WO2019058011A1 - Composición para el control del peso a través de la modulación de los niveles de péptidos involucrados en saciedad y/o apetito. - Google Patents

Composición para el control del peso a través de la modulación de los niveles de péptidos involucrados en saciedad y/o apetito. Download PDF

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Enrique Roche Collado
Vicente Micol Molina
Jonathan Richard Jones Barberá
Nuria CATURLA CERNUDA
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Definitions

  • Composition for the control of weight through the modulation of the levels of peptides involved in satiety and / or appetite.
  • the present invention is framed within the following technical fields: nutritional supplements, functional food, pharmaceutical preparation, and animal use; to control body weight and appetite, particularly useful for people who are overweight or obese.
  • nutritional supplements functional food, pharmaceutical preparation, and animal use
  • body weight and appetite particularly useful for people who are overweight or obese.
  • it relates to a composition that includes two polyphenolic extracts of plants.
  • Obesity has been described by the World Health Organization (WHO) as a global epidemic associated with several metabolic imbalances, which produce an increase in adipose tissue mass, endothelial dysfunction, dyslipidemia, hypertension, atherosclerosis and insulin resistance. . Taken together, these imbalances are a complex pathology known worldwide with the term metabolic syndrome.
  • WHO World Health Organization
  • Obesity is defined as a condition of excessive accumulation of fat in adipose tissue, which carries a risk to health and predisposes to resistance to insulin, hypertension and dyslipidemia. It is generally accepted that the only option to prevent the development of alterations derived from obesity is to restrict the intake of calories and increase physical activity. However, these changes in the way of life are not feasible because aging is associated with a reduction in muscle mass and resting metabolic rate.
  • Obesity is usually treated through a combination of methods, which include adopting a healthy diet, exercise and psychological support to achieve tangible goals of weight reduction and efficient metabolic control of this pathology.
  • these methods are difficult to carry out among the overweight population in the long term, because individuals under treatment tend to abandon it and regain lost weight.
  • a period of weight loss is accompanied by a body adaptation to the new metabolic requirements.
  • Obesity is a very complex pathology in which numerous factors intervene, such as the presence of a chronic and low intensity inflammatory component, an altered energy metabolism and an oxidative imbalance. This complexity is part of the reason why the readjustments of weight and metabolism are very slow processes. On many occasions this leads to the use of complementary methods to achieve the desired weight reduction, such as bariatric surgery, pharmacological treatments and nutritional intervention with dietary or nutraceutical supplements.
  • a first aspect of the invention provides a composition for use in the modulation of an individual's food intake by reducing appetite and / or increasing satiety through a modification of appetite-related peptide levels secreted by the digestive tract and adipose tissue of the individual, characterized in that said composition comprises an extract with at least 5% by weight of anthocyanins and an extract with at least 15% by weight of phenylpropanoids.
  • a composition containing both extracts mentioned above is extremely effective in the modulation of food intake because it produces satiating and / or appetite-reducing effects, through its effect on the levels of peptides secreted by the digestive tract, which cause feelings of satiety and / or appetite.
  • said composition it is possible to reduce the negative effects of weight control and maintenance strategies; for example, it is possible to reduce the appetite during a period of weight reduction and thus avoid or reduce the chances that the dieter begins to eat more food than recommended and regain weight.
  • this composition is very useful in weight maintenance strategies, once the desired weight has been reached, this composition helps to maintain the feeling of fullness for longer, and therefore, it is possible to modulate the food intake at the desired level, for example, to maintain the weight (or reduce it further, if necessary).
  • the extract with at least 5% by weight of anthocyanins contains about 10% anthocyanins.
  • the extract with at least 15% by weight of phenylpropanoids contains about 30% of phenylpropanoids.
  • the extract with anthocyanins comprises an extract of rosella ⁇ Hibiscus sabdariffá).
  • the extract with phenylpropanoids comprises an extract of lemon grass ⁇ Lippia citriodora).
  • Rosella is a plant rich in anthocyanins and its extract combined with extract of lemon grass, which is a plant rich in phenylpropanoids produces a marked satiating effect and / or reduction of appetite.
  • the composition may comprise a minimum of 50% by weight of the extract of lemon grass (Lippia citriodora) and a minimum of 25% by weight of the extract of rosella ⁇ Hibiscus sabdariffá).
  • the composition comprises about 65% by weight of the extract of lemongrass (Lippia citriodora) and about 35% by weight of the extract of rosella ⁇ Hibiscus sabdariffá).
  • composition has a greater effect on the activation of the metabolism of the fats mediated by a greater activation of AMPK compared to a composition where the extracts are mixed in equal parts.
  • the composition can be administered in a dose of 250 to 1000 milligrams per day. Preferably the composition is administered in a dose of 500 mg per day.
  • a second aspect of the invention provides a composition for use in reducing an individual's weight by a modification in lipid metabolism mediated by an activation of the AMP-activated protein kinase sensors (AMPK) of the individual which is translated in a reduction of the percentage of body fat, characterized in that said composition comprises an extract with at least 5% by weight of anthocyanins and an extract with at least 15% by weight of phenylpropanoids.
  • AMPK AMP-activated protein kinase sensors
  • a composition containing both extracts mentioned above is enormously effective in reducing an individual's weight by a change or improvement in lipid metabolism through the activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) energy sensors.
  • This composition is very useful in the treatment of obesity, being able to reduce the amount of adipose tissue of an individual and improve other parameters typically related to obesity or overweight.
  • AMPK is a serine / threonine kinase that plays a very important role in the maintenance of cellular homeostasis. Its activation involves the activation of catabolic processes such as lipolysis and the oxidation of fatty acids and the inhibition of anabolic processes such as lipogenesis and glycogenesis.
  • the extract with at least 5% by weight of anthocyanins contains about 10% anthocyanins.
  • the extract with at least 15% by weight of phenylpropanoids contains about 30% of phenylpropanoids.
  • the anthocyanin extract comprises an extract of rosella ⁇ Hibiscus sabdar ⁇ ffá).
  • the phenylpropanoid extract comprises an extract of lemon grass ⁇ Lippia citr ⁇ odora). It has been shown that Rosella anthocyanins are particularly effective in reducing inflammation linked to metabolic stress by the inhibition of leptin secretion and monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), which are important adipokines that regulate the migration of non-resident macrophages to adipose tissue and general systemic inflammation.
  • MCP-1 monocyte chemoattractant protein 1
  • the polyphenolic extracts of Rosella also prevent hepatic steatosis in hyperlipidemic mice by modulating the expression of genes involved in glucose and lipid homeostasis.
  • Rosella anthocyanins Attenuate the increase in blood glucose and the apparent increase in insulin resistance, as well as increase the respiratory rate, which is intimately related to the basal metabolic rate (BMR ).
  • BMR basal metabolic rate
  • a reduction in the expression of lipogenic genes, such as fatty acid synthase (FASN) and the binding protein of the sterol regulatory element (Srebp-1 c) was observed simultaneously with an activation of hepatic AMPK. .
  • the phenylpropanoids of the herb extract and its major component verbascoside improves the metabolic alterations induced by an elevated glucose level.
  • These effects are mediated by a positive PPAR ⁇ -dependent transcriptional regulation of adiponectin and a potent activation of AMPK, a positive regulation of PPAR- ⁇ expressed by mRNA and a negative regulation of FASN.
  • the experiments carried out in mice indicate an improvement in the metabolism of fats (cholesterol and triglycerides), especially in the elimination of triglycerides.
  • the composition may comprise a minimum of 50% by weight of the extract of lemongrass (Lippia citriodora) and a minimum of 25% by weight of the extract of rosella ⁇ Hibiscus sabdariffa).
  • the composition comprises about 65% by weight of the extract of lemongrass (Lippia citriodora) and about 35% by weight of the extract of rosella ⁇ Hibiscus sabdariffa). This percentage of both extracts produces that the composition has a greater effect on the activation of the metabolism of the fats mediated by a greater activation of AMPK compared to a composition where the extracts are mixed in equal parts.
  • composition can be administered in a dose of 250 to 1000 milligrams per day.
  • composition is administered in a dose of 500 mg per day.
  • the administration of the composition of the present invention is selected from parenteral, transdermal, oral, topical, intracolonic or vaginal routes.
  • the composition of the present invention is administered parenterally in combination with conventional injectable liquid carriers, such as water or suitable alcohols.
  • conventional injectable liquid carriers such as water or suitable alcohols.
  • Conventional pharmaceutical adjuvants for injection such as stabilizing agents, solubilizing agents and buffers may be included in such injectable compositions.
  • the composition of the present invention is administered intramuscularly, intraperitoneally or intravenously.
  • composition of the present invention is administered orally containing one or more physiologically compatible carriers or excipients, in solid or liquid form.
  • physiologically compatible carriers or excipients may contain conventional components such as binding agents, fillers, lubricants and physiologically acceptable wetting agents.
  • the compositions may take any suitable form, such as tablets, dragees, capsules, lozenges, oily or aqueous solutions, suspensions, emulsions or in dry powder form suitable for reconstitution with water or other suitable liquid medium before use, for the immediate or controlled release.
  • liquid oral forms for administration may also contain certain additives such as sweeteners, flavors, preservatives and emulsifying agents.
  • Non-aqueous liquid compositions for oral administration can also be formulated, containing for example edible oils. Such liquid compositions can be conveniently encapsulated in, for example, gelatin capsules in a unit dosage amount.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is daily for humans and animals and may vary depending on the age, weight or degree of disease etc.
  • the daily dosage for mammals, including humans, normally ranges from 250 milligram up to 1000 milligrams, preferably 500 mg of substance to be administered during one or several ingestions.
  • a third aspect of the invention provides a method of producing a composition
  • a composition comprising an extract with at least 5% by weight of anthocyanins and an extract with at least 15% by weight of phenylpropanoids characterized in that it comprises a hydroalcoholic extraction of lemon verbena ⁇ Lippia citr ⁇ odorá) and a hydroalcoholic extraction of rosella ⁇ Hibiscus sabdar ⁇ ffá).
  • This method uses two natural sources rich in the active compounds of the composition. The hydroalcoholic extraction of these plants allows obtaining the required active content with a remarkable and economically viable yield.
  • the hydroalcoholic extraction of lemon grass can be carried out using a solution of alcohol in water with an alcohol content of greater than 70% and up to 100% by volume of ethanol for two hours at a temperature between 40 and 80 ° C.
  • the solution of ethanol in water contains about 70% by volume of alcohol.
  • composition of the extraction agent and the extraction conditions maximize the obtaining of the phenylpropanoic compounds, in particular the verbascoside of the leaves of lemongrass under economically viable conditions without having to distill an excess of alcohol or water.
  • FIGURES Figure 1 Graph showing the percentage of accumulation of triglycerides in hypertrophic insulin-resistant adipocytes.
  • Figure 2 Graph showing the percentage of AMPK activation in hypertrophic insulin resistant adipocytes treated with different concentrations of rosella and lemon verbena extracts.
  • Figure 3 Graph showing the percentage of AMPK activation in hypertrophic insulin-resistant adipocytes treated with different concentrations of mixed rosella and lemongrass extracts, in two different proportions.
  • Figure 4 Graphs showing the levels of total cholesterol, LDL (bad) cholesterol and HDL (good) cholesterol in the blood of mice fed a high-fat diet and treated with the extracts of Hierbaluisa and Rosella, separately, and with two different doses of a mixture of extracts of lemongrass and rosella in a proportion of 65:35 by weight respectively, and of mice fed a high-fat untreated diet and of mice fed a normal diet.
  • Figure 5 Graph and table representing the ratio of food efficiency in mice fed a diet high in fat and treated with extracts of lemongrass and rosella, separately, and with two different doses of a mixture of extracts of lemongrass and rosella and of mice fed a diet high in untreated fat and of mice fed a normal diet.
