WO2019069885A1 - アナライトの検出方法 - Google Patents
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- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
Definitions
- the present invention relates to a method of detecting an analyte, and more particularly, to a method of detecting an analyte that uses a biological sample mainly as a sample and detects a small amount of analyte with high sensitivity.
- an analyte (antigen) is bound to a fixed first ligand (solid phase antibody), and a labeled second ligand (labeled antibody) is bound to the analyte to obtain a first ligand.
- a labeled second ligand (labeled antibody) is bound to the analyte to obtain a first ligand.
- -Analyte forms a sandwich system of the second ligand and detects the analyte by measuring the labeled second ligand when the binding between the first ligand, the analyte and the second ligand is achieved to some extent Do.
- SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
- surface plasmon light (coarse wave) on the surface of a metal thin film under the condition that attenuated total reflection (ATR) occurs on the surface of the metal thin film with excitation light such as laser light emitted from a light source.
- excitation light such as laser light emitted from a light source.
- the amount of photons of the excitation light irradiated from the light source is increased to several tens to several hundreds by generating the electric field, and the electric field enhancing effect of surface plasmon light is obtained.
- the fluorescent substance bound (labeled) to the captured analyte is efficiently excited, and this fluorescence is observed to detect an extremely low concentration of analyte.
- analyte an analyte
- affinity affinity between an analyte (antigen) and a second ligand (labeled antibody)
- the second ligand is an analyte.
- the detection accuracy of the analyte is not high because it can not be accurately coupled to the
- Patent Document 1 includes carboxymethyl dextran in a sample dilution liquid to cause contaminates contained in the sample to be captured by carboxymethyl dextran, and contamination Discloses a method of improving the detection accuracy of an analyte by suppressing the increase of blanks due to
- this method can be expected to improve detection accuracy by blank reduction, but when the binding strength between the analyte and the second ligand is weak, the detection sensitivity itself of the analyte does not increase, so the detection accuracy of the analyte There was a limit to improve the
- An object of the present invention is to provide a method for detecting an analyte with high detection sensitivity of an analyte even when the binding strength between the analyte to be measured and the labeled ligand is weak in an immunoassay etc. It is.
- a method of detecting an analyte of the present invention which achieves the above object comprises: supplying an analyte onto the substrate of a detection device having a first ligand capable of specifically binding to the analyte, which is immobilized on the substrate; A first step of binding an analyte contained in the sample to the first ligand; A second ligand labeled with a labeling substance, capable of specifically binding to the analyte, is supplied onto the substrate, and the second ligand is bound to the analyte bound to the first ligand. And the process of Measuring the second ligand bound to the analyte, and In the second step, carboxymethyl dextran is provided on the substrate.
- carboxymethyl dextran is preferably supplied on the substrate at a concentration of 1 to 30 mg / mL.
- carboxymethyl dextran is preferably supplied on the substrate together with the second ligand.
- a second ligand-containing liquid containing the second ligand and carboxymethyl dextran is provided on the substrate.
- carboxymethyl dextran is provided.
- carboxymethyl dextran is contained in a washing solution for washing the substrate after the second ligand is bound to the analyte in the second step.
- the analyte is preferably cardiac troponin I (cTnI) or brain natriuretic peptide (BNP).
- the kit for detecting an analyte of the present invention is a kit used in the method for detecting an analyte, which comprises a second ligand-containing solution containing the second ligand and carboxymethyl dextran.
- the kit for detecting an analyte of the present invention is a kit used in the method for detecting an analyte, which comprises a washing solution for washing the substrate, which contains carboxymethyl dextran.
- the method for detecting an analyte of the present invention can detect an analyte with high sensitivity even when the amount of the analyte is small and the binding strength between the analyte and the labeled ligand is weak. .
- the analyte detection kit of the present invention can be effectively used in the above-described analyte detection method.
- the method for detecting an analyte according to the present invention comprises: providing an analyte on the substrate of a detection device having a first ligand capable of specifically binding to the analyte immobilized on the substrate, and being contained in the analyte Binding an analyte to the first ligand; A second ligand labeled with a labeling substance, capable of specifically binding to the analyte, is supplied onto the substrate, and the second ligand is bound to the analyte bound to the first ligand. And the process of Measuring the second ligand bound to the analyte, and In the second step, carboxymethyl dextran is provided on the substrate.
- an analyte in a first step, an analyte (antigen) is bound to a first ligand (solid phase antibody) immobilized on a substrate of a detection device, and in a second step, the first ligand is bound to the first ligand
- the labeled second ligand (labeled antibody) is specifically bound to the selected analyte, and in the third step, indirectly by measuring the labeled second ligand bound to the analyte by any method.
- the method for detecting an analyte according to the present invention is characterized in that carboxymethyl dextran is provided on a substrate in the second step.
- the second ligand which is the target of the measurement can not be bound properly to the analyte, so the analyte can be precisely detected. It could not be detected.
- the method for detecting an analyte according to the present invention in the second step, by supplying carboxymethyl dextran on the substrate, even if the binding strength between the analyte and the labeled second ligand is weak, the It becomes possible to detect the light with high sensitivity.
- the carboxyl group of carboxymethyl dextran is hydrophilic, so carboxymethyl dextran steals the hydration water of the second ligand. This causes a change in the steric structure of the second ligand, resulting in a conformation in which the second ligand is more likely to react with the analyte, thereby enhancing the reactivity with the analyte, and the second ligand properly binds to the analyte. It can be estimated that the detection sensitivity of the analyte will be improved.
- an analyte is provided on the substrate of the detection device having a first ligand which can be specifically bound to the analyte immobilized on the substrate, and the analyte contained in the analyte is It binds to the first ligand.
- the detection device is, for example, a plasmon excitation sensor.
- the detection device has a substrate.
- the substrate comprises a support, a metal member formed on the support, and a self-assembled monolayer formed on the metal member. (SAM) and a hydrophilic polymer layer formed on the SAM.
- a transparent support is preferable because light is irradiated to a metal member described later through the support.
- the transparent support is not particularly limited in its material, and may be made of glass, plastic such as polycarbonate or cycloolefin polymer.
- the transparent support preferably has a refractive index [nd] at d-line (588 nm) of 1.40 to 2.20, and a thickness of preferably 0.01 to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm. .
- Glass-made transparent supports are commercially available as “BK7” (refractive index [nd] 1.52) and “LaSFN 9” (refractive index [nd] 1.85) manufactured by Schott Japan Ltd.
- the metal member has a role of generating surface plasmon or localized plasmon by irradiation light from a light source.
- a metal member a metal film or metal particles can be used, for example, and it is preferable to form as a metal film on the surface of the said support body.
- This metal film has a role of causing surface plasmons to be induced by excitation light emitted from a light source and efficiently exciting a fluorescent dye.
- the metal of the metal film is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, copper, aluminum, platinum and zinc, and more preferably made of gold.
- the metal film may be in the form of several alloys of these metals, or a plurality of metal films may be stacked. Such metal species are suitable because they are stable against oxidation and the electric field enhancement by plasmon resonance is large.
- a support made of glass When a support made of glass is used as the support, it is preferable to previously form a thin film of chromium, nickel chromium alloy or titanium on the support in order to bond the glass and the metal film more firmly.
- the thickness of the metal film is 5 to 500 nm for gold, 5 to 500 nm for silver, 5 to 500 nm for aluminum, 5 to 500 nm for copper, 5 to 500 nm for platinum, and 5 for their alloys
- the thickness is preferably about 500 nm
- the thickness of the chromium thin film is preferably 1 to 20 nm.
- the thickness of the metal film is 20 to 70 nm for gold, 20 to 70 nm for silver, 10 to 50 nm for aluminum, 20 to 70 nm for copper, and 20 to 70 nm for platinum
- 10 to 70 nm is more preferable
- the thickness of the chromium thin film is more preferably 1 to 3 nm.
- metal particles When metal particles are used as the metal member, localized plasmons can be induced.
- the type of metal used for the metal particles is not particularly limited as long as the particles capable of inducing plasmons can be prepared, but at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, copper, aluminum, platinum and zinc Or these 2 or more types of alloys are preferable.
- the particle diameter of the metal particles is not particularly limited as long as it generates localized plasmons, but 10 to 100 nm is preferable, and a group of metal particles having an average particle diameter in such a range is used Is preferred.
- the metal particles can be used in the form dispersed on the support described above.
- a self-assembled monolayer (SAM: Self-Assembled Monolayer) is a metal member for the purpose of preventing metal quenching of fluorescent molecules in fluorescence measurement as a scaffold on which a hydrophilic polymer layer described later is immobilized. Is formed on the other surface not in contact with the support.
- a carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms for example, available from Dojin Chemical Research Institute, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd., etc.
- Carboxyalkanethiols having 4 to 20 carbon atoms have properties such as less optical influence of SAM formed using them, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. From the viewpoint of
- the hydrophilic polymer layer is formed on the other surface of the SAM not in contact with the metal member, and has a two-dimensional structure or a three-dimensional structure.
- the three-dimensional structure refers to a structure of a hydrophilic polymer layer which extends to a three-dimensional space liberated from the surface of the support without limiting the immobilization of the ligand described later to the two-dimensional surface of the support.
- the hydrophilic polymer layer can be used without being limited to the amount (concentration or density) of the hydrophilic polymer.
- the polymer of the hydrophilic polymer layer refers to a compound having a molecular weight of 5,000 or more.
- Such a hydrophilic polymer may be at least one polymer selected from the group consisting of polysaccharides, polyethylene glycols, polyacrylic acids and polymethacrylic acids.
- the polysaccharide comprises structural units derived from glucose and / or carboxymethylated glucose, and polyacrylic acid and polymethacrylic acid (also collectively referred to as "poly (meth) acrylic acid") (meta)
- the structural units derived from acrylic acid can be included, but structural units derived from the following monomers can be appropriately included.
