BR112020005239A2

BR112020005239A2 - cepa de saccharomyces cerevisiae e seu uso para a elaboração de produtos alcoólicos

Info

Publication number: BR112020005239A2
Application number: BR112020005239-6A
Authority: BR
Inventors: Miguel Villena Reyes; Manuel Aguado Ramos; Yolanda Núñez Gutiérrez; Elena Maganto Burgos; Daniel Hernández Mateo
Original assignee: Tomsa Destil, S.L.
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2020-09-24
Also published as: CO2020003062A2; EP3683302A4; WO2019053316A1; ES2704201B2; EP3683302B1; ES2704201A1; MX2020002916A; EP3683302A1; EP3683302C0

Abstract

A presente invenção refere-se a uma nova cepa de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae osmotolerante ao etanol, e ao seu uso para produzir etanol ou elaborar produtos alcoólicos. Além disso, a cepa descrita tem utilidade para a produção de biomassa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de invenção para “CEPA DE

SACCHAROMYCES CEREVISIAE E SEU USO PARA A ELABORAÇÃO DE PRODUTOS ALCOÓLICOS” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção pertence ao campo técnico das fermentações alcoólicas, tais como elaboração de vinhos, cerveja, álcool etc., para consumo humano. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma nova cepa de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae osmotolerante ao etanol, e ao seu uso para produzir etanol ou elaborar produtos alcoólicos. Além disso, a cepa descrita tem utilidade para a produção de biomassa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O estresse osmótico tem uma notável influência sobre a fisiologia celular das cepas de Saccharomyces cerevisiae, o qual se manifesta na dinâmica de alterações da parede celular, na alteração da homeostasia de íons, em ajustes metabólicos, na interrupção do ciclo celular, tendo também um efeito muito notável sobre a expressão gênica. Portanto, o estresse osmótico é um fator que afeta negativamente tanto a proliferação celular quanto a capacidade fermentativa das cepas de Saccharomyces cerevisiae e, em última instância, a produção de álcool em nível industrial.

[003] Existe, portanto, uma necessidade constante de se desenvolver novas cepas de Saccharomyces cerevisiae que apresentem características melhoradas e, em particular, que apresentem uma alta osmotolerância ao etanol.

[004] Algumas cepas de S. cerevisiae com características melhoradas já foram descritas na literatura como, por exemplo, nos documentos ES2116922, ES2524704 ou ES2406412.

[005] Os autores da presente invenção obtiveram uma nova cepa híbrida de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae mediante a técnica de fusão de protoplastos a partir da cepa S. cerevisiae NCYC73 altamente osmotolerante e de outra cepa de S. cerevisiae. Mediante o uso dessa técnica, gera-se uma troca cromossômica, sobretudo de cromossomos de menor peso molecular, o que resulta em uma nova cepa de levedura na qual coexistem características e capacidades de ambas as cepas precursoras.

[006] Em particular, a cepa obtida pelos autores apresenta uma alta capacidade de osmotolerância ao etanol e uma capacidade de produzir 16 ºGL ou mais.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[007] O aspecto principal da invenção é uma cepa osmotolerante ao etanol de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae (a cepa da invenção), que foi depositada em 4 de julho de 2017 na Coleção Espanhola de Culturas-Tipo (CECT) (Burjassot, Valência, Espanha) e à qual foi designado o número de acesso CECT 13152.

[008] Em outro aspecto relevante, a invenção refere-se ao uso da cepa da invenção para a produção de etanol ou de produtos alcoólicos por fermentação empregando-se diferentes substratos.

[009] Além disso, outro aspecto da invenção refere-se ao uso da levedura para a produção de biomassa.

[0010] Um último aspecto da invenção refere-se a uma composição microbiológica que compreende uma cepa da invenção e, opcionalmente, pelo menos um elemento adicional que favorece a produção de álcoois ou de produtos alcoólicos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0011] Figura 1: mostra um esquema da eliminação da parede celular nas cepas de levedura precursoras.

[0012] Figura 2: é uma representação da fusão dos protoplastos das células precursoras, sendo o protoplasto A uma levedura altamente osmotolerante e sendo o protoplasto B uma levedura empregada em fermentação industrial.

