WO2019102606A1 - 疾患部位特異的リポソーム製剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a disease site-specific liposome preparation.
- the compound (A) (ONO-1301) is a low molecular weight compound having both PGI2 receptor (IP) agonism and thromboxane (TX) A2 synthetase inhibitory activity.
- IP PGI2 receptor
- TX thromboxane
- the compound (A) is known to be useful for the prevention and / or treatment of thrombosis, arteriosclerosis, ischemic heart disease, gastric ulcer, hypertension and the like since it has PGI2 agonism (Patent Document 1) .
- prostaglandin (PG) I2 receptor (IP) agonists, EP2 agonists and EP4 agonists including ONO-1301 include, for example, hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial cell growth factor (VEGF), Stromal cell-derived factor (SDF-1), and by inducing many in vivo regenerative factors such as high mobility group box protein 1 (HMGB1), it is endogenous to many diseases at low doses It is known that it can be used as a repair factor production promoter and is useful as a regenerative therapy (Patent Document 2).
- HGF hepatocyte growth factor
- VEGF vascular endothelial cell growth factor
- SDF-1 Stromal cell-derived factor
- HMGB1 high mobility group box protein 1
- biodegradable polymers are used so that the base does not remain at the administration site after drug release, and polylactic acid has been used particularly for surgical sutures and bone fixation bolts etc.
- a united body hereinafter sometimes abbreviated as PLA
- PLGA lactic acid / glycolic acid copolymer
- PLA united body
- PLGA lactic acid / glycolic acid copolymer
- the drugs used in the microspheres include physiologically active peptides, various hormones, growth factors, antibodies, peptides such as genes and various cell proliferation / differentiation inducing factors, proteins and nucleic acids, and the like, and as the low molecular weight compounds,
- the compound (A) (patent document 3), and the compound (B) and the compound (C) (patent document 4) are known.
- administration dosage forms of sustained tissue concentration maintenance type at the disease site or intravenous drip like intravenous administration of MS agent by intramuscular injection, subcutaneous injection and patch administration to various organs.
- Administration dosage forms of blood concentration maintenance type are administration preparations that show high drug concentration maintenance near the administration site and administration of intravenous drip-like blood dynamics when administered at the disease site, and DDS with drug accumulation at the disease site (drug delivery system) No effect is shown. That is, DDS is a technology for delivering medicines to necessary places, necessary times, and necessary amounts.
- a nanosphere preparation containing a PGI2 receptor agonist such as compound (A) (hereinafter abbreviated as NS There are studies to make). Many preparation methods are known for NS preparation, and by intravenous administration, NS preparation utilizes disease site-specific drug accumulation by utilizing vascular hyperpermeability action at inflammation site, ischemic site and cancer tissue. It is known to be a DDS preparation. However, it is difficult to produce a clinically usable NS preparation using a PGI 2 receptor agonist, which contains Compound (A), from the stability, content, yield, safety, sustained release rate, efficacy, etc. of the preparation. Met. In addition, it was very difficult to produce a preparation that exerts an effect by accumulating at the disease site as an NS preparation of compound (A).
- Methods of producing an NS preparation are roughly classified into a breakdown method and a build-up method.
- the former is a method of pulverizing particles by a method such as spray drying to submicronize the size.
- PEG polyethylene glycol
- Drug-incorporated micelle preparations using micellarized nanoparticles (polymer micelles) having a two-layer structure using a gel a hydrogel is prepared by crosslinking gelatin, collagen, or a polymer mixture such as hyaluronic acid or alginic acid,
- a hydrogel preparation in which a growth factor or the like is immobilized in a hydrogel, or a liposome preparation encapsulated in various phospholipids is known.
- vascular endothelial cells unlike normal vascular endothelial cells, a wide gap of about 200 nm is opened between cancer tissue and vascular endothelial cells at the inflammation / ischemic site, and a particle formulation whose size is controlled to about 100 nm or high.
- molecular preparations can be accumulated in vascular lesion site tissue such as cancer, infection, ischemia, inflammation, arteriosclerosis, rheumatism and the like. Therefore, as an NS preparation exhibiting DDS effect, a method is known in which the size is 50 nm to 200 nm, a drug is allowed to reach a lesion, and the drug is released there to enhance the therapeutic effect.
- NS preparations cross cell membranes and exert their potency in cells as an endocytosis effect.
- lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) nanosphere orally administered preparation of calcitonin Non-patent document 1
- Chitosan nanosphere pulmonary administration preparation of calcitonin Non-patent document 2
- PLGA nanosphere preparation of topically administered steroid Non-patent document 2
- Patent Document 3 nanospheres in which an anti-inflammatory agent, a mitochondrial injury inhibitor and the like are enclosed in a lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) are known to be effective for the treatment of ischemic reperfusion injury.
- nanosphere preparations in which prostaglandin E1 and derivatives thereof are encapsulated in a lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) are also known (Patent Document 6, Non-patent Document 4). Also, it is known that nanospheres encapsulated in beraprost's lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) are effective for pulmonary hypertension (Patent Document 7).
- these PLGA or PLA nanoformulations release the encapsulated drug by hydrolysis with lactic acid-glycolic acid bond water, the large surface area nanoformulation has a very short drug release time.
- the drug is gradually released by enzymatic degradation by in vivo lipase and the like.
- compositions containing immunosuppressant-encapsulated liposomes such as FK506, FTY720 and cyclosporin A as active ingredients are also known to be effective for the treatment of cardiovascular inflammatory diseases such as myocardial infarction, myocarditis and vasculitis syndrome.
- cardiovascular inflammatory diseases such as myocardial infarction, myocarditis and vasculitis syndrome.
- Patent Document 8 Doxil (Yansen Pharma) in which Doxorubicin (anticancer antibiotic) is in the form of liposome is already marketed as an anticancer agent.
- Doxorubicin anticancer antibiotic
- it is marketed as an antifungal agent, Kaposi's sarcoma, lymphomatous meningitis, age-related macular degeneration, and post-operative pain suppressant.
- Lipo PGE 1 encapsulated in lipid microspheres which are o / w emulsions of prostaglandin E1 using egg yolk lecithin, oleic acid, olive oil, and glycerin, has already been marketed (Ripple distributor: Mitsubishi Tanabe Pharma) ( Non-patent document 4) has a large average particle diameter of 200 to 300 nm and is not stealth, so it is trapped in the liver and macrophages, and its blood duration is short.
- the present invention relates to cardiovascular diseases such as ischemic and dilated cardiomyopathy, obstructive arteriosclerosis, vasculitis syndrome, valvular disease, aortic valve stenosis, chronic heart failure, diastolic dysfunction, pulmonary hypertension, pulmonary fibrosis, Asthma, respiratory diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, digestive diseases and urinary diseases such as chronic kidney disease, chronic hepatitis, chronic pancreatitis, and cerebral infarction chronic stage, Alzheimer's disease, diabetic neuropathy, Parkinson's disease, muscle It is an object of the present invention to provide a disease site-specific stealth liposomal pharmaceutical composition that is effective for treating neurodegenerative diseases such as atrophic lateral sclerosis.
- cardiovascular diseases such as ischemic and dilated cardiomyopathy, obstructive arteriosclerosis, vasculitis syndrome, valvular disease, aortic valve stenosis, chronic heart failure, diastolic dysfunction,
- the object of the present invention is to intermittently administer intravenous administration or inhalation administration by preparing a liposome (LP) preparation such as compound (A) which is a PGI 2 receptor agonist
- LP liposome
- A a PGI 2 receptor agonist
- the present invention is intended to provide a safe and convenient stealth liposome preparation that can be used clinically and that the drug can be accumulated in a disease site-specific manner to exert the DDS effect.
- LP preparation is the optimum preparation for achieving the purpose. It can be clinically used from the viewpoint of stability, content, yield, safety, efficacy, release property, stealth property, etc. among LP preparations containing compound (A) etc. LP formulation was found. That is, liposome preparations which are fine particle drug carriers coated with PEG-modified phosphoethanolamine and phospholipid etc. not only improve the release control and stability of the drug, but also disease site accumulation (targeting), tissue adhesion, etc. It has been found that the effects at lower doses can be enhanced and the side effects can be reduced by expressing the new functions of and enhancing the bioavailability (BA) and efficacy of drugs significantly.
- BA bioavailability
- the inventors of the present invention have found that, in a liposome preparation containing a PGI 2 receptor agonist containing a compound (A) etc., a component of phospholipid, PEG-modified phosphoethanolamine having stealth property
- the compound (A) which is a low molecular weight compound, is surprisingly found by appropriately combining the type of lipid and the composition ratio thereof, the average particle size of the liposome preparation, the weight ratio of the compound (A) etc and the phospholipid, etc. It has been found for the first time that DDS effects are exhibited by the regulation of the release rate of PGI 2 receptor agonists such as E. coli and the accumulation at the disease site being improved.
- a pharmaceutical composition for the treatment of a disease site which comprises a stealth-type liposome encapsulating a prostaglandin I2 receptor agonist.
- a stealth liposome preparation can be produced stably and with a high yield.
- the present invention has been completed through further trial and error based on these findings, and includes the following inventions.
- R 1 represents a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group
- R 2 represents (i) a hydrogen atom, (ii) a C 1-8 alkyl group, (iii) a phenyl group or a C 4-7 cycloalkyl group, (iv) a 4 to 7 membered single ring containing one nitrogen atom
- Rv A a C 1-4 alkyl group substituted with a benzene ring or a C 4-7 cycloalkyl group, or (vi) a C 1-4 alkyl group substituted with a 4-7 membered monocyclic ring containing one nitrogen atom
- R 3 represents (i) a C 1-8 alkyl group, (ii) a phenyl group or a C 4-7 cycloalkyl group, (iii) a 4 to 7-membered monocyclic ring containing one nitrogen atom, (iv) a benzene ring or C 4- A C
- the pharmaceutical composition according to Item 1 which comprises at least one selected from the group consisting of ONO-1301, beraprost, limaprost and NS-304 as a prostaglandin I2 receptor agonist.
- the stealth type liposome comprises a Bangamu method, a hydration dispersion method, a reverse phase evaporation method, an ethanol injection method or an ethanol dilution method, a homogenization method or the like using at least a prostaglandin I2 receptor agonist and a phospholipid.
- the stealth liposome is It has an average particle size of 50 to 200 nm, and contains 5 to 50 parts by weight of a phospholipid and 0.05 to 5 parts by weight of a PEG-modified phosphoethanolamine per 1 part by weight of a prostaglandin I2 receptor agonist , Item 7.
- the stealth liposome is 0.05 to 5 parts by weight of MPEG 2000-DSPE relative to 1 part by weight of prostaglandin I 2 receptor agonist, and ONO-1301, beraprost, limaprost and NS-304 as prostaglandin I 2 receptor agonists Containing at least one selected from the group consisting of and releasing said prostaglandin I2 receptor agonist for 3 hours to 4 weeks, Item 8.
- the pharmaceutical composition according to any one of Items 1 to 7.
- the stealth liposome is A prostaglandin I2 receptor agonist, With phospholipids, PEG modified phosphoethanolamine A water-miscible organic solvent and sterols-free, which can be obtained by the production method including the following steps (1) to (8), (1) mixing these in a solvent such that the amount of phospholipid is 5 mg or more and PEG-modified phosphoethanolamine is 0.05 mg or more per 1 mg of prostaglandin I 2 receptor agonist, (2) heating the mixture obtained in step (1) to prepare a melt; (3) instantaneously freezing the lysate obtained in step (2), (4) a step of lyophilizing the frozen product obtained in step (3) to remove the solvent, (5) A step of heating the lyophilizate obtained in step (4) and dispersing it in a phosphate buffer aqueous solution, (6) a step of sizing the dispersion obtained in step (5) with an extruder; (7) removing unencapsulated matter by ultrafiltration of the dispersion obtained in step (6),
- Diseases to be treated include liposomes, circulatory diseases, respiratory diseases, urinary diseases, digestive diseases, bone diseases, neurodegenerative diseases, vascular diseases, dental diseases, eye diseases, skin diseases, etc. 12.
- Diseases to be treated include liposomes containing ischemic and dilated cardiomyopathy, obstructive arteriosclerosis, vasculitis syndrome, valvular disease, aortic valve stenosis, chronic heart failure, cardiovascular disease such as diastolic dysfunction, lung Respiratory lung diseases such as hypertension, pulmonary fibrosis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, digestive and urinary diseases such as chronic kidney disease, chronic hepatitis, chronic pancreatitis, and cerebral infarction chronic phase, Alzheimer's disease, Item 12.
- inflammatory diseases such as cardiovascular diseases, respiratory diseases, digestive and urinary diseases, and neurodegenerative diseases, ischemic organ diseases, diabetic complications, tissue fibrotic diseases, tissue degeneration
- the pharmaceutical composition of the present invention exhibits an effect of enhancing the action at a low dose and reducing side effects as compared with the PGI2 receptor agonist alone.
- the liposome preparation of the present invention containing the compound (A) or the like may be administered by intermittent administration, such as intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or circulatory disease such as respiratory administration, respiratory disease, urinary disease, etc. It is useful for digestive system diseases, neurodegenerative diseases and the like. In particular, by accumulating at the disease site by intravenous administration or inhalation administration, it exerts an action of promoting endogenous repair factor production locally and is useful as a regenerative drug. In addition, myocardial infarction, angina pectoris, dilated cardiomyopathy, aortic valve stenosis, valvular disease, etc.
- Intravenous administration is useful for heart diseases such as chronic heart failure and diastolic dysfunction.
- inhaled administration is also useful for pulmonary diseases such as acute pneumonia, chronic pneumonia, pulmonary hypertension, pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, COPD and ARDS.
- pulmonary diseases such as acute pneumonia, chronic pneumonia, pulmonary hypertension, pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, COPD and ARDS.
- intrathecal administration is useful in addition to intravenous administration.
- FIG. 5 is an average particle size distribution chart of Preparations 1 to 4.
- FIG. 16 is an average particle size distribution map of Preparations 5 to 8.
- FIG. 16 is an average particle size distribution diagram of Preparation 9.
- FIG. 10 is an average particle size distribution chart of Preparation 10.
- FIG. 16 is an average particle size distribution map of Preparations 11 to 14.
- FIG. 16 is an average particle size distribution map of Preparations 15 to 18.
- FIG. 16 is an average particle size distribution chart of Preparation 19.
- FIG. 16 is an average particle size distribution chart of preparation 20. It is a graph which shows the quantification result of a compound (A).
- FIG. 16 is an average particle size distribution chart of preparation 21. Transmission electron microscopy imaging of formulation 21.
- FIG. 6 is an HPLC measurement chart of Samples 1 to 5.
- FIG. 6 is an HPLC measurement chart of Samples 1 to 5.
- FIG. 6 is an HPLC measurement chart of Samples 1 to 5.
- FIG. 16 is an average particle size distribution chart of preparation 22. Transmission electron microscopy imaging of formulation 22.
- FIG. It is an absorption spectrum of a compound (B) solution.
- FIG. 16 is an average particle size distribution chart of Preparation 23. Transmission electron microscopy imaging of formulation 23.
- FIG. It is an absorption spectrum of a compound (C).
- FIG. 20 is a particle size distribution diagram of Preparations 24 and 25. It is an HPLC analysis result.
- It is a particle size distribution of a compound (B) (preparation 26) inclusion liposome.
- It is a UV absorption spectrum of a compound (B) and a compound (B) inclusion liposome.
- It is a particle size distribution of a compound (D) (preparation 27) inclusion liposome.
- 32 is a graph showing a comparison with intratracheal administration of formulation 25 (ONO-1301 Lipo) with intravaginal administration. It is drawing which shows left ventricular wall thickness and left ventricular wall area evaluation method. It is drawing which shows an infarct area evaluation method.
- Liposomes used in the pharmaceutical composition of the present invention may be closed vesicles surrounded by a lipid bilayer membrane. Also, it may be a large unilamellar vesicle (LUV), a small unilamellar vesicle (SUV), or a multilamellar vesicle (MLV). Liposomes can be produced by known production methods.
- LUV large unilamellar vesicle
- SUV small unilamellar vesicle
- MLV multilamellar vesicle
- the Bangham method is generally used as a method of preparing the liposome, there is a method also referred to as a simple hydration method, an ultrasonication method, or an evaporation method by adding some operations.
- a method also referred to as a simple hydration method, an ultrasonication method, or an evaporation method by adding some operations.
- direct dispersion method organic solvent (ethanol etc.) injection method, reverse phase evaporation method, calcium fusion method, surfactant removal method, static hydration method, hexane-span 80 dialysis method, organic solvent small sphere evaporation method, mechanochemical
- ultrasonic methods lipid-compound film methods, etc., and their improved methods.
- Adjustment of the particle size includes extrusion, extrusion, French press, and the like.
- the extruder method or the French press method there is a method of adjusting the liposome size by passing the nanopore membrane filter with an appropriate pore size set in the extruder or the French press several times.
- a compound inclusion method there are a pH gradient (remote loading) method, a counter ion concentration gradient (gelation) method, a freeze-thaw method, a supercritical carbon dioxide method, a film loading method and the like.
- the superior methods for encapsulating water-soluble drugs include the reverse phase evaporation method and the freeze-thaw method. It is the Bangham method, the mechanochemical method, the supercritical carbon dioxide method, and the film loading method that are superior to the inclusion of the fat-soluble drug. In addition, what is superior to the dissociative drug is a pH gradient (remote loading) method, a counter ionization concentration gradient method, and the like.
- the Bangham method there is a method (hydration dispersion) in which a lipid film is produced and then mechanical vibration is applied in an aqueous buffer by vortex, ultrasonic waves or the like.
- a lipid In the reverse phase evaporation method, a lipid is dissolved in an organic solvent immiscible with water, and then an aqueous buffer is added and sonicated to form a reverse micelle (W / O emulsion). Thereafter, the organic solvent is removed by reduced pressure treatment or the like to form a liposome after gel state.
- the ethanol injection method or ethanol dilution method is a method in which a lipid is dissolved in ethanol and a liposome is formed by injecting a lipid solution into an aqueous buffer.
- the direct dispersion method includes a method of directly dispersing a lipid or a mixture of a lipid and a compound in an aqueous buffer to form a liposome without producing a lipid film.
- a particle diameter adjustment method there is a method of adjusting liposome size by passing through a nanopore set in an extruder or a French press as an extruder method or a French press method.
- the remote loading method is an encapsulation method using the difference in pH solubility of a compound. That is, a liposome is formed having an inner aqueous phase of a pH solution at which the compound becomes water soluble, and then the outer aqueous phase is replaced with a pH solution at which the compound becomes lipid soluble by ultrafiltration or dialysis.
- the compound solution is added to the liposome dispersion, the compound is encapsulated in the aqueous phase in the liposome.
- the dehydration-rehydration method is an encapsulation method by dehydrating the liposome by lyophilization or the like and then rehydrating it with an aqueous buffer containing a compound to be encapsulated.
- the freeze-thaw method there is a method in which the compound is encapsulated at a high concentration by mixing the liposome dispersion and the compound solution to be encapsulated and repeating freezing and thawing.
- the method for producing the liposome is not limited to these production methods, and each improved method is also included.
- the lipid constituting the liposome is not particularly limited.
- soybean lecithin hydrogenated soybean lecithin, egg yolk lecithin, phosphatidyl cholines, phosphatidyl serines, phosphatidyl ethanolamines, phosphatidyl inositols, phosphasphingomyelins, phosphatidic acids, long And chain alkyl phosphates, gangliosides, glycolipids, phosphatidyl glycerols, sterols and the like.
- the lipids may be used alone or in combination of two or more.
- phosphatidyl cholines examples include dimyristoyl phosphatidyl choline, dipalmitoyl phosphatidyl choline, distearoyl phosphatidyl choline and the like.
- phosphatidylserines dipalmitoyl phosphatidylserine, dipalmitoyl phosphatidylserine sodium, phosphatidylserine sodium derived from bovine brain and the like can be mentioned.
- phosphatidyl ethanolamines examples include dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine, dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine, distearoyl phosphatidyl ethanolamine and the like.
- Examples of phosphatidylinositols include phosphatidylinositol sodium derived from wheat and the like.
- Examples of phosphasphingomyelins include sphingomyelin derived from bovine brain.
- Examples of phosphatidic acids and long chain alkyl phosphates include dimyristoyl phosphatidic acid, dipalmitoyl phosphatidic acid, distearoyl phosphatidic acid, and dicetyl phosphate.
- Gangliosides include ganglioside GM1, ganglioside GD1a, ganglioside GT1b and the like.
- glycolipids examples include galactosyl ceramide, glucosyl ceramide, lactosyl ceramide, phosphatide, globoside and the like.
- the phosphatidyl glycerols include dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol and the like.
- Sterols include cholesterol, dihydrocholesterol, lanosterol, dihydrolanosterol, sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, ergosterol and the like.
- a combination of phospholipid and cholesterol is preferred.
- a phospholipid phosphatidyl cholines are preferable.
- the molar ratio of phospholipid to cholesterol is preferably in the range of 1: 0.1 to 1.5, preferably 1: 0.5 to 1.25. It is more preferable to be in the range of
- phospholipids used in the present invention the followings have already been marketed (sales company; Nippon Seika).
- DOPC DOPC or DEPC
- the conventional liposome preparation is a liposome consisting of typical phospholipids and cholesterol, but there is a stealth-type liposome in which the retention property in blood is improved by modifying the liposome surface with polyethylene glycol (PEG) or the like. These have an accumulation action in a disease site-specific manner by the EPR effect.
- PEG polyethylene glycol
- the membrane surface of the liposome is preferably modified with a polyethylene glycol (PEG) derivative.
- PEG polyethylene glycol
- Liposomes modified with a PEG derivative can be produced by using a covalent conjugate of PEG and phospholipid having a molecular weight of 500 to 20000.
- a covalent conjugate of PEG and phospholipid it is preferable to use PEG-modified phosphoethanolamine which is a conjugate of PEG having a molecular weight of 200 to 5,000 and distearoylphosphatidylethanolamine.
- DMPE 1, 2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
- mPEG 350, mPEG 550, mPEG 750, mPEG 1000, mPEG 2000, mPEG 3000, and mPEG 5000 as PEG modified group respectively DPPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine), DSPE (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine), DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanamine), and the like are commercially available (Nippon Seika).
- mPEG 2000-DSPE N- (carbonyl-methoxypolyethyleneglycol 5000) -1, 2 distearoyl-sn-glycero-3-phosphophenolamine, sodium salt CAS No. 147867-65-0 (Nippon Seika) and DEPC: 1,2- The combination of Dierucoyl-sn-glycerol-3- phosphorylcholine CAS No. 51779-95-4 (Nippon Seika) is preferred.
- the content of the PEG-modified phosphoethanolamine and the phospholipid is not particularly limited, but preferably 0.01% to 10% of the PEG-modified phosphoethanolamine to the phospholipid 1, 0.01% to 3% It is more preferable that
- a targeting molecule such as PEG and an antibody or peptide to increase retention in blood and further enhance transfer to the target site.
- the present invention provides a stealth-type liposome characterized in that the liposome comprises a PGI2 receptor agonist and a phospholipid, and PEG-modified phosphoethanolamine. It is preferable that the said liposome mixes a PGI2 receptor agonist, a phospholipid, and EG modified
- a step of preparing a lysate, a step of instantaneously freezing the lysate, a step of freeze-drying and removing a solvent after freezing, heating the lyophilizate It is manufactured by the manufacturing method including the steps of dispersing in a phosphate buffer aqueous solution, sizing with an extruder, removing unencapsulated matter by ultrafiltration, and adding a sugar and lyophilizing.
- the liposome produced by this method is a PGI2 receptor agonist-encapsulated stealth-type liposome preparation characterized in that it contains a PGI2 receptor agonist and has an average particle size of 50 to 200 nm.
- the mixture comprising PGI 2 receptor agonist and phospholipid, and PEG modified phosphoethanolamine and solvent may or may not contain sterols, such as cholesterol. It is said that conventional liposomes are preferably used in combination with phospholipids and cholesterol as a constituent lipid, but by not using cholesterol as a constituent lipid, production of a PGI2 receptor agonist-encapsulated liposome stable at a high concentration It became possible.
- the size (particle size) of the liposome is not particularly limited, but the average particle size is preferably about 10 to 1000 nm, more preferably about 20 to 500 nm, and still more preferably the average particle size. Is about 50 to 200 nm.
- particle size refers to the diameter of the particles as measured by dynamic light scattering.
- the preferred polydispersity index PDI) is less than or equal to 0.3.
- the method of adjusting the particle size is not particularly limited.
- the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for cardiovascular disease, respiratory disease, urinary disease, vascular disease, digestive disease or neurodegenerative disease and the like, which comprises PGI2 receptor agonist-encapsulated liposome as an active ingredient.
- PGI2 receptor agonist used in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and known PGI2 receptor agonists can be suitably used. Examples of known PGI 2 receptor agonists include, for example, general formula (I)
- R 1 represents a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group
- R 2 represents (i) a hydrogen atom, (ii) a C 1-8 alkyl group, (iii) a phenyl group or a C 4-7 cycloalkyl group, (iv) a 4 to 7 membered single ring containing one nitrogen atom
- Rv A a C 1-4 alkyl group substituted with a benzene ring or a C 4-7 cycloalkyl group, or (vi) a C 1-4 alkyl group substituted with a 4-7 membered monocyclic ring containing one nitrogen atom
- R 3 represents (i) a C 1-8 alkyl group, (ii) a phenyl group or a C 4-7 cycloalkyl group, (iii) a 4 to 7-membered monocyclic ring containing one nitrogen atom, (iv) a benzene ring or C 4- A C
- the PGI2 receptor agonist is (A) the following formula (II)
- a mammal having developed an inflammatory disease As a target for administration of the pharmaceutical composition of the present invention, a mammal having developed an inflammatory disease, ischemic organ disorder, diabetic complication, tissue fibrotic disease, tissue degeneration disease and the like is preferable. Mammals include humans, monkeys, cattle, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs and the like, and in particular those who have developed or developed an inflammatory disease Preferred are humans suspected of having
- the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as the active ingredient can reach the disease site, but for intravenous administration, for infusion / infusion, for intracoronary administration, for inhalation, for intramuscular administration
- intravenous administration for infusion / infusion
- intracoronary administration for inhalation
- intramuscular administration for subcutaneous administration, for oral administration, for suppository, for intraperitoneal administration, for transmucosal administration and for percutaneous administration, for injectable preparation for organs, or patch, inhalant, nebulizer, spray, gel,
- inhalant, nebulizer, spray, gel There are creams, sprays, cartilages, nasal drops, eye drops and the like.
