WO2019053316A1 - Cepa de saccharomyces cerevisiae y su uso para la elaboración de productos alcohólicos - Google Patents

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alcoholic
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fermentation
saccharomyces cerevisiae
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Miguel VILLENA REYES
Manuel Aguado Ramos
Yolanda NÚÑEZ GUTIÉRREZ
Elena MAGANTO BURGOS
Daniel HERNÁNDEZ MATEO
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Tomsa Destil, S.L.
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Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of alcoholic fermentations, such as wine making, beer, alcohol, etc., for human consumption. More specifically, the present invention relates to a new yeast strain of the species Saccharomyces cerevisiae, osmoethanoltolerant, and to its use to produce ethanol or to produce alcoholic products. Also, the described strain has utility for the production of biomass.
  • Osmotic stress has a remarkable influence on the cellular physiology of the strains of Saccharomyces cerevisiae, which is manifested in the dynamics of changes in the cell wall, in the alteration of ion homeostasis, in metabolic adjustments, in cell cycle arrest , as well as a very remarkable effect on gene expression. Therefore, osmotic stress is a factor that negatively affects both cell proliferation and the fermenting capacity of the strains of Saccharomyces cerevisiae and ultimately to the production of alcohol at the industrial level.
  • the authors of the present invention have obtained a new hybrid strain of yeast of the Saccharomyces cerevisiae species by means of the protoplast fusion technique from the highly osmotolerant strain S. cerevisiae NCYC73 and from another strain S. Cerevisiae
  • chromosome exchange takes place, especially of chromosomes of lower molecular weight, which results in a new strain of yeast in which characteristics and capacities of both parental strains coexist.
  • the strain obtained by the authors has a high osmo-ethanol-tolerant capacity and a capacity to produce 16 ° GL or more.
  • the main aspect of the invention is an osmo-ethanol-tolerant strain of yeast of the species Saccharomyces cerevisiae, (strain of the invention), which was deposited on July 4, 2017 in the Spanish Type Culture Collection (CECT) (Burjassot, Valencia, Spain ) and to which the access number CECT 13152 was assigned.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • the invention relates to the use of the strain of the invention for the production of ethanol or alcohol products by fermentation using different substrates.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the yeast for the production of biomass.
  • a final aspect of the invention relates to a microbiological composition
  • a microbiological composition comprising a strain of the invention and optionally at least one additional element that favors the production of alcohols or alcoholic products.
  • Figure 1 shows a scheme of cell wall removal in the parental yeast strains.
  • Figure 2 representation of the fusion of the protoplasts of the parental cells, the protoplast A being a highly osmotolerant yeast and the protoplast B a yeast used in industrial fermentation.
  • Figure 3 A schematic of the production of the strain of the invention is shown by the protoplast fusion technique involving the sequence of the enzyme treatment of parental yeasts, induction of protoplast fusion, incubation of new hybrids and selection in specific media.
  • the present invention relates in its main aspect to a strain of the species Saccharomyces cerevisiae deposited in the Spanish Collection of Type Cultures (CECT) with the access number CECT 13152.
  • This strain has the main characteristic that is highly osmoetanoltolerant, which makes it especially suitable for the production of ethanol by alcoholic fermentation from different substrates, as well as for the production of alcoholic products such as alcoholic beverages (wine, beer, cava or cider).
  • the strain of the present invention is capable of producing ethanol or alcohol products by fermentation at 16 0 GL or higher.
  • the strain of the invention has been obtained by the technique of fusion of protoplasts that allows the genetic exchange of the parental cells through a previous stage of digestion of their cell walls and a subsequent membrane fusion.
  • Figures 1 and 2 show a graphic representation of both stages.
  • the strain of the invention is a hybrid strain resulting from the fusion of a highly osmotolerant strain of S.cerevisiae, the strain NCYC73 and another strain of S.cerevisiae used in industrial fermentation.
  • the obtained strain possesses characteristics and capacities of both parental strains and in particular shows a high osmoethanol tolerance.
  • the strain of the invention can be transported in liquid, fresh paste, dry active or dry instant format.
  • the strain of the invention has an ovoid morphology and a matt beige color.
  • the observed metabolic characteristics are similar to those of other industrial strains of S. cerevisiae and in particular of the parental strains from which it comes. Rapid growth and rapid metabolization of fermentable sugars, as well as high
  • the osmo ethanol tolerance of the strain of the invention makes it especially suitable for industrial use and particularly in the production of bioethanol or in the production of alcoholic beverages.
  • Another aspect of the invention relates to the use or application of the strain of the invention.
  • the strain of the invention is useful in the production of ethanol or the production of alcoholic products by fermentation.
  • the strain of the invention is useful for the production of bioethanol from vegetable waste and lignocellulosic residues.
  • Vegetable residues or lignocellulosic residues may be the biodegradable fraction of products, residues and traces of origin from agriculture such as crop residues, rich in fermentable sugars, such as sugarcane; starch biomass, for example, grains or wheat straw; or corn or corn straw or corn grain or corn fiber; or grains or barley straw; or grains or sorghum straw, rice, grass, branches, etc.
  • Vegetable residues and lignocellulosic waste can also come from forest industries such as lumber.