[0013] Figura 3: mostra um esquema da produção da cepa da invenção pela técnica de fusão de protoplastos que implica na sequência de tratamento com enzimas líticas das leveduras precursoras, indução da fusão de protoplastos, incubação de novos híbridos e seleção em meios específicos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0014] A presente invenção refere-se, em seu aspecto principal, a uma cepa da espécie Saccharomyces cerevisiae, depositada na Coleção Espanhola de Culturas-Tipo (CECT) sob o número de acesso CECT 13152.

[0015] A principal característica dessa cepa é ser altamente osmotolerante ao etanol, o que a torna especialmente adequada para a produção de etanol por fermentação alcoólica a partir de diferentes substratos, bem como para a elaboração de produtos alcoólicos, tais como bebidas alcoólicas (vinho, cerveja, cava ou sidra). De fato, a cepa da presente invenção é capaz de produzir etanol ou produtos alcoólicos mediante fermentação a 16 ºGL ou mais.

[0016] A cepa da invenção foi obtida pela técnica de fusão de protoplastos, a qual permite a troca genética das células precursoras mediante uma etapa prévia de digestão de suas paredes celulares e uma etapa posterior de fusão de membranas. As Figuras 1 e 2 mostram uma representação gráfica de ambas as etapas.

[0017] Portanto, a cepa da invenção é uma cepa híbrida resultante da fusão de uma cepa altamente osmotolerante de S. cerevisiae, a cepa NCYC73 e outra cepa de S. cerevisiae empregada em fermentação industrial. A cepa obtida possui características e capacidades de ambas as cepas precursoras e, em particular, mostra uma alta osmotolerância ao etanol.

[0018] A cepa da invenção pode ser transportada em formato líquido, fresco em pasta, seco ativo ou seco instantâneo.

[0019] A cepa da invenção apresenta uma morfologia ovoide e uma cor bege fosco. As características metabólicas observadas são similares às de outras cepas industriais de S. cerevisiae e, em particular, das cepas precursoras das quais são provenientes. O rápido crescimento e a rápida metabolização dos açúcares fermentáveis, assim como a alta osmotolerância ao etanol da cepa da invenção a tornam especialmente adequada para seu uso industrial e, em particular, na produção de bioetanol ou na produção de bebidas alcoólicas.

[0020] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso ou aplicação da cepa da invenção. Por um lado, a cepa da invenção tem utilidade na produção de etanol ou na elaboração de produtos alcoólicos por fermentação.

[0021] Em uma modalidade particular, a cepa da invenção é útil para a produção de bioetanol a partir de resíduos vegetais e resíduos lignocelulósicos. Os resíduos vegetais ou os resíduos lignocelulósicos podem ser a fração biodegradável dos produtos, resíduos e restos de origem procedentes da agricultura, tais como resíduos de cultivos, ricos em açúcares fermentáveis, como cana-de-açúcar; biomassa de amido, por exemplo, grãos ou palha de trigo; ou milho ou palha de milho ou grão de milho ou fibra de milho; ou grãos ou palha de cevada; ou grãos ou palha de sorgo, arroz, grama, galhos etc. Os resíduos vegetais e os resíduos lignocelulósicos também podem ser provenientes de indústrias florestais, tais como a indústria madeireira.

[0022] Quanto à aplicação para a fabricação de produtos alcoólicos por fermentação, a cepa da invenção é especialmente adequada para a elaboração de bebidas alcoólicas e, mais particularmente, de bebidas como vinho, cerveja, cava, sidra ou bebidas destiladas.

[0023] O uso da cepa da invenção permite obter-se, por fermentação alcoólica, etanol ou produtos alcoólicos a 16 ºGL ou mais.

[0024] Além disso, um outro uso da cepa da invenção é na panificação ou na produção de pão ou produtos de confeitaria e pastelaria.

[0025] Um outro uso da cepa da invenção é para a produção de biomassa como meio para transformar resíduos vegetais ou animais (soros de leite) fermentáveis de baixo valor agregado em biomassa com um alto valor proteico.

[0026] Em uma relação particular, a biomassa obtida tem aplicação como fonte de alimentação animal, em particular de gado.

[0027] Um último aspecto da invenção refere-se a uma composição microbiológica que compreende a cepa da invenção e, opcionalmente, pelo menos um elemento adicional que favorece a produção de álcoois ou de produtos alcoólicos e/ou o processo de fermentação.