- intracoronary administration is preferred
- peripheral intravenous administration is preferred.
- the injection may be either aqueous injection or oil injection.
- an aqueous injection for example, after mixing the encapsulated liposome of the present drug etc. with a solution in which a pharmaceutically acceptable additive is appropriately added to an aqueous solvent (water for injection, purified water etc.) according to a known method It can be prepared by sterilizing it with a filter, etc. and then filling it into a sterile container.
- an isotonicity agent such as sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol, etc .
- phosphate buffer, acetate buffer Buffers such as borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer, etc .
- Preservatives such as butyl acid, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax, etc .
- thickeners such as hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol etc.
- suitable solubilizers for example, alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, nonionic surfactants such as lysolecithin and pluronic polyol Agents and the like may be further blended.
- proteins such as bovine serum albumin and keyhole limpet hemocyanin; polysaccharides such as aminodextran and the like may be contained.
- sesame oil or soybean oil is used as an oily solvent, and benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like may be blended as a solubilizing agent.
- the prepared injection is usually filled in a suitable ampoule or vial.
- Liquid preparations such as injections can be stored by removing water by freeze storage, lyophilization or the like. The freeze-dried preparation is used by reconstituting, for example, distilled water for injection at the time of use.
- the amount of the drug and the like contained in the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the dosage form, administration interval, or administration route, but in the case of injection for intravenous administration, it is from the range of 0.001 ng / mL to 100 mg / mL. It can be selected appropriately.
- the administration period and administration method are appropriately determined in consideration of safety, convenience, low invasiveness, patient burden, compliance, etc., depending on the disease and its treatment method. It may be effective and any convenient dosing interval may be used, but twice daily, once every two days, once every three days, once a week, once every two weeks, three weeks Preferably once a week or once every 4 weeks, but more preferably once a day to once a week.
- the dose per dose is preferably 500 mg or less, preferably 100 mg or less as ONO-1301. Is more preferred.
- the lower limit is not particularly limited, and it may be a dose that can achieve the intended effect.
- the pharmaceutical composition of the present invention contains PGI2 receptor agonist-encapsulated liposomes as an active ingredient, and the free PGI2 receptor agonist administration exhibits an antihypertensive effect because of its vasodilator action at a large dose, so an effective amount
- liposomal preparations are useful in that they can show effects in many diseases even at low doses due to the disease site accumulation due to the DDS effect. That is, vascular permeability enhancement occurs in the lesion area, and nanosize liposomes can be expected to specifically accumulate in the lesion area (EPR effect).
- EPR effect vascular permeability enhancement
- the drug is transferred into cells by the endocytic effect, it is very useful in that it can be expected to increase drug efficacy and reduce side effects.
- the pharmaceutical composition of the present invention is useful in that it can deliver an active ingredient to a target lesion site by administration from a peripheral vein or the like and does not require a central venous catheter or the like. It is also advantageous in that it is difficult to deliver from a peripheral vein to a site other than the target. That is, the pharmaceutical composition of the present invention is very useful in that it can enhance the tissue repair action at a low dose and can reduce side effects by reducing the dose, suppressing delivery outside the target site, eliminating the need for central venous catheters, etc. .
- lipid premix when preparing a liposome preparation by the direct dispersion improvement method, when preparing a lipid premix, it is a solvent that dissolves the lipid and the sample, can be instantly frozen, and can be removed by lyophilization, Any solvent may be used if this condition is met.
- t-butanol, cyclohexane + ethanol, hexafluoropropanol, 1-propanol, isopropyl alcohol, 2-butoxyethanol and the like are preferable, but t-butanol is preferably used.
- lyophilization of the liposome it is generally necessary to perform lyophilization by suppressing disintegration of the cell membrane at the time of freezing by adding and dispersing saccharides such as maltose, sucrose, or trehalol.
- the PGI 2 receptor agonist such as compound (A) has an action to promote the production of internal regenerative factors, an action to induce differentiation of stem cells, an anti-apoptotic action, a reverse remodeling action, an antifibrotic action, an angiogenesis promoting action, etc.
- Stealth liposomal preparations containing PGI 2 receptor agonists are various organ disorders, inflammatory diseases (eg, vascular diseases (eg, obstructive arteriosclerosis (ASO), burger's disease, Raynaud's disease, arteriosclerosis, vasculitis) Syndrome, etc., cardiovascular disease (eg, myocardial infarction, myocarditis, angina pectoris, supraventricular tachyarrhythmia, congestive heart failure, coronary artery disease, idiopathic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, ischemic cardiomyopathy Atrial fibrillation, chronic heart failure, diastolic dysfunction, systolic dysfunction, valvular disease, aortic valve stenosis etc., neurodegenerative diseases (eg, ischemic brain injury, cerebrovascular disorder, stroke, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, etc.
- vascular diseases eg, obstructive arteriosclerosis (ASO), burger's
- Compound (A) and the like PGI2 receptor agonists induce and promote the production of internal regeneration factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), various fibroblast growth factors (for example, a / bFGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), platelet derived growth factor (PDGF), angiopoietin, hypoxia inducible factor (HIF), insulin-like growth factor (IGF), bone morphogenetic protein (BMP), Known are connective tissue growth factor (CTGF), epidermal growth factor (EGF), stroma cell-derived factor (SDF-1), High Mobility Group Box 1 (HMGB1), etc., and growth factors of their families.
- VEGF vascular endothelial growth factor
- HGF hepatocyte growth factor
- various fibroblast growth factors for example, a / bFGF
- TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
- PDGF platelet derived growth factor
- HGF- ⁇
- drugs that produce the above-mentioned endogenous repair factors include other PGI2 receptor agonists, EP2 among PGE2 receptors, EP4 receptor agonists, mixed receptor agonists thereof and the like.
- the above-mentioned drug may be used in place of compound (A).
- the drugs that can be used in place of compound (A) include PGIs and derivatives of PGEs, IP, EP2 And EP4 receptor agonists and the like, and examples thereof include Compound (B), Aeroprost, Ornoprostil, Compound (C), Compound (D) (Limaprost), Compound (E), Enprostil, Misoprostol, ONO -4232, ONO-8055 etc. are mentioned.
- the compound (A) and two or more drugs selected from the above drugs are also preferable to combine into a liposome.
- the above drug is a commercially available product or can be easily produced according to a known method.
- the administration mode of the liposome of the present invention is for intravenous administration, coronary artery administration, inhalation, for intramuscular administration, for subcutaneous administration, for oral administration, for transmucosal administration, for percutaneous administration or for injection for organs. Preparations, ointments, patches, oral preparations, sprays and the like can be mentioned.
- transmucosal administration agents such as rectum, uterus, oral cavity, nasal drops, and intravenous drip infusion or continuous administration into the coronary artery.
- HSPC hydrogenated soybean phospholipid, hydrogenated lecithin
- Product name COATSOME NC-21, (NOF corporation) CAS: 921228-87-5, 92128-87-5
- DSPE 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
- DEPC 1,2-Dierucoyl-sn-glycerol-3-phosphorylcholine CAS No.
- the external solution was 10 mM phosphate buffer (pH 7.4).
- the extrader was implemented using LIPEX 100 mL Thermobarrel Extruder: manufactured by Northern Lipid, Nunlepore membrane, manufactured by GE 400 nm: product number 111107 200 nm: product number 111106. 8) Stirred cell 8000 series: 50 mL Cell: Free compound (A) was removed by stirred ultrafiltration (fractionated molecular weight: 300,000 Da) manufactured by Merck Co., Ltd. and Biomax PBMK 04310 Merck Co., Ltd. The external solution was 10 mM phosphate buffer (pH 7.4).
- FIG. 3 shows an average particle size distribution chart.
- Thermobarrel Extruder manufactured by Northern Lipid, Nunlepore membrane, manufactured by GE 400 nm: product number 111107, 200 nm: product number 111106.
- the free compound (A) was removed by agitation type ultrafiltration (fractionated molecular weight: 300,000 Da).
- the external solution was 10 mM phosphate buffer (pH 7.4).
- FIG. 4 shows an average particle size distribution chart.
- FIG. 5 shows these average particle size distribution maps.
- FIG. 6 shows these average particle size distribution maps.
- FIG. 7 shows an average particle size distribution chart.
- 10 mM phosphate buffer (pH 8.0) was added to a lipid concentration of 10 mg / mL. 4. Sonication was carried out at VS-100III 28 KHz, manufactured by As One, the lipid and compound (A) on the wall of the eggplant flask were peeled off, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 30 minutes. 5. An equal volume of 10 mM phosphate buffer (pH 8.0) was added and extruder treatment was performed. (60 ° C., 400 nm, 200 nm). The extruder was implemented using LIPEX 100 mL Thermobarrel Extruder: Northern Lipid, Nunlepore membrane, and GE 400 nm: Item No.
- 111107 200 nm Item No. 111106. 6.
- Free compound (A) was removed by agitation type ultrafiltration (fractionated molecular weight: 300,000 Da).
- the external solution was 10 mM phosphate buffer (pH 7.4).
- FIG. 8 shows an average particle size distribution chart.
- Compound (A) concentration was measured by adding a compound (A) solution (0.1 mg / mL, 0.2 mg / mL, 0.4 mg / mL) of known concentration to blank liposome (lipid concentration 4.7 mg / mL) . 6) The measurement result of the known concentration solution and the measurement result of the liposome-added known concentration solution were determined to calculate the recovery rate.
- the compound (A) was quantified by the absorbance method.
- FIG. 10 shows these average particle size distribution maps.
- FIG. 11 shows transmission electron microscope imaging of preparation 21.
- Sample 2 Compound (A) was prepared to be 0.5 mg / mL with 0.1 N sodium hydroxide solution-10 mM phosphate buffer (pH 8.0) (buffer at the time of encapsulation).
- Sample 3 Sample 2 was diluted 1: 1 with saline to prepare a 0.25 mg / mL solution. This was allowed to stand overnight at 37 ° C.
- Sample 4 PEG-treated empty liposome was diluted 10-fold with physiological saline. The mixture was allowed to stand overnight at 37 ° C., followed by ultrafiltration.
- the HPLC analysis of the five samples was performed to confirm the presence or absence of the compound (A) oxide and the presence or absence of the compound (A) oxide on the PEG-treated compound (A) -encapsulating liposome in a 37 ° C. environment.
- FIG. 15 shows changes in UV absorption spectrum.
- Compound (C) was dissolved in DMSO so as to be 20 mg / mL, and 10 mM phosphate buffer (pH 8.0) was added so that compound (C) was 10 mg / mL.
- Compound (C) solution was added to the lipid film so as to be 1/10 (Drug / Lipid w / w%), and stirred at 37 ° C. for 1 hour (Compound (C): 6.0 mg, lipid: 60.0 mg).
- Asone VS-100III The ultrasonic treatment was performed for a total of 90 minutes with an output of 28 kHz, 60 seconds, 45 kHz, 60 seconds, and 100 kHz, 3 seconds cycle.
- FIG. 17 shows transmission electron microscope imaging of Preparation 23.
- the absorption spectrum of the compound (C) was measured to confirm that absorption peaks were at 300 nm and 368 nm. It could be confirmed that the quantification of the compound (C) was carried out by the absorbance method (wavelength: 300 nm).
- the UV absorption spectrum change of the compound (C) is shown in FIG.
- Ultrafiltration Ultrafiltration (ultrafiltration membrane: Merck Millipore PBMK 04310, molecular weight cut off: 300,000 Da) was carried out using PBS ( ⁇ ) (diluted SIGMA D1408 at a factor of 10) to remove unencapsulated compounds.
- PBS diluted SIGMA D1408 at a factor of 10.
- a stirring cell 8000 series Model 8050 product number 5122 manufactured by Merck & Co. was used, and a membrane manufactured by Merck Biomax PBMK 04310 300 KDa was used.
- the liposome solution was subjected to ultrafiltration (molecular weight cut off: 300,000 Da) with PBS ( ⁇ ); Dulbecco's phosphate buffered saline (containing no Ca and Mg), and used as a sample after ultrafiltration.
- the presence or absence of the ONO-1301 oxide was confirmed by HPLC.
- Table 15 before and after ultrafiltration no significant change was observed in various physical property results.
- FIG. 19 and FIG. 20 the peak of the ONO-1301 degradation product was not confirmed from the particle size distribution and the HPLC analysis results.
- the yield of compound (A) was 88%.
- the extruder used was LIPEX 100 mL ThermoBarrel Extruder manufactured by Northern Lipid, and the membrane was manufactured by GE, Inc. Nuclepore; Part No. 111107 of 400 nm and part No. 111106 of 200 nm.
- Viii Ultrafiltration (ultrafiltration membrane: Merck Millipore PBMK04310, molecular weight cut off: 300,000 Da) was performed with PBS ( ⁇ ) (diluted SIGMA D1408 at a factor of 10) to remove the unencapsulated compound.
- the ultrafiltration waste was carried out up to 140 mL, 7 times the 20 mL liposome volume, and recovered in the final 20 mL.
- a stirring cell 8000 series Model 8050 product number 5122 manufactured by Merck & Co. was used, and a membrane manufactured by Merck Biomax PBMK 04310 300 KDa was used.
- the liposome solution was placed in a stirring cell, the apparatus was set, and liquid delivery was carried out by nitrogen gas pressure (0.4 MPa) until the waste liquid came out of 140 mL.
- FIG. 22 shows UV absorption spectra of the compound (B) (belyplast) and the liposome in which the compound (B) is contained.
- FIG. 24 shows UV absorption spectra of compound (D) (limaprost) and the liposome in which the compound (D) is contained.
- the animals used are rats, Slc: Wistar (male), age at the start of the test: 5 weeks, body weight at arrival: 66.4 to 90.8 g, (NSC, Japan), monocrotaline (hereinafter MCT), Lot No .: SLBG 1999 V (Sigma-Aldrich Corporation) was subcutaneously administered at a dose of 60 mg // kg and divided into groups by weight stratification (Table 19) 6 days after MCT administration.
- Group 1 Physiological saline was intravenously administered at one week intervals at 7, 14, 21, 28 and 35 days after MCT administration (5 times in total).
- Group 2 Up to 7 to 41 days after MCT administration, 3 mg / kg of Compound (A) was orally administered twice a day at intervals of 8 hours or more.
- Group 3 50 mg / kg of bosentan was orally administered twice / day at intervals of 8 hours or more until 7 to 41 days after MCT administration.
- Group 4 1 mg / kg of formulation 21 (ONO-1301 Lipo) was intravenously administered at weekly intervals 7, 5 days after MCT administration (7, 14, 21, 28 and 35 days (total 5 times)).
- Group 5 1 mg / kg of Compound (A) was intravenously administered at weekly intervals at 7, 14, 21, 28 and 35 days after MCT administration (5 times in total).
- group 1 one death was observed 15 days after preparation of a severe heart failure model by subcutaneous administration of 60 mg / kg of MCT. Subsequently, 17 deaths were observed by day 42, and the final survival rate was 10% (number of survivors: 2/20).
- the ET-1 antagonist bosentan which was used as a positive control, has been clinically used as a treatment for pulmonary hypertension and has been validated in the rat MCT-induced heart failure model (Circ J 2013; 77: 2127- 2133), these are repeated oral administrations immediately after MCT administration. At this time, no significant survival benefit could be confirmed in the administration after 7 days of MCT administration (Group 3).
- a novel ONO-1301 liposome preparation (Formulation 21; ONO-1301Lipo) is prepared as a disease site-specific DDS liposome preparation, and the more versatile disease site-specific (DDS) treatment for severe heart failure is achieved by intravenous injection.
- DDS disease site-specific
- the DDS effect was confirmed by comparing and examining the survival rate in the MCT-induced severe heart failure model by intermittent intravenous administration of Preparation 21.
- Bosentan an ET-1 antagonist used as a positive control substance, has been clinically used as a therapeutic agent for pulmonary hypertension and has been validated in the MCT-induced heart failure model, but these are repeated from immediately after MCT administration. It is oral administration. At this time, no significant survival benefit was confirmed in the treatment administration 7 days after MCT administration.
- the final survival rate after repeated administration of 3 mg / kg (Group 2) of Compound (A) twice daily is 50%, and a significant survival effect is confirmed compared to the control group (Group 1).
- the In addition, the final survival rate is 50% even when 1 mg / kg (group 4) of preparation 21 (ONO-1301 Lipo) is also administered weekly for 1 week, and equivalent to compound (A) (group 2) It showed the effect of prolonging life.
- test substance was administered from 28 days after the BLM administration until 28 days, and the survival rates were compared.
- Compound (A) (ONO-1301) was repeatedly orally administered twice daily, Compound (A) (ONO-1301) was intravenously administered once a week, and once weekly was administered intratracheally. .
- preparation 25 ONO-1301 Lipo
- intratracheal administration once weekly administration of preparation 25 (ONO-1301 Lipo) and intratracheal administration once a week were performed, and the DDS effect of preparation 25 (ONO-1301 Lipo) was examined from comparison of survival rate.
- the test group configurations are shown in Table 21.
- Test substance administration 1 Oral administration: Administration of vehicle (0.5% CMC-Na aqueous solution) and compound (A) (groups 1 and 2) The vehicle and compound (A) (3 mg / kg) were administered twice daily (the interval between morning and afternoon separated by 8 hours or more) and orally administered orally for 23 days from 6 days after preparation of lung injury model.
- Administration volume 5 mL / kg ⁇ 2 times / day
- Administration method Oral administration was carried out using a polypropylene disposable syringe and a gastric tube for mice. 2) Intravenous administration: administration of compound (A) and preparation 25 (groups 3, 4 and 5) The lung injury model was administered 6 days after preparation of the model, and thereafter tail vein administration was performed once a week (a total of 4 times after 6, 13, 20, 27 or 28 days of model preparation). Administration volume: 1.5 mL / kg Administration method: Intravenous administration was performed using a glass syringe and a disposable injection needle 30G.
- Intratracheal administration administration of compound (A) and preparation 25 (groups 6, 7, 8, 9)
- the lung injury model was administered 6 days after preparation of the model, and thereafter intratracheal administration was performed once a week (a total of 4 times after 6, 13, 20, 27 or 28 days of model preparation).
- Normal group 9 Normal was similarly administered physiological saline.
- Administration volume 0.5 mL / kg
- Administration method Intratracheal (intrapulmonary) administration after pentobarbital (30 to 35 mg / kg, ip) anesthesia.
- the survival rate was 30%.
- the survival rate was 60%, and the survival rate was extended compared to the vehicle administration group.
- the survival rate was 40% in the 3 mg / kg intravenous administration group of compound (A).
- both groups showed a 50% survival rate.
- the survival rate is 20% in the 1 mg / kg intratracheal administration group of compound (A), and 50% and 40% survival rates in 0.3 mg / kg of preparation 25 and 1 mg / kg tracheal administration of preparation 25.
- the survival rate in the vehicle group (group 1) was 30%. Compared with the compound (A) (ONO-1301) oral administration group (2 groups; 60%), 4 groups (1/33 dose compared to the total dose of 2 groups) and 5 groups (2 groups total) When the dose ratio was 1/11, the survival rate was the same value and showed a slightly lower survival rate (50%) compared to the 2 groups. On the other hand, the compound (A) (ONO-1301) drug substance at 3 mg / kg once weekly for intravenous administration (group 5) has an even lower survival rate (40%) at 1/11 dose compared to the 2 groups. )showed that.
- FIG. 30 Comparison with intrathecal intratracheal administration of preparation 25 (ONO-1301 Lipo)
- the total dose of compound (A) (ONO-1301) (3 mg / kg ⁇ 2 ⁇ 22 days) in two groups is It was 132 mg / kg.
- the total dose of 1 mg / kg once weekly intratracheal administration (six groups) of compound (A) (ONO-1301) is 4 mg / kg, and 0.3 mg / kg once weekly of preparation 25
- the total dose for intratubular administration (7 groups) was 1.2 mg / kg.
- the total dose of 1 mg / kg once weekly intratracheal administration (group 8) of preparation 25 was 4 mg / kg.
- the survival rate in the vehicle administration group (group 1) was 30%.
- Compound (A) ONO-1301 compared with the oral administration group (group 2; 60%), 7 groups (1/110 dose compared to the total dose of 2 groups), and 8 groups (2 groups)
- the survival rates were 50% and 40%, respectively, at a dose of 1/33 of the total dose.
- the once weekly intratracheal administration group (7 groups, 8 groups) of the preparation 25 has a survival rate higher than that of the once weekly intratracheal administration group (6 groups) of the compound (A) (ONO-1301) drug substance It has a prolonged effect, and it has a lower total dose of 1/110 to 1/33 compared to the twice-daily repeated oral administration group (group 2) of the compound (A) (ONO-1301) drug substance Regardless of the slightly lower survival rate, it was suggested that intratracheal administration of formulation 25 shows a lung disease site-specific DDS effect.
- preparation 25 was used by suspension dilution with saline.
- the control compound (A) (ONO-1301) was dissolved in an equal volume of aqueous NaOH, and diluted with saline and used.
- the compound (A) (ONO-1301) oral administration group was suspended in 0.5% CMC-Na aqueous solution.
- test substance was administered for 8 weeks using a male, age at the start of administration; 20 weeks of age; (Japan SLC), and a comparative study was conducted for spontaneous onset dilated cardiomyopathy (J2N-k) hamster.
- Echocardiography The animals arrived at 18 weeks of age were given a two-week quarantine and acclimation period, and at the age of 20 weeks, examination at the time of grouping (testing start date) was performed. Then, examinations were performed at 4 weeks and 8 weeks from the study start date, and dissection was performed at 8 weeks.
- left ventricular wall thickness and area in short-axis section of isolated heart At heart extraction, including left and right ventricles, divided into Apical part, Midole part and Basal part at intervals of about 2 mm in short axis direction . Among them, one section of the Midle section was photographed, and the wall thickness and left ventricular area of the Anterior, Lateral, Posterior, and Septum sections were determined using image editing software. For the wall thickness of the left ventricle, use image editing software to obtain the number of pixels on a scale of 1 mm 2 on the photograph, trace the outer diameter and the inner diameter of the entire left ventricular wall, and obtain the respective pixel numbers. After determining the outer pixel number-inner pixel number) / 1 mm 2 ), the wall thickness of each part was measured.
- the measurement method is described in FIG. After dividing the Apical, Middle, Basal region into 3 sections at intervals of about 2 mm, the wall thickness and left ventricular area of the Anterior, Lateral, Posterior, Septum sections were determined for one section on the Middle side. Determine the wall thickness of the left ventricle, using image editing software, determine the number of pixels on a scale of 1 mm 2 on the photograph, trace the outer diameter and the inner diameter across the entire left ventricular wall, obtain the respective pixel numbers, After determining (the number of outer pixels and the number of inner pixels) / 1 mm 2 ), the wall thickness of each portion was measured.
- Echocardiography was performed at 4 and 8 weeks after the start of treatment. Each measurement was performed 3 times, and the average value of the measurement data was taken as the measurement result.
- the EF% values at 4 weeks and 8 weeks were 42.5 ⁇ 3.2%, 33.6 ⁇ 12.3% and 31.5 ⁇ 3.5%, respectively.
- a significant decrease of p ⁇ 0.05 was observed in the 8% EF% value compared to the EF% value in groups.
- the values at grouping, 4 weeks and 8 weeks are 17.8 ⁇ 1.4%, 13.3 ⁇ 6.1% and 12.6 ⁇ 1.6%, respectively, and the EF of 8 weeks is the same as the EF% value.
- a significant decrease (p ⁇ 0.01) was observed in% value compared to% FS value in groups.
- Compound (A) (ONO-1301): The repeated oral administration group (4 groups) at 3.0 mg / kg ⁇ 2 times / day is 43.0 ⁇ 7.8% for the EF% value at 4 weeks and 4 weeks at the time of grouping, respectively , 40.4 ⁇ 14.9% and 40.3 ⁇ 9.2%, and there was no significant decrease in cardiac function in the 4th and 8th week figures compared to the time of grouping.
- the EF% value at 8 weeks was higher than that of the Control group, and a significant difference (p ⁇ 0.05) was observed.
- in% FS values the values at grouping, 4 weeks and 8 weeks showed 18.2 ⁇ 3.9%, 17.2 ⁇ 7.2% and 17.1 ⁇ 4.5%, respectively, and showed the same result as EF% value .
- Compound (A) (ONO-1301): The 3.0 mg / kg intravenous administration group (3 groups) had an EF% value of 38.8 ⁇ 4.3% and 35.7 ⁇ at week 4, week 8 and week 8, respectively. It was 7.4% and 30.8 ⁇ 2.9%. The results showed that the decrease in the 4th week was slow compared to the Control group, but the result in the 8th week was similar to that of the Control group. The 8% EF% value was significantly lower (p ⁇ 0.01) compared to the value at the time of grouping. The% FS values were 16.0 ⁇ 2.1%, 16.1 ⁇ 3.1% and 12.3 ⁇ 1.3% at the 4th and 8th weeks, respectively. Since this result showed almost the same result as the EF% value, its effectiveness could not be confirmed.
- the cardiac function improvement effect of preparation 25 was examined using a spontaneous onset dilated cardiomyopathy (J2N-k) hamster. After the onset of the pathological condition, the test substance was administered starting from 20 weeks of age when marked decrease in cardiac function appears until the 28th week, and cardiac function changes were examined.
- J2N-k spontaneous onset dilated cardiomyopathy
- the control group (1 group) and the compound (A) (ONO-1301) compared with the 3.0 mg / kg intravenous administration group (3 group)
- preparation 25 (ONO-1301 Lipo) was intravenously injected at 3 mg / kg ⁇ 4, and the total dose was 12 mg / kg in total, and showed equal efficacy.
- preparation 25 (ONO-1301 Lipo)
- intermittent administration at 3 mg / kg showed no effect. Therefore, once every two weeks of preparation 25 (ONO-1301Lipo), intermittent intravenous administration was equivalent to Compound (A) (ONO-1301) repeated oral administration with 1/28 administration.
- Tables 26 and 27 show weight change at grouping and dissection, and heart and lung weights at dissection. There was no change in any of these.
- a tracheal cannula (outside diameter 2.0 mm cut-down catheter; manufactured by JMS) is intubated and indwelled, and an artificial respirator (for small animals; Shinano Seisakusho) is connected. Stroke volume 1 mL / 100 g / Stroke ( ⁇ 1 mL), Stroke number The respiration was maintained at 70 times / min ( ⁇ 10 times). After that, the left chest was fixed upward to the dorsal thorax and fixed in a recumbent position, and the epidermis and muscle layer between the third and fourth or fourth and fifth toes were dissected with a surgical sharp blade.