- the monomers are vinyl esters, acrylic esters, methacrylic esters, olefins, styrenes, crotonic esters, itaconic diesters, maleic diesters, fumaric diesters, allyl compounds It is preferably at least one selected from the group consisting of vinyl ethers and vinyl ketones.
- the polysaccharide is preferably a hydrophilic polymer such as dextran and / or a dextran derivative, and is preferably a hydrophilic polymer layer composed of dextran such as carboxymethyl dextran to improve biocompatibility and the like. It is particularly preferable from the viewpoint of improving the suppression of nonspecific adsorption reaction or securing high hydrophilicity.
- the molecular weight of carboxymethyl dextran is preferably 1 kDa or more and 5,000 kDa or less, and more preferably 4 kDa or more and 1,000 kDa.
- the density (mass per unit area of the hydrophilic polymer layer formed on the SAM) of the polymer of the hydrophilic polymer layer can be appropriately adjusted according to the type of polymer to be used and the layer forming method. Is, for example, 0.001 ng / mm 2 or more and 30 ng / mm 2 or less, although it depends on the film thickness of the hydrophilic polymer layer, preferably 0.2 ng / mm 2 or more and 6 ng / mm 2 or less .
- the hydrophilic polymer layer containing dextran or a dextran derivative preferably has a density of the polymer satisfying this range. It is preferable to use a sensor chip in which a hydrophilic polymer is immobilized on the SAM within such a density range, since the assay luminescence signal is stabilized and increased.
- the average film thickness of the hydrophilic polymer layer can be appropriately adjusted according to the type of polymer to be used and the density of the layer. For example, 3 nm or more and 300 nm or less can be mentioned. Among these, 3 nm or more and 130 nm or less are preferable, and 50 nm or more and 100 nm or less are particularly preferable.
- This film thickness can be measured using an atomic force microscope (AFM) or the like.
- AFM atomic force microscope
- the average film thickness of the hydrophilic polymer layer is in such a range, it is preferable because the assay fluorescence signal is stabilized and increased.
- the range of the said average film thickness is an average film thickness in solutions, such as an analyte solution mentioned later.
- the first ligand is used to immobilize (capture) the analyte in the sample, is immobilized on the substrate, and in a preferred embodiment of the substrate is immobilized on the hydrophilic polymer layer.
- the hydrophilic polymer layer has a two-dimensional structure
- the ligand is immobilized on the outer surface of the hydrophilic polymer layer
- the hydrophilic polymer layer has a three-dimensional structure
- the ligand is in the layer of the hydrophilic polymer layer Or immobilized on the outer surface.
- the hydrophilic polymer layer has a three-dimensional structure, generally, most of the ligands are dispersed and immobilized in the three-dimensional structure of the hydrophilic polymer layer.
- the first ligand is a molecule or molecule fragment that specifically recognizes the analyte contained in the sample or is specifically recognized by the analyte and can bind to the analyte.
- a molecule or molecule fragment for example, nucleic acid (DNA which may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid) etc., or nucleoside, nucleotide And their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains etc.), lipids, or their modified molecules, complexes
- the protein include, but are not limited to, antibodies, etc.
- an anti- ⁇ -fetoprotein [AFP] monoclonal antibody manufactured by Nippon Medical Clinical Laboratory, Inc. Available from Japan
- anti-carcinoembryonic antigen [CEA] monoclonal antibody anti-CA 19-9 monoclonal antibody
- anti-PSA monoclonal antibody and the like.
- the term "antibody” includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments.
- a carboxyl group possessed by a polymer having a reactive functional group such as carboxymethyl dextran [CMD], a water-soluble carbodiimide [WSC] (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride [EDC] and the like) and N-hydroxysuccinimide [NHS] to form an active esterified carboxyl group in this way;
- the amino group possessed by the ligand are dehydrated by using a water-soluble carbodiimide and immobilized.
- a blocking agent such as bovine serum albumin [BSA] in order to prevent nonspecific adsorption of a sample or the like described later on the substrate.
- BSA bovine serum albumin
- the density of the first ligand immobilized on the hydrophilic polymer layer is preferably 1 femtomol / cm 2 or more and 1 nanomol / cm 2 or less, and more preferably 10 femtomol / cm 2 or more and 100 picomol / cm 2 or less preferable.
- the density of the ligand is in the above range, the signal intensity of the assay fluorescence signal is increased, which is preferable.
- the analyte is a substance to be measured, and is usually contained in a sample.
- the sample include blood (whole blood, serum / plasma), urine, nostril fluid, saliva, stool, body cavity fluid (such as spinal fluid, ascites fluid, pleural effusion, etc.).
- the sample may be appropriately diluted with a desired solvent, buffer solution or the like.
- Analytes are molecules or molecular fragments that can be specifically recognized by the first ligand immobilized on the hydrophilic polymer layer, or can specifically recognize the first ligand and bind to the first ligand.
- Analytes are, for example, nucleic acids (DNA, which may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids) etc., and nucleosides, nucleotides and their modified molecules) And proteins (including polypeptides and oligopeptides), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, and modified molecules and complexes thereof, etc.
- DNA which may be single-stranded or double-stranded
- RNA polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids) etc.
- PNA peptide nucle
- cardiac troponin I cTnI
- brain natriuretic peptide BNP
- alpha fetoprotein AFP
- tumor markers such as carcinoembryonic antigen, signal transduction substances, hormones, etc. It is not a thing. Since it is assumed that the second ligand described later is likely to react with the analyte, that is, a structure in which the antigen recognition site is exposed on the surface, as the analyte, cardiac troponin I (cTnI), brain natriuretic The peptide (BNP) is preferred.
- the analyte is bound to the first ligand immobilized on the substrate, usually by supplying an analyte to the substrate.
- a channel is formed on the substrate, and at least a part of the channel is configured to include a metal member on a support, a hydrophilic polymer layer on a SAM, and a first ligand. It is preferable that the analyte be bound to the first ligand by sending the sample into the channel and immersing the first ligand in the analyte solution.
- the flow channel may be in the shape of a square cylinder (tube) or a round cylinder (tube), and a reaction unit and a measurement unit for combining an analyte with a first ligand etc. and performing fluorescence measurement are square cylinders. It is preferable that the flow path portion be used in the form of a round shape, and the flow path portion used only for the liquid transfer of the other drug solution or the like is preferably a round cylinder.
- solvent used to dilute the sample examples include phosphate buffered saline [PBS], Tris buffered saline [TBS], HEPES buffered saline [HBS] and the like.
- the temperature and time of the sample at that time vary depending on the type of sample and the like, but it is usually 1 to 60 minutes at 20 to 40 ° C., preferably 5 to 15 minutes at 37 ° C.
- the initial concentration of the analyte contained in the sample is, for example, 0.001 pg / mL to 100 ⁇ g / mL.
- the total amount of samples fed to the flow channel is usually 0.001 to 20 mL, preferably 0.01 to 1 mL.
- the flow rate of the sample fed to the flow channel is usually 1 to 5,000 ⁇ l / min, preferably 5,000 to 1,000 ⁇ l / min.
- the substrate is preferably washed.
- the washing solution used for washing for example, the solvent used for dilution of the sample or other buffer solution (for example, PBS, TBS, HBS, etc.), surfactant such as Tween 20, Triton X 100, etc. It is preferable to use a solution obtained by dissolving by mass or a solution obtained by dissolving 10 to 500 mM of a salt such as sodium chloride or potassium chloride. Alternatively, a low pH buffer such as 10 mM glycine-hydrochloric acid buffer with a pH of 1.5 to 4.0 may be used as a washing solution.
- the temperature and the flow rate of the washing solution are preferably the same as the temperature and the flow rate at the time of sample delivery. The washing is usually performed for 0.5 to 180 minutes, preferably for 5 to 60 minutes.
- a second ligand labeled with a labeling substance and capable of specifically binding to the analyte is supplied onto the substrate, and the second ligand is bound to the analyte bound to the first ligand. Allow the ligand to bind.
- carboxymethyl dextran is provided on the substrate.
- the second ligand is labeled with a labeling substance and can specifically bind to the analyte.
- the second ligand is a ligand used for the purpose of labeling the analyte with a labeling substance, and as described above, may be the same as or different from the first ligand.
- the primary antibody used as the first ligand is a polyclonal antibody
- the secondary antibody used as the second ligand may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but the primary antibody is a monoclonal antibody. In some cases, it is desirable that the secondary antibody be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody that recognizes an epitope that the primary antibody does not recognize.
- a complex in which a second analyte (competitive antigen; but different from the target antigen) that competes with the analyte (target antigen) contained in the analyte solution and the secondary antibody are bound in advance
- the embodiment using the body is also preferred.
- Such an embodiment is preferable because the amount of fluorescence (assay fluorescence signal) can be proportional to the amount of target antigen.
- the labeling substance is a substance used for detecting an analyte by measuring the labeling substance by any method after the second ligand labeled with the labeling substance is bound to the analyte, and such a substance There is no restriction on the type as long as the purpose is achieved.
- a fluorescent dye is preferable because a high detection sensitivity can be obtained.
- the fluorescent dye is a general term for substances that emit fluorescence by irradiation with a predetermined excitation light or by excitation using an electric field effect. Fluorescence is a concept including various types of light emission such as phosphorescence.
- the type of the fluorescent dye is not particularly limited as long as it is not completely quenched due to the light absorption by the metal member, and may be any of known fluorescent dyes.
- fluorescent dyes with large Stokes shifts that allow for the use of filters with filters rather than monochromometers, and which increase the efficiency of detection, are preferred.
