WO2019146670A1 - 光応答性Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄリガンド - Google Patents

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WO2019146670A1
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smo
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与志穂 池内
龍志 三澤
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to Smoothened ligands that activate in response to light.
  • the Hedgehog signaling pathway plays an important role in embryo development and tissue regeneration in order for each cell to obtain correct positional information, and is a signal transduction pathway centered on Hedgehog proteins. If this pathway is inhibited, serious developmental abnormalities etc. may be caused and it may be fatal (Non-patent Document 1). In adults, abnormal hedgehog signals have been reported to be involved in the formation and progression of tumors such as osteoblasts, basal cell carcinoma and rhabdomyosarcoma (Non-patent documents 2 and non-patent documents) 3 etc.).
  • Non-patent document 4 agonists are used as therapeutic agents for cerebral ischemia such as cerebral infarction and cerebral hemorrhage
  • antagonists are anticancer agents. Attention has been focused on its use as an agent (such as Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3).
  • Hedgehog signaling is initiated by hedgehog proteins.
  • the 12-transmembrane receptor Patched Ptch
  • the 12-transmembrane receptor Patched Ptch
  • Smo 7-transmembrane GPCR-like receptor Smoothed
  • Sufu Sypressor of Fused
  • Gli transcription factor
  • Gli R functions as a repressor of the hedgehog response gene and represses transcription of hedgehog target genes such as GLI1 and PTCH1.
  • Hedgehog pathway agonists or antagonists have been developed for the purpose of treating developmental abnormalities or tumorigenesis caused by Hedgehog pathway abnormalities. Excessive activation of hedgehog pathways has been shown to cause a variety of cancers such as osteoblasts, rhabdomyosarcoma brain tumors, basal cell carcinomas, lung carcinomas and breast carcinomas. Therefore, hedgehog pathway antagonists are expected to be used as candidates for anticancer agents, and many antagonists have been reported (Patent Document 1, Non-patent Document 3, Non-patent Document 5 and Non-patent Document 6).
  • hedgehog pathway agonists are expected to be therapeutic agents for developmental disorders, neurodegenerative diseases, bone degeneration diseases, diabetes and obesity, as well as ischemia such as ischemic heart disease and cerebral ischemic disease (non- Patent Document 4).
  • SAG Smoothened agonist
  • Pumorphamine Non-patent document 4
  • SAG is a small molecule compound that binds to the heptahelical domain of Smo, and several compounds with a common skeleton have been reported, and detailed studies have been conducted on substituents that are important for agonist activity (non-patented) Literature 4).
  • Hedgehog proteins which play a major role in hedgehog pathways, have been identified as three hedgehog homologs in mammals: Sonic hedgehog, Indian hedgehog and Desert hedgehog. Among them, research on sonic hedgehog is the most advanced. Sonic hedgehog acts as a morphogen, for example, in determining the axis of the neural tube in the early development of the brain. In recent years, it has been attempted to culture pluripotent stem cells as aggregates and induce differentiation of three-dimensional tissue, and artificial brain tissue (such as Non-patent document 7 and Non-patent document 8) and lung epithelium (non-patent document) There have been many attempts to use organoids such as the reference 9) as a human disease model. However, the artificial brain tissue obtained in the uniform culture solution used in the existing report can not freely define the body axis, and various parts of the brain are formed disorderly, which is a disease model. The practical use is far from now.
  • the present invention is directed to induction and developmental disorders of artificial tissues in which component cells are properly disposed, neurodegenerative diseases, bone degeneration diseases, diabetes and obesity, as well as ischemic heart diseases and cerebral ischemia diseases etc.
  • a light responsive Smoothened agonist (a light responsive Smo agonist) for use in the treatment of blood and the like, and a light responsive Smoothened antagonist (a light responsive Smo that can be used in the treatment of a cancer caused by a hedgehog pathway abnormality) Antagonist)
  • the agonist and the antagonist are collectively referred to as “light-responsive Smo ligand”
  • the timely activation of the Smo receptor into position during embryonic development is crucial in axial formation. Also, in the case of suppression of cancer cells by inactivating the Smo receptor, if the effect is extended to normal cells, side effects may be triggered. Therefore, the present inventors attempted to develop a light-responsive Smo ligand that activates only the Smo ligand present at a desired position in a tissue (including an artificial tissue). The inventors selected SAG as a representative Smo ligand and attached a photoresponsive protecting group to an amino group important for its activity, the SAG activity disappeared.
  • the present invention is a "photoresponsive Smo ligand" completed based on the above findings.
  • the present invention is a photoresponsive Smo ligand in which a photodegradable protecting group is bound to the active site (site important for agonist or antagonist activity) of the Smo ligand.
  • the Smo ligand is preferably SAG or a SAG derivative (including an antagonist), and is a photoresponsive Smo ligand characterized in that the photocleavable protecting group comprises an aromatic ring.
  • the present invention is also a method of inducing artificial tissue in vitro, comprising culturing cells or tissue in the presence of the light-responsive Smo ligand.
  • the present invention is a medicine or pharmaceutical composition comprising the above-mentioned photoresponsive Smo ligand or a salt thereof or a solvate thereof or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention makes it possible to control hedgehog signals with high spatio-temporal resolution, and provides a means to elucidate various functions of the hedgehog pathway.
  • the present invention enables the development of a therapeutic agent and treatment method for diseases caused by abnormal hedgehog signals.
  • Results of characterization by absorption spectroscopy of Caged SAG The upper figure is a graph of absorption spectra of Caged SAG and SAG. The lower figure is a graph showing the difference in absorbance spectrum change of Caged SAG irradiated with light at different energy intensities.
  • a chart analyzing Caged SAG light-irradiated in PBS by HPLC (detected by absorbance at 270 nm) and a molecule eluting near 23 minutes and a fraction eluting around 14 minutes were analyzed by ESI Mass It is a result (within the frame). It is the graph which plotted the peak area of Caged SAG and SAG with respect to the light irradiation amount of the HPLC chart of FIG.
  • the upper figure shows the outline of the experiment.
  • the lower figure is the result of measuring the expression level of the cerebral ventral marker (NKX2.1 and MASH1) in the brain organoid cultured in the presence of SAG, Caged SAG before light irradiation, and Caged SAG after light irradiation. It is a result of immunohistological staining of brain organoid cultured in the presence of Caged SAG after light irradiation with anti-NKX2.1 antibody and anti-MASH1 antibody.
  • the first embodiment of the present invention is a photoresponsive Smo ligand in which a photodegradable protecting group is bound to the active site of the Smo ligand.
  • the Smo ligand is a substance that binds to 7-transmembrane GPCR-like receptor Smoothened to control its activity positively (Smo agonist) or negative (Smo antagonist). So far, there have been many research reports on Smo ligands (see, for example, Patent Document 1, Patent Document 2, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6, etc.) .
  • Smo ligands include SAG and 1,4-diaminocyclohexane derivatives referred to as SAG derivatives, Pumorphamine and its derivatives, etc.
  • SAG derivatives 1,4-diaminocyclohexane derivatives
  • Pumorphamine and its derivatives etc.
  • the photoresponsive Smo ligand according to the first embodiment (hereinafter, also described as “the photoresponsive Smo ligand of the present invention”) is photolyzed at the active site (site important for agonist or antagonist activity) of a known Smo ligand. Sex protective groups are attached. In this state, the photoresponsive Smo ligand of the present invention shows almost no activity (agonist or antagonist activity), but has the characteristic that it exhibits the original activity when the photodegradable protecting group is eliminated by light irradiation. doing.
  • the active site of the Smo ligand can be identified by methods well known in the art such as Structure-activity Relationships (SAR) analysis.
  • SAR Structure-activity Relationships
  • SAG and its derivatives 1,4-diaminocyclohexane derivatives
  • H bonded to N to which R 1 is bonded is a bulk such as an aromatic ring-containing benzyl group or n-butyl group
  • This portion is considered to be an active site because substitution with a high functional group results in loss of activity (see Non-Patent Document 5).
  • the photodegradable protective group is any functional group which is released by light irradiation, and preferably one having a bulky structure such as an aromatic ring (eg, Klan et al., Chem Rev. 113: 119-191 2013, etc.).
  • a photocleavable protecting group can be easily selected by those skilled in the art, and is not particularly limited.
  • NPOC 2-nitroveratryloxycarbonyl
  • NVOC 2-nitroveratryloxycarbonyl
  • MeNPOC 2-nitroveratryloxycarbonyl
  • MeNVOC ⁇ -methyl-2-nitropiperonyloxycarbonyl
  • DNBOC 2,6-dinitrobenzyloxycarbonyl
  • MeDNBOC 1- (2-nitrophenyl) ethyloxycarbonyl
  • NPEOC 1- (2-nitrophenyl) ethyloxycarbonyl
  • MeNPEOC 9-anthracenylmethyloxycarbonyl
  • AN MOC 1-pyrenylmethyloxycarbonyl
  • PYMOC 3'-methoxybenzoynyloxycarbonyl
  • MBOC 3 ', 5'-dimethoxybenzoyl
  • the photoresponsive ligand of the present invention when used as a medicine, it is necessary to use a light with low biotoxicity and high tissue permeability for irradiating light to release the photocleavable protecting group.