  • the strain of the invention is especially suitable for the production of alcoholic beverages and, more particularly, of beverages such as wine, beer, cava, cider or distilled beverages.
  • strain of the invention makes it possible to obtain by alcoholic fermentation ethanol or alcoholic products at 16 0 GL or higher.
  • strain of the invention is for the baking or production of bread or pastry and confectionery products.
  • strain of the invention is for the production of biomass as a means to transform low-value-added fermentable vegetable or animal waste (lactoses) into biomass with a high protein value.
  • the biomass obtained has application as a source of animal feed, in particular of livestock.
  • a final aspect of the invention relates to a microbiological composition comprising the strain of the invention and, optionally, at least one additional element that favors the production of alcohols or alcoholic products and / or the fermentation process.
  • composition may be presented in a diluted, cream, pressed, dried or lyophilized aqueous composition format.
  • Example 1 Obtaining the mutant Saccharomyces cerevisiae of the invention (CECT 13152).
  • the parental strains were grown on glycerol agar plates, to ensure that they breathed properly. As parental strains were used, on the one hand, strain NCYC73 of S.cerevisiae with a highly osmotolerant capacity and on the other hand, other strains of S.cerevisiae for industrial use.
  • the incubation time depends on the growth curve of the yeast, so that they were removed from the shaker when they finished the exponential phase and before entering the stationary phase.
  • the first thing to do is obtain a pellet of yeast cream.
  • Tris-EDTA pH between 6 and 9 previously prepared and autoclaved Tris-EDTA pH between 6 and 9 previously prepared and autoclaved was added in the following proportion: between 4 and 11 ml of Tris-EDTA buffer + 100 - 400 ⁇ of ⁇ -mercaptoethanol, stirring well.
  • the ⁇ -mercaptoethanol was incorporated into a 15 ml falcon containing between 4 and 11 ml of buffer.
  • the buffer had the appropriate molarity for the osmotolerance condition of the yeast that we are using.
  • a buffer with sorbitol between 0.2 and 1 M or KCI between 0.2 and 1 M was used.
  • the supernatant of the yeasts was removed after the last centrifugation. It was incorporated between 4 and 12 ml of pretreatment buffer already containing ⁇ -mercaptoethanol. It was stirred well, using a vortex and the mixture was introduced into the shaker between 30 ° and
  • a water test was performed based on the fragility of the cells without a wall against osmotic variations in the extracellular medium.
  • the yeast solution were introduced in 0.5 and 6 ml of milliQ water.
  • the solution was translucent it meant that the yeasts had not yet lost the wall, whereas when the solution was transparent, with small whitish lumps it implied that the yeasts had lost their wall, and when introduced into a hypotonic medium, they did not resist the change.
  • the molarity of the buffer it may be that the cells do not lose the wall correctly, that they undergo a modification in their shape, or in their size (due to loss or absorption of water). In these cases, the yeasts can not be used for the fusion. Osmotolerant yeasts take longer to lyse the cell wall.
  • yeasts were introduced again in the shaker and the test was repeated after 10 to 60 minutes. So until the cells broke down in water.
  • the cells were washed for fusion.
  • Tris-HCl wash buffer between 6 and 9 was used with sorbitol (at the molarity to which it corresponded).
  • sorbitol at the molarity to which it corresponded.
  • the amount of spheroplasts suspension of the first yeast that was calculated based on the population was introduced into an eppendorf. Then, it was centrifuged between 1000 and 7000 rpm for 1 and 50 seconds. Once this was done, the supernatant was removed and the amount of suspension of the second yeast was incorporated. It was centrifuged again between 1000 and 7000 rpm at the same time. The supernatant was removed again and between 0, 1 and 5 ml of the fusion solution was incorporated.
  • the PEG makes the solution very dense and it is difficult to aspirate it. It was resuspended and incubated in an oven between 27 and 40 ° C for 10 and 50 minutes.
  • the colonies grown in OSY medium were taken and seeded in YPD medium, and from there they were transferred to glycerol agar between 1 and 5%. In the YPD medium they were sown taking all the large colonies, forming 4 or 5 striae on the plate. From the glycerol agar a reserve tube was prepared using glycerol medium between 10 and 50%. Among the different strains isolated, the strain of the invention deposited with the access number CECT 13152 was selected.
  • Example 2 Growth kinetics of the mutant Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.
  • samples were inoculated with both parental strains and the new mutant strain CECT 13152 in YPD broth.
  • a material balance was made based on the nutritional requirements of the yeast formulating three media, based on agroindustrial waste, tubers, cereal hydrolysates and fruit waste.
  • the pH of the samples was regulated until reaching the range of 4.5-5.0. After mixing and homogenizing, the media was autoclaved at 121 ° C for 15 minutes.
  • Culture media were placed in 2L capacity glass balloons; the aeration mechanism was connected to this system through low power pumps together with diffuser stones, these were disinfected and introduced into the respective culture media. Finally, the harvested yeasts were inoculated. The systems were covered with cotton to avoid external contamination.
  • Example 3 In vitro evaluation of the ethanol production capacity and osmotolerance of the mutant Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.
  • a comparative test was carried out between the alcohol production capacity between a commercial Saccharomyces cerevisiae strain and the CECT 13152 strain under different conditions and different substrates.