- a fluorescent dye for example, a fluorescent dye of the fluorescein family (manufactured by Integrated DNA Technologies), a fluorescent dye of the polyhalofluorescein family (manufactured by Applied Biosystems Japan Ltd.), a fluorescent dye of the hexachlorofluorescein family (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.
- fluorescent dyes are not limited to the above-mentioned organic fluorescent dyes.
- rare earth complex fluorescent dyes such as Eu and Tb can also be used.
- the rare earth complex generally has a large wavelength difference between the excitation wavelength (about 310 to 340 nm) and the emission wavelength (about 615 nm for Eu complex, about 545 nm for Tb complex), and has a long fluorescence lifetime of several hundred microseconds or more is there.
- a commercially available rare earth complex fluorescent dye is ATBTA-Eu 3+ .
- the fluorescence pigment which has the maximum fluorescence wavelength in the wavelength range with little light absorption by the metal contained in a metallic member.
- a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 600 nm or more in order to minimize the influence of light absorption by the gold member. Therefore, in this case, it is particularly desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the near infrared region such as Cy5, Alexa Fluor (registered trademark) 647, and the like.
- a fluorescent dye having the maximum fluorescence wavelength in such a near-infrared region can minimize the influence of light absorption by iron derived from blood cell components in blood, and therefore, in the case of using blood as a sample Is also useful.
- a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 400 nm or more may be used alone or in combination of two or more.
- a carboxyl group is added to a fluorescent dye, and the carboxyl group is added to a water-soluble carbodiimide [WSC]
- WSC water-soluble carbodiimide
- EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
- NHS N-hydroxysuccinimide
- Method of dehydrating reaction and immobilization with water-soluble carbodiimide with amino group which it has method of reacting and immobilizing secondary antibody and fluorescent dye having isothiocyanate and amino group respectively; having sulfonyl halide and amino group respectively Method of reacting and immobilizing a secondary antibody and a fluorescent dye; Method of reacting and immobilizing a secondary antibody and a fluorochrome having a ce
- a solution containing the second ligand labeled with the labeling substance can be sent onto the substrate of the detection device, and
- the concentration of the second ligand labeled with the labeling substance in the solution is preferably 0.001 to 10,000 ⁇ g / mL, more preferably 1 to 1,000 ⁇ g / mL.
- the temperature of the solution, the flow rate, and the liquid transfer time when the solution is transferred are the same as those of the sample transfer in the first step. It is preferable that the second ligand labeled with the labeling substance be supplied to the substrate, and the second ligand labeled with the labeling substance be bound to the analyte bound to the first ligand, and then the substrate be washed. This washing is similar to the washing in the first step.
- carboxymethyl dextran is provided on the substrate as described above.
- an embodiment of supplying carboxymethyl dextran an embodiment of supplying carboxymethyl dextran together with the second ligand, and after supplying the second ligand on the substrate to bind the second ligand to the analyte And a mode of supplying carboxymethyl dextran.
- carboxymethyl dextran deprives the water of hydration of the second ligand dissolved in the sample, thereby causing a change in the conformation of the second ligand and causing the second ligand to become an analyte.
- carboxymethyl dextran deprives the water of hydration of the second ligand bound to the analyte, changing the second ligand to a conformation with high affinity for the analyte, and the analyte and the second It is considered that the detection sensitivity of the analyte is improved by suppressing the dissociation with the ligand.
- An embodiment of supplying carboxymethyl dextran together with the second ligand includes a method of supplying a second ligand-containing solution containing the second ligand and carboxymethyl dextran.
- carboxymethyl dextran can be used as the substrate after the second ligand is bonded to the analyte. And a method of containing it in a washing solution for washing and supplying it.
- the concentration of carboxymethyl dextran supplied is preferably 1 to 30 mg / mL, more preferably 1 to 10 mg / mL.
- concentration of carboxymethyl dextran is in the above range, high detection sensitivity of the analyte is easily obtained.
- concentration of carboxymethyl dextran exceeds 30 mg / mL, it may be difficult to dissolve, the viscosity may be high, and the operation may be difficult.
- the molecular weight of carboxymethyl dextran is preferably 10,000 to 1,000,000, more preferably 40,000 to 750,000, and still more preferably 100,000 to 500,000. When the molecular weight of carboxymethyl dextran is in the above range, high detection sensitivity of the analyte is easily obtained.
- the degree of substitution of the carboxyl group of carboxymethyl dextran is preferably 0.2 to 0.8, and more preferably 0.4 to 0.7. When the degree of substitution of the carboxyl group of carboxymethyl dextran is in the above range, high detection sensitivity of the analyte is easily obtained.
- the degree of substitution of the carboxyl group of carboxymethyl dextran is defined as the ratio of substitution of a residue by a carboxyl group in one carboxymethyl dextran molecule.
- the second ligand bound to the analyte is measured.
- the method of measuring the second ligand is appropriately determined according to the type of labeling substance and detection device that labels the second ligand.
- the third step can be performed as follows. Laser light is irradiated to the sensor chip of the plasmon excitation sensor from the surface of the support on which the metal member is not formed, and the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye is measured and measured via the prism. From the results, calculate the amount of analyte contained in the sample.
- the light source irradiated when measuring the amount of fluorescence is not particularly limited as long as it can cause plasmon excitation in the metal member, but in terms of unity of wavelength distribution and intensity of light energy, It is preferable to use laser light as a light source. It is desirable to adjust the energy and the amount of photons of the laser light just before entering the prism through an optical filter.
- the irradiation of the laser light generates surface plasmons on the surface of the metal member under the total reflection attenuation condition [ATR]. Due to the electric field enhancement effect of surface plasmons, the fluorescent dye is excited by photons that are increased by several tens to several hundreds times the amount of irradiated photons.
- the amount of increase in photons due to the electric field enhancement effect depends on the refractive index of the support, the metal species of the metal member and the film thickness thereof, but in general, the amount of increase is about 10 to 20 times for gold.
- the fluorescent dye In the fluorescent dye, electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electron excited state in a short time, and return from this state (level) to the ground state at a wavelength corresponding to the energy difference. It emits fluorescence.
- the type of light source is not particularly limited, and may not be a laser diode.
- Examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
- the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit or the like.
- the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted to monochromatic light by a diffraction grating or the like.
- the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted to linearly polarized light by a polarizer or the like.
- the purpose of the prism is to allow laser light passing through various filters such as optical filters, polarization filters and cut filters, which are used if necessary, to be efficiently incident on the metal member, and the refractive index is the same as that of the transparent support Is preferred.
- the angle and the shape are not particularly limited, and for example, a 60 degree dispersion prism may be used.
- a commercial item of such a prism the thing similar to the commercial item of the transparent support made of glass mentioned above is mentioned.
- ND filter for example, a light reduction (ND) filter, a diaphragm lens, etc.
- a light reduction [ND] filter (or neutral density filter) aims to adjust the incident laser light quantity.
- ND light reduction
- the polarizing filter is used to make the laser light P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
- the cut filter is based on external light (illumination light outside the device), excitation light (transmission component of excitation light), stray light (scattered component of excitation light at various locations), plasmon scattered light (excitation light), and sensor chip surface It is a filter that removes optical noise such as scattered light generated due to the influence of the above structures or deposits, and autofluorescence of a fluorescent dye, and examples thereof include interference filters and color filters.
- the condenser lens is used for efficiently condensing a fluorescence signal on a detector that measures the amount of fluorescence, and may be any condenser lens.
- a simple condensing lens a commercially available objective lens (for example, manufactured by Nikon Corp. or manufactured by Olympus Corp., etc.) used in a microscope or the like may be diverted.
- the magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
- the detector is preferably a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics K. K.) from the viewpoint of ultrahigh sensitivity.
- a photomultiplier a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics K. K.
- the sensitivity is lower than these, it can be viewed as an image and noise light can be easily removed, so a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also preferable.
- a calibration curve is created by performing measurement with a target antigen or target antibody of known concentration, and the calibration curve And the amount of analyte (target antigen) in the sample can be calculated from the measurement signal.
- the blank luminescence signal measured before the second step, the assay luminescence signal obtained in the third step, and a metal substrate without any modification are immobilized in the flow path, and the measurement is performed while flowing ultrapure water.
- the kit for detecting an analyte according to the present invention is a kit used in the method for detecting an analyte, which comprises a second ligand-containing solution containing a second ligand and carboxymethyl dextran, or carboxymethyl dextran. And a cleaning solution for cleaning the substrate.
- the analyte detection kit comprises at least a sensor chip (having at least a metal member, SAM, a hydrophilic polymer layer and a ligand on a support), And a second ligand-containing solution containing a second ligand and carboxymethyl dextran, or a washing solution for washing the substrate containing carboxymethyl dextran.
- a more preferred analyte detection kit includes all that is required except the sample and the ligand in performing the assay method of the present invention.
- the analyte detection kit includes at least a sensor chip on which a ligand is not immobilized (at least a metal member, a SAM, and a hydrophilic polymer on a support) Layer) and a second ligand-containing solution containing a second ligand and carboxymethyl dextran, or containing carboxymethyl dextran.
- a ligand for example, a specific antibody etc.
- the desired ligand for example, a specific antibody etc.
- the versatility of the kit is higher.
- analyte detection kit for example, blood or serum as a specimen, and an antibody against a specific tumor marker it can. From this result, it is possible to predict with high accuracy the presence of preclinical non-invasive cancer (cancer in situ) which can not be detected by palpation or the like.
- a glass transparent support (“S-LAL 10” manufactured by OHARA CORPORATION) having a refractive index [nd] of 1.72 and a thickness of 1 mm is plasma-cleaned and one side of the support is Then, a chromium thin film was formed by sputtering, and then a gold thin film as a metal member was formed on the surface of the transparent support by sputtering.
