WO2019095082A1 - Bacteria lactococcus lactis transformada, productora de interferon gamma (ifng) de salmo salar, alimento y composicion que la comprende, para inmunoestimular especies acuicolas - Google Patents

Bacteria lactococcus lactis transformada, productora de interferon gamma (ifng) de salmo salar, alimento y composicion que la comprende, para inmunoestimular especies acuicolas Download PDF

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fish
bacterium
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Mario Cesar Gerardo TELLO REYES
Alvaro Eugenio SANTIBAÑEZ VARGA
Mick Philippe PARRA MARDONEZ
Diego Enrique PAINE CABRERA
Claudia Andrea ZAPATA ROJAS
Andrea Del Pilar GARCES FERNANDEZ
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Universidad De Santiago De Chile
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Definitions

  • the present invention is within the technical field of aquaculture, particularly, the invention relates to a particular solution for the prevention and treatment of bacterial diseases through a Lactococcus lactis lactic acid bacterium transformed to produce an Interferon type II immunostimulant clitoqulna ( IFN II), particularly interferon gamma (IFNg or IFNy).
  • IFN II Interferon type II immunostimulant clitoqulna
  • IFNg or IFNy interferon gamma
  • This transformed bacterium has been deposited the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources of INIA access number RGM 2416 dated October 22, 2017.
  • the Invention is related to a feed for nimostimulant aquaculture species comprising the lactic bacteria transformed with IFN type II of salmonids. It also relates to the method of preparing said probiotic food, to the method of preparing said bacterium lactic acid expressing IFNg, that is, producing a cytokine stimulating the immune response antibacterial.
  • the interferons are a group of clots originally discovered for their antiviral properties (Isaacs and Llndenmann, 1957). In mammals, these clitoqulnas can be classified into three families according to their homology, receptors, structure and function (Pestka et al., 2004).
  • the interferons of type I and II are families of multiple genes (17 types I and 4 of type II) strongly induced by viruses, playing a preponderant role in the control of viral infections (Lazear et al., 2015, McNab et al. ., 2015, Teljaro, 2016).
  • the interferon type II or Interferon gamma is an immunoregulatory cell encoded by a single gene, produced mainly by activated NK and T cells, although it is also secreted by B cells and antigen presenting cells (APC).
  • interferon I is effective against pathogens of economic importance such as IPNV, IHNV, ISAV and SAV (Chang et al., 2014, 2016, Robertsen et al., 2003, Salnt-Jean and Pérez -Prleto, 2006, Sun and others, 2011, Svlngerud et al., 2012, 2013, Xu et al., 2010).
  • interferon I also stimulates adaptive immunity, increasing immuno-stimulation mediated by DNA vaccines (Chang et al., 2015).
  • IFN As in humans, IFN (s) have the potential to be used as a therapeutic or prophylactic treatment against viral pathogens of salmon culture.
  • the application of these cytokines has been little stable in aquaculture, due to the lack of a delivery vehicle, compatible with the physiology of the fish that makes its use effective.
  • the present invention develops an oral immunostimulant bacterium to stimulate in a non-specific form the innate immune response against infections of bacterial origin, both for intracellular and extracellular pathogens.
  • the present invention demonstrates that salmon IFN gamma (IFNg) is a cytokine that provides protection against bacterial infections in salmonids from the activation of genes that favor the cellular and humoral immune response of fish.
  • IFNg salmon IFN gamma
  • the mucosal expression of this immunostimulant cytokine using a lactic acid bacterium as delivery vehicle, provides a protective effect in individuals against bacterial infections.
  • lactic acid bacteria have emerged as a feasible vehicle for the in situ release of cytokines and blocky peptides within the gastrointestinal tract of mammals (Bahey-EI-DIn et al., 2010; Steldler et al. ., 2009).
  • the alpha interferons (Bayat et al., 2014, Ma et al., 2014, Zhang et al., 2010), beta (Zhuang et al., 2008), gamma (Berm ⁇ dez-Humarán et al., 2008; Rupa et al.
  • the present invention describes a specific solution, of a specific LAB bacterium, to prepare an immunomodulatory food for a problem not satisfactorily solved such as bacterial diseases in aquaculture, particularly salmonid diseases, in the salmon industry.
  • the lactic bacteria of the present invention which express IFNg of Salmo salar, administered together with a food base were biologically functional in the in vivo test, in the protection of bacterial diseases. Furthermore, the administration of these modified LABs shows that the treated specimens allow the effective control of bacterial infections with intracellular and extracellular pathogens of fish, such as Flavobacterium psycrophilum or Pisciricketia salmonis, a solution not foreseen or inferred from the prior art. direct
  • the present invention relates to a bacterium Lactococcus lactis transformed, producing gamma interferon (IFNg) Salmo salar comprising Lactococcus lactis NZ3900 strain comprising the gene system comprising the DNA construction pNZ8149-pl-USP45-IFNg-GGG -6xHIS.
  • This transformed L. lactis bacterium has an access number RGM 2416 dated October 22, 2017 in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources of INIA, Chile.
  • the invention relates to a plasmid for transforming L.
  • lactis bacteria to produce gamma interferon (IFNg) comprising the vector pNZ8149 and the DNA sequence Pl-Usp45-IFNy-GGG-6xHIS and with the method for preparing the bacterium L. lactis transformed and individualized previously.
  • Part of the invention is also the probiotic food for immunostimulating fish which comprises the transformed L. lactis bacterium for the purpose of preventing or treating bacterial infections in fish and the method of food preparation comprising mixing the transformed bacterium with fish feed.
  • the invention encompasses an immunomodulatory composition of fish and kit comprising the transformed L. lactis bacterium.
  • the invention also describes the use of the transformed L. lactis bacterium to prepare a food useful for immunostimulating fish, to reduce the bacterial load, preferably, of pathogenic fish bacteria such as Flavobacterium psychrophilum and / or Piscirickettsia salmonis.
  • FIG. 1 Corresponding genetic map construction pNZ8149-IFNg.
  • PnisA promoter inducible by nisin.
  • Pl constitutive expression promoter of L. lactis.
  • Usp45 export signal.
  • IFNg mature sequence of the coding mRNA for gamma interferon (IFNy) of Salmo salar.
  • 3xGly three spacing glycines.
  • 6xH ⁇ s tail of histid i na.
  • RepA and RepC genes that allow the replication of the plasmid.
  • LacF gene coding for lactase.
  • the restriction sites Ncol and Xbal, used to clone the cassette in the vector pNZ8149, are shown. Plasmid size: 3289 bp.
  • Figure 2 Detection of gamma (IFNy or IFNg) from the cytosolic content of recombinant L. lactis induced with different concentrations of nisin.
  • St molecular weight standard.
  • Lac 20 ug of total protein of L. lactis containing the plasmid pNZ8149 without the reading frame of the gene as control induced with 10 ng / mL of nlsin.
  • O, 1, 5 and 10 20 ug of total protein of L. lactis expressing IFNy Induced with 0, 1, 5 and 10 ng / mL of nlsin.
  • the membrane was developed by chemiluminescence with the UltraSIgnal® kit (kit name), using the LI-COR chemldock equipment.
  • C + lOug of cytoplasmic extract of L. lactis-IFNg.
  • the values in kDa corresponding to the molecular weight standard are indicated on the left. The samples were loaded in duplicate.
  • Figure 4 Quantification of the copy number of IFNg mRNA of L. lactis-IFNg by RT-qPCR. Absolute quantification of the copy number of the mRNA encoding IFNg from L. lactis-IFNg cultures Induced with increasing amounts of ninsin. Using TRIZOL, the total RNA was extracted from 20 mL of bacterial culture. Subsequently, for the RT-qPCR reaction, 100 ng of RNA treated with DNAsas of each condition. The reverse transcription controls did not show amplification (data not shown). The test was performed with biological and technical replication. Figure 5. Induction of genes related to the immune response activated by the mixture of L. lactis-IFNg sonicates in SHK-1 cells. Different concentrations of sonicates obtained from mixtures of L. lactis were used according to the
  • FIG. 6 Feeding scheme with L. lactis producing IFNg in vivo in rainbow trout.
  • the strategy used was to acclimate the fish for 7 days, then special feeding began with a) fed with commercial feed, b) L. lactis with the vector without insert and c) L. lactis-IFNg for 7 days.
  • days 0 before treatment
  • 2, 4 and 6 feeding were made sampling of 3 fish for each time.
  • the special diet was suspended and all the fish were fed with commercial fish.
  • Groups of 3 fish were analyzed again at 1, 3, 5 and 7 days after feeding with the problotic. (d.a): during feeding and (d.p.a): during feeding.
  • FIG. 7 Quantification by RT-qPCR of the transcripts associated with the immune response of interferon gamma (IFNy or IFNg) during the administration of Lactococcus lactis-IFNg to rainbow trout specimens. Relative quantification of different IFNg response genes was performed. The response is shown at the level of spleen (Spleen, BZ) and kidney (Kidney, R ⁇ ) at day 0, 2, 4 and 6 of feeding (day). IL-lb, IL-12, IL-6, IFNg, STAT1 and glPlO were measured. The values were standardized and standardized based on the elongation factor 1 alpha (eFla).
  • IFNy or IFNg interferon gamma
  • FIG. 8 Quantification of lysozyme in rainbow trout serum during treatment with L. lactis-IFNg. Trout were fed for 7 days with food supplemented with L. lactis-IFNg or normal food (control). Blood samples were taken at the beginning of feeding (0 d.a) and at 2, 4 and 6 days of treatment (d.a). From the blood samples, serum was prepared by centrifugation at 4500 r.p.m for 15 minutes at 4 ° C. The amount of serum lysozyme was estimated by the Micrococcus lutheus assay through a decrease in optical density and the absorbance was measured on a Tecan Pro200 Nanoquant. Number of fish analyzed per sampling day: 3.
  • IFNg spleen
  • BZ spleen
  • R ⁇ kidney
  • IFNg IFNg
  • A STATl
  • B glPlO
  • C TGF-b
  • E IL-6
  • the values were standardized and standardized based on the elongation factor 1 alpha (eFla) and on the day of the start of feeding (0 d.a).
  • the statistical analysis was performed with Mann Whitney with one tail and the significance of the data was determined by t-student (p ⁇ 0.05) comparing with the levels of transcripts of the first day, that is, before starting the diet.
  • NER Normalized relative expression. Number of fish analyzed per sampling day: 3. Number of technical replicas: 2.
  • FIG. 10 Quantification of lysozyme in post-feeding serum. From the blood samples of the analyzed fish, once the feeding was finished, blood was taken at 1, 3, 5 and 7 days after feeding (dpa), subsequently it was centrifuged at 4500 rpm for 15 minutes at 4 ° C to separate the serum . Next, Micrococcus lutheus was tested for the amount of lysozyme through a decrease in optical density, and the absorbance was measured on a Tecan Pro200 Nanoquant. The The assay was performed in triplicate. Number of fish analyzed per day of sampling: 3. Technical replicates: 2. The conditions tested were fish fed normal feed (control), fish fed L. lactis NZ3900 (L. lactis) and L. lactos expressing IFNg (L lactis-IFNg)
  • FIG. 11 Mortality caused by F. psychrophilum in rainbow trout fed with L. lactis-IFNy (IFNg) and infected.
  • Six aquariums (AQ1-AQ6) were used with 15 specimens each, of approximately 25 g. They were challenged by intraperitoneal injection with 100 pL (1.25 x 10 9 CFU) of inoculum and cumulative mortality was observed for 17 days at 12 ° C. Control without challenge: fish injected with TYES culture medium.
  • A Percentage of survival averaged by condition.
  • B Percentage of survival obtained by each aquarium.
  • Flavo fish injected with Flavobacteria.
  • Flavo + L. lactis fish fed for 7 days with L. lactis and subsequently injected with Flavobacteria.
  • Flavo + L. lactis IFNy fish fed for 7 days with L. lactis expressing IFNy (IFNg) and subsequently injected with Flavobacteria. 100% corresponds to 15 fish for each condition.
  • Figure 12 Number of copies of RpoS / mL of F. psychrophilum from spleen of infected rainbow trout.
  • Fish fed normal feed and with feed supplemented with L. lactis-INFg (IFNg) or with L. lactis that does not express interferon g (Lactis) were challenged with F. psycrophillum (FLAVO, IFNg + fLAVO and Lactis + FLAVO, respectively) .
  • F. psycrophillum FLAVO, IFNg + fLAVO and Lactis + FLAVO, respectively
  • As negative control of infection the fish were treated with normal food and injected with physiological saline (control).
  • control physiological saline
  • FIG. 13 Mortality caused by F. psychrophilum in specimens of rainbow trout fed with L. lactis-IFNg and infected. Twelve aquariums (AQ1-AQ12) were used with 12 specimens each, of approximately 30 g. They challenged themselves by intraperitoneal injection with 100 pL (1.25 x 10 9 CFU) of inoculum per fish and accumulated mortality was observed for 17 days at 12 ° C.