  • a photocleavable protecting group which is desorbed by irradiation with near infrared light (wavelength; about 650 nm to about 900 nm).
  • a photolytic protective group for example, C4'-dialkylamine-substituted heptamethine cyanines (Groka et al., J. Am. Chem. Soc., 136: 14153-14159 2014; Nani et al., Angew.
  • Such a photoresponsive ligand having a photocleavable protecting group attached thereto which is desorbed by irradiation of near-infrared light is administered to a living body and then irradiated with light (near-infrared light) when it reaches a desired site.
  • light near-infrared light
  • Preferred Smo ligands for use in the first embodiment of the present invention include, but are not limited to, for example, US 2010/0048637 A1, Hadden, ChemMedChem 9: 27-37 2014, Yang et al., J. Biol. Chem. 284: 20876-20884 2009, King, J. Biol. 1 (2), 8 2002, Brunton et al., Bioorg Med Chem Lett. 19: 4308-4311 2009, Seifer et al., Bioorg Med Chem. 20: 6465-6481 2012 and Che et al. Mention may be made of SAG and SAG derivatives as disclosed in, eg, Beilstein J Org Chem. 8: 841-849 2012.
  • SAG derivatives include not only Smo agonists but also Smo antagonists. Although specifically mentioned later, depending on the kind of substituent of R 1 of the following general formula (I), the case where it functions as an antagonist is known.
  • SAG and SAG derivatives are not particularly limited, and, for example, 1,4-diaminocyclohexane derivatives represented by the following general formula (I) can be mentioned.
  • R 1 is a hydrogen atom or a saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, a propyl group or a 2-propenyl group .
  • R 1 is preferably hydrogen or a methyl group (see Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5), and in the case of an antagonist, R 1 is an ethyl group. And propyl and 2-propenyl are preferred (see Non-patent Document 5).
  • R 2 is hydrogen, a substituted or unsubstituted phenyl group or a substituted or unsubstituted pyridyl group, and in particular, a phenyl group, a 4-cyanophenyl group, a 4-methoxyphenyl group, a 4- (methylsulfonyl) phenyl group, A 3-cyanophenyl group or a 4-pyridinyl group is preferred.
  • R 3 is hydrogen, fluorine or a hydrocarbon group which may contain oxygen having 1 to 3 carbon atoms, and particularly preferably hydrogen, fluorine, a methyl group or a methoxy group.
  • R 4 is preferably hydrogen, a methoxy group or a substituent represented by the following formula (1), and R 5 is preferably a hydrocarbon chain having 1 to 4 carbon atoms which may contain an amide bond.
  • R 6 is a substituent containing a substituted or unsubstituted aromatic ring (including a heteroaromatic ring), which is represented by the following formula (2), (3), (4) or (5) The substituent is preferable, and in the formula (5), R 7 is preferably chlorine or a methyl group, and R 8 is preferably hydrogen or fluorine.
  • SAG or SAG derivatives represented by the general formula (I) are described, for example, in Non-patent Document 5, Frank-Kamenetsky et al., J. Biol. 1 (2), 8 2002, Wnag et al., J. Comb. Chem. 10: 825-834 2008, James et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 14071-14076 2002 and Che et al., Beilstein J Org Chem. 8: 841-849 2012, and the like. Alternatively, a commercially available product may be purchased.
  • Examples of the photoresponsive Smo ligand of the present invention include, but not particularly limited to, photoactive Smo ligands in which a photocleavable protecting group containing an aromatic ring is bound to the active site of the above-mentioned SAG and SAG derivatives.
  • One example of the photoresponsive Smo ligand of the present invention is not particularly limited, but can also be represented as, for example, the following general formula (II).
  • X is a photocleavable protecting group.
  • R 1 is a hydrogen atom or a saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, a propyl group or a 2-propenyl group.
  • R 1 is preferably hydrogen or a methyl group (see Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5), and in the case of an antagonist, R 1 is an ethyl group. And propyl and 2-propenyl are preferred (see Non-patent Document 5).
  • R 2 is hydrogen, a substituted or unsubstituted phenyl group or a substituted or unsubstituted pyridyl group, and in particular, a phenyl group, a 4-cyanophenyl group, a 4-methoxyphenyl group, a 4- (methylsulfonyl) phenyl group, A 3-cyanophenyl group or a 4-pyridinyl group is preferred.
  • R 3 is hydrogen, fluorine or a hydrocarbon group which may contain oxygen having 1 to 3 carbon atoms, and particularly preferably hydrogen, fluorine, a methyl group or a methoxy group.
  • R 4 is preferably hydrogen, a methoxy group or a substituent represented by the following formula (1), and R 5 is preferably a hydrocarbon chain having 1 to 4 carbon atoms which may contain an amide bond.
  • R 6 is a substituent containing a substituted or unsubstituted aromatic ring (including a heteroaromatic ring), which is represented by the following formula (2), (3), (4) or (5) The substituent is preferable, and in the formula (5), R 7 is preferably chlorine or a methyl group, and R 8 is preferably hydrogen or fluorine.
  • a second embodiment of the present invention is a pharmaceutical or pharmaceutical composition
  • a photoresponsive Smo agonist is a developmental disorder, neurodegenerative disease, bone degeneration disease, diabetes, obesity .
  • ischemia such as ischemic heart disease and cerebral ischemic disease (Hadden, ChemMedChem 9: 27-37 2014)
  • light-responsive Smo antagonists include osteoblasts, rhabdomyosarcoma brain tumors, It can be used for the treatment of cancers such as basal cell carcinoma, lung carcinoma and breast carcinoma (Sekulic and Von Hoff, Cell 164: 831 2016; Rimkus et al., Cancers 8, 22: 2016 Doi: 10.3390 / cancers 8020022).
  • the medicine according to the second embodiment of the present invention may be administered with the photoresponsive Smo ligand of the present invention or a salt thereof or a solvate or hydrate thereof per se, but generally, the active ingredient It is desirable to administer in the form of a pharmaceutical composition comprising these substances and one or more formulation additives.
  • two or more types of the photoresponsive Smo ligands of the present invention may be used in combination as an active ingredient of the medicament according to the embodiment of the present invention.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition may contain other known components effective for the treatment of a target disease.
  • the dosage form of the medicament or pharmaceutical composition according to the present invention includes tablets, capsules, granules, powders, syrups, suspensions, suppositories, ointments, creams, gels, patches, inhalants, injections Agents and the like. These formulations are prepared according to a conventional method. In the liquid preparation, it may be dissolved or suspended in water or other suitable solvent at the time of use. In addition, tablets and granules may be coated by a known method. In the case of injection, the compound of the present invention is prepared by dissolving in water, but it may be dissolved in physiological saline or glucose solution if necessary, and a buffer or preservative may be added. It is also good.
  • Formulations for oral or parenteral administration are provided in any dosage form.
  • the pharmaceutical form is, for example, a pharmaceutical or pharmaceutical composition for oral administration in the form of granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, syrups, emulsions, suspensions or solutions, etc., intravenous administration
  • Drug or pharmaceutical composition for parenteral administration in the form of injections for intravenous, intramuscular or subcutaneous administration, drips, percutaneous absorption, transmucosal absorption, nasal drops, inhalants, suppositories, etc. It can be prepared as a product.
  • the injections, drips and the like may be prepared as a powdery dosage form such as a lyophilised form, and may be dissolved in a suitable aqueous medium such as physiological saline at the time of use.
  • the types of pharmaceutical additives used for the preparation of the medicament or pharmaceutical composition according to the present invention, the ratio of the pharmaceutical additives to the active ingredient, or the method for producing the medicine or pharmaceutical composition are those skilled in the art depending on the form. Can be selected appropriately. Inorganic or organic substances, or solid or liquid substances can be used as pharmaceutical additives, and generally, it can be formulated at 1% by weight to 90% by weight based on the weight of the active ingredient. .
  • examples of pharmaceutical additives include lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium aluminometasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, carboxymethylcellulose calcium , Ion exchange resin, methyl cellulose, gelatin, gum arabic, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, veegum, veegum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycero gelatin, polyso Bate, macrogol, vegetable oils, waxes, liquid paraffin, white petrolatum, fluoro
  • a solid preparation for oral administration it may be mixed with the active ingredient and an excipient component, for example, lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, anhydrous silicic acid, etc., as a powder, or as necessary.
  • an excipient component for example, lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, anhydrous silicic acid, etc.
  • a binder such as sucrose, hydroxypropyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone and the like, a disintegrating agent such as carboxymethyl cellulose and carboxymethyl cellulose calcium, and the like are added and wet or dry granulated to give granules.
  • these powders and granules may be compressed as such or added with a lubricant such as magnesium stearate or talc.
  • granules or tablets are coated with an enteric base such as hydroxypropyl methylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer, etc. and coated with an enteric preparation, or ethylcellulose, carnauba wax, or a hardened oil to obtain a sustained preparation. It can also be done.
  • an enteric base such as hydroxypropyl methylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer, etc.
  • an enteric preparation or ethylcellulose, carnauba wax, or a hardened oil to obtain a sustained preparation. It can also be done.
  • powder or granules are filled in a hard capsule, or the active ingredient is dissolved as it is or in glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil, etc. can do.