- the thickness of the chromium thin film was 1 to 3 nm, and the thickness of the gold thin film was 42 to 47 nm.
- the support on which the gold thin film was thus formed was immersed in 10 mL of an ethanol solution of 10-amino-1-decanethiol prepared to 1 mM for 24 hours to form SAM on one side of the gold thin film. Thereafter, the support was removed from the ethanol solution, washed with ethanol and isopropanol respectively, and dried using an air gun.
- MES of pH 7.4 containing 1 mg / mL of carboxymethyl dextran [CMD] having a molecular weight of 500,000, 0.5 mM of N-hydroxysuccinimide [NHS], and 1 mM of water-soluble carbodiimide [WSC]
- MES buffered saline
- CMD carboxymethyl dextran
- NHS N-hydroxysuccinimide
- WSC water-soluble carbodiimide
- the substrate is immersed in MES containing 50 mM of NHS and 100 mM of WSC for 1 hour, and then immersed in an anti-human troponin I IgG monoclonal antibody “antibody” solution (Hytest) solution for 30 minutes to obtain a CMD
- the primary antibody was immobilized as a ligand of 1.
- non-specific adsorption preventing treatment was performed by circulating the solution in PBS containing 1% by mass of bovine serum albumin [BSA] and 1 M aminoethanol for 30 minutes.
- the flow path member was mounted on the support on which the primary antibody was immobilized to prepare a detection device.
- the flow path member has a recess in the flow path a and the flow path b extending from the upper surface to the lower surface, and the lower surface, and the lower ends of the flow path a and the flow path b each have a structure communicating with both ends of the recess There is.
- the recess is covered with the support to form a reaction chamber (measurement area).
- the primary antibody immobilized in the reaction chamber is accommodated.
- the detection device has a flow path a and a flow path b extending from the upper surface of the flow path member to the upper surface of the support, and a reaction chamber which communicates with the flow path a and the flow path b at both ends and accommodates the primary antibody.
- the liquid can be injected into the flow path a, sent to the reaction chamber, and then discharged from the flow path b.
- Example 1 (First step) 0.1 mL of a PBS solution containing 100 pg / mL (0.1 ng / mL) of human troponin I was fed from the flow path a of the detection device to the reaction chamber. Subsequently, Tris-buffered saline (TBS) containing 0.05% by mass of Tween 20 is supplied to the flow path of the detection device for SPFS from the flow path a to the reaction chamber, and circulated for 10 minutes to flow the flow path and the reaction. The room was cleaned.
- TBS Tris-buffered saline
- the PBS solution containing 100 pg / mL of troponin I was fed, and the amount of fluorescence was measured by the same procedure as described above. This measurement value was taken as assay noise signal Ian.
- the S / N ratio was determined according to the above equation (1b).
- the obtained Ia, Ian and S / N ratios are shown in Tables 1 and 2.
- the ratio of the S / N ratio which increased with respect to the S / N ratio obtained in the following comparative example 1 is shown in Table 2 as a S / N ratio increase rate.
- carboxymethyl dextran used at the said 2nd process in each Example was described with "CMD" as "additional substance" in Tables 1 and 2.
- Examples 2 to 4 In Examples 2 to 4, except that in the second step, the concentration of carboxymethyl dextran in the PBS solution containing Alexa Fluor 647-labeled antibody and carboxymethyl dextran was changed to 5 mg / mL, 10 mg / mL and 30 mg / mL, respectively. The detection of the analyte was performed in the same manner as in Example 1. The obtained Ia, Ian and S / N ratio are shown in Table 1.
- Comparative Examples 3 and 4 are the same as Comparative Example 2 except that, in the second step, the concentration of polyethylene glycol in the PBS solution containing AlexaFluor 647-labeled antibody and polyethylene glycol is changed to 3% by mass and 5% by mass, respectively. Detection of the analyte. The obtained Ia, Ian and S / N ratio are shown in Table 1.
- carboxymethyl dextran used in the second step is carboxymethyl dextran (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd., molecular weight: 10,000), carboxymethyl dextran (manufactured by Meisho Sangyo Co., Ltd., molecular weight: Same as Example 1 except that 40,000), carboxymethyl dextran (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd., molecular weight: 200,000), and carboxymethyl dextran (manufactured by Meisho Sangyo Co., Ltd., molecular weight: 1,000,000) were changed. Detected the analyte. The obtained Ia, Ian, S / N ratio and S / N ratio increase rate are shown in Table 2.
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Abstract
本発明のアナライトの検出方法は、基板上に固定化された、アナライトに特異的に結合しうる第1リガンドを有する検出デバイスの前記基板上に検体を供給して、前記検体に含まれるアナライトを前記第1リガンドに結合させる第一の工程と、前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる第二の工程と、前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する第三の工程とを含み、前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。
Description
本発明は、アナライトの検出方法に関し、詳しくは、主として生体試料を検体として用い、微量のアナライトを高感度で検出するアナライトの検出方法に関する。
一般的なイムノアッセイでは、固定された第1リガンド(固相抗体)にアナライト(抗原)を結合させ、そのアナライトに、標識された第2リガンド(標識抗体)を結合させて、第1リガンド-アナライト-第2リガンドのサンドイッチ系を形成し、第1リガンド、アナライトおよび第2リガンド間の結合がある程度達成された時点で、標識された第2リガンドを測定することによりアナライトを検出する。
このようなイノムアッセイ装置の一つとして、表面プラズモン共鳴現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS)の原理に基づき、高精度にアナライト検出を行えるようにしたSPFS装置が挙げられる。
表面プラズモン励起増強蛍光分光法は、光源より照射したレーザ光などの励起光が、金属薄膜表面で減衰全反射(ATR;attenuated total reflectance)する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン光(粗密波)を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍から数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得て、この電場増強効果により、金属薄膜の表面近傍に捕捉したアナライトに結合(標識)した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出する方法である。
SPFS等のイムノアッセイは、高感度なアナライトの検出方法ではあるが、アナライト(抗原)と第2リガンド(標識抗体)との結合力(アフィニティ)が弱い場合には、第2リガンドがアナライトに的確に結合することができないので、アナライトの検出精度は高くならない。
アナライトの検出精度を向上させる1つの方法として、特許文献1に、検体希釈用液にカルボキシメチルデキストランを含有させることにより、検体中に含まれる夾雑物をカルボキシメチルデキストランに補足させて、夾雑物によるブランクの増加を抑制することにより、アナライトの検出精度を向上させる方法が開示されている。
しかし、この方法では、ブランク低減による検出精度の向上は期待できるが、アナライトと第2リガンドとの結合力が弱い場合には、アナライトの検出感度自体は高くならないので、アナライトの検出精度を向上させるには限界があった。
本発明の目的は、イムノアッセイなどにおいて、測定対象であるアナライトと、標識されたリガンドとの結合力が弱い場合であっても、アナライトの検出感度の高いアナライトの検出方法を提供することである。
前記目的を達成する本発明のアナライトの検出方法は、基板上に固定化された、アナライトに特異的に結合しうる第1リガンドを有する検出デバイスの前記基板上に検体を供給して、前記検体に含まれるアナライトを前記第1リガンドに結合させる第一の工程と、
前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる第二の工程と、
前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する第三の工程とを含み、
前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。
前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる第二の工程と、
前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する第三の工程とを含み、
前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。