  • the strain of the invention has a high osmotolerance to sugars and that it is able to grow and metabolize sugars at a high concentration of up to at least 28 g / 100ml.
  • the degree of distilled alcohol is substantially higher in the case of the CECT13152 strain than in the commercial strain under all the conditions tested, which shows that the strain is suitable for industrial use .
  • Table 2 also summarizes some of the parameters that demonstrate the greater fermentative capacity and production of alcohol of the strain of the invention:
  • Table 5 shows some of the parameters that demonstrate the greater fermentative capacity and production of alcohol of the strain of the invention:
  • Example 3 Fermentative capacity of the mutant Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.
  • the fermentative capacity of new mutant strain of Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 was determined by fermentation from amylaceous substrates obtained from tubers, cereal hydrolysates and fruit waste.
  • the starchy substrates used that is, the cereal, tubers and fruit waste were crushed and sieved with a diameter of approximately 1 mm and mixed with water at a ratio of 38:62 (substrate: water) (w / w).
  • Step 1 A total of 20% of the total dose of ⁇ -amylase (Liquozyme, 240 KNU / g) was added to each of the mixtures and incubated for a period of 45 minutes at 65 ° C constant stirring temperature. intense enough to keep the substrate suspended.
  • ⁇ -amylase Liquozyme, 240 KNU / g
  • Step 2 The remaining 80% of ⁇ -amylase (Liquozyme, 240 KNU / g) was added to the mixture and incubated for 30 minutes at a temperature of 85 ° C under constant stirring as in step 1.
  • the processed amylaceous compounds were introduced into the autoclave subjected to a temperature of 130 ° C for 3 minutes.
  • amyloglucosidase (Spirizyme Fuel) was added and incubated at 65 ° C, for 90 minutes, maintaining constant agitation, equal to that of previous stages.
  • Nutrients were added to the fermentation media in those cases where it was necessary.
  • b) Yeast and propagation conditions The mutant yeast Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 was used to carry out the fermentation. For this purpose, a propagation prior to fermentation was carried out. Yeast propagation was carried out in two stages: an initial stage in YPD and a second stage in a sugar substrate of the same nature as that used in fermentation, at a concentration of sugars between 7-8%. The propagation temperature was 34.5 ° C, agitation of 120 rpm and pH of 5. Depending on the type of substrate, the addition of salts and vitamins was necessary. The use of aeration during this second stage considerably increased the number of cells obtained per mL at the end of the process.
  • the fermentation was carried out at a constant temperature of 35 ° C. Regarding agitation, the assay was started without agitation, and the first hour was maintained. The second hour was programmed at 40 rpm. Finally, 85 rpm were set at the beginning of the third hour, and this was maintained until the end of the fermentation. The end of fermentation was defined at the moment in which the loss of CO2 between two consecutive weight measurements is zero, or when the 100 hours of fermentation are exceeded.

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Abstract

Cepa de Saccharomyces cerevisiaey su uso para la elaboración de productos alcohólicos. La presente invención se refiere a una nueva cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, osmoetanoltolerante, y a su uso para producir etanol o elaborar productos alcohólicos. Asimismo, la cepa descrita tiene utilidad para la producción de biomasa.

Description

CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y SU USO PARA LA ELABORACIÓN
DE PRODUCTOS ALCOHÓLICOS
DESCRIPCIÓN
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo técnico de las fermentaciones alcohólicas, tales como elaboración de vinos, cerveza, alcohol, etc, para consumo humano. Más concretamente, la presente invención se refiere a una nueva cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, osmoetanoltolerante, y a su uso para producir etanol o elaborar productos alcohólicos. Asimismo, la cepa descrita tiene utilidad para la producción de biomasa.
Antecedentes de la invención
El estrés osmótico tiene una notable influencia sobre la fisiología celular de las cepas de Saccharomyces cerevisiae, que se manifiesta en la dinámica de cambios de la pared celular, en la alteración de la homeostasis de iones, en ajustes metabólicos, en la detención de ciclo celular, así como un efecto muy notable sobre la expresión génica. Por tanto, el estrés osmótico es un factor que afecta negativamente tanto a la proliferación celular como a la capacidad fermentadora de las cepas de Saccharomyces cerevisiae y en última instancia a la producción de alcohol a nivel industrial.
Existe por tanto una necesidad constante de desarrollar nuevas cepas de Saccharomyces cerevisiae que presenten características mejoradas y en particular que presenten una alta osmoetanoltolerancia.
Algunas cepas de S. cerevisiae con características mejoradas ya se han descrito en la literatura como por ejemplo en ES2116922, ES2524704 o ES2406412.
Los autores de la presente invención han obtenido una nueva cepa híbrida de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae mediante la técnica de fusión de protoplastos a partir de la cepa altamente osmotolerante S. cerevisiae NCYC73 y de otra cepa S. cerevisiae. Mediante esta técnica se produce un intercambio cromosómico sobre todo de cromosomas de menor peso molecular, que da como resultado una nueva cepa de levadura en la que coexisten características y capacidades de ambas cepas parentales. De manera particular, la cepa obtenida por los autores presenta una alta capacidad osmoetanoltolerante y una capacidad para producir 16° G.L o superiores.
