．０ミリ秒までの前記生体分子を含む溶液の射出圧力が２５ＭＰａ未満である、
    　注入器。
  2. 　前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの、前記生体分子を含む溶液の単位時間当たりの射出圧力の変化である射出圧力速度が２．３×１０４ＭＰａ／秒以上である、
    　請求項１に記載の注入器。
  3. 　前記生体分子を含む溶液の射出圧力の第一下降領域において、前記生体分子を含む溶液の第一ピーク射出圧力の下降開始時刻から前記第一ピーク射出圧力直後の底値となる射出圧力に到達する時刻までの時間が、６．０ミリ秒以下である、
    　請求項１又は２に記載の注入器。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の注入器を用いて、注入対象に生体分子を含む溶液を注入する方法。
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