  • the active ingredient may be, if necessary, hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate, pH adjuster such as sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride, glucose etc. It may be dissolved in distilled water for injection together with an isotonicity agent, sterile filtered and filled into an ampoule, and further, mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin and the like may be added and vacuum freeze dried to obtain a topically injectable injection . Alternatively, reticin, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil or the like may be added to the active ingredient and the mixture may be emulsified in water to give an emulsion for injection.
  • the active ingredient is moistened with a suppository base material such as cocoa butter, tri-, di- and monoglycerides of fatty acids, polyethylene glycol etc., poured into a solution and cooled, or the active ingredient is polyethylene After dissolving in glycol, soybean oil, etc., it may be coated with a gelatin film.
  • a suppository base material such as cocoa butter, tri-, di- and monoglycerides of fatty acids, polyethylene glycol etc.
  • the dosage and frequency of administration of the medicament or pharmaceutical composition according to the present invention are not particularly limited, and may be based on the purpose of preventing and / or treating the aggravation and development of the disease to be treated, conditions such as type of disease, patient weight and age. Depending, according to the judgment of the doctor it is possible to select appropriately.
  • the daily dosage for adults for oral administration is about 0.01 to 1000 mg (weight of active ingredient), and can be administered once or divided into several times a day, or every few days . When used as an injection, it is desirable to continuously or intermittently administer a daily dose of 0.001 to 100 mg (active ingredient weight) to an adult.
  • the medicament or pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared as a sustained release preparation such as an implanted tablet and a delivery system encapsulated in a microcapsule, using a carrier that can prevent immediate removal from the body. it can.
  • a carrier that can prevent immediate removal from the body.
  • biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid.
  • a suspension of liposomes can be used as a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Liposomes are prepared through filters of appropriate pore size to size suitable for use as lipid compositions including, but not limited to, phosphatidyl choline, cholesterol and PEG derived phosphatidyl ethanol (PEG-PE), reverse phase evaporation method Can be purified by
  • the medicament or pharmaceutical composition according to the present invention may be provided in the form of a kit together with instructions such as a method of administration.
  • the drug contained in the kit effectively sustains the activity of the drug or the component of the drug composition for a long period of time, and is a container made of a material that does not adsorb inside the container and does not deteriorate the component Supplied by
  • a sealed glass ampoule may contain a buffer or the like enclosed in the presence of a neutral, non-reactive gas such as nitrogen gas.
  • Instructions for use may also be attached to the kit. Instructions for use of the kit may be printed on paper or the like, or may be stored on an electromagnetically readable medium such as a CD-ROM or a DVD-ROM and supplied to the user.
  • the medicament or the pharmaceutical composition according to the second embodiment of the present invention is administered to a subject to be treated, and developmental disorders, neurodegenerative diseases, bone degeneration diseases, diabetes, obesity , Ischemia (such as ischemic heart disease or cerebral ischemia) or cancer (eg, osteoblast, rhabdomyosarcoma brain tumor, basal cell carcinoma, lung cancer and breast cancer).
  • treatment means preventing or alleviating the progression and deterioration of the pathological condition in a mammal suffering from a disease or the like, thereby preventing or alleviating the progression and deterioration of the disease. Treatment.
  • mammal to be treated means any animal classified as a mammal, including but not limited to, for example, humans, pet animals such as dogs, cats, rabbits, etc., cows, pigs, sheep , And domestic animals such as horses. Particularly preferred "mammals" are humans.
  • a fourth embodiment of the present invention is a method of inducing artificial tissue in vitro, comprising A step of conducting cell or tissue culture in the presence of the photoresponsive Smo ligand of the present invention, and a step of conducting light irradiation.
  • an artificial tissue refers to a culture in which pluripotent stem cells and the like are cultured in vitro and having similar function and / or structure to any in vivo tissue. More specifically, it refers to, for example, a culture having a function and / or structure similar to that of a living tissue such as brain, lung and intestine. Furthermore, in the present specification, it is a concept including an organ in which different tissues are combined.
  • the protective group is eliminated by irradiation with light of a wavelength suitable for the decomposition of the photolytic protective group bound to the ligand, and the ligand is activated.
  • Cells or tissues are cultured in the presence of the photoresponsive Smo ligand of the present invention, and light is irradiated at appropriate times and in place to activate the Smo ligand, whereby cells having desired characteristics at the desired tissue location Alternatively, cell populations can be induced to differentiate.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells
  • a spheroid cell mass
  • the desired location on the spheroid is irradiated with light in the presence of an agonist of the light-responsive Smo ligands of the present invention
  • the Smo agonist is activated and the hedgehog signaling pathway is activated to induce desired cell differentiation.
  • the desired location on the tissue is irradiated with light in the presence of the antagonist among the light-responsive Smo ligands of the present invention, thereby The hedgehog signal at the desired location is suppressed.
  • the cell differentiation induced at the desired place is suppressed.
  • a tissue having a desired three-dimensional structure can be obtained It becomes possible to guide.
  • the wavelength and energy intensity of the light to be irradiated adopt a wavelength suitable for the photocleavable protecting group bound to the ligand used, do not adversely affect the cells, and irradiate with an intensity sufficient for detachment of the protecting group It is desirable to do.
  • the wavelength of the irradiation light can be easily selected by one skilled in the art or preliminary experiments can determine the energy intensity of the light to be irradiated.
  • Experimental method 1-1 Human iPS Cell Culture
  • the iPSC 409B2 cell line (Cell no. HPS 0076) was supplied from National University Corporation Kyoto University via RIKEN Bioresource center cell bank. iPS cells were cultured on dishes coated with vitronectin (VNT-N, Thermofisher Scientific) in Essential 8 medium to maintain an undifferentiated state.
  • VNT-N vitronectin
  • NIH-3T3 Cell Culture and Hedgehog Signal Assay NIH-3T3 cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS, glutamine, penicillin and streptomycin. To perform hedgehog signal assays, cells cultured to confluence were cultured overnight in starvation-inducing medium (DMEM; no serum added) and starved. Then, the medium was replaced with a starvation induction medium supplemented with SAG, Caged SAG, SANT75, Caged SANT75 and the like. The cells were irradiated with a halogen lamp for 15 minutes. Thereafter, total RNA was extracted from NIH-3T3 cells cultured for 6 hours and subjected to real-time PCR.
  • DMEM starvation-inducing medium
  • Brain organoid was prepared according to the method described in Lancaster et al., Nat Protoc. 9: 2329-2340 2014.
  • the hiPSCs cultured in E8 medium 10,000 cells density using after separation into single cells, in a low adhesive 96-well round bottom plate, the E6 medium 100 [mu] L / well using a TrypLE TM (Thermofisher Scientific)
  • the cells were allowed to reaggregate to some degree.
  • FGF2 5 ng / mL, 0 to 4 days of culture initiation
  • ROCK inhibitor Thiazovivine, 1 ⁇ M, 0 to 4 days of culture initiation
  • the medium was changed 2 days and 4 days after the start of culture.
  • Neuronal differentiation medium (DMEM / F12, 1% N2 supplement, insulin containing SAG, Caged SAG, caged SAG after UV irradiation or before UV irradiation (SAG with photocleavable protecting group attached), 6 days after the start of culture
  • the medium was changed to 1% GlutaMax supplement, 1% NEAA, 1% penicillin streptomycin and 1 ⁇ g / mL heparin).
  • Caged SAG was added, cultures were irradiated with a halogen lamp for 15 minutes.
  • the medium was changed on the 6th, 8th and 10th days after the start of the culture.
  • the mixture was extracted three times with 30 mL of water and 30 mL of ethyl acetate, and the solvent was removed by a rotary evaporator.
  • the reaction solution was added with 4 M HCl and allowed to react for 15 minutes, and then the solvent was removed by a rotary evaporator.
  • the yield is 46.5 mg, and the yield is 58%.
  • Caged SAG 2-1-1 Characteristic Evaluation of Caged SAG Above 1-6.
  • the analysis results of Caged SAG showing the synthesis method are shown in. First, the absorption spectrum of Caged SAG was measured. The SAG has a peak top near 270 nm, and the photocleavable protecting group has a peak near 360 nm. As a result of the measurement of the absorption spectrum, SAG had a peak only in the vicinity of 270 nm, and Caged SAG showed a peak in the vicinity of 360 nm in addition to 270 nm (FIG. 1, upper diagram).
  • Caged SAG is irradiated with light at a wavelength of 365 nm at 0.25 J / cm 2 , 0.5 J / cm 2 , 1.0 J / cm 2 , 2.0 J / cm 2 , 4.0 J / cm 2 and 8.0 J / cm 2.
  • the peak around 270 nm increased and the peak around 360 nm decreased as the energy of the irradiation light was increased.
  • Caged SAG is irradiated with light of wavelength 365 nm at 0.25 J / cm 2 , 0.5 J / cm 2 , 1.0 J / cm 2 , 2.0 J / cm 2 , 4.0 J / cm 2 and 8.0 J / cm 2 and HPLC It was found that the peak area of the Caged SAG decreased and the peak of the SAG increased according to the increase in the light irradiation dose (FIGS. 2 and 3). It was identified which peak corresponds to which compound by ESI Mass measurement of each fraction. From the above results, it was confirmed that SAG is generated by irradiating 365 nm light to the synthesized Caged SAG. The photolysis with 2-4 J / cn 2 was found to be almost complete.