  • Figure 6. Graph showing the blood glucose level of mice fed a diet high in fat and treated with the extracts of lemongrass and rosella, separately, and with two different doses of a mixture of extracts of lemongrass and rosella and mice fed a diet high in untreated fat and mice fed a normal diet.
  • Figure 7 Graph showing the level of leptin in the blood of mice fed a diet high in fat and treated with extracts of lemongrass and rosella, separately, and with two different doses of a mixture of extracts of Hierbaluisa and Rosella and mice fed a diet high in untreated fat and mice fed a normal diet.
  • Figure 8 Graph showing the level of leptin in the adipose tissue of mice fed a high-fat diet and treated with the extracts of Hierbaluisa and Rosella, separately, and with two different doses of a mixture of extracts of Hierbaluisa and Rosella and of mice fed a high-fat untreated diet and mice fed a normal diet.
  • Figure 9 Graph showing the body fat weight of mice fed a high-fat diet and treated with the extracts of lemongrass and rosella, separately, and with two different doses of a mixture of lemongrass and rosella extracts and mice fed a diet high in untreated fat and mice fed a normal diet.
  • Figures 10a, 10b, 10c and 10d Graphs representing metabolic markers of abdominal adipose tissue and the liver of mice fed a high-fat diet and treated with the extracts of Hierbaluisa and Rosella, separately, and with two different doses of a mixture of extracts of Hierbaluisa and Rosella and mice fed a diet high in untreated fat and mice fed a normal diet.
  • Figure 1 Graph representing the Western Blot analysis to determine the amount of protein in the adipose tissue of mice fed a high-fat diet and treated with the extracts of Hierbaluisa and Rosella, separately, and with two different doses of a mixture of extracts from lemongrass and rosella and mice fed a diet high in untreated fat and mice fed a normal diet.
  • FIG 12. Graphs representing the genes corresponding to the metabolic markers of human immortalized, undifferentiated (ND) and differentiated (MDI) adipocytes, cultured in vitro treated with different doses of herbal extracts (LV) and rosella (HS), separately, and with different doses of a mixture of lemongrass and rosella extracts.
  • Figure 13. Graphs showing the decrease in lipid content of the hypertrophic adipocytes treated with the composition with extracts of rosella and hierbaluisa and the parallel increase in the activation of AMPK in said adipocytes.
  • Figure 14. Scheme of the production method of a lemon verbena extract.
  • EXAMPLE 1 Determination of the proportion of Hierbaluisa and Rosella extracts.
  • 3T3-L1 preadipocytes were cultured in 96 well plates and complete culture medium (DMEM with low glucose at 1 g / L) and sodium pyruvate, enriched with glutamine and supplemented with 10% bovine serum and antibiotic (100 ⁇ g / mL of streptomycin and 100 U / mL of penicillin).
  • the differentiation of adipocytes was induced by adding adipogenic agents (0.5 mM IBMX, 1 ⁇ DEX and 1 ⁇ insulin) to the culture medium for two days. The medium was changed to fresh medium every 48 hours.
  • adipogenic agents 0.5 mM IBMX, 1 ⁇ DEX and 1 ⁇ insulin
  • adipocytes The phenotypic change of adipocytes was observed under a microscope. In all the experiments, more than 90% of the cells were mature adipocytes after 8 -10 days of incubation. To induce cell hypertrophy, the adipocytes were exposed to a medium high in glucose (25 mM).
  • the cell cultures were carried out under sterile conditions using a laminar air flow hood for cell cultures and an incubator at 37 ° C with a humidified atmosphere with 5% CO 2 .
  • the effect of the extracts and that of the composition with both extracts on the accumulation of triglycerides and the cytoplasmic activation of AMPK in 3T3-L1 adipocytes was studied.
  • the extracts were added after the adipocytes had differentiated until the plates were analyzed.
  • the extracts were previously prepared with the culture medium and filtered with a 0.2 um filter to sterilize them.
  • Hypertrophic adipocytes with 29 days of differentiation were exposed to extracts of rosella (-10% by weight anthocyanins) and extracts of lemongrass (-30% by weight phenylpropanoids) separately and to mixtures of 50:50 by weight and 35:65 by weight. weight.
  • the extracts were added on day 24 after the differentiation of the adipocytes and were incubated at 50, 200 and 500 ⁇ g / mL for 5 days.
  • the lipid content of the adipocytes was evaluated with the commercial reagent AdipoRed TM and using the multi-modal microplate reader with BioTek Cytation 3 cellular image capture with an excitation wavelength of 485 nm and of emission of 572 nm.
  • the absence of cytotoxicity was evaluated by the crystal violet method. The results are shown in the Figure 1, using a graph showing the percentage of accumulation of triglycerides in hypertrophic insulin-resistant adipocytes.
  • HS represents adipocytes treated with rosella extract with 10% anthocyanins
  • LV represents adipocytes treated with extract of lemongrass with 30% phenylpropanoids
  • HS-LV (1: 1) represents adipocytes treated with a mixture of extracts of lemongrass and rosella in one to one weight ratio
  • HS-LV (35:65) represents the adipocytes treated with a mixture of the extracts of lemongrass and rosella in proportion 65 to 35 by weight, respectively.
  • the values of p are: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** p ⁇ 0.001.
  • the levels of AMPK and phosphorylated (activated) AMPK were determined by a quantitative immunofluorescence experiment using AMPK and phosphorylated AMPK antibodies.
  • the nuclei were labeled with Hoechst 33342 reagent. Once the cells were labeled, the AMPK fluorescence was quantified with an excitation wavelength of 490 nm and emission of 520 nm, that of AMPK phosphorylated with a length of excitation wave of 593 nm and of emission of 614 nm and that of the nuclei with an excitation wavelength of 350 nm and emission of 461 nm, using the multi-modal microplate reader.
  • EXAMPLE 2 Evaluation of the reduction in fat, hyperlipidemia, hyperglycemia and adipogenesis in obese mice treated with a composition containing extracts of lemongrass and rosella.
  • HFD high-fat diet
  • mice with a high-fat diet are hyperglycemic.
  • Figure 6 * p ⁇ 0.05 with respect to the HFD-CTL control
  • the mice that took the highest concentration of the composition with both extracts were the only ones with a significant reduction of blood glucose, near the levels of mice with normal diet.
  • the levels of the hormone leptin in the mice were analyzed by taking a diet high in fat. Specifically, the levels of said hormones in blood were analyzed, as can be seen in Figure 7 ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 with respect to the HFD-CTL).
  • mice that took the composition with both extracts had significantly less amount of fat, in the case of the abdominal, epididymal, and intestine ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0, 01).
  • metabolic markers were studied in the abdominal adipose tissue and the liver (due to in the case of overweight / obesity there is an abnormal accumulation of adipose tissue in the liver, called "fatty liver") related to the regulation of accumulation or production of triglycerides and fatty acids.
  • PPAR ⁇ is a nuclear membrane receptor that is found in adipocytes, as well as colon cells and macrophages. In the case of adipose tissue, its function is to activate lipogenesis and lipid uptake. SREBPI c regulates the homeostasis of lipids, and its activation induces the synthesis of cholesterol when it is low. C / ⁇ is a transcription factor that regulates both adipogenesis and normal function of adipocytes, and regulates the expression of PPARy. Finally, AMPK (AMP kinase) inhibits lipid uptake, cholesterol synthesis and lipogenesis, among other functions, although to perform its function the protein must be phosphorylated (p-AMPK).
  • AMPK AMP kinase
  • the transcriptional expression of AMPK was increased in the mice taking the composition with both extracts (in the liver, the mice taking rosella also appreciated an increase in their expression, but not in the adipose tissue).
  • the active form of AMPK is when it is phosphorylated (p-AMPK).
  • p-AMPK phosphorylated
  • mice taking a high-fat diet for 8 weeks present an activation of genes involved in fat accumulation, lipogenesis, triglyceride and cholesterol synthesis, and adipogenesis, which leads to greater body fat content, comparing with control mice with a normal diet (C57bl / 6J Nr).
  • a normal diet C57bl / 6J Nr.
  • the expression of these genes is reverted towards concentrations similar to those observed in non-obese mice with normal diet.
  • the activation of p-AMPK indicates that it increases the metabolism of fatty acids, decreasing their storage while increasing their degradation.
  • mice were corroborated with in vitro studies using a human adipocyte cell line, where different concentrations of the various ingredients were tested and cultured for 10 days. The same genes as those studied in mice were analyzed for the metabolism of fatty acids. The results are shown in Figure 12. (ND: undifferentiated cell cultures, MDI: differentiated cell cultures, LV: lemon verbena, HB: rosella, MA: composition with both extracts, 125-1000: concentrations of the ingredients, expressed in Mg / ml).
  • AMPK differentiated cell culture
  • EXAMPLE 3 Reduction of appetite and / or increase of satiety by changes in peptides secreted by the digestive tract and adipose tissue induced by consumption of composition containing an extract of lemongrass with a content of 30% by weight of phenylpropanoids and a rosella extract with a content of 10% by weight of anthocyanins, in a proportion of 65 to 35 by weight.
  • the members of the L1 group received a daily dose of 500 mg of a composition containing lemon verbena extract and rosella extract.
  • the members of the L2 group received a daily dose of 500 mg of microcrystalline cellulose.
  • the placebo capsules and the satiation effect composition had the same size, odor, color and weight.
  • the volunteers took a capsule 20 or 30 minutes before breakfast each day for two months.
  • the anthropometric measurements were taken at the beginning of the study, after one month and after two months from the beginning of the study, which included body weight, height, measurement of the triceps, biceps and abdominal skinfolds and measurement of the perimeter of the arm and of the abdomen.
  • the perimeter of the abdomen (AC) was measured at two different sites: anterior midway between the xiphoid bulge of the sternum and the umbilicus and laterally midway between the end of the rib cage and the iliac crests (AC1) and to the height of the navel (AC2).
  • the percentage of body fat was obtained from the abdominal measurements using the Weltman equation.
  • VAS test The validated visual analog scale
  • the VAS test was used to record hunger, satiety, filling feeling, prospective food consumption, desire to eat something fatty, salty, sweet or not sweet and the appreciation of the taste of foods .
  • the VAS test was completed at the beginning of the study at rest and after 15, 20, 45 and 60 days of study.
  • the volunteers filled out an SF-36 questionnaire at the beginning and at the end of the study.
  • blood samples were obtained from the forearm vein after an overnight fast at the beginning, after 30 and after 60 days of study.
  • Table 1 shows the anthropometric parameters at the beginning and during the study. No significant differences were observed at the beginning of the study between both groups. The results of table 1 indicate a statistically significant improvement of the anthropometric parameters after two months of study in the group (L1) that took the composition with extracts of lemongrass and rosella, especially the percentage of body fat, the skinfold of the body was improved. triceps, body weight and the perimeter of the hip (AC2). These differences can be observed more clearly in table 1 a.
  • Table 1a Differences between the anthropometric parameters during the study with the initial values in mean values plus / minus standard deviations. The intra-group statistical analysis was determined in each period in comparison with the data at the beginning of the study. Significance was established at: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, * ** p ⁇ 0.001, **** p ⁇ 0.0001.
  • the consumption of the composition with the extracts of lemongrass and rosella decreases the sensation of hunger consistently throughout the two months of study.
  • the average hunger score decreased from 5.92 on day 15 to 2.58 on day 60 in the L1 group, while in the L2 group it increased from 6.18 on day 15 to 6.41 on day 60 in the placebo group. A similar trend is observed in the scores of question 4.
  • peptides analyzed are secreted after food intake. Ghrelin stimulates the appetite, while GLP-1 and PYY are secreted together to cause the sensation of satiety. Because the blood samples were taken fasting in the morning, the determined levels of these peptides in particular, correspond to basal levels. Initially, the basal levels of both groups coincide and there are no significant differences between the two. The other peptides show significant differences in the L1 group. In this context, incretin GLP-1 increased significantly in the L1 group while it decreased in the L2 group and ghrelin increased in the L2 group and remained constant in the L1 group. Therefore, the volunteers in the L1 group had less appetite and more satiety than the volunteers in the L2 group.