Breve descripción de la invención
El aspecto principal de la invención es una cepa osmoetanoltolerante de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, (cepa de la invención), que fue depositada el 4 de julio de 2017 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Burjassot, Valencia, España) y a la cual se le asignó el número de acceso CECT 13152.
En otro aspecto relevante, la invención se refiere al uso de la cepa de la invención para la producción de etanol o de productos alcohólicos por fermentación empleando diferentes sustratos.
Asimismo, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la levadura para la producción de biomasa.
Un último aspecto de la invención se refiere a una composición microbiológica que comprende una cepa de la invención y opcionalmente al menos un elemento adicional que favorezca la producción de alcoholes o de productos alcohólicos. Breve descripción de las figuras
Figura 1 : muestra un esquema de la eliminación de la pared celular en las cepas de levadura parentales. Figura 2: representación de la fusión de los protoplastos de las células parentales, siendo el protoplasto A una levadura altamente osmotolerante y el protoplasto B una levadura empleada en fermentación industrial.
Figura 3: se muestra un esquema de la producción de la cepa de la invención por la técnica de fusión de protoplastos que implica la secuencia del tratamiento con enzimas líticas de las levaduras parentales, inducción de la fusión de protoplastos, incubación de nuevos híbridos y selección en medios específicos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere en su aspecto principal a una cepa de la especie Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 13152.
Esta cepa presenta como principal característica que es altamente osmoetanoltolerante lo cual, la hace especialmente adecuada para la producción de etanol por fermentación alcohólica a partir de diferentes sustratos, así como para la elaboración de productos alcohólicos tales como bebidas alcohólicas (vino, cerveza, cava o sidra). De hecho la cepa de la presente invención es capaz de producir etanol o productos alcohólicos mediante fermentación a 16 0 G.L. o superiores.
La cepa de la invención se ha obtenido por la técnica de fusión de protoplastos que permite el intercambio genético de las células parentales mediante una etapa previa de digestión de sus paredes celulares y una posterior de fusión de membranas. Las figuras 1 y 2 muestran una representación gráfica de ambas etapas.
Por tanto la cepa de la invención es una cepa híbrida resultante de la fusión de una cepa altamente osmotolerante de S.cerevisiae, la cepa NCYC73 y otra cepa de S.cerevisiae empleada en fermentación industrial. La cepa obtenida posee características y capacidades de ambas cepas parentales y de manera particular muestra una alta osmoetanoltolerancia.
La cepa de la invención puede ser transportada en formato líquido, fresco en pasta, seco activo o seco instantáneo.
La cepa de la invención presenta una morfología ovoide y un color beige mate. Las características metabólicas observadas son similares a las de otras cepas industriales de S. cerevisiae y en particular de las cepas parentales de las que proviene. El rápido crecimiento y la rápida metabolización de los azúcares fermentables, así como la alta osmoetanoltolerancia de la cepa de la invención la hacen especialmente adecuada para su uso industrial y de manera particular en la producción de bioetanol o en la producción de bebidas alcohólicas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso o aplicación de la cepa de la invención. Por un lado, la cepa de la invención es de utilidad en la producción de etanol o la elaboración productos alcohólicos por fermentación.
En una realización particular, la cepa de la invención es útil para la producción de bioetanol a partir de residuos vegetales y residuos lignocelulósicos. Los residuos vegetales o residuos lignocelulósicos pueden ser la fracción biodegradable de los productos, residuos y restos de origen procedentes de la agricultura tales como residuos de cultivos, ricos en azúcares fermentables, como caña de azúcar; biomasa de almidón, por ejemplo, granos o paja de trigo; o maíz o paja de maíz o grano de maíz o fibra de maíz; o granos o paja de cebada; o granos o paja de sorgo, arroz, hierba, ramas, etc. Los residuos vegetales y residuos lignocelulósicos también pueden provenir de industrias forestales tales como la maderera.
En cuanto a la aplicación para la producción de productos alcohólicos por fermentación la cepa de la invención es especialmente adecuada para la elaboración de bebidas alcohólicas y de manera más particular de bebidas como el vino, la cerveza, el cava, la sidra o bebidas destiladas.
El uso de la cepa de la invención permite obtener por fermentación alcohólica etanol o productos alcohólicos a 16 0 G.L. o superiores.
Asimismo, otro de los uso de la cepa de la invención es para la panificación o producción de pan o productos de repostería y pastelería.
Otro de los usos de la cepa de la invención es para la producción de biomasa como medio para transformar residuos vegetales o animales (lactosueros) fermentables de bajo valor añadido en biomasa con un alto valor proteico.
En una relación particular, la biomasa obtenida tiene aplicación como fuente de alimentación animal, en particular de ganado. Un último aspecto de la invención se refiere a una composición microbiológica que comprende la cepa de la invención y, opcionalmente, al menos un elemento adicional que favorezca la producción de alcoholes o de productos alcohólicos y/o el proceso de fermentación.
En una realización particular de la invención la composición se puede presentar en formato de composición acuosa diluida, crema, prensada, seca o liofilizada.
A continuación se detallan unos ejemplos concretos de realización de la invención que sirven para ilustrar la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 : Obtención del mutante Saccharomyces cerevisiae de la invención (CECT 13152).