[0028] Em uma modalidade particular da invenção, a composição pode ser apresentada em formato de composição aquosa diluída, creme, prensada, seca ou liofilizada.

[0029] A seguir, são detalhados alguns exemplos concretos de modalidades da invenção que servem para ilustrar a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Obtenção do mutante Saccharomyces cerevisiae da invenção (CECT 13152).

[0030] Para a obtenção da cepa de Saccharomyces cerevisiae, depositada na Coleção Espanhola de Culturas-Tipo (CECT) sob o número de acesso CECT 13152, foram utilizados métodos de fusão de protoplastos análogos àqueles descritos em “Induced Fusion of Fungal Protoplasts following Treatment with Polyethylene Glycol”. Journal of General Microbiology (1976), 92, 4 I 3-4 I 7. J. Anne and J. F. Peberdy o “Fusion of protoplasts of Bacillus megaterium.” Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 73, No. 6, pp. 2147-2150, June 1976 Microbiology. Katalin Fodor and Lajos Alfoldi.

[0031] A seguir, são detalhados os passos que foram seguidos para a obtenção do mutante depositado sob o número CECT 13152.

[0032] Crescimento das cepas precursoras

[0033] As cepas precursoras foram cultivadas em placas de ágar de glicerol para garantir que respirassem corretamente. Por um lado, foram utilizadas como cepas precursoras a cepa NCYC73 de S. cerevisiae com uma capacidade altamente osmotolerante e, por outro lado, outras cepas de S. cerevisiae de uso industrial.

[0034] Após o crescimento nessas placas, foram inoculadas 1, 2 ou 3 “ases” dessas leveduras em um meio líquido, cuja composição dependeu da condição de osmotolerância da levedura.

[0035] As leveduras osmotolerantes, em um meio que contém glicose, produzem uma parede mais dura que leva mais tempo para se degradar na fase de lise. Por isso, usou-se galactose, de modo que a parede resultante ficasse mais flexível. Uma vez inoculados, os meios foram mantidos entre 25º e 35 ºC e entre 50 e 500 rpm, durante uma noite.

[0036] O tempo de incubação depende da curva de crescimento das leveduras, de maneira que forma retiradas do agitador quando finalizaram a fase exponencial e antes de entrarem na fase estacionária.

[0037] Ressuspensão das leveduras em tampão de pré-tratamento.

[0038] Para a fusão, deve-se primeiro obter um pélete de creme de levedura. Para tanto, entre 10 e 50 mL do meio de cultura foram centrifugados entre 500 e 5000 rpm durante 1 a 10 minutos e, em seguida, retirou-se o sobrenadante até restar entre 1 e 12 mL. Este foi ressuspenso e centrifugado novamente entre 1000 e 5000 rpm durante 1 a 10 minutos. Preparação do tampão de pré-tratamento.

[0039] Ao tampão de pré-tratamento Tris-EDTA, com pH entre 6 e 9 e previamente preparado e autoclavado, adicionou-se β-mercaptoetanol na seguinte proporção: entre 4 e 11 mL de tampão Tris-EDTA + 100 a 400 µl de β- mercaptoetanol, agitando-se bem. O β-mercaptoetanol foi incorporado em um tubo de 15 mL contendo entre os 4 e 11 mL de tampão. O tampão tinha a molaridade adequada para a condição de osmotolerância da levedura que estamos utilizando. Como regra geral, caso não fossem osmotolerantes, seria usado um tampão com sorbitol entre 0,2 e 1 M ou KCl entre 0,2 e 1 M. Ao contrário, caso fossem osmotolerantes, seria usado o tampão com uma molaridade entre 0,1 e 1,1 M com sorbitol ou entre 0,5 e 2 M com KCl. Pré-tratamento das leveduras

[0040] O sobrenadante foi retirado das leveduras após a última centrifugação. Incorporou-se entre os 4 e 12 mL de tampão de pré-tratamento já contendo o β-mercaptoetanol. Agitou-se bem por meio de um vórtice e introduziu-se a mistura no agitador entre 30º e 45 ºC e entre 50 e 200 rpm durante

10 a 50 minutos. As revoluções anteriormente indicadas foram mantidas entre 5 e 15 minutos adicionais. Voltou-se a centrifugar entre 1000 e 5000 rpm durante 1 a 20 minutos. Nesse nível, a parede já começava a se degradar. Preparação do tampão de lise

[0041] Para preparar o tampão de lise, as enzimas líticas foram incorporadas a um tampão de fosfato-citrato (com sorbitol), com pH entre 4 e 7.