- LAD anterior descending branch
- Echocardiography echocardiography was performed with the purpose of confirming the improvement effect of cardiac function in the test substance using the left ventricular ejection fraction (hereinafter referred to as EF%) as an index.
- the examination is performed 23 hours after the model preparation (examination for grouping), and the animals whose EF% value is reduced by 25% or more of the normal animals are selected and grouped, and the test substance administration solution is the model preparing The tail vein was administered 24 hours later. Echocardiography was performed 7 and 14 days after administration of the test substance.
- Dissection and Treatment of Excised Tissue Dissection was performed after completion of echocardiography on the 14th day after administration of the test substance.
- the EF% value before test substance administration in each group relative to the EF% value in normal animals showed a significant (p ⁇ 0.01) decrease in all groups, and no significant difference was found among the groups.
- the% FS value is clinically said to be normal more than 28%, and although it is mild in all groups, it was lower than that.
- The% FS value before test substance administration in each group relative to the EF% value in normal animals showed a significant (p ⁇ 0.01) decrease in all groups, and no significant difference was found among the groups.
- Infarct area evaluation method The sections were divided into two at intervals of about 2 mm, except for the Apical part, and the infarct area was determined for the two sections, the Apical side and the Basals side. The infarct area was evaluated by the ratio of the infarct area to the entire left ventricular area and the ratio of the length of the normal area to the infarct area to the left outdoor diameter.
- the infarct area evaluation method is shown in FIG.
- the sections were divided into two at intervals of about 2 mm except for the Apical part, and the infarct area was determined for the two sections on the Apical side and the Basal side.
- the infarct area evaluation was evaluated by the ratio of the infarct wall area to the entire left ventricular wall area and the ratio of the length of the normal area to the infarct area to the left outdoor diameter.
- Preparation 25 exhibited a reduction in infarct area and was exerting an effect.
- no effect was shown at 3 mg / kg of the compound (A) (ONO-1301), suggesting that the formulation 25 exhibits a DDS effect.
- Preparation 25 (ONO-1301Lipo) Single intravenous administration suppressed the pathogenesis of rat cardiac ischemia model in a dose-correlated manner, and the preparation 25; 3 mg / kg showed improvement effect compared to Pre.
- single intravenous administration of 3 mg / kg of Compound (A) (ONO-1301) drug substance showed the same inhibitory effect as 1 mg / kg of Preparation 25, but no inhibitory effect on infarct area was observed .
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Abstract
臨床上使用可能な安全で利便性の良い疾患部位特異的治療用医薬組成物を提供する。 プロスタグランジンI2受容体作動薬を封入するステルス型リポソームを含有する疾患部位特異的治療用医薬組成物。
Description
本発明は、疾患部位特異的リポソーム製剤に関する。
化合物(A)(ONO-1301)は、PGI2受容体(IP)作動作用とトロンボキサン(TX)A2合成酵素阻害活性を合わせ持つ低分子化合物である。化合物(A)は、PGI2作動活性を有することから、血栓症、動脈硬化、虚血性心疾患、胃潰瘍、高血圧等の予防および/または治療に有用であることが知られている(特許文献1)。
一方、ONO-1301を含む、プロスタグランジン(PG)I2受容体(IP)作動薬、同 EP2作動薬、及び同 EP4作動薬は、例えば、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、ストローマー細胞由来因子(SDF-1)、及び high mobility group box protein1(HMGB1)等の多くの体内再生因子を誘導することにより、低用量にて多くの疾患に対して、内因性修復因子産生促進剤として使用でき、再生療法として有用であること(特許文献2)が知られている。
一方、ONO-1301を含む、プロスタグランジン(PG)I2受容体(IP)作動薬、同 EP2作動薬、及び同 EP4作動薬は、例えば、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、ストローマー細胞由来因子(SDF-1)、及び high mobility group box protein1(HMGB1)等の多くの体内再生因子を誘導することにより、低用量にて多くの疾患に対して、内因性修復因子産生促進剤として使用でき、再生療法として有用であること(特許文献2)が知られている。
しかし、化合物(A)を経口投与した場合には下痢等、及び静脈内投与した場合には、血管拡張作用から降圧作用等の副作用が懸念されることから、消化管中での高濃度暴露、または急激な血中濃度上昇を防ぎ、患者の負担が少なく、薬効を最大限に発揮できる投与剤形とすることが切望されている。長期徐放性注射剤の開発には、水に難溶性のポリマーを用いた薬物の平均粒子径30μm程度のマイクロスフェア(以下、MSと略記する場合がある)による放出制御法が多く検討されている。使用されるポリマーとしては、薬物放出後、基剤が投与部位に残存しないように生体分解性高分子が使用されており、特に手術縫合糸、および骨固定ボルト等に使用実績のあるポリ乳酸重合体(以下、PLAと略記する場合がある。)あるいは乳酸/グリコール酸共重合体(以下、PLGAと略記する場合がある。)等が使用されている。これらは、LH-RH誘導体のリュープリン注射剤(販売会社;武田薬品)や持続性ソマトスタチン誘導体のサンドスタチンLAR(販売会社;ノバルティス)等に使用されている。
マイクロスフェアに使用されている薬物としては、生理活性ペプチド、各種ホルモン、成長因子、抗体、遺伝子および各種細胞増殖・分化誘導因子類等のペプチド、蛋白質や核酸等であり、低分子化合物としては、化合物(A)(特許文献3)、及び化合物(B)及び化合物(C)(特許文献4)が知られている。
これらは、例えば、MS剤の筋注投与、皮下注投与、及び各種臓器への貼付投与等にて、疾患部位での持続的な組織濃度維持型の投与剤形、または点滴静脈様の持続的な血中濃度維持型の投与剤形等が挙げられる。
これらは、疾患部位投与においては、投与部位近傍での薬物の高濃度維持、及び点滴静注様の血中動態を示す投与製剤であり、疾患部位への薬剤集積性あるDDS(ドラッグデリバリーシステム)効果は示さない。即ち、DDSとは、医薬品類を必要な場所に、必要な時間、必要な量を送達する技術である。
これらは、疾患部位投与においては、投与部位近傍での薬物の高濃度維持、及び点滴静注様の血中動態を示す投与製剤であり、疾患部位への薬剤集積性あるDDS(ドラッグデリバリーシステム)効果は示さない。即ち、DDSとは、医薬品類を必要な場所に、必要な時間、必要な量を送達する技術である。
一方、MS製剤を少量静注投与することにより、肺臓にMS製剤を集積させ、肺臓にて徐々に薬剤を放出することにより肺臓内での薬剤濃度の高濃度維持を目的とした肺疾患部位特異的治療剤(特許文献4)が知られている。一方、本法は、大量投与による肺塞栓症の発症が危惧され、安全性に問題がある。
これらの問題点を改善し、疾患部位特異的にDDS効果を発揮するための方法として、化合物(A)等のPGI2受容体作動薬等を含有するナノスフェアー製剤(以下、NSと略記する場合がある)を作製することが検討されている。NS製剤は、多くの製造方法が知られており、NS製剤は静注投与により、炎症部位、虚血部位や癌組織での血管透過性亢進作用を利用した疾患部位特異的薬剤集積性を利用したDDS製剤であることが知られている。しかしながら、化合物(A)を含む、PGI2受容体作動薬を用いた臨床使用可能なNS製剤の製造は、製剤の安定性、含有率、収率、安全性、徐放速度、有効性等から困難であった。また、化合物(A)のNS製剤として疾患部位に集積し、効果を発揮する製剤作製は非常に困難であった。
NS製剤の製造方法には、ブレイクダウン法とビルトアップ法とに大別される。前者は、スプレードライ等の方法で粒子を粉砕してそのサイズをサブミクロン化する方法である。また、後者には、乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)や乳酸重合体(PLA)等を用いた高分子カプセル製剤、ポリエチレングリコール(PEG)とポリアミノ酸を結合させたブロックコポリマー(共重合体)を用いた二層構造を有するミセル化ナノ粒子(高分子ミセル)を用いた薬剤内包ミセル製剤、ゼラチンやコラーゲンあるいはヒアルロン酸、アルギン酸などの高分子混合物を架橋することによりハイドロゲルを作製し、細胞成長因子等をハイドロゲル内に固定化するハイドロゲル製剤、又は各種リン脂質に内包したリポソーム製剤などが知られている。
微粒子のサイズが数nm以下と小さい場合、腎臓から尿中に排泄され体内に滞留させることが出来ない。一方、微粒子のサイズが400nm以上になると免疫機構が働き、マクロファージなどによる異物排除により体内から素早く排除される。それゆえに薬物を含有するNS製剤としては数nmから400nmのNS製剤にはEPR効果(Enhanced Permeation and Retention Effect)が提唱されている。即ち、正常な血管内皮細胞とは異なり、がん組織や炎症・虚血部位の血管内皮細胞間には200nm程度の広い隙間が開口しており、100nm程度にサイズが制御された微粒子製剤や高分子製剤をがん、感染症、虚血、炎症、動脈硬化、リウマチ等による血管病変部位組織に集積させることが可能なことが知られている。よって、DDS効果を示すNS製剤としては、50nmから200nmのサイズとし、薬物を病変部に到達させ、そこで薬剤をリリースして治療効果を高める手法が知られている。また、NS製剤は、エンドサイトーシス効果として、細胞膜を通過し、細胞内にて効力を発揮することが知られている。例えば、 カルシトニンの乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)ナノスフェア経口投与製剤(非特許文献1)、 カルシトニンのキトサンナノスフェア経肺投与製剤(非特許文献2)、ステロイドの局所投与型PLGA ナノスフェア製剤(非特許文献3)、及び抗炎症剤やミトコンドリア傷害阻害剤等を乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)に封入されたナノスフェアーを作製し、虚血性再灌流障害の治療に有効であることが知られている(特許文献5)。また、プロスタグランジンE1及びその誘導体を乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)に内包したナノスフェアー製剤も知られている(特許文献6、非特許文献4)。また、ベラプロストの乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)に封入されたナノスフェアーが肺高血圧症に有効であることが知られている(特許文献7)。
これらのPLGA、又はPLAのナノ製剤は、乳酸―グリコール酸結合の水にによる加水分解により内包されている薬剤がリリースするため、表面積の大きいナノ製剤は薬剤放出時間が非常に短い。一方、リポソーム製剤は、生体内リパーゼ等による酵素分解により徐々に薬剤が放出される。
FK506、FTY720、シクロスポリンA等の免疫抑制剤封入リポソームを有効成分として含有する医薬組成物は、心筋梗塞、心筋炎、血管炎症候群等の循環器系炎症性疾患の治療に有効であることも知られている(特許文献8)。また、ドキソルビシン(抗がん性抗生物質)をリポソームにしたドキシル(ヤンセンファーマ)は制癌剤としてすでに市販されている。その他、抗真菌剤、カポジ肉腫、リンパ腫性髄膜炎、加齢黄班変性、術後疼痛抑制剤としても市販されている。また、卵黄レシチン、オレイン酸、オリーブ油、グリセリンを用いたプロスタグランジンE1のo/wエマルションであるリピッドマイクロスフェアに封入したリポPGE1はすでに市販(リプル 販売会社:田辺三菱製薬)されている(非特許文献4)が、平均粒子径が200~300nmと大きく、ステルス性を有しないため、肝臓、マクロファージにトラップされ、その血中持続時間は少ない。
一方、プロスタグランジンI2受容体作動薬に関する平均粒子径50~200nmであるステルス型リポソーム製剤の報告はない。
Y. Kawashima, H. Yamamoto, H. Takeuchi and Y. Kuno, Pharm. Develop. Technol., 5,77-85, (2000)
Y. Kawashima, 6th US-Japan Symposium on Drug Delivery Systems, December 16-21,(2001), Maui
E. Horisawa et al., Pharm. Res., 19, 132-139, (2002)
J Pharm Pharmacol. 2013 Aug;65(8):1187-94
本発明は、虚血性及び拡張型心筋症、閉塞性動脈硬化症、血管炎症候群、弁膜症、大動脈弁狭窄症、慢性心不全、拡張不全等の循環器系疾患、肺高血圧症、肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患等の呼吸器系疾患、慢性腎臓病、慢性肝炎、慢性膵炎等の消化器・泌尿器系疾患、及び脳梗塞慢性期、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症等の神経変性疾患等の治療に有効な疾患部位特異的ステルス性リポソーム医薬品組成物を提供することを課題とする。
より具体的には、本発明の課題は、PGI2受容体作動薬である化合物(A)等のリポソーム(LP)製剤を作製することにより、間歇的に静注投与、又は吸入投与等をすることにより疾患部位特異的に本剤が集積し、DDS効果を発揮することが可能であり、臨床上使用可能な安全で利便性の良いステルス性リポソーム製剤を提供することにある。
本発明者らは、PGI2受容体(IP)作動薬を封入するNS製剤製造に関して種々検討した結果、ステルス型リポソーム(以下、LPと略記する場合がある)製剤が目的を達成する最適製剤であることを見出し、多くの製造法検討から、化合物(A)等を含有するLP製剤の中で、安定性、含有率、収率、安全性、有効性、放出性、ステルス性等から臨床使用可能なLP製剤を見出した。即ち、PEG修飾ホスホエタノールアミンおよびリン脂質等で被覆した微粒子薬物キャリアーであるリポソーム製剤は、薬物の放出制御や安定性を向上させるだけでなく、疾患部位集積性(ターゲッティング)や、組織付着性などの新機能を発現し、薬物の生物学的利用能(BA)や薬効が著しく向上することにより、各々単独より低用量における作用が増強すると共に、副作用を低減することが出来ることを見出した。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、化合物(A)等を含むPGI2受容体作動薬を含有するリポソーム製剤において、リン脂質の成分、ステルス性を有するPEG修飾ホスホエタノールアミン等の脂質の種類とその組成比、リポソーム製剤の平均粒子径、化合物(A)等とリン脂質との重量比等を適宜組み合わせることにより、驚くべきことに、低分子化合物である化合物(A)等のPGI2受容体作動薬の放出速度の調節が可能となり、疾患部位への集積性が向上することにより、DDS効果を示すことを初めて見出した。
さらに、本発明者らは特定の脂質の組み合わせにより、リポソーム製剤のステルス性を保有させることができ、それによりマクロファージ等への捕獲を逃れさせることができることを見出した。また、本発明の方法によれば、安定で収率よくステルス性リポソーム製剤を作製できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づきさらなる試行錯誤を経て完成されたものであり、以下の各発明を包含する。
[項1]
プロスタグランジンI2受容体作動薬を封入するステルス型リポソームを含有する疾患部位特異的治療用医薬組成物。
[項2]
前記プロスタグランジンI2受容体作動薬として、下記一般式(I)の化合物またはその塩を少なくとも含む、項1に記載の医薬組成物
[項1]
プロスタグランジンI2受容体作動薬を封入するステルス型リポソームを含有する疾患部位特異的治療用医薬組成物。
[項2]
前記プロスタグランジンI2受容体作動薬として、下記一般式(I)の化合物またはその塩を少なくとも含む、項1に記載の医薬組成物
(式中、
R1は、水素原子またはC1~4アルキル基を表わし、
R2は、(i)水素原子、(ii)C1~8アルキル基、(iii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iv)窒素原子1個を含む4~7員単環、(v)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(vi)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
R3は、(i)C1~8アルキル基、(ii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iii)窒素原子1個を含む4~7員単環、(iv)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(v)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
eは、3~5の整数を表わし、
fは、1~3の整数を表わし、
pは、1~4の整数を表わし、
qは、1または2を表わし、
rは、1~3の整数を表わす
(ただし、
R1は、水素原子またはC1~4アルキル基を表わし、
R2は、(i)水素原子、(ii)C1~8アルキル基、(iii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iv)窒素原子1個を含む4~7員単環、(v)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(vi)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
R3は、(i)C1~8アルキル基、(ii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iii)窒素原子1個を含む4~7員単環、(iv)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(v)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
eは、3~5の整数を表わし、
fは、1~3の整数を表わし、
pは、1~4の整数を表わし、
qは、1または2を表わし、
rは、1~3の整数を表わす
(ただし、
が前記(iii)または前記(iv)で示される基である場合には、
-(CH2)p-および=CH-(CH2)s-は、環上のaまたはbの位置に結合し、かつ
R2およびR3中の環構造は、1~3個のC1~4アルキル基、C1~4アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基またはトリハロメチル基で置換されていてもよい)。
[項3]
前記プロスタグランジンI2受容体作動薬として、以下の化合物(A)またはその塩を少なくとも含む、項1記載の医薬組成物:
(A)下記式(II)
-(CH2)p-および=CH-(CH2)s-は、環上のaまたはbの位置に結合し、かつ
R2およびR3中の環構造は、1~3個のC1~4アルキル基、C1~4アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基またはトリハロメチル基で置換されていてもよい)。
[項3]
前記プロスタグランジンI2受容体作動薬として、以下の化合物(A)またはその塩を少なくとも含む、項1記載の医薬組成物:
(A)下記式(II)
で示される({5-[2-({[(1E)-フェニル(ピリジン-3-イル)メチレン]アミノ}オキシ)エチル]-7,8-ジヒドロナフタレン-1-イル}オキシ)酢酸(ONO-1301)。
[項4]
プロスタグランジンI2受容体作動薬として、以下の化合物(B)~化合物(E)のいずれか一種またはその塩を少なくとも含む、項1記載の医薬組成物:
(B)(±)-(1R,2R,3aS,8bS)-2,3,3a,8b-テトラヒドロ-2-ヒドロキシ-1-[(E)-(3S,4RS)-3-ヒドロキシ-4-メチル-1-オクテン-6-イニル]-1H-シクロペンタ[b]ベンゾフラン-5-ブタン酸ナトリウム塩(ベラプロスト)、又はその誘導体であるカルバサイクリン系PGI2誘導体、
(C)MRE-269、
(D)(2E)‐7‐{(1R,2R,3R)‐3‐ハイドロキシ‐2‐[(1E ,3S ,5S)‐3‐ハイドロキシ‐5‐メチルノン‐1‐エン‐1‐イル]‐5‐オキシシクロペンチル}ヘプト‐2‐エノイック酸(リマプロスト)、オルノプロスチル、エンプロスチル若しくはミソプロストール、又はそれらの誘導体であるPGE誘導体、及び
(E)NS-304(セレキシパグ)。
[項5]
プロスタグランジンI2受容体作動薬として、ONO-1301、ベラプロスト、リマプロスト及びNS-304からなる群より選択される少なくとも一種を少なくとも含む、項1記載の医薬組成物。
[項6]
前記ステルス型リポソームが、プロスタグランジンI2受容体作動薬とリン脂質とを少なくも用いて、バンガム法、水和分散法、逆相蒸発法、エタノール注入法若しくはエタノール希釈法、ホモジナイゼイション法若しくはメカノケミカル法、直接分散法、エクストルーダー法若しくはフレンチプレス法、リモートローディング法、脱水―再水和法、凍結融解法、超音波法、脂質―化合物フィルム法、又はこれらの改良法により得られうる、項1~5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項7]
前記ステルス型リポソームが、
平均粒子径50~200nmであり、かつ
プロスタグランジンI2受容体作動薬1重量部に対して、5~50重量部のリン脂質及び0.05~5重量部のPEG修飾ホスホエタノールアミンを含有する、
項1~6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項8]
前記ステルス型リポソームが、
プロスタグランジンI2受容体作動薬1重量部に対して、MPEG2000-DSPEを0.05~5重量部含有し、かつ
プロスタグランジンI2受容体作動薬としてONO-1301、ベラプロスト、リマプロスト及びNS-304からなる群より選択される少なくとも一種を含有し、かつ
3時間~4週間にわたって前記プロスタグランジンI2受容体作動薬を放出する、
項1~7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項9]
前記ステルス型リポソームが、
プロスタグランジンI2受容体作動薬と、
リン脂質と、
PEG修飾ホスホエタノールアミンと、
水混和性有機溶媒と
を含み、かつ
ステロール類を含まず、下記工程(1)~(8)を含む製造方法により得られうるものであり、
(1)プロスタグランジンI2受容体作動薬1mg当たり、リン脂質が5mg以上、かつPEG修飾ホスホエタノールアミンが0.05mg以上となるようにこれらを溶媒に混合する工程、
(2)工程(1)で得られた混合物を加熱し、溶解物を調製する工程、
(3)工程(2)で得られた溶解物を瞬時に凍結する工程、
(4)工程(3)で得られた凍結物を凍結乾燥し溶媒を除去する工程、
(5)工程(4)で得られた凍結乾燥物を加温してリン酸緩衝水溶液に分散する工程、
(6)工程(5)で得られた分散物をエクストルーダーによりサイジングする工程、
(7)工程(6)で得られた分散物を限外濾過することにより未封入物を除去する工程、(8)工程(7)で得られた分散物に糖類を加えて凍結乾燥する工程、かつ
リポソーム内にリン脂質1.0mgあたり0.001mg以上のプロスタグランジンI2受容体作動薬を含み、
平均粒子径が50~200nmである、
項1~8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項10]
静脈内投与用、冠動脈内投与用、吸入用、筋注投与用、皮下投与用、経口投与用、経粘膜投与用及び経皮投与用または臓器用の注射用製剤、経口剤、吸入剤、ネブライザー、軟膏剤、貼付剤またはスプレー剤である、項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項11]
1回あたりの静脈内投与量がプロスタグランジンI2受容体作動薬として、0.001~100mgである、項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項12]
治療対象疾患が、リポソームを含有してなる循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、消化器系疾患、骨疾患、神経変性疾患、血管系疾患、歯科疾患、眼疾患、皮膚疾患等の炎症性疾患、虚血性臓器障害、糖尿病性合併症、組織線維性疾患、組織変性疾患又は脱毛である、項11に記載の医薬組成物。
[項13]
治療対象疾患が、リポソームを含有してなる虚血性及び拡張型心筋症、閉塞性動脈硬化症、血管炎症候群、弁膜症、大動脈弁狭窄症、慢性心不全、拡張不全等の循環器系疾患、肺高血圧症、肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患等の呼吸器系肺疾患、慢性腎臓病、慢性肝炎、慢性膵炎等の消化器系・泌尿器系疾患、及び脳梗塞慢性期、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症等の神経変性疾患である、項11に記載の医薬組成物。
[項4]
プロスタグランジンI2受容体作動薬として、以下の化合物(B)~化合物(E)のいずれか一種またはその塩を少なくとも含む、項1記載の医薬組成物:
(B)(±)-(1R,2R,3aS,8bS)-2,3,3a,8b-テトラヒドロ-2-ヒドロキシ-1-[(E)-(3S,4RS)-3-ヒドロキシ-4-メチル-1-オクテン-6-イニル]-1H-シクロペンタ[b]ベンゾフラン-5-ブタン酸ナトリウム塩(ベラプロスト)、又はその誘導体であるカルバサイクリン系PGI2誘導体、
(C)MRE-269、
(D)(2E)‐7‐{(1R,2R,3R)‐3‐ハイドロキシ‐2‐[(1E ,3S ,5S)‐3‐ハイドロキシ‐5‐メチルノン‐1‐エン‐1‐イル]‐5‐オキシシクロペンチル}ヘプト‐2‐エノイック酸(リマプロスト)、オルノプロスチル、エンプロスチル若しくはミソプロストール、又はそれらの誘導体であるPGE誘導体、及び
(E)NS-304(セレキシパグ)。
[項5]
プロスタグランジンI2受容体作動薬として、ONO-1301、ベラプロスト、リマプロスト及びNS-304からなる群より選択される少なくとも一種を少なくとも含む、項1記載の医薬組成物。
[項6]
前記ステルス型リポソームが、プロスタグランジンI2受容体作動薬とリン脂質とを少なくも用いて、バンガム法、水和分散法、逆相蒸発法、エタノール注入法若しくはエタノール希釈法、ホモジナイゼイション法若しくはメカノケミカル法、直接分散法、エクストルーダー法若しくはフレンチプレス法、リモートローディング法、脱水―再水和法、凍結融解法、超音波法、脂質―化合物フィルム法、又はこれらの改良法により得られうる、項1~5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項7]
前記ステルス型リポソームが、
平均粒子径50~200nmであり、かつ
プロスタグランジンI2受容体作動薬1重量部に対して、5~50重量部のリン脂質及び0.05~5重量部のPEG修飾ホスホエタノールアミンを含有する、
項1~6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項8]
前記ステルス型リポソームが、
プロスタグランジンI2受容体作動薬1重量部に対して、MPEG2000-DSPEを0.05~5重量部含有し、かつ
プロスタグランジンI2受容体作動薬としてONO-1301、ベラプロスト、リマプロスト及びNS-304からなる群より選択される少なくとも一種を含有し、かつ
3時間~4週間にわたって前記プロスタグランジンI2受容体作動薬を放出する、
項1~7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項9]
前記ステルス型リポソームが、
プロスタグランジンI2受容体作動薬と、
リン脂質と、
PEG修飾ホスホエタノールアミンと、
水混和性有機溶媒と
を含み、かつ
ステロール類を含まず、下記工程(1)~(8)を含む製造方法により得られうるものであり、
(1)プロスタグランジンI2受容体作動薬1mg当たり、リン脂質が5mg以上、かつPEG修飾ホスホエタノールアミンが0.05mg以上となるようにこれらを溶媒に混合する工程、
(2)工程(1)で得られた混合物を加熱し、溶解物を調製する工程、
(3)工程(2)で得られた溶解物を瞬時に凍結する工程、
(4)工程(3)で得られた凍結物を凍結乾燥し溶媒を除去する工程、
(5)工程(4)で得られた凍結乾燥物を加温してリン酸緩衝水溶液に分散する工程、
(6)工程(5)で得られた分散物をエクストルーダーによりサイジングする工程、
(7)工程(6)で得られた分散物を限外濾過することにより未封入物を除去する工程、(8)工程(7)で得られた分散物に糖類を加えて凍結乾燥する工程、かつ
リポソーム内にリン脂質1.0mgあたり0.001mg以上のプロスタグランジンI2受容体作動薬を含み、