Para la obtención de la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 13152 se utilizaron métodos de fusión de protoplastos análogos a los descritos en "Induced Fusión of Fungal Protoplasts following Treatment with Polyethylene Glycol". Journal of General Microbiology (1976), 92, 4 I 3- 4 I 7. J. Anne and J. F. Peberdy o "Fusión of protoplasts of Bacillus megaterium." ' Proa Nati. Acad. Sci. USA Vol. 73, No. 6, pp. 2147-2150, June 1976 Microbiology. Katalin Fodor and Lajos Alfoldi.
A continuación se detallan los pasos que se llevaron a cabo para la obtención del mutante depositado con el número CECT 13152.
Crecimiento de las cepas parentales
Las cepas parentales se hicieron crecer en placas de agar glicerol, para asegurarse de que respiraban correctamente. Como cepas parentales se utilizaron, por un lado, la cepa NCYC73 de S.cerevisiae con una capacidad altamente osmotolerante y por otro lado, otras cepas de S.cerevisiae de uso industrial.
Una vez crecidas en estas placas, se inocularon 1 , 2 ó 3 asas de estas levaduras en un medio líquido, cuya composición dependió de la condición de osmotolerancia de la levadura. Las levaduras osmotolerantes, en un medio que contiene glucosa, producen una pared más dura, que cuesta más degradar en la fase de lisis. Por ello se usó galactosa, de modo que la pared resultante quedó más laxa. Una vez inoculados los medios, se mantuvieron entre 25° y 35°C y entre 50 y 500 rpm, durante una noche.
El tiempo de incubación depende de la curva de crecimiento de la levadura, de manera que se retiraron del shaker cuando finalizaban la fase exponencial y antes de entrar en la fase estacionaria.
Resuspensión de las levaduras en buffer de pretratamiento.
Para la fusión, lo primero que hay que hacer es obtener un pellet de crema de levadura.
Para ello, se tomaron entre 10 y 50 mi del medio de cultivo, y se centrifugó entre 500 y 5000 rpm durante 1 y 10 minutos y luego se retiró el sobrenadante hasta dejar entre 1 y 12 mi. Se resuspendió y centrifugó de nuevo entre 1000 y 5000 rpm durante 1 y 10 minutos.
Preparación del buffer de pretratamiento.
Al buffer de pretratamiento Tris-EDTA pH entre 6 y 9 previamente preparado y autoclavado, se le añadió β-mercaptoetanol en la siguiente proporción: entre 4 y 11 mi de buffer Tris-EDTA + 100 - 400μΙ de β-mercaptoetanol, agitando bien. El β- mercaptoetanol se incorporó a un falcon de 15ml conteniendo entre los 4 y 11 mi de buffer. El buffer tenía la molaridad adecuada para la condición de osmotolerancia de la levadura que estemos utilizando. Por norma general, si no eran osmotolerantes, se utilizó un buffer con sorbitol entre 0,2 y 1 M o KCI entre 0,2 y 1 M. Por el contrario para las osmotolerantes se usó el buffer con una molaridad entre 0,1 y 1 , 1 M con sorbitol o entre 0,5 y 2 M con KCI.
Pretratamiento de las levaduras
Se retiró el sobrenadante de las levaduras tras la última centrifugación. Se incorporó entre los 4 y 12 mi de buffer de pretratamiento ya conteniendo el β-mercaptoetanol. Se agitó bien, valiéndose de un vórtex y se introdujo la mezcla en el shaker entre 30° y
45°C y entre 50 y 200 rpm durante 10 y 50 minutos. Se mantuvo entre 5 y 15 minutos adicionales a las revoluciones indicadas anteriormente. Se volvió a centrifugar entre 1000 y 5000 rpm durante 1 y 20 minutos. A este nivel la pared ya empezaba a degradarse. Preparación del buffer de lisis
Para preparar el buffer de lisis a un buffer fosfato-citrato (con sorbitol) pH entre 4 y 7 se le incorporaron las enzimas líticas.
Justo antes de incorporar el buffer de lisis sobre las levaduras, se filtró con un filtro estéril de entre 0, 1 y 1 μηι. se usaron entre uno o dos filtros para filtrar completamente entre 1 y 10 mi de buffer.
Finalización de la lisis de la pared celular
Se retiró casi todo el sobrenadante del falcon, y se adicionaron entre 1 y 10 mi del buffer de lisis estéril. Luego se resuspendieron las levaduras. Se incubó la mezcla entre 30° y 40°C nuevamente y a una agitación de entre 50 y 500 rpm durante 10 a 50 minutos. Entre los 10 y 50 minutos se empezó a comprobar la aparición de los esferoplastos en la suspensión.
Para determinar en qué momento la lisis se había completado se realizó prueba del agua se basa en la fragilidad que poseen las células sin pared ante variaciones osmóticas en el medio extracelular. Para llevarla a cabo, se introdujeron entre 5 y 75 μΙ de la solución de levaduras en 0,5 y 6 mi de agua miliQ. Cuando la solución quedaba translúcida significaba que las levaduras aún no han perdido la pared mientras que cuando la solución quedaba transparente, con pequeños grumos blanquecinos implicaba que las levaduras habían perdido su pared, y al introducirlas en un medio hipotónico, no resistían el cambio. Si hemos elegido de manera incorrecta la molaridad del buffer, puede ser que las células no pierdan la pared correctamente, que sufran una modificación en su forma, o en su tamaño (por pérdida o absorción de agua). En estos casos, las levaduras no pueden utilizarse para la fusión. Las levaduras osmotolerantes tardan más tiempo en lisar su pared celular.