  • leptin which is synthesized in adipose tissue and produces satiety, decreased significantly in the L1 group while no changes were seen in the L2 group.
  • the resistin decreased significantly in the L1 group while no changes were observed in the L2 group.
  • the elevated level of leptin in blood in the L2 group is explained by the resistance created in the receptors corresponding to causing satiety in response to the secretion of leptin, it is as if the corresponding receptors had become desensitized, while in the L1 group the level Normal leptin in blood indicates that the corresponding receptors continue with the same sensitivity or higher than the leptin level.
  • the 3T3-L1 preadipocytes were cultured in a medium low in glucose (1 g / L) DMEM supplemented with 10% bovine serum (CS), 100 ⁇ g / mL streptomycin and 100 U / mL penicillin and incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 and 95% air in volume.
  • Differentiation to adipocytes was induced by culture in a medium high in glucose (4.5g / L) DMEM supplemented with 10% in fetal bovine serum (FBS), 1 ⁇ of insulin, 1 ⁇ of dexamethasone (DEX) and 0.5mM of 3 Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) for 48 hours.
  • FBS fetal bovine serum
  • DEX dexamethasone
  • IBMX Isobutyl-1-methylxanthine
  • the cells were maintained in a medium high in glucose with FBS and insulin, and the medium was changed every two days, with which hypertrophied adipocytes were obtained after 20 days of incubation.
  • the cells were treated with extracts of lemongrass ( ⁇ 30% by weight of phenylrpopanoids) and rosella (-10% by weight of anthocyanins) with a weight ratio of 65 to 36, at various concentrations for 72 hours.
  • the extracts were dissolved in a medium and filtered to be sterilized.
  • the lipid content of the hypertrophic adipocytes was evaluated using the AdipoRed TM reagent. The supernatant was removed from the cells and these were carefully washed with phosphate buffered saline (PBS). Next, AdipoRed TM was added and the cells were allowed to incubate for 15 at room temperature. Triglyceride accumulation was measured using a microplate reader at 485 nm excitation wavelength and at 572 nm emission.
  • phosphorylated AMPK in Thr172 was quantified with an immunofluorescence assay.
  • the cells were fixed with a fixation buffer, permeabilized with 0.3% Triton x-100 (Sigma-Aldrich, Spain) and blocked with 4% goat serum. Once this was done, the cells were incubated overnight at 4 ° C with AMPK mouse monoclonal alpha 1 + alpha 2 (Abcam, Cambridge, UK) and with rabbit phospho-AMPK alpha 1 (Thr172; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
  • the cells were washed with PBS and incubated for 6 hours at room temperature with each corresponding secondary polyclonal antibody, goat anti-rabbit IgG CF TM 594 and anti-mouse FITC (both from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Fluorescence of the cells was measured using a multi-plate microplate reader mode with capture of cellular images (Cytation 3, Biotek, Spain) at 593 nm excitation wavelength and 614 nm emission to measure AMPK levels. Activation of AMPK is expressed as the quotient of AMPK levels normalized by total AMPK. The results are shown in Figure 13 ( * p ⁇ 0.05, *** p ⁇ 0.001).
  • the exclusion criteria were a total cholesterol level lower than 200 mg / dL, the presence of some pathology related to obesity, the use of medication for cholesterol or hypertension, the consumption of supplements or pharmaceutical antioxidants, alcohol addiction and pregnant or lactating women. Based on these criteria, 55 healthy women, aged between 36 to 69 years, with a body mass index of 25 to 34 kg / m 2 were selected , who passed a selection and telephone interview about their health as well as a biochemical and anthropometric evaluation. .
  • 9 volunteers were withdrawn, 6 in the placebo group and 3 in the experimental group, and a total of 46 volunteers completed the study.
  • the placebo group (mean age 51 years) received two placebo capsules with 400 mg of microcrystalline cellulose each and the experimental group (mean age 52) received two capsules each containing 250 mg of the composition with extracts of rosella and lemon verbena and 150 mg of excipients (microcrystalline cellulose). Therefore, the experimental group took 500 mg / day of the composition under study. Both types of capsules had the same size, smell, color and weight.
  • the volunteers took two capsules every day 20 or 30 minutes before breakfast for two months.
  • the anthropometric measurements were taken at the beginning of the study, after one month and after two months from the beginning of the study, which included body weight, height, measurement of the triceps, biceps and abdominal skinfolds and measurement of the perimeter of the arm and of the abdomen.
  • the perimeter of the abdomen (AC) was measured at two different sites: anterior midway between the xiphoid bulge of the sternum and the umbilicus and laterally midway between the end of the rib cage and the iliac crests (AC1) and to the height of the navel (AC2).
  • the percentage of body fat was obtained from the abdominal measurements using the Weltman equation.
  • Fasting blood samples were taken to measure total glucose, glycosylated hemoglobin and lipid profile, which includes triglycerides, total cholesterol, good cholesterol (high density lipoprotein) or HDL and bad cholesterol (low lipoprotein). density) or LDL.
  • the blood samples were analyzed to measure safety parameters such as hematology, electrolytes, creatinine, urea, uric acid, glutamic-pyruvic transaminase, glutamic-oxaloacetic transaminase and C-reactive protein.
  • systolic and diastolic blood pressure and resting heart rate were measured at the beginning, after one month and after two months of study.
  • Triglycerides mg / dl 39.39
  • the composition with extracts of lemongrass and rosella causes a potent increase in the pAMPK / AMPK ratio in a dose-dependent manner that is statistically significant in comparison with the increase observed in the experiment of control at a dose of 350 ⁇ g / mL, while at a dose of 500 ⁇ g / mL an increase of approximately 1.5 is observed.
  • the anthropometric parameters of both groups do not show appreciable differences at the beginning of the study.
  • the results of the study show a significant improvement in the experimental group compared to the placebo group, after two months of study, particularly in body weight, abdominal circumference and body fat percentage (see table 4).
  • the experimental group showed a greater reduction in body weight than the placebo group that is statistically significant with p ⁇ 0.01.
  • Both abdominal perimeters AC1 and AC2 were reduced after the two months of study, but only the highest abdominal perimeter showed statistically significant differences with the placebo group after one and two months of study. Consistent with these data, the percentage of body fat reduced in both groups, but in the experimental group it was significantly reduced more than in the placebo group after the two months of study, p ⁇ 0.01.
  • Statistically significant differences were also observed in the triceps skinfold measurements (p ⁇ 0.05) and in the body mass index (p ⁇ 0.01).
  • EXAMPLE 5 Method of production of a composition with lemongrass and rosella extracts according to an aspect of the invention.
  • composition with herbal extracts and rosella is a mixture of two extracts with a very specific composition of active compounds, ie at least 10% by weight of anthocyanins in the rosella extract and at least 30% by weight of phenylpropanoids in the extract of lemongrass, which mixed in a weight ratio of 35 to 65, respectively, offer synergistic activity, especially for the control of satiety.
  • the manufacturing process of the herbal extract comprises a hydroalcoholic extraction using concentrations of alcohol (ethanol, methanol, propanol, isopropanol or butanol) greater than 70 and up to 100% by volume in water (Figure 14).
  • alcohol ethanol, methanol, propanol, isopropanol or butanol
  • the leaves of lemon grass ⁇ Lippia citriodorá) are analyzed to determine the amount of verbascoside using high pressure liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • Approximately 330 g of lemon verbena leaves are extracted in 4 liters of ethanol diluted in demineralised water (greater than 70% and up to 100% of ethanol by volume) keeping the liquid stirred in the container, recirculating the evaporated solvent or percolating it in the filter nutcha at a temperature of 40 to 80 ° C for 2 hours. After two hours, the solution is filtered to separate the leaves and other particles.
  • the filtered solution is distilled under vacuum at a temperature of 60 to 80 ° C to obtain a concentrated aqueous solution containing 15 to 30% solids. This concentrated solution is spray-dried at a temperature of 70-90 ° C to obtain a dry powder extract containing not less than 30% by weight of phenylpropanoids in total.
  • the yield is from 19 to 21% by weight
  • the flowers of the plant are selected and analyzed to obtain the anthocyanin content by means of high pressure liquid chromatography (HPLC) and detection with ultraviolet light.
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • 320 grams of flowers are taken and extracted with 3.2 liters of ethanol diluted in 50% by volume demineralized water, maintaining the agitation of the liquid in the reactor, and recirculating the solvent evaporated or percolating in filter nucha at a temperature between 40 and 60 ° C for 2 hours.
  • the solution is filtered with a 0.5 micron pore filter to separate the flowers.
  • the filtered solution is distilled under vacuum at a temperature between 50 and 70 ° C and the concentrate obtained is diluted to obtain 620 liters.
  • the product is subjected to a purification step by chromatography on a polymeric adsorption / desorption resin suitable for polyphenols.
  • the eluate constitutes the extract purified in liquid form.
  • the purified liquid is concentrated to a content of 30 to 50% by weight solids.
  • the concentrated solution is spray-dried at a temperature between 70 and 80 ° C to obtain a dry powder extract containing not less than 10% anthocyanins.
  • the yield is from 5 to 7% by weight.

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Abstract

La presente invención aporta unas composiciones que comprenden un extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas y un extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides que resultan especialmente indicadas para su uso en periodos de reducción de peso debido a que reducen el apetito y aumentan la saciedad mediante una modificación de los niveles de hormonas segregadas por el tracto digestivo. De forma paralela o complementaria, estas composiciones actúan sobre el metabolismo de los lípidos en las células de tejido adiposo mediante la activación de AMPK y los procesos de oxidación y eliminación de lípidos. Dicha composición se obtiene mediante la extracción hidroalcohólica de flor de rosella y hoja de hierbauisa, empleando en el caso de la hierbaluisa concentraciones de alcohol (etanol, metanol, propanol, isopropanol o butanol) superiores al 70 y hasta el 100 % en volumen.

Description

TÍTULO DE LA INVENCIÓN
Composición para el control del peso a través de la modulación de los niveles de péptidos involucrados en saciedad y/o apetito.
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enmarca dentro de los siguientes campos técnicos: suplementos nutricionales, alimentación funcional, preparado farmacéutico, y uso animal; para controlar el peso corporal y el apetito, en particular, de utilidad para personas con sobrepeso u obesidad. En particular, se refiere a una composición que incluye dos extractos polifenólicos de plantas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La obesidad ha sido calificada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una epidemia global asociada a varios desequilibrios metabólicos, que producen un aumento de la masa de tejido adiposo, disfunción del endotelio, dislipidemia, hipertensión, ateroesclerosis y resistencia a la insulina. En conjunto, estos desequilibrios constituyen una patología compleja conocida mundialmente con el término de síndrome metabólico.
La obesidad se define como una condición de excesiva acumulación de grasa en el tejido adiposo, que conlleva un riesgo para la salud y predispone a una resistencia frente a la insulina, hipertensión y dislipidemia. Está generalmente aceptado que la única opción para prevenir el desarrollo de alteraciones derivadas de la obesidad es restringir la ingesta de calorías y aumentar la actividad física. Sin embargo, estos cambios en el modo de vida no son factibles debido a que el envejecimiento viene asociado a una reducción de masa muscular y gasto metabólico en reposo.