平均粒子径が50~200nmである、
項1~8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項10]
静脈内投与用、冠動脈内投与用、吸入用、筋注投与用、皮下投与用、経口投与用、経粘膜投与用及び経皮投与用または臓器用の注射用製剤、経口剤、吸入剤、ネブライザー、軟膏剤、貼付剤またはスプレー剤である、項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項11]
1回あたりの静脈内投与量がプロスタグランジンI2受容体作動薬として、0.001~100mgである、項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項12]
治療対象疾患が、リポソームを含有してなる循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、消化器系疾患、骨疾患、神経変性疾患、血管系疾患、歯科疾患、眼疾患、皮膚疾患等の炎症性疾患、虚血性臓器障害、糖尿病性合併症、組織線維性疾患、組織変性疾患又は脱毛である、項11に記載の医薬組成物。
[項13]
治療対象疾患が、リポソームを含有してなる虚血性及び拡張型心筋症、閉塞性動脈硬化症、血管炎症候群、弁膜症、大動脈弁狭窄症、慢性心不全、拡張不全等の循環器系疾患、肺高血圧症、肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患等の呼吸器系肺疾患、慢性腎臓病、慢性肝炎、慢性膵炎等の消化器系・泌尿器系疾患、及び脳梗塞慢性期、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症等の神経変性疾患である、項11に記載の医薬組成物。
本発明によれば、循環器系疾患、呼吸器系疾患、消化器・泌尿器系疾患、及び神経変性疾患等の炎症性疾患、虚血性臓器障害、糖尿病性合併症、組織線維性疾患、組織変性疾患又は脱毛等の治療に有効な医薬組成物を提供することができる。本発明の医薬組成物は、PGI2受容体作動薬単独と比較して低用量における作用が増強すると共に、副作用を低減できるという効果を奏する。また、本発明によれば、PGI2受容体作動薬を疾患部位へ高濃度集積させ、持続的に効果を発揮するステルス性リポソーム製剤、およびその製造方法を提供することができる。
化合物(A)等を含有する本発明のリポソーム製剤は、間歇投与での、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または吸入投与等における循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、消化器系疾患、および神経変性疾患等に有用である。特に、静脈内投与、または吸入投与により、疾患部位に集積することにより、局所にて内因性修復因子産生促進作用を示し、再生創薬として有用である。また、血管拡張作用、血管新生作用、幹細胞分化誘導作用、抗線維化作用、抗アポトーシス作用、リバースリモデリング作用等により、心筋梗塞、狭心症、拡張型心筋症、大動脈弁狭窄症、弁膜症、慢性心不全、拡張不全等の心疾患には、静注投与が有用である。急性肺炎、慢性肺炎、肺高血圧症、肺線維症、間質性肺炎、COPD、およびARDS等の肺疾患等には、静注投与に加えて吸入投与も有用である。また、筋委縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄損傷等の神経変性疾患の場合は、静注投与に加えて髄内投与が有用である。
本発明の医薬組成物に用いられるリポソームは、脂質二重膜により囲まれた閉鎖小胞であればよい。また、大きな一枚膜リポソーム(LUV)でもよく、小さな一枚膜リポソーム(SUV)でもよく、複数の膜からなるリポソーム(MLV)でもよい。リポソームは、公知の製造方法により製造することができる。
リポソームの作製方法には3つの要素がある。即ち、リポソームの調整方法としては、バンガム法が一般的であるが、幾つかの操作を追加することにより、単純水和法、超音波処理法、エクルトルージョン法とも称される方法がある。また、直接分散法、有機溶媒(エタノール等)注入法、逆相蒸発法、カルシウム融合法、界面活性剤除去法、静置水和法、ヘキサンーspan80透析法、有機溶媒小球蒸発法、メカノケミカル法、超音波法、脂質―化合物フィルム法等、及びこれらの改良法もある。
粒子径の調整としては、エクストルージョン法、押し出し法、フレンチプレス法、などがある。例えば、エクストルーダー法又はフレンチプレス法として、エクストルーダーもしくはフレンチプレスにセットした適切な孔径のナノポアーメンブランフィルターに数回通過させることにより、リポソームサイズを調整する方法等がある。
また、化合物内包法としては、pH勾配(リモートローディング)法、対イオン濃度勾配(ゲル化)法、凍結融解法、超臨界二酸化炭素法、フィルムローディング法などがある。
水溶性薬物の内包に優れているのは、逆相蒸発法、凍結融解法がある。脂溶性薬物の内包に優れているのは、バンガム法、メカノケミカル法、超臨界二酸化炭素法、フィルムローディング法がある。また、解離性薬物に優れているのは、pH勾配(リモートローディング)法、対イオン化濃度勾配法等がある。
バンガム法としては、脂質フィルムを作製した後、水系バッファー中で、ボルテックス、超音波等で機械的振動を与えてリポソームを形成させる(水和分散)法がある。逆相蒸発法としては、水と混和しない有機溶媒に脂質を溶解し、その後水系バッファーを加え超音波処理し逆ミセル(W/Oエマルジョン)を形成させる。その後減圧処理等で有機溶媒を除去し、ゲル状態の後リポソームが形成される方法である。エタノール注入法又はエタノール希釈法としては、脂質をエタノールに溶解し、水系バッファーに脂質溶液を注入することでリポソームを形成させる方法である。
ホモジナイゼイション法又はメカノケミカル法として、高圧乳化器によってリポソームを形成させる方法もある。
また、直接分散法は、脂質フィルムの作製無しに、脂質もしくは脂質と化合物の混在物を直接水系バッファーに分散させ、リポソームを形成する方法等がある。
粒子径調製法としては、エクストルーダー法又はフレンチプレス法として、エクストルーダーもしくはフレンチプレスにセットしたナノポアーを通過させることにより、リポソームサイズを調整する方法等がある。
化合物内包法としては、リモートローディング法は、化合物のpH溶解性の違いを利用した内包方法である。すなわち化合物が水溶性になるpH溶液の内水相をもつリポソームを形成させ、その後外水相を限外濾過や透析等にて化合物が脂溶性になるpH溶液に置き換える。そのリポソーム分散液に化合物溶液を加えると化合物がリポソーム内水相に封入される方法である。脱水―再水和法は、凍結乾燥等により、リポソームを脱水し、その後内包化する化合物を含む水系バッファーで再水和することによる内包化法である。
また、凍結融解法は、リポソーム分散液と内包したい化合物溶液の混和し凍結―融解を繰り返すことにより、高濃度に化合物を内包化する方等がある。
リポソームの製造法に関してはこれらの製造方法には限定されず、各々の改良法等も含まれる。
リポソームを構成する脂質は特に限定されないが、例えば、大豆レシチン、水添大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファスフィンゴミエリン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、ステロール類などが挙げられる。脂質は一種類を用いてもよく二種類以上を組み合わせて用いてもよい。ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。ホスファチジルセリン類としては、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンナトリウム、ウシ脳由来のホスファチジルセリンナトリウム等が挙げられる。ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。ホスファチジルイノシトール類としては、小麦由来のホスファチジルイノシトールナトリウム等が挙げられる。ホスファスフィンゴミエリン類としては、ウシ脳由来のスフィンゴミレリン等が挙げられる。ホスファチジン酸類や長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジセチルリン酸等が挙げられる。ガングリオシド類は、ガングリオシドGM1、ガングリオシドGD1a、ガングリオシドGT1b等が挙げられる。糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスファチド、グロボシド等が挙げられる。ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。ステロール類としてはコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール等が挙げられる。二種類以上の脂質を組み合わせて用いる場合、リン脂質と、コレステロールとの組み合わせが好ましい。リン脂質としては、ホスファチジルコリン類が好ましい。リン脂質とコレステロールを用いてリポソームを製造する場合、リン脂質とコレステロールとのモル比は、1:0.1~1.5の範囲内であることが好ましく、1:0.5~1.25の範囲内であることがより好ましい。
例えば、本発明で使用するリン脂質としては、以下のもにがすでに市販(販売会社;日本精化)されている。
内包される検体により異なるが、一般的には、DOPC,又はDEPCが好ましい。
従来のリポソーム製剤は、典型的なリン脂質およびコレステロールからなるリポソームであるが、リポソーム表面をポリエチレングリコール(PEG)などで修飾することにより血中滞留性を上げたステルス型リポソームがある。これらはEPR効果により、疾患部位特異的に集積作用を有している。
リポソームの血中での安定性(ステルス性)を向上させるために、リポソームの膜表面をポリエチレングリコール(PEG)誘導体で修飾することが好ましい。PEG誘導体で修飾されたリポソームは、分子量500~20000のPEGとリン脂質の共有結合体を用いることにより製造することができる。PEGとリン脂質の共有結合体としては、分子量200~5000のPEGとジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの結合体である、PEG修飾ホスホエタノールアミンを用いることが好ましい。
PEG修飾ホスホエタノールアミンとしては、PEG修飾基として、mPEG 350、mPEG550、mPEG750、mPEG1000、mPEG2000、mPEG3000、及びmPEG5000による各々
DMPE(1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)、
DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)、
DSPE(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)、及び
DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)等が市販(日本精化)されている。
DMPE(1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)、
DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)、
DSPE(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)、及び
DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)等が市販(日本精化)されている。
例えば、mPEG2000-DSPE:N-(carbonyl-methoxypolyethyleneglycol 5000)-1,2 distearoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamine, sodium salt CAS No. 147867-65-0 (日本精化)とDEPC:1,2-Dierucoyl-sn-glycerol-3- phosphorylcholine CAS No. 51779-95-4(日本精化)の組み合わせが好ましい。
PEG修飾ホスホエタノールアミンとリン脂質との含量は、特に限定されないが、リン脂質1に対してPEG修飾ホスホエタノールアミンが0.01%から10%であることが好ま
しく、0.01%から3%であることがより好ましい。
しく、0.01%から3%であることがより好ましい。
一方、PEGおよび抗体やペプチドなど標的化分子でリポソーム表面を修飾し、血中滞留性を上げ、さらに標的部位への移行性を高める方法もある。
本発明は、リポソーム内にPGI2受容体作動薬とリン脂質、およびPEG修飾ホスホエタノールアミンを含むことを特徴とするステルス型リポソームを提供する。当該リポソームは、目的に応じて、PGI2受容体作動薬とリン脂質、及びEG修飾ホスホエタノールアミンを組み合わせ、適時の割合にて混合し、リポソーム製剤とすることが好ましい。
例えば、PGI2受容体作動薬とリン脂質、およびPEG修飾ホスホエタノールアミンと水混和性有機溶媒とを含み、PGI2受容体作動薬1mg当たり、リン脂質が5mg以上、PEG修飾ホスホエタノールアミンが0.05mg以上となるように混合物を調製後加熱し、溶解物を調製する工程と、前記溶解物を瞬時に凍結する工程と、凍結後凍結乾燥し溶媒を除去する工程と、凍結乾燥物を加温にてリン酸緩衝水溶液に分散する工程と、エクストルーダーによりサイジングする工程と、限外濾過により未封入物を除去する工程と、糖類を加えて凍結乾燥する工程を含む製造方法により製造される。
本法にて製造されたリポソームは、PGI2受容体作動薬を含み、平均粒子径が50から200nmであることを特徴とするPGI2受容体作動薬封入ステルス型リポソーム製剤である。
PGI2受容体作動薬とリン脂質、およびPEG修飾ホスホエタノールアミンと溶媒を含む混合物には、ステロール類、例えばコレステロールが含まれても良く、含まれなくても良い。従来のリポソームは、構成脂質としてリン脂質とコレステロールを組み合わせて用いることが好ましいとされているが、構成脂質としてコレステロールを併用しないことにより、高濃度にて安定なPGI2受容体作動薬封入リポソームの作製が可能となった。
リポソームの大きさ(粒子径)は特に限定されないが、平均粒子径が約10~1000nmであることが好ましく、平均粒子径が約20~500nmであることがより好ましく、さらに好ましくは、平均粒子径が約50~200nmである。本明細書において「粒子径」は、動的光散乱法によって測定された粒子の直径を意味する。好ましい多分散指数PDI)は、0.3以下である。粒子径を調整する方法は特に限定されない。
本発明は、PGI2受容体作動薬封入リポソームを有効成分として含有する循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、血管疾患、消化器系疾患または神経変性疾患等の予防および/または治療剤を提供する。本発明の医薬組成物に用いられるPGI2受容体作動薬は特に限定されず、公知のPGI2受容体作動薬を好適に用いることができる。公知のPGI2受容体作動薬としては、例えば、一般式(I)
(式中、
R1は、水素原子またはC1~4アルキル基を表わし、
R2は、(i)水素原子、(ii)C1~8アルキル基、(iii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iv)窒素原子1個を含む4~7員単環、(v)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(vi)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
R3は、(i)C1~8アルキル基、(ii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iii)窒素原子1個を含む4~7員単環、(iv)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(v)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
eは、3~5の整数を表わし、
fは、1~3の整数を表わし、
pは、1~4の整数を表わし、
qは、1または2を表わし、
rは、1~3の整数を表わす
(ただし、
R1は、水素原子またはC1~4アルキル基を表わし、
R2は、(i)水素原子、(ii)C1~8アルキル基、(iii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iv)窒素原子1個を含む4~7員単環、(v)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(vi)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
R3は、(i)C1~8アルキル基、(ii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iii)窒素原子1個を含む4~7員単環、(iv)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(v)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
eは、3~5の整数を表わし、
fは、1~3の整数を表わし、
pは、1~4の整数を表わし、
qは、1または2を表わし、
rは、1~3の整数を表わす
(ただし、
が前記(iii)または前記(iv)で示される基である場合には、
-(CH2)p-および=CH-(CH2)s-は、環上のaまたはbの位置に結合し、かつ
R2およびR3中の環構造は、1~3個のC1~4アルキル基、C1~4アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基またはトリハロメチル基で置換されていてもよい)
で示される化合物またはその塩である医薬組成物、PGI2誘導体及びPGE誘導体が挙げられる。
好ましくは、PGI2受容体作動薬が、
(A)下記式(II)
-(CH2)p-および=CH-(CH2)s-は、環上のaまたはbの位置に結合し、かつ
R2およびR3中の環構造は、1~3個のC1~4アルキル基、C1~4アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基またはトリハロメチル基で置換されていてもよい)
で示される化合物またはその塩である医薬組成物、PGI2誘導体及びPGE誘導体が挙げられる。
好ましくは、PGI2受容体作動薬が、
(A)下記式(II)
で示される、({5-[2-({[(1E)-フェニル(ピリジン-3-イル)メチレン]アミノ}オキシ)エチル]-7,8-ジヒドロナフタレン-1-イル}オキシ)酢酸(CAS 176391-41-6;化合物(A)(ONO-1301));
(B)(±)-(1R,2R,3aS,8bS)-2,3,3a,8b-テトラヒドロ-2-ヒドロキシ-1-[(E)-(3S,4RS)-3-ヒドロキシ-4-メチル-1-オクテン-6-イニル]-1H-シクロペンタ[b]ベンゾフラン-5-ブタン酸ナトリウム塩(CAS: 88475-69-8;ベラプロスト)等を含むカルバサイクリン系PGI2誘導体(化合物(B));
(C)[4-(5,6-ジフェニルピラジニル)(1-メチレチル)アミノ]ブトキシ]-酢酸(CAS:475085-57-5;MRE-269;化合物(C));
(D)(2E)-7{-(1R,2R,3R)-3-ハイドロキシ-2[-(1E,3S,5S)-3-ハイドロキシ-5-メチルノン-1-エン-1-イル]-5-オキソシクロペンチル}-へプト-2-エノイック酸(CAS:74397-12-9;リマプロスチル)、オルノプロスチル;17S,20-ジメチル-6-オキソ-PGE1メチルエステル、エンプロスチル、ミソプロストール等を含むPGE誘導体(化合物(D));又は
(E)2-{4-[(5,6-ジフェニルピラジン-2-)イル)(プロパン-2-イル)アミノ] ブトキシ}-N-(メタンスルフォニル)アセトアミド(CAS:475086-01-2;セレキシパグ;NS-304(化合物(E))であるPGI2受容体作動薬が好ましい。
(B)(±)-(1R,2R,3aS,8bS)-2,3,3a,8b-テトラヒドロ-2-ヒドロキシ-1-[(E)-(3S,4RS)-3-ヒドロキシ-4-メチル-1-オクテン-6-イニル]-1H-シクロペンタ[b]ベンゾフラン-5-ブタン酸ナトリウム塩(CAS: 88475-69-8;ベラプロスト)等を含むカルバサイクリン系PGI2誘導体(化合物(B));
(C)[4-(5,6-ジフェニルピラジニル)(1-メチレチル)アミノ]ブトキシ]-酢酸(CAS:475085-57-5;MRE-269;化合物(C));
(D)(2E)-7{-(1R,2R,3R)-3-ハイドロキシ-2[-(1E,3S,5S)-3-ハイドロキシ-5-メチルノン-1-エン-1-イル]-5-オキソシクロペンチル}-へプト-2-エノイック酸(CAS:74397-12-9;リマプロスチル)、オルノプロスチル;17S,20-ジメチル-6-オキソ-PGE1メチルエステル、エンプロスチル、ミソプロストール等を含むPGE誘導体(化合物(D));又は
(E)2-{4-[(5,6-ジフェニルピラジン-2-)イル)(プロパン-2-イル)アミノ] ブトキシ}-N-(メタンスルフォニル)アセトアミド(CAS:475086-01-2;セレキシパグ;NS-304(化合物(E))であるPGI2受容体作動薬が好ましい。
本発明の医薬組成物の投与対象としては、炎症性疾患、虚血性臓器障害、糖尿病性合併症、組織線維性疾患、又は組織変性疾患等を発症している哺乳動物が好適である。哺乳動物としては、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられ、特に炎症性疾患を発症しているまたは発症していることが疑われるヒトが好ましい。
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患部位に有効成分が到達できる方法であれば特に限定されないが、静脈内投与用、点滴・輸液用、冠動脈内投与用、吸入用、筋肉内投与用、皮下投与用、経口投与用、座剤用、腹腔内投与用、経粘膜投与用及び経皮投与用、臓器用の注射用製剤、又は貼付剤、吸入剤、ネブライザー、スプレー剤、ゲル剤、クリ―ム剤、噴霧剤、軟骨剤、点鼻剤、点眼剤等がある。動脈内投与の場合、冠動脈内投与が好ましく、静脈内投与の場合、末梢静脈内投与が好ましい。
注射剤としては、水性注射剤または油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒(注射用水、精製水等)に、薬学的に許容される添加剤を適宜添加した溶液に、本薬剤等封入リポソームを混合した後、フィルター等で濾過等して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。薬学的に許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤;リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤;パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤;ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤;亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤;塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のpH調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール;プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール;ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油50、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等のタンパク質;アミノデキストラン等のポリサッカリド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油または大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルまたはバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存、凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え再溶解して使用される。
本発明の医薬組成物に含まれる本薬剤等の量は、剤形、投与間隔、または投与経路によって異なるが、静脈投与用の注射剤の場合、0.001ng/mL~100mg/mLの範囲から適宜選択することができる。投与期間と投与方法は、疾患とその治療法により、安全性、利便性、低侵襲性、患者負担、コンプライアンス等を考慮して適宜決定される。効果が期待でき、利便性の良い投与間隔であればいずれでも良いが、1日2回、毎日、2日に1回、3日に1回、週1回、2週に1回、3週に1回、又は4週に1回程度が好ましいが、1日に1回から週に1回の範囲がより好ましい。
例えば、本発明の医薬組成物として、化合物(A)封入リポソームを、心臓疾患発症しているヒトに静脈内投与する場合、1回あたりの投与量はONO-1301として500mg以下が好ましく、100mg以下がより好ましい。下限は特に限定されず目的の効果が得られる投与量であればよい。
本発明の医薬組成物は、PGI2受容体作動薬封入リポソームを有効成分とすることにより、フリーのPGI2受容体作動薬投与は、大量投与では血管拡張作用のため、降圧作用を示すため、有効量との乖離が少なかったが、リポソーム製剤では、DDS効果により疾患部位集積性のため、低用量でも多くの疾患で効果を示すことができる点で有用である。すなわち、病変部における血管透過性亢進が生じ、ナノサイズのリポソームが特異的に病変部に集積(EPR効果)が期待できる。また、エンドサイトーシス効果により細胞内に薬剤が移動するために、薬効の増大ならびに副作用の軽減が期待できる点で非常に有用である。また、本発明の医薬組成物は、末梢静脈等からの投与で標的である病変部へ有効成分を送達でき、中心静脈カテーテル等を必要としない点で有用である。また、末梢静脈から投与しても標的以外の部位へ送達され難い点でも有利である。すなわち、本発明の医薬組成物は、低用量における組織修復作用を増強できると共に、低用量化、標的部位以外への送達抑制、中心静脈カテーテル不要等により副作用を低減できる点で非常に有用である。
直接分散改良法にてリポソーム製剤を作製する場合、脂質のプレミックスを作製する時には、脂質と検体を溶解する溶媒であること、瞬時に凍結出来ること、及び凍結乾燥にて除去できることが条件となり、本条件を満たす場合にはいずれの溶媒でも良い。
一般的には、t-ブタノール、シクロヘキサン+エタノール、ヘキサフルオロプロパノール、1-プロパノール、イソプロピルアルコール、2-ブトキシエタノール等が良いが、t-ブタノールを用いることが好ましい。
一般的には、t-ブタノール、シクロヘキサン+エタノール、ヘキサフルオロプロパノール、1-プロパノール、イソプロピルアルコール、2-ブトキシエタノール等が良いが、t-ブタノールを用いることが好ましい。
リポソームの凍結乾燥には、一般的には、マルトース、スクロース、又はトレハロール等の糖類を加え分散することにより、凍結時の細胞膜崩壊を抑制して、凍結乾燥を行う必要がある。
[医薬品への適用]
化合物(A)等のPGI2受容体作動薬は、体内再生因子産生促進作用、幹細胞分化誘導作用、抗アポトーシス作用、リバースリモデリング作用、抗線維化作用および血管新生促進作用等を有しているため、PGI2受容体作動薬を含有するステルス性リポソーム製剤は、各種臓器障害、炎症性疾患(例えば、血管疾患(例えば、閉塞性動脈硬化症(ASO)、バージャー病、レイノー病、動脈硬化、血管炎症候群等)、循環器系疾患(例えば、心筋梗塞、心筋炎、狭心症、上室性頻脈性不整脈、うっ血性心不全、冠動脈疾患、特発性心筋症、拡張型心筋症、虚血性心筋症、心房細動、慢性心不全、拡張不全、収縮不全、弁膜症、大動脈弁狭窄症等)、神経変性疾患(例えば、虚血性脳障害、脳血管障害、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、脊柱管狭窄症、認知症、モヤモヤ病、脊髄損傷、筋委縮性側索硬化症(ALS)等)、呼吸器系疾患(例えば、急性肺炎、肺線維症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、全身性炎症反応症候群(SIRS)、急性肺障害(ALI)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、サルコイドーシス、間質性肺炎、過敏性肺炎、喘息、難治性喘息等)、骨疾患(例えば、脊椎または膝等変形性関節炎(OA)、関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症、骨折、脊髄損傷、骨膜損傷等)、消化器系肝疾患(例えば、劇症肝炎、急性肝炎、肝硬変、慢性肝炎、脂肪肝、脂肪性肝炎、胃潰瘍、胃炎、腸潰瘍等)、泌尿器系疾患(例えば、急性腎不全、慢性腎不全、糸球体疾患、尿細管間質性疾患、腎血管系障害症、嚢胞性腎疾患、中毒性腎症、尿細管輸送異常症、透析患者腎障害、腎症、ネフローゼ症候群、IgA腎症、非典型溶血性尿毒素症症候群、急性進行性腎炎症候群、腎線維症等)、消化器系膵疾患(例えば、糖尿病、慢性膵炎、急性膵炎等)、消化器疾患(例えば、食道炎、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病等)、糖尿病性合併症(例えば、糖尿病性神経障害、皮膚潰瘍、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等)、血管内皮細胞障害(例えば、PTCA(percutaneous transluminal coronary angioplasty:経皮経管冠動脈形成術)後の再狭窄予防等)、歯科疾患(例えば、歯周病、抜歯創、口腔創傷、歯周組織障害等)、皮膚疾患(例えば褥瘡、脱毛等)、眼科疾患(例えば、緑内障等)、臓器・細胞移植(心臓、肝臓、腎臓、肺臓、膵、膵島細胞、骨髄等)、移植慢性拒絶等の予防および/または治療剤として有用である。特に、心疾患、肺疾患、腎疾患、骨疾患、神経変性疾患、肝疾患、膵疾患、自己免疫疾患、アレルギー症候群および血管性疾患への予防および/または治療剤として有望である。
化合物(A)等のPGI2受容体作動薬は、体内再生因子産生促進作用、幹細胞分化誘導作用、抗アポトーシス作用、リバースリモデリング作用、抗線維化作用および血管新生促進作用等を有しているため、PGI2受容体作動薬を含有するステルス性リポソーム製剤は、各種臓器障害、炎症性疾患(例えば、血管疾患(例えば、閉塞性動脈硬化症(ASO)、バージャー病、レイノー病、動脈硬化、血管炎症候群等)、循環器系疾患(例えば、心筋梗塞、心筋炎、狭心症、上室性頻脈性不整脈、うっ血性心不全、冠動脈疾患、特発性心筋症、拡張型心筋症、虚血性心筋症、心房細動、慢性心不全、拡張不全、収縮不全、弁膜症、大動脈弁狭窄症等)、神経変性疾患(例えば、虚血性脳障害、脳血管障害、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、脊柱管狭窄症、認知症、モヤモヤ病、脊髄損傷、筋委縮性側索硬化症(ALS)等)、呼吸器系疾患(例えば、急性肺炎、肺線維症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、全身性炎症反応症候群(SIRS)、急性肺障害(ALI)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、サルコイドーシス、間質性肺炎、過敏性肺炎、喘息、難治性喘息等)、骨疾患(例えば、脊椎または膝等変形性関節炎(OA)、関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症、骨折、脊髄損傷、骨膜損傷等)、消化器系肝疾患(例えば、劇症肝炎、急性肝炎、肝硬変、慢性肝炎、脂肪肝、脂肪性肝炎、胃潰瘍、胃炎、腸潰瘍等)、泌尿器系疾患(例えば、急性腎不全、慢性腎不全、糸球体疾患、尿細管間質性疾患、腎血管系障害症、嚢胞性腎疾患、中毒性腎症、尿細管輸送異常症、透析患者腎障害、腎症、ネフローゼ症候群、IgA腎症、非典型溶血性尿毒素症症候群、急性進行性腎炎症候群、腎線維症等)、消化器系膵疾患(例えば、糖尿病、慢性膵炎、急性膵炎等)、消化器疾患(例えば、食道炎、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病等)、糖尿病性合併症(例えば、糖尿病性神経障害、皮膚潰瘍、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等)、血管内皮細胞障害(例えば、PTCA(percutaneous transluminal coronary angioplasty:経皮経管冠動脈形成術)後の再狭窄予防等)、歯科疾患(例えば、歯周病、抜歯創、口腔創傷、歯周組織障害等)、皮膚疾患(例えば褥瘡、脱毛等)、眼科疾患(例えば、緑内障等)、臓器・細胞移植(心臓、肝臓、腎臓、肺臓、膵、膵島細胞、骨髄等)、移植慢性拒絶等の予防および/または治療剤として有用である。特に、心疾患、肺疾患、腎疾患、骨疾患、神経変性疾患、肝疾患、膵疾患、自己免疫疾患、アレルギー症候群および血管性疾患への予防および/または治療剤として有望である。