Mientras la solución permanecía translúcida, las levaduras se introducían de nuevo en el shaker y se repetía la prueba pasados entre 10 y 60 minutos. Así hasta que las células se rompían en agua. Para comparar la respuesta de las levaduras en agua con un control negativo, se introdujeron entre 5 y 80 μΙ de levaduras en 0,5 y 6 mi de buffer. También se comprobó visualmente la formación de los esferoplastos por observación al microscopio.
Lavado de las células y medida de la población celular
Una vez se formaron los esferoplastos, se procedió al lavado de las células para su fusión. Para ello se empleó buffer de lavado Tris-HCI pH entre 6 y 9 con sorbitol (a la molaridad a la que correspondiera). Así, una vez retirado el falcon del shaker, se añadió entre 1 y 15 mi del buffer de lavado y agitando, se centrifugó entre 500 y 5000 rpm durante 1 y 15 minutos. Se retiró el sobrenadante y se repitió el procedimiento. Este procedimiento se realizó en total entre una y seis veces.
La última vez, tras retirar el sobrenadante se añadieron entre 1 y 6 mi del buffer de lavado y se resuspendió cuidadosamente. Seguidamente se tomaron entre 1 y 20 μΙ de la suspensión de levaduras y se disolvieron entre 450 y 1000μΙ de agua miliQ. De esa dilución se tomó con una pipeta una pequeña cantidad y se introdujo en la cámara de
Neubauer (objetivo de 40X). Se contaron los millones de células, y en función de la población, se determinaron los mi que había que añadir de la suspensión para recoger entre 100 y 2000 millones de células. Lo importante era que hubiera la misma cantidad de las dos cepas de levadura para fusionar.
Incubación de las levaduras en la solución de fusión
Se introdujo en un eppendorf la cantidad de suspensión de esferoplastos de la primera levadura que se calculó en función de la población. A continuación, se centrifugó entre 1000 y 7000 rpm durante 1 y 50 segundos. Una vez hecho esto, se retiró el sobrenadante y se incorporó la cantidad de suspensión de la segunda levadura. Se centrifugó nuevamente entre 1000 y 7000 rpm el mismo tiempo. Se retiró el sobrenadante de nuevo y se incorporó entre 0, 1 y 5 mi de la solución de fusión. El PEG hace muy densa la solución y resulta difícil aspirarla. Se resuspendió y se incubó en una estufa entre 27 y 40°C durante 10 y 50 minutos.
Crecimiento de híbridos en medio sólido
Una vez pasados entre los 10 y 50 minutos de fusión, se tomaron entre 10 y 75 mi de una solución de agar tipo E al 1 ,5% autoclavado y atemperado entre 40 y 70°C y entre 10 y 65 mi de CaC entre 0,5 y 2M esterilizado con filtro de entre 0, 1 y Ο,δμηι y también atemperado entre 40 y 70°C y se mezcló bien. A la mezcla se le añadieron entre 50 y 300μΙ de la solución de fusión con las levaduras, y se agitó para dispersar los híbridos por todo el agar.
Por último, se vertió esta mezcla sobre las placas OSY que se incubaron entre 20 y 40°C durante 1 a 5 días.
Fases posteriores.
Las colonias que crecidas en el medio OSY, se tomaron y se sembraron en medio YPD, y de ahí se pasaron a agar glicerol entre 1 y 5%. En el medio YPD se sembraron tomando todas las colonias grandes, formando 4 ó 5 estrías sobre la placa. Desde el agar glicerol se preparó un tubo de reserva utilizando medio glicerol entre 10 y 50%. De entre las diferentes cepas aisladas se seleccionó la cepa de la invención depositada con el número de acceso CECT 13152.
Ejemplo 2: Cinética de crecimiento del mutante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.
Para estudiar la cinética de crecimiento se inocularon muestras las cepas tanto parentales como la nueva cepa mutante CECT 13152 en caldo YPD. Se realizó un balance de materia en base a los requerimientos nutricionales de la levadura formulando tres medios, a base de residuos agroindustriales, tubérculos, hidrolizados de cereal y desechos de frutas. Se reguló el pH de las muestras hasta llegar al rango de 4.5-5.0. Luego del mezclado y homogenizado, se autoclavaron los medios a 121 °C por 15 minutos.
Los medios de cultivo se pusieron en balones de vidrio de 2L de capacidad; se conectó el mecanismo de aireación a este sistema a través de bombas de baja potencia junto a piedras difusoras, éstas fueron desinfectadas e introducidas en los medios de cultivo respectivos. Finalmente se procedió a inocular las levaduras cosechadas. Los sistemas fueron cubiertos con algodón para evitar contaminación externa.
Se realizaron mediciones cada hora, para lo cual se tomó una muestra de 10 mL de cada cultivo. El crecimiento fue cuantificado empleando la cámara de Neubauer con un microscopio óptico con aumento de 400X; durante la producción de biomasa se controlaron el °Brix y pH. Se usaron las versiones modificadas de los modelos Logístico y de Gompertz propuestas por Zwietering et al., (1990).