La obesidad se trata generalmente mediante una combinación de métodos, que incluyen adoptar una dieta saludable, ejercicio y apoyo psicológico para conseguir objetivos tangibles de reducción de peso y un control metabólico eficiente de esta patología. Sin embargo, estos métodos son difíciles de llevar a cabo entre la población con sobrepeso a largo plazo, debido a que los individuos bajo tratamiento tienden a abandonarlo y a recuperar el peso perdido. Además, un periodo de pérdida de peso viene acompañado por una adaptación corporal a los nuevos requerimientos metabólicos. Se produce un déficit de energía entre el consumo y el gasto calórico que estimula la producción de ghrelina para inducir apetito y provocar un mayor consumo de alimentos, al mismo tiempo que se reduce el consumo energético metabólico en letargo y se incrementa la eficiencia energética (reducción del consumo de energía cuando se está activo). A largo plazo, esto implica que el cuerpo tiende a consumir menos calorías y aumenta considerablemente el apetito, con lo que se producen los conocidos "rebotes", en los que se vuelve a consumir igual o más alimentos que antes de empezar la dieta y el cuerpo no consigue quemar las calorías al mismo ritmo que antes de la dieta, con la consecuencia de que se vuelve a recuperar el peso perdido o incluso a superarlo. Es necesario, por tanto, modular el metabolismo para evitar el incremento del apetito en periodos de i dieta y reducción de peso y evitar o reducir las recaídas en los tratamientos de la obesidad y el sobrepeso.
La obesidad es una patología muy compleja en la que intervienen numerosos factores como la presencia de un componente inflamatorio crónico y de baja intensidad, un metabolismo energético alterado y un desequilibrio oxidativo. Esta complejidad es parte del motivo por el que los reajustes del peso y el metabolismo son procesos muy lentos. En numerosas ocasiones esto conlleva que se recurra a métodos complementarios para lograr la reducción de peso deseada, tales como la cirugía bariátrica, los tratamientos farmacológicos y la intervención nutricional con suplementos dietéticos o nutracéuticos.
Los inconvenientes de la cirugía bariátrica son los propios de cualquier intervención quirúrgica, llegándose a dar incluso casos de muerte durante el procedimiento. Los inconvenientes de los tratamientos farmacéuticos son también de sobra conocidos por los llamados "efectos secundarios", que siempre pueden presentarse en mayor o menor medida. Además, en el mercado existen numerosos productos nutracéuticos y suplementos dietéticos de los que se preconizan sus efectos de reducción de peso, de "quemar" la grasa e incluso de reducir el apetito, cuyos efectos no están demostrados científicamente, son dudosos o en el mejor de los casos es debido a un efecto placebo o de autosugestión.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la invención aporta una composición para su uso en la modulación de la ingesta de alimentos de un individuo mediante reducción del apetito y/o aumento de la saciedad a través de una modificación de los niveles de péptidos relacionados con el apetito segregados por el tracto digestivo y tejido adiposo del individuo, caracterizada porque dicha composición comprende un extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas y un extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides.
Una composición que contiene ambos extractos mencionados anteriormente es enormemente efectiva en la modulación de la ingesta de alimentos porque produce efectos saciantes y/o reductores del apetito, mediante su efecto en los niveles de péptidos segregados por el tracto digestivo, que provocan sensaciones de saciedad y/o apetito. Con dicha composición es posible reducir los efectos negativos de las estrategias de control y mantenimiento de peso; por ejemplo, es posible reducir el apetito durante un periodo de reducción de peso y así evitar o reducir las posibilidades de que el individuo a dieta comience a ingerir alimentos en mayor cantidad de la recomendada y vuelva a subir de peso. Igualmente, esta composición es muy útil en las estrategias de mantenimiento de peso, una vez que se ha alcanzado el peso deseado, esta composición ayuda a mantener la sensación de saciedad por más tiempo, y por lo tanto, se consigue modular la ingesta de alimentos al nivel deseado, por ejemplo, para mantener el peso (o reducirlo más, si es necesario). Preferiblemente el extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas contiene alrededor de un 10 % en antocianinas.
Preferiblemente el extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides contiene alrededor de un 30 % de fenilpropanoides.
Estas concentraciones en antocianinas y fenilpropanoides garantizan que la composición utilizada no sea citotóxica. Preferiblemente el extracto con antocianinas comprende un extracto de rosella {Hibiscus sabdariffá).
Preferiblemente el extracto con fenilpropanoides comprende un extracto de hierbaluisa {Lippia citriodora).
En el estado de la técnica no están claramente definidos los efectos sobre el apetito y la saciedad de los extractos de hierbaluisa y de rosella por separado. Hay fuentes que consideran que tienen efectos de aumentar el apetito y reducen la saciedad y fuentes que consideran que disminuyen el apetito y aumentan la saciedad. En la presente memoria se podrá comprobar que una composición con ambos extractos tiene un potente efecto de modificar la expresión de péptidos que intervienen en la regulación de la ingesta de alimentos (apetito y saciedad), como por ejemplo la ghrelina y la leptina y que en comparación con dosis equivalentes de estos extractos administrados por separado, producen un efecto muy significativamente mayor. Dados los efectos ambiguos de ambos extractos por separado, es altamente sorprendente e inesperado el efecto saciante y de reducción del apetito conseguido por las composiciones que contienen ambos extractos.
La rosella es una planta rica en antocianinas y su extracto combinado con el extracto de hierbaluisa, que es una planta rica en fenilpropanoides produce un marcado efecto saciante y/o de reducción del apetito.
La composición puede comprender un mínimo de 50 % en peso del extracto de hierbaluisa (Lippia citriodora) y mínimo de 25 % en peso del extracto de rosella {Hibiscus sabdariffá).
Preferiblemente la composición comprende alrededor de un 65 % en peso del extracto de hierbaluisa (Lippia citriodora) y alrededor de un 35 % en peso del extracto de rosella {Hibiscus sabdariffá).
Este porcentaje de ambos extractos produce que la composición tenga un efecto mayor sobre la activación del metabolismo de las grasas mediado por una mayor activación de AMPK en comparación con una composición donde los extractos están mezclados a partes iguales.
La composición puede ser administrada en una dosis de 250 a 1000 miligramos al día. Preferiblemente la composición se administra en una dosis de 500 mg al día.
Estas dosis aseguran un efecto sobre los péptidos relacionados con el apetito y segregados por el tracto digestivo y tejido adiposo del individuo, lo que se traduce en una reducción del apetito y/o aumento de la saciedad que se refleja en una disminución de la necesidad de ingesta de alimentos.
Un segundo aspecto de la invención aporta una composición para su uso en la reducción de peso de un individuo mediante una modificación en el metabolismo de lípidos mediada por una activación de los sensores energéticos de proteína quinasa activados por AMP (AMPK) del individuo que se traduce en una reducción del porcentaje de grasa corporal, caracterizada porque dicha composición comprende un extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas y un extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides.
Una composición que contiene ambos extractos mencionados anteriormente es enormemente efectiva en la reducción de peso de un individuo mediante un cambio o mejora en el metabolismo de los lípidos a través de la activación de los sensores energéticos de proteína quinasa activados por AMP (AMPK). Esta composición es muy útil en el tratamiento de la obesidad, al ser capaz de reducir la cantidad de tejido adiposo de un individuo y mejorar otros parámetros típicamente relacionados con la obesidad o el sobrepeso. AMPK es una quinasa de serina/treonina que juega un papel muy importante en el mantenimiento de la homeostasis celular. Su activación conlleva la activación de procesos catabólicos tales como la lipólisis y la oxidación de ácidos grasos y la inhibición de procesos anabólicos tales como la lipogénesis y la glucogénesis. Preferiblemente el extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas contiene alrededor de un 10 % en antocianinas.
Preferiblemente el extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides contiene alrededor de un 30 % de fenilpropanoides.
Estas concentraciones en antocianinas y fenilpropanoides garantizan que la composición utilizada no sea citotóxica.
Preferiblemente el extracto antocianinas comprende un extracto de rosella {Hibiscus sabdaríffá).
Preferiblemente el extracto fenilpropanoides comprende un extracto de hierbaluisa {Lippia citríodora). Se ha demostrado que las antocianinas de Rosella son particularmente efectivas en la reducción de la inflamación ligada al estrés metabólico por la inhibición de secreción de leptina y proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1 ), que son adipoquinas importantes que regulan la migración de macrófagos no residentes al tejido adiposo y la inflamación sistémica general. Los extractos polifenólicos de Rosella también previenen la esteatosis hepática en ratones hiperlipidémicos a través de la modulación de la expresión de los genes involucrados en la homeostasis de glucosa y lípidos. En ratones alimentados con una dieta alta en grasas, las antocianinas de Rosella atenúan el incremento de glucosa en sangre y el aumento aparente de la resistencia a la insulina, así como incrementan el ritmo respiratorio, que está íntimamente relacionado con el ritmo metabólico basal (BMR). En este mismo modelo animal también se observó una reducción en la expresión de genes lipogénicos, tales como la sintasa de ácidos grasos (FASN) y la proteína ligante del elemento regulador del sterol (Srebp-1 c), simultáneamente a una activación de AMPK hepático.
Se sabe que la activación de AMPK hepático induce la expresión del gen PPARGC1 A y mejora directamente su actividad mediante fosforilación, lo cual incrementa la biogénesis y la función mitocondrial. Esto implica que las antocianinas de Rosella actúan sobre la modulación del uso de grasa, mas probablemente por la inhibición de la lipogénesis y la activación de la lipolisis a nivel de la biogénesis mitocondrial. Todos estos procesos se parecen a una situación metabólica que refleja una elevada demanda energética celular, un gasto energético mejorado y un ritmo metabólico basal más elevado.
Por otra parte, los fenilpropanoides del extracto de hierbaluisa y su componente mayoritario el verbascósido mejora las alteraciones metabólicas inducidas por un elevado nivel de glucosa. Estos efectos son mediados por una regulación positiva transcripcional dependiente de PPARy de adiponectina y una potente activación de AMPK, una regulación positiva de PPAR- α expresada por mRNA y una regulación negativa de FASN. Los experimentos realizados en ratones indican una mejora en el metabolismo de las grasas (colesterol y triglicéridos), especialmente en la eliminación de triglicéridos.
Esto indica un efecto complementario hasta ahora desconocido de ambos extractos en el metabolismo de la grasa y en la activación de AMPK. Esto implica que una composición como la descrita anteriormente tiene un efecto inesperado y muy significativo en la reducción de peso de personas con obesidad u sobrepeso, como se explica en los ejemplos.
La composición puede comprender un mínimo de 50 % en peso del extracto de hierbaluisa (Lippia citríodora) y un mínimo de 25 % en peso del extracto de rosella {Hibiscus sabdariffa).
Preferiblemente la composición comprende alrededor de un 65 % en peso del extracto de hierbaluisa (Lippia citríodora) y alrededor de un 35 % en peso del extracto de rosella {Hibiscus sabdariffa). Este porcentaje de ambos extractos produce que la composición tenga un efecto mayor sobre la activación del metabolismo de las grasas mediado por una mayor activación de AMPK en comparación con una composición donde los extractos están mezclados a partes iguales.
La composición puede ser administrada en una dosis de 250 a 1000 miligramos al día.
Preferiblemente la composición se administra en una dosis de 500 mg al día.
Esta dosis asegura un efecto significativo sobre la activación de AMPK que se traduce en una activación del metabolismo de lípidos y en consecuencia en una reducción de porcentaje de grasa corporal. En una realización más en particular, la administración de la composición de la presente invención se selecciona de entre vía parenteral, transdermal, oral, tópica, intracolónica o vaginal.
En una realización más en particular, la composición de la presente invención se administra vía parenteral en combinación con vehículos líquidos inyectables convencionales, tales como agua o alcoholes adecuados. Los adyuvantes farmacéuticos convencionales para inyección, tales como agentes estabilizadores, agentes solubilizantes y tampones pueden incluirse en tales composiciones inyectables. En una realización más en particular, la composición de la presente invención se administra por vía intramuscular, por vía intraperitoneal o por vía intravenosa.
En una realización más en particular, la composición de la presente invención se administra por vía oral conteniendo uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente compatibles, en forma sólida o líquida. Estas composiciones pueden contener componentes convencionales tales como agentes de unión, cargas, lubricantes y agentes humectantes fisiológicamente aceptables. Las composiciones pueden tomar cualquier forma apropiada, tales como comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas para chupar, disoluciones aceitosas o acuosas, suspensiones, emulsiones o en forma en polvo seco adecuada para la reconstitución con agua u otro medio líquido adecuado antes del uso, para la liberación inmediata o controlada.