  • Control fish Injected with TYES culture medium.
  • Flavo fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture.
  • Flavo + Lactis fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture and fed for 7 days with 1 x 10 7 CFU of L. lactis per fish. Flavo + L.
  • lactis IFNg (7da) fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture and fed for 7 days with lxlO 7 CFU of L. lactis expressing IFNg per fish.
  • Flavo + Lactis IFNg (x3) fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture and fed for 7 days with 3xl0 7 CFU of L. lactis expressing IFNg.
  • Flavo + Lactis IFNg (14da) fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture and fed for 14 days with lxlO 7 CFU of L. lactis expressing IFNg.
  • Figure 14 Weight and length of the surviving rainbow trout specimens of each experimental condition at the end of the test of Figure 13.
  • Control fish injected with TYES culture medium.
  • Flavo fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture.
  • Flavo + Lactis fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture and fed for 7 days with 1 x 10 7 CFU of L. lactis per fish.
  • Flavo + Lactis IFNg x3 fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture and fed for 7 days with 3xl0 7 CFU of L. lactis expressing IFNg.
  • Flavo + Lactis IFNg 14da fish injected with 1.25 x 10 9 CFU in TYES culture and fed for 14 days with lxlO 7 CFU of L. lactis expressing IFNg. Duplicates are shown as independent experiments.
  • FIG. 15 Mortality caused by Piscirickettsia salmonis in Salmo salar specimens fed with L. lactis-IFNy (IFNg) and infected. We used 10 aquariums with 8 fish each, of approximately 45 g, evaluated in 5 conditions in duplicate each.
  • A Percentage of survival obtained by each aquarium.
  • B Percentage of survival averaged per condition
  • Injection control fish Injected with culture medium L-15.
  • Challenge control Intraperitoneally injected fish with 100 pL of P. salmonis (lxlO 7 live bacteria / mL).
  • L. lactis + SRS fish injected intraperitoneally with 100 pL of P. salmonis (lx 10 7 live bacteria / mL) and fed 7 days with L.
  • FIG. 16 Mortality caused by Piscirickettsia salmonis in Salmo salar specimens fed L. lactis without insert.
  • P. salmonis P. salmonis (lxlO 7 Bacteria / fish).
  • P. salmonis + pNZ8149 s / insert Salmo salar fed with food supplemented with L. lactis with vector pNZ8149 without IFNg gene from Salmo salar and challenged with P. salmonis (lxlO 7 Bacteria / fish).
  • the graph shows the averages of the survival percentage of each condition.
  • the present invention relates to a probiotic food comprising a lactic acid bacterium, especially L. lactis, transformed to produce an immunostimulatory cytokine, preferably, Type II IFN, to immunostimulate aquaculture species against bacterial infections, thus achieving heterologous expression of an immunostimulatory protein of Salmo salar in a lactic acid bacterium.
  • the bacterium L. lactis transformed has access number RGM 2416 dated October 22, 2017 from the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources of INIA, Chile.
  • the immunostimulatory proteins exert a potent modulating effect on the immune response.
  • the administration of these in recombinant form has allowed their therapeutic use to increase the immune response against pathogenic bacteria.
  • functional immunostimulant proteins that allow its therapeutic use.
  • the lactic acid bacteria are GRAS organisms (Generally Regarded as Safe), which by virtue of this classification have been used as vaccination systems and release of therapeutic molecules.
  • the lactic acid bacterium of the present invention can be used to express and secrete functional immunostimulant proteins in aquaculture species, particularly, in fish and preferably in Salmo salar and rainbow trout.
  • the present bacterium lactic acid allows the immunogenic protection non-invasive and applicable on a large scale, capable of increasing the current immunization systems.
  • the administration of the present lactic bacteria producing an immunostimulatory cytokine can stimulate the expression of IFN gamma response genes in vivo and reduce the mortality of aquaculture species challenged with bacteria, particularly with F. psychropillhum and P. salmonis.
  • the lactic acid bacteria produces and secretes the heterologous protein.
  • the protein was located mainly in the cytoplasmic fraction. The bioassays showed that this protein is functional by stimulating the expression of immunological genes.
  • the invention relates, in particular, to a transformed Salmon salar interferon gamma-producing Lactococcus lactis (IFNg) bacterium which includes the DNA construct comprising pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS, where pNZ8149 is the transformed vector ; Pl, the constitutive expression promoter of L. lactis, - Usp45 is the export signal; IFNg is the mature sequence of mRNA coding for IFN gamma of Salmo salar; GGG is a sequence that codes for three glycines (SEQ ID No.5) and 6xHIS (SEQ ID No. 1) is a sequence that codes for 6 terminal H istids.
  • IFNg Salmon salar interferon gamma-producing Lactococcus lactis
  • the transformed strain of Lactococcus lactis is one identified as NZ3900, however, it is not limiting and may be other strains of L. lactis.
  • the preferred bacterium is Lactococcus lactis NZ3900 transformed with the gene system comprising the plasmid pNZ8149 / Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS.
  • the recombinant strain is that which has accession number RGM 2416 dated October 22, 2017 from the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources of INIA, Chile.
  • Part of the invention is also a plasmid useful for transforming a L. lactis bacterium to produce interferon gamma (IFNg) comprising the vector pNZ8149 and the sequence Pl-Usp45-IFNy-GGG-6xHIS, where Pl, the constitutive expression promoter of L. lactis, - Usp45 is the export signal; IFNg is the mature sequence of mRNA coding for IFN gamma of Salmo salar, GGG is a sequence that codes for three glycines and 6xHIS is a sequence that codes for 6 terminal Histidines.
  • IFNg interferon gamma
  • Pl the constitutive expression promoter of L. lactis
  • - Usp45 is the export signal
  • IFNg is the mature sequence of mRNA coding for IFN gamma of Salmo salar
  • GGG is a sequence that codes for three glycines
  • 6xHIS is a sequence that codes for
  • the invention relates to a method for preparing the transformed L. lactis bacterium comprising the following steps:
  • Preferred restriction enzymes for steps a) and c) correspond to the restriction enzymes Ncol and Xbal and the electrocompetent bacterium of step g) is the strain of L. lactis NZ3900.
  • Part of the present invention is a problotic food for immunostimulatory aquaculture species, in a particularly preferred way, to immunostimulate fish.
  • the probiotic food comprises the bacterium L.
  • lactis transformed with a bacterium transformed Lactococcus lactis, producer of interferon gamma (IFNg) of Salmo salar that includes the DNA construction comprising pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS, where pNZ8149 is the transformed vector; Pl, the constitutive expression promoter of L. lactis, - Usp45 is the export signal; IFNg is the mature sequence of mRNA coding for IFN gamma of Salmo salar, GGG is a sequence that codes for three glycines and 6xHIS is a sequence that codes for 6 terminal Histidines.
  • the invention encompasses the method for preparing a probiotic food described above.
  • the invention protects any immunomodulatory composition to be administered to aquaculture species, in the broadest sense of the scope of composition.
  • the composition may have a liquid or solid form and excipients to provide stability for storage and increase bioavailability to the transformed bacterium of the present invention.
  • the composition includes all combinations of organic molecules useful for administration in aquaculture species, being proteins, lipids or saccharides, in combination with the transformed L. lactis bacterium, described above or with the bacteria described in the preferred embodiment of the invention. examples
  • This composition may comprise the combination of the bacterium of the invention with recombinant protein vaccines or vaccines of nucleic acids, bacterins, probiotics, prebiotics, other immunomodulators, vitamins, etc.
  • the use of transformed L. lactis bacteria is to prepare a food or composition useful for immunostimulating aquaculture species, particularly, immunostimulate fish.
  • the use given for this bacterium is to prepare a useful food to reduce the bacterial load, preferably bacterial load of Flavobacterium psychrophilum and / or Piscirickettsia salmonis.
  • the use of the bacteria and of the food comprising it is to prepare a food or composition useful for treating or preventing the infection of Flavobacterium psychrophilum and / or Piscirickettsia salmonis in fish.
  • Part of the invention is a kit that includes a package comprising the L.
  • this kit may comprise instructions for the use of feeding, treating or preventing bacterial diseases in aquaculture species, preferably, relevant fish in the aquaculture industry.
  • the instructions have information for the use of feeding fish, treating or preventing diseases caused by Flavobacterium psychrophilum and Piscirickettsia salmonis in fish.
  • the invention further encompasses the method for reducing the bacterial load in aquaculture species, which comprises administering to these species, the feed mixed with the transformed L. lactis bacterium, selected from any bacteria comprising the DNA construct pNZ8149-Pl-USP45 -IFNg-GGG-6xHIS detailed in the examples of the present invention.
  • the aquaculture species are preferably fish, and the method treats or prevents infections by Flavobacterium psychrophilum or Piscirickettsia salmonis.
  • the method of administration is capable of treating or preventing a bacterial infection by reducing the bacterial load in aquaculture species, preferably fish.
  • Example 1 By means of synthetic biology, a gene coding for an immunostimulant protein of Salmo salar optimized codogenically was designed and synthesized, with a secretion peptide and a tail of 6 histidines (6xHis) (SEQ ID NO: 1). The gene was cloned into an expression vector with food grade. The production of the heterologous protein was determined through Western blot and its functionality was determined by bioassays.
  • the present invention consists of a recombinant strain of Lactococcus lactis NZ3900, comprising the plasmid pNZ8149 in which a synthetic DNA segment comprising the Pl promoter, the signal peptide of the USP45 protein, a gene coding for the mature sequence was cloned. of interferon I of Salmo salar, and a tail of three glycines and six histidines, denominated pNZ8149-IFNgSS ( Figure 1). The sequence of the IFNg gene was obtained from the genome of Salmo salar and is optimized codogenically to be expressed in the host L. lactis ( Figure 1).
  • This strain constitutively expresses the IFN gamma gene from the presence of Promoter Pl, of L. lactis sequence SEQ ID NO: 2, and is inducible from the presence of the Promoter nisin present in the commercial vector ( Figure 2).
  • IFNg is secreted into the culture medium thanks to the presence of the Usp45 signal peptide, sequence SEQ ID No: 3, which is fused in frame with the sequence of IFN gamma (INFg), SEQ ID No: 4 ( Figure 3).
  • the expression of IFNg was detected in extracts of L. lactis producing IFNg compared to the extract of the strain containing the plasmid pNZ8149 without the reading frame of the gene ( Figure 4).
  • Vector design pNZ8149-IFNg For the design of the lactococcal vector, the plasmid pNZ8149 (Mobltec®) and a plasmid pJetl .2-IFNg (Genescript®) containing the IFNg reading frame of Salmo salar (GenBank: FJ263446.1) were used as the backbone (skeleton). ). In silico, the IFNg gene was optimized codogenically for Lactococcus lactis nz3900 through the online application http://www.kazusa.or.jp/codon/, and modified in such a way to incorporate the sequence it codes for in its amino terminal end.
  • both Plasmids were digested for 1 hour at 37 ° C with the enzymes Ncol and Xbal, present at the site of multiple cloning of pNZ8149 and at the ends of IFNg present in pJetl.2. Both digestions were resolved in a 1% w / v agarose gel where the linear vector and the insert were obtained for purification by Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega®). The vector and the insert were ligated all night to
  • the bacterial pellet was resuspended in 500 uL of PBS1X supplemented with 1 mM Protease Inhibitor. Then, it is sonicated 5 times during 15 seconds in an Ultrasonlc processor Sonic Vlbracell VCX130 equipment (amplitude of 90%) incubating in ice between each cycle. The sample was centrifuged at 6000 rpm for 10 mln at 4 ° C and the supernatant was separated from the cell debris in a new tube that was frozen at -20 ° C until use. The Bradford method was used to determine the concentration of total proteins in the extract. Once the concentration was known, it was normalized to resolve and compare the amount of protein by SDS-PAGE electrophoresis.
  • the membrane was then washed at room temperature three times for 10 minutes with 0.1% PBS-lX-Tween 20 and incubated for 1 hour with a 1: 2,000 dilution of the anti-His (Abcam) primary antibody in PBS- BSA at 2%. Then, the membrane was washed with the same procedure and incubated for 1 hour with a 1: 5,000 dilution of the secondary antibody anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase.
  • the membrane was rewashed and revealed by means of chemiluminescence with the Superslgnal® West Pico Chemiluminescent Substrate kit, incubating the solutions for 5 minutes and exposing the membrane in a digital development equipment C-DIGIt model 3600 (LI-COR) for 7 minutes for the acquisition of Images.
  • C-DIGIt model 3600 LI-COR
  • RNA was treated with DNasal (Promega®) to eliminate traces of contaminating plasmidlal DNA, and was used as a template to quantify the number of coplas of mRNA encoding IFNg by qRT-PCR.
  • the reaction mixture used was as follows: 2 uL of total RNA (100 ng), 5 uL of 2X SensIMix SYBR No-ROX One-Step Kit, 0.5 uL of first Fw IFNy L. lactis, 0.5 uL of first Rv IFNy L. lactis (lOmM) (Table 2) and 2 uL of nuclease-free water.