前記アナライトの検出方法は、前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを1~30mg/mLの濃度で供給することが好ましい。
前記アナライトの検出方法は、前記第二の工程において、前記基板上に第2リガンドとともにカルボキシメチルデキストランを供給することが好ましい。
前記アナライトの検出方法は、前記第二の工程において、前記基板上に第2リガンドとともにカルボキシメチルデキストランを供給することが好ましい。
前記アナライトの検出方法は、前記第二の工程において、前記基板上に、前記第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液を供給することが好ましい。
前記アナライトの検出方法は、前記第二の工程において、前記基板上に第2リガンドを供給して前記第2リガンドを前記アナライトに結合させた後に、カルボキシメチルデキストランを供給することが好ましい。
前記アナライトの検出方法は、カルボキシメチルデキストランを、前記第二の工程において、第2リガンドを前記アナライトに結合させた後に、前記基板を洗浄する洗浄液に含有させて供給することが好ましい。
前記アナライトの検出方法において、前記アナライトは、心筋トロポニンI(cTnI)または脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)であることが好ましい。
本発明のアナライト検出用キットは、前記アナライトの検出方法において使用されるキットであって、前記第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液を含む。
本発明のアナライト検出用キットは、前記アナライトの検出方法において使用されるキットであって、前記第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液を含む。
本発明のアナライト検出用キットは、前記アナライトの検出方法において使用されるキットであって、カルボキシメチルデキストランを含有する、前記基板を洗浄する洗浄液を含む。
本発明のアナライトの検出方法は、アナライトが微量であり、また、アナライトと、標識されたリガンドとの結合力が弱い場合であっても、アナライトを高感度で検出することができる。本発明のアナライト検出用キットは、前記アナライトの検出方法において有効に使用することができる。
[アナライトの検出方法]
本発明のアナライトの検出方法は、基板上に固定化された、アナライトに特異的に結合しうる第1リガンドを有する検出デバイスの前記基板上に検体を供給して、前記検体に含まれるアナライトを前記第1リガンドに結合させる第一の工程と、
前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる第二の工程と、
前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する第三の工程とを含み、
前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。
本発明のアナライトの検出方法は、基板上に固定化された、アナライトに特異的に結合しうる第1リガンドを有する検出デバイスの前記基板上に検体を供給して、前記検体に含まれるアナライトを前記第1リガンドに結合させる第一の工程と、
前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる第二の工程と、
前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する第三の工程とを含み、
前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。
一般的なイムノアッセイでは、第一の工程において、検出デバイスの基板上に固定された第1リガンド(固相抗体)にアナライト(抗原)を結合させ、第二の工程において、第1リガンドに結合したアナライトに、標識された第2リガンド(標識抗体)を特異的に結合させ、第三の工程において、アナライトに結合した標識された第2リガンドを何らかの方法により測定することにより、間接的にアナライトを検出する。本発明のアナライトの検出方法は、前記第二の工程において、基板上にカルボキシメチルデキストランを供給することを特徴とする。
従来のイムノアッセイでは、アナライトと標識された第2リガンドとの結合力が弱い場合には、測定の標的となる第2リガンドがアナライトに的確に結合することができないので、アナライトを精度よく検出することはできなかった。本発明のアナライトの検出方法は、第二の工程において、基板上にカルボキシメチルデキストランを供給することにより、アナライトと標識された第2リガンドとの結合力が弱い場合であっても、アナライトを高感度で検出することが可能になる。本発明のアナライトの検出方法においてこのような効果が得られる理由は明らかではないが、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基は親水性であることから、カルボキシメチルデキストランが第2リガンドの水和水を奪い、これにより第2リガンドの立体構造に変化が生じ、第2リガンドがアナライトとより反応しやすいコンフォメーションとなることでアナライトとの反応性が高まり、第2リガンドがアナライトに的確に結合することができるようになって、アナライトの検出感度が向上するのではないかと推測される。
[第一の工程]
第一の工程では、基板上に固定化された、アナライトに特異的に結合しうる第1リガンドを有する検出デバイスの前記基板上に検体を供給して、前記検体に含まれるアナライトを前記第1リガンドに結合させる。
第一の工程では、基板上に固定化された、アナライトに特異的に結合しうる第1リガンドを有する検出デバイスの前記基板上に検体を供給して、前記検体に含まれるアナライトを前記第1リガンドに結合させる。
検出デバイスは、たとえばプラズモン励起センサーである。検出デバイスは基板を有する。検出デバイスがプラズモン励起センサーである場合の前記基板の好適な一態様として、基板は、支持体と、支持体上に形成された金属部材と、金属部材上に形成された自己組織化単分子膜(SAM)と、SAM上に形成された親水性高分子層とを有する。
前記支持体としては、後述する金属部材への光照射をこの支持体を通じて行うことから、透明支持体が好ましい。透明支持体は、その材料に特に制限はなく、ガラス製、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのプラスチック製であってもよい。透明支持体は、d線(588nm)における屈折率〔nd〕が好ましくは1.40~2.20であり、厚さが好ましくは0.01~10mm、より好ましくは0.5~5mmである。
ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本(株)製の「BK7」(屈折率〔nd〕1.52)および「LaSFN9」(屈折率〔nd〕1.85)、(株)住田光学ガラス製の「K-PSFn3」(屈折率〔nd〕1.84)、「K-LaSFn17」(屈折率〔nd〕1.88)および「K-LaSFn22」(屈折率〔nd〕1.90)、ならびに(株)オハラ製の「S-LAL10」(屈折率〔nd〕1.72)などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
前記金属部材は、光源からの照射光により表面プラズモンまたは局在プラズモンを発生させる役割を有する。金属部材としては、例えば金属膜または金属粒子を用いることができ、金属膜として上記支持体の表面に形成することが好ましい。この金属膜は、光源から照射された励起光により表面プラズモンを誘起させ、蛍光色素を効率的に励起させる役割を有する。
前記金属膜の金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金および亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。金属膜は、これらの金属の幾つかの合金からなる形態であってもよく、また金属膜を複数積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつプラズモン共鳴による電場増強が大きくなることから好適である。
支持体としてガラス製の支持体を用いる場合には、ガラスと上記金属膜とをより強固に接着するために、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を支持体上に形成することが好ましい。
金属膜の厚さとしては、金の場合5~500nm、銀の場合5~500nm、アルミニウムの場合5~500nm、銅の場合5~500nm、白金の場合5~500nm、およびそれらの合金の場合5~500nmが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1~20nmが好ましい。電場増強効果の観点から、金属膜の厚さは、金の場合20~70nm、銀の場合20~70nm、アルミニウムの場合10~50nm、銅の場合20~70nm、白金の場合20~70nmおよびそれらの合金の場合10~70nmがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1~3nmがより好ましい。金属膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。
金属部材として金属粒子を用いる場合は、局在プラズモンを誘起させることが可能である。金属粒子に用いる金属の種類としては、プラズモンを誘起させる粒子を調製できる限り特に限定されるものではないが、金、銀、銅、アルミニウム、白金及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属またはこれら2種以上の合金が好ましい。また、金属粒子の粒径は、局在プラズモンを生じる範囲であれば特に限定されるものではないが、10~100nmが好ましく、平均粒径がそのような範囲にある金属粒子の集団を利用することが好適である。
例えば、金属粒子は、上述した支持体上に分散された態様で用いることができる。
自己組織化単分子膜(SAM:Self-Assembled Monolayer)は、後述する親水性高分子層を固相化する足場として、また蛍光測定の際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、金属部材の、上記支持体と接していないもう一方の表面に形成される。
自己組織化単分子膜(SAM:Self-Assembled Monolayer)は、後述する親水性高分子層を固相化する足場として、また蛍光測定の際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、金属部材の、上記支持体と接していないもう一方の表面に形成される。
SAMを形成する単分子としては、通常、炭素原子数4~20程度のカルボキシアルカンチオール(例えば、(株)同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン(株)などから入手可能)、特に好ましくは10-カルボキシ-1-デカンチオールが用いられる。炭素原子数4~20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたSAMの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
前記親水性高分子層は、上記SAMの、上記金属部材とは接していないもう一方の表面に形成され、2次元構造または3次元構造を有する。3次元構造とは、後述するリガンドの固定化を、支持体表面の2次元に限定することなく、該支持体表面から遊離した3次元空間にまで広がる親水性高分子層の構造をいう。
後述する親水性高分子を層として用いることによって、親水性高分子層は、当該親水性高分子の量(濃度や密度)に制限されることなく、使用することができる。
親水性高分子層の高分子とは、分子量が5000以上の化合物を指す。このような親水性高分子は、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種の高分子であってもよい。ポリサッカライドは、グルコースおよび/またはカルボキシメチル化グルコースに由来する構造単位を含んでなり、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸(これらを合わせて「ポリ(メタ)アクリル酸」ともいう。)は、(メタ)アクリル酸(すなわち、アクリル酸およびメタクリル酸)に由来する構造単位を含んでなるが、以下の単量体に由来する構造単位を適宜含むことができる。その単量体とは、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。
親水性高分子層の高分子とは、分子量が5000以上の化合物を指す。このような親水性高分子は、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種の高分子であってもよい。ポリサッカライドは、グルコースおよび/またはカルボキシメチル化グルコースに由来する構造単位を含んでなり、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸(これらを合わせて「ポリ(メタ)アクリル酸」ともいう。)は、(メタ)アクリル酸(すなわち、アクリル酸およびメタクリル酸)に由来する構造単位を含んでなるが、以下の単量体に由来する構造単位を適宜含むことができる。その単量体とは、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。
前記ポリサッカライドとしては、デキストランおよび/またはデキストラン誘導体などの親水性高分子であることが好ましく、カルボキシメチルデキストランなどのデキストランで構成された親水性高分子層であることが、生体親和性の向上や非特異的な吸着反応の抑制性の向上、あるいは高い親水性の確保の観点から特に好適である。
カルボキシメチルデキストランの分子量は、1kDa以上5,000kDa以下が好ましく、4kDa以上1,000kDaがより好ましい。
親水性高分子層の高分子の密度(SAM上に形成された親水性高分子層の単位面積当たりの質量)は、用いる高分子の種類や、層形成方法に応じて適宜調整することができるが、例えば0.001ng/mm2以上30ng/mm2以下であり、親水性高分子層の膜厚にもよるが、0.2ng/mm2以上6ng/mm2以下の範囲であることが好ましい。
親水性高分子層の高分子の密度(SAM上に形成された親水性高分子層の単位面積当たりの質量)は、用いる高分子の種類や、層形成方法に応じて適宜調整することができるが、例えば0.001ng/mm2以上30ng/mm2以下であり、親水性高分子層の膜厚にもよるが、0.2ng/mm2以上6ng/mm2以下の範囲であることが好ましい。
特に、デキストランまたはデキストラン誘導体を含む親水性高分子層は、その高分子の密度がこの範囲を満たすことが好ましい。上記SAMにこのような密度の範囲内で親水性高分子が固相化されたセンサーチップを用いると、アッセイ発光シグナルが安定化しかつ増加するので好適である。