[0042] Pouco antes de incorporar o tampão de lise sobre as leveduras, filtrou-se usando um filtro estéril entre 0,1 e 1 µm. Entre um e dois filtros foram usados para filtrar completamente entre 1 e 10 mL de tampão. Finalização da lise da parede celular

[0043] Retirou-se quase todo o sobrenadante do tubo e adicionou- se entre 1 e 10 mL do tampão de lise estéril. Em seguida ocorreu a ressuspensão das leveduras. Incubou-se a mistura entre 30º e 40 ºC novamente e sob uma agitação entre 50 e 500 rpm durante 10 a 50 minutos. Entre 10 e 50 minutos, começou a verificar-se o surgimento dos esferoplastos na suspensão.

[0044] Para determinar o momento de término da lise, realizou-se um teste de água com base na fragilidade das células sem parede mediante variações osmóticas no meio extracelular. Para sua realização, foram introduzidos entre 5 e 75 µl da solução de leveduras em 0,5 e 6 mL de água miliQ. Quando a solução ficava translúcida, significava que as leveduras ainda não haviam perdido a parede, ao passo que, quando a solução ficava transparente, com pequenos grumos esbranquiçados, significava que as leveduras tinham perdido sua parede e, quando introduzidas em um meio hipotônico, não resistiam à mudança.

[0045] Se tivermos escolhido incorretamente a molaridade do tampão, é possível que as células não percam a parede corretamente e que sofram uma modificação em sua forma ou em seu tamanho (por perda ou absorção de água). Nesses casos, as leveduras não podem ser utilizadas para a fusão. As leveduras osmotolerantes levam mais tempo para lisar sua parede celular.

[0046] Enquanto a solução permanecia translúcida, as leveduras eram novamente introduzidas no agitador e o teste era repetido após 10 a 60 minutos. Assim procedeu-se até que as células se rompessem em água. Para comparar a resposta das leveduras em água com um controle negativo, foram introduzidos entre 5 e 80 µl de leveduras em 0,5 e 6 mL de tampão.

[0047] Também se comprovou visualmente a formação dos esferoplastos por observação ao microscópio. Lavagem das células e medição da população celular

[0048] Uma vez formados os esferoplastos, procedeu-se à lavagem das células para sua fusão. Para tanto, empregou-se tampão de lavagem Tris- HCl, pH entre 6 e 9, com sorbitol (na molaridade a que corresponde). Assim, depois que o tubo foi retirado do agitador, adicionou-se entre 1 e 15 mL do tampão de lavagem sob agitação e centrifugou-se entre 500 e 5000 rpm durante 1 a 15 minutos. Retirou-se o sobrenadante e repetiu-se o procedimento. Esse procedimento foi realizado entre uma e seis vezes no total.

[0049] Na última vez, depois de retirar o sobrenadante, adicionou- se entre 1 e 6 mL do tampão de lavagem e ressuspendeu-se cuidadosamente. Em seguida, entre 1 e 20 µl da suspensão de leveduras foram dissolvidos entre 450 e 1000 µl de água miliQ. Dessa diluição, aspirou-se com uma pipeta uma pequena quantidade que foi introduzida na câmara de Neubauer (objetiva de 40X). Foram contadas as milhões de células e, em função da população, determinou-se os mL que precisariam ser adicionados da suspensão para coletar entre 100 e 2000 milhões de células. O importante era que houvesse a mesma quantidade das duas cepas de levedura para ocorrer a fusão. Incubação das leveduras na solução de fusão

[0050] Introduziu-se em um Eppendorf a quantidade de suspensão de esferoplastos da primeira levedura que foi calculada em função da população. Em seguida, centrifugou-se entre 1000 e 7000 rpm durante 1 a 50 segundos. Uma vez feito isso, retirou-se o sobrenadante e incorporou-se a quantidade de suspensão da segunda levedura. Centrifugou-se novamente entre 1000 e 7000 rpm pelo mesmo tempo. Retirou-se o sobrenadante novamente e incorporou-se entre 0,1 e 5 mL da solução de fusão. O PEG deixa a solução muito densa e dificulta sua aspiração. Ressuspendeu-se e incubou-se em uma estufa entre 27 e 40 ºC durante 10 a 50 minutos. Crescimento de híbridos em meio sólido