  • cytoplasmic extracts of the bacterium were incubated in the SHK-1 cell line derived from Salmo salar (Table 1) and subsequently some transcripts involved in the IFNg response were quantified. Briefly, different proportions between cytoplasmic extracts of L. lactis and L. lactis-IFNg were mixed with culture medium L-15 and incubated for 8 hours at 16 ° C in SHK-1 cells in order to determine the contribution of the protein Recombinant between the total content of proteins contributed by the bacteria.
  • RNA of the salmon cells was extracted by the E.Z.N.A Total RNA kit (OMEGA blo-tek) and treated with DNAse I (Promega®).
  • the treated RNA was used as a template for the synthesis of cDNA with Ollgos (dT) with the following reaction mixture: 11 uL of treated RNA, 0.5 uL of OllgodT (lOmM), 1 uL of dNTPs (lOmM each), 0.5 uL of M-MLV (Promega®), 7 uL of nuclease-free water.
  • the obtained cDNA was diluted 1: 2 and used as a template for the relative quantification of the transcripts associated with the immune response by qPCR with the following reaction mixture: 2 uL cDNA, 5 uL of 2X SensIMix SYBR No-ROX Kit, 0, 25 uL of Fw (10mM), 0.25 uL of Rv (10mM) and 2 uL of nuclease-free water (Table 2).
  • Table 1 ( Figure 5) Amount of total protein used in each assay to determine the contribution of IFNg in the immune response of SHK-1. The amount of final protein was normalized to 20ug by mixing the sonicate volumes of L. lactis expressing IFNg (L.L IFNg) and of L. lactis that does not express it (L.L vacuum). Subsequent work concentrations were made from this final amount.
  • PNZ8149-IFNg has a "food grade” selection marker that allows the metabolism of lactose (LacF), contains a constitutive promoter pl and a promoter inducible by nisin (PnisA), the natural secretion signal of L lactis Usp45, the gene that codifies for IFNg of Salmo salar and a "tag" of histid inas.
  • RepA and RepC are genes that allow the replication of the plasmid ( Figure 1). By transforming NZ3900 bacteria that present a chromosomal deletion into the lactose ORF, the bacteria can use this carbon source and maintain the plasmid.
  • the constitutive promoter Pl allows the expression of IFNg, this induction can increase proportionally with the amount of nisin added to the culture medium thanks to the pNisA promoter ( Figure 2).
  • the protein is easily detectable from the cltoplasmatic fraction by western blot, however the amount of secreted protein is in a much smaller proportion ( Figure 3). This same increase in the amount of protein detected by western blot it can be observed by quantifying the number of mRNA transcripts of IFNg by qRT-PCR. ( Figure 4).
  • Example 2 Effects of the administration of the L. lactis bacterium producing IFNg
  • an assay was mounted with rainbow trout specimens (grammage ⁇ x>: 20-25 g) where, over time, the effect of the problem during feeding and afterwards as shown in the scheme of Figure 6 was evaluated.
  • the strategy was to acclimatize the fish for 7 days, then start special feeding with a) L. lactis-IFNg, b) L. lactis with the vector without insert and c) fed with commercial feed for 7 days.
  • days 0 before treatment
  • 2, 4 and 6 feeding were made sampling of 3 fish for each time.
  • the special feeding is suspended and all the fish are fed with the commercial pellet.
  • Groups of 3 fish were analyzed again at 1, 3, 5 and 7 days after feeding with the problotic.
  • 300 uL of blood was extracted to three specimens, which were later sacrificed for the extraction of spleen and kidney.
  • the blood was used to quantify the enzymatic activity of lsozlma in serum by suspensions of Micrococcus iuteus.
  • the test consisted of measuring the decrease in absorbance at 450 nm from 180 ⁇ L of the stock of M. Iuteus Incubated with 20 uL of direct serum, using as a positive control 200-400 units of llsozyme / mL.
  • the calculations of the amount of lsozlma in serum were carried out with the following formula:
  • the cytokines were quantified: IL-Ib, IL-6, IL-12, TGF-b, IFNy, gamma IP10 and STAT1 by relative quantification.
  • RNA treated with DNAse I was used as a template for the synthesis of cDNA with Ollgos (dT) with the following reaction mixture: 11 uL of treated RNA, 0.5 uL of OllgodT (lOmM), 1 uL of dNTPs (lOmM each one), 0.5 uL of M-MLV (Promega®), 7 uL of nuclease-free water.
  • the obtained cDNA was diluted in a 1: 2 ratio and used as a template for the relative quantification of the transcripts associated with the immune response by qPCR with the following reaction mixture: 2 uL cDNA, 5 uL of 2X SensIMIx SYBR No-ROX Kit , 0.25 uL of Fw (10mM), 0.25 uL of Rv (10mM) and 2 uL of nuclease-free water (Table 2).
  • lactis-IFNg than the original one (3xl0 7 bacteria / fish) and later infected
  • the size and weight of the surviving fish were recorded at the end of the test.
  • Bacterial load The bacterial load of fish infected with P. salmonis or F. psycrophillum was performed by absolute qPCR using total DNA extracted from the immunological organisms of the Spleen and Kidney salmonids. From these Organs total DNA was extracted with the Wlzzart Genomlc DNA Kit, promising. The purified DNA was quantified by absorbance at 260 nm. 50 ng of total DNA were used for the qPCR reaction. For the detection of F.
  • the rpoS-F primers were used (5 'GAA GAT GAA GGT AAT TIA GTT GAT 3'), SEQ ID No: 23, and rpoS-R (5 'CAA ATA ACA TCT GGT TTT TGT ACA ACT 3 '), SEQ ID No: 24, which allow the amplicflcanclon of a fragment of 200 bp.
  • the 16SPS-F starters (5 'AGG GAG ACT GGC GGT GAT A 3')
  • SEQ ID No: 26 and 16SPS-R 5 'AGT ACG AGG CGC TTT CTC A3'
  • Each amplification product gave a single peak of denaturation indicating the amplification of a specific product.
  • a calibration curve based on increasing concentrations of the PCR product previously cloned in pGEM-T was constructed for each of the amplicons. In this way the number of bacteria was inferred, assuming that the number of coplas of each gene is unique within the chromosome of each of the bacteria.
  • the transformed bacterium was administered together with the feeding of healthy trout specimens and analyzed during the post-feeding period.
  • Two parameters were analyzed from spleen and kidney: a) the transcripts associated with the immune response of IFNg from spleen and kidney during feeding ( Figure 7) and post feeding with the problotic ( Figure 9 from A to E) and b) ) the enzymatic activity of lsozlma from serum d ura nte ( Figure 8) and post feeding ( Figure 10) with the problotic.
  • lactis-IFNg for 7 days show a slight increase in protection in relation to the fish treated with the problem for 14 days (treatment b: survival of 25%) suggesting that the protective effect against P. salmonis is given by feeding the fish for 7 days and subsequently it remains constant.
  • treatment c survival: 0%
  • the fish fed with L. lactis that has the plasmid without the Insert showed a disparity significant in its mortality (treatment d: 12% and 50% each replication). Therefore, L. lactis-IFNg can contribute to the survival of fish against Infections with P. salmonis. (Figure 15).
  • RV splitter RpoS F. pyschrophilum

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Abstract

La presente invención está dentro del campo técnico de la acuicultura, particularmente, el invento se relaciona con una solución en particular para la prevención y tratamiento de enfermedades bacterianas a través de una bacteria ácido láctica Lactococcus lactis transformada para producir una citoquina inmunoestimulante Interferón tipo II (IFN II), particularmente interferón gamma (IFNg o IFNγ). Esta bacteria transformada ha sido depositada la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017. Así mismo, el invento se relaciona con un alimento para especies acuícolas inmunoestimulante que comprende la bacteria láctica transformada con IFN tipo II de salmónidos. También se refiere al método de preparación de dicho alimento probiótico, al método de preparación de dicha bacteria ácido láctica que expresa IFNg, es decir, producir una citoquina estimulante de la respuesta inmune antibacteriana.

Description

BACTERIA LACTOCOCCUS LACTIS TRANSFORMADA. PRODUCTORA DE INTERFERON GAMMA fIFNGI DE SALMO SALAR. ALIMENTO Y COMPOSICION QUE LA COMPRENDE. PARA INMUNOESTIMULAR ESPECIES ACUICOLAS CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está dentro del campo técnico de la acuicultura, particularmente, el Invento se relaciona con una solución en particular para la prevención y tratamiento de enfermedades bacterianas a través de una bacteria ácido láctica Lactococcus lactis transformada para producir una cltoqulna inmunoestlmulante Interferón tipo II (IFN II), particularmente interferón gamma (IFNg o IFNy). Esta bacteria transformada ha sido depositada la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017. Así mismo, el Invento se relaciona con un alimento para especies acuícolas ¡nmunoestimulante que comprende la bacteria láctica transformada con IFN tipo II de salmónidos. También se refiere al método de preparación de dicho alimento probiótico, al método de preparación de dicha bacteria ácido láctica que expresa IFNg, es decir, producir una citoquina estimulante de la respuesta Inmune antibacterlana.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En la industria salmonlcultora existen diversas causas naturales que producen la mortalidad de los peces, siendo las de origen Infeccioso las más agravantes. Algunos de los patógenos que han causado mayores pérdidas son las bacterias Flavobacterium psycrophilum y Pisciricketsia salmonis. La principal estrategia para estimular la respuesta Inmune de los peces en la industria acuícola, es por medio de la administración de vacunas inyectables. Sin embargo, este tipo de Inmunización conlleva a la manipulación y a un alto grado de estrés en los ejemplares. Además, debido a la corta memoria ¡nmunológica que poseen los peces se requiere de continuos refuerzos ( boosters ) que favorecen, por medio de la manipulación, la generación de más estrés, de mortalidad y daños en la calidad del filete. Por otra parte, las estrategias de vacunación oral y de Inmersión, poseen limitaciones en su efectividad y restricciones en su aplicación. Sumado al escenario de las vacunas, las enfermedades de origen bacteriano, principalmente producidas por P. salmonis no han podido controlarse con el uso de vacunas, lo que ha decantado en la aplicación excesiva de antibióticos de amplio espectro, los que pueden modificar el medioambiente donde se hacen los cultivos, pueden aumentar la resistencia de las bacterias patógenas y alterar la microbiota de los peces. Todos estos antecedentes hacen urgente la necesidad de crear nuevas formas de estimular el sistema Inmune de los peces de forma no Invasiva. Actualmente, los estudios se enfocan hacia el desarrollo de vacunas orales que puedan ser utilizadas como refuerzo ("boost") estimulando reiteradas veces el sistema ¡nmunológlco de los salmónidos sin la necesidad de manipularlos manteniéndolos en un estado más natural hasta la cosecha.
Los ¡nterferones son un grupo de cltoqulnas descubiertas originalmente por sus propiedades antlvlrales (Isaacs y Llndenmann, 1957). En los mamíferos, estas cltoqulnas pueden clasificarse en tres familias según su homología, receptores, estructura y función (Pestka et al., 2004). Los ¡nterferones de tipo I y II son familias de genes múltiples (17 tipos I y 4 de tipo II) fuertemente Inducidos por virus, desempeñando un papel preponderante en el control de las Infecciones virales (Lazear et al., 2015, McNab et al., 2015, Teljaro, 2016).
El ¡nterferón tipo II o Interferón gamma (IFNg) es una cltoqulna ¡nmunorreguladora codificada por un único gen, producida principalmente por células NK y T activadas, aunque también es secretada por células B y células presentadoras de antígeno (APC)
(Frucht et al. 2001, Kearney et al., 2013, Zlmonjlc et al., 1995).
El ¡nterferón tipo I de Salmo salar (Salmón del Atlántico) muestra propiedades antlvlrales que Inducen la expresión de varios genes antivíricos, entre los que se encuentran Mx (Ool y otros, 2008, Martin et al., 2007, C. Xu, Evensen y Munang'andu 2015). Experimentos in vitro e in vivo muestran que el ¡nterferón I es eficaz contra patógenos de Importancia económica tales como IPNV, IHNV, ISAV y SAV (Chang et al., 2014, 2016, Robertsen et al., 2003, Salnt-Jean y Pérez-Prleto, 2006, Sun y otros, 2011, Svlngerud et al., 2012, 2013, Xu et al., 2010). Además, en Salmo salar el ¡nterferón I también estimula la inmunidad adaptativa, aumentando la inmunoestimulación mediada por las vacunas de ADN (Chang et al., 2015).
No obstante, los ensayos de bioactivldad utilizando IFNg recombinante de Salmo salar o trucha arco iris muestran que esta citoquina es capaz de inducir la expresión de las proteínas MHCI, MHCII, relacionadas con el procesamiento de los antígenos y aumentar la explosión respiratoria de las células fagocíticas (Martin et al., 2007a, 2007b, 2007c, Zou et al., 2005). In vitro también el IFNg de Salmo salar tiene propiedades antivlrales contra SAV e IPNV (Sun et al., 2011).