Lo que permitió determinar la cinética de crecimiento a través del crecimiento máximo (Ymax), fase lag o de adaptación (λ), velocidad específica de crecimiento
Figure imgf000011_0001
Se calculó el tiempo de generación (G): G = log
Figure imgf000011_0002
Los resultados demostraron que el tiempo de generación de Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 respecto de ambas cepas parentales aumentó en al menos un 20%, sin incremento de la duración del período de latencia.
Ejemplo 3: Valoración in vitro de la capacidad de producción de etanol y osmotolerancia del mutante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.
Se llevó a cabo un ensayo comparativo entre la capacidad de producción de alcohol entre una cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae y la cepa CECT 13152 en diferentes condiciones y diferentes sustratos.
En la siguiente tabla 1 se resume las condiciones y parámetros que se midieron antes y después del ensayo de fermentación usando azúcar moreno como fuente de carbono:
TABLA 1
c PARAMETROS INICIALES PARAMETROS FINALES
ó ΗΟ
DI AZÚ
G RA
o CAR ACI ACID
ΡΟΒ °GL s ΡΟΒ
ES DENSI DEZ EZ
BU LAC DES FE AZÚC P LAC INICI DAD (% (%
LEV FF IÓN PH TIL RM ARES (g/c IÓN PH ALES (g/cm3 ác. ác.
ER (mili AD EN (%) m3) (mili te/i ) acéti Acéti
/mL) o TA /mL)
OOrn co) co)
CIÓ
L) N
1 20 Comer 1,080 73 4,40 <0,01 5,8 90 11,5 1,036 106 2,9 0,25
2 17 cial NO 1,070 80 4,34 <0,01 5,6 90 8,48 1,025 133 3,3 0,21
3 20 CECT 1,080 75 4,40 <0,01 7,2 72 8,15 1,024 111 3,16 0,25
4 17 13152 1,070 70 4,34 <0,01 6,6 72 1,016 101 3,13 0,22
5 20 Comer 1,086 90 4,48 0,33 7,9 90 1,025 155 3,81 0,59
6 17 cial SI 1,075 145 4,51 0,34 7,7 90 4,69 1,016 161 3,75 0,60
7 20 CECT 1,086 128 4,48 0,33 11,0 72 1,004 110 4,07 0,53
8 17 13152 1,075 120 4,51 0,34 10,2 72 0,18 0,996 120 4,03 0,55 Lo primero que se puede observar es que la cepa de la invención tiene una elevada osmotolerancia a los azúcares y que es capaz de crecer y metabolizar azúcares a una alta concentración de hasta por los menos 28 g/100ml. Por otro lado, tal y como se puede observar el grado de alcohol destilado es sustancialmente mayor en el caso de la cepa CECT13152 que en el de la cepa comercial en todas las condiciones ensayadas, lo cual demuestra que la cepa es apropiada para su uso industrial. En la tabla 2 también se resumen algunos de los parámetros que demuestran la mayor capacidad fermentativa y de producción de alcohol de la cepa de la invención:
Tabla 2
Figure imgf000012_0001
De manera similar, se llevó a cabo un ensayo comparativo entre la capacidad de producción de alcohol entre una cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae y la cepa CECT 13152 para diferentes porcentajes de melaza como sustrato.
En las siguientes tablas 3A y 3B se detallan los códigos de los diferentes ensayos realizados que identifican tanto el porcentaje de melaza utilizado y los azúcares totales (código numérico) así como la cepa utilizada (código alfabético): Tabla 3A y 3B
Figure imgf000013_0001
La tabla 4 resume a continuación los parámetros que se midieron antes y después del ensayo de fermentación usando melaza como fuente de carbono:
Tabla 4 c PARAMETROS INICIALES PARAMETROS FINALES
ó
HOR
DI
G POBLA ACIDEZ °G.L AS ACIDEZ o P
CIÓN ( ác. DEST FER P POBLACIÓN ( ác.
(g/cm3 BRIX PH PH BRIX (mili/ acético ILAD MEN (g/cm3) (mill/mL) acético )
mL) ) O TACI )
ÓN
1A 1,134 141 32 4,45 0,56 13.0 120 1,036 188 4,64 0,72 17.6
IB 105 15.1 76 1.025 118 4,61 0,74 17.4
2A 1,110 101 27 4,53 0,53 10,4 120 1,027 170 4,43 0,82 14,4
2B 118 12 42 1.020 183 4,60 0,77 14,0
3A 1,108 116 26 4,46 0,71 9,5 120 1,036 191 4,60 0,89 15,8
3B 120 9,7 50 1,040 200 4,61 0,92 15,4
4A 1,138 71 33 4,45 0,70 3,8 126 1,109 123 4,49 0,88 28,6
4B 95 9.2 91 1,067 176 4,45 0,93 22,0
5A 1,120 114 29 4,43 0,73 10,2 128 1,036 166 4,61 1,00 16,4 En este caso se puede observar también que el grado de alcohol destilado es sustancialmente mayor en el caso de la cepa CECT 13152 que en el de la cepa comercial en todas las condiciones ensayadas.