[0051] Após 10 a 50 minutos de fusão, coletou-se entre 10 e 75 mL de uma solução de ágar tipo E autoclavado a 1,5% e temperado entre 40 e 70 ºC e entre 10 e 65 mL de CaCl2 entre 0,5 e 2 M esterilizado com filtro entre 0,1 e 0,5 µm e também temperado entre 40 e 70 ºC e misturou-se bem. À mistura adicionou-se entre 50 e 300 µl da solução de fusão com as leveduras e agitou- se para dispersar os híbridos por todo o ágar.

[0052] Por último, despejou-se essa mistura sobre as placas OSY que foram incubadas entre 20 e 40 ºC durante 1 a 5 dias. Fases posteriores.

[0053] As colônias que cresceram no meio OSY foram coletadas e semeadas em meio YPD e, a partir daí, foram transferidas para o ágar de glicerol entre 1 e 5%. No meio YPD, todas as colônias grandes coletadas foram semeadas, formando 4 ou 5 estrias sobre a placa. A partir do ágar de glicerol, preparou-se um tubo de reserva utilizando meio de glicerol entre 10 e 50%.

[0054] Dentre as diferentes cepas isoladas, selecionou-se a cepa da invenção depositada sob o número de acesso CECT 13152. Exemplo 2: Cinética de crescimento do mutante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.

[0055] Para estudar a cinética de crescimento, inoculou-se amostras tanto das cepas precursoras quanto da nova cepa mutante CECT 13152 em caldo de YPD. Realizou-se um balanceamento de matéria com base nas exigências nutricionais da levedura formulando três meios, à base de resíduos agroindustriais, tubérculos, hidrolisados de cereal e resíduos de frutas. Regulou-se o pH das amostras até se chegar na faixa de 4,5 a 5,0. Após a mistura e homogeneização, os meios foram autoclavados a 121 ºC por 15 minutos.

[0056] Os meios de cultura foram colocados em balões de vidro com 2 litros de capacidade; conectou-se o mecanismo de aeração a esse sistema através de bombas de baixa potência junto a pedras difusoras que foram desinfectadas e introduzidas nos respectivos meios de cultura. Por fim, as leveduras coletadas foram inoculadas. Os sistemas foram cobertos com algodão para evitar contaminação externa.

[0057] Foram realizadas medições a cada hora, para as quais coletou-se uma amostra de 10 mL de cada cultura. O crescimento foi quantificado empregando-se a câmara de Neubauer com um microscópio óptico com aumento de 400X; durante a produção de biomassa, controlou-se o ºBrix e o pH. Foram usadas as versões modificadas dos modelos Logístico e de Gompertz propostos por Zwietering et al., (1990).

[0058] Isso permitiu determinar a cinética de crescimento através do crescimento máximo (Ymax), fase lag ou de adaptação (λ), velocidade específica de crescimento (µmax). Calculou-se o tempo de geração (G): G = log 2/µmax.

[0059] Os resultados demonstraram que o tempo de geração de Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 em relação a ambas as cepas precursoras aumentou em pelo menos 20%, sem aumento da duração do período de latência. Exemplo 3: Avaliação in vitro da capacidade de produção de etanol e osmotolerância do mutante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.

[0060] Realizou-se um teste comparativo entre a capacidade de produção de álcool entre uma cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae e a cepa CECT 13152 sob diferentes condições e em diferentes substratos.

[0061] A tabela 1 a seguir resume as condições e parâmetros que foram medidos antes e depois do teste de fermentação usando açúcar mascavo como fonte de carbono: TABELA 1

PARÂMETROS INICIAIS PARÂMETROS FINAIS

AÇÚCARES ACIDEZ ACIDEZ CÓDIGO DENSIDADE POPULAÇÃO ºGL HORAS DE POPULAÇÃO INICIAIS LEV TAMPÃO pH (% ác. AÇÚCARES (%) ρ (g/cm3) pH (% ác.