親水性高分子層の平均膜厚は、用いる高分子の種類や層の密度に応じて適宜調整することができる。例えば、3nm以上300nm以下を挙げることができる。この中でも、3nm以上130nm以下が好ましく、50nm以上100nm以下の範囲であることが特に好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔AFM〕などを用いて測定することができる。親水性高分子層の平均膜厚がこのような範囲内であると、アッセイ蛍光シグナルが安定化しかつ増加するため好適である。なお、上記平均膜厚の範囲は、後述するアナライト溶液等の溶液中の平均膜厚である。
第1リガンドは、検体中のアナライトを固定(捕捉)させる目的で用いられ、前記基板上に固定化され、前記基板の好適な態様においては、親水性高分子層に固定化される。親水性高分子層が2次元構造の場合、リガンドは親水性高分子層の外面に固定化され、親水性高分子層が3次元構造の場合、リガンドは親水性高分子層の層中および/または外面に固定化される。親水性高分子層が3次元構造の場合、一般にはリガンドの多くは親水性高分子層の3次元構造の中に分散して固定化される。
第1のリガンドは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し、またはアナライトに特異的に認識され、アナライトに結合し得る分子または分子断片である。このような分子または分子断片としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない
前記タンパク質としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔AFP〕モノクローナル抗体((株)日本医学臨床検査研究所などから入手可能)、抗ガン胎児性抗原〔CEA〕モノクローナル抗体、抗CA19-9モノクローナル抗体、抗PSAモノクローナル抗体などが挙げられる。
前記タンパク質としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔AFP〕モノクローナル抗体((株)日本医学臨床検査研究所などから入手可能)、抗ガン胎児性抗原〔CEA〕モノクローナル抗体、抗CA19-9モノクローナル抗体、抗PSAモノクローナル抗体などが挙げられる。
本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
第1リガンドを親水性高分子層に固定化する方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン〔CMD〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔WSC〕(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩〔EDC〕など)とN-ヒドロキシコハク酸イミド〔NHS〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、第1のリガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
第1リガンドを親水性高分子層に固定化する方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン〔CMD〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔WSC〕(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩〔EDC〕など)とN-ヒドロキシコハク酸イミド〔NHS〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、第1のリガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
第1リガンドを固定化させた後に、後述する検体等が基板に非特異的に吸着することを防止するため、基板の表面を牛血清アルブミン〔BSA〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
親水性高分子層に固定化された第1リガンドの密度は、1フェムトmol/cm2以上1ナノmol/cm2以下が好ましく、10フェムトmol/cm2以上100ピコmol/cm2以下がより好ましい。リガンドの密度が上記範囲内であると、アッセイ蛍光シグナルの信号強度が大きくなるため好適である。
前記アナライトは、測定対象となる物質であり、通常検体に含まれる。検体としては、例えば、血液(全血、血清・血漿)、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液(髄液、腹水、胸水等)などが挙げられる。検体は、所望の溶媒、緩衝液等により適宜希釈されてもよい。
アナライトは、親水性高分子層に固定化された第1リガンドに特異的に認識され、または、第1リガンドを特異的に認識して、第1リガンドに結合し得る分子または分子断片である。アナライトは、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、およびヌクレオシド、ヌクレオチドならびにそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチドを含む)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、およびこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、心筋トロポニンI(cTnI)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、αフェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原等の腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されるものではない。後述する第2リガンドがアナライトと反応しやすい立体構造、すなわち抗原認識部位が表面に露出した構造となることが推測されることから、アナライトとしては、心筋トロポニンI(cTnI)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)が好ましい。
アナライトは、通常検体が前記基板に供給されることにより、基板上に固定された第1リガンドに結合する。前記基板には流路が形成されていることが好ましく、流路中の少なくとも一部が支持体上に金属部材、SAM上に親水性高分子層及び第1のリガンドを備えた構成とされ、検体を前記流路中に送液して第1リガンドがアナライト溶液で浸漬されることにより、アナライトを第1リガンドに結合させることが好ましい。
アナライトは、通常検体が前記基板に供給されることにより、基板上に固定された第1リガンドに結合する。前記基板には流路が形成されていることが好ましく、流路中の少なくとも一部が支持体上に金属部材、SAM上に親水性高分子層及び第1のリガンドを備えた構成とされ、検体を前記流路中に送液して第1リガンドがアナライト溶液で浸漬されることにより、アナライトを第1リガンドに結合させることが好ましい。
流路の形状は、角筒(管)状であっても丸筒(管)状であってもよく、アナライトと第1リガンド等を結合させ、蛍光測定する反応部および測定部は角筒状であることが好ましく、それ以外の薬液等の送液のみに利用される流路部分は丸筒状であることが好ましい。
検体を希釈するために用いる溶媒としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔PBS〕、トリス緩衝生理食塩水〔TBS〕、HEPES緩衝生理食塩水〔HBS〕などが挙げられる。
第1リガンドに多くのアナライトを捕捉させるために、送液された検体を流路中に循環させることが好ましい。その際の検体の温度および時間としては、検体の種類などにより異なるが、通常20~40℃で1~60分間、好ましくは37℃で5~15分間である。
検体を流路に送液する場合、検体中に含有されるアナライトの初期濃度(送液前の濃度)は、たとえば0.001pg/mL~100μg/mLである。流路に送液する検体の総量は、通常0.001~20mL、好ましくは0.01~1mLである。流路に送液する検体の流速は、通常1~5,0000μL/min、好ましくは5,000~1,0000μL/minである。
検体を基板に供給し、アナライトを第1リガンドに結合させた後、基板を洗浄することが好ましい。洗浄に使用される洗浄液としては、例えば、検体の希釈に用いた溶媒、あるいはその他の緩衝液(例えば、PBS、TBS、HBS等)に、Tween20、TritonX100などの界面活性剤を0.00001~1質量%溶解させて得られた溶液、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を10~500mM溶解させて得られた溶液などが好ましい。あるいは、低pHの緩衝液、例えば、10mMグリシン-塩酸緩衝液でpHが1.5~4.0のものを洗浄液として用いてもよい。
洗浄液の温度および流速は、検体の送液時の温度および流速と同じであることが好ましい。洗浄は、通常0.5~180分間、好ましくは5~60分間行われる。
洗浄液の温度および流速は、検体の送液時の温度および流速と同じであることが好ましい。洗浄は、通常0.5~180分間、好ましくは5~60分間行われる。
[第二の工程]
第二の工程では、前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる。また、第二の工程では、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。
第二の工程では、前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる。また、第二の工程では、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。
第2リガンドは、標識物質で標識されており、アナライトに特異的に結合することができる。第2のリガンドは、アナライトに標識物質による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上述したように上記第1リガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第1リガンドとして用いる1次抗体がポリクローナル抗体である場合、第2リガンドとして用いる2次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該1次抗体がモノクローナル抗体である場合、2次抗体は、該1次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
さらに、アナライト溶液中に含有されるアナライト(標的抗原)と競合する第2のアナライト(競合抗原;ただし、標的抗原とは異なるものである。)と2次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光量(アッセイ蛍光シグナル)と標的抗原量とを比例させることができるので好適である。
前記標識物質は、標識物質で標識された第2リガンドがアナライトに結合した後に、その標識物質を何らかの方法で測定することによりアナライトを検出する目的で使用される物質であり、そのような目的が達成される限りその種類に制限はない。標識物質としては、高い検出感度が得られるなどの理由から、蛍光色素が好ましい。蛍光色素は、所定の励起光を照射することによって、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称である。蛍光は、燐光など各種の発光も含む概念である。
蛍光色素は、金属部材による吸光に起因して完全に消光しない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔monochromometer〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素(Integrated DNA Technologies社製)、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素(アプライドバイオシステムズジャパン(株)製)、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素(アプライドバイオシステムズジャパン(株)製)、クマリン・ファミリーの蛍光色素(インビトロジェン(株)製)、ローダミン・ファミリーの蛍光色素(GEヘルスケア バイオサイエンス(株)製)、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、BODIPY(登録商標)・ファミリーの蛍光色素(インビトロジェン(株)製)、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Alexa Fluor(登録商標)色素シリーズ(インビトロジェン(株)製)などが挙げられ、さらに米国特許番号第6,406,297号、同第6,221,604号、同第5,994,063号、同第5,808,044号、同第5,880,287号、同第5,556,959号および同第5,135,717号に記載の蛍光色素を用いることもできる。
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Eu、Tb等の希土類錯体系の蛍光色素も用いることができる。希土類錯体は、一般的に励起波長(310~340nm程度)と発光波長(Eu錯体で615nm付近、Tb錯体で545nm付近)との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ATBTA-Eu3+が挙げられる。
後述する蛍光測定を行う際に、金属部材に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属部材として金を用いる場合には、金部材による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が600nm以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Cy5、Alexa Fluor(登録商標)647等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属部材として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が400nm以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
これら蛍光色素は1種単独でも、2種以上併用してもよい。
これら蛍光色素は1種単独でも、2種以上併用してもよい。