Al Igual que en los seres humanos, IFN(s) tienen el potencial para ser utilizado como tratamiento terapéutico o profiláctico contra patógenos virales de salmonlcultura . Sin embargo, la aplicación de estas citoquinas ha sido poco estable en acuicultura, debido a la falta de un vehículo de entrega, compatible con la fisiología de los peces que haga efectivo su uso.
La presente invención desarrolla una bacteria inmunoestlmulante oral para estimular en forma no específica la respuesta inmune innata contra infecciones de origen bacteriano, tanto para patógenos Intra y extracelulares. La presente invención demuestra que IFN gamma (IFNg) de salmón es una citoquina que otorga protección contra infecciones bacterianas en salmónidos a partir de la activación de genes que favorecen la respuesta inmune celular y humoral de los peces. Así, la expresión a nivel mucoso de esta citoquina inmunoestlmulante, utilizando como vehículo de liberación una bacteria ácido láctica, otorga un efecto protector en los individuos contra las infecciones bacterianas.
En las últimas décadas, las bacterias de ácido láctico (LAB) han surgido como un vehículo factible para la liberación in situ de citoquinas y péptldos bloactlvos dentro del tracto gastrointestinal de mamíferos (Bahey-EI-DIn et al., 2010; Steldler et al., 2009). Los ¡nterferones alfa (Bayat et al., 2014, Ma et al., 2014, Zhang et al., 2010), beta (Zhuang et al., 2008), gamma (Bermúdez-Humarán et al., 2008; Rupa et al., 2008) e IL-10 (Steldler et al., 2000) se ha expresado con éxito en LAB bajo su forma biológicamente funcional, produciendo efectos locales y slstémicos después de la administración a animales (mamíferos). Si bien, cepas de Lactococcus Lactis para la entrega de proteínas recombinantes tales como proteínas antigénicas, citoquinas, incluyendo IFN u otras proteínas biológicamente activas en animales, han sido descritas anteriormente en los documentos Zhuang Z, Wu ZG, Chen M, Wang PG. (2008), Bahey-EI-Din MI, Gahan CG. (2011), W02011150127, W02010139195, CN 102329766, CN102796755, CL201503797, CN104120142,
CN 103074291, US4808523, CN 105331570 o W02014040987, el presente invento describe una solución concreta, de una bacteria LAB específica, para preparar un alimento inmunomodulador para un problema no resuelto satisfactoriamente como son las enfermedades bacterianas en acuicultura, particularmente, enfermedades de salmónidos, en la industria salmonera.
En el salmón Atlántico y la trucha arco Iris, el uso de LAB en la entrega in situ de proteínas bloactlvas ha sido deficientemente estudiado, explorando su uso sólo para la entrega de péptldos antlgénicos (Li et al., 2012). Los inventores previamente han descrito la transformación de bacterias Lactococcus lactis con IFN tipo I, la cual es útil en la prevención de la enfermedad viral del virus de la necrosis pancreática infecciosa. Sin embargo, el presente invento describe una cepa de Lactococcus lactis transformado con IFN tipo II y que sorprendentemente pudo proteger de enfermedades bacterianas Importante en la Industria acuícola, particularmente de salmónidos. En este invento se utilizó Lactococcus lactis para la expresión de IFNg de Salmo salar. Las bacterias lácticas del presente Invento, que expresan IFNg de Salmo salar, administradas junto con una base de alimento fueron biológicamente funcionales en el ensayo in vivo, en la protección de enfermedades bacterianas. Además, la administración de estas LAB modificadas, muestran que los especímenes tratados permiten el control eficaz de infecciones bacterianas con patógenos ¡ntracelulares y extracelulares de peces, tales como Flavobacterium psycrophilum o Pisciricketsia salmonis, solución no prevista ni deduclble del estado de la técnica en forma directa.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una bacteria Lactococcus lactis transformada, productora de ¡nterferón gamma (IFNg) de Salmo salar que comprende cepa de Lactococcus lactis NZ3900 que comprende el sistema génico que comprende la construcción de ADN pNZ8149-pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS. Esta bacteria de L. lactis transformada tiene un número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017 en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA, Chile. Así mismo, el invento se relaciona con un plásmido para transformar bacteria de L. lactis para producir ¡nterferón gamma (IFNg) que comprende el vector pNZ8149 y la secuencia de ADN Pl- Usp45-IFNy-GGG-6xHIS y con el método para preparar la bacteria L. lactis transformada e individualizada anteriormente. Es parte del invento, también el alimento probiótico para inmunoestimular peces el cual comprende la bacteria L. lactis transformada con el fin de prevenir o tratar infecciones bacterianas en peces y el método de preparación del alimento que comprende mezclar la bacteria transformada con alimento de peces. De igual forma, el invento abarca una composición inmunomoduladora de peces y kit que comprende la bacteria L. lactis transformada. Así mismo el invento describe uso de la bacteria L. lactis transformada para preparar un alimento útil para inmunoestimular peces, para reducir la carga bacteriana, preferentemente, de bacterias patógenas de peces tales como Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Mapa genético correspondiente la construcción pNZ8149-IFNg. PnisA: promotor inducible por nisina. Pl : promotor de expresión constitutiva de L. lactis. Usp45: señal de exportación. IFNg : secuencia madura del mRNA codificante para ¡nterferón gamma (IFNy) de Salmo salar. 3xGly: tres glicinas espaciadoras. 6xH¡s: cola de histid i na . RepA y RepC: genes que permiten la replicación del plásmido. LacF: gen que codifica para la lactasa. Se muestran los sitios de restricción Ncol y Xbal, utilizados para clonar el cassette en el vector pNZ8149. Tamaño del plásmido: 3289 pb.
Figura 2. Detección de gamma (IFNy o IFNg) desde el contenido citosólico de L. lactis recombinante inducido con distintas concentraciones de nisina. St: estándar de peso molecular. Lac: 20 ug de proteína total de L. lactis que contiene el plásmido pNZ8149 sin el marco de lectura del gen como control inducido con 10 ng/mL de nlsina. O, 1, 5 y 10: 20 ug de proteína total de L. lactis que expresa IFNy Inducida con 0, 1, 5 y 10 ng/mL de nlsina. A la izquierda el gel teñido con Azul de Coomassie y a la derecha western blot para la cola de hlstdina (6XHIs). Para el western blot se utilizó el anticuerpo primarlo contra la cola de histid i na 6X (1 :2000) que es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. El anticuerpo secundarlo conjugado a HRP que reconoce el IgG del anticuerpo primarlo (1 :2000) es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Después de cada anticuerpo se lavó 3 veces la membrana durante 10 minutos con PBS-Tween20 0,15%. La membrana fue relevada mediante quimlolumlnlscencia con el kit UltraSIgnal® (nombre kit), y el equipo chemldock LI-COR.
Figura 3. Cinética de secreción de IFNy o IFNg, producido por L. lactis- IFNg.
Cuatro cultivos con 40 mL de M17 suplementados con lactosa fueron Inoculados al 2% con un precultivo de L. lactis- IFNg, e incubados a 30 °C sin agitación. Luego los sobrenadantes se analizaron 1, 2, 6 y 24 horas post Inducción con Nlsina. Para el western blot se utilizó el anticuerpo primarlo contra la cola de hlstidina 6X (1 :2000) que es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. El anticuerpo secundarlo conjugado a HRP que reconoce el IgG del anticuerpo primarlo (1 : 2000) es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Después de cada anticuerpo se lavó 3 veces la membrana durante 10 minutos con PBS-Tween20 0,15%. La membrana fue revelada mediante quimlolumlnlscencia con el kit UltraSIgnal® (nombre kit), utilizando el equipo chemldock LI-COR. C+ : lOug de extracto citoplasmático de L. lactis- IFNg. A la izquierda se Indican los valores en kDa correspondientes al estándar de peso molecular. Las muestras fueron cargadas en duplicado.
Figura 4. Cuantificación del número de copias del mRNA de IFNg de L. lactis- IFNg mediante RT-qPCR. Cuantificación absoluta del número de copias del mRNA que codifica para IFNg desde cultivos de L. lactis-IFNg Inducidos con cantidades crecientes de nlsina. Mediante TRIZOL, se extrajo el RNA total a partir de 20 mL de cultivo bacteriano. Posteriormente, para la reacción de RT-qPCR se utilizaron 100 ng de RNA tratado con DNAsas de cada condición. Los controles de transcripción reversa no mostraron amplificación (dato no mostrado). El ensayo fue realizado con réplica biológica y técnica. Figura 5. Inducción de genes relacionados a la respuesta inmune activados por la mezcla de sonicados de L. lactis- IFNg en células SHK-1. Distintas concentraciones de sonicados obtenidos de mezclas de L. lactis fueron utilizados según la
Tabla 1. Los sonicados fueron incubados en células SHK-1 por 8 horas a 16 °C. Se midió la inducción de STAT1, gamma IP-10, IFNg, TGF-b, IL-lb e IL-6. Los valores obtenidos fueron normalizados y relativos a eFla. Control: células SHK-1 sin tratamiento. 0: células SHK-1 incubadas con 200 ng/mL de extracto de L. lactis con plásmido sin inserto. 20, 50, 100 y 200: células SHK-1 incubadas con 0 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL y
200 ng/mL de sonicado aportado por L. lactis- IFNg, respectivamente. Ensayo se realizó con réplica biológica y técnica.
Figura 6. Esquema de alimentación con L. lactis productor de IFNg in vivo en truchas arcoíris. La estrategia utilizada consistió en aclimatar a los peces durante 7 días, posteriormente se inició la alimentación especial con a) alimentados con alimento comercial , b) L. lactis con el vector sin inserto y c) L. lactis- IFNg durante 7 días. A los días 0 (antes del tratamiento), 2, 4 y 6 de alimentación se realizaron muéstreos de 3 peces por cada tiempo. Luego, se suspendió la alimentación especial y todos los peces fueron alimentados con el peí let comercial. Se analizaron grupos de 3 peces nuevamente a los 1, 3, 5 y 7 días post alimentación con el problótlco. (d.a) : durante la alimentación y (d.p.a): durante post alimentación.
Figura 7. Cuantificación mediante RT-qPCR de los transcritos asociados a la respuesta inmune de interferón gamma (IFNy o IFNg) durante la administración de Lactococcus lactis-IFNg a ejemplares de trucha arcoiris. Se realizó cuantificación relativa de distintos genes de respuesta a IFNg. Se muestra la respuesta a nivel de bazo (Spleen, BZ) y riñón (Kidney, RÑ) al día 0, 2, 4 y 6 de alimentación (d.a). Se midió IL-lb, IL-12, IL-6, IFNg, STAT1 y glPlO. Los valores fueron normalizados y estandarizados en base al factor de elongación 1 alpha (eFla). El análisis estadístico fue realizado con Mann Withney de una cola y la significancia de los datos fue determinada por t-student (p<0,05) comparando con los niveles de transcritos del primer día, es decir, antes de iniciar la dieta. NER: Expresión relativa normalizada. Número de peces analizados por día de muestreo: 3. Réplicas técnicas: 2.
Figura 8. Cuantificación de lisozima en suero de trucha arcoiris durante el tratamiento con L. lactis-IFNg. Truchas fueron alimentadas durante 7 días con alimento suplementado con L. lactis-IFNg o alimento normal (control). Se extrajeron muestras de sangre al inicio de la alimentación (0 d.a) y a 2, 4 y 6 días del tratamiento (d.a). A partir de las muestras de sangre, se preparó suero mediante centrifugación a 4500 r.p.m por 15 minutos a 4 °C. La cantidad de lisozima en suero se estimó mediante el ensayo de Micrococcus lutheus a través de una disminución en la densidad óptica y se midió la absorbancia en un Tecan Pro200 Nanoquant. Número de peces analizados por día de muestreo:3.
Figura 9. Cuantificación mediante RT-qPCR de transcritos asociados a la respuesta inmune de IFNy (IFNg) durante el periodo post alimentación con L. lactis-IFNg. Se realizó cuantificación relativa de distintos genes de respuesta a IFNy
(IFNg). Se muestra la respuesta a nivel de bazo (BZ) y riñón (RÑ), al día 0, 1, 3 y 7 post alimentación (d.p.a). Se midió IFNg (A), STATl(B), glPlO (C), TGF-b (D) y IL-6 (E). Los valores fueron normalizados y estandarizados en base al factor de elongación 1 alpha (eFla) y al día de inicio de la alimentación (0 d.a). El análisis estadístico fue realizado con Mann Withney de una cola y la significancia de los datos fue determinada por t- student (p<0,05) comparando con los niveles de transcritos del primer día, es decir, antes de iniciar la dieta. NER: Expresión relativa normalizada. Número de peces analizados por día de muestreo: 3. Número de réplicas técnicas: 2.