化合物(A)等PGI2受容体作動薬が産生を誘導・促進する体内再生因子には、例えば、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、各種の線維芽細胞増殖因子(a/bFGF)、形質転換増殖因子-β(TGF-β)、血小板由来増殖因子(PDGF)、アンジオポエチン、低酸素誘導因子(HIF)、インスリン様成長因子(IGF)、骨形成蛋白質(BMP)、結合組織成長因子(CTGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、ストローマ細胞由来因子(SDF-1)、High Mobility Group Box 1(HMGB1)等またはそのファミリーの増殖因子等が知られている。上記の内因性修復因子類を産生する他の薬物類としては、他のPGI2受容体アゴニスト、PGE2受容体の中のEP2、EP4受容体アゴニスト、およびこれらの混合受容体作動薬等が挙げられる。本発明の目的を達成するために、化合物(A)の代わりに上記薬物を用いてもよい。なお、化合物(A)の代わりに用いることができる薬物には、PGI類、及びPGE類の誘導体、IP、EP2
及びEP4受容体作動薬等も含まれ、例えば化合物(B)、アエロプロスト、オルノプロスチル、化合物(C)、化合物(D)(リマプロスト)、化合物(E)、エンプロスチル、ミソプロストール、ONO-4232、ONO-8055 等が挙げられる。
及びEP4受容体作動薬等も含まれ、例えば化合物(B)、アエロプロスト、オルノプロスチル、化合物(C)、化合物(D)(リマプロスト)、化合物(E)、エンプロスチル、ミソプロストール、ONO-4232、ONO-8055 等が挙げられる。
これらの薬物、およびその薬物を含有するリポソームは、化合物(A)と同様の疾患に効果を発揮する。
本発明においては、目的に応じて、化合物(A)および上記の薬物から選択される2種以上の薬物を組み合わせてリポソームとすることも好ましい。なお、上記薬物は市販品であるか、もしくは公知の方法に準じて容易に製造することができる。
本発明のリポソームの投与形態としては、 静脈内投与用、冠動脈投与用、吸入用、筋注投与用、皮下投与用、経口投与用、経粘膜投与用及び経皮投与用または臓器用の注射用製剤、軟膏剤、貼付剤、経口剤、スプレー剤等が挙げられる。前記以外にも、埋め込み剤、直腸、子宮、口腔内などの経粘膜投与剤、点鼻剤、及び点滴静注又は冠動脈内への持続的な投与法がある。
[毒性]
PGI2受容体作動薬単独に比し、本発明のリポソーム製剤の毒性は低く、医薬として使用するために十分に安全である。 また、PGI2受容体作動薬は、発がんに対するイニシエーション作用、及びプロモーション作用を有していないことは、これらのマウス及びラットを用いた長期癌原性試験、及び中期肝発がん性試験等で確認されている。
PGI2受容体作動薬単独に比し、本発明のリポソーム製剤の毒性は低く、医薬として使用するために十分に安全である。 また、PGI2受容体作動薬は、発がんに対するイニシエーション作用、及びプロモーション作用を有していないことは、これらのマウス及びラットを用いた長期癌原性試験、及び中期肝発がん性試験等で確認されている。
以下、実施例によって本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、使用した試薬類例を以下に示す。尚、実施例記載においては、これらの略語にて記載する。
(1)HSPC(水添添加大豆リン脂質, hydrogenated lecithin)
品名:COATSOME NC-21、(NOF corporation) CAS:921228-87-5, 92128-87-5
(2)DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) CAS: 1069-79-0(日本精化)
(3)DEPC:1,2-Dierucoyl-sn-glycerol-3- phosphorylcholine CAS No. 51779-95-4(日本精化)
(4)MPEG2000-DSPE:N-(carbonyl-methoxypolyethyleneglycol 5000)-1,2 distearoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamine, sodium salt CAS:147867-65-0 (日本精化)
(5)DOPC:1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(CAS:4235-95-4)(日本精化)
(6)Cholesterol:Cholesterol HP(NOF corporation)
(7)PBS(-);ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)
濾過滅菌済 マイコプラズマ, エンドトキシン検査済(商品コード14249-95)(ナカライテスク)リポソームに内包されるPGI2受容体作動薬類は以下記載会社から市販されており一般に購入することが出来る。
(i)化合物(A)(ONO-1301) Sigma-Aldrich CAS 176391-41-6
(ii)化合物(B)(ベラプロスト)Cayman社 CAS: 88475-69-8
(iii)化合物(C)(MRE-269) Cayman社 CAS:475085-57-5
(iv)化合物(D)(リマプロスト)Cayman社 CAS:74397-12-9
(v)化合物(E)(NS-304)Cayman社 CAS: 475086-01-2
以下、PGI2受容体作動薬類のリポソーム製造例を具体的に詳述する。
尚、使用した試薬類例を以下に示す。尚、実施例記載においては、これらの略語にて記載する。
(1)HSPC(水添添加大豆リン脂質, hydrogenated lecithin)
品名:COATSOME NC-21、(NOF corporation) CAS:921228-87-5, 92128-87-5
(2)DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) CAS: 1069-79-0(日本精化)
(3)DEPC:1,2-Dierucoyl-sn-glycerol-3- phosphorylcholine CAS No. 51779-95-4(日本精化)
(4)MPEG2000-DSPE:N-(carbonyl-methoxypolyethyleneglycol 5000)-1,2 distearoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamine, sodium salt CAS:147867-65-0 (日本精化)
(5)DOPC:1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(CAS:4235-95-4)(日本精化)
(6)Cholesterol:Cholesterol HP(NOF corporation)
(7)PBS(-);ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)
濾過滅菌済 マイコプラズマ, エンドトキシン検査済(商品コード14249-95)(ナカライテスク)リポソームに内包されるPGI2受容体作動薬類は以下記載会社から市販されており一般に購入することが出来る。
(i)化合物(A)(ONO-1301) Sigma-Aldrich CAS 176391-41-6
(ii)化合物(B)(ベラプロスト)Cayman社 CAS: 88475-69-8
(iii)化合物(C)(MRE-269) Cayman社 CAS:475085-57-5
(iv)化合物(D)(リマプロスト)Cayman社 CAS:74397-12-9
(v)化合物(E)(NS-304)Cayman社 CAS: 475086-01-2
以下、PGI2受容体作動薬類のリポソーム製造例を具体的に詳述する。
1.製剤例1(リモートローディング法)リポソームの調整
1)HSPC;107.4mg、DSPE;9.0mg、コレステロール;35.3mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質濃度20mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥を行った。
3)0.1N 水酸化ナトリウム溶液(>pH12.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加し、ボルテックスを行い、再分散させ、アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル30分、超音波処理後に粒子径サイズの確認を行った。
4)リポソーム外液を交換するために、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)を行った。リポソーム外液は、10mM リン酸緩衝液 (pH8.0)とした。(リポソーム溶液)限外濾過は、攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、バイオマックスPBMK04310 メルク社製を使用し、空リポソーム作成後、脂質定量を実施した。
5)化合物(A)を56.5mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を1.41mL添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を5.65mL添加し、8mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
6)リポソーム溶液に化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加し、60℃、1時間撹拌した。
7)3濃度条件は、1/10混合比:化合物3.29mg、脂質32.9mg 、2/10混合比 化合物6.58mg、脂質32.9mg 、及び4/10混合比:化合物13.16mg 脂質32.9mg 溶液ボリューム3mLで実施した。
8)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製の撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。 外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表2に示す4種の特性を有するリポソーム製剤を得た。図1にこれらの平均粒子径分布図を示す。
1)HSPC;107.4mg、DSPE;9.0mg、コレステロール;35.3mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質濃度20mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥を行った。
3)0.1N 水酸化ナトリウム溶液(>pH12.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加し、ボルテックスを行い、再分散させ、アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル30分、超音波処理後に粒子径サイズの確認を行った。
4)リポソーム外液を交換するために、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)を行った。リポソーム外液は、10mM リン酸緩衝液 (pH8.0)とした。(リポソーム溶液)限外濾過は、攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、バイオマックスPBMK04310 メルク社製を使用し、空リポソーム作成後、脂質定量を実施した。
5)化合物(A)を56.5mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を1.41mL添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を5.65mL添加し、8mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
6)リポソーム溶液に化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加し、60℃、1時間撹拌した。
7)3濃度条件は、1/10混合比:化合物3.29mg、脂質32.9mg 、2/10混合比 化合物6.58mg、脂質32.9mg 、及び4/10混合比:化合物13.16mg 脂質32.9mg 溶液ボリューム3mLで実施した。
8)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製の撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。 外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表2に示す4種の特性を有するリポソーム製剤を得た。図1にこれらの平均粒子径分布図を示す。
2.製剤例2(バンガム法)リポソームの調製
1)HSPC;102.0mg、DSPE;8.5mg、コレステロール;33.5mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1:1, v/v)を脂質濃度20mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥を行った。
ナスフラスコ4本にそれぞれ総脂質として30mgになるように準備した。
3)化合物(A)を170.6mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を4.5mL添加し、ボルテックスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.6ml添加し、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)真空乾燥した脂質フィルムに化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加し、37℃、1時間撹拌した。
各ナスフラスコに30mgの脂質が入っているので、1/10混合比:化合物(A)3.0mg・脂質30mg、2/10混合比:化合物(A)6mg・脂質30mg、及び4/10混合比:化合物(A)12mg・脂質30mg 各3mLになるようPBSにて溶液量を調整した。
5)アズワン製 VS-100IIIにて28KHz 60秒・45KHz 60秒・100KHz 3秒のサイクルの繰り返しでトータル60分処理を行った。
6)超音波処理を60分行った。
7)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
1)HSPC;102.0mg、DSPE;8.5mg、コレステロール;33.5mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1:1, v/v)を脂質濃度20mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥を行った。
ナスフラスコ4本にそれぞれ総脂質として30mgになるように準備した。
3)化合物(A)を170.6mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を4.5mL添加し、ボルテックスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.6ml添加し、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)真空乾燥した脂質フィルムに化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加し、37℃、1時間撹拌した。
各ナスフラスコに30mgの脂質が入っているので、1/10混合比:化合物(A)3.0mg・脂質30mg、2/10混合比:化合物(A)6mg・脂質30mg、及び4/10混合比:化合物(A)12mg・脂質30mg 各3mLになるようPBSにて溶液量を調整した。
5)アズワン製 VS-100IIIにて28KHz 60秒・45KHz 60秒・100KHz 3秒のサイクルの繰り返しでトータル60分処理を行った。
6)超音波処理を60分行った。
7)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表3に示す4種の特性を有するリポソーム製剤を得た。図2にこれらの平均粒子径分布図を示す。
3.製剤例3(エクストルーダー法)リポソームの調製
1)HSPC;255.0mg、DSPE;21.3mg、コレステロール;83.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質濃度20mg/mlになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
3)化合物(A)を143mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を3.76mL添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.2ml添加し、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)脂質フィルムに化合物(A)溶液を添加し、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を追加し、36mLにメスアップした(化合物(A);140mg、脂質;360mg)。
5)アズワン社製 VS-100III 28Khzにて超音波処理を1分行い、ナスフラスコ壁面の脂質を分散した。
6)60℃、加温撹拌を30分行った。
7)等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。エクストレーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、GE社製 400nm:品番111107 200nm:品番111106にて実施した。
8)攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、及びバイオマックスPBMK04310 メルク社製の撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
1)HSPC;255.0mg、DSPE;21.3mg、コレステロール;83.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質濃度20mg/mlになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
3)化合物(A)を143mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を3.76mL添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.2ml添加し、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)脂質フィルムに化合物(A)溶液を添加し、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を追加し、36mLにメスアップした(化合物(A);140mg、脂質;360mg)。
5)アズワン社製 VS-100III 28Khzにて超音波処理を1分行い、ナスフラスコ壁面の脂質を分散した。
6)60℃、加温撹拌を30分行った。
7)等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。エクストレーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、GE社製 400nm:品番111107 200nm:品番111106にて実施した。
8)攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、及びバイオマックスPBMK04310 メルク社製の撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表4に示した特性を有するリポソーム製剤を得た。図3には平均粒子径分布図を示す。
4.製剤例4(脂質―化合物フィルム法)リポソームの調製
1)脂質(HSPC;21.2mg、DSPE;1.8mg、コレステロール;7.0mg)および化合物(A);6.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取した。この時、脂質10mgに対し、化合物
A)が2mgになるように秤量した。
2)クロロホルム/メタノール溶液(1/1,v/v)を脂質と化合物(A)総重量20mg/mLになるように添加し、溶解した。
3)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
4)10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加した。
5)アズワン製 VS-100III 28KHzでの超音波処理によりナスフラスコ壁面の脂質および化合物(A)を剥離し、60℃、30分撹拌した。
6)等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。即ち、エクストレーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、GE社製 400nm:品番111107、200nm:品番111106にて実施した。
7)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製の)撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
1)脂質(HSPC;21.2mg、DSPE;1.8mg、コレステロール;7.0mg)および化合物(A);6.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取した。この時、脂質10mgに対し、化合物
A)が2mgになるように秤量した。
2)クロロホルム/メタノール溶液(1/1,v/v)を脂質と化合物(A)総重量20mg/mLになるように添加し、溶解した。
3)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
4)10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加した。
5)アズワン製 VS-100III 28KHzでの超音波処理によりナスフラスコ壁面の脂質および化合物(A)を剥離し、60℃、30分撹拌した。
6)等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。即ち、エクストレーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、GE社製 400nm:品番111107、200nm:品番111106にて実施した。
7)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製の)撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表5に示した特性を有するリポソーム製剤を得た。図4には平均粒子径分布図を示す。
5.PEG処理ステルス型リポソーム製剤の作製
(1)製剤例5(リモートローディング法)リポソームの調製
1)HSPC;107.5mg、MPEG2000-DSPE ;35.0mg、コレステロール(35.5mg)を秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1:1, v/v)を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液(>pH12.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加し、ボルテックスを行い、再分散させた。
3)ズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル30分、超音波処理後に粒子径サイズの確認を行った。
4)リポソーム外液を交換するために、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)を行った。リポソーム外液は、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)とした(リポソーム溶液)。
限外濾過は、攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、及びバイオマックスPBMK04310 メルク社製にて実施し、空リポソーム作成後、脂質定量実施した。
5)化合物(A)を56.5mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を1.41mL添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を5.65mL添加し、8mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
6)リポソーム溶液に化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加して、60℃、1時間撹拌した。3濃度条件は、1/10混合比:化合物(A)4.0mg、脂質40.0mg、2/10混合比 化合物(A)8.0mg、脂質40.0mg、及び 4/10混合比:化合物(A)16.0mg 脂質40.0mg 溶液ボリューム4mLで実施した。
7)撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。限外濾過は、攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製にて実施した。外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
(1)製剤例5(リモートローディング法)リポソームの調製
1)HSPC;107.5mg、MPEG2000-DSPE ;35.0mg、コレステロール(35.5mg)を秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1:1, v/v)を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液(>pH12.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加し、ボルテックスを行い、再分散させた。
3)ズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル30分、超音波処理後に粒子径サイズの確認を行った。
4)リポソーム外液を交換するために、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)を行った。リポソーム外液は、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)とした(リポソーム溶液)。
限外濾過は、攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、及びバイオマックスPBMK04310 メルク社製にて実施し、空リポソーム作成後、脂質定量実施した。
5)化合物(A)を56.5mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を1.41mL添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を5.65mL添加し、8mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
6)リポソーム溶液に化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加して、60℃、1時間撹拌した。3濃度条件は、1/10混合比:化合物(A)4.0mg、脂質40.0mg、2/10混合比 化合物(A)8.0mg、脂質40.0mg、及び 4/10混合比:化合物(A)16.0mg 脂質40.0mg 溶液ボリューム4mLで実施した。
7)撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。限外濾過は、攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製にて実施した。外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表6示す4種の特性を有するリポソーム製剤を得た。図5これらの平均粒子径分布図を示す。
(2)製剤例6(バンガム法)リポソームの調製
1)HSPC;87.0mg、MPEG2000-DSPE ;28.3mg、コレステロール;29.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1:1, v/v)を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
ナスフラスコ4本にはそれぞれ総脂質として10mgになるよう準備した。
3)化合物(A)を164mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を4.3mL添加し、ボルテックスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.53ml添加し、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)真空乾燥した脂質フィルムに化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加し、37℃、1時間撹拌した。
5)3濃度条件とは、1/10混合比:化合物(A)1.0mg、脂質10.0mg 、2/10混合比 化合物(A)2.0mg、脂質10.0mg 、4/10混合比:化合物(A)4.0mg 脂質10.0mg 溶液ボリューム4mLとした。
6)アズワン製 VS-100IIIにて、出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル60分、超音波処理を行った。
7)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
1)HSPC;87.0mg、MPEG2000-DSPE ;28.3mg、コレステロール;29.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1:1, v/v)を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
ナスフラスコ4本にはそれぞれ総脂質として10mgになるよう準備した。
3)化合物(A)を164mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を4.3mL添加し、ボルテックスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.53ml添加し、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)真空乾燥した脂質フィルムに化合物(A)溶液(3濃度条件)を添加し、37℃、1時間撹拌した。
5)3濃度条件とは、1/10混合比:化合物(A)1.0mg、脂質10.0mg 、2/10混合比 化合物(A)2.0mg、脂質10.0mg 、4/10混合比:化合物(A)4.0mg 脂質10.0mg 溶液ボリューム4mLとした。
6)アズワン製 VS-100IIIにて、出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル60分、超音波処理を行った。
7)攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表7に示す4種の特性を有するリポソーム製剤を得た。図6これらの平均粒子径分布図を示す。
(3)製剤例7(エクストルダー法)リポソームの調製
1)HSPC;215.0mg、MPEG2000-DSPE ;70.0mg、コレステロール;71.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥した。