標識物質で標識された第2リガンドの作製方法としては、第2リガンドとして2次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔WSC〕(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩〔EDC〕など)とN-ヒドロキシコハク酸イミド〔NHS〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と2次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法;イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された2次抗体(あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された2次抗体)とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
標識物質で標識された第2リガンドを検出デバイスの基板上に供給する際には、標識物質で標識された第2リガンドを含む溶液を検出デバイスの基板上に送液することができ、送液される当該溶液における標識物質で標識された第2リガンドの濃度は、0.001~10,000μg/mLであることが好ましく、1~1,000μg/mLであることがより好ましい。
この溶液を送液する際の溶液の温度、流速および送液時間は、それぞれ上記第一の工程における検体の送液の場合と同様である。
標識物質で標識された第2リガンドを基板に供給し、標識物質で標識された第2リガンドを、第1リガンドに結合したアナライトに結合させた後、基板を洗浄することが好ましい。この洗浄については、第一の工程における洗浄と同様である。
標識物質で標識された第2リガンドを基板に供給し、標識物質で標識された第2リガンドを、第1リガンドに結合したアナライトに結合させた後、基板を洗浄することが好ましい。この洗浄については、第一の工程における洗浄と同様である。
第二の工程においては、前述のとおり、基板上にカルボキシメチルデキストランを供給する。カルボキシメチルデキストランを供給する態様としては、具体的には、第2リガンドとともにカルボキシメチルデキストランを供給する態様、および、基板上に第2リガンドを供給して第2リガンドをアナライトに結合させた後に、カルボキシメチルデキストランを供給する態様が挙げられる。前者の態様の場合には、カルボキシメチルデキストランが、検体中に溶解している第2リガンドの水和水を奪い、これにより第2リガンドの立体構造に変化が生じ、第2リガンドがアナライトとより反応しやすいコンフォメーションとなることによりアナライトとの反応性が高まり、アナライトの検出感度が向上すると考えられる。後者の態様の場合には、カルボキシメチルデキストランが、アナライトに結合した第2リガンドの水和水を奪い、第2リガンドをアナライトとの親和力が高いコンフォメーションに変化させ、アナライトと第2リガンドとの解離を抑止することにより、アナライトの検出感度が向上すると考えられる。
第2リガンドとともにカルボキシメチルデキストランを供給する態様としては、第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液を供給する方法が挙げられる。基板上に第2リガンドを供給して第2リガンドをアナライトに結合させた後に、カルボキシメチルデキストランを供給する態様としては、第2リガンドをアナライトに結合させた後に、カルボキシメチルデキストランを、基板を洗浄する洗浄液に含有させて供給する方法が挙げられる。
供給されるカルボキシメチルデキストランの濃度は1~30mg/mLであることが好ましく、1~10mg/mLであることがより好ましい。カルボキシメチルデキストランの濃度が前記範囲であると、アナライトの高い検出感度が得られやすい。また、カルボキシメチルデキストランの濃度が30mg/mLを超えると、溶解しにくく、粘度が高くなり、操作が困難になる場合がある。
カルボキシメチルデキストランの分子量は1万~100万であることが好ましく、4万~75万であることがより好ましく、10万~50万であることがさらに好ましい。カルボキシメチルデキストランの分子量が前記範囲であると、アナライトの高い検出感度が得られやすい。
カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基の置換度は0.2~0.8であることが好ましく、0.4~0.7であることがさらに好ましい。カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基の置換度が前記範囲であると、アナライトの高い検出感度が得られやすい。なお、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基の置換度は、カルボキシメチルデキストラン1分子において、残基がカルボキシル基に置換されている割合と定義される。
[第三の工程]
第三の工程では、前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する。第2リガンドの測定方法は、第2リガンドを標識する標識物質および検出デバイスの種類に応じて適宜決定される。
第三の工程では、前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する。第2リガンドの測定方法は、第2リガンドを標識する標識物質および検出デバイスの種類に応じて適宜決定される。
検出デバイスが、第一の工程において述べたプラズモン励起センサーであり、標識物質が蛍光色素である場合、第三の工程は以下のように行うことができる。
プラズモン励起センサーのセンサーチップに、支持体の、金属部材が形成されていない表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定して、測定結果から検体中に含有されるアナライト量を算出する。
プラズモン励起センサーのセンサーチップに、支持体の、金属部材が形成されていない表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定して、測定結果から検体中に含有されるアナライト量を算出する。
蛍光量を測定する際に照射される光源は、金属部材にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば特に制限はないが、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ATR〕において、金属部材の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十~数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、支持体の屈折率、金属部材の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約10~20倍の増加量となる。
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態(準位)から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
光源の種類は、特に限定されず、レーザーダイオードでなくてもよい。光源の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザ光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
プリズムは、必要に応じて用いられる光学フィルタ、偏光フィルタ及びカットフィルタ等の各種フィルタを介したレーザ光が、金属部材に効率よく入射されることを目的としており、屈折率が透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、60度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述したガラス製の透明支持体の市販品と同様のものが挙げられる。
光学フィルタとしては、例えば、減光〔ND〕フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。減光〔ND〕フィルタ(または、中性濃度フィルタ)は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
偏光フィルタは、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるP偏光とするために用いられるものである。
カットフィルタは、外光(装置外の照明光)、励起光(励起光の透過成分)、迷光(各所での励起光の散乱成分)、プラズモンの散乱光(励起光を起源とし、センサーチップ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光)などの光学ノイズ、および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
カットフィルタは、外光(装置外の照明光)、励起光(励起光の透過成分)、迷光(各所での励起光の散乱成分)、プラズモンの散乱光(励起光を起源とし、センサーチップ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光)などの光学ノイズ、および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
集光レンズは、蛍光量を測定する検出器に、蛍光シグナルを効率よく集光することを目的として使用され、任意の集光レンズでよい。簡易な集光レンズとして、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ(例えば、(株)ニコン製またはオリンパス(株)製等)を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、10~100倍が好ましい。
検出器としては、超高感度の観点からは光電子増倍管(浜松ホトニクス(株)製のフォトマルチプライヤー)が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なCCDイメージセンサーも好適である。
測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する方法としては、具体的には、既知濃度の標的抗原または標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、その検量線に基づいて検体中のアナライト(標的抗原)量を測定シグナルから算出する方法が挙げられる。
さらに、第二の工程の前に測定したブランク発光シグナル、第三の工程で得られたアッセイ発光シグナル、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながら測定して得られた初期ノイズシグナルを用いて、下記式(1a)で表されるS/N比を算出することができる:
S/N=|Ia/Io|/In (1a)
(上記式(1a)において、Iaはアッセイ発光シグナル、Ioはブランク発光シグナル、Inは初期ノイズシグナルである)。
S/N=|Ia/Io|/In (1a)
(上記式(1a)において、Iaはアッセイ発光シグナル、Ioはブランク発光シグナル、Inは初期ノイズシグナルである)。
ただし、S/Nを算出するにあたっては、実用上、上記式(1a)に代えて、検体中に含まれるアナライトの濃度が0の場合におけるアッセイノイズシグナルを基準として、下記式(1b)にしたがって算出してもよい:
S/N=|Ia|/|Ian| (1b)
(上記式(1b)において、Ianはアッセイノイズシグナル、Iaは上記式(1a)の場合と同様にアッセイ発光シグナルである)。
S/N=|Ia|/|Ian| (1b)
(上記式(1b)において、Ianはアッセイノイズシグナル、Iaは上記式(1a)の場合と同様にアッセイ発光シグナルである)。
[アナライト検出用キット]
本発明に係るアナライト検出用キットは、前記アナライトの検出方法において使用されるキットであって、第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液、またはカルボキシメチルデキストランを含有する、前記基板を洗浄する洗浄液を含む。
本発明に係るアナライト検出用キットは、前記アナライトの検出方法において使用されるキットであって、第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液、またはカルボキシメチルデキストランを含有する、前記基板を洗浄する洗浄液を含む。
前記アナライト検出用キットは、前記アナライトの検出方法を実施するにあたり、検体を除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。検出デバイスが、第一の工程において述べたプラズモン励起センサーである場合、アナライト検出用キットは、少なくともセンサーチップ(支持体上に少なくとも金属部材、SAM、親水性高分子層及びリガンドを有する)、及び第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液、またはカルボキシメチルデキストランを含有する、前記基板を洗浄する洗浄液を含むことが好ましい。より好ましいアナライト検出用キットは、本発明のアッセイ方法を実施するにあたり、検体およびリガンドを除く必要とされるものすべてを含む。検出デバイスが、第一の工程において述べたプラズモン励起センサーである場合、アナライト検出用キットは、少なくとも、リガンドを固定化していないセンサーチップ(支持体上に少なくとも金属部材、SAMおよび親水性高分子層)、及び第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液、またはカルボキシメチルデキストランを含有する。このようなアナライト検出用キットを使用する場合、所望のリガンド(例えば、特定の抗体など)を、当該センサーチップが有する親水性高分子層に容易に固定化することができるから、本発明のキットの汎用性がより高くなる。
このようなアナライト検出用キットと、例えば、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌(上皮内癌)の存在も高精度で予測することができる。
(1)検出デバイスの作製
屈折率〔nd〕1.72、厚さ1mmのガラス製の透明支持体((株)オハラ製の「S-LAL 10」)をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金属部材である金薄膜をスパッタリング法により該透明支持体に金属膜を形成した。クロム薄膜の厚さは1~3nm、金薄膜の厚さは42~47nmであった。
屈折率〔nd〕1.72、厚さ1mmのガラス製の透明支持体((株)オハラ製の「S-LAL 10」)をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金属部材である金薄膜をスパッタリング法により該透明支持体に金属膜を形成した。クロム薄膜の厚さは1~3nm、金薄膜の厚さは42~47nmであった。
こうして金薄膜が形成された支持体を、1mMに調製した10-アミノ-1-デカンチオールのエタノール溶液10mLに24時間浸漬し、金薄膜の片面にSAMを形成した。その後、この支持体をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
続いて、分子量50万のカルボキシメチルデキストラン〔CMD〕を1mg/mLと、N-ヒドロキシコハク酸イミド〔NHS〕を0.5mMと、水溶性カルボジイミド〔WSC〕を1mMとを含むpH7.4のMES緩衝生理食塩水〔MES〕(イオン強度:10mM)にSAMを形成した支持体を1時間浸漬し、SAMに親水性高分子層としてCMDを固定化し、1モル/リットルのNaOH水溶液に30分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。CMD層の平均膜厚は70nmであり、密度は5.0ng/mm2であった。