(g/cm3) (milhões/mL) DESTILADO FERMENTAÇÃO (milhões/mL) (g/100 mL) acético) acético) 1 20 1,080 73 4,40 <0,01 5,8 90 11,5 1,036 106 2,9 0,25 Comercial 2 17 1,070 80 4,34 <0,01 5,6 90 8,48 1,025 133 3,3 0,21

NÃO 3 20 1,080 75 4,40 <0,01 7,2 72 8,15 1,024 111 3,16 0,25 CECT 13152 4 17 1,070 70 4,34 <0,01 6,6 72 - 1,016 101 3,13 0,22 5 20 1,086 90 4,48 0,33 7,9 90 - 1,025 155 3,81 0,59 Comercial 6 17 1,075 145 4,51 0,34 7,7 90 4,69 1,016 161 3,75 0,60

SIM 7 20 1,086 128 4,48 0,33 11,0 72 - 1,004 110 4,07 0,53 CECT 13152 8 17 1,075 120 4,51 0,34 10,2 72 0,18 0,996 120 4,03 0,55

[0062] A primeira coisa que se pode observar é que a cepa da invenção tem uma elevada osmotolerância aos açúcares e que é capaz de crescer e metabolizar açúcares a uma alta concentração de até pelo menos 28 g/100 mL.

[0063] Por outro lado, como pode ser observado, o grau do álcool destilado é substancialmente maior no caso da cepa CECT13152 do que no caso da cepa comercial sob todas as condições testadas, o que demonstra que a cepa é apropriada para seu uso industrial.

[0064] Na tabela 2 também estão resumidos alguns dos parâmetros que demonstram a maior capacidade fermentativa e de produção de álcool da cepa da invenção: Tabela 2 CÓDIGO 1 2 3 4 5 6 7 8 UNIDADES η TEÓRICO 0,511 0,511 0,511 0,511 0,511 0,511 0,511 0,511 g de EtOH/g de glicose GRAU ALCOÓLICO 5,8 5,6 7,2 6,6 7,9 7,7 11 10,2 ºGL

CÓDIGO 1 2 3 4 5 6 7 8 UNIDADES DESTILADO 45,80 44,22 56,85 52,11 62,38 60,80 86,86 80,54 g de EtOH puro/L AÇÚCARES 89,60 86,51 111,23 101,96 122,04 118,95 169,94 157,58 g de açúcares FERMENTÁVEIS SOBRE fermentáveis/L

ÁLCOOL AÇÚCARES 200 170 200 170 200 170 200 170 g/L

FERMENTÁVEIS

MEDIDOS POR HPLC CONCENTRAÇÃO DE 200 170 200 170 200 170 200 170 g/L

SUBSTRATO % DE AÇÚCARES FERMENTÁVEIS NO SUBSTRATO ORIGINAL (SEM DILUIÇÃO) TEÓRICO (EM RELAÇÃO 45 51 56 60 61 70 85 93 % AO ºGL OBTIDO) REAL (EM RELAÇÃO AOS 100 100 100 100 100 100 100 100 % AÇÚCARES MEDIDOS) η ETANOL MÁXIMO 290 329 360 388 395 453 550 600 L.A.P./ Tm subtrato

[0065] De maneira similar, realizou-se um teste comparativo entre a capacidade de produção de álcool entre uma cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae e a cepa CECT 13152 para diferentes porcentagens de melaço como substrato.

[0066] Nas tabelas 3A e 3B a seguir são detalhados os códigos dos diferentes testes realizados que identificam tanto a porcentagem de melaço utilizado e os açúcares totais (código numérico) quanto a cepa utilizada (código alfabético): Tabelas 3A e 3B Comercial 1A 20% DE MELAÇO (25% DE AÇÚCARES TOTAIS)

2A 20% DE MELAÇO (20% DE AÇÚCARES TOTAIS) 3A 25% DE MELAÇO (17,2% DE AÇÚCARES TOTAIS) 4A 25% DE MELAÇO (25% DE AÇÚCARES TOTAIS) 5A 25% DE MELAÇO (20% DE AÇÚCARES TOTAIS) CECT 13152 1B 20% DE MELAÇO (25% DE AÇÚCARES TOTAIS) 2B 20% DE MELAÇO (20% DE AÇÚCARES TOTAIS) 3B 25% DE MELAÇO (17,2% DE AÇÚCARES TOTAIS) 4B 25% DE MELAÇO (25% DE AÇÚCARES TOTAIS) 5B 25% DE MELAÇO (20% DE AÇÚCARES TOTAIS)

