WO2019026800A1 - チオエステル結合加水分解酵素を用いたキラルなカルボン酸化合物の不斉合成方法 - Google Patents

チオエステル結合加水分解酵素を用いたキラルなカルボン酸化合物の不斉合成方法 Download PDF

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一樹 丹羽
直樹 五島
枝里子 福田
太一郎 加藤
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to asymmetric synthesis of the carboxylic acid compound.
  • Optically active biological materials and the like may be useful or harmful only for one enantiomer, and need to be synthesized as a chiral material that does not contain an optical isomer.
  • a reaction having high reaction selectivity or a chemical reaction system having high activity in an aqueous solution (without using an organic solvent) is required, and an enzyme having high selectivity and activity in an aqueous solution the reaction has been developed and put to practical use (for example, non-Patent Document 2).
  • acyl CoA ligase an ATP-dependent acyl coenzyme A ligase as an asymmetric synthesis method of a carboxylic acid compound having an asymmetric carbon at the ⁇ position (hereinafter referred to as carboxylic acid) and its derivative Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide is to provide a novel method of asymmetric synthesis of the carboxylic acid of the chiral objects.
  • the present inventors have a mixture of optical isomers of the thioester compound having a specific structure containing an asymmetric carbon and as a reaction substrate, subjecting it to enzymatic hydrolysis reaction using specific acyl-CoA esterase by, it found that a carboxylic acid of the chiral objects can be asymmetric synthesis.
  • the present invention is based on such novel findings.
  • the present invention will typically provide the invention as defined in the following sections: Item 1.
  • a method for asymmetric synthesis of the carboxylic acid of the chiral objects [In formula, R ⁇ 1 >, R ⁇ 2 >, R ⁇ 3 > and R ⁇ 4 > show hydrogen or a substituent.
  • R 2 and R 3 may form a substituted or unsubstituted ring structure with the carbon atom to which they are attached. However, R 1, R 2, R 3 and CO-S-R 4 are different from each other. ].
  • Item 2 The method according to Item 1, wherein R 1 is hydrogen.
  • R 4 is represented by the following general formula Wherein, R 10 and R 11 are the same or different and are each a hydrogen or an alkyl group.
  • -O-R 12 is a hydroxyl group, a phosphoric acid group-containing functional group or a sulfonic acid group.
  • p represents a natural number of 1 to 6.
  • q is an integer of 0 to 5.
  • r represents a natural number of 1 to 6.
  • the method according to item 1 or 2 which is a group represented by
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein R 1 is hydrogen and -S-R 4 is -S-CoA.
  • R 6 represents a substituent.
  • m is an integer of 0 to 5; when m is 2 or more, R 6 may be the same or different.
  • R 9 is 8. The method according to item 7, which is a group represented by
  • R 3 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, The method according to any one of claim 1-6.
  • a mixture of optical isomers of a thioester of a carboxylic acid having an asymmetric carbon ⁇ -position by subjecting the enzymatic hydrolysis reaction, the carboxylic acid of the chiral objects can be asymmetric synthesis.
  • test result of this-application Example 3 is shown.
  • the test result of this-application Example 4 is shown.
  • the present invention provides an enzyme by at least one acyl-CoA esterase selected from the group consisting of ACOT7 and ACOT13 from a mixture of optical isomers of a thioester compound having an asymmetric carbon at the alpha position represented by the following general formula (I) the hydrolysis reaction, a method of a carboxylic acid of the chiral asymmetric synthesis:
  • R ⁇ 1 >, R ⁇ 2 >, R ⁇ 3 > and R ⁇ 4 > show hydrogen or a substituent.
  • R 2 and R 3 may form a substituted or unsubstituted ring structure with the carbon atom to which they are attached. However, R 1, R 2, R 3 and CO-S-R 4 are different from each other. ] I will provide a.
  • the “substituent” is not particularly limited unless otherwise specified in the present specification, and examples thereof include hydroxyl group, amino group, alkyl, halogen, aryl, arylcarbonyl, aryloxy, Thioaryl, a substituted or unsubstituted 5- to 10-membered unsaturated heterocyclic group having 1 to 3 heteroatoms, and the like can be mentioned.
  • the alkyl include such a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more specifically, for example, methyl, ethyl, n- propyl, isopropyl, 2,2 dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n- butyl, isobutyl, tert- butyl, isopentyl, n- pentyl, a n- hexyl group.
  • the halogen includes fluorine, chlorine, bromine, and iodine.
  • the aryl include an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, more specifically, for example, phenyl, naphthyl, fluorenyl, anthryl, biphenylyl, tetrahydronaphthyl, and the like.
  • arylcarbonyl for example, arylcarbonyl groups such as 7 to 17 carbon atoms having a structure in which an aryl group having 6 to 14 carbon atoms attached to a carbonyl group. More specifically, the aryl carbonyl, aryl as listed above can be exemplified groups such structures attached to a carbonyl group.
  • aryloxy for example, aryl moieties aryloxy such an aryl group having 6 to 14 carbon atoms. More specifically, examples of aryloxy include a aryloxy such an aryl group which aryl moiety listed above.
  • a hetero atom for example, nitrogen, at least one heteroatom selected from the group consisting of sulfur and oxygen (preferably nitrogen and / or sulfur) 1 to 3 (preferably 1 to 2, more preferably such two) having 5-10 membered unsaturated heterocyclic group ring.
  • Unsaturated heterocyclic group having 5 to 10-membered ring having 1-3 heteroatoms which may have a substituent or may be unsubstituted. If unsaturated heterocyclic group having 5 to