  • NKX2.1 and MASH1 the expression status of the ventral cerebral marker (NKX2.1 and MASH1) in brain organoid cultured in the presence of Caged SAG (100 nM) before or after light irradiation was subjected to anti-NKX2.1 antibody or anti-MASH1 antibody.
  • the confirmation was performed by the immunohistological staining used.
  • SAG (+) SAG (+)
  • Caged SAG (+) Caged SAG
  • NKX2.1 and MASH1 ventral cerebral markers
  • IR-783-SANT75 The characteristics of IR-783-SANT75 were examined.
  • the SAG derivative SANT75 used here is a compound that exhibits smoothened antagonist activity.
  • the photocleavable protecting group IR-783 is green, but when the Cl part is replaced with N, the absorption shifts to a short wavelength and becomes blue. After irradiation with 660 nm light, it is thought that the cyanine skeleton is oxidized, the absorptor is broken, and the absorption is shifted to a short wavelength to become red (FIG. 9). The light was irradiated with a 660 nm LED light for 1 hour.
  • NVOC-SANT75 Next, it was examined whether or not the antagonist activity of SANT75 could be restored by irradiating the NVOC-SANT75 in which the NVOC of the photocleavable protecting group is bound to the antagonist SANT75.
  • the expression level of Gli1 was quantified by simultaneously causing the agonist SAG (100 nM) and the antagonist SANT75 (1 ⁇ M). As a result, competitive inhibition of the hedgehog signal by SANT75 was observed (FIG. 10).

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Abstract

本発明は、Smoリガンドの活性部位（アゴニストまたはアンタゴニスト活性に重要な部位）に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドの提供を目的とする。すなわち、本発明は、Smoリガンドの活性部位に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドである。より具体的には、例えば、前記Smoリガンドが1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体であり、光分解性保護基が芳香環を含むものであることを特徴とする光応答性Smoリガンドである。

Description

光応答性Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄリガンド
　本発明は、光に応答して活性化するSmoothenedリガンドに関する。
　ヘッジホッグシグナルパスウェイ（Hedgehog signaling pathway）は、胚の発生や組織の再生において各細胞が正しい位置情報を得るために重要な役割を果たしており、ヘッジホッグタンパク質を中心とするシグナル伝達経路である。このパスウェイを阻害すると、重篤な発達異常等が引き起こされ、致死となる場合もある（非特許文献１）。成体では、異常なヘッジホッグシグナルが、骨芽腫、基底細胞がんおよび横紋筋肉腫などの腫瘍の形成および進行に関与していることが報告されている（非特許文献２および非特許文献３など）。そのため、ヘッジホッグパスウェイを創薬のターゲットとする研究が進んでおり、例えば、アゴニストは、脳梗塞や脳出血などの脳虚血の治療薬（非特許文献４）として、また、アンタゴニストは抗がん剤（非特許文献２および非特許文献３など）としての利用に注目が集まっている。
　ヘッジホッグシグナル伝達は、ヘッジホッグタンパク質によって開始される。ヘッジホッグタンパク質が存在しない場合、12回膜貫通レセプターであるPatched（Ptch）が、7回膜貫通GPCR様レセプターであるSmoothened（Smo）の活性を抑制している。脊椎動物において、Smoが不活性化されると、転写因子GliにSufu（Suppressor of Fused）が結合してヘテロ二量体を形成し、Gliタンパク質のリン酸化が促進され、N末端が切断されたGliRが生成される。生じたGliRは、ヘッジホッグ応答遺伝子のレプレッサーとして機能し、GLI1やPTCH1などのヘッジホッグ標的遺伝子の転写を抑制する。
　一方、ヘッジホッグタンパク質がPtchに結合すると、Smoの抑制が解除され、Gliタンパク質のN末端側の切断が抑制されて、活性型である全長のGli（GliA）が生じる。この活性型のGliは核へ移行して、ヘッジホッグ標的遺伝子の転写を誘導する（非特許文献４）。
　ヘッジホッグパスウェイの異常によって引き起こされる発達異常や腫瘍形成などを治療する目的で、ヘッジホッグパスウェイのアゴニストまたはアンタゴニストの開発が行われている。
　ヘッジホッグパスウェイの過剰な活性化によって、骨芽腫、横紋筋肉腫脳腫瘍、基底細胞がん、肺がんおよび乳がんなどの様々ながんが引き起こされることが示されている。そのため、ヘッジホッグパスウェイアンタゴニストは、抗がん剤の候補としての使用が期待され、多くのアンタゴニストが報告されている（特許文献１、非特許文献３、非特許文献５および非特許文献６）。
　他方、ヘッジホッグパスウェイのアゴニストは、発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病や肥満の他、虚血性心疾患や脳虚血疾患などの虚血などの治療薬として期待されている（非特許文献４）。現在、最もよく研究されているアゴニストとして、Smoに直接結合するSAG（Smoothened agonist）（非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６）やPumorphamine（非特許文献４）などが知られている。SAGはSmoのヘプタヘリカルドメインに結合する小分子化合物で、共通の骨格を持ついくつかの化合物が報告され、アゴニスト活性に重要な置換基などについても、詳細に研究が行われている（非特許文献４）。
　ヘッジホッグパスウェイの主役であるヘッジホッグタンパク質は、哺乳類ではソニック（Sonic）ヘッジホッグ、インディアン（Indian）ヘッジホッグおよびデザート（Desert）ヘッジホッグの３つのヘッジホッグホモログが同定されている。なかでも、ソニックヘッジホッグに関する研究が最も進んでいる。ソニックヘッジホッグは、例えば、脳の初期発生における神経管の体軸の決定において、モルフォジェンとして機能する。近年、多能性幹細胞を凝集体として培養し、三次元的な組織を分化誘導することが試みられており、人工脳組織（非特許文献７および非特許文献８など）や肺上皮（非特許文献９）などのオルガノイドをヒトの疾患モデルとして利用する試みが盛んである。
　しかし、既存の報告で用いられる均一な培養液中で得られる人工脳組織は、自在に体軸を規定することができないため、様々な脳の部位が無秩序に形成されてしまい、疾患モデルとしての実用化は、ほど遠いのが現状である。
US2010/0048637 A1 US6,683,108 B1
Zhangら, Cell 106:781-792 2001 SekulicおよびVon Hoff, Cell 164:831 2016 Rimkusら, Cancers 8, 22: 2016 Doi:10.3390/cancers8020022 Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014 Yangら, J. Biol. Chem. 284:20876-20884 2009 King, J. Biol. 1(2), 8 2002 Lancasterら, Nature 501:373-379 2013 Di Lulloら, Nature Review neuroscience 18:573-584 2017 Dyeら, eLife 4, Doi:10.7554/eLife.05098 2015
　上記事情に鑑み、本発明は、構成細胞が正しく配置された人工組織の誘導および発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病や肥満の他、虚血性心疾患や脳虚血疾患などの虚血などの治療に利用するための光応答性Smoothenedアゴニスト（光応答性Smoアゴニスト）、ならびに、ヘッジホッグパスウェイの異常によって生じるがんなどの治療に利用し得る光応答性Smoothenedアンタゴニスト（光応答性Smoアンタゴニスト）（以下、アゴニストとアンタゴニストをまとめて、「光応答性Smoリガンド」と称する）の提供を目的とする。
　胚発生においてSmo受容体が適時適所に活性化されることは、体軸形成において極めて重要である。また、Smo受容体を不活性化することによるがん細胞の抑制を考えた場合も、正常細胞にまでその効果が及ぶと副作用が惹起されることになりかねない。
　そこで、発明者らは、組織（人工組織を含む）中の所望の位置に存在するSmoリガンドのみが活性化するような光応答性Smoリガンドの開発を試みた。発明者らは、Smoリガンドの代表としてSAGを選択しその活性に重要なアミノ基に光応答性保護基を結合させたところ、SAG活性が消失した。次いで、光応答性保護基を結合したSAG（以下「caged SAG」とも記載する）に光照射を行ったところ、SAG活性が回復することを確認した。
　本発明は以上の知見に基づいて完成された「光応答性Smoリガンド」である。
　すなわち、本発明はSmoリガンドの活性部位（アゴニストまたはアンタゴニスト活性に重要な部位）に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドである。
　より具体的には、前記Smoリガンドは、好ましくはSAGまたはSAG誘導体（アンタゴニストを含む）であり、光分解性保護基が芳香環を含むものであることを特徴とする光応答性Smoリガンドである。
　また、本発明は、インヴィトロにおける人工組織の誘導方法であって、上記光応答性Smoリガンドの存在下で細胞または組織を培養することを含む、誘導方法である。
　さらに、本発明は、上記光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を有効成分として含む、医薬または医薬組成物である。
　本発明により、ヘッジホッグシグナルを高時空間分解能で制御することが可能となり、ヘッジホッグ経路の多様な機能の解明手段が提供される。
　さらに、本発明によりヘッジホッグシグナルの異常に起因する疾患の治療剤および治療方法の開発が可能となる。