En una realización más en particular de la presente invención, las formas orales líquidas para la administración también pueden contener determinados aditivos tales como edulcorantes, aromatizantes, conservantes y agentes emulsionantes. Las composiciones líquidas no acuosas para la administración oral pueden formularse también, conteniendo por ejemplo aceites comestibles. Tales composiciones líquidas pueden encapsularse de manera conveniente en, por ejemplo, cápsulas de gelatina en una cantidad de dosificación unitaria.
En una realización más en particular, la dosificación de la composición farmacéutica de la presente invención es diaria para seres humanos y animales y puede variar dependiendo de la edad, el peso o grado de enfermedad etc. La dosificación diaria para mamíferos, incluyendo a los seres humanos, oscila normalmente desde 250 miligramo hasta 1000 miligramos, preferiblemente a 500 mg de sustancia que va a administrarse durante una o varias ingestiones.
Un tercer aspecto de la invención aporta un método de producción de una composición que comprende un extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas y un extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides caracterizado porque comprende una extracción hidroalcoholica de hierbaluisa {Lippia citríodorá) y una extracción hidroalcoholica de rosella {Hibiscus sabdaríffá). Este método utiliza dos fuentes naturales ricas en los compuestos activos de la composición. La extracción hidroalcoholica de estas plantar permite obtener con un rendimiento notable y económicamente viable el contenido en activos requerido.
La extracción hidroalcoholica de hierbaluisa puede efectuarse usando una disolución de alcohol en agua con un contenido en alcohol mayor del 70 % y hasta el 100% en volumen de etanol durante dos horas a una temperatura entre 40 y 80 °C.
Preferiblemente la disolución de etanol en agua contiene alrededor del 70 % en volumen de alcohol.
Esta composición del agente de extracción y las condiciones de extracción maximizan la obtención de los compuestos fenilpropanóicos, en particular el verbascosido de las hojas de hierbaluisa en condiciones económicamente viables sin tener que destilar un exceso de alcohol o agua.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 . Gráfico que representa el porcentaje de acumulación de triglicéridos en adipocitos resistentes a la insulina hipertróficos.
Figura 2. Gráfico que representa el porcentaje de activación de AMPK en adipocitos resistentes a la insulina hipertróficos tratados con diferentes concentraciones de extractos de rosella y hierbaluisa.
Figura 3. Gráfico que representa el porcentaje de activación de AMPK en adipocitos resistentes a la insulina hipertróficos tratados con diferentes concentraciones de composiciones mezcla de extractos de rosella y hierbaluisa, en dos proporciones distintas.
Figura 4. Gráficos que muestran los niveles de colesterol total, colesterol LDL (malo) y colesterol HDL (bueno) en sangre de ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella en proporción 65:35 en peso respectivamente, y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal.
Figura 5. Gráfico y tabla que representan la ratio de eficiencia de la comida en ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal. Figura 6. Gráfico que representa el nivel de glucosa en sangre de ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal.
Figura 7. Gráfico que representa el nivel de leptina en sangre de ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal.
Figura 8. Gráfico que representa el nivel de leptina en el tejido adiposo de ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal.
Figura 9. Gráfico que representa el peso de grasa corporal de ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal.
Figuras 10a, 10b, 10c y 10d. Gráficos que representan marcadores metabólicos del tejido adiposo abdominal y del hígado de ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal.
Figura 1 1 . Gráfico que representa el análisis Western Blot para determinar la cantidad de proteína en el tejido adiposo de ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con los extractos de hierbaluisa y rosella, por separado, y con dos dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella y de ratones alimentados con una dieta alta en grasa no tratados y de ratones alimentados con una dieta normal.
Figura 12. Gráficos que representan los genes correspondientes a los marcadores metabólicos de adipocitos humanos inmortalizados, no diferenciados (ND) y diferenciados (MDI), cultivados in vitro tratados con dosis diferentes de los extractos de hierbaluisa (LV) y rosella (HS), por separado, y con dosis diferentes de una mezcla de extractos de hierbaluisa y rosella. Figura 13. Gráficos que muestran la disminución en el contenido de lípidos de los adipocitos hipertróficos tratados con la composición con extractos de rosella y hierbaluisa y el aumento paralelo de la activación de AMPK en dichos adipocitos. Figura 14. Esquema del método de producción de un extracto de hierbaluisa.
Figura 15. Esquema del método de producción de la composición de acuerdo con un aspecto de esta invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y EJEMPLOS.
EJEMPLO 1. Determinación de la proporción de extractos de hierbaluisa y rosella. Se cultivaron preadipocitos 3T3-L1 en placas de 96 pocilios y en medio de cultivo completo (DMEM con glucosa baja a 1 g/L) y piruvato de sodio, enriquecido con glutamina y suplementado con suero bovino al 10 % y antibiótico (100 μg/mL de estreptomicina y 100 U/mL de penicilina). La diferenciación de los adipocitos fue inducida añadiendo agentes adipogénicos (0,5 mM IBMX, 1 μΜ DEX y 1 μΜ de insulina) al medio de cultivo durante dos días. El medio se cambió por medio fresco cada 48 horas.
El cambio fenotípico de los adipocitos de observó con un microscopio. En todos los experimentos, más de un 90 % de las células eran adipocitos maduros tras 8 -10 días de incubación. Para inducir la hipertrofia celular, los adipocitos fueron expuestos a un medio alto en glucosa (25 mM).
Los cultivos celulares fueron llevados a cabo en condiciones estériles usando una campana de flujo laminar de aire para cultivos celulares y un incubador a 37 °C con una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
Se estudió el efecto de los extractos y el de la composición con ambos extractos sobre la acumulación de triglicéridos y la activación citoplásmica de AMPK en adipocitos 3T3-L1 . Los extractos se añadieron después de que los adipocitos se habían diferenciado hasta que las placas fueron analizadas. Los extractos fueron previamente preparados con el medio de cultivo y filtrados con un filtro de 0,2 um para esterilizarlos. Los adipocitos hipertróficos con 29 días de diferenciación fueron expuestos a extractos de rosella (-10 % en peso antocianinas) y a extractos de hierbaluisa (-30 % en peso fenilpropanoides) por separado y a mezclas de 50:50 en peso y de 35:65 en peso. Los extractos fueron añadidos el dia 24 tras la diferenciación de los adipocitos y fueron incubados a 50, 200 y 500 μg/mL durante 5 días.
Después de estos cinco días, se evaluó el contenido en lípidos de los adipocitos con el reactivo comercial AdipoRed™ y usando el lector de microplacas multi-modal con captura de imágenes celulares Cytation 3 de BioTek con una longitud de onda de excitación de 485 nm y de emisión de 572 nm. La ausencia de citotoxicidad fue evaluada mediante el método del cristal violeta. Los resultados se muestran en la Figura 1 , mediante una gráfica representando el porcentaje de acumulación de triglicéridos en adipocitos resistentes a la insulina hipertróficos. HS representa los adipocitos tratados con extracto de rosella con un 10 % de antocianinas, LV representa los adipocitos tratados con extracto de hierbaluisa con un 30 % de fenilpropanoides, HS-LV (1 :1 ) representa los adipocitos tratados con una mezcla de los extractos de hierbaluisa y rosella en proporción uno a uno en peso y HS-LV (35:65) representa los adipocitos tratados con una mezcla de los extractos de hierbaluisa y rosella en proporción 65 a 35 en peso, respectivamente. Los valores de p son: *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001 .
Los niveles de AMPK y de AMPK fosforilado (activado) fueron determinados mediante un experimento de inmunofluorescencia cuantitativa usando los anticuerpos de AMPK y AMPK fosforilado. Además, los núcleos fueron marcados con el reactivo Hoechst 33342. Una vez que las células fueron marcadas, la fluorescencia del AMPK fue cuantificada con una longitud de onda de excitación de 490 nm y de emisión de 520 nm, la del AMPK fosforilado con una longitud de onda de excitación de 593 nm y de emisión de 614 nm y la de los núcleos con una longitud de onda de excitación de 350 nm y de emisión de 461 nm, usando el lector de microplacas multi-modal.
Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3 que muestran gráficos que representan porcentajes de activación de AMPK en adipocitos resistentes a la insulina hipertróficos tratados con diferentes dosis de los extractos de rosella y hierbaluisa por separado y en combinación en dos proporciones distintas. Se puede observar que la mayor activación de AMPK se produce con la mayor dosis de la composición que contiene los dos extractos en una proporción de 35 a 65 en peso de extracto de rosella a extracto de hierbaluisa, respectivamente. Los valores de p son: *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001 , que indican diferencias estadísticamente significativas con los adipocitos de control (adipocitos no tratados). Las leyendas tienen el mismo significado que en la Figura 1 .
EJEMPLO 2. Evaluación de la reducción en grasa, hiperlipemia, hiperglicemia y adipogenesis en ratones obesos tratados con una composición que contiene extractos de hierbaluisa y rosella.
Los experimentos in vivo se realizaron en ratones normales a los que se les dieron una dieta alta en grasas (High Fat Diet, HFD) durante 8 semanas. Se analizaron los niveles de colesterol total en sangre, así como de HDL (colesterol bueno o lipoproteína de alta densidad) y LDL (colesterol malo o lipoproteína de baja densidad).
Los resultados se muestran en la Figura 4 en donde C57bl/6-Nr corresponde a ratones con dieta normal, HFD-CTL a ratones con dieta alta en grasa (HFD), HFD- LV a ratones con dieta alta en grasa y tomando extracto de hierbaluisa con -30% en peso de fenilpropanoides, HFD-HS a ratones con dieta alta en grasa y tomando extracto de rosella con -10% en peso de antocianinas , y HFD-MetA a ratones tomando la composición con ambos extractos en proporción 65:35, respectivamente. Los resultados demuestran que los ratones tomando la composición con ambos extractos tenían niveles más bajos de colesterol total, coincidiendo con una bajada de LDL y una subida de HDL. Estos valores eran más bajos que con los extractos ingeridos por separado (* p<0,05, ** p < 0,01 con respecto al control HFD-CTL).
Se analizó la cantidad de comida que los ratones tomaban al día, con respecto al peso del animal. Este valor se conoce como el cociente de eficiencia de comida (Food Efficiency Ratio). Una cantidad más baja implica una ingesta menor de comida con respecto a su peso. Los resultados se pueden observar en la Figura 5. (* p<0,01 con respecto al control HFD-CTL)
También se analizó el nivel de glucosa en sangre, ya que los ratones con dieta alta en grasa son hiperglucémicos. Como se puede ver en la Figura 6 (* p<0,05 con respecto al control HFD-CTL), los ratones que tomaban la concentración más alta de la composición con ambos extractos eran los únicos con una reducción importante de glucosa en sangre, cerca de los niveles de ratones con dieta normal.
Se analizaron los niveles de la hormona leptina en los ratones tomando una dieta alta en grasa. Concretamente, se analizaron los niveles de dichas hormonas en sangre, como se puede ver en la Figura 7 (*p<0,05, **p<0,01 con respecto al HFD- CTL).
Comparando el control con dieta normal (C57bl/6J Nr) con respecto al que está tomando una dieta alta en grasa (HFD-CTL), podemos comprobar que la leptina tiene una expresión significativamente mayor en el caso de la dieta alta en grasa. La leptina induce la saciedad, sin embargo, se sabe que los receptores de membrana de dicha hormona tienen una resistencia elevada en individuos obesos, y requieren de niveles altos de leptina para que se estimulen y por tanto activen la cascada de señales que induzcan la saciedad. Como consecuencia, detectar niveles elevados de leptina en los ratones con dieta alta en grasa, y consiguientemente obesos, confirma dicha resistencia a la hormona.