Figura 10. Cuantificación de lisozima en suero post alimentación. A partir de las muestras de sangre de los peces analizados una vez finalizada la alimentación se extrajo sangre a 1, 3, 5 y 7 dias post alimentación (d.p.a) posteriormente se centrifugó a 4500 r.p.m por 15 minutos a 4°C para separar el suero. A continuación, se hizo ensayo de Micrococcus lutheus para determinar la cantidad de lisozima a través de una disminución en la densidad óptica, y se midió la absorbancia en un Tecan Pro200 Nanoquant. El ensayo fue realizado por triplicado. Número de peces analizados por día de muestreo: 3. Replicas técnicas: 2. Las condiciones ensayadas fueron peces alimentados con alimento normal (control), peces alimentados con L. lactis NZ3900 (L. lactis) y L. lactos que expresa IFNg (L. lactis-IFNg)
Figura 11. Mortalidad ocasionada por F. psychrophilum en ejemplares de Trucha arcoíris alimentados con L. lactis- IFNy(IFNg) e infectados. Se utilizaron seis acuarios (AQ1-AQ6) con 15 ejemplares cada uno, de aproximadamente 25 g. Se desafiaron mediante inyección intraperitoneal con 100 pL (1,25 x 109 UFC) de inoculo y se observó la mortalidad acumulada durante 17 días a 12 °C. Control sin desafío: peces inyectados con medio de cultivo TYES. (A) Porcentaje de sobrevida promediados por condición. (B) Porcentaje de sobrevida obtenidos por cada acuario. Flavo: peces inyectados con Flavobacteria. Flavo + L. lactis: peces alimentados durante 7 días con L. lactis y posteriormente inyectados con Flavobacteria. Flavo + L. lactis IFNy: peces alimentados durante 7 días con L. lactis que expresa IFNy (IFNg) y posteriormente inyectados con Flavobacteria. 100% corresponde a 15 peces por cada condición.
Figura 12. Número de copias de RpoS/mL de F. psychrophilum desde bazo de truchas arcoíris infectados. Peces alimentados con alimento normal y con alimento suplementado con L. lactis-INFg (IFNg) o con L. lactis que no expresa interferon g (Lactis) fueron desafiados con F. psycrophillum (FLAVO, IFNg+fLAVO y Lactis+FLAVO, respectivamente). Como control negativo de infección los peces fueron tratados con alimento normal e inyectados con suero fisiológico (control). Mediante qPCR al gen RpoC, se realizó una cuantificación absoluta de la carga bacteriana en los peces moribudos y los sobrevivientes al desafío con F. psycrophillum. Los peces moribundos aparecieron a partir del día 7 post infección. Se definió como sobrevivientes a los peces no moribundos vivos al dia 17 post infección. Los valores de carga bacteriana que se encuentran debajo de la línea roja se consideran ruido de la técnica.
Figura 13. Mortalidad ocasionada por F. psychrophilum en ejemplares de Trucha arcoíris alimentados con L. lactis-IFNg e infectados. Se utilizaron doce acuarios (AQ1-AQ12) con 12 ejemplares cada uno, de aproximadamente 30 g. Se desafiaron mediante inyección intraperitoneal con 100 pL (1,25 x 109 UFC) de inoculo por pez y se observó la mortalidad acumulada durante 17 días a 12°C. Control : peces Inyectados con medio de cultivo TYES. Flavo: peces inyectados con 1,25 x 109 UFC en cultivo TYES. Flavo + Lactis : peces inyectados con 1,25 x 109 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 1 x 10 7 UFC de L. lactis por pez. Flavo + L. lactis IFNg (7da): peces inyectados con 1,25 x 109 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con lxlO7 UFC de L. lactis que expresa IFNg por pez. Flavo + Lactis IFNg (x3): peces inyectados con 1,25 x 10 9 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 3xl07 UFC de L. lactis que expresa IFNg. Flavo + Lactis IFNg (14da): peces inyectados con 1,25 x 10 9 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 14 días con lxlO7 UFC de L. lactis que expresa IFNg.
Figura 14. Peso y longitud de los ejemplares de Trucha arcoíris sobrevivientes de cada condición experimental al final del ensayo de la Figura 13. Control : peces inyectados con medio de cultivo TYES. Flavo: peces inyectados con 1,25 x 109 UFC en cultivo TYES. Flavo + Lactis : peces inyectados con 1,25 x 109 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 1 x 10 7 UFC de L. lactis por pez. Flavo + L. lactis IFNg (7da): peces inyectados con 1,25 x 109 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con lxlO7 UFC de L. lactis que expresa IFNg por pez. Flavo + Lactis IFNg x3: peces inyectados con 1,25 x 10 9 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 3xl07 UFC de L. lactis que expresa IFNg. Flavo + Lactis IFNg 14da : peces inyectados con 1,25 x 10 9 UFC en cultivo TYES y alimentados durante 14 días con lxlO7 UFC de L. lactis que expresa IFNg. Los duplicados se muestran como experimentos independientes.
Figura 15. Mortalidad ocasionada por Piscirickettsia salmonis en ejemplares de Salmo salar alimentados con L. lactis- IFNy (IFNg) e infectados. Se utilizaron 10 acuarios con 8 peces cada uno, de aproximadamente 45 g, evaluados en 5 condiciones en duplicado cada una. (A) Porcentaje de sobrevida obtenidos por cada acuario. (B) Porcentaje de sobrevida promediados por condición Control inyección: peces Inyectados con medio de cultivo L-15. Control desafío: peces Inyectados ¡ntraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lxlO7 bacterias vivas/mL). L. lactis + SRS: peces inyectados intraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lx 107 bacterias vivas/mL) y alimentados 7 días con L. lactis más un refuerzo de 3 días. L. lactis- IFNy (IFNg) (7da) + SRS: peces inyectados intraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lx 107 bacterias vivas/mL) y alimentados 7 días con L. lactis que expresa IFNy (IFNg) más un refuerzo de 3 días. L. lactis- IFNy (IFNg) (14da) + SRS: peces inyectados intraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lx 107 bacterias vivas/mL) y alimentados 14 días con L. lactis que expresa IFNy (IFNg). Los resultados se muestran en duplicado.
Figura 16. Mortalidad ocasionada por Piscirickettsia salmonis en ejemplares de Salmo salar alimentados con L. lactis sin inserto. Se utilizaron 6 acuarios con 7 peces cada uno, de aproximadamente 50 g, evaluados en 3 condiciones en duplicado cada una. Los peces fueron alimentados durante 7 días, al día siguiente desafiados intraperitonealmente. Control vehículo: Medio L-15. P. salmonis: P. salmonis (lxlO7 Bacterias/pez). P. salmonis + pNZ8149 s/insert: Salmo salar alimentado con alimento suplementado con L. lactis con el vector pNZ8149 sin el gen de IFNg de Salmo salar y desafiado con P. salmonis (lxlO7 Bacterias/pez). El gráfico muestra los promedios del porcentaje de sobrevida de cada condición.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un alimento probiótico que comprende una bacteria ácido láctica, especialmente, L. lactis, transformada para producir una citoquina inmunoestimulante, preferentemente, IFN de Tipo II, para inmunoestimular especies acuícolas ante infecciones bacterianas, logrando así la expresión heteróloga de una proteína inmunoestimulante de Salmo salar en una bacteria ácido láctica. La bacteria L. lactis transformada tiene número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017 de la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA, Chile.
Las proteínas inmunoestimulantes ejercen un potente efecto modulador sobre la respuesta inmune. La administración de éstas en forma recombinante ha permitido su uso terapéutico para incrementar la respuesta inmune contra bacterias patógenas. En el mercado de la acuicultura no se dispone de sistemas de producción heteróloga in situ de proteínas ¡nmunoestimulantes funcionales que permitan su uso terapéutico. Las bacterias ácido lácticas, son organismos GRAS (Generally Regarded as Safe), que en virtud de esta clasificación han sido utilizadas como sistemas de vacunación y liberación de moléculas terapéuticas.
La bacteria ácido láctica de la presente invención puede ser usada para expresar y secretar proteínas ¡nmunoestimulantes funcionales en especies acuícolas, particularmente, en peces y preferentemente en Salmo salar y trucha arcoiris. La presente bacteria ácido láctica permite la protección inmunogénica no invasiva y aplicable a gran escala, capaz de incrementar los sistemas de inmunización actuales.
La administración de la presente bacteria láctica productora de una citoquina inmunoestimulante puede estimular in vivo la expresión de genes de respuesta a IFN gamma y reducir la mortalidad de especies acuícolas desafiadas con bacterias, particularmente con F. psychropillhum y P. salmonis.
Mediante técnicas de biología molecular, se generó una cepa de bacteria ácido láctica productora de una citoquina inmunoestimulante. Sus propiedades ¡nmunoestimulantes fueron estudiadas en especies de interés acuícola, administrando una dosis oral de lxlO7 UFC en cada pez. La inmunoestimuladón se evaluó cuantificando los genes de respuesta a esta citoquina mediante real time qPCR normalizando su expresión con el gen housekepping eFla. Para lograr este objetivo el RNA total fue extraído a partir de órganos inmunológicos (Bazo y Riñón), los cuales fueron inspeccionados previamente para evaluar, a través de la morfología, signos de toxicidad.
La bacteria ácido láctica produce y secreta la proteína heteróloga. La proteína se ubicó principalmente en la fracción citoplasmática. Los bioensayos mostraron que esta proteína es funcional al estimular la expresión de genes inmunológicos.
La invención se relaciona, particularmente, con una bacteria Lactococcus lactis transformada, productora de interferón gamma (IFNg) de Salmo salar que incluye la construcción de ADN que comprende pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS, donde pNZ8149 es el vector transformado; Pl, el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,- Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar; GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas (SEQ ID No.5) y 6xHIS (SEQ ID No. l) es una secuencia que codifica para 6 H istid inas terminales. La cepa transformada de Lactococcus lactis es aquella identificada como NZ3900, no obstante, no es limitativa y pueden ser otras cepas de L. lactis. La bacteria, preferente es Lactococcus lactis NZ3900 transformada con el sistema génico que comprende el plásmido pNZ8149/Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS. En forma preferida, la cepa recombinante es aquella que tiene el número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017 de la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA, Chile.
Es parte del invento, también, un plásmido útil para transformar una bacteria L. lactis para producir interferón gamma (IFNg) que comprende el vector pNZ8149 y la secuencia Pl-Usp45-IFNy-GGG-6xHIS, donde Pl, el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,- Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar, GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas y 6xHIS es una secuencia que codifica para 6 Histidinas terminales.
Así mismo, el invento se relaciona con un método para preparar la bacteria L. lactis transformada que comprende los siguientes pasos:
a) Digerir un plásmido que contiene el marco de lectura de IFNg de Salmo salar y optimizado codogénicamente para Lactococcus lactis, con enzimas de restricción, b) Purificar el producto de digestión correspondiente al gen de IFNg con los sitios cohesivos para las enzimas de restricción,
c) En paralelo, digerir con las mismas enzimas el plásmido NZ8149,
d) Purificar el plásmido linea I izado desde gel de agarosa,
e) Ambos productos purificados, son ligados mediante una Ligasa,
f) Dializar el producto de ligación;
g) Transformar bacterias L. lactis electrocompetentes con el plásmido ligado;
Las enzimas de restricción, preferentes, para las etapas a) y c) corresponden a las enzimas de restricción Ncol y Xbal y la bacteria electrocompetente de la etapa g) es la cepa de L. lactis NZ3900. Es parte del presente invento un alimento problótlco para ¡nmunoestlmular especies acuícolas, en forma particularmente preferida, inmunoestimular peces. El alimento probiótico comprende la bacteria L. lactis transformada con una bacteria Lactococcus lactis transformada, productora de interferón gamma (IFNg) de Salmo salar que incluye la construcción de ADN que comprende pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS, donde pNZ8149 es el vector transformado; Pl, el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,- Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar, GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas y 6xHIS es una secuencia que codifica para 6 Histidinas terminales. De igual manera, el invento abarca el método para preparar un alimento probiótico antes descrito. Adicionalmente, el invento protege cualquier composición inmunomoduladora para ser administrado a especies acuícolas, en el sentido más amplio del alcance de composición. La composición puede tener una forma líquida o sólida y excipientes para otorgar estabilidad para el almacenaje y aumentar la biodisponibilidad a la bacteria transformada del presente invento. Además, la composición incluye todas las combinaciones de moléculas orgánicas útiles para la administración en especies acuícolas, siendo ellas proteínas, lípidos o sacáridos, en combinación con la bacteria L. lactis transformada, descrita precedentemente o con la bacteria descrita en la realización preferida de los ejemplos. Esta composición puede comprender, la combinación de la bacteria del invento con vacunas de proteínas recombinantes o vacunas de ácidos nucleicos, bacterinas, probióticos, prebióticos, otros inmunomoduladores, vitaminas, etc.