Caged SAGの吸光スペクトル測定による特性評価の結果。上図は、Caged SAGとSAGの吸光スペクトルのグラフである。下図は、異なるエネルギー強度で光照射を行ったCaged SAGの吸光スペクトル変化の差分を示したグラフである。 PBS中で光照射したCaged SAGをHPLC（270 nmの吸光で検出）によって解析したチャートと、23分付近に溶出している分子と14分付近に溶出している画分をESI Massによって解析した結果（枠内）である。 図２のHPLCチャートのCaged SAGとSAGのピーク面積を光照射量に対してプロットしたグラフである。 光照射後のCaged SAGによる脳オルガノイドにおける大脳腹側マーカーの発現誘導。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、SAG、光照射前のCaged SAGおよび光照射後のCaged SAGの存在下で培養した脳オルガノイドにおける、大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現量を測定した結果である。 光照射後のCaged SAG存在下で培養した脳オルガノイドを抗NKX2.1抗体および抗MASH1抗体で免疫組織染色した結果である。 Caged SAG存在下で培養したNIH-3T3細胞に光照射したのち、細胞内のヘッジホッグシグナル下流遺伝子の発現量を調べた結果である。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、Caged SAG存在下で培養したNIH-3T3細胞に光照射した後、Gliの発現量を測定した結果を示す。 SAGの量とGli発現量との関係について検討した結果を示す。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、SAG、Caged SAG（光照射有りまたは無し）存在下で培養したNIH-3T3細胞中のGliの発現量を測定した結果を示す。 Caged SAGの存在下で培養した脳オルガノイドに光照射したのち、大脳腹側マーカーの発現量を調べた結果である。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、Caged SAG存在下で培養した脳オルガノイドに光照射した後、大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現量を測定した結果である。 IR-783-SANT75（SANT75：アンタゴニスト活性を有するSAG誘導体、IR-783：光分解性保護基）の特性について検討した結果を示す。 NVOC-SANT75（NVOC：光分解性保護基）に光照射することによるアンタゴニスト活性の回復を確認した結果を示す。
　本発明の第１の実施形態は、Smoリガンドの活性部位に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドである。
　ここでSmoリガンドとは、7回膜貫通GPCR様レセプターであるSmoothenedに結合して、その活性を正（Smoアゴニスト）または負（Smoアンタゴニスト）に制御する物質のことである。これまでに、Smoリガンドに関する多くの研究報告が存在する（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６などを参照のこと）。より具体的には、特に限定はしないが、例えば、Smoリガンドとして、SAGおよびSAG誘導体と称される1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体、ならびに、Pumorphamineおよびその誘導体などを挙げることができる（US2010/0048637A1、Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014、Yangら, J. Biol. Chem. 284:20876-20884 2009、King, J. Biol. 1(2), 8 2002、Bruntonら, Bioorg Med Chem Lett. 19:4308-4311 2009、Seiferら, Bioorg Med Chem. 20:6465-6481 2012およびCheら, Beilstein J Org Chem. 8:841-849 2012などを参照のこと）。
　第１の実施形態にかかる光応答性Smoリガンド（以下「本発明の光応答性Smoリガンド」とも記載する）は、既知のSmoリガンドの活性部位（アゴニストまたはアンタゴニスト活性に重要な部位）に光分解性保護基が結合している。本発明の光応答性Smoリガンドは、この状態では、ほとんど活性（アゴニストまたはアンタゴニスト活性）を示さないが、光を照射して光分解性保護基が脱離すると本来の活性を示すという特徴を有している。
　Smoリガンドの活性部位は、構造活性相関（Structure-activity Relationships : SAR）解析など当該分野において周知の方法によって特定することができる。Smoリガンドの１例である1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体（SAGおよびその誘導体）の場合、シクロヘキサンに結合するアミノ基（ベンゾチオフェン環またはフラン環などが結合していないアミノ基）の部分に活性部位が存在している。例えば、一般式（Ｉ）で表される1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体では、Ｒ１が結合しているＮに結合しているＨを、芳香環を含むベンジル基やｎ－ブチル基などの嵩高い官能基に置換すると活性が失われるため（非特許文献５などを参照のこと）この部分が活性部位であると考えられる。
　本発明の第１の実施形態において、光分解性保護基とは、光照射によって離脱する任意の官能基のことで、芳香環などの嵩高い構造を含むものが好ましい（例えば、Klanら, Chem. Rev. 113:119-191 2013などを参照のこと）。このような光分解性保護基は、当業者により容易に選択することが可能であり、特に限定はしないが、例えば、２－ニトロベンジル誘導体骨格を有する基、ジメトキシベンゾイン基、２－ニトロピペロニルオキシカルボニル（NPOC）基、２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（NVOC）基、α－メチル－２－ニトロピペロニルオキシカルボニル（MeNPOC）基、α－メチル－２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（MeNVOC）基、２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（DNBOC）基、α－メチル－２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（MeDNBOC）基、１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（NPEOC）基、１－メチル－１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（MeNPEOC）基、９－アントラセニルメチルオキシカルボニル（ANMOC）基、１－ピレニルメチルオキシカルボニル（PYMOC）基、３’－メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）基、３’，５’－ジメトキシベンゾイルオキシカルボニル（DMBOC）基、７－ニトロインドリニルオキシカルボニル（NIOC）基、５，７－ジニトロインドリニルオキシカルボニル（DNIOC）基、２－アントラキノニルメチルオキシカルボニル（AQMOC）基、α，α－ジメチル－３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、５－ブロモ－７－ニトロインドリニルオシキカルボニル（BNIOC）基などを挙げることができる。
　さらに、本発明の光応答性リガンドを医薬として使用する場合、光分解性保護基を脱離させるために照射する光は、生体毒性が低く、組織透過性の高い波長を使用する必要がある。そのために、例えば、近赤外光（波長；650 nm～900 nm程度）の照射で脱離する光分解性保護基を使用するのが望ましい。このような光分解性保護基として、例えば、C4’-dialkylamine-substituted heptamethine cyanines（Grokaら, J. Am. Chem. Soc., 136:14153-14159 2014；Naniら, Angew. Chem. Int. Ed., 54:13635-13638 2015などを参照のこと）などを挙げることができる。このような近赤外光の照射で脱離する光分解性保護基を結合した光応答性リガンドは、生体に投与したのち、所望の部位に到達した時点で、光照射（近赤外光）することで、所望の部位でのリガンドの活性化が可能であり、疾患の治療に用いることができる。
　本発明の第１の実施形態で使用される好ましいSmoリガンドとして、特に限定はしないが、例えば、US2010/0048637A1、Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014、Yangら, J. Biol. Chem. 284:20876-20884 2009、King, J. Biol. 1(2), 8 2002、Bruntonら, Bioorg Med Chem Lett. 19:4308-4311 2009、Seiferら, Bioorg Med Chem. 20:6465-6481 2012およびCheら, Beilstein J Org Chem. 8:841-849 2012などに開示されるSAGおよびSAG誘導体を挙げることができる。ここで、SAG誘導体には、SmoアゴニストのみならずSmoアンタゴニストが含まれる。具体的には後述するが、下記一般式（Ｉ）のＲ１の置換基の種類によっては、アンタゴニストとして機能する場合が知られている。
　ここで、SAGおよびSAG誘導体とは、特に限定はしないが、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　一般式（Ｉ）において、Ｒ１は水素原子または炭素数１から６の飽和もしくは不飽和の炭化水素基であり、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基または２－プロペニル基である。特に、第１の実施形態のSmoリガンドが、アゴニストの場合、Ｒ１は水素またはメチル基が好ましく（非特許文献４および非特許文献５の参照のこと）、アンタゴニストの場合、Ｒ１はエチル基、プロピル基または２－プロペニル基が好ましい（非特許文献５を参照のこと）。
　Ｒ２は水素、置換または無置換のフェニル基または、置換または無置換のピリジル基であり、特に、フェニル基、４－シアノフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－（メチルスルホニル）フェニル基、３－シアノフェニル基または４－ピリジニル基が好ましい。
　Ｒ３は水素、フッ素または炭素数１～３の酸素を含んでもよい炭化水素基であり、特に、水素、フッ素、メチル基またはメトキシ基が好ましい。
　Ｒ４は水素、メトキシ基または下記式（１）で表される置換基が好ましく、Ｒ５はアミド結合を含んでもよい炭素数１～４の炭化水素鎖が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　Ｒ６は、置換もしくは無置換の芳香環（複素芳香環を含む）を含む置換基であって、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表されるいずれかの置換基が好ましく、式（５）において、Ｒ７は塩素またはメチル基が好ましく、Ｒ８は水素またはフッ素が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　一般式（Ｉ）で表されるSAGまたはSAG誘導体は、例えば、非特許文献５、Frank-Kamenetskyら, J. Biol. 1(2), 8 2002、Wnagら, J. Comb. Chem. 10:825-834 2008、Jamesら, Proc Natl Acad Sci USA 99:14071-14076 2002およびCheら, Beilstein J Org Chem. 8:841-849 2012などを参照して合成することができる。あるいは、市販品を購入してもよい。
　本発明の光応答性Smoリガンドとして、特に限定はないが、例えば、上述のSAGおよびSAG誘導体の活性部位に芳香環を含む光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドを挙げることができる。本発明の光応答性Smoリガンドの１例として、特に限定はしないが、例えば、下記一般式（ＩＩ）のように表すこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　一般式（ＩＩ）において、Ｘは光分解性保護基である。
Ｒ１は水素原子または炭素数１から６の飽和もしくは不飽和の炭化水素基であり、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基または２－プロペニル基である。特に、第１の実施形態のSmoリガンドが、アゴニストの場合、Ｒ１は水素またはメチル基が好ましく（非特許文献４および非特許文献５の参照のこと）、アンタゴニストの場合、Ｒ１はエチル基、プロピル基または２－プロペニル基が好ましい（非特許文献５を参照のこと）。