La tabla 5 recoge algunos de los parámetros que demuestran la mayor capacidad fermentativa y de producción de alcohol de la cepa de la invención:
Tabla 5
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 3: Capacidad fermentativa del mutante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.
Se determinó la capacidad fermentativa de nueva cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 mediante fermentación a partir de sustratos amiláceos obtenidos a partir de tubérculos, hidrolizados de cereal y de desechos de frutas.
a) Hidrólisis del sustrato amiláceo Como los azúcares presentes en los sustratos amiláceos utilizados se encuentran en forma de almidón y la levadura empleada carece de amilasas, fue necesario llevar a cabo la hidrólisis previa de los mismos. Además, se licuefacto el sustrato una vez se mezcló con el agua.
Mezcla de sustrato amiláceo-agua
Los sustratos amiláceos utilizados, esto es el cereal, los tubérculos y deshechos de frutas fueron triturados y tamizados con un diámetro de aproximadamente 1 mm y se mezclaron con agua a una proporción de 38:62 (sustrato: agua) (p/p).
Licuefacción en 2 etapas
Etapa 1. Se añadió un 20% de la dosis total de α-amilasa (Liquozyme, 240 KNU/g) a cada una de las mezcla y se incubó durante un periodo de 45 minutos a 65°C de temperatura en agitación constante, lo suficientemente intensa como para mantener el sustrato suspendido.
Etapa 2. Se añadió el 80% restante de la α-amilasa (Liquozyme, 240 KNU/g) a la mezcla y se incubó durante 30 minutos a una temperatura de 85°C en agitación constante igual que en la etapa 1.
Autoclave
Los compuestos amiláceos procesados fueron introducidos en el autoclave sometieron a una temperatura de 130°C durante 3 minutos.
Sacarificación
Se agregó la dosis de amiloglucosidasa (Spirizyme Fuel) y se incubó a 65° C, durante 90 minutos manteniendo agitación constante, igual a la de etapas anteriores.
A partir de los distintos sustratos se realizaron diluciones, para obtener una concentración de azúcares del 27%.
Se adicionaron nutrientes a los medios de fermentación en los casos en los que fue necesario. b) Levadura y condiciones de propagación Se utilizó la levadura muíante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 para llevar a cabo la fermentación. Para ello se realizó una propagación previa a la fermentación. La propagación de levaduras se realizó en dos etapas: una etapa inicial en YPD y una segunda etapa en un sustrato azucarado de la misma naturaleza que el que se utilizó en fermentación, a una concentración de azúcares de entre 7-8%. La temperatura de propagación fue de 34.5°C, agitación de 120 rpm y pH de 5. Dependiendo del tipo de sustrato, fue necesaria la adición de sales y vitaminas. El empleo de aireación durante esta segunda etapa incrementó considerablemente el número de células obtenidas por mL al final del proceso.
c) Condiciones de fermentación
La fermentación se llevó a cabo a una temperatura constante de 35°C. En cuanto a la agitación, el ensayo se inició sin agitación, y se mantuvo así la primera hora. La segunda hora se programó a 40 rpm. Por último, se establecieron 85 rpm al comienzo de la tercera hora, y así se mantuvo hasta el final de la fermentación. Se definió el final de fermentación al momento en el que la pérdida de CO2 entre dos medidas de peso consecutivas es cero, o cuando se superan las 100 horas de fermentación.
Los resultados de los ensayos de fermentación en los diferentes sustratos se muestran a continuación en las tablas 6 a 8.
Tabla 6. Azúcares iniciales (% p/v).
Tubérculos Hidrolizados de Desechos de
cereal frutas
27 27 27
Tabla 7. Concentración alcohólica obtenida (°G.L.)
Tubérculos Hidrolizados de Desechos de
cereal frutas
16,1 ° 16,2° 16,2°
Tabla 8. Azúcares finales (% p/v).
Tubérculos Hidrolizados de Desechos de
cereal frutas
0,2 < 0,1 < 0,1

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepa de la especie Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 13152.
2. Cepa según la reivindicación 1 caracterizada porque se encuentra en formato líquido, fresco en pasta, seco activo o seco instantáneo.
3. Uso de la cepa de la reivindicación 1 ó 2 en la producción de etanol o la elaboración productos alcohólicos por fermentación.
4. Uso según la reivindicación 3 donde el etanol se produce por fermentación alcohólica de residuos vegetales y residuos lignocelulósicos.
5. Uso según la reivindicación 3 donde el producto alcohólico es una bebida alcohólica.
6. Uso según la reivindicación 5 donde la bebida alcohólica es vino, cerveza, cava, sidra o bebidas destiladas.
7. Uso según la reivindicación 3 donde la fermentación alcohólica produce etanol a 16 0 G.L. o superiores u otros productos alcohólicos.
8. Uso de la cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para la panificación.
9. Uso de una cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para la producción de biomasa.
10. Uso según la reivindicación 9 donde la biomasa tiene aplicación como fuente de alimentación animal.
1 1. Composición microbiológica que comprende una cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 y opcionalmente al menos un elemento adicional que favorezca la producción de alcoholes o de productos alcohólicos y/o el proceso de fermentación.
12. Composición de acuerdo con la reivindicación 11 en formato de composición acuosa diluida, crema, prensada, seca o liofilizada.
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