El uso de la bacteria L. lactis transformada es para preparar un alimento o composición útil para inmunoestimular especies acuícolas, particularmente, inmunoestimular peces. El uso dado para esta bacteria es para preparar un alimento útil para reducir la carga bacteriana, preferentemente carga bacteriana de Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis. El uso de la bacteria y del alimento que la comprende, es para preparar un alimento o composición útil para tratar o prevenir la infección de Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis en peces. Es parte del invento, un kit que incluye un envase que comprende la bacteria L. lactis transformada con la construcción de ADN pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS. Además, este kit puede comprender instrucciones para el uso de alimentar, tratar o prevenir enfermedades bacterianas en especies acuícolas, preferentemente, peces relevantes en la industria acuícola. En una realización preferida las instrucciones tienen información para el uso de alimentar peces, tratar o prevenir enfermedades causadas por Flavobacterium psychrophilum y Piscirickettsia salmonis en peces.
El invento, además, abarca el método para reducir la carga bacteriana en especies acuícolas, que comprende administrar a estas especies, el alimento mezclado con la bacteria L. lactis transformada, seleccionada de cualquiera bacteria que comprende la construcción de ADN pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS detallada en los ejemplos de la presente invención. Las especies acuícolas, preferentemente son peces, y el método trata o previene infecciones por Flavobacterium psychrophilum o Piscirickettsia salmonis. El método de administración es capaz de tratar o prevenir una infección bacteriana al reducir la carga bacteriana en especies acuícolas, preferentemente, peces.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Mediante biología sintética se diseñó y sintetizó un gen codificante para una proteína inmunoestimulante de Salmo salar optimizada codogénicamente, con un péptido de secreción y una cola de 6 histidinas (6xHis) (SEQ ID NO: l). El gen fue clonado en un vector de expresión con calidad alimentaria. La producción de la proteína heteróloga se determinó a través de Western blot y su funcionalidad fue determinada mediante bioensayos.
La presente invención consiste en una cepa recombinante de Lactococcus lactis NZ3900, que comprende el plásmido pNZ8149 en el cual se clonó un segmento de ADN sintético que comprende el promotor Pl, el péptido señal de la proteína USP45, un gen que codifica para la secuencia madura del interferón I de Salmo salar, y una cola de tres glicinas y seis histidinas, denominándose pNZ8149-IFNgSS (Figura 1). La secuencia del gen de IFNg se obtuvo a partir del genoma de Salmo salar y está optimizada codogénicamente para ser expresada en el hospedero L. lactis (Figura 1). Esta cepa expresa constitutivamente el gen de IFN gamma a partir de la presencia del Promotor Pl, de L. lactis secuencia SEQ IDNo:2, y es inducible a partir de la presencia del Promotor nisina presente en el vector comercial (Figura 2). IFNg es secretada hacia el medio de cultivo gracias a la presencia del péptldo señal Usp45, secuencia SEQ ID No:3, que está fusionado en marco con la secuencia de IFN gamma (INFg), SEQ ID No:4 (Figura 3). La expresión de IFNg fue detectada en extractos de L. lactis productor de IFNg comparada con el extracto de la cepa con que contiene el plásmido pNZ8149 sin el marco de lectura del gen (Figura 4).
Metodología
Diseño de vector pNZ8149-IFNg. Para el diseño del vector lactococcal, se utilizó como backbone (esqueleto) el plásmido pNZ8149 (Mobltec®) y un plásmido pJetl .2-IFNg (Genescript®) que contiene el marco de lectura de IFNg de Salmo salar (GenBank: FJ263446.1). In silico el gen IFNg fue optimizado codogénicamente para Lactococcus lactis nz3900 a través de la aplicación online http://www.kazusa.or.jp/codon/, y modificado de tal manera de Incorporar en sus extremo amino terminal la secuencia que codifica para el péptldo USP45, y en su extremo carboxllo la secuencia que codifica para una cola de tres glicinas y seis h istid i na (GGGHHHHHH) SEQ ID No: 5. Estas secuencias fueron colocadas en marco de lectura junto con el gen de INFg optimizado codogénicamente para L. lactis. También in silico se agregó la secuencia del promotor Pl en el extremo 5' de la secuencia que codifica para USP45-IFNg-GGGHHHHHH. Esta nueva secuencia Pl- USP45-IFNg-GGGHHHHHH fue sintetizada in vitro y clonada en pJetl.2 (Genescript co) (Figura 1). La Identidad de la secuencia génica del constructo fue corroborada mediante secuenclaclón sanger y la secuencia aminoacídlca del gen que sintetiza a través de la página http://vvww.biOinform3tics.orQ/sms2/rev trans.html.
Ya que los plásmidos pNZ8149 y pJetl.2-IFNg poseen origen de repllcaclón para ser propagado en E. col i y el marcador de selección de ampiclllna, se utilizó la cepa MC1061 para obtener altas concentraciones de ambos plásmidos. Posteriormente, ambos plásmidos fueron digeridos durante 1 hora a 37°C con las enzimas Ncol y Xbal, presentes en el sitio de múltiple clonamiento de pNZ8149 y en los extremos de IFNg presente en pJetl.2. Ambas digestiones fueron resueltas en un gel de agarosa al 1% p/v donde se obtuvo el vector lineal y el inserto para su purificación por Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega®). El vector y el inserto fueron ligados toda la noche a
4°C y al día siguiente dializados durante 30 minutos para la electroporaclón de Lactococcus lactis NZ3900 para obtener la bacteria con el vector pNZ8149-IFNg.
Detección de IFNg en cultivos de L. lactis. Para detectar la expresión de la proteína recombinante se realizaron ensayos de western blot a partir del extracto citoplasmático de L. lactis sonlcado. Para esto se creció un pre-cultivo de L. lactis pNZ8149-IFNg en M17 0,5% de lactosa toda la noche a 30 °C. Al día siguiente se inoculó al 2% un cultivo de 40 mL, luego de cultivar a 30 °C hasta que la ODS00 alcanzara un valor entre 0,4 y 0,6, el cultivo se dividió en volúmenes iguales. A unos cultivos se agregó concentraciones de nlsina entre 0 y 10 ng/mL. Los cultivos se Incubaron durante 2 horas a 30 °C. Posteriormente, las bacterias fueron colectadas por centrifugación a 7.000 rpm durante
20 mln a 4 °C.
El pellet bacteriano se resuspendió en 500 uL de PBS1X suplementado con Inhibidor de proteasas 1 mM. Luego, es sonlcado 5 veces durante 15 segundos en un equipo Ultrasonlc processor Sonic Vlbracell VCX130 (amplitud del 90%) incubando en hielo entre cada ciclo. La muestra se centrifugó a 6000 rpm durante 10 mln a 4°C y el sobrenadante se separó del debris celular en un nuevo tubo que fue congelado a -20 °C hasta su uso. Para determinar la concentración de proteínas totales en el extracto se utilizó el método de Bradford. Una vez conocida la concentración, esta se normalizó para resolver y comparar la cantidad de proteína mediante electroforesis SDS-PAGE. Se cargaron 10 pg del extracto citoplasmático de L. lactis productor de IFNg Inducido y no inducido con nlsina, además de un extracto de L. lactis que contiene el plásmldo pNZ8149 sin el marco de lectura del gen para IFNg como control. Las muestras fueron sometidas a electroforesis durante 40 mln a 60 V y luego 1,5 horas a 120 V. Las proteínas contenidas en el gel de poliacrllamlda fueron electrotransferldas a una membrana de nltrocelulosa a 300 mA durante 7 min. Posteriormente, la membrana se bloqueó en una solución de PBS-BSA al 2% con agitación a 4°C durante toda la noche. A continuación, la membrana se lavó a temperatura ambiente tres veces durante 10 minutos con PBS lX-Tween 20 al 0,1% y se Incubó durante 1 hora con una dilución 1 :2.000 del anticuerpo primario antl- His (Abcam) en PBS-BSA al 2%. Luego, la membrana se lavó con el mismo procedimiento y se Incubó durante 1 hora con una dilución 1 : 5.000 del anticuerpo secundario antl IgG de conejo conjugado a peroxldasa de rábano. Se volvió a lavar la membrana y se reveló mediante qulmioluminiscencla con el kit superslgnal® West Pico Chemiluminescent Substrate, Incubando las soluciones durante 5 minutos y exponiendo la membrana en un equipo de revelado digital C-DIGIt model 3600 (LI-COR) durante 7 minutos para la adquisición de Imágenes.
Detección de IFNg en sobrenadantes de cultivos de L. lactis Para detectar la proteína del sobrenadante del cultivo de L. lactis, el sobrenadante obtenido luego de la centrifugación del cultivo bacteriano, se precipitó con seis volúmenes de acetona y se almacenó a -20 °C toda la noche. Luego, se centrifugó a 6.000 rpm durante 10 min a 4°C, se descartó el sobrenadante y el precipitado fue lavado dos veces con 1 mL de agua bidesti lada, finalmente el pellet se resuspendió en 50 uL de buffer de carga para proteínas. Para la detección de la proteína se utilizó el protocolo de westernblot descrito previamente.
Cuantificación de mRNA para INFg en cultivos de L. lactis. Para correlacionar el nivel de inducción de la proteína con el nivel de RNAs mensajeros de IFNg generados por L. lactis (Figura 4) se replicaron las condiciones de crecimiento e inducción de la bacteria. Luego de haber inducido con nislna durante 2 horas, el cultivo bacteriano se centrifugó a 6000 r.p. m a 4 °C durante 10 minutos, el sobrenadante fue eliminado y la bacteria se liso en 1 mL de Trizol para extraer el RNA total según recomendación del fabricante. Posteriormente, el RNA se trató con DNasal (Promega®) para eliminar trazas de DNA plasmidlal contaminante, y se utilizó como plantilla para cuantlflcar el número de coplas del mRNA que codifica IFNg mediante qRT-PCR. La mezcla de reacción utilizada fue la siguiente: 2 uL de RNA total (100 ng), 5 uL de 2X SensIMix SYBR No-ROX One-Step Kit, 0,5 uL de primer Fw IFNy L. lactis, 0,5 uL de primer Rv IFNy L. lactis (lOmM) (Tabla 2) y 2 uL de agua libre de nucleasas.
Actividad biológica de IFNg producido en L. lactis. Para determinar si la proteína generada es activa biológicamente, se incubaron extractos citoplasmáticos de la bacteria en la línea celular SHK-1 derivada de Salmo salar (Tabla 1) y posteriormente se cuantificaron algunos transcritos Involucrados en la respuesta de IFNg. Brevemente, distintas proporciones entre extractos citoplasmáticos de L. lactis y L. lactis- IFNg fueron mezclados con medio de cultivo L-15 e incubados durante 8 horas a 16°C en células SHK-1 con el fin de determinar la contribución de la proteína recomblnante entre el contenido total de proteínas aportadas por la bacteria. Posteriormente, el RNA total de las células de salmón fue extraído mediante el kit E.Z.N .A Total RNA (OMEGA blo-tek) y tratadas con DNAsa I (Promega®). El RNA tratado se utilizó como plantilla para la síntesis de cDNA con Ollgos (dT) con la siguiente mezcla de reacción : 11 uL de RNA tratado, 0,5 uL de OllgodT (lOmM), 1 uL de dNTPs (lOmM cada uno), 0,5 uL de M-MLV (Promega®), 7 uL de agua libre de nucleasas. El cDNA obtenido fue diluido 1 :2 y utilizado como plantilla para la cuantlflcaclón relativa de los transcritos asociados a la respuesta inmune mediante qPCR con la siguiente mezcla de reacción: 2 uL cDNA, 5 uL de 2X SensIMix SYBR No-ROX Kit, 0,25 uL de Fw (lOmM), 0,25 uL de Rv (lOmM) y 2 uL de agua libre de nucleasas (Tabla 2).
Tabla 1. (Figura 5) Cantidad de proteína total utilizada en cada ensayo para determinar la contribución de IFNg en la respuesta inmune de SHK-1. Se normalizó la cantidad de proteína final a 20ug mezclando los volúmenes de sonicado de L. lactis que expresa IFNg (L.L IFNg) y de L. lactis que no la expresa (L.L vacío). A partir de esta cantidad final se hicieron las concentraciones posteriores de trabajo.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Tabla 2. Secuencia nucleotídica de los primers utilizados para la cuantlflcaclón de genes de respuesta inmune y patógenos evaluados.
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Descripción de los Resultados
La pNZ8149-IFNg tiene un marcador de selección tipo grado alimentario ("food grade" ) que permite el metabolismo de lactosa (LacF), contiene un promotor constitutivo pl y un promotor inducible por nisina (PnisA), la señal de secreción natural de L. lactis Usp45, el gen que codifica para IFNg de Salmo salar y un "tag" de histid inas . RepA y RepC son genes que permiten la repllcaclón del plásmido (Figura 1). Al transformar bacterias NZ3900 que presenta una deleclón cromosomal en el ORF de lactosa, la bacteria puede utilizar esta fuente de carbono y mantener el plásmido. El promotor constitutivo Pl permite la expresión de IFNg, esta inducción puede aumentar proporclonalmente con la cantidad de nisina adicionada al medio de cultivo gracias al promotor pNisA (Figura 2). La proteína es fácilmente detectable desde la fracción cltoplasmátlca mediante western blot, sin embargo la cantidad de proteína secretada esta en mucha menor proporción (Figura 3). Este mismo aumento en la cantidad de proteína detectada mediante western blot puede observarse al cuantificar el número de transcritos del mRNA de IFNg mediante qRT-PCR. (Figura 4).