3)化合物(A)を142.7mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液3.8mLを添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.19mL添加、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)脂質フィルムに化合物(A)溶液を添加し、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を追加し、35.6mLにメスアップした(化合物:142.4mg 脂質:356.0mg)。
5)アズワン製 VS-100IIIにて、出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル30分、超音波処理を1分行い、ナスフラスコ壁面の脂質を剥離し、60℃、30分撹拌した。
6)等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。エクストレーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、GE社製 400nm:品番111107 200nm:品番111106にて実施した。
7)攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、及びバイオマックスPBMK04310 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
1)HSPC;215.0mg、MPEG2000-DSPE ;70.0mg、コレステロール;71.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2)ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥した。
3)化合物(A)を142.7mg秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液3.8mLを添加し、ボルッテクスを行い溶解したところに、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を2.19mL添加、24mg/mLの溶液を調製した。(化合物(A)溶液)
4)脂質フィルムに化合物(A)溶液を添加し、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を追加し、35.6mLにメスアップした(化合物:142.4mg 脂質:356.0mg)。
5)アズワン製 VS-100IIIにて、出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル30分、超音波処理を1分行い、ナスフラスコ壁面の脂質を剥離し、60℃、30分撹拌した。
6)等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。エクストレーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、GE社製 400nm:品番111107 200nm:品番111106にて実施した。
7)攪拌式セル8000シリーズ50mLセル:Model8050 5122 メルク社製、及びバイオマックスPBMK04310 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表8の特性を有するリポソーム製剤を得た。図7には平均粒子径分布図を示す。
(4)製剤例8(脂質-化合物フィルム法)リポソームの調製
1.HSPC;18.0mg、MPEG2000-DSPE ;6.0mg、コレステロール;6.0mgおよび化合物(A);6.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取した。この時、脂質10mgに対し、化合物(A)2mgになるように秤量し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質と化合物(A)総重量30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2.ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
3.10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加した。
4.アズワン製 VS-100III 28KHzにて、超音波処理を行い、ナスフラスコ壁面の脂質および化合物(A)を剥離し、60℃、30分撹拌した。
5.等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。エクストルーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、及びGE社製 400nm:品番111107 200nm:品番111106にて実施した。
6.攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
1.HSPC;18.0mg、MPEG2000-DSPE ;6.0mg、コレステロール;6.0mgおよび化合物(A);6.0mgを秤量し、ナスフラスコに採取した。この時、脂質10mgに対し、化合物(A)2mgになるように秤量し、クロロホルム/メタノール溶液(1/1, v/v)を脂質と化合物(A)総重量30mg/mLになるように添加し、溶解した。
2.ロータリーエバポレーターでクロロホルム/メタノールを蒸発させ、真空乾燥した。
3.10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加した。
4.アズワン製 VS-100III 28KHzにて、超音波処理を行い、ナスフラスコ壁面の脂質および化合物(A)を剥離し、60℃、30分撹拌した。
5.等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、エクストルーダー処理を行った。(60℃、400nm、200nm)。エクストルーダーは、LIPEX 100mL Thermobarrel Extruder:Northern Lipid社製、Nunleporeメンブレン、及びGE社製 400nm:品番111107 200nm:品番111106にて実施した。
6.攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、撹拌式限外濾過(分画分子量:300,000Da)で、遊離の化合物(A)を除去した。
外液は、10mM リン酸緩衝液(pH7.4)とした。
その結果、以下表9の特性を有するリポソーム製剤20を得た。図8は平均粒子径分布図を示す。
6. 化合物(A)の定量方法
1)化合物(A)を5mg秤量し、試験管に入れ、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を0.125mL添加し、ボルテックスを行い溶解した。
2)精製水4.875mLを添加して、1mg/mLの化合物(A)溶液を調製した。
3)化合物(A)濃度0.0mg/mL~0.50mg/mLの6ポイントで、波長265nmの吸光度を測定して、検量線を作成した。
4)既知濃度の化合物(A)溶液(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL)を調製し、検量線からサンプル濃度を求めた。
5)ブランクリポソーム(脂質濃度4.7mg/mL)に既知濃度の化合物(A)溶液(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL)を添加して、化合物(A)濃度を測定した。
6)既知濃度溶液の測定結果とリポソーム添加既知濃度溶液の測定結果を求めて、回収率を算出した。
1)化合物(A)を5mg秤量し、試験管に入れ、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を0.125mL添加し、ボルテックスを行い溶解した。
2)精製水4.875mLを添加して、1mg/mLの化合物(A)溶液を調製した。
3)化合物(A)濃度0.0mg/mL~0.50mg/mLの6ポイントで、波長265nmの吸光度を測定して、検量線を作成した。
4)既知濃度の化合物(A)溶液(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL)を調製し、検量線からサンプル濃度を求めた。
5)ブランクリポソーム(脂質濃度4.7mg/mL)に既知濃度の化合物(A)溶液(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL)を添加して、化合物(A)濃度を測定した。
6)既知濃度溶液の測定結果とリポソーム添加既知濃度溶液の測定結果を求めて、回収率を算出した。
これらの測定結果を表10及び図9に示す。
その結果、リポソーム化脂質の影響がないことが確認できたことから、化合物(A)は吸光度法で定量した。
7.化合物(A)のステルス性リポソームナノスフェアのバンガム法での大量製造
(1)バンガム法によるPEG処理化化合物(A)内包リポソームの大量調製を行い、特性試験を行った。
(1)バンガム法によるPEG処理化化合物(A)内包リポソームの大量調製を行い、特性試験を行った。
(作製方法)
(i) HSPC;5.524g、Cholesterol;1.8419g、MPEG2000-DSPE ;1.7978gをナスフラスコに秤量し、クロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液を脂質濃度30mg/mLになるように添加、37℃、撹拌溶解した。
(ii) 窒素封入下、エバポレーターで溶媒留去後、真空乾燥した。脂質600mgx15本、及び脂質300mgx1本の100mLナスフラスコを準備した。
(iii) 化合物(A)を秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を添加、化合物(A)濃度40mg/mLの溶液を作製した。 そこに10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を化合物(A)濃度24mg/mLになるように添加した。
(iv) 脂質フィルムに(3)の溶液を添加、脂質濃度10mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、37℃、1時間撹拌した。各ナスフラスコに脂質600mgに対して化合物(A)22.2mgを添加、及び脂質300mgに対しては化合物(A)11.1mg添加した。
(v) アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルで、各々のナスフラスコで超音波処理をトータル60分行った。
(vi) 攪拌式セル8000シリーズ400mLセル:MMODEL8400 5124 メルク社製、 バイオマックスPBMK07610 メルク社製を使用した。溶液量がトータル930mLのため、セルを3つ使用して限外濾過(分画分子量:300,000Da)により外水相を10mM リン酸緩衝液(pH7.4)に置換、未内包化合物(A)を除去した。
(i) HSPC;5.524g、Cholesterol;1.8419g、MPEG2000-DSPE ;1.7978gをナスフラスコに秤量し、クロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液を脂質濃度30mg/mLになるように添加、37℃、撹拌溶解した。
(ii) 窒素封入下、エバポレーターで溶媒留去後、真空乾燥した。脂質600mgx15本、及び脂質300mgx1本の100mLナスフラスコを準備した。
(iii) 化合物(A)を秤量し、0.1N 水酸化ナトリウム溶液を添加、化合物(A)濃度40mg/mLの溶液を作製した。 そこに10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を化合物(A)濃度24mg/mLになるように添加した。
(iv) 脂質フィルムに(3)の溶液を添加、脂質濃度10mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、37℃、1時間撹拌した。各ナスフラスコに脂質600mgに対して化合物(A)22.2mgを添加、及び脂質300mgに対しては化合物(A)11.1mg添加した。
(v) アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルで、各々のナスフラスコで超音波処理をトータル60分行った。
(vi) 攪拌式セル8000シリーズ400mLセル:MMODEL8400 5124 メルク社製、 バイオマックスPBMK07610 メルク社製を使用した。溶液量がトータル930mLのため、セルを3つ使用して限外濾過(分画分子量:300,000Da)により外水相を10mM リン酸緩衝液(pH7.4)に置換、未内包化合物(A)を除去した。
その結果、以下表11の特性を有するリポソーム製剤を得た。図10にこれらの平均粒子径分布図を示す。
作製したPEG処理化合物(A)内包リポソームの一部を用いて、以下一般試験を行った
。
。
(2)図11に製剤21の透過型電子顕微鏡撮像を示す。
解析方法:形態観察
撮影機種:HITACHI H-7600 at 100kV
試料作製方法
・分散:400mesh カーボン支持膜付グリッド
・染色:ネガティブ染色 (リンタングステン酸)
電顕写真を図11に示す。
撮影機種:HITACHI H-7600 at 100kV
試料作製方法
・分散:400mesh カーボン支持膜付グリッド
・染色:ネガティブ染色 (リンタングステン酸)
電顕写真を図11に示す。
(3)作製したPEG処理化合物(A)内包リポソームの一部のHPLC分析を行い、分解物の有無を確認した。
・HPLCによる化合物(A)の分析及び定量
機器名 :Agilent 1290 Infinity LCシリーズ
カラム :SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 5μm, 4.6×150mm
移動相 :1% 酢酸/H2O:1% 酢酸/アセトニトリル=60:40
流速 :1mL/min
検出波長 :265nm
カラム温度:25℃
(試料調製方法)
サンプル1:化合物(A)を1mg/mLになるように1M 水酸化ナトリウム溶液に溶解した。
これを40℃、一晩静置した。(酸化物産生検体)
サンプル2:化合物(A)を0.5mg/mLになるように0.1N 水酸化ナトリウム溶液-10mM リン酸緩衝液(pH8.0)(内包時の緩衝液)で調製した。(コントロール検体)
サンプル3:サンプル2を生理食塩水で等倍希釈し、0.25mg/mLの溶液を調製した。これを、37℃、一晩静置した。(化合物コントロール検体)
サンプル4:PEG処理空リポソームを生理食塩水で10倍希釈を行った。これを37℃、一晩静置後、限外濾過を行った。(脂質コントロール検体)
サンプル5:PEG処理化合物(A)内包リポソームを生理食塩水で10倍希釈行った。これを37℃、一晩静置後、限外濾過を行った。(リポソーム検体)
・HPLCによる化合物(A)の分析及び定量
機器名 :Agilent 1290 Infinity LCシリーズ
カラム :SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 5μm, 4.6×150mm
移動相 :1% 酢酸/H2O:1% 酢酸/アセトニトリル=60:40
流速 :1mL/min
検出波長 :265nm
カラム温度:25℃
(試料調製方法)
サンプル1:化合物(A)を1mg/mLになるように1M 水酸化ナトリウム溶液に溶解した。
これを40℃、一晩静置した。(酸化物産生検体)
サンプル2:化合物(A)を0.5mg/mLになるように0.1N 水酸化ナトリウム溶液-10mM リン酸緩衝液(pH8.0)(内包時の緩衝液)で調製した。(コントロール検体)
サンプル3:サンプル2を生理食塩水で等倍希釈し、0.25mg/mLの溶液を調製した。これを、37℃、一晩静置した。(化合物コントロール検体)
サンプル4:PEG処理空リポソームを生理食塩水で10倍希釈を行った。これを37℃、一晩静置後、限外濾過を行った。(脂質コントロール検体)
サンプル5:PEG処理化合物(A)内包リポソームを生理食塩水で10倍希釈行った。これを37℃、一晩静置後、限外濾過を行った。(リポソーム検体)
上記、5サンプルのHPLC分析を行い、37℃環境下での化合物(A)酸化物の有無及びPEG処理化合物(A)内包リポソームの化合物(A)酸化物の有無を確認した。
サンプル1~5のHPLC測定チャートを図12に示す。
8.バンガム法によるPEG処理化化合物(B)内包ステルス性リポソームの作製
(1)リポソーム作製
(i) HSPC;36.0mg、Cholesterol;12.0mg、MPEG2000-DSPE ;12.0mgをナスフラスコに秤量し、クロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、37℃、撹拌溶解した。
(ii) 窒素封入下、エバポレーターで溶媒留去し、真空乾燥した。
(iii) 化合物(B)を20mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、溶解した。
(iv) 脂質フィルムに化合物(B)溶液を1/10(Drug/Lipid w/w%)になるように添加し、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加、メスアップした(化合物(B)6.0mg、脂質;60.0mg)。
(v) ボルッテクスを20秒程行い、37℃、1時間撹拌した。
(vi) アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル90分超音波処理を行った。
(vii) 攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製 スタート時6mL 回収時4mLで、1.5倍濃縮した。薬剤内包量が低かった為限外濾過(分画分子量:300,000Da)により外水相10mM リン酸緩衝液(pH7.4)に置換し、未内包化合物(B)を除去した。
(1)リポソーム作製
(i) HSPC;36.0mg、Cholesterol;12.0mg、MPEG2000-DSPE ;12.0mgをナスフラスコに秤量し、クロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、37℃、撹拌溶解した。
(ii) 窒素封入下、エバポレーターで溶媒留去し、真空乾燥した。
(iii) 化合物(B)を20mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、溶解した。
(iv) 脂質フィルムに化合物(B)溶液を1/10(Drug/Lipid w/w%)になるように添加し、10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を脂質濃度10mg/mLになるように添加、メスアップした(化合物(B)6.0mg、脂質;60.0mg)。
(v) ボルッテクスを20秒程行い、37℃、1時間撹拌した。
(vi) アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル90分超音波処理を行った。
(vii) 攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、 バイオマックスPBMK02510 メルク社製 スタート時6mL 回収時4mLで、1.5倍濃縮した。薬剤内包量が低かった為限外濾過(分画分子量:300,000Da)により外水相10mM リン酸緩衝液(pH7.4)に置換し、未内包化合物(B)を除去した。
その結果、以下の表12の特性を有するリポソーム製剤を得た。図13にこれらの平均粒子径分布図を示す。
以上の結果より、PEG処理化合物(B)内包リポソームが作製できた。
(2)製剤22の透過型電子顕微鏡撮像を図14に示す。
(3)化合物(B)の定量法確認
(吸収スペクトルの確認方法)
(i) 化合物(B)を20mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、溶解した。
(ii) (i)を精製水で等倍4段階希釈した。
(iii) 各濃度のサンプルをクロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液で10倍希釈し、UV2700を用いて吸光度220~700nmの吸収スペクトルを測定した。
(吸収スペクトルの確認方法)
(i) 化合物(B)を20mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加し、溶解した。
(ii) (i)を精製水で等倍4段階希釈した。
(iii) 各濃度のサンプルをクロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液で10倍希釈し、UV2700を用いて吸光度220~700nmの吸収スペクトルを測定した。
化合物(B)の吸収スペクトルの測定を行ったところ、最大吸収波長が285nmであった。化合物(B)の定量は、吸光度法(吸光度:285nm)で測定できることを確認した。図15にUV吸収スペクトル変化を示す。
9.バンガム法によるPEG処理化化合物(C)内包ステルス性リポソームの作製
(1)リポソーム作製方法
(i) HSPC;60.0mg、Cholesterol;12.0mg、MPEG2000-DSPE ;12.0mgをナスフラスコニ秤量し、クロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、37℃、撹拌溶解した。
(ii) 窒素封入下、エバポレーターで溶媒留去し、真空乾燥した。
(iii) 化合物(C)を20mg/mLになるようにDMSOで溶解し、化合物(C)が10mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加した。
(iv) 脂質フィルムに化合物(C)溶液を1/10(Drug/Lipid w/w%)になるように添加し、37℃、1時間撹拌した(化合物(C):6.0mg、脂質:60.0mg)。
(v)アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル90分、超音波処理を行った。
(vi) 攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、限外濾過(分画分子量:300,000Da)により外水相10mM リン酸緩衝液(pH7.4)に置換し、未内包化合物(C)を除去した。
(2)その結果、表13の特性を有するリポソームを得た。図16に平均粒子径分布図を示す。
(1)リポソーム作製方法
(i) HSPC;60.0mg、Cholesterol;12.0mg、MPEG2000-DSPE ;12.0mgをナスフラスコニ秤量し、クロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液を脂質濃度30mg/mLになるように添加し、37℃、撹拌溶解した。
(ii) 窒素封入下、エバポレーターで溶媒留去し、真空乾燥した。
(iii) 化合物(C)を20mg/mLになるようにDMSOで溶解し、化合物(C)が10mg/mLになるように10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を添加した。
(iv) 脂質フィルムに化合物(C)溶液を1/10(Drug/Lipid w/w%)になるように添加し、37℃、1時間撹拌した(化合物(C):6.0mg、脂質:60.0mg)。
(v)アズワン製 VS-100III 出力28Khz60秒、45KHz60秒、100KHz3秒サイクルでトータル90分、超音波処理を行った。
(vi) 攪拌式セル8000シリーズ10mLセル:MMODEL8010 5121 メルク社製、及びバイオマックスPBMK02510 メルク社製にて、限外濾過(分画分子量:300,000Da)により外水相10mM リン酸緩衝液(pH7.4)に置換し、未内包化合物(C)を除去した。
(2)その結果、表13の特性を有するリポソームを得た。図16に平均粒子径分布図を示す。
以上の結果より、PEG処理化合物(C)内包リポソームの作製ができた。
(3)図17に、製剤23の透過型電子顕微鏡撮像を示す。
(3)図17に、製剤23の透過型電子顕微鏡撮像を示す。
(4)化合物(C)の定量法確認
(吸収スペクトルの確認方法)
(i) 化合物(C)を20mg/mLになるようにDMSOを添加し、溶解した。
(ii) 等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を(i)に添加し、化合物(C)濃度10mg/mLの50% DMSO溶液を作製した。
(iii) (ii)を精製水で等倍3段階希釈した。
(vi) 各濃度のサンプルをクロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液で10倍希釈し、UV2700を用いて吸光度220~700nmの吸収スペクトルを測定した。
(吸収スペクトルの確認方法)
(i) 化合物(C)を20mg/mLになるようにDMSOを添加し、溶解した。
(ii) 等量の10mM リン酸緩衝液(pH8.0)を(i)に添加し、化合物(C)濃度10mg/mLの50% DMSO溶液を作製した。
(iii) (ii)を精製水で等倍3段階希釈した。
(vi) 各濃度のサンプルをクロロホルム/メタノール(1/1, v/v)溶液で10倍希釈し、UV2700を用いて吸光度220~700nmの吸収スペクトルを測定した。
化合物(C)について吸収スペクトルを測定したところ、吸収ピークが300nmと368nmであることが確認された。化合物(C)の定量は、吸光度法(波長:300nm)で行うことが確認できた。
図18に化合物(C)のUV吸収スペクトル変化を示した。
図18に化合物(C)のUV吸収スペクトル変化を示した。
10.直接分散改良法による、化合物(A)(ONO-1301)のステルス性リポソーム製剤の作製。
1)作製法
(i)下記表14に2種の脂質および化合物(A)を採り、20gのt-ブタノールに70℃で溶解した。
1)作製法
(i)下記表14に2種の脂質および化合物(A)を採り、20gのt-ブタノールに70℃で溶解した。
(ii)溶解した(i)の液をドライアイス/アセトンにより瞬時に凍結。
(iii)凍結後、凍結乾燥機にて約17hr凍結乾燥。
(iv) 得られた粉体にPBS(-)440mLを加え、50℃の温浴およびソニケーターにより塊がなくなるまで分散。(この時点でONO-1301濃度2.5mg/mL)
(v)400nm孔径のポリカーボネートフィルターおよびドレンディスクを装着し、ジャケットに50℃温水を通水したエクストルーダーにより、約50kg/cm2にてサイジング。
(vi)(v)と同様に200nmフィルターでも3Passしてサイジングし、半透明なリポソーム液を得た。
(iii)凍結後、凍結乾燥機にて約17hr凍結乾燥。
(iv) 得られた粉体にPBS(-)440mLを加え、50℃の温浴およびソニケーターにより塊がなくなるまで分散。(この時点でONO-1301濃度2.5mg/mL)
(v)400nm孔径のポリカーボネートフィルターおよびドレンディスクを装着し、ジャケットに50℃温水を通水したエクストルーダーにより、約50kg/cm2にてサイジング。
(vi)(v)と同様に200nmフィルターでも3Passしてサイジングし、半透明なリポソーム液を得た。
2)限外濾過
PBS(-) (SIGMA D1408を10倍希釈)を用いて限外濾過(限外濾過膜:メルクミリポアPBMK04310、分画分子量:300,000Da)を行い、未内包化合物を除去した。
限外濾過は、メルク社、攪拌セル8000シリーズ Model8050 品番5122 を使用し、膜はメルク社 バイオマックス PBMK04310 300KDaを使用した。
PBS(-) (SIGMA D1408を10倍希釈)を用いて限外濾過(限外濾過膜:メルクミリポアPBMK04310、分画分子量:300,000Da)を行い、未内包化合物を除去した。
限外濾過は、メルク社、攪拌セル8000シリーズ Model8050 品番5122 を使用し、膜はメルク社 バイオマックス PBMK04310 300KDaを使用した。
濾過後、クリーンベンチ内で0.22μm フィルター滅菌濾過を行った。
3)特性確認
リポソーム液をPBS(-);ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)で限外濾過(分画分子量:300,000Da)を行い、限外濾過後サンプルとした。また、HPLCによりONO-1301の酸化物有無の確認を行った。
その結果、限外濾過前後において表15に示す通り、各種物性結果に大きな変化は確認されなかった。また、図19、図20に示す通り、粒度分布及びHPLC分析結果よりONO-1301分解物のピークは確認されなかった。化合物(A)の収率は、88%であった。
リポソーム液をPBS(-);ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)で限外濾過(分画分子量:300,000Da)を行い、限外濾過後サンプルとした。また、HPLCによりONO-1301の酸化物有無の確認を行った。
その結果、限外濾過前後において表15に示す通り、各種物性結果に大きな変化は確認されなかった。また、図19、図20に示す通り、粒度分布及びHPLC分析結果よりONO-1301分解物のピークは確認されなかった。化合物(A)の収率は、88%であった。
4)安定性試験
限外濾過後(製剤25)、PBS(-);ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)にて、4℃で9ヶ月間保存後、安定性を確認したところ、粒度分布、含有率、その他物性には変化がなく、安定であることが確認された。
限外濾過後(製剤25)、PBS(-);ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)にて、4℃で9ヶ月間保存後、安定性を確認したところ、粒度分布、含有率、その他物性には変化がなく、安定であることが確認された。
5)分解物の確認(HPLC分析)
HLPC測定の結果、本製造条件下で、化合物(A)の分解物は存在しないことが確認された。
HLPC測定の結果、本製造条件下で、化合物(A)の分解物は存在しないことが確認された。
11.直接分散改良法による、化合物(B)、化合物(D)及び化合物(E)のステルス性リポソーム製剤の作製。
[リポソーム作製方法]
(i) DEPC (日本精化) 0.188gとMPEG2000-DSPE (日本精化) 0.012g及び化合物(B、D、又はE)0.01gをガラスバイアルに秤量した。
(ii) t-ブタノール 2.0gを(i)に添加、37℃加温下で撹拌溶解した。
(iii) エタノールドライアイスで瞬時に凍結した。
(iv) 凍結乾燥を17時間行った。
(v) 凍結乾燥後の脂質・化合物粉末にPBS(-)20mL(ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)を添加した。
(vi)軽くボルテックスを行った後、37℃加温下で超音波処理30分行った。
(vii) 37℃加温下、エクストルーダー処理を行った。装置はLIPEX Extruder 100mLを使用した。400nm孔径ポリカーボネートフィルターを1回処理後、200nm孔径ポリカーボネートフィルターを3回処理した。(処理圧力:約5MPa)
エクストルーダーは、Northern Lipid社製 LIPEX 100mL ThermoBarrel Extruder、膜は GE社製 Nuclepore;400nmの品番111107 200nmの品番 111106を使用した。
(viii) PBS(-) (SIGMA D1408を10倍希釈)で限外濾過(限外濾過膜:メルクミリポアPBMK04310、分画分子量:300,000Da)を行い、未内包化合物を除去した。限外濾過廃液はリポソーム容量20mLの7倍の140mLまで行い最終20mLで回収した。
[リポソーム作製方法]
(i) DEPC (日本精化) 0.188gとMPEG2000-DSPE (日本精化) 0.012g及び化合物(B、D、又はE)0.01gをガラスバイアルに秤量した。
(ii) t-ブタノール 2.0gを(i)に添加、37℃加温下で撹拌溶解した。
(iii) エタノールドライアイスで瞬時に凍結した。
(iv) 凍結乾燥を17時間行った。
(v) 凍結乾燥後の脂質・化合物粉末にPBS(-)20mL(ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)を添加した。
(vi)軽くボルテックスを行った後、37℃加温下で超音波処理30分行った。
(vii) 37℃加温下、エクストルーダー処理を行った。装置はLIPEX Extruder 100mLを使用した。400nm孔径ポリカーボネートフィルターを1回処理後、200nm孔径ポリカーボネートフィルターを3回処理した。(処理圧力:約5MPa)