La toma de cualquiera de los extractos o mezclas probadas (hierbaluisa, rosella, combinación o mezcla) disminuye la expresión de leptina en sangre, aunque solo en el caso de la composición con ambos extractos podemos ver unos valores similares a los detectados en ratones con dieta normal, es decir, no obesos. Por tanto, la toma de esta composición es capaz de revertir esta sobreexpresión de leptina, ya que anula la resistencia a dicha hormona, permitiendo de esta forma que los ratones tengan niveles de saciedad parecidos a las normales.
Este dato coincide con los resultados observados con el FER (Food Efficiency Ratio), donde los ratones que tomaron la composición con ambos extractos ingerían menos cantidad de alimento con respecto a su peso. Un resultado similar se puede observar en la Figura 8 en cuanto a la expresión de leptina en el tejido adiposo, donde se puede comprobar que solo en los ratones que tomaban la composición con ambos extractos disminuían su expresión de leptina en el tejido adiposo (*p<0,05 vs HFD-CTL), llegando a los niveles observados en los ratones con dieta normal. Esto es debido a una posible sensibilización de los receptores de leptina en los ratones que tomaban la composición con ambos extractos, de forma que una menor concentración de leptina en sangre es suficiente para producir la sensación de saciedad.
Se ha estudiado el efecto de los extractos de hierbaluisa y de rosella por separado y combinados en la composición objeto de la invención en el metabolismo del tejido adiposo. En primer lugar, se comprobó la cantidad de tejido adiposo que tenían los ratones, aislando y pesando la grasa del abdomen, epidídimo, riñon e intestino.
Como se puede apreciar en la Figura 9, solo los ratones que tomaban la composición con ambos extractos presentaban significativamente menos cantidad de grasa, en el caso del abdominal, epididimal, e intestino (*p<0,05, **p<0,01 ). Estos valores concuerdan con los resultados comentados anteriormente, es decir, que los ratones toman menos alimento, mediante la regulación de la saciedad, que resulta en la disminución de peso mediante pérdida de tejido adiposo.
Además del peso, se estudiaron marcadores metabólicos en el tejido adiposo abdominal y el hígado (debido a en el caso de sobrepeso/obesidad hay una acumulación anómala de tejido adiposo en el hígado, denominado "hígado graso") relacionados con la regulación de la acumulación o producción de triglicéridos y ácidos grasos. Los marcadores analizados, mediante RT-PCR, fueron PPARy, SREBP1 c (ADD1 ), C/ΕΒΡα y AMPK.
PPARy es un receptor de membrana nuclear que se encuentra en adipocitos, así como células del colon y macrófagos. En el caso del tejido adiposo, su función es en activar la lipogénesis y captación de lípidos. SREBPI c regula la homeostasis de los lípidos, y su activación induce a la síntesis de colesterol cuando éste sea bajo. C/ΕΒΡα es un factor de transcripción que regula tanto la adipogénesis como la función normal de adipocitos, y regula la expresión de PPARy. Finalmente, la AMPK (AMP quinasa) inhibe la captación de lípidos, síntesis de colesterol y lipogénesis, entre otras funciones, aunque para realizar su función la proteína debe estar fosforilada (p-AMPK).
Como se puede apreciar en los histogramas de las Figuras 10a a 10d, la expresión de PPARy y SREBPI c (ADD1 ) disminuye significativamente únicamente en los ratones que tomaron la composición con ambos extractos, estudiado tanto en el hígado como en el tejido adiposo abdominal (*p<0,05). En cuanto al C/EBPa, también se ve un efecto de disminución en su expresión con hierbaluisa y rosella, pero solo en el hígado, mientras que la composición con ambos extractos disminuía la expresión de este factor de transcripción en ambos tejidos analizados. En estos tres genes, la expresión resultante en los ratones tomando la composición con ambos extractos era similar a la obtenida en los ratones control que tomaban una dieta normal.
Por otro lado, la expresión transcripcional de AMPK se encontraba aumentada en los ratones tomando la composición con ambos extractos (en el hígado, los ratones tomando rosella también apreciaban un aumento de su expresión, pero no en el tejido adiposo).
Este resultado además se corroboró mediante un análisis Western Blot, que permite analizar la cantidad de proteína presente en el tejido adiposo y cuyos resultados se muestran en la Figura 1 1 . La leyenda se interpreta como: N ratones con dieta normal, CT ratones con dieta alta en grasa sin tratar, LV ratones con dieta alta engrasa tratados con extracto de hierbaluisa, HS ratones con dieta alta engrasa tratados con extracto de rosella, MA1 ratones con dieta alta engrasa tratados con mezcla 35:65 de extractos de rosella y hierbaluisa a una dosis de 50 mg/kg y MA2 ratones con dieta alta engrasa tratados con mezcla 35:65 de extractos de rosella y hierbaluisa a una dosis de 100 mg/kg.
La forma activa de la AMPK es cuando está fosforilada (p-AMPK). Como se puede ver en la figura, el tejido adiposo de los ratones tomando la composición con ambos extractos eran los que presentaban mayor concentración de p-AMPK en forma de proteína activa.
Por tanto, los ratones tomando una dieta alta en grasas durante 8 semanas (HFD- CTL) presentan una activación de genes implicados en la acumulación de grasa, lipogénesis, síntesis de triglicéridos y colesterol, y de adipogénesis, lo cual da lugar a un mayor contenido de grasa corporal, comparando con ratones control con una dieta normal (C57bl/6J Nr). Sin embargo, cuando estos ratones toman la composición con ambos extractos, se revierte la expresión de estos genes, hacia concentraciones parecidas a las observadas en ratones no obesos con dieta normal. Además, la activación de p-AMPK indica que aumenta el metabolismo de ácidos grasos, disminuyendo su almacenamiento a la vez que aumenta su degradación.
Estos resultados in vivo realizados en ratones se corroboraron con estudios in vitro empleando una línea celular de adipocitos humanos, donde se probaron distintas concentraciones de los diversos ingredientes y se cultivaron durante 10 días. Se analizaron los mismos genes que los estudiados en ratones para el metabolismo de ácidos grasos. Los resultados se muestran en la Figura 12. (ND: cultivos celulares sin diferenciar, MDI: cultivos celulares diferenciados, LV: hierba luisa, HB: rosella, MA: composición con ambos extractos, 125-1000: concentraciones de los ingredientes, expresados en Mg/ml).
En los casos de PPARy, SREBP1 c(ADD1 ), C/ΕΒΡα, se observa una disminución de su expresión en los tres casos estudiados con respecto a los adipocitos diferenciados (MDI), concretamente en la concentración de 1 mg/ml de hierbaluisa, de rosella, y tanto 0.5 como 1 mg/ml de la composición con ambos extractos. Por tanto, la composición con ambos extractos se puede emplear a concentraciones más bajas para inducir un efecto represor de dichos transcritos, comparado con los extractos de forma individual.
En cuanto a la AMPK, se puede observar un importante aumento de expresión en el caso de la composición con ambos extractos a 0.5 y 1 mg/ml, mientras que con los extractos por separado, no se aprecian diferencias significativas con respecto al cultivo celular diferenciado (MDI).
EJEMPLO 3. Reducción de apetito y/o incremento de la saciedad mediante cambios en péptidos segregados por el tubo digestivo y tejido adiposo inducidos por consumo de composición que contiene un extracto de hierbaluisa con un contenido de 30 % en peso de fenilpropanoides y un extracto de rosella con un contenido de 10 % en peso de antocianinas, en una proporción de 65 a 35 en peso.
Se seleccionaron 54 mujeres de edades comprendidas entre 30 y 75 años con un índice de masa corporal entre 25 a 35 kg/m2. El estudio es un ensayo de 8 semanas, aleatorio, doble ciego, con control placebo llevado a cabo en la Universidad Miguel Hernández de Elche en España. Tras el alistamiento, las voluntarias fueron aleatoriamente asignadas al grupo de control por placebo L2 (n=26) o al grupo experimental L1 (n=28).
Los miembros del grupo L1 (edad media 51 años) recibieron una dosis diaria de 500 mg de una composición que contiene extracto de hierbaluisa y extracto de rosella.
Los miembros del grupo L2 (edad media 51 años) recibieron una dosis diaria de 500 mg de celulosa microcristalina.
Las capsulas de placebo y de la composición de efecto saciante tenían el mismo tamaño, olor, color y peso. Los voluntarios tomaron una capsula 20 o 30 minutos antes del desayuno cada día durante dos meses.
Se requirió a las voluntarias seguir una dieta isocalórica equilibrada y caminar durante al menos 30 minutos al día.
El cumplimiento de estos requisitos fue monitorizado durante las visitas clínicas o por entrevistas telefónicas cada semana. Un total de 3 y 4 participantes fueron excluidas de los grupos L2 y L1 respectivamente.
Durante el estudio se monitorizaron varios parámetros. Se tomaron las medidas antropométricas al inicio del estudio, después de un mes y tras dos meses desde el inicio del estudio, que incluyen peso corporal, altura, medida de los pliegues cutáneos del tríceps, bíceps y abdominal y medida del perímetro del brazo y del abdomen. El perímetro del abdomen (AC) se midió en dos sitios diferentes: por delante a medio camino entre el abultamiento xifoideo del esternón y el ombligo y lateralmente a medio camino entre el final de la caja torácica y las crestas ilíacas (AC1 ) y a la altura del ombligo (AC2). El porcentaje de grasa corporal fue obtenido a partir de las medidas abdominales mediante la ecuación de Weltman. Además también se midió la tensión sistólica y diastólica y el ritmo cardiaco en reposo al inicio, tras un mes y tras dos meses de estudio. La escala visual análoga (test VAS) validada fue utilizada para registrar el hambre, la saciedad, el sentimiento de llenado, el consumo de comida prospectivo, deseo de comer algo graso, salado, dulce o no dulce y la apreciación del sabor de las comidas. El test VAS fue completado al inicio del estudio en reposo y tras 15, 20, 45 y 60 días de estudio. De forma complementaria a la evaluación subjetiva del estado de salud, las voluntarias rellenaron un cuestionario SF-36 al comienzo y al final del estudio. Finalmente, se obtuvieron muestras sanguíneas de la vena del antebrazo tras ayuno nocturno al principio, tras 30 y tras 60 días de estudio. El plasma fue procesado inmediatamente y las muestras se almacenaron a -80 grados Celsius. La tabla 1 muestra los parámetros antropométricos al inicio y durante el estudio. No se observan diferencias significativas al principio del estudio entre ambos grupos. Los resultados de la tabla 1 indican una mejora estadísticamente significativa de los parámetros antropométricos tras dos meses de estudio en el grupo (L1 ) que tomó la composición con extractos de hierbaluisa y rosella, especialmente se mejoraron el porcentaje de grasa corporal, el pliegue cutáneo del tríceps, el peso corporal y el perímetro de la cadera (AC2). Estas diferencias se pueden observar con más claridad en la tabla 1 a.
Figure imgf000016_0001
Tabla 1. Cambios en los parámetros antropométricos durante el estudio expresados en valores medios más/menos deviaciones estándar. El análisis estadístico intra- grupo fue determinado en cada periodo en comparación con los datos al inicio del estudio. La significatividad fue establecida a: *p<0,05, **p<0,01 , ***p<0,001 , ****p<0,0001 .
Figure imgf000017_0001
Tabla 1a. Diferencias entre los parámetros antropométricos durante el estudio con los valores iniciales en valores medios más/menos deviaciones estándar. El análisis estadístico intra-grupo fue determinado en cada periodo en comparación con los datos al inicio del estudio. La significatividad fue establecida a: *p<0,05, **p<0,01 , ***p<0,001 , ****p<0,0001 . De acuerdo con las puntuaciones mostradas en la tabla 2, el consumo de la composición con los extractos de hierbaluisa y rosella disminuye la sensación de hambre consistentemente a lo largo de los dos meses de estudio. La puntuación media de hambre disminuyó de 5.92 en el día 15 a 2.58 en el día 60 en el grupo L1 , mientras que en el grupo L2 incrementó de 6.18 en el día 15 a 6.41 en el día 60 en el grupo placebo. Una tendencia similar se observa en las puntuaciones de la pregunta 4.