[0067] A tabela 4 a seguir resume os parâmetros que foram medidos antes e depois do teste de fermentação usando melaço como fonte de carbono: Tabela 4

CÓDIG PARÂMETROS INICIAIS PARÂMETROS FINAIS O ρ POPULAÇÃ BRI pH ACIDEZ ºGL HORAS DE ρ POPULAÇÃ pH ACIDEZ BRI (g/cm3 O X (% ác. DESTILAD FERMENTAÇÃ (g/cm3 O (% ác. X ) (milhões/mL) acético O O ) (milhões/mL) acético ) ) 1A 1,134 141 32 4,4 0,56 13,0 120 1,036 188 4,6 0,72 17,6 5 4 1B 105 15,1 76 1,025 118 4,6 0,74 17,4 1 2A 1,110 101 27 4,5 0,53 10,4 120 1,027 170 4,4 0,82 14,4 3 3 2B 118 12 42 1,020 183 4,6 0,77 14,0 0 3A 1,108 116 26 4,4 0,71 9,5 120 1,036 191 4,6 0,89 15,8

3B 120 9,7 50 1,040 200 4,6 0,92 15,4 1 4A 1,138 71 33 4,4 0,70 3,8 126 1,109 123 4,4 0,88 28,6 5 9 4B 95 9,2 91 1,067 176 4,4 0,93 22,0 5 5A 1,120 114 29 4,4 0,73 10,2 128 1,036 166 4,6 1,00 16,4 3 1

[0068] Nesse caso, pode-se observar também que o grau de álcool destilado é substancialmente maior no caso da cepa CECT 13152 do que no caso da cepa comercial sob todas as condições testadas.

[0069] A tabela 5 reúne alguns dos parâmetros que demonstram a maior capacidade fermentativa e de produção de álcool da cepa da invenção: Tabela 5 CÓDIGO 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B UNIDADES η TEÓRICO 0,511 0,51 0,51 0,51 0,51 0,51 0,51 0,51 0,51 0,51 g de 1 1 1 1 1 1 1 1 1 EtOH/g de glicose GRAU 13 15,1 10,4 12 9,5 9,7 3,8 9,2 10,2 12 ºGL ALCOÓLICO 102,65 119, 82,1 94,7 75,0 76,5 30,0 72,6 80,5 94,7 g de EtOH DESTILADO 23 2 5 1 9 0 4 4 5 puro/L AÇÚCARES 200,83 233, 160, 185, 146, 149, 58,7 142, 157, 185, g de FERMENTÁVE 28 67 38 76 85 1 13 58 38 açúcares IS SOBRE fermentávei ÁLCOOL s/L AÇÚCARES 250 250 200 200 172 172 250 250 200 200 g/L

FERMENTÁVE IS MEDIDOS

CÓDIGO 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B UNIDADES

POR HPLC CONCENTRA 250 250 200 200 172 172 250 250 200 200 g/L

ÇÃO DE

SUBSTRATO % DE AÇÚCARES FERMENTÁVEIS NO SUBSTRATO ORIGINAL (SEM DILUIÇÃO) TEÓRICO (EM 80 93 80 93 85 87 23 57 79 93 %

RELAÇÃO AO ºGL OBTIDO) REAL (EM 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 %

RELAÇÃO AOS

AÇÚCARES MEDIDOS) η ETANOL MÁXIMO 520 604 520 600 552 564 152 368 510 600 L.A.P./ Tm subtrato Exemplo 3: Capacidade fermentativa do mutante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152.

[0070] Determinou-se a capacidade fermentativa da nova cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 mediante fermentação a partir de substratos amiláceos obtidos a partir de tubérculos, hidrolisados de cereal e de resíduos de frutas. a) Hidrólise do substrato amiláceo

[0071] Uma vez que os açúcares presentes nos substratos amiláceos utilizados se encontram em forma de amido e como a levedura empregada não contém amilases, foi necessário realizar a hidrólise prévia dos mesmos. Além disso, o substrato foi liquefeito depois de misturado com água. Mistura de substrato amiláceo-água

[0072] Os substratos amiláceos utilizados, isto é, o cereal, os tubérculos e os resíduos de frutas, foram triturados e peneirados com um diâmetro de aproximadamente 1 mm e se misturaram com água em uma proporção de 38:62 (substrato: água) (p/p). Liquefação em 2 etapas

[0073] Etapa 1. Adicionou-se 20% da dose total de α-amilase (Liquozyme, 240 KNU/g) a cada uma das misturas e incubou-se durante um período de 45 minutos a 65 ºC de temperatura sob agitação constante, de maneira suficientemente intensa para manter o substrato suspenso.