エクストルーダーは、Northern Lipid社製 LIPEX 100mL ThermoBarrel Extruder、膜は GE社製 Nuclepore;400nmの品番111107 200nmの品番 111106を使用した。
(viii) PBS(-) (SIGMA D1408を10倍希釈)で限外濾過(限外濾過膜:メルクミリポアPBMK04310、分画分子量:300,000Da)を行い、未内包化合物を除去した。限外濾過廃液はリポソーム容量20mLの7倍の140mLまで行い最終20mLで回収した。
限外濾過は、メルク社、攪拌セル8000シリーズ Model8050 品番5122 を使用し、膜はメルク社 バイオマックス PBMK04310 300KDaを使用した。
攪拌セルにリポソーム溶液を入れ、装置をセットし、廃液が140mL出るところまで 窒素ガスのガス加圧(0.4MPa)によって送液した。
(ix) クリーンベンチ内で0.22μm フィルター滅菌濾過を行った。
(x) 物性試験を行った。物性試験として平均粒子径およびゼータ電位測定、脂質定量(和光純薬、リン脂質C-テストワコー)、吸光度(Abs 680nm)を測定した。
攪拌セルにリポソーム溶液を入れ、装置をセットし、廃液が140mL出るところまで 窒素ガスのガス加圧(0.4MPa)によって送液した。
(ix) クリーンベンチ内で0.22μm フィルター滅菌濾過を行った。
(x) 物性試験を行った。物性試験として平均粒子径およびゼータ電位測定、脂質定量(和光純薬、リン脂質C-テストワコー)、吸光度(Abs 680nm)を測定した。
[試験結果]
(1)化合物(B)(製剤26)内包リポソーム 製造
化合物(B)内包リポソームは表16及び図21に示す通りの物性となった。図22に示す通り、化合物(B)内包リポソームのUV吸収スペクトルを確認したところ、化合物(B)由来のUV吸収が確認された。粒子径、PdI値及びゼータ電位は以下表16に示す特性を有するリポソームを得た。図21には、製剤26のリポソーム粒度分布を示す。
(1)化合物(B)(製剤26)内包リポソーム 製造
化合物(B)内包リポソームは表16及び図21に示す通りの物性となった。図22に示す通り、化合物(B)内包リポソームのUV吸収スペクトルを確認したところ、化合物(B)由来のUV吸収が確認された。粒子径、PdI値及びゼータ電位は以下表16に示す特性を有するリポソームを得た。図21には、製剤26のリポソーム粒度分布を示す。
また、図22には、化合物(B)(ベリプラスト)及びその内包リポソームのUV吸収スペクトルを示す。
(2)化合物(D)(製剤27)内包ステルス性リポソームの製造
化合物(D)内包量は、UV定量にて0.249mg/mLとなった。また、粒子径、PdI値及びゼータ電位は以下表17に示す特性を有するリポソームを得た。図23には、製剤27のリポソーム粒度分布を示す。
化合物(D)内包量は、UV定量にて0.249mg/mLとなった。また、粒子径、PdI値及びゼータ電位は以下表17に示す特性を有するリポソームを得た。図23には、製剤27のリポソーム粒度分布を示す。
図24に示す通り吸収スペクトルを確認したところ、233nmのUV吸収値にて定量性があることを確認した。図24には、化合物(D)(リマプロスト)及びその内包リポソームのUV吸収スペクトルを示す。
(3)化合物(E)(製剤28)内包ステルス性リポソームの製造
化合物(E)内包リポソームは表18及び図25に示す通りの物性となった。化合物(E)内包量は、UV定量にて0.305mg/mLとなった。また、粒子径、PdI値及びゼータ電位についても表に示す結果となった。図26に示す通り吸収スペクトルを確認したところ、300nmのUV吸収値にて定量性があることを確認した。
化合物(E)内包リポソームは表18及び図25に示す通りの物性となった。化合物(E)内包量は、UV定量にて0.305mg/mLとなった。また、粒子径、PdI値及びゼータ電位についても表に示す結果となった。図26に示す通り吸収スペクトルを確認したところ、300nmのUV吸収値にて定量性があることを確認した。
11.製剤21及び25の化合物(A)ステルス性リポソームを用いた各種薬効薬理試験1)ラットモノクロタリン誘発肺高血圧症モデルに対する製剤21(ONO-1301Lipo)間歇静注投与での効果の検討
作製した製剤21(ONO-1301Lipo製剤)をラットモノクロタリン(MCT)誘発重症心不全(肺高血圧症)モデルに、MCT投与7日目から被験物質を週1回間歇で静脈内投与し、化合物(A)(ONO-1301)反復経口投与、化合物(A) の週1回間歇静注投与、及び陽性対照として、ET-1拮抗剤(ボセンタン)を経口投与した群と生存率を比較した。また、対照群は、静脈内投与にて週1回生理食塩水(媒体)を投与した。
作製した製剤21(ONO-1301Lipo製剤)をラットモノクロタリン(MCT)誘発重症心不全(肺高血圧症)モデルに、MCT投与7日目から被験物質を週1回間歇で静脈内投与し、化合物(A)(ONO-1301)反復経口投与、化合物(A) の週1回間歇静注投与、及び陽性対照として、ET-1拮抗剤(ボセンタン)を経口投与した群と生存率を比較した。また、対照群は、静脈内投与にて週1回生理食塩水(媒体)を投与した。
使用動物は、ラット、 Slc:Wistar(雄性)、試験開始時週齢: 5週齢、入荷時体重: 66.4~90.8 g、(日本エスエルシー株式会社)にて、モノクロタリン(以下、MCT)、Lot No.:SLBG1999V(Sigma-Aldrich Corporation)を60 mg//kgの用量で単回背部皮下投与し、MCT投与6日後に体重層別割付法で群分け(表19)した。
1群:MCT投与7、14、21、28および35日後(計5回)に1週間間隔で生理食塩液を静脈内投与した。
2群:MCT投与後7~41日後まで、投与の間隔を8時間以上空けて、化合物(A) の3 mg/kgを2回/日、経口投与した。
3群:MCT投与7~41日後まで、投与の間隔を8時間以上空けて、ボセンタンの50 mg/kgを2回/日、経口投与した。
4群:MCT投与7、14、21、28および35日後(計5回)に1週間間隔で製剤21(ONO-1301Lipo)の1 mg/kgを静脈内投与した。
5群:MCT投与7、14、21、28および35日後(計5回)に1週間間隔で化合物(A) の1 mg/kgを静脈内投与した。
2群:MCT投与後7~41日後まで、投与の間隔を8時間以上空けて、化合物(A) の3 mg/kgを2回/日、経口投与した。
3群:MCT投与7~41日後まで、投与の間隔を8時間以上空けて、ボセンタンの50 mg/kgを2回/日、経口投与した。
4群:MCT投与7、14、21、28および35日後(計5回)に1週間間隔で製剤21(ONO-1301Lipo)の1 mg/kgを静脈内投与した。
5群:MCT投与7、14、21、28および35日後(計5回)に1週間間隔で化合物(A) の1 mg/kgを静脈内投与した。
その結果、生存率では、重症心不全モデル作製42日後までの1群、2群、及び4群の生存率の推移を図27、および42日後の全群の生存率を表20に示した。
1群は、MCTの60 mg/kg皮下投与により重症心不全モデル作製15日後に1例の死亡が観察された。その後、42日までに17例の死亡が観察され、最終生存率は10 %(生存数:2/20例)であった。
化合物(A) の3 mg/kgの2回/日、反復経口投与群(2群)は、重症心不全モデル作製14日後に1例の死亡が観察された。その後、42日までにさらに4例の死亡が観察され、最終生存率は50 %(生存数:5/10例)であり、対照群(1群)と比較して有意な延命効果が認められた(p<0.05)。
ボセンタンの50 mg/kgの2回/日、反復経口投与群(3群)は、重症心不全モデル作製20日後に1例の死亡が観察された。その後、42日までにさらに6例の死亡が観察され、最終生存率は30 %(生存数:3/10例)であり、対照群(1群)と比較して有意な延命効果は認められなかった。
陽性対照として用いたET-1拮抗剤であるボセンタンは肺高血圧治療剤として臨床的に使用されており、同ラットMCT誘発心不全モデルにおいて有効性を確認している(Circ J 2013; 77: 2127 - 2133)が、これらはMCT投与直後からの反復経口投与である。今回、(3群)MCT投与7日後からの投与においては、有意な延命効果は確認出来なかった。
製剤21(ONO-1301Lipo)の1 mg/kgの1回/週、間歇静脈内投与群(4群)は、重症心不全モデル作製27日後に1例の死亡が観察された。その後、42日までに4例の死亡が観察され、最終生存率は50 %(生存数:5/10例)であり、対照群(1群)と比較して有意な延命効果が認められた(p<0.05)。
化合物(A)の1 mg/kgの1回/週、間歇静脈内投与群(6群)は、重症心不全モデル作製28日後の投与約30分後に2例の死亡が観察された。その後、42日までに6例の死亡が観察され、最終生存率は20 %(生存数:2/10例)であり、対照群(1群)と比較して有意な延命効果は認められなかった。
化合物(A)の1 mg/kgの1回/週、間歇静脈内投与群(6群)は、重症心不全モデル作製28日後の投与約30分後に2例の死亡が観察された。その後、42日までに6例の死亡が観察され、最終生存率は20 %(生存数:2/10例)であり、対照群(1群)と比較して有意な延命効果は認められなかった。
MCT投与7日後から41日までの35日間に投与された動物あたりの化合物(A)の総被験物質量を求めた。
その結果、2群は210 mg/kg/animal(3 mg/kg×2回/日×35日)、3群は3500 mg/kg/animal(50 mg/kg×2回/日×35日)、4群~5群は5 mg/kg/animal(1 mg/kg/週×5回)であった。4群は2群と比較し、5/210(1/42)投与量にて同等の効果を示した。
疾患部位特異的なDDSリポソーム製剤として、新規ONO-1301リポソーム製剤(製剤21;ONO-1301Lipo)を作製し、間歇静脈内投与により、より汎用性の高い疾患部位特異的(DDS)な重症心不全治療剤開発を目的とした治療法の開発を検討した。
製剤21の間歇静脈内投与によりMCT誘発重症心不全モデルでの生存率を比較検討することにより、DDS効果を確認した。
陽性対照物質として用いたET-1拮抗剤であるボセンタンは肺高血圧治療剤として臨床的に使用されており、MCT誘発心不全モデルにおいて有効性を確認しているが、これらはMCT投与直後からの反復経口投与である。今回、MCT投与7日後からの治療投与においては、有意な延命効果が確認出来なかった。一方、化合物(A) の3 mg/kg(2群)の1日2回反復投与での最終生存率は50 %であり、対照群(1群)と比較して有意な延命効果が確認された。また、製剤21(ONO-1301Lipo)の1 mg/kg(4群)も週1回の間歇静脈内投与においても、最終生存率は50 %であり、化合物(A) (2群)と同等の延命効果を示した。
製剤21の1 mg/kg/週間歇静脈内投与(4群)は化合物(A) の3 mg/kgの2回/日、反復経口投与(2群)と比較し、総投与量として1/42投与量において、同等な延命効果を示すことにより、リポソーム製剤でのDDS効果が確認された。
一方、ONO-1301原薬(5群)の1 mg/kg/週間歇静脈内投与群は効果を示さなかった(表20)。
以上の結果より、重症心不全モデルに対して心不全発症後(MCT投与7日後)からの投与において化合物(A) (ONO-1301)反復経口投与および製剤21の間歇静脈内投与は治療的な投与により有意な延命効果を示した。また、総投与量として1/42投与量において、同等な延命効果を示すことにより、ステルス型リポソーム製剤でのDDS効果が確認された。
2)製剤25(ONO-1301Lipo)のマウスBLM肺線維症モデルに対する各種投与法でのDDS効果の検討
1.方法;
マウス(C57BL/6NCr)、雌性(7週齢)にペントバルビタールナトリウム麻酔後、ブレオマイシン塩酸塩水溶液(BLM)20 μLを2回、計40 μL/animalを気管内(肺内)投与した。なお、正常群(Normal)として同様に媒体(生理食塩液)を気管内投与した。
1.方法;
マウス(C57BL/6NCr)、雌性(7週齢)にペントバルビタールナトリウム麻酔後、ブレオマイシン塩酸塩水溶液(BLM)20 μLを2回、計40 μL/animalを気管内(肺内)投与した。なお、正常群(Normal)として同様に媒体(生理食塩液)を気管内投与した。
BLM投与6日後から、28日まで被験物質を投与し、生存率を比較した。被験物質として、化合物(A)(ONO-1301)の1日2回反復経口投与、化合物(A)(ONO-1301)の週1回静脈内投与、及び週1回の気管内投与を行った。また、製剤25(ONO-1301Lipo)の週1回静脈内投与、及び週1回の気管内投与を行い、生存率の比較から、製剤25(ONO-1301Lipo)のDDS効果を検討した。
2.試験群構成を表21に示した。
2.試験群構成を表21に示した。
3.被験物質投与
1)経口投与:媒体(0.5% CMC-Na水溶液)及び化合物(A)の投与(1、2群)
肺障害モデル作製6日後より媒体及び化合物(A)(3 mg/kg)を1日2回(午前と午後の投与間隔は8時間以上空けた)、23日間反復経口投与を行った。
1)経口投与:媒体(0.5% CMC-Na水溶液)及び化合物(A)の投与(1、2群)
肺障害モデル作製6日後より媒体及び化合物(A)(3 mg/kg)を1日2回(午前と午後の投与間隔は8時間以上空けた)、23日間反復経口投与を行った。
投与容量:5 mL/kg×2回/日
投与方法:ポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒及びマウス用胃ゾンデを用いて強制経口投与した。
2)静脈内投与:化合物(A)及び製剤25の投与(3、4、5群)
肺障害モデル作製6日後に投与し、その後は週1回の割合で尾静脈内投与を行った(モデル作製6、13、20、27又は28日後の計4回)。
投与容量:1.5 mL/kg
投与方法:ガラス製注射筒及びディスポーザブル注射針30Gを用いて静脈内投与した。
3)気管内投与:化合物(A)及び製剤25の投与(6、7、8、9群)
肺障害モデル作製6日後に投与し、その後は週1回の割合で気管内投与を行った(モデル作製6、13、20、27又は28日後の計4回)。なお、正常の9群(Normal)は生理食塩液を同様に投与した。
投与方法:ポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒及びマウス用胃ゾンデを用いて強制経口投与した。
2)静脈内投与:化合物(A)及び製剤25の投与(3、4、5群)
肺障害モデル作製6日後に投与し、その後は週1回の割合で尾静脈内投与を行った(モデル作製6、13、20、27又は28日後の計4回)。
投与容量:1.5 mL/kg
投与方法:ガラス製注射筒及びディスポーザブル注射針30Gを用いて静脈内投与した。
3)気管内投与:化合物(A)及び製剤25の投与(6、7、8、9群)
肺障害モデル作製6日後に投与し、その後は週1回の割合で気管内投与を行った(モデル作製6、13、20、27又は28日後の計4回)。なお、正常の9群(Normal)は生理食塩液を同様に投与した。
投与容量:0.5 mL/kg
投与方法:ペントバルビタール(30~35 mg/kg、i.p.)麻酔後、気管内(肺内)投与した。
投与方法:ペントバルビタール(30~35 mg/kg、i.p.)麻酔後、気管内(肺内)投与した。
4.結果
1)生存率の結果を図28~30に示した。
1)生存率の結果を図28~30に示した。
正常群では、死亡は認められなかった。一方、肺障害モデルの媒体の経口投与群では、生存率30 %を示した。化合物(A)の3 mg/kg経口投与群では、生存率60 %であり、媒体投与群と比較して生存率延長が認められた。化合物(A)の3 mg/kg静脈内投与群では、生存率40 %であった。製剤25の1 mg/kg及び製剤25の3 mg/kg静脈内投与群では、両群ともに生存率50 %を示した。化合物(A)の1 mg/kg気管内投与群では、生存率20 %であり、製剤25の0.3 mg/kg及び製剤25の1 mg/kg気管投与群では、生存率50 %及び40 %を示し、媒体投与群又は化合物(A)の1 mg/kg気管内投与群と比較して高い生存率を示した。
2)生存率の比較
(1)図29;製剤25(ONO-1301Lipo)の間歇静脈内投与との比較
2群の化合物(A)(ONO-1301)(3 mg/kg×2回×22日)の総投与量は132 mg/kgであった。
また、化合物(A)(ONO-1301)の3 mg/kg週1回静脈内投与(3群)での総投与量は12 mg/kgであり、製剤25の1 mg/kg週1回静脈内投与(4群)での総投与量は4 mg/kgであった。また、製剤25の3 mg/kg週1回静脈内投与(5群)での総投与量は12 mg/kgであった。
2)生存率の比較
(1)図29;製剤25(ONO-1301Lipo)の間歇静脈内投与との比較
2群の化合物(A)(ONO-1301)(3 mg/kg×2回×22日)の総投与量は132 mg/kgであった。
また、化合物(A)(ONO-1301)の3 mg/kg週1回静脈内投与(3群)での総投与量は12 mg/kgであり、製剤25の1 mg/kg週1回静脈内投与(4群)での総投与量は4 mg/kgであった。また、製剤25の3 mg/kg週1回静脈内投与(5群)での総投与量は12 mg/kgであった。
媒体群(1群)での生存率は30 %であった。化合物(A)(ONO-1301)経口投与群(2群;60 %)に比し、4群(2群の総投与量に比し1/33の投与量)及び5群(2群の総投与量比し1/11の投与量)では、生存率は同値であり、2群に比し僅かに低い生存率(50 %)を示した。一方、化合物(A)(ONO-1301)原薬での3 mg/kg週1回静脈内投与(5群)では、2群に比し1/11投与量では、さらに低い生存率(40 %)を示した。
これらの結果より、肺障害モデルにおける製剤25の週1回の静脈内投与(4群、5群)は、化合物(A)(ONO-1301)原薬の週1回静脈内投与(3群)に比し、生存率の延長作用を示し、化合物(A)(ONO-1301)原薬の1日2回反復経口投与(2群)に比し、総投与量;1/11~1/33の低用量であるにも係らず、わずかに低い生存率を示したことから、製剤25の静脈内投与は、肺疾患部位特異的にDDS効果を示していることが示唆された。
(2)図30;製剤25(ONO-1301Lipo)の間歇気管内投与との比較
2群の化合物(A)(ONO-1301)(3 mg/kg×2回×22日)の総投与量は132 mg/kgであった。
2群の化合物(A)(ONO-1301)(3 mg/kg×2回×22日)の総投与量は132 mg/kgであった。
また、化合物(A)(ONO-1301)の1 mg/kg週1回気管内投与(6群)での総投与量は4 mg/kgであり、製剤25の0.3 mg/kg週1回気管内投与(7群)での総投与量は1.2 mg/kgであった。また、製剤25の1 mg/kg週1回気管内投与(8群)での総投与量は4 mg/kgであった。
媒体投与群(1群)での生存率は30 %であった。化合物(A)(ONO-1301)経口投与群(2群;60 %)に比し、7群(2群の総投与量に比し1/110の投与量)、及び8群(2群の総投与量比し1/33の投与量)では生存率は各々50 %及び40 %を示した。
一方、化合物(A)(ONO-1301)原薬での1 mg/kg週1回静脈内投与(6群)では、2群に比し1/33投与量では、更に低い生存率(20 %)を示した。
これらの結果より、肺障害モデルにおける製剤25の週1回の気管内投与(7群、8群)は、化合物(A)(ONO-1301)原薬の週1回気管内投与(6群)に比し、生存率の延長作用を示し、化合物(A)(ONO-1301)原薬の1日2回反復経口投与群(2群)に比し、総投与量;1/110~1/33の低用量であるにも係らず、わずかに低い生存率を示したことから、製剤25の気管内投与は、肺疾患部位特異的にDDS効果を示していることが示唆された。また、製剤25の0.3 mg/kg週1回気管内投与は、製剤25の1 mg/kg及び3 mg/kg週1回静脈内投与と同じ生存率(50 %)を示したことにより、気管内投与は、静脈内投与に比しDDS効果がより大きいことが示唆された。
これらの結果より、マウスブレオマイシン誘発肺障害モデルを用いてブレオマイシン投与6日目から製剤25の週1回の間歇静脈内投与群(4、5群)及び同間歇気管内投与群(7、8群)での生存率を媒体投与群(1群)と比較検討した。尚、陽性対照として、化合物(A)(ONO-1301)の1日2回反復経口投与群(2群)を設けた。また、化合物(A)(ONO-1301)の週1回の間歇静脈内投与群(3群)及び同間歇気管内投与群(6群)を設定し、ONO-1301リポソーム製剤のDDS効果を比較検討した。
試験おいて、ブレオマイシン投与6日目から化合物(A)(ONO-1301)の3 mg/kg 1日2回反復経口投与群では、生存率の延長を示したことにより、治療効果が有ることが示唆された。
製剤25の週1回の静脈内投与(4群、5群)は、化合物(A)(ONO-1301)原薬の週1回静脈内投与群(3群)に比し、生存率の延長作用を示し、化合物(A)(ONO-1301)原薬の1日2回反復経口投与群(2群)に比し、総投与量1/11~1/33の低用量であるにも係らず、わずかに低い生存率を示したことから、製剤25の静脈内投与は、肺疾患部位特異的にDDS効果を示していることが示唆された。
製剤25の週1回の気管内投与群(7群、8群)は、化合物(A)(ONO-1301)原薬の週1回気管内投与群(6群)に比し、生存率の延長効果を示し、化合物(A)(ONO-1301)原薬の1日2回反復経口投与群(2群)に比し、総投与量1/110~1/33の低用量であるにも係らず、わずかに低い生存率を示したことから、製剤25の気管内投与は、肺疾患部位特異的にDDS効果を示していることが示唆された。また、製剤25の0.3 mg/kg週1回気管内投与は、製剤25の1 mg/kg及び3 mg/kg週1回静脈内投与と同じ生存率(50 %)を示したことにより、気管内投与は、静注投与より10倍程度、DDS効果が大きいことが示唆された。
3)自然発症拡張型心筋症(J2N-k)ハムスターにおける製剤25(ONO-1301Lipo)効果の検討
(1)試験系
製剤25、及び化合物(A)(ONO-1301)の2週間に1回間歇静注投与における自然発症拡張型心筋症(J2N-k)ハムスターモデルのDDS心機能の改善を心エコー検査による左室駆出率(以後,EF%),左室内径短縮率(以後,%FS)および組織学的評価を指標に比較検討した。
また、陽性対照として、化合物(A)(ONO-1301)の1日2回反復経口投与群を設けた。
(1)試験系
製剤25、及び化合物(A)(ONO-1301)の2週間に1回間歇静注投与における自然発症拡張型心筋症(J2N-k)ハムスターモデルのDDS心機能の改善を心エコー検査による左室駆出率(以後,EF%),左室内径短縮率(以後,%FS)および組織学的評価を指標に比較検討した。
また、陽性対照として、化合物(A)(ONO-1301)の1日2回反復経口投与群を設けた。
被験物質として、製剤25を生理食塩水により懸濁希釈して使用した。また、対照の化合物(A)(ONO-1301)は等量のNaOH水て溶解させ、生理食塩水にて希釈して使用した。化合物(A)(ONO-1301)経口投与群は0.5% CMC-Na水溶液にて懸濁投与した。
また、自然発症拡張型心筋症(J2N-k)ハムスターは、雄性、投与開始時週齢;20週齢;(日本SLC)を用い、8週間被験物質を投与し、比較検討した。
(2)群構成を表22に示す。
※:化合物(A)(ONO-1301)としての投与量。 投与液量:5mL/kg
(3) 心エコー検査
18週齢にて入荷した動物を2週間の検疫・馴化飼育期間を設け,20週齢目に群分け時の検査(試験開始日)を実施した.その後,試験開始日より4週目および8週目に検査を行い、8週目にて解剖を行った。
18週齢にて入荷した動物を2週間の検疫・馴化飼育期間を設け,20週齢目に群分け時の検査(試験開始日)を実施した.その後,試験開始日より4週目および8週目に検査を行い、8週目にて解剖を行った。
(4)解剖 および摘出組織の処理
投与開始日より8週目に最終の心エコー検査実施後,解剖を行った。
解剖は,イソフルラン麻酔下に腹部大動脈より全採血し,安楽死させた後,心臓および肺を摘出し,重量を測定した.重量測定後,左室および右室を含めて,短軸方向で約2mm間隔でApical部,Midole部およびBasal部に3分割した。
3分割した組織は,Midle部の右室と左室を含む短軸切片を4%パラホルムアルデヒド(一般病理検査用)に浸漬し保存した。
投与開始日より8週目に最終の心エコー検査実施後,解剖を行った。
解剖は,イソフルラン麻酔下に腹部大動脈より全採血し,安楽死させた後,心臓および肺を摘出し,重量を測定した.重量測定後,左室および右室を含めて,短軸方向で約2mm間隔でApical部,Midole部およびBasal部に3分割した。
3分割した組織は,Midle部の右室と左室を含む短軸切片を4%パラホルムアルデヒド(一般病理検査用)に浸漬し保存した。
(5)摘出心臓の短軸切片における左室壁厚および面積の測定
心臓摘出時に左室および右室を含めて,短軸方向で約2mm間隔でApical部,Midole部およびBasal部に3分割した.その内,Midle部の1切片に対し,写真撮像し,画像編集ソフトを用いAnterior,Lateral,Posterior,Septum部の壁厚および左室面積を求めた.左室の壁厚は,画像編集ソフトを用い,写真上のスケール1mm2のピクセル数を求め,左室壁全体を外径および内径をトレースし,それぞれのピクセル数を出し,左室面積((外形ピクセル数-内径ピクセル数)/1mm2)を求めた後,各部位の壁厚を測定した。
心臓摘出時に左室および右室を含めて,短軸方向で約2mm間隔でApical部,Midole部およびBasal部に3分割した.その内,Midle部の1切片に対し,写真撮像し,画像編集ソフトを用いAnterior,Lateral,Posterior,Septum部の壁厚および左室面積を求めた.左室の壁厚は,画像編集ソフトを用い,写真上のスケール1mm2のピクセル数を求め,左室壁全体を外径および内径をトレースし,それぞれのピクセル数を出し,左室面積((外形ピクセル数-内径ピクセル数)/1mm2)を求めた後,各部位の壁厚を測定した。
図31に測定法を記す。切片は、Apical, Middle, Basal領域を約2mm間隔で3分割した後、Middle側の1切片に対し、Anterior, Lateral, Posterior, Septum部の壁厚および左室面積を求めた。左室の壁厚は、画像編集ソフトを用い、写真上のスケール1mm2のピクセル数を求め、左室壁全体を外径および内径をトレースし、それぞれのピクセル数を出し、左室壁面積((外形ピクセル数-内径ピクセル数)/1mm2)を求めた後、各部位の壁厚を測定した。
(6) 試験結果
心エコー検査によるEF%値および%FS値の測定結果を、表23に示す。
心エコー検査によるEF%値および%FS値の測定結果を、表23に示す。
心エコー検査は,群分け時,投与開始4週目および8週目に実施した.測定は,各個体3回実施し、測定データの平均値を測定結果とした。
Control群(1群)は,群分け時,4週目および8週目のEF%値は,それぞれ42.5±3.2%,33.6±12.3%および31.5±3.5%であった.8週目のEF%値において,群わけ時のEF%値と比較して,p<0.05の有意な低下が認められた.また,%FS値では,群分け時,4週目および8週目の値は,それぞれ17.8±1.4%,13.3±6.1%および12.6±1.6%であり,EF%値と同様,8週のEF%値において,群わけ時の%FS値と比較して,有意な低下(p<0.01)が認められた。
Control群(1群)は,群分け時,4週目および8週目のEF%値は,それぞれ42.5±3.2%,33.6±12.3%および31.5±3.5%であった.8週目のEF%値において,群わけ時のEF%値と比較して,p<0.05の有意な低下が認められた.また,%FS値では,群分け時,4週目および8週目の値は,それぞれ17.8±1.4%,13.3±6.1%および12.6±1.6%であり,EF%値と同様,8週のEF%値において,群わけ時の%FS値と比較して,有意な低下(p<0.01)が認められた。
化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgx2回/日の反復経口投与群(4群)は,群分け時,4週目および8週目のEF%値は,それぞれ43.0±7.8%,40.4±14.9%および40.3±9.2%であり,群分け時に比較して,4週目,8週目の数値において,有意な心機能の低下は認められなかった.8週目のEF%値はControl群のそれと比較して,高値を示し,有意差(p<0.05)な効果が認められた。また,%FS値では,群分け時,4週目および8週目の値は,それぞれ18.2±3.9%,17.2±7.2%および17.1±4.5%を示し,EF%値と同様の結果を示した。
化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの静脈内投与群(3群)は,群分け時,4週目および8週目のEF%値は,それぞれ38.8±4.3%,35.7±7.4%および30.8±2.9%であった。この結果は,Control群と比較し,4週目の低下は緩徐であったが,8週目の結果では,Control群と同程度の低下を認めた。この8週目のEF%値は,群分け時の値に比較し,有意な低下(p<0.01)であった。また,%FS値では,群分け時,4週目および8週目の値は,それぞれ16.0±2.1%,16.1±3.1%および12.3±1.3%であった.この結果は,EF%値とほぼ同様の結果を示したことから,有効性は確認できなかった。
一方,製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kgの静脈内投与群(2群)では,群分け時,4週目および8週目のEF%値は,それぞれ40.5±5.1%,44.5±9.9%および39.6±4.1%であった。4週目において有意差は認められなかったが,軽度の増加を示し,8週目においては,化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの経口投与群のそれと比較して,同程度の低下抑制が認められ,Control群と比較して有意(p<0.05)な高値を示した.また,%FS値では,群分け時,4週目および8週目の値は,それぞれ16.9±2.6%,18.5±4.9%および16.5±2.1%を示し,EF%値の変動とほぼ同様の結果を示し,8週目の結果においてContol群(1群)のそれと比較し,有意(p<0.01)な効果が認められ,その効果は,化合物(A)(ONO-1301)反復経口投与群(4群)とほぼ同等であった。
2.摘出心臓の壁厚測定結果(Midle部短軸切片での評価)
壁厚測定結果を表24に示す。
表24に示すごとく,Control群(1群)のMidle部切片のApical,Lateral,PosteriorおよびSeptumの壁厚は,それぞれ0.8±0.1mm,1.1±0.2mm,1.1±0.2mmおよび1.0±0.2mmであった。
化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの経口投与群(4群)では,Midle部切片のApical,Lateral,PosteriorおよびSeptumの壁厚は,それぞれ1.4±0.5mm,1.5±0.2mm,1.2±0.4mmおよび1.5±0.3mmであった.Apical,LateralおよびSeptumにおいては,Control群のそれと比較し,有意(p<0.05)な高値を示した。
化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの静脈内投与群(3群)では,1.1±0.6mm,1.2±0.3mm,1.2±0.2mmおよび1.0±0.3mmであった。この結果は,Control群とほぼ同様の測定結果であった。
一方,製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kgの静脈内投与群(2群)では,1.7±0.4mm** 1.5±0.1mm* 1.5±0.6mm†1.2±0.3mmであった. この結果はControl群のそれと比較して,Apical(p<0.01),Lateral(p<0.05)およびPosterior(0.05<p<0.1)において有意な高値および高値を示す傾向が認められた。
壁厚測定結果を表24に示す。
表24に示すごとく,Control群(1群)のMidle部切片のApical,Lateral,PosteriorおよびSeptumの壁厚は,それぞれ0.8±0.1mm,1.1±0.2mm,1.1±0.2mmおよび1.0±0.2mmであった。
化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの経口投与群(4群)では,Midle部切片のApical,Lateral,PosteriorおよびSeptumの壁厚は,それぞれ1.4±0.5mm,1.5±0.2mm,1.2±0.4mmおよび1.5±0.3mmであった.Apical,LateralおよびSeptumにおいては,Control群のそれと比較し,有意(p<0.05)な高値を示した。
化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの静脈内投与群(3群)では,1.1±0.6mm,1.2±0.3mm,1.2±0.2mmおよび1.0±0.3mmであった。この結果は,Control群とほぼ同様の測定結果であった。