La saciedad incrementó de un valor de 5.04 en el día 15 hasta un valor de 7.58 en el día 60 en el grupo L1 , mientras que ésta disminuyó desde un valor de 4.82 en el día 15 hasta un valor de 4.22 en el día 60 en el grupo de placebo L2. Una tendencia similar se observó en la puntuación de la pregunta 3. 15 dias 30 dias 45 dias 60 dias
Items Ll L2 Ll L2 Ll L2 Ll L2
1. Cuánta 5.92±2.48 6.18±2.36 4.00±2.34** 6.05±1.73 3.29±2.37**** 6.18±2.11 2.58±2.35**** 6.41±1.87 hambre
tienes?
2. Cómo de 5.04±2.07 4.82±1.89 5.92±2.02* 4.32±1.95 6.45±2.32** 4.63±1.50 7.58±1.72**** 4.22±1.38 saciado te
sientes?
3. Cómo de 4.65±1.94 4.45±1.76 5.76±1.80* 4.30±1.90 6.42±1.87**** 3.86±1.83 7.46±1.59**** 3.52±1.91 lleno te
sientes?
4. Cuánto 5.57±2.83 7.22±1.52 4.14+1.98**** 6.95±1.90 2.83±2.20**** 6.82±1.74 2.54Ü.90**** 7.33±1.90 piensas que
puedes
comer?
5. Te 2.04±2.23 2.45±2.70 5.65±2.55** 2.80±2.76 4.83±2.73*** 1.95±2.13 6.67±2.18**** 1.82±2.17 gustaría
comer algo
dulce?
6. Te 5.45±3.42 5.09±3.53 6.38±2.73**** 2.60±1.79 7.57±2.27**** 2.86±2.59 7.75+2.19**** 3.09±2.72 gustaría
comer algo
salado?
7. Te 2.70±2.25* 4.68±2.93 4.96±2.51 3.68±2.73 6.50±2.19**** 2.90±2.75 7.67Ü.40**** 2.71±2.47 gustaría
comer algo
no dulce?
8. Te 4.29±3.58** 8.07±2.52 6.87±3.18 5.60±3.58 8.13±2.71** 5.18±3.88 8.21±2.47** 5.14±3.48 gustaría *
comer algo
graso?
Tabla 2. Marcadores de las sensaciones relacionadas con el apetito en el grupo L1 (composición) y el grupo L2 (placebo) tras 15, 30, 45 y 60 días de estudio, expresados como valores medios más/menos la desviaciones estándar. Los datos expresan los marcadores de cada pregunta en comparación con el placebo. Las diferencias estadísticamente significativas fueron establecidas como: *p,0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 , ****p<0.0001 . La puntuación varía según el esquema siguiente:
1 . 0 "No tengo nada de hambre" - 10 "Nunca he tenido más hambre".
2. 0 "Estoy completamente vacía" - 10 "No puedo dar ni un bocado más"
3. 0 "No estoy llena de nada" - 10 "Estoy completamente llena"
4. 0 "Nada de nada" - 10 "Un montón"
5. 0 "Si, mucho" - 10 "No, en absoluto"
6. 0 "Si, mucho" - 10- "No, en absoluto"
7. 0 "Si, mucho" - 10- "No, en absoluto"
8. 0 "Si, mucho" - 10- "No, en absoluto"
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Tabla 3. Niveles de péptidos en sangre segregados por el tracto digestivo relacionados con el apetito y la saciedad determinados al inicio y al final del estudio (segundo mes), expresados como valores medios más/menos las desviaciones estándar. La significatividad se estableció para: *p<0,05.
Es necesario mencionar que algunos péptidos analizados (como el GLP-1 , PYY y ghrelina) son secretados tras la ingesta de alimentos. La ghrelina estimula el apetito, mientras que GLP-1 y PYY se secretan juntos para provocar la sensación de saciedad. Debido a que las muestras de sangre fueron tomadas en ayunas por la mañana, los niveles determinados de estos péptidos en particular, se corresponden con niveles básales. Inicialmente, los niveles básales de ambos grupos coinciden y no se aprecian diferencias significativas entre ambos. Los otros péptidos presentan diferencias significativas en el grupo L1 . En este contexto, la incretina GLP-1 aumentó significativamente en el grupo L1 mientras que disminuyó en el grupo L2 y la ghrelina aumentó en el grupo L2 y se mantuvo constante en el grupo L1 . Por lo tanto, los voluntarios del grupo L1 tenían menos apetito y más sensación de saciedad que los voluntarios del grupo L2.
Por otra parte, la leptina, que se sintetiza en el tejido adiposo y produce sensación de saciedad, disminuyó significativamente en el grupo L1 mientras que no se apreciaron cambios en el grupo L2. La resistina decreció significativamente en el grupo L1 mientras que no se observaron cambios en el grupo L2. El nivel elevado de leptina en sangre en el grupo L2 se explica por la resistencia creada en los receptores correspondientes a provocar saciedad en respuesta a la secreción de leptina, es como si los receptores correspondientes se hubieran insensibilizado, mientras que en el grupo L1 el nivel normal de leptina en sangre indica que los receptores correspondientes siguen con la misma sensibilidad o mayor al nivel de leptina.
En general, estos cambios en los niveles de hormonas (péptidos) se correlacionan positivamente con las puntuaciones de los cuestionarios sobre apetito y saciedad y con la evolución de los parámetros antropométricos mostrados anteriormente. EJEMPLO 4. Reducción de peso corporal mediante una modificación en el metabolismo de lípidos mediada por una activación de los sensores energéticos de proteína quinasa activados por AMP (AMPK).
La acumulación de triglicéridos y la activación de AMPK por los polifenoles fue evaluada mediante inmunofluorescencia con el modelo de adipocito 3T3-L1 resistente a la insulina hipertrófico. Por otra parte, se realizó un estudio clínico con voluntarios tomando un placebo o 500 mg al día de un suplemento dietético con extractos de hierbaluisa y rosella en proporción 65:35 respectivamente, doble ciego con control de placebo y aleatorio en el que participaron 56 voluntarios con sobrepeso durante dos meses. Se determinaron parámetros antropométricos y parámetros bioquímicos.
Los preadipocitos 3T3-L1 fueron cultivados en un medio bajo en glucosa (1 g/L) DMEM suplementado con 10 % de suero bovino (CS), 100 μg/mL de estreptomicina y 100 U/mL de penicilina y fueron incubados a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 y 95% de aire en volumen. La diferenciación a adipocitos fue inducida mediante cultivo en un medio alto en glucosa (4.5g/L) DMEM suplementado con 10% en suero fetal bovino (FBS), 1 μΜ de insulina, 1 μΜ de dexametasona (DEX) y 0.5 mM de 3 isobutil-1 -metilxantina (IBMX) durante 48 horas. Tras las 48 horas, las células se mantuvieron en un medio alto en glucosa con FBS e insulina, y el medio fue cambiado cada dos días, con lo que se obtuvieron adipocitos hipertrofiados tras 20 días de incubación. Una vez que los adipocitos hipertrofiados fueron obtenidos, las células fueron tratadas con extractos de hierbaluisa (~ 30 % en peso de fenilrpopanoides) y de rosella (-10 % en peso de antocianinas) enr porporción en peso de 65 a 36, a varias concentraciones durante 72 horas. Los extractos fueron disueltos en un medio y filtrados para ser esterilizados.
El contenido en lípidos de los adipocitos hipertróficos fue evaluado usando el reactivo AdipoRed™. Se eliminó el sobrenadante de las células y éstas fueron lavadas cuidadosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, se añadió AdipoRed™ y se dejó incubar las células durante 15 a temperatura ambiente. La acumulación de triglicéridos fue medida usando un lector de microplacas a 485 nm longitud de onda de excitación y a 572 nm de emisión.
Para el estudio de la activación de AMPK en adipocitos hipertrofiados, se cuantificó el AMPK fosforilado en Thr172 (pAMPK) con una ensayo de inmunofluorescencia. Las células fueron fijadas con un tampón de fijación, permeabilizadas con 0.3% de Tritón x-100 (Sigma-Aldrich, España) y bloqueadas con 4% de suero de cabra. Una vez hecho esto, las células fueron incubadas durante toda la noche a 4°C con AMPK anticuerpos monoclonales de ratón alpha 1 + alpha 2 (Abcam, Cambridge, UK) y con con fosfo-AMPK alpha 1 de conejo (Thr172; Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA). Tras la incubación con los anticuerpos primarios, las células fueron lavadas con PBS e incubadas durante 6 horas a temperatura ambiente con cada anticuerpo policlonal secundario correspondiente, IgG CF™ 594 de cabra anticonejo y FITC anti-ratón (ambos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). La fluorescencia de las células fue medida utilizando un lector de microplacas multi- modo con captura de imágenes celulares (Cytation 3, Biotek, España) a 593 nm de longitud de onda de excitación y 614 nm de emisión para medir los niveles de AMPK. La activación de AMPK se expresa como el cociente de los niveles de AMPK normalizado por AMPK total. Los resultados se muestran en la Figura 13 (*p<0,05, ***p<0,001 ).
El estudio con humanos duró ocho semanas, aleatorio, doble ciego y controlado por placebo. Los criterios de exclusión fueron un nivel de colesterol total menor de 200 mg/dL, la presencia de alguna patología relacionada con la obesidad, el uso de medicación para el colesterol o la hipertensión, el consumo de suplementos o productos farmacéuticos antioxidantes, adicción al alcohol y mujeres embarazadas o en lactancia. Basados en estos criterios se seleccionaron 55 mujeres sanas, de edades entre 36 a 69 años, con un índice de masa corporal de 25 a 34 kg/m2, que pasaron una selección y entrevista telefónica sobre su salud así como una evaluación bioquímica y antropométrica.
Una vez alistadas en el estudio, las voluntarias fueron asignadas aleatoriamente al grupo de placebo (n=26) o al grupo experimental (n=29). Durante el estudio se retiraron 9 voluntarias, 6 en el grupo de placebo y 3 en el grupo experimental, y un total de 46 voluntarias completó el estudio. El grupo de placebo (edad media 51 años) recibió dos cápsulas de placebo con 400 mg de celulosa microcristalina cada una y el grupo experimental (edad media 52) recibió dos capsulas que contenían cada una 250 mg de la composición con extractos de rosella y hierbaluisa y 150 mg de excipientes (celulosa microcristalina). Por lo tanto, el grupo experimental tomaba 500 mg/dia de la composición en estudio. Ambos tipos de cápsulas tenían el mismo tamaño, olor, color y peso. Los voluntarios tomaron dos capsulas cada día 20 o 30 minutos antes del desayuno durante dos meses. Durante la visita de selección, se recogió información demográfica y sobre estilo de vida (edad, dieta, pautas de ejercicio físico, consumo de alcohol y tabaco). Un médico pidió a las mujeres voluntarias seguir una dieta isocalórica con hidratación normal y caminar al menos 30 minutos al día. Se comprobó el cumplimiento de los requisitos del estudio en cada visita y por teléfono, cada semana, durante los dos meses de estudio. Las medidas de los parámetros se tomaron al inicio del estudio y tras 30 y 60 días de estudio.
Durante el estudio se monitorizaron varios parámetros. Se tomaron las medidas antropométricas al inicio del estudio, después de un mes y tras dos meses desde el inicio del estudio, que incluyen peso corporal, altura, medida de los pliegues cutáneos del tríceps, bíceps y abdominal y medida del perímetro del brazo y del abdomen. El perímetro del abdomen (AC) se midió en dos sitios diferentes: por delante a medio camino entre el abultamiento xifoideo del esternón y el ombligo y lateralmente a medio camino entre el final de la caja torácica y las crestas ilíacas (AC1 ) y a la altura del ombligo (AC2). El porcentaje de grasa corporal fue obtenido a partir de las medidas abdominales mediante la ecuación de Weltman.