Al utilizar el extracto cltoplasmátlco de la bacteria sonlcada en la línea celular de salmón SHK-1, normalizando la cantidad de proteína total (Tabla 1) es posible detectar la Inducción de transcritos como STAT1, glPlO e IL-lb, sugiriendo que la proteína es funcional in vitro ya que estas dos primeras están Involucrados en la cascada de señalización Iniciada por IFNg y la tercera Involucrada en la respuesta prolnflamatorla natural posterior a IFNg. (Figura 5). Por otro lado, al cuantificar IL-6, una cltoqulna plelotróplca asociada a una Inducción en la respuesta Inmune Innata, aumenta proporclonalmente con la cantidad de proteína recomblnante presente en el cultivo, sugiriendo que IFNg estaría sorpresivamente Induciendo su expresión.
Ejemplo 2: Efectos de la administración de la bacteria L. lactis que produce IFNg Para evaluar el efecto ¡nmunoestlmulador de L. lactis productor de IFNg en un modelo in vivo, se montó un ensayo con ejemplares de trucha arcoírls (gramaje <x> : 20-25 g) donde se evaluó, a través del tiempo, el efecto que tiene el problótlco durante la alimentación y posterior a este como se representa en el esquema de la Figura 6.
La estrategia fue aclimatar a los peces durante 7 días, posteriormente Inicia la alimentación especial con a) L. lactis- IFNg, b) L. lactis con el vector sin Inserto y c) alimentados con alimento comercial durante 7 días. A los días 0 (antes del tratamiento), 2, 4 y 6 de alimentación se realizaron muéstreos de 3 peces por cada tiempo. Luego, se suspende la alimentación especial y todos los peces son alimentados con el pellet comercial. Se analizaron grupos de 3 peces nuevamente a los 1, 3, 5 y 7 días post alimentación con el problótlco. Para día de los muéstreos, durante la alimentación (d .a) y post alimentación (d.p.a) se extrajeron 300 uL de sangre a tres ejemplares, los cuales fueron posteriormente sacrificados para la extracción de bazo y riñón. La sangre se utilizó para cuantificar la actividad enzlmátlca de llsozlma en suero mediante suspensiones de Micrococcus iuteus. El ensayo constó de medir la disminución en la absorbancla a 450 nm desde 180 uL del stock de M. Iuteus Incubado con 20 uL de suero directo, utilizando como control positivo 200-400 unidades de llsozima/mL. Los cálculos de la cantidad de llsozlma en suero se llevaron a cabo con la siguiente fórmula :
(AA min Muestra - AA min Blanco)
un¡dades/ml enzima =
(0.001) (0.02)
Para determinar si existe estimulación de la respuesta Inmune a nivel de transcrito se extrajo el RNA total desde bazo y riñón con TRIZOL siguiendo las recomendaciones del fabricante. A continuación, se cuantificaron las citoquinas: IL-Ib, IL-6, IL-12, TGF-b, IFNy, gamma IP10 y STAT1 mediante cuantificación relativa. El RNA tratado con DNAsa I se utilizó como plantilla para la síntesis de cDNA con Ollgos (dT) con la siguiente mezcla de reacción: 11 uL de RNA tratado, 0,5 uL de OllgodT (lOmM), 1 uL de dNTPs (lOmM cada uno), 0,5 uL de M-MLV (Promega®), 7 uL de agua libre de nucleasas. El cDNA obtenido fue diluido en una proporción 1 :2 y utilizado como plantilla para la cuantificación relativa de los transcritos asociados a la respuesta Inmune mediante qPCR con la siguiente mezcla de reacción : 2 uL cDNA, 5 uL de 2X SensIMIx SYBR No-ROX Kit, 0,25 uL de Fw (lOmM), 0,25 uL de Rv (lOmM) y 2 uL de agua libre de nucleasas (Tabla 2).
Para evaluar si la ¡nmunoestlmulaclón observada es capaz de generar protección contra patógenos de Importancia en la salmonlcultura, se montó un desafío en ejemplares de trucha arcolrls (gramaje <x> : 15-20 g) utilizando F. psychrophilum (lxlO8 bacterlas/pez) como modelo. Los peces fueron aclimatados durante 7 días, posteriormente se Inicia la alimentación especial durante 7 días y 5 días post alimentación se realiza el desafío. Luego se registró la mortalidad durante los siguientes 18 días post Infección para evaluar la respuesta ¡nmunltarla y la carga bacteriana.
En este ensayo se evaluaron los tratamientos: a) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis- IFNg (lxlO7 bacterlas/pez) y posteriormente Infectados, b) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis que contiene el plásmldo sin Inserto (lxlO7 bacterlas/pez) y posteriormente Infectados y c) Peces alimentados durante 7 días con alimento comercial y posteriormente Infectados. Se registró la mortalidad durante 17 días post Infección donde se extrajo el bazo de peces que se observaron moribundos durante el ensayo y de peces que sobrevivieron hasta el término del ensayo para la cuantlflcaclón de la carga bacteriana
Para definir si mayores dosis o una administración de la dieta más prolongada puede mejorar la sobrevivencia se realizó otro desafío en ejemplares de trucha arcoiris (gramaje <x> : 30-40 g) con F. psychrophilum (lxl O8 bacterias/pez). En este ensayo los peces fueron aclimatados durante 7 días, posteriormente se inicia la alimentación especial durante 7 días y 5 días post alimentación se realiza el desafío. Para esto se evaluaron los tratamientos: a) Peces alimentados durante 7 días con una dosis tres veces más alta de L. lactis- IFNg que la original (3xl07 bacterias/pez) y posteriormente infectados, b) Peces alimentados durante 13 días con L. lactis- IFNg (lxlO7 bacterias/pez) y posteriormente infectados, c) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis- IFNg (lxlO7 bacterias/pez) y posteriormente infectados y d) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis que contiene el plásmido sin inserto (lxlO7 bacterias/pez) y posteriormente infectados y e) Peces alimentados durante 7 días con alimento comercial y posteriormente infectados. Para determinar si la administración del probiótico altera el estado físico de los peces se registró la talla y el peso de los peces sobrevivientes al final del ensayo.
Para evaluar el efecto protector de L. lactis- IFNg en la especie Salmo salar, se utilizó como patógeno modelo la bacteria intracelular Pisiricketssia salmonis (1 x 107 bacterias/pez). Los peces se aclimataron durante 7 días y posteriormente se iniciaron los siguientes tratamientos: Peces alimentados durante 7 días con L. lactis- IFNg (1 x 107 bacterias/pez) y posteriormente infectados, b) Peces alimentados durante 14 días con L. lactis- IFNg (1 x 107 bacterias/pez), c) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis que contiene el plásmido sin inserto (1 x 107 bacterias/pez) y posteriormente infectados y d) Peces alimentados durante 7 días con alimento comercial y posteriormente infectados. La mortalidad fue registrada durante los siguientes 23 días post infección.
Carga Bacteriana. La carga bacteriana de peces infectados con P. salmonis o F. psycrophillum se realizó mediante qPCR absoluto usando DNA total extraído a partir de los Orga nos inmunológicos del salmónidos Bazo y Riñón. A partir de estos Organos DNA total fue extraído con el Kit Wlzzart Genomlc DNA, promega . El DNA purificado fue cuantlflcado por absorbancla a 260 nm. 50 ng de DNA tota l fueron utilizados para la reacción de qPCR. Para la detección de F. psycrophillum se utilizaron los partidores rpoS- F (5’ GAA GAT GGA GAA GGT AAT TIA GTT GAT 3'), SEQ ID No: 23, y rpoS-R (5' CAA ATA ACA TCT GGT TTT TGT ACA ACT 3'), SEQ ID No: 24, que permiten la ampllflcanclon de un fragmento de 200 pb. Para la detección de P. salmonis si utilizaron los partidores 16SPS- F (5' AGG GAG ACT GGC GGT GAT A 3'), SEQ ID No: 26, y 16SPS-R (5' AGT ACG AGG CGC TTT CTC A3'), SEQ ID No :27. Cada producto de amplificación dio un solo peak de desnaturación Indicando la amplificación de un producto específico. Para cada uno de los ampllcones se construyó una curva de calibración basada en concentraciones creciente del producto PCR previamente clonado en pGEM-T. De esta manera se Infirió el número de bacterias, asumiendo que el número de coplas de cada gen es único dentro del cromosoma de cada una de las bacterias.
Descripción de los Resultados
Para evaluar el efecto in vivo la bacteria transformada se administró junto a la alimentación de ejemplares sanos de trucha arcolrls y se analizaron dura nte y post alimentación. Se ana lizaron dos parámetros desde bazo y riñón : a) los transcritos asociados a la respuesta Inmune de IFNg desde bazo y riñón dura nte la alimentación (Figura 7) y post alimentación con el problótlco (Figura 9 de la A a la E) y b) la actividad enzlmátlca de llsozlma desde suero d ura nte (Figura 8) y post alimentación (Figura 10) con el problótlco. Al observar la Inducción de los transcritos durante la alimentación, se obtiene un aumento de IL-12, STAT1 y gamma IP10, el primero Involucrado en la respuesta celular que genera el aumento de IFNg, y los otros dos asociados a la respuesta rio abajo de IFNg . Al evaluar el efecto del problótlco post alimentación ya no se ve un a umento significativo en los transcritos asociados a IFN tipo II, pero si existe una estimulación de la cltoqulna a ntünflamatorla (TGF-b) y un aumento considerable de IL-6 desde el quinto día post allmentanclón, efecto correlacionado a lo observado en cultivo celular. Cua ndo se cua ntlflca la actividad enzlmátlca de llsozlma no se ve un aumento de este durante la alimentación, sin embargo, existe un fuerte aumento importante desde el quinto dia post alimentación, mismo comportamiento observado para IL-6 mediante qPCR, lo que podría estar proponiendo que esta citoquina estaría involucrada en los niveles de lisozima séricos.
Ya que se obtuvo estimulación de genes involucrados en la respuesta IFN tipo II, se evaluó el efecto protector del probiótico, para esto se montó otro ensayo en ejemplares de trucha arcoíris frente a un desafío con Flavobacterium psychrophillum ("Figura 11). Los peces alimentados con L. lactis- IFNg (Tratamiento a) presentaron una sobrevivencia mayor al 70%, no así los peces alimentados con L. lactis que posee el plásmido sin inserto que sólo alcanzaron un 35% de sobrevivencia (Tratamiento b). Los peces que no recibieron tratamiento con el probiótico fueron los que presentaron menor porcentaje de sobrevivencia (25%), (Tratamiento c). Al comparar la carga bacteriana de los peces que murieron durante el ensayo con los de los peces sobrevivientes se observa que hay una disminución de al menos dos órdenes de magnitud en el número de copias del gen RpoS de la bacteria (Figura 12). Por lo tanto, la proteína heteróloga generada por L. lactis estaría protegiendo a los peces frente a la infección con F. psychrophilum.
Al administrar L. lactis- IFNg durante mayor tiempo (13 días en lugar de 7) se observó un mayor porcentaje de sobrevivencia (54%) que los peces alimentados solo durante 7 días (42%), mismo efecto se observó en los peces alimentados con una dosis tres veces mayor a la original (42%), indicando un mejor efecto al prolongar la alimentación (Figura 13). Los peces alimentados solo con L. lactis (Tratamiento d) presentaron un bajo porcentaje de sobrevivencia (29%) muy cercano el 25% obtenido en los peces alimentados solo con peí let comercial (Tratamiento e), comportamiento ya observado en el ensayo anterior. Este menor porcentaje de protección en el total de los diversos tratamientos podría deberse al mayor gramaje de los peces (<X> : 30-40 g en relación con <x> : 15-20 g), sugiriendo que el probiótico presenta mejores propiedades en estadios más tempranos de trucha arcoiris. Al evaluar el peso o la longitud de los ejemplares sobrevivientes al final del ensayo no se encontraron diferencias significativas (Figura 14), sugiriendo que el probiótico no altera el estado físico del pez. Con el fin de evaluar el potencial del problótlco en ejemplares de Salmo salar desafiados con Pisciricketssia salmonis se observa que los peces alimentados con L. lactis- IFNg durante 7 días (tratamiento a : Sobrevivencia de 28%) presentan un leve aumento en la protección en relación a los peces tratados con el problótlco durante 14 días (tratamiento b: sobrevivencia de 25%) sugiriendo que el efecto protector contra P. salmonis se da al alimentar a los peces durante 7 días y posteriormente se mantiene constante. Por otro lado, los peces alimentados con L. lactis que posee el plásmldo sin Inserto (tratamiento c: sobrevivencia : 0%) mostraron mortalidad total, sin embargo, los peces alimentados con L. lactis que posee el plásmldo sin el Inserto mostraron una disparidad significativa en su mortalidad (tratamiento d : 12% y 50% cada réplica). Por lo tanto, L. lactis- IFNg puede contribuir a la sobrevivencia de los peces frente a Infecciones con P. salmonis. (Figura 15).