[0074] Etapa 2. Adicionou-se os 80% restantes da α-amilase (Liquozyme, 240 KNU/g) à mistura e incubou-se durante 30 minutos a uma temperatura de 85 ºC sob agitação constante da mesma maneira que na etapa

1. Autoclave

[0075] Os compostos amiláceos processados foram introduzidos na autoclave e submetidos a uma temperatura de 130 ºC durante 3 minutos. Sacarificação

[0076] Adicionou-se a dose de amiloglicosidase (Spirizyme Fuel) e incubou-se a 65º C durante 90 minutos, mantendo agitação constante, da mesma maneira que nas etapas anteriores.

[0077] A partir dos diferentes substratos, foram realizadas diluições para se obter uma concentração de açúcares de 27%.

[0078] Foram adicionados nutrientes aos meios de fermentação nos casos em que foi necessário. b) Levadura e condições de propagação

[0079] Utilizou-se a levedura mutante Saccharomyces cerevisiae CECT 13152 para realizar a fermentação. Para tanto, realizou-se uma propagação antes da fermentação. A propagação de leveduras foi realizada em duas etapas: uma etapa inicial em YPD e uma segunda etapa em um substrato açucarado da mesma natureza que aquele utilizado na fermentação, em uma concentração de açúcares entre 7 e 8%. A temperatura de propagação foi de

34,5 ºC, a agitação foi de 120 rpm e o pH foi 5. Dependendo do tipo de substrato, foi necessária a adição de sais e vitaminas. O uso de aeração durante essa segunda etapa aumentou consideravelmente o número de células obtidas por mL ao final do processo. c) Condições de fermentação

[0080] A fermentação foi realizada a uma temperatura constante de 35 ºC. Quanto à agitação, o teste foi iniciado sem agitação e assim foi mantido durante a primeira hora. A segunda hora foi programada a 40 rpm. Por último, estabeleceu-se 85 rpm no início da terceira hora e assim foi mantido até o final da fermentação. Ficou definido como fim da fermentação o momento em que a perda de CO2 entre duas medições consecutivas de peso é igual a zero ou quando são ultrapassadas 100 horas de fermentação.

[0081] Os resultados dos testes de fermentação nos diferentes substratos são apresentados a seguir nas tabelas 6 a 8. Tabela 6. Açúcares iniciais (% p/v). Tubérculos Hidrolisados de Resíduos de cereal frutas 27 27 27 Tabela 7. Concentração alcoólica obtida (ºGL) Tubérculos Hidrolisados de Resíduos de cereal frutas 16,1º 16,2º 16,2º Tabela 8. Açúcares finais (% p/v). Tubérculos Hidrolisados de Resíduos de cereal frutas 0,2 <0,1 <0,1

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa, caracterizada pelo fato de que é da espécie Saccharomyces cerevisiae, depositada na Coleção Espanhola de Culturas-Tipo (CECT) sob o número de acesso CECT 13152.

2. Cepa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que se encontra em formato líquido, fresco em pasta, seco ativo ou seco instantâneo.

3. Uso da cepa, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é usada na produção de etanol ou na elaboração de produtos alcoólicos por fermentação.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o etanol é produzido por fermentação alcoólica de resíduos vegetais e resíduos lignocelulósicos.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o produto alcoólico é uma bebida alcoólica.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a bebida alcoólica é vinho, cerveja, cava, sidra ou bebidas destiladas.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a fermentação alcoólica produz etanol a 16 ºGL ou mais ou outros produtos alcoólicos.

8. Uso da cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para panificação.

9. Uso de uma cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a produção de biomassa.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a biomassa tem aplicação como fonte de alimentação animal.

11. Composição microbiológica, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa de acordo com quaisquer das reivindicações 1 e 2 e, opcionalmente, pelo menos um elemento adicional que favorece a produção de álcoois ou de produtos alcoólicos e/ou o processo de fermentação.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que está em formato de composição aquosa diluída, creme, prensada, seca ou liofilizada.