Se tomaron muestras de sangre en ayunas para medir la glucosa total, la hemoglobina glucosilada y el perfil de lípidos, que incluye los triglicéridos, el colesterol total, el colesterol bueno (lipoproteína de alta densidad) o HDL y el colesterol malo (lipoproteína de baja densidad) o LDL. Las muestras de sangre fueron analizadas para medir parámetros de seguridad como la hematología, electrolitos, creatinina, urea, ácido úrico, transaminasa glutámica-pirúvica, transaminasa glutámica-oxaloacética y proteína C-reactiva.
Además también se midió la tensión sistólica y diastolica y el ritmo cardiaco en reposo al inicio, tras un mes y tras dos meses de estudio.
Grupo experimental (N= 26) Grupo placebo (N= 20)
Inicio Mes 1 Mes Inicio Mes 1 Mes 2
Parámetros
Antropométricos
Peso Corporal 75.12± 72.761 71.081 75.16111.34 73.361 73.12111.47**
13.62 13.51*** 13.34*** 11.24***
índice de Grasa 29.201 28.261 27.591 30.2314.41 29.521 29.4314.58**
Corporal 4.76 4.63*** 444*** 442***
AC1 (cm) 90.871 86.591 84.391 90.93113.12 89.211 88.50111.65**
10.81 951*** 991*** 12.83***
AC2 (cm) 100.52 97.101 94.711 102.32111.59 99.871 97.05110.66***
19.10 8.20*** g 11.96**
Grosor pliege 28.361 26.081 24.671 30.1315.24 28.451 27.8814.69*** tríceps 7.57 6.95*** 742*** 4.75**
% Grasa Corporal 44.361 43.531 43.041 44.6712.82 44.181 43.9512.73***
2.86 2.73*** 2.64*** 2.83***
Constantes vitales
Ritmo cardiaco
(pul. por minuto) 79.431 74.361 711 75.7518.62 75.151 75.50111.61
9.84 9.03*** 4o*** 11.86
128.701 118.431 109.961 126.65119.06 120.70117.50 118.05115.64*
Tensión sistólica 12.74 13.91*** 909***
77.621 72.761 67.051 78.30113.12 76.1018.16 71.10111.61*
Tensión diastolica 10.99 10.54* 9.30***
Parámetros
bioquímicos
93.33116.10 90.44114.11 90.061 93.95112.96 94.05111.14 92.63114.95
Glucosa mg/dl 13.31
84.83152.61 76.28135.22 83.171 85.63142.37 78.53127.95 88.74139.23
Trigliceridos mg/dl 39.39
237.781 215.221 207.941 229.11126.13 205.531 207.53128.62 **
Colesterol total 26.51 26.90*** 25.11 *** 24.84***
60.5917.24 59.2317.15 58.951 59.0017.54 56.9519.02* 57.1118.58 *
HDL mg/dl 8.52
158.521 140.901 127.431 153.68124.88 132.891 132.95125.39 ***
LDL mg/dl 25.17 23.39*** 20.83 *** 23.18***
0.7510.11 0.8510.14 0.811 0.8010.14 0.9110.18 0.8210.12
Creatinina mg/dl 0.12
33.3617.96 32.0918.52 32.321 32.21110.54 32.3717.77 31.5817.44
Urea mg/dl 9.15
4.6611.01 4.2911.09 4.551 4.9711.53 4.2911.03 4.4810.96
Ácido úrico mg/dl 1.18
22.5917.39 21.5919.53 2118.83 21.2116.82 21.6119.62 20.0518.44
GPTU/I
21.0015.07 21.5915.66 21.271 21.1114.53 21.1115.51 20.2115.02
GOT U/1 6.85
Tabla 4. Medidas antropométricas, iniciales y tras uno y dos meses de estudio. Los valores estadísticos intra-grupo al final del estudio comparados con los valores iniciales son: * p < 0,05; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001 ; **** p < 0,0001 . Los datos son expresados como valores medios ± DS.
Según se puede observar en la Figura 13, la composición con extractos de hierbaluisa y rosella causa un potente incremento en el cociente de pAMPK/AMPK de una forma dependiente de la dosis administrada que es estadísticamente significativo en comparación con el incremento observado en el experimento de control a una dosis de 350 μg/mL, mientras que a una dosis de 500 μg/mL se observa un incremento de 1 .5 aproximadamente. Los parámetros antropométricos de ambos grupos no presentan diferencias apreciables al inicio del estudio. Los resultados del estudio muestran una mejora significativa en el grupo experimental en comparación con el grupo de placebo, tras dos meses de estudio, particularmente en el peso corporal, la circunferencia abdominal y el porcentaje de grasa corporal (ver tabla 4).
El grupo experimental mostró una mayor reducción en peso corporal que el grupo de placebo que es estadísticamente significativa con una p<0.01 . Ambos perímetros abdominales AC1 y AC2 se redujeron tras los dos meses de estudio, pero solo el perímetro abdominal más elevado mostró diferencias estadísticamente significativas con el grupo de placebo tras uno y dos meses de estudio. En consonancia con estos datos, el porcentaje de grasa corporal redujo en ambos grupos, pero en el grupo experimental se redujo significativamente más que en el grupo de placebo tras los dos meses de estudio, p<0.01 . También se observaron diferencias estadísticamente significativas en las medidas de pliegues cutáneos del tríceps (p<0.05) y en el índice de masa corporal (p<0.01 ).
EJEMPLO 5. Método de producción de una composición con extractos de hierbaluisa y rosella de acuerdo con un aspecto de la invención.
La composición con extractos de hierbaluisa y rosella se trata de una mezcla de dos extractos con una composición de compuestos activos muy específica, es decir, al menos 10% en peso de antocianinas en el extracto de rosella y al menos 30 % en peso de fenilpropanoides en el extracto de hierbaluisa, que mezclados en una relación en peso de 35 a 65, respectivamente, ofrecen actividad sinérgica, especialmente para el control de la saciedad.
El proceso de fabricación del extracto de hierbaluisa comprende una extracción hidroalcohólica empleando concentraciones de alcohol (etanol, metanol, propanol, isopropanol o butanol) superiores al 70 y hasta el 100 % en volumen en agua (Figura 14).
Las hojas de hierbaluisa {Lippia citriodorá) se analizan para determinar la cantidad de verbascósido utilizando cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Se extraen aproximadamente 330 g de hojas de hierbaluisa en 4 litros de etanol diluido en agua desmineralizada (superior al 70 % y hasta el 100% de etanol en volumen) manteniendo agitación del líquido en el recipiente, recirculando el disolvente evaporado o percolándolo en filtro nutcha a una temperatura de 40 a 80 °C durante 2 horas. Al cabo de las dos horas, la disolución se filtra para separar las hojas y otras partículas. La disolución filtrada se destila a vacío a una temperatura de 60 a 80 °C para obtener una disolución acuosa concentrada que contiene de un 15 a 30 % en sólidos. Esta disolución concentrada es secada por atomización (spray-dried) a una temperatura de 70-90 °C para obtener un extracto seco en polvo que contiene no menos de 30 % en peso de fenilpropanoides en total. El rendimiento es de 19 a 21 % en peso.
Para producir el extracto de rosella se seleccionan las flores de la planta y se analizan para obtener el contenido en antocianinas mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y detección con luz ultravioleta. Se toman 320 gramos de flores y se extraen con 3.2 litros de etanol diluido en agua desmineralizada al 50 % en volumen, manteniendo la agitación del líquido en el reactor, y recirculando el disolvente evaporado o percolando en filtro nucha a una temperatura entre 40 y 60 °C durante 2 horas. Tras las dos horas de extracción, la disolución se filtra con un filtro de poro de 0.5 micrones para separar las flores. La disolución filtrada se destila a vacío a una temperatura entre 50 y 70 °C y el concentrado obtenido se diluye hasta obtener 620 litros.
El producto es sometido a una etapa de purificación por cromatografía en una resina polimérica de adsorción/desorción adecuada para polifenoles. El eluato constituye el extracto purificado en forma líquida. El líquido purificado se concentra hasta un contenido de 30 a 50 % en peso de sólidos. La disolución concentrada se seca por atomización (spray-drying) a una temperatura entre 70 y 80 °C para obtener un extracto seco en polvo que contiene no menos de 10 % de antocianinas. El rendimiento es de 5 a 7 % en peso.
Tras la producción de los extractos de hierba luisa y rosella por separado, ambos son tamizados y mezclados y pasan por un sistema de detección de metales antes de ser envasado, como se muestra en el esquema de la Figura 15.

Claims

REIVINDICACIONES
Composición para su uso en la modulación de la ingesta de alimentos de un individuo mediante reducción del apetito y/o aumento de la saciedad a través de una modificación de los niveles de péptidos relacionados con el apetito, caracterizada porque dicha composición comprende un extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas y un extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides en la que el extracto con antocianinas comprende un mínimo de 25 % en peso de extracto de rosella {Hibiscus sabdaríffá) y en la que el extracto con fenilpropanoides comprende un mínimo de 50% en peso de extracto de hierbaluisa {Lippia citriodora).
Composición según la reivindicación 1 en la que el extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas comprende un extracto con alrededor de un 10 % en peso de antocianinas.
Composición según la reivindicación 1 o 2 en la que el extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides comprende un extracto con alrededor de un 30 % de fenilpropanoides.
Composición según cualquiera de las reivindicaciones anterioresl en la que la composición comprende alrededor de 65% en peso del extracto de hierbaluisa (Lippia citriodora) y alrededor de 35 % en peso del extracto de rosella {Hibiscus sabdaríffá)
Composición según la reivindicación 4 administrada en una dosis de 250 a 1000 mg diarios.
Composición según la reivindicación 5 en la que la dosis administrada es de 500 miligramos diarios.
Composición para su uso en la reducción de peso de un individuo mediante una modificación en el metabolismo de lípidos mediada por una activación de los sensores energéticos de proteína quinasa activados por AMP (AMPK) del individuo que se traduce en una reducción del porcentaje de grasa corporal, caracterizada porque dicha composición comprende un extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas y un extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides en la que el extracto con antocianinas comprende un mínimo de 25 % en peso de extracto de rosella {Hibiscus sabdaríffá) y en la que el extracto con fenilpropanoides comprende un mínimo de 50% en peso de extracto de hierbaluisa {Lippia citriodora).
Composición según la reivindicación 7 en la que el extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas comprende un extracto con alrededor de un 10 % en peso de antocianinas.
9. Composición según la reivindicación 7 u 8 en la que el extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides comprende un extracto con alrededor de un 30 % de fenilpropanoides. 10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que la composición comprende alrededor de 65% en peso del extracto de hierbaluisa (Lippia citríodora) y alrededor de 35 % en peso del extracto de rosella {Hibiscus sabdariffa) 1 1 . Composición según la reivindicación 10 administrada en una dosis de 250 a 1000 mg diarios.
12. Composición según la reivindicación 1 1 en la que la dosis administrada es de 500 miligramos diarios.
13. Método de producción de una composición que comprende un extracto con al menos un 5 % en peso de antocianinas y un extracto con al menos un 15 % en peso de fenilpropanoides caracterizado porque comprende una extracción hidroalcohólica de hierbaluisa {Lippia citríodora) y una extracción hidroalcohólica de rosella {Hibiscus sabdariffa) en el que la extracción hidroalcohólica de hierbaluisa se efectúa usando una disolución de alcohol en agua con un contenido de alcohol superior al 70% y hasta el 100% en volumen durante dos horas a una temperatura entre 40 y 80 °C 14. Método según la reivindicación 13 en el que el contenido en alcohol es
alrededor del 70 % en volumen.
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