Para determinar si L. lactis pNZ8149 sin Inserto genera un efecto en la sobrevivencia de los peces frente a desafíos con P. salmonis se repitió el ensayo con ejemplares de Salmo salar (Gramaje <x> : 50g) Infectados y alimentados con el problótlcos (Figura 16), observando que el comportamiento registrado en los niveles de mortalidad ocasionado fue el mismo que en los peces Infectados sin alimentación especial Indicando que la bacteria per se no genera protección.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CONSORCIO TECNOLOGICO DE SANIDAD ACUICOLA S.A. (90%) UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE (10%)
<120> BACTERIA LACTOCOCCUS LACTIS TRANSFORMADA, PRODUCTORA DE
INTERFERON GAMMA (IFNG) DE SALMO SALAR, ALIMENTO Y COMPOSICION QUE LA COMPRENDE, PARA INMUNOESTIMULAR ESPECIES ACUICOLAS <130>
<140>
< 141 > <150> CL 201702897
<151> 2017-11-14
<160> 27 < 170 > ASCII Text
<210> 1
<211> 778
<212> ADN
<213> Secuencia Artifical
<220> gen
<223> gen que codifica para proteína inmunoestimulante de Salmo Salar <400> 1
CCATGGTATA GATCTAATTA ATCTATAAAC CATATCCCTC TTTGGAATCA AAATTTATTA 60 TCTACTCCTT TGTAGATATG TTATAATACA AGTATCAATG ATCTGGGAGA CCACAACGGT 120 TTCCCACTAG AAATAATPT GTTTAACTTT AGAAAGGAGA TATACGCATG AAAAAAAAGA 180 TTATCTCAGC TATTTTAATG TCTACAGTGA TACTTTCTGC TGCAGCCCCG TTGTCAGGTG 240 TTTACGCTGC TCAATATACA TCAATTAATA TGAAATCAAA TATTGATAAA CTTAAAGTAC 300 ATTATAAAAT TAGTAAAGAT CAATTGTTTA ATGGAAAACC AGTTTTTCCT AAAGATACAT 360 TTGAAGATTC AGAACGTAGA GTTTGGATGT CTGTTGTATT AGATGTATAT CGTTCAATTT 420 TTAATCAAAT GCTTAATCAA ACAGGTGATC AAGAAGTACG TGAAAGATTA GATCAAGTTA 480 AAGGAAAAGT ACAAGAAACT CAAAAACATT ATTTTCTTAA ACGAATTCCA GAATTGAGAA 540 CACATTTGCA AAATCTTTGG GCTATTGAAA CTAGTAATAC AACTGTTCAA GGAAAAGCAT 600 TGTCAGAATT TATTACTATT TATGAAAAAG CTTCTAAATT AGCACTTAAA ATTCATTTAA 660 AGAAAGATAA TCGACGTAAA AGACGACAAG CACAACGATT GAAAAGTAGT ATTATGGGAG
720
GTGGACATCA TCATCATCAT CATTAAAAAA AAGTCTTAAA ATAATAAAAA TAGTCTAGA 778
<210> 2
<211 > 161
<212> ADN
<213> Partidor
<220> Partidor Pl, L. lactis
<223> Partidor que expresa IFNg
<400> 2
TATAGATCTA ATTAATCTAT AAACCATATC CCTCTTTGGA ATCAAAATTT ATTATCTACT 60
CCTTTGTAGA TATGTTATAA TACAAGTATC AATGATCTGG GAGACCACAA CGGTTTCCCA 120 CTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTTTAGAAAG GAGATATACG C
<210> 3
<211 > 81
<212> ADN
<213> precursor proteína secretada
<220> Usp45
<223> ácido nucleico que permite que se secrete IFNg
<400> 3
ATGAAAAAAA AGATTATCTC AGCTATTTTA ATGTCTACAG TGATACTTTC TGCTGCAGCC 60 CCGTTGTCAG GTGTTTACGC T.
<210> 4
<211 > 558
<212> ADN
<213> precursor de proteína
<220> precursor
<223> precursor de IFNg
<400> 4
GCTCAATATA CATCAATTAA TATGAAATCA AATATTGATA AACTTAAAGT 60
ACATTATAAA ATTAGTAAAG ATCAATTGTT TAATGGAAAA CCAGTTTTTC 120 CTAAAGATAC ATTTGAAGAT TCAGAACGTA GAGTTTGGAT GTCTGTTGTA 180
TTAGATGTAT ATCGTTCAAT TTTTAATCAA ATGCTTAATC AAACAGGTGA 240 TCAAGAAGTA CGTGAAAGAT TAGATCAAGT TAAAGGAAAA GTACAAGAAA 300 CTCAAAAACA TTATTTTCTT AAACGAATTC CAGAATTGAG AACACATTTG 360 CAAAATCTTT GGGCTATTGA AACTAGTAAT ACAACTGTTC AAGGAAAAGC 420 ATTGTCAGAA TTTATTACTA TTTATGAAAA AGCTTCTAAA TTAGCACTTA 480 AAATTCATTT AAAGAAAGAT AATCGACGTA AAAGACGACA AGCACAACGA 540
TTGAAAAGTA GTATTATG
<210> 5
<211 >
<212> ADN
<213> ácido nucleico que codifica secuencia de amino ácido
<220> secuencia nucleotida
<223> ácido nucleico que codifica secuencia amino ácido terminal <400> 5
GGAGGTGGAC ATCATCATCA TCAT
<210> 6
<211 > 20
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW partidor <223> FW pa rtidor IFNg salmón
<400> 6
CCGTACACCG ATTGAGGACT
<210> 7
<211 > 20
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor IFNg salmón
<400> 7
GCGGCATTAC TCCATCCTAA
<210> 8
<211 > 20
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW pa rtidor
<223> FW pa rtidor ILl b salmón
<400> 8
CCCCATTGAG ACTAAAGCCA <210> 9
<211> 20
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor ILlb salmón
<400> 9
GCAACCTCCT CTAGGTGCAG
<210> 10
<211> 20
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW partidor
<223> FW partidor TGF-B salmón
<400> 10
AGCTCTCGGA AGAAACGACA
<210> 11
<211> 20
<212> ADN
<213> partidor <220> RV partidor
<223> RV partidor TGF-B salmón
<400> 11
AGTAGCCAGT GGGTTCATGG
<210> 12
<211 > 22
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW pa rtidor
<223> FW pa rtidor gamma IP10 salmón
<400> 12
GTGTCTGAAT CCAGAGGCTC CA
<210> 13
<211 > 22
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor ga mma IP10 salmón
<400> 13 TCTCATGGTG CTCTCTGTTC CA
<210> 14
<211 > 23
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW pa rtidor
<223> FW pa rtidor IFNg Lactis-IFNg
<400> 14
CACATTTGCA AAATCTTTGG GCT
<210> 15
<211 > 21
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor IFNg Lactis-IFNg
<400> 15
CAATCGTTGT GCTTGTCGTC T
<210> 16
<211 > 21 <212> ADN
<213> partidor
<220> FW pa rtidor
<223> FW pa rtidor IL-6 salmón
<400> 16
CCTTGCGGAA CCAACAGTTT G
<210> 17
<211 > 22
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor IL-6 salmón
<400> 17
CCTCAGCAAC CTTCATCTGG TC
<210> 18
<211 > 23
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW pa rtidor
<223> FW pa rtidor IL-12 salmón <400> 18
TGACGCTTTT TCTCACCGGT TGT
<210> 19
<211 > 22
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor IL-12 salmón
<400> 19
ACGCTTTGCA GCATGAGCTT GA
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW partidor
<223> FW partidor eFla salmón
<400> 20
GGGTGAGTTT GAGGCTGGTA <210> 21
<211 > 20
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor eFla salmón
<400> 21
TTCTGGATCT CCTCAAACCG
<210> 22
<211 > 30
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW pa rtidor
<223> FW pa rtidor RpoS F. pyschrophilum
<400> 22
GAAGATGGAG AAGGTAATTT AGTTGATATT
<210> 23
<211 > 30
<212> ADN
<213> partidor <220> RV partidor
<223> RV partidor RpoS F. pyschrophilum
<400> 23
CAAATAACAT CTCCTTTTTC TACAACTTGA
<210> 24
<211 > 24
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW partidor
<223> FW partidor STAT1
<400> 24
GACCAGCGAA CCCAAGAACC TGAA
<210> 25
<211 > 23
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor STAT1
<400> 25 CACAAAGCCC AGGATGCAAC CAT
<210> 26
<211 > 19
<212> ADN
<213> partidor
<220> FW pa rtidor
<223> FW pa rtidor rDNA 16S P. salmonis
<400> 26
AGGGAGACTG CCGGTGATA
<210> 27
<211 > 19
<212> ADN
<213> partidor
<220> RV partidor
<223> RV partidor rDNA 16S P. sa lmonis
<400> 27
ACTACGAGGC GCTTTCTCA

Claims

REIVINDICACIONES
1. Bacteria Lactococcus lactis transformada, productora de interferón gamma (IFNg) de Salmo salar, caracterizada porque comprende la construcción de ADN que comprende pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS, donde pNZ8149 es el vector transformado;
Pl, el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,· Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar, GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas y 6xHIS es una secuencia que codifica para 6 Histidinas terminales.
2. Bacteria Lactococcus lactis transformada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada la cepa de Lactococcus lactis es aquella identificada como NZ3900.
3. La bacteria L. lactis transformada de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque tiene el número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017.
4. La bacteria L. lactis transformada de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque comprende la cepa recombinante de Lactococcus lactis NZ3900 que comprende el sistema génico que comprende el plásmido pNZ8149/Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS.
5. Plásmido para transformar bacteria L. lactis para producir interferón gamma (IFNg), caracterizado porque comprende el vector pNZ8149 y la secuencia Pl-Usp45-IFNy- GGG-6xHIS; donde Pl, es el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,- Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar, GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas y 6xHIS es una secuencia que codifica para 6 Histidinas terminales.
6. Método para preparar la bacteria L. lactis transformada de la reivindicación 1, caracterizada porque comprende los siguientes pasos:
a) Digerir un plásmido que contiene el marco de lectura de IFNg de Salmo salar y optimizado codogénicamente para Lactococcus lactis, con enzimas de restricción; b) Purificar el producto de digestión correspondiente al gen de IFNg con los sitios cohesivos para las enzimas de restricción;
c) En paralelo, digerir con las mismas enzimas el plásmido NZ8149; d) Purificar el plásmido linea lizado desde gel de agarosa;
e) Unir mediante una Ligasa ambos productos purificados;
f) Dializar el producto de ligación;
g) Transformar bacterias L. lactis electrocompetentes con el plásmido ligado;
7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque las enzimas de restricción de las etapas a) y c) corresponden a las enzimas de restricción Ncol y Xbal.
8. Método de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la bacteria electrocompetente de la etapa g) es la cepa de L. lactis NZ3900.
9. Alimento probiótico para inmunoestimular peces, caracterizado porque comprende la bacteria L. lactis transformada, seleccionada de cualquiera de las bacterias de las reivindicaciones 1 a 4.
10. Método para preparar un alimento probiótico para inmunoestimular especies acuícolas, caracterizado porque comprende mezclar la bacteria L. lactis transformada, seleccionada de cualquiera de las bacterias de las reivindicaciones 1 a 4 con un alimento para especies acuícolas.
11. Composición inmunomoduladora de especies acuícolas, caracterizado porque comprende la bacteria L. lactis transformada, seleccionada de cualquiera de las bacterias de las reivindicaciones 1 a 4.
12. Uso de la bacteria L. lactis transformada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque sirve para preparar un alimento o composición útil para inmunoestimular especies acuícolas.
13. Uso de la bacteria L. lactis transformada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque sirve para preparar un alimento o composición útil para inmunoestimular peces.
14. Uso de la bacteria L. lactis transformada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque sirve para preparar un alimento o composición útil para reducir la carga bacteriana.
15. El uso de la reivindicación 14, caracterizado porque dicha carga bacteriana es una carga de bacteriana de Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis.
16. Uso de la bacteria L. lactis transformada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque sirve para preparar un alimento o composición útil para tratar o prevenir la infección de Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis en peces.
17. Kit inmunomodulador de especies acuícolas, caracterizado porque comprende un envase que comprende la bacteria L. lactis transformada, seleccionada de cualquiera de las bacterias de las reivindicaciones 1 a 4.
18. Kit de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende instrucciones para el uso para alimentar, tratar o prevenir enfermedades bacterianas en especies acuícolas.
19. Kit de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende instrucciones para el uso para alimentar, tratar o prevenir enfermedades causadas por Flavobacterium psychrophilum y Piscirickettsia salmonis en peces.
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