　Ｒ２は水素、置換または無置換のフェニル基または、置換または無置換のピリジル基であり、特に、フェニル基、４－シアノフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－（メチルスルホニル）フェニル基、３－シアノフェニル基または４－ピリジニル基が好ましい。
　Ｒ３は水素、フッ素または炭素数１～３の酸素を含んでもよい炭化水素基であり、特に、水素、フッ素、メチル基またはメトキシ基が好ましい。
　Ｒ４は水素、メトキシ基または下記式（１）で表される置換基が好ましく、Ｒ５はアミド結合を含んでもよい炭素数１～４の炭化水素鎖が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　Ｒ６は、置換もしくは無置換の芳香環（複素芳香環を含む）を含む置換基であって、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表されるいずれかの置換基が好ましく、式（５）において、Ｒ７は塩素またはメチル基が好ましく、Ｒ８は水素またはフッ素が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　本発明の光応答性リガンドのうち、アゴニストとしては表１～表５に示す化合物群を例示することができる。表１～表４中のＲ１～Ｒ８は一般式（ＩＩ’）に示される置換基を、表５中のＲ１～Ｒ８は一般式（ＩＩ”）に示される置換基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　また、本発明の光応答性リガンドのうち、アンタゴニストとしては以下の化合物群を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　本発明の第２の実施形態は、本発明の光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を有効成分として含む医薬または医薬組成物である。
　本発明の光応答性リガンドはヘッジホッグシグナルの異常に起因する疾患の治療に使用することができ、例えば、光応答性Smoアゴニストは、発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病、肥満症、虚血性心疾患や脳虚血疾患などの虚血の治療のために（Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014）、また、光応答性Smoアンタゴニストは、骨芽腫、横紋筋肉腫脳腫瘍、基底細胞がん、肺がんおよび乳がんなどのがん（SekulicおよびVon Hoff, Cell 164:831 2016；Rimkusら, Cancers 8, 22: 2016 Doi:10.3390/cancers8020022）の治療のために使用することができる。
　本発明の第２の実施形態にかかる医薬は、本発明の光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくは水和物自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分であるこれらの物質と１または２以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。
　また、本発明の実施形態にかかる医薬の有効成分として、本発明の光応答性Smoリガンドのうち２種類以上を組み合わせて用いてもよい。上記医薬組成物には、その他対象疾患の治療に有効な既知の成分を配合してもよい。
　本発明にかかる医薬または医薬組成物の剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
　経口投与用または非経口投与用の製剤は、任意の製剤形態で提供される。製剤形態としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤または液剤等の形態の経口投与用医薬または医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬または医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
　本発明にかかる医薬または医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬または医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して1重量％から90重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
　経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは、エチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
　注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
　直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
　本発明にかかる医薬または医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。
　一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は0.01～1000mg（有効成分重量）程度であり、一日１回または数回に分けて、あるいは、数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量0.001～100mg（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
　本発明にかかる医薬または医薬組成物は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。
　本発明にかかる医薬または医薬組成物は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる薬剤は、医薬または医薬組成物の構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。
　また、キットには使用説明書が添付されてもよい。当該キットの使用説明は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROM、DVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。
　さらに、本発明の第３の実施形態は、本発明の第２の実施形態にかかる医薬または医薬組成物を、治療対象に投与し、発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病、肥満症、虚血（虚血性心疾患や脳虚血など）またはがん（例えば、骨芽腫、横紋筋肉腫脳腫瘍、基底細胞がん、肺がんおよび乳がんなど）を治療する方法である。
　ここで「治療」とは、疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによって該疾患の進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
　治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
　本発明の第４の実施形態は、インヴィトロにおいて人工組織を誘導する方法であって、
本発明の光応答性Smoリガンドの存在下で細胞または組織培養を行う工程、および、光照射を行う工程を、を含む誘導方法である。
　ここで、人工組織とは、多能性幹細胞などをインヴィトロで培養し、任意の生体内組織と類似の機能および／または構造を有する培養物のことである。より具体的には、例えば、脳、肺、腸などの生体組織と類似の機能および／または構造を有する培養物のことである。さらに、本明細書中では、異なる組織が組み合わさった器官を包含する概念である。
　本発明の光応答性Smoリガンドは、当該リガンドに結合している光分解性保護基の分解に適した波長の光を照射することによって当該保護基が脱離し、リガンドが活性化する。本発明の光応答性Smoリガンドの存在下で、細胞または組織を培養し、適時および適所に光照射を行って当該Smoリガンドを活性化することで、組織所望の場所に所望の特徴を有する細胞または細胞集団を分化誘導することができる。例えば、多能性幹細胞（iPS細胞など）をスフェロイド（細胞塊）にまで培養したのち、本発明の光応答性Smoリガンドのうちアゴニストの存在下でスフェロイド上の所望の場所に光照射すると、その場所でSmoアゴニストが活性化され、ヘッジホッグシグナル経路が活性化し所望の細胞分化が誘導される。また、逆に、活性化したヘッジホッグシグナルを抑制したい場合には、本発明の光応答性Smoリガンドのうちアンタゴニストの存在下にて、組織上の所望の場所に光照射を行うことにより、当該所望の場所におけるヘッジホッグシグナルが抑制される。その結果、当該所望の場所で誘導された細胞分化が抑制されることになる。
　以上のように、本発明の光応答性Smoリガンド（アゴニストおよび／またはアンタゴニスト）の存在下で培養した細胞塊の所望の場所に光照射することで、所望の三次元的な構造を有する組織の誘導が可能となる。
　照射する光の波長およびエネルギー強度は、用いるリガンドに結合している光分解性保護基に適した波長を採用し、細胞へ悪影響を及ぼさず、かつ、保護基の脱離に十分な強度で照射することが望ましい。照射光の波長は、当業者であれば容易に選択することができ、または、予備的な実験により照射する光のエネルギー強度を決定することができる。
　本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．実験方法
１－１．ヒトiPS細胞培養
 iPSC 409B2細胞株（Cell no. HPS0076）は、RIKEN Bioresource center cell bankを介して国立大学法人京都大学から供給された。iPS細胞は、未分化状態を維持するためにEssential 8 培地中、ビトロネクチン（VNT-N, Thermofisher Scientific）でコートしたディッシュ上で培養した。
１－２．NIH-3T3細胞培養およびヘッジホッグシグナルアッセイ
　NIH-3T3細胞はDMEM（10% FBS、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加）で生育させた。ヘッジホッグシグナルアッセイを行うために、コンフルエントになるまで培養した細胞を飢餓誘導培地（DMEM；血清非添加）で一晩培養し、飢餓状態にした。次いで、培地を、SAG、Caged SAG、SANT75、Caged SANT75等を添加した飢餓誘導培地に交換した。細胞にハロゲンランプで15分間、光照射を行った。その後、6時間培養したNIH-3T3細胞から総RNAを抽出し、リアルタイムPCRを行った。
１－３．脳オルガノイドの調製
　脳オルガノイドは、Lancasterら, Nat Protoc. 9:2329-2340 2014に記載の方法に従って調製した。E8培地で培養したhiPSCsを、TrypLETM（Thermofisher Scientific）を用いて単一の細胞に分離した後、低接着性96-ウェル丸底プレート中、100 μL/ウェルのE6培地を用いて10,000細胞密度程度の細胞塊に再凝集させた。
　E6培地には、FGF2（5 ng/mL、培養開始0日～4日）およびROCKインヒビター（Thiazovivine、1 μM、培養開始0日～4日）を添加した。培養開始後2日と4日に培地交換を行った。培養開始後6日に、SAG、Caged SAG、UV照射後もしくはUV照射前のcaged SAG（光分解性保護基を結合したSAG）を含む、神経分化培地（DMEM/F12、1 % N2サプリメント、インスリン、1 % GlutaMaxサプリメント、1 % NEAA、1 % ペニシリン　ストレプトマイシンおよび1 μg/mL ヘパリン）に培地を変更した。Caged SAGを添加した場合は、培養物にハロゲンランプで15分間、光照射を行った。培養開始後6日、8日および10日に培地交換を行った。
　各条件で培養した3種類のオルガノイドを培養開始後11日に回収し、qPCRを行った。オルガノイドをマトリゲルドロプレット（25 μl）中に包埋し、脳分化用培地（DMEM/F12：NeurobasalTM media＝ 1：1、0.5 % N2サプリメント、1 % GlutaMaxサプリメント、0.5 % NEAA, 1 % ペニシリン　ストレプトマイシン、インスリン、1% B27 サプリメント（ビタミン A非含有）含有）を添加した60 mm ディッシュへ移した。培養開始後15日に、ビタミンA含有B27サプリメントを含む脳分化用培地に培地交換し、オービタルシェーカーに移した。その後、培地交換は、培養開始後30日まで、4～5日毎に行った。
１－４．定量PCR解析
　総RNAは、TriPure Isolation Reagent kit (Roche Diagnosis)を用いて抽出した。 cDNAは、SuperScript（登録商標）IV Reverse Transcriptase (Invitrogen)を使用して合成した。定量PCRは、KAPA SYBR Fast qPCR kit (KAPA Biosystems)を用いて行った。データは、GAPDHの発現量に対して標準化した。
１－５．免疫組織染色
　オルガノイドは4 % パラホルムアルデヒド／PBS溶液にて、1時間、4℃で固定し、PBS中で洗浄後、30 % スクロース／PBS中で一晩、4℃で抗凍結処理を行った。その後、オルガノイドをTissue-Tek O.C.T. Compound中に包埋して、-80℃で保存した。
　オルガノイドを12 μmの凍結切片にカットし、スライドグラス上に回収した。スライドグラスは乾燥後、-20℃で保存した。スライドグラスは、PBSで３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（1% BSA、5% Goat serumおよび0.3 % Triton X-100を含む1×PBS）で、1時間、室温にてインキュベートし、その後、ブロッキングバッファーで希釈した1次抗体（抗-NKX2.1抗体、1:1000および抗-MASH1抗体、1:1000）で、一晩、4℃にてインキュベートした。1次抗体でインキュベートした後、スライドグラスをPBSで3回洗浄し、Alexa Fluor 488を結合した2次抗体でインキュベートし、Hoechst33342でインキュベートした。蛍光イメージは、CMOS カメラ（Zyla4.2, Andor）を付属した倒立蛍光顕微鏡で取得した。
１－６．Caged SAG（光応答性保護基を結合させたSAG）の合成
化合物１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 　メタノールに溶けたピリジニルベンズアルデヒド溶液（504 mg、2.75 mmol、1 eq）にbocピリジン（604 mg、2.82 mmol、1.02 eq）を添加し、混合物を氷上で30分間撹拌した。撹拌後の溶液にNaBH4（332mg、8.78 mmol、3.2 eq）を添加し、氷上で20分間、その後、室温で1時間撹拌した。Na2CO3飽和溶液を添加して反応を停止し、その後、クロロホルム抽出（30 mL×3）を行い、有機層を混合しMg2SO4で乾燥した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH = 10:1）にかけて、化合物１を得た。
収率 82 %（857.4 m）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
化合物２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 　化合物１（857.4 mg、2.24 mmol、1 eq）および3-クロロベンゾ[b]チオフェン-2-カルボニルクロライド（569.2 mg、2.46 mmol、1.1 eq）のジクロロメタン溶液にEt3N （750 μL、5.3 mmol、2.4 eq）を添加し、室温で、30分間撹拌した。真空下で溶媒とEt3Nを除去し、残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（Acetone : Hexane = 1:1）にかけて、化合物２を得た。収率78%（1.00g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
SAGの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　化合物２（269.6 mg、0.468 mmol、1 eq）のDMF溶液に、触媒量の水（5 μL）を添加し、氷上で1時間撹拌した。次いで、NaH（150 mg、3.75 mmol、8.6 eq）を添加し、氷上で1時間撹拌した。次に、ヨードメタン（37.5 μL、0.602 mmol、1.3 eq）を添加した後、反応液を撹拌し、室温で一晩撹拌した。Na2CO3飽和溶液を添加して反応を停止し、その後、ジメチルエーテル抽出（60 mL×3）を行い、有機層を混合しMg2SO4で乾燥した。真空下、溶媒を除去し、4M HCl/エチルアセテート（10 mL）に添加後、反応液を室温で30分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM : MeOH = 3:1 to DCM : MeOH = 1:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、SAGを得た。収率55%（126.2 g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
化合物３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　1-(4-ブロモ-3-メトキシフェニル)エタノン（15.0 g、90.3 mmol、1 eq）、K2CO3（20.1 g、144.6 mmol、1.6 eq）およびメチル4-ブロモブチレートをDMF（100 ml）に溶解させ、この混合物を室温で16時間撹拌した。沈殿が溶解するまで純水を加え、酢酸と塩水で抽出を行った。有機層をMgSO4で乾燥し、エチルアセテートを真空下で除去した。粗製品を真空下で24時間乾燥させた。黄色のオイルから白色結晶（化合物３）を得た。収率93%（22.3 g）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
化合物４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 　氷上にて、硝酸（200 ml、3.3mol）を酢酸（40 ml、406mmol）にゆっくり添加した。この混合物に30mlの酢酸に溶解した化合物３をゆっくり添加した。得られた混合物を氷上で2.5時間撹拌し、その後、純水（4℃）にゆっくり添加した。生じた沈殿を濾過して回収し、真空下で乾燥させ、黄色の粉体（化合物４）を得た。収率69 %（8.02g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
化合物５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　化合物４（1.02 g、2.93 mmol）のエタノール（40 mL）懸濁液に、1M NaOH aq（8 mL）を添加して、40℃で1時間撹拌した。真空下でEtOHを除去し、NaHCO3の飽和水溶液（20 mL）を添加し、DCM （20 mL×3）で抽出した。有機層をMgSO4と溶媒蒸発にて乾燥させ、化合物５を得た。収率87%（760 mg）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
化合物６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　化合物５をtBuOH/THF (3:1) 溶液に溶解させ、これにBoc2O（222.6 mg、1.68 mmol、3 eq）のtBuOH/THF (3:1)溶液を15分間かけて少しずつ加え、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM 100%）のカラムクロマトグラフィーにかけて、化合物６を得た。収率47%（92.5mg）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
化合物７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　化合物６（92.5 mg、0.289 mmol、1 e）のメタノール溶液（5 mL）にNaBH4（21.6 mg、0.578 mmol、2 eq）を添加し、氷上で1時間、室温で一晩撹拌した。反応液にクエン酸水溶液（600 mg/mL、10 mL）を添加して酸性にし、クロロホルム（20 mL×3）で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させた。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 10 : 1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、化合物７を得た。収率77%（79.4 mg）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
化合物８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　化合物７（170.0 mg、478.3 μmol、1 eq）および4-ニトロフェニルクロロフォルメート（210.2 mg、1.04 mmol、2 eq）のDCM溶液（7 mL）に、Et3N（500 μL）を添加し、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 10 : 1 to DCM : MeOH = 3:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、化合物８を得た。収率82%（183.8 mg）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Caged SAGの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　SAG（40.0 mg、81.6 μmol、1 eq）と化合物８（90 mg、193.8 μmol、2.3 eq）のDMF溶液（3 mL）にEt3N（500　μL）添加し、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 10 : 1 to DCM : MeOH = 3:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、boc基で保護されたCaged SAGを得た（81.9 mg）。残渣に5 mLの4 M HCl-酢酸溶液を添加し、室温で40分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣を高速液体クロマトグラフィー（C18-AR-II column, 4 mL/min, 0 min CH3CN : H2O = 50 : 50, 5 min 70 : 50, 25 min 100 : 0）にかけて精製を行った。収率45 %（30.2 mg）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
１－７．Caged SAG誘導体（光応答性保護基を結合させたアンタゴニストタイプSAG誘導体）の合成
１－７－１．IR-783-SANT75の合成
SANT75の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 　化合物２（Mw. 576.15, 90.1 mg, 156.4　μmol, 1 eq）を5 mLのdry DMFに溶解し、水5uLを加えて氷上で1時間撹拌した。その後NaH（60 % in paraffin oil, 60 mg, 1.5 mmol, 10 eq）を加え氷上で1時間反応させた。PrI（Mw. 169.9, 1.75 g/mL, 45 μM, 1.5 eq）を加えて室温にてオーバーナイトで反応させた。水30 mL、酢酸エチル30 mLで３回抽出し、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。そこへ4 M HClを加え15分反応させた後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。残渣をシリカゲル（CHCl3 to CHCl3 : MeOH = 6 : 1 to CHCl3 : MeOH = 3 : 1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、目的物を回収した。収量は46.5 mg、収率は58 %。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
IR-783-SANT75の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 　SANT75（9.9 mg、19.1 μmol、1 eq）とIR-783（21.4 mg、28.6 μmol 1.5 eq）のdryDMF溶液（5 mL）にEt3N（13 μL, 100umol, 5.2 eq）添加し、80 °Cで1時間撹拌した。水30 mLを加え、酢酸エチル15 mLで3回抽出を行い、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。残渣をシリカゲル（CHCl3 to CHCl3 : MeOH = 10 : 1 to CHCl3 : MeOH = 3:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、青色のフラクションを回収し、ロータリーエバポレーターによって溶媒を除去した。収率5 %（0.9 mg）。
１－７－２．NVOC-SANT75の合成
NVOC-SANT75の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 　SANT75（10 mg、19.2 μmol、1 eq）と化合物８（14.7 mg、28.2 μmol、1.4 eq）のDMF溶液（5 mL）にEt3N（100　μL）添加し、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、再び4M HCl/Dioxiane（1 mL）に溶かし室温で30分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 50 : 1 to DCM : MeOH = 10:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて精製を行った。収率14 %（2.34 mg）。
１－８．HPLCを用いた光分解動力学的解析
　100 μMのCaged SAG（PBS:DMSO=9:1）に波長365 nmの光を0～8 J/cm2のエネルギー強度で照射した。各サンプルについてHPLC（5-C18-AR-II column, 0 min CH3CN:H2O=5:95 to 8 min 30:70 to 15 min 0:100）で分析した。HPLCから得られた各分画を回収し、ESIスペックトロメトリーで解析した。
２．結果
２－１．Caged SAG
２－１－１．Caged SAGの特性評価
　上記１－６．に合成方法を示したCaged SAGの解析結果を示す。まず、Caged SAGの吸光スペクトルを測定した。SAGは270 nm付近、光分解性保護基は360 nm付近にピークトップを持つ。吸光スペクトルの測定の結果、SAGは270 nm付近にのみピークがあり、Caged SAGは270 nmに加え、360 nm付近にもピークを示した（図１上図）。
　次に、Caged SAGに波長365nmの光を、0.25 J/cm2、0.5 J/cm2、1.0 J/cm2、2.0 J/cm2、4.0 J/cm2および8.0 J/cm2で照射し、吸光スペクトルを測定したところ、照射光のエネルギーを上げるに従い、270 nm付近のピークが増大し、360 nm付近のピークが減少した。
　また、Caged SAGに波長365 nmの光を0.25 J/cm2、0.5 J/cm2、1.0 J/cm2、2.0 J/cm2、4.0 J/cm2および8.0 J/cm2で照射しHPLCによって分析したところ、光照射量増加に応じてCaged SAGのピーク面積が減少し、SAGのピークが増加することがわかった（図２および図３）。各分画のESI Mass測定によりどのピークがどの化合物に対応するかを同定した。
　以上の結果から、合成したCaged SAGに、365 nm光を照射することで、SAGが生じることが確認された。そして、2-4 J/cn2で光分解はほぼ完了することが分かった。
２－１－２．脳オルガノイドにおける光照射後Caged SAGによる大脳腹側マーカーの発現誘導
　脳オルガノイドを光照射前のCaged SAG（100 nM）または光照射後のCaged SAG（100 nM）の存在下で培養を行い、大脳腹側マーカーであるNKX2.1およびMASH1の発現量を定量PCR法で測定した。光照射後のCaged SAGの存在下においてNKX2.1およびMASH1のいずれの発現量も増加したのに対し、光照射前のCaged SAG存在下では、SAG非存在下の場合と同様に、大脳腹側マーカーの発現は誘導されなかった（図４）。
　以上のことから、Caged SAGは、光分解性保護基によって活性が抑制されており、光照射によって、SAGと同程度のSmoアゴニスト活性を示すことが確認された。
　さらに、光照射前または光照射後のCaged SAG（100 nM）の存在下で培養した脳オルガノイドにおける大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現状況を抗NKX2.1抗体または抗MASH1抗体を用いた免疫組織染色により確認を行った。
　その結果、SAG存在下（SAG(+)）および光照射後のCaged SAG（Caged SAG(+)）の存在下で培養したとき、NKX2.1およびMASH1の発現が上昇していることが確認された（図５）。
２－１－３．Caged SAGへの光照射によるヘッジホッグシグナルの誘導
　Caged SAG（100 nM）の存在下で培養したNIH-3T3細胞に光照射を行い、ヘッジホッグシグナル下流遺伝子のGliの発現量を定量PCR法で測定した。その結果、Caged SAG存在下で培養した細胞に光照射を行うと、SAG存在下で培養したときと同様に、Gliの発現が上昇することが確認された。他方、Caged SAG存在下で培養した細胞に光照射を行わないと、Gliの発現上昇は確認できなかった（図６）。
　なお、SAGの量とGli発現量との関係について検討したところ、SAGおよびCaged SAG（光照射有り）を、100 nMより低い濃度で試すと、10 nMでは活性化が見られたものの1 nMではわずかな活性化しか見られなかった（図７）。この結果は、すでに報告されているSAGのEC50=3 nM（Chenら, Proc. Natl. Acad Sci, 99:14071-14076 2002）とも整合性が取れる。
　また、Caged SAGの存在下で培養した脳オルガノイドに光照射を行い、大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現状況を抗NKX2.1抗体または抗MASH1抗体を用いた免疫組織染色により確認を行った。その結果、Caged SAG存在下で培養した脳オルガノイドに光照射を行うと、SAG存在下で培養したときと同様に、NKX2.1およびMASH1の発現が上昇していることが確認された（図８）。
２－２．Caged SAG誘導体（アンタゴニストタイプ）
２－２－１．IR-783-SANT75
　IR-783-SANT75の特性について検討した。ここで使用したSAG誘導体であるSANT75は、Smoothenedアンタゴニスト活性を示す化合物である。
　IR-783-SANT75のスペクトルデータを測定した。光分解性保護基のIR-783は緑色だが、Clの部分がNに置き換わると吸収が短波長にシフトして青色になる。660 nm光を照射後は、シアニン骨格が酸化され、吸収団が壊れさらに吸収が短波長シフトし赤色になったと考えられる（図９）。光照射は、660 nmのLEDライトで1時間照射した。
２－２－２．NVOC-SANT75
　次に、アンタゴニストであるSANT75に光分解性保護基のNVOCを結合させたNVOC-SANT75に光照射することで、SANT75のアンタゴニスト活性が回復するかどうかを検討した。
　アゴニストのSAG（100 nM） とアンタゴニストのSANT75（1 μM）を同時に存在させ、Gli1の発現量を定量した。その結果、SANT75によるヘッジホッグシグナルの競合阻害が見られた（図１０）。さらにSAG（100 nM）とCaged SANT75（NVOC-SANT75）（1 μM）同時存在下で培養し、光照射後のGli1の発現量を定量したところ、光照射応答的にヘッジホッグシグナルが阻害されることがわかった（図１０）。
　以上のことから、アンタゴニストタイプのCaged SAG誘導体であるNVOC-SANT75は、光分解性保護基によって活性が抑制されており、光照射によって、SANT75と同程度のSmoアンタゴニスト活性を示すことが確認された。
　本発明によれば、ヘッジホッグ経路の機能解析が可能となる。そのため、ヘッジホッグ経路が関係する疾患の原因および治療方法の解明が期待される。

Claims (9)

  1. 　Smoリガンドの活性部位に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンド。
  2. 　前記Smoリガンドが、SAGまたはSAG誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の光応答性Smoリガンド。
  3. 　前記光応答性保護基が芳香環を含むことを特徴とする請求項２に記載の光応答性Smoリガンド。
  4. 　前記光分解性保護基が、SAGまたはSAG誘導体のアミノ基であって、ベンゾチオフェン環が結合していないアミノ基に結合していることを特徴とする請求項２または３に記載の光応答性Smoリガンド。
  5. 　下記一般式（ＩＩ）で表される請求項２ないし４のいずれかに記載の光応答性Smoリガンド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（ＩＩ）中、Ｘは光分解性保護基、Ｒ１は水素原子または炭素数１から６の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、Ｒ２は水素、置換または無置換のフェニル基または置換または無置換のピリジル基、Ｒ３は水素、フッ素または炭素数１～３の酸素を含んでもよい炭化水素基、Ｒ４は水素、メトキシ基または下記式（１）で表される置換基
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（１）中、Ｒ５はアミド結合を含んでもよい炭素数１～４の炭化水素鎖を表す。）、Ｒ６は、置換もしくは無置換の芳香環（複素芳香環を含む）を含む置換基を表す。］
  6. 　前記Ｒ１が水素原子またはメチル基であることを特徴とする請求項５に記載の光応答性Smoリガンド。
  7. 　前記Ｒ１がエチル基、プロピル基または２－プロペニル基であることを特徴とする請求項５に記載の光応答性Smoリガンド。
  8. 　請求項１ないし７のいずれかに記載の光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を有効成分として含む、医薬または医薬組成物。
  9. 　インヴィトロにおいて人工組織を誘導する方法であって、
    請求項１ないし７のいずれかに記載の光応答性Smoリガンドの存在下で細胞または組織培養を行う工程、および、
    光照射を行う工程、
    を含む方法。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005520788A (ja) * 2001-09-26 2005-07-14 キュリス インコーポレイテッド 有機的小分子である細胞増殖の調整剤
US20100048637A1 (en) * 2008-08-19 2010-02-25 Shuo Lin Cyclohexylamines, phenylamines and uses thereof
CN103319470A (zh) * 2012-03-23 2013-09-25 北京大学深圳研究生院 基于Sant-75结构的化合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005520788A (ja) * 2001-09-26 2005-07-14 キュリス インコーポレイテッド 有機的小分子である細胞増殖の調整剤
US20100048637A1 (en) * 2008-08-19 2010-02-25 Shuo Lin Cyclohexylamines, phenylamines and uses thereof
CN103319470A (zh) * 2012-03-23 2013-09-25 北京大学深圳研究生院 基于Sant-75结构的化合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HADDEN, M K: "Hedgehog pathway agonism: Therapeutic potential and small-molecule development", CHEMMEDCHEM, vol. 9, 2014, pages 27 - 37, XP055628960 *
HOLMES D B ET AL.: "Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium", BIOL OPEN, vol. 6, no. 3, 2017, pages 402 - 406, XP055628961 *

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