続いて、NHSを50mMと、WSCを100mMとを含むMESに1時間浸漬させた後に、抗ヒトトロポニンI IgGモノクローナル抗体「抗体」溶液(Hytest社)溶液に30分間浸漬することで、CMDに第1のリガンドとして1次抗体を固定化した。
さらに、1質量%の牛血清アルブミン〔BSA〕および1Mのアミノエタノールを含むPBSにて30分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行なった。
上記1次抗体が固定化された支持体上に流路部材を装着して検出デバイスを作製した。流路部材は、その上面から下面に至る流路aおよび流路b、ならびに下面部に凹部を有し、流路aおよび流路bの下端はそれぞれ前記凹部の両端に通じる構造を有している。この流路部材を支持体上に装着することにより、前記凹部に支持体によって蓋をして、反応室(測定領域)が形成される。この反応室に固定化された1次抗体が収容される。つまり、前記検出デバイスは、流路部材の上面から支持体の上面に至る流路aおよび流路b、ならびに両端において流路aおよび流路bに通じ、1次抗体を収容する反応室を有する。前記検出デバイスにおいては、液体を流路aに注入して、反応室に送り、その後流路bから排出することができる。
上記1次抗体が固定化された支持体上に流路部材を装着して検出デバイスを作製した。流路部材は、その上面から下面に至る流路aおよび流路b、ならびに下面部に凹部を有し、流路aおよび流路bの下端はそれぞれ前記凹部の両端に通じる構造を有している。この流路部材を支持体上に装着することにより、前記凹部に支持体によって蓋をして、反応室(測定領域)が形成される。この反応室に固定化された1次抗体が収容される。つまり、前記検出デバイスは、流路部材の上面から支持体の上面に至る流路aおよび流路b、ならびに両端において流路aおよび流路bに通じ、1次抗体を収容する反応室を有する。前記検出デバイスにおいては、液体を流路aに注入して、反応室に送り、その後流路bから排出することができる。
(2)標識物質で標識されたリガンドの作製
抗ヒトトロポニンI IgGモノクローナル抗体「抗体」溶液(Hytest社)と、AlexaFluor647標識キット(Invitrogen社)とを用いて、当該キットの所定の手順に従い、AlexaFluor647標識化抗体を作製した。その後、分子量カットフィルタ(日本ミリポア(株))を用いて未反応物を除去し、AlexaFluor647標識化抗体を精製し、下記アッセイの実施まで4℃で保存した。
抗ヒトトロポニンI IgGモノクローナル抗体「抗体」溶液(Hytest社)と、AlexaFluor647標識キット(Invitrogen社)とを用いて、当該キットの所定の手順に従い、AlexaFluor647標識化抗体を作製した。その後、分子量カットフィルタ(日本ミリポア(株))を用いて未反応物を除去し、AlexaFluor647標識化抗体を精製し、下記アッセイの実施まで4℃で保存した。
[実施例1]
(第一の工程)
前記検出デバイスの流路aから前記反応室に、ヒトトロポニンIを100pg/mL(0.1ng/mL)含むPBS溶液0.1mLを送液した。続いて、流路aから前記反応室に、SPFS用検出デバイスの流路にTween20を0.05質量%含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)を送液し、10分間循環させて流路および反応室を洗浄した。
(第一の工程)
前記検出デバイスの流路aから前記反応室に、ヒトトロポニンIを100pg/mL(0.1ng/mL)含むPBS溶液0.1mLを送液した。続いて、流路aから前記反応室に、SPFS用検出デバイスの流路にTween20を0.05質量%含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)を送液し、10分間循環させて流路および反応室を洗浄した。
(第二の工程)
前記検出デバイスの流路aから前記反応室に、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mL、およびカルボキシメチルデキストラン(商品名CMD-500、名糖産業株式会社製、分子量:50万)を2.5mg/mL含むPBS溶液を送液した。続いて、流路aから前記反応室に、Tween20を0.05質量%含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)を送液し、10分間循環させて流路および反応室を洗浄した。
前記検出デバイスの流路aから前記反応室に、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mL、およびカルボキシメチルデキストラン(商品名CMD-500、名糖産業株式会社製、分子量:50万)を2.5mg/mL含むPBS溶液を送液した。続いて、流路aから前記反応室に、Tween20を0.05質量%含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)を送液し、10分間循環させて流路および反応室を洗浄した。
(第三の工程)
PBSバッファー(pH7.4)で流路を満たした状態にしてから、測定領域の金属薄膜の裏面からプリズム(シグマ光機(株)製)を経由してレーザ光(640nm、40μW)を照射し、測定領域の上部に設置された光電子増倍管(PMT)で蛍光量を測定した。この測定値を、トロポニンI濃度が100pg/mLにおけるアッセイ発光シグナルIaとした。
PBSバッファー(pH7.4)で流路を満たした状態にしてから、測定領域の金属薄膜の裏面からプリズム(シグマ光機(株)製)を経由してレーザ光(640nm、40μW)を照射し、測定領域の上部に設置された光電子増倍管(PMT)で蛍光量を測定した。この測定値を、トロポニンI濃度が100pg/mLにおけるアッセイ発光シグナルIaとした。
一方、トロポニンIを100pg/mL含むPBS溶液の代わりにトロポニンIを全く含まない(0pg/mL)PBS溶液を送液し、それ以外は上記と同様の手順により、蛍光量を測定した。この測定値をアッセイノイズシグナルIanとした。
上記式(1b)に従い、S/N比を求めた。得られたIa、IanおよびS/N比を表1および2に示す。また、下記比較例1において得られたS/N比に対して増加したS/N比の比率をS/N比増加率として表2に示す。
なお、各実施例における上記第二の工程で用いたカルボキシメチルデキストランは、表1および2において、「添加物質」として「CMD」と表記した。
なお、各実施例における上記第二の工程で用いたカルボキシメチルデキストランは、表1および2において、「添加物質」として「CMD」と表記した。
[実施例2~4]
実施例2~4では、上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体およびカルボキシメチルデキストランを含むPBS溶液におけるカルボキシメチルデキストランの濃度をそれぞれ5mg/mL、10mg/mLおよび30mg/mLに変更したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1に示す。
実施例2~4では、上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体およびカルボキシメチルデキストランを含むPBS溶液におけるカルボキシメチルデキストランの濃度をそれぞれ5mg/mL、10mg/mLおよび30mg/mLに変更したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1に示す。
[比較例1]
上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mLおよびカルボキシメチルデキストランを2.5mg/mL含むPBS溶液に替えて、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mL含み、カルボキシメチルデキストランを含まないPBS溶液を使用したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1および2に示す。
上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mLおよびカルボキシメチルデキストランを2.5mg/mL含むPBS溶液に替えて、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mL含み、カルボキシメチルデキストランを含まないPBS溶液を使用したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1および2に示す。
[比較例2]
上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mLおよびカルボキシメチルデキストランを2.5mg/mL含むPBS溶液に替えて、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mL、およびポリエチレングリコール(PEG♯4000、和光純薬株式会社製)を1質量%含むPBS溶液を使用したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1に示す。
なお、比較例2~4における上記第二の工程で用いたポリエチレングリコールは、表1において、「添加物質」として「PEG」と表記した。
上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mLおよびカルボキシメチルデキストランを2.5mg/mL含むPBS溶液に替えて、AlexaFluor647標識化抗体を2μg/mL、およびポリエチレングリコール(PEG♯4000、和光純薬株式会社製)を1質量%含むPBS溶液を使用したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1に示す。
なお、比較例2~4における上記第二の工程で用いたポリエチレングリコールは、表1において、「添加物質」として「PEG」と表記した。
[比較例3および4]
比較例3および4では、上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体およびポリエチレングリコールを含むPBS溶液におけるポリエチレングリコールの濃度をそれぞれ3質量%および5質量%に変更したこと以外は比較例2と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1に示す。
比較例3および4では、上記第二の工程において、AlexaFluor647標識化抗体およびポリエチレングリコールを含むPBS溶液におけるポリエチレングリコールの濃度をそれぞれ3質量%および5質量%に変更したこと以外は比較例2と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、IanおよびS/N比を表1に示す。
[実施例5~9]
実施例5~9では、上記第二の工程において使用するカルボキシメチルデキストランをそれぞれカルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:1万)、カルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:4万)、カルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:20万)、およびカルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:100万)に変更したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、Ian、S/N比およびS/N比増加率を表2に示す。
実施例5~9では、上記第二の工程において使用するカルボキシメチルデキストランをそれぞれカルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:1万)、カルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:4万)、カルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:20万)、およびカルボキシメチルデキストラン(名糖産業株式会社製、分子量:100万)に変更したこと以外は実施例1と同様にアナライトの検出を行った。得られたIa、Ian、S/N比およびS/N比増加率を表2に示す。
Claims (9)
- 基板上に固定化された、アナライトに特異的に結合しうる第1リガンドを有する検出デバイスの前記基板上に検体を供給して、前記検体に含まれるアナライトを前記第1リガンドに結合させる第一の工程と、
前記基板上に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第2リガンドを供給して、前記第1リガンドに結合した前記アナライトに前記第2リガンドを結合させる第二の工程と、
前記アナライトに結合した前記第2リガンドを測定する第三の工程とを含み、
前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを供給するアナライトの検出方法。 - 前記第二の工程において、前記基板上にカルボキシメチルデキストランを1~30mg/mLの濃度で供給する請求項1に記載のアナライトの検出方法。
- 前記第二の工程において、前記基板上に第2リガンドとともにカルボキシメチルデキストランを供給する請求項1または2に記載のアナライトの検出方法。
- 前記第二の工程において、前記基板上に、前記第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液を供給する請求項3に記載のアナライトの検出方法。
- 前記第二の工程において、前記基板上に第2リガンドを供給して前記第2リガンドを前記アナライトに結合させた後に、カルボキシメチルデキストランを供給する請求項1または2に記載のアナライトの検出方法。
- カルボキシメチルデキストランを、前記第二の工程において、第2リガンドを前記アナライトに結合させた後に、前記基板を洗浄する洗浄液に含有させて供給する請求項5に記載のアナライトの検出方法。
- 前記アナライトは、心筋トロポニンI(cTnI)または脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)である請求項1~6のいずれかに記載のアナライトの検出方法。
- 請求項1または2に記載のアナライトの検出方法において使用されるキットであって、前記第2リガンドおよびカルボキシメチルデキストランを含有する第2リガンド含有液を含むアナライト検出用キット。
- 請求項1または2に記載のアナライトの検出方法において使用されるキットであって、カルボキシメチルデキストランを含有する、前記基板を洗浄する洗浄液を含むアナライト検出用キット。
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