一方,製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kgの静脈内投与群(2群)では,1.7±0.4mm** 1.5±0.1mm* 1.5±0.6mm†1.2±0.3mmであった. この結果はControl群のそれと比較して,Apical(p<0.01),Lateral(p<0.05)およびPosterior(0.05<p<0.1)において有意な高値および高値を示す傾向が認められた。
3.摘出心臓の左室壁面積測定結果(Midle部短軸切片での評価)
左室面積測定結果を表25に示す。
表25に示すごとく,Control群(1群),化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg経口投与群(4群),化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg静脈内投与群(3群)および製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kg静脈内投与群(2群)の左室壁面積の測定結果は,それぞれ23.4±5.4mm2,26.4±4.3mm2,23.9±4.5mm2および29.5±6.4mm2であった.この測定結果は,有意差は認められなかったが,壁厚測定結果を反映して,Control群(1群)および化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg静脈内投与群(3群)で低値を,化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg経口投与群(4群)および製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kg静脈内投与群(4群)で高値を示す傾向が認められた。
左室面積測定結果を表25に示す。
表25に示すごとく,Control群(1群),化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg経口投与群(4群),化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg静脈内投与群(3群)および製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kg静脈内投与群(2群)の左室壁面積の測定結果は,それぞれ23.4±5.4mm2,26.4±4.3mm2,23.9±4.5mm2および29.5±6.4mm2であった.この測定結果は,有意差は認められなかったが,壁厚測定結果を反映して,Control群(1群)および化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg静脈内投与群(3群)で低値を,化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg経口投与群(4群)および製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kg静脈内投与群(4群)で高値を示す傾向が認められた。
以上のごとく,自然発症拡張型心筋症(J2N-k)ハムスターを用い製剤25(ONO-1301Lipo)の心機能改善効果の検討を行った。試験は,病態発症後、心機能の低下が顕著に現れる20週齢より開始し28週目まで被験物質を投与し、心機能変化を検討した。
心エコー測定によるEF%および%FSを指標とした心機能評価では,Control群(1群)および化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg静脈内投与群(3群)に比較し,化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgx2回/日の反復経口投与群(4群)、および群分け時,2週目,4週目,6週目の計4回,静脈内投与を間歇投与した製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kg群(2群)で,心機能低下の抑制効果が認められた。 この結果は,左室のWall Thicknessの測定結果におけるControl群(1群)および化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg静脈内投与群(3群)で菲薄化が進んだと思われる低値を示し,化合物(A)(ONO-1301):3.0mg/kgの反復経口投与群(4群)および製剤25(ONO-1301Lipo):3.0mg/kg群(2群)では,Control群(1群)および化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kg静脈内投与群(3群)に比較して,高値を示し,菲薄化の進行を抑制していることが示唆された。その事が心エコー測定によるEF%値および%FS値の結果を反映していると考えられた。
以上のことから,化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの1日2回、反復経口投与群(4群)および製剤25(ONO-1301LipoNS):3.0mg/kgの2週に1回、間歇静注投与群(2群)において,自然発症拡張型心筋症(J2N-k)ハムスターにおける心機能の低下を抑制することが示唆された。
尚,化合物(A)(ONO-1301)反復経口投与は,3mg/kgx2回x56日で総投与量は計336mg/kgであった.また,製剤25(ONO-1301Lipo)静注投与は,3mg/kgx4回で総投与量は計12mg/kgで同等の有効性を示した。また、化合物(A)(ONO-1301)の2週間に1回、3mg/kg間歇静注投与では効果を示さなかった。よって,製剤25(ONO-1301Lipo)の2週間に1回、間歇静注投与は,化合物(A)(ONO-1301)反復経口投与に比し,1/28投与にて同等の効果を認めたことから,製剤25(ONO-1301Lipo)静注投与のDDS効果が確認された。
表26、および表27には、群分け時及び解剖時の体重変化、及び解剖時の心臓重量および肺重量を示した。これらはいずれも変化は認められなかった。
以上のことから,化合物(A)(ONO-1301): 3.0mg/kgの1日2回、反復経口投与群(4群)および製剤25(ONO-1301LipoNS):3.0mg/kgの2週に1回、間歇静注投与群(2群)において,自然発症拡張型心筋症(J2N-k)ハムスターにおける心機能の低下を抑制することが示唆された。
尚,化合物(A)(ONO-1301)反復経口投与は,3mg/kgx2回x56日で総投与量は計336mg/kgであった.また,製剤25(ONO-1301Lipo)静注投与は,3mg/kgx4回で総投与量は計12mg/kgで同等の有効性を示した。また、化合物(A)(ONO-1301)の2週間に1回、3mg/kg間歇静注投与では効果を示さなかった。よって,製剤25(ONO-1301Lipo)の2週間に1回、間歇静注投与は,化合物(A)(ONO-1301)反復経口投与に比し,1/28投与にて同等の効果を認めたことから,製剤25(ONO-1301Lipo)静注投与のDDS効果が確認された。
表26、および表27には、群分け時及び解剖時の体重変化、及び解剖時の心臓重量および肺重量を示した。これらはいずれも変化は認められなかった。
4)ラット冠動脈完全結紮による虚血モデルに対する製剤25(ONO-1301LipoNS)の単回静脈内投与における効果の検討
製剤25(ONO-1301Lipo)、及び化合物(A)(ONO-1301)の間歇静脈内投与における虚血性心疾患に対する心機能の改善および心不全に伴う致死防御効果を心エコー検査による左室駆出率(以後,EF%),左室内径短縮率(以後,%FS)および病理学的評価を指標に検討した.。
製剤25(ONO-1301Lipo)、及び化合物(A)(ONO-1301)の間歇静脈内投与における虚血性心疾患に対する心機能の改善および心不全に伴う致死防御効果を心エコー検査による左室駆出率(以後,EF%),左室内径短縮率(以後,%FS)および病理学的評価を指標に検討した.。
(1)心筋虚血モデルの作製
雄性Sprague-Dawley 系ラット(日本クレア;入手時6週齢)をミダゾラム(ドルミカム注射液10mg;astellas)0.5mg/kgとキシラジン(セラクタール2%注射液;バイエル薬品(株))2mg/kgの混液にて麻酔を施した後,尾静脈動物を確保し,フ゜ロホ゜フォール(1%テ゛ィフ゜リハ゛ン注;アストラゼネカ(株))6~10mg/kg/hrをシリンシ゛ホ゜ンフ゜(テルフューシ゛ョンTE-3310N;テルモ)を用いて持続注入し、深麻酔維持する。次いで、気管カニューレ(外径2.0mmカットダウンカテーテル;JMS製)を挿管・留置し,人工呼吸器(小動物用;シナノ製作所)を連結させ、Stroke volume 1mL/100g/Stroke(±1mL), Stroke数70回/min(±10回)で呼吸を維持させた。その後,左胸部を上方に向くように背位固定から横臥位に固定し、第3~4もしくは第4~5肋間の表皮ならびに筋肉層を外科用尖刀で切開した. そして、胸腔内に達したことを確認し、開胸器を用いて肋間を広げ左心耳から前下行枝部(以後,LAD)が正面に直視できる状態を確保した。
その後、半透明の薄い心膜をピンセットで除去し,心筋を露出させた。その後、マイクロ持針器にて左心耳辺縁に位置するLADを6-0もしくは7-0針付きナイロン糸で2~3mmの深さで刺入・確保し,LADを完全結紮した。 その後,筋肉層および表皮を4-0もしくは5-0ナイロン糸にて縫合・閉胸する.閉胸後,処置部にセファメジン50mgを皮下投与し,処置を終了した。
雄性Sprague-Dawley 系ラット(日本クレア;入手時6週齢)をミダゾラム(ドルミカム注射液10mg;astellas)0.5mg/kgとキシラジン(セラクタール2%注射液;バイエル薬品(株))2mg/kgの混液にて麻酔を施した後,尾静脈動物を確保し,フ゜ロホ゜フォール(1%テ゛ィフ゜リハ゛ン注;アストラゼネカ(株))6~10mg/kg/hrをシリンシ゛ホ゜ンフ゜(テルフューシ゛ョンTE-3310N;テルモ)を用いて持続注入し、深麻酔維持する。次いで、気管カニューレ(外径2.0mmカットダウンカテーテル;JMS製)を挿管・留置し,人工呼吸器(小動物用;シナノ製作所)を連結させ、Stroke volume 1mL/100g/Stroke(±1mL), Stroke数70回/min(±10回)で呼吸を維持させた。その後,左胸部を上方に向くように背位固定から横臥位に固定し、第3~4もしくは第4~5肋間の表皮ならびに筋肉層を外科用尖刀で切開した. そして、胸腔内に達したことを確認し、開胸器を用いて肋間を広げ左心耳から前下行枝部(以後,LAD)が正面に直視できる状態を確保した。
その後、半透明の薄い心膜をピンセットで除去し,心筋を露出させた。その後、マイクロ持針器にて左心耳辺縁に位置するLADを6-0もしくは7-0針付きナイロン糸で2~3mmの深さで刺入・確保し,LADを完全結紮した。 その後,筋肉層および表皮を4-0もしくは5-0ナイロン糸にて縫合・閉胸する.閉胸後,処置部にセファメジン50mgを皮下投与し,処置を終了した。
(2) 群構成を表28に示す。
(3)心エコー検査
心エコー検査は,左室駆出率(以後,EF%)を指標に被験物質における心機能の改善効果を確認する目的で実施した。
検査は,モデル作製後23時間後(群わけのための検査)に行い,EF%値が正常動物の25%以上低下した動物を選択し,群分けを行い、被験物質投与溶液は,モデル作製後24時間後に尾静脈内投与を行った。以後,被験物質投与後7日および14日後に心エコー検査を行った。
(4)解剖 および摘出組織の処理
被験物質投与後14日目の心エコー検査終了後に解剖を行った。解剖は,イソフルラン麻酔下に腹部大動脈より全採血し,安楽死させた後,心臓を摘出し,心重量を測定した。心重量測定後,梗塞領域を左室および右室を含めて,短軸に3分割した。
心エコー検査は,左室駆出率(以後,EF%)を指標に被験物質における心機能の改善効果を確認する目的で実施した。
検査は,モデル作製後23時間後(群わけのための検査)に行い,EF%値が正常動物の25%以上低下した動物を選択し,群分けを行い、被験物質投与溶液は,モデル作製後24時間後に尾静脈内投与を行った。以後,被験物質投与後7日および14日後に心エコー検査を行った。
(4)解剖 および摘出組織の処理
被験物質投与後14日目の心エコー検査終了後に解剖を行った。解剖は,イソフルラン麻酔下に腹部大動脈より全採血し,安楽死させた後,心臓を摘出し,心重量を測定した。心重量測定後,梗塞領域を左室および右室を含めて,短軸に3分割した。
(5)試験結果
(1)心エコー検査によるEF%値の測定結果
心エコー検査結果を表29および表30に示す。
表29に示すごとく,正常動物におけるEF%値は,85.0±1.9%(n=4)であった.各群のLAD完全結紮23時間後の被験物質投与前EF%値は,Control群で52.8±6.8%(n=5)で,製剤25(ONO-1301Lipo)の0.3mg/kg,1.0 mg/kgおよび3.0mg/kg投与群では,それぞれ55.1±2.4%(n=5),55.0±4.1%(n=5)および54.7±5.2%(n=5)であった。また,化合物(A)(ONO-1301)の3mg/kg投与群は,56.7±5.5%(n=5)であった。
正常動物のEF%値に対する各群の被験物質投与前EF%値は,全ての群で有意(p<0.01)な低下を示し,各群間差において,有意差は認められなかった。
表29に示すごとく,各群の投与後7日目および14日目のEF%値の変化は,Control群では,投与前EF%値52.8±6.8%(n=5)に対し,それぞれ48.9±4.0%および39.0±5.2%と経日的に低下を示し,2週間後のEF%値では,投与前値と比較して有意(p< 0.05)低下を示した。
一方,製剤25(ONO-1301LipoNS)では,0.3mg/kg投与群で投与前EF%値55.1± 2.4%(n=5)に対し,それぞれ50.7±6.2%および42.0±6.2%と,Control群と同程度の変化を示し,14日目のEF%値においてもControl群と同様,投与前値と比較して有意(p< 0.05)低下を示した。
1.0mg/kg投与群では,投与前EF%値55.0±4.1%(n=5)に対し,それぞれ53.6±7.5%および54.7±8.2%と,投与前EF%値と同程度であった.14日目の EF%値はControl群のそれと比較して,p<0.05)の有意な増加を示した。
3.0mg/kg投与群では,投与前EF%値54.7±5.2%(n=5)に対し,それぞれ62.4±8.7%および58.2±13.2%と,投与前EF%値と比較して投与後7日目をピークとして増加を示し,心機能の改善効果が認められた.その被験物質投与後7日目および14日目のEF%値はControl群のそれと比較して,それぞれp<0.05)およびp<0.01の有意な低下抑制を示した。
また,化合物(A)(ONO-1301)の3.0mg/kg投与群では,投与前EF%値56.7±5.5% (n=5)に対し,それぞれ54.6±8.8%および53.2±7.1%と,投与前EF%値と比較して,低下傾向を示したが,有意な差は認められなかった.しかしながら,Control群の7日目および14日目と比較した結果,ともに有意差は認められなかった。
(1)心エコー検査によるEF%値の測定結果
心エコー検査結果を表29および表30に示す。
表29に示すごとく,正常動物におけるEF%値は,85.0±1.9%(n=4)であった.各群のLAD完全結紮23時間後の被験物質投与前EF%値は,Control群で52.8±6.8%(n=5)で,製剤25(ONO-1301Lipo)の0.3mg/kg,1.0 mg/kgおよび3.0mg/kg投与群では,それぞれ55.1±2.4%(n=5),55.0±4.1%(n=5)および54.7±5.2%(n=5)であった。また,化合物(A)(ONO-1301)の3mg/kg投与群は,56.7±5.5%(n=5)であった。
正常動物のEF%値に対する各群の被験物質投与前EF%値は,全ての群で有意(p<0.01)な低下を示し,各群間差において,有意差は認められなかった。
表29に示すごとく,各群の投与後7日目および14日目のEF%値の変化は,Control群では,投与前EF%値52.8±6.8%(n=5)に対し,それぞれ48.9±4.0%および39.0±5.2%と経日的に低下を示し,2週間後のEF%値では,投与前値と比較して有意(p< 0.05)低下を示した。
一方,製剤25(ONO-1301LipoNS)では,0.3mg/kg投与群で投与前EF%値55.1± 2.4%(n=5)に対し,それぞれ50.7±6.2%および42.0±6.2%と,Control群と同程度の変化を示し,14日目のEF%値においてもControl群と同様,投与前値と比較して有意(p< 0.05)低下を示した。
1.0mg/kg投与群では,投与前EF%値55.0±4.1%(n=5)に対し,それぞれ53.6±7.5%および54.7±8.2%と,投与前EF%値と同程度であった.14日目の EF%値はControl群のそれと比較して,p<0.05)の有意な増加を示した。
3.0mg/kg投与群では,投与前EF%値54.7±5.2%(n=5)に対し,それぞれ62.4±8.7%および58.2±13.2%と,投与前EF%値と比較して投与後7日目をピークとして増加を示し,心機能の改善効果が認められた.その被験物質投与後7日目および14日目のEF%値はControl群のそれと比較して,それぞれp<0.05)およびp<0.01の有意な低下抑制を示した。
また,化合物(A)(ONO-1301)の3.0mg/kg投与群では,投与前EF%値56.7±5.5% (n=5)に対し,それぞれ54.6±8.8%および53.2±7.1%と,投与前EF%値と比較して,低下傾向を示したが,有意な差は認められなかった.しかしながら,Control群の7日目および14日目と比較した結果,ともに有意差は認められなかった。
4.心エコー検査による %FS値の測定結果
表29に示すごとく,正常動物における%FS値は,49.4±2.4%(n=4)であった.各群のLAD完全結紮後約23時間の被験物質投与前%FS値は,Control群で23.9±3.7%(n=5)で,製剤25(ONO-1301Lipo)の0.3mg/kg,1.0 mg/kgおよび3.0mg/kg投与群では,それぞれ25.0±1.7%(n=5),25.8±2.4%(n=5)および25.0±3.0%(n=5)であった。また,化合物(A)(ONO-1301)の3mg/kg投与群は,26.5±3.7%(n=5)であった.通常,%FS値は臨床上では28%以上が正常と言われており,全群で軽度ではあるものの,それを下回っていた。
正常動物のEF%値に対する各群の被験物質投与前%FS値は,全ての群で有意(p<0.01)な低下を示し,各群間差において,有意差は認められなかった。
表30に示すごとく,各群の投与後7日目および14日目の%FS値の変化は,Control群では,投与前 %FS値23.9±3.7%(n=5)に対し,それぞれ21.8± 2.2%および16.7±2.7%と経日的に低下を示し,2週間後の%FS値では,EF%値と同様に投与前値と比較してp< 0.05の有意な低下を示した。
一方,製剤25(ONO-1301Lipo)では,0.3mg/kg投与群で投与前 %FS値25.0±1.7%(n=5)に対し,それぞれ22.9±3.4%および18.4±3.2%と,Control群と同程度の変化を示し,14日目の%FS値においてもControl群と同様,投与前値と比較して有意(p< 0.05)低下を示した。
1.0mg/kg投与群では,投与前%FS値25.8±2.4%(n=5)に対し,それぞれ24.8±4.2%および25.4±5.0%と,投与前FS%値と同程度であった。
3.0mg/kg投与群では,投与前%FS値25.0±3.0%(n=5)に対し,それぞれ30.1±5.4%および27.9±8.5%と,投与前 %FS値と比較して投与後7日目をピークとして増加を示した.その被験物質投与後7日目および14日目の %FS値はControl群のそれと比較して,ともにp<0.05)の有意な増加を示した。
また,化合物(A)(ONO-1301)の3.0mg/kg投与群では,投与前 %FS値26.5±3.7% (n=5)に対し,それぞれ25.4±5.6%および24.5±4.4%と,投与前 %FS値と比較して,低下傾向を示したが,有意な差は認められなかった。しかしながら,Control群の7日目および14日目と比較した結果,ともに有意差は認められなかった。
以上のごとく,心機能評価の指標である,EF%値および %FS値は各群で相関した測定結果が認められ,製剤25(ONO-1301LipoNS)の1.0mg/kgおよび3.0mg/kgの単回静脈内投与により,心機能の改善効果のある事が認められた。
表29に示すごとく,正常動物における%FS値は,49.4±2.4%(n=4)であった.各群のLAD完全結紮後約23時間の被験物質投与前%FS値は,Control群で23.9±3.7%(n=5)で,製剤25(ONO-1301Lipo)の0.3mg/kg,1.0 mg/kgおよび3.0mg/kg投与群では,それぞれ25.0±1.7%(n=5),25.8±2.4%(n=5)および25.0±3.0%(n=5)であった。また,化合物(A)(ONO-1301)の3mg/kg投与群は,26.5±3.7%(n=5)であった.通常,%FS値は臨床上では28%以上が正常と言われており,全群で軽度ではあるものの,それを下回っていた。
正常動物のEF%値に対する各群の被験物質投与前%FS値は,全ての群で有意(p<0.01)な低下を示し,各群間差において,有意差は認められなかった。
表30に示すごとく,各群の投与後7日目および14日目の%FS値の変化は,Control群では,投与前 %FS値23.9±3.7%(n=5)に対し,それぞれ21.8± 2.2%および16.7±2.7%と経日的に低下を示し,2週間後の%FS値では,EF%値と同様に投与前値と比較してp< 0.05の有意な低下を示した。
一方,製剤25(ONO-1301Lipo)では,0.3mg/kg投与群で投与前 %FS値25.0±1.7%(n=5)に対し,それぞれ22.9±3.4%および18.4±3.2%と,Control群と同程度の変化を示し,14日目の%FS値においてもControl群と同様,投与前値と比較して有意(p< 0.05)低下を示した。
1.0mg/kg投与群では,投与前%FS値25.8±2.4%(n=5)に対し,それぞれ24.8±4.2%および25.4±5.0%と,投与前FS%値と同程度であった。
3.0mg/kg投与群では,投与前%FS値25.0±3.0%(n=5)に対し,それぞれ30.1±5.4%および27.9±8.5%と,投与前 %FS値と比較して投与後7日目をピークとして増加を示した.その被験物質投与後7日目および14日目の %FS値はControl群のそれと比較して,ともにp<0.05)の有意な増加を示した。
また,化合物(A)(ONO-1301)の3.0mg/kg投与群では,投与前 %FS値26.5±3.7% (n=5)に対し,それぞれ25.4±5.6%および24.5±4.4%と,投与前 %FS値と比較して,低下傾向を示したが,有意な差は認められなかった。しかしながら,Control群の7日目および14日目と比較した結果,ともに有意差は認められなかった。
以上のごとく,心機能評価の指標である,EF%値および %FS値は各群で相関した測定結果が認められ,製剤25(ONO-1301LipoNS)の1.0mg/kgおよび3.0mg/kgの単回静脈内投与により,心機能の改善効果のある事が認められた。
梗塞面積評価法
切片は,Apical部を除き,Midle領域を約 2mm間隔で 2 分割した後,Apical側とBasals側の2切片に対し,梗塞面積を求めた.梗塞面積評価は,左室面積全体に対する梗塞領域の割合および左室外径に対する正常領域と梗塞領域の長さの比率で評価した。
梗塞面積評価法を図32に示す。切片は、Apical部を除き、Middle領域を約2mm間隔で2分割した後、Apical側とBasal側の2切片に対し、梗塞面積を求めた。梗塞面積評価は、左室壁面積全体に対する梗塞壁領域の割合および左室外径に対する正常領域と梗塞領域の長さの比率で評価した。
切片は,Apical部を除き,Midle領域を約 2mm間隔で 2 分割した後,Apical側とBasals側の2切片に対し,梗塞面積を求めた.梗塞面積評価は,左室面積全体に対する梗塞領域の割合および左室外径に対する正常領域と梗塞領域の長さの比率で評価した。
梗塞面積評価法を図32に示す。切片は、Apical部を除き、Middle領域を約2mm間隔で2分割した後、Apical側とBasal側の2切片に対し、梗塞面積を求めた。梗塞面積評価は、左室壁面積全体に対する梗塞壁領域の割合および左室外径に対する正常領域と梗塞領域の長さの比率で評価した。
その結果、製剤25の3mg/kg投与群において、有意に左室面積全体に対する梗塞面積比、及び左室外径領域における梗塞領域比が有意に低下していた(表32、表33)。
これらの結果から、製剤25は、梗塞面積の低下を示し、効果を発揮していることが確認された。一方、化合物(A)(ONO-1301)の3mg/kgでは効果を示さなかったことから、製剤25はDDS効果を示すことが示唆された。
製剤25(ONO-1301Lipo)単回静脈内投与により、ラット心臓虚血モデルの病態発症を用量相関的に抑制し、製剤25;3mg/kg投与では、Preに比し改善効果を示した。一方、化合物(A)(ONO-1301)原薬の3mg/kg単回静脈内投与は、製剤25の1mg/kgと同様の抑制効果を示したが、梗塞面積の抑制効果は認められなかった。
これらの結果から、製剤25はDDS効果を示すことが確認された。
Claims (13)
- プロスタグランジンI2受容体作動薬を封入するステルス型リポソームを含有する疾患部位特異的治療用医薬組成物。
- 前記プロスタグランジンI2受容体作動薬として、下記一般式(I)の化合物またはその塩を少なくとも含む、請求項1に記載の医薬組成物
R1は、水素原子またはC1~4アルキル基を表わし、
R2は、(i)水素原子、(ii)C1~8アルキル基、(iii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iv)窒素原子1個を含む4~7員単環、(v)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(vi)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
R3は、(i)C1~8アルキル基、(ii)フェニル基またはC4~7シクロアルキル基、(iii)窒素原子1個を含む4~7員単環、(iv)ベンゼン環またはC4~7シクロアルキル基で置換されているC1~4アルキル基、または(v)窒素原子1個を含む4~7員単環で置換されているC1~4アルキル基を表わし、
eは、3~5の整数を表わし、
fは、1~3の整数を表わし、
pは、1~4の整数を表わし、
qは、1または2を表わし、
rは、1~3の整数を表わす
(ただし、
-(CH2)p-および=CH-(CH2)s-は、環上のaまたはbの位置に結合し、かつ
R2およびR3中の環構造は、1~3個のC1~4アルキル基、C1~4アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基またはトリハロメチル基で置換されていてもよい)。 - プロスタグランジンI2受容体作動薬として、以下の化合物(B)~化合物(E)のいずれか一種またはその塩を少なくとも含む、請求項1記載の医薬組成物:
(B)(±)-(1R,2R,3aS,8bS)-2,3,3a,8b-テトラヒドロ-2-ヒドロキシ-1-[(E)-(3S,4RS)-3-ヒドロキシ-4-メチル-1-オクテン-6-イニル]-1H-シクロペンタ[b]ベンゾフラン-5-ブタン酸ナトリウム塩(ベラプロスト)、又はその誘導体であるカルバサイクリン系PGI2誘導体、
(C)[4-[(5,6-ジフェニルピラジニル)(1-メチレチル)アミノ]ブトキシ]-酢酸(MRE-269)、
(D)(2E)‐7‐{(1R,2R,3R)‐3‐ハイドロキシ‐2‐[(1E ,3
S ,5S )‐3‐ハイドロキシ‐5‐メチルノン‐1‐エン‐1‐イル]‐5‐オキシシクロペンチル}ヘプト‐2‐エノイック酸(リマプロスト)、オルノプロスチル、エン
プロスチル若しくはミソプロストール、又はそれらの誘導体であるPGE誘導体、及び
(E)2-{4-[(5,6-ジフェニルピラジン-2-イル)(プロパン-2-イル)アミノ] ブトキシ}-N-(メタンスルフォニル)アセトアミド(NS-304;セレキシパグ)。 - プロスタグランジンI2受容体作動薬として、ONO-1301、ベラプロスト、リマプロスト及びNS-304からなる群より選択される少なくとも一種を少なくとも含む、請求項1記載の医薬組成物。
- 前記ステルス型リポソームが、プロスタグランジンI2受容体作動薬とリン脂質とを少なくも用いて、バンガム法、水和分散法、逆相蒸発法、エタノール注入法若しくはエタノール希釈法、ホモジナイゼイション法若しくはメカノケミカル法、直接分散法、エクスト
ルーダー法若しくはフレンチプレス法、リモートローディング法、脱水―再水和法、凍結融解法、超音波法、脂質―化合物フィルム法、又はこれらの改良法により得られうる、請求項1~5のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記ステルス型リポソームが、
平均粒子径50~200nmであり、かつ
プロスタグランジンI2受容体作動薬1重量部に対して、5~50重量部のリン脂質及び0.05~5重量部のPEG修飾ホスホエタノールアミンを含有する、
請求項1~6のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記ステルス型リポソームが、
プロスタグランジンI2受容体作動薬1重量部に対して、MPEG2000-DSPEを0.05~5重量部含有し、かつ
プロスタグランジンI2受容体作動薬としてONO-1301、ベラプロスト、リマプロスト及びNS-304からなる群より選択される少なくとも一種を含有し、かつ
3時間~4週間にわたって前記プロスタグランジンI2受容体作動薬を放出する、
請求項1~7のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記ステルス型リポソームが、
プロスタグランジンI2受容体作動薬と、
リン脂質と、
PEG修飾ホスホエタノールアミンと、
水混和性有機溶媒と
を含み、かつ
ステロール類を含まず、下記工程(1)~(8)を含む製造方法により得られうるものであり、
(1)プロスタグランジンI2受容体作動薬1mg当たり、リン脂質が5mg以上、かつPEG修飾ホスホエタノールアミンが0.05mg以上となるようにこれらを溶媒に混合する工程、
(2)工程(1)で得られた混合物を加熱し、溶解物を調製する工程、
(3)工程(2)で得られた溶解物を瞬時に凍結する工程、
(4)工程(3)で得られた凍結物を凍結乾燥し溶媒を除去する工程、
(5)工程(4)で得られた凍結乾燥物を加温してリン酸緩衝水溶液に分散する工程、
(6)工程(5)で得られた分散物をエクストルーダーによりサイジングする工程、
(7)工程(6)で得られた分散物を限外濾過することにより未封入物を除去する工程、(8)工程(7)で得られた分散物に糖類を加えて凍結乾燥する工程、かつ
リポソーム内にリン脂質1.0mgあたり0.001mg以上のプロスタグランジンI2受容体作動薬を含み、
平均粒子径が50~200nmである、
請求項1~8のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 静脈内投与用、冠動脈内投与用、吸入用、筋注投与用、皮下投与用、経口投与用、経粘膜投与用及び経皮投与用または臓器用の注射用製剤、経口剤、吸入剤、ネブライザー、軟膏剤、貼付剤またはスプレー剤である、請求項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 1回あたりの静脈内投与量がプロスタグランジンI2受容体作動薬として、0.001~100mgである、請求項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 治療対象疾患が、リポソームを含有してなる循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、消化器系疾患、骨疾患、神経変性疾患、血管系疾患、歯科疾患、眼疾患、皮膚疾患等の炎症性疾患、虚血性臓器障害、糖尿病性合併症、組織線維性疾患、組織変性疾患又は脱毛である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 治療対象疾患が、リポソームを含有してなる虚血性及び拡張型心筋症、閉塞性動脈硬化症、血管炎症候群、弁膜症、大動脈弁狭窄症、慢性心不全、拡張不全等の循環器系疾患、肺高血圧症、肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患等の呼吸器系肺疾患、慢性腎臓病、慢性肝炎、慢性膵炎等の消化器系・泌尿器系疾患、及び脳梗塞慢性期、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症等の神経変性疾患である、請求項11に記載の医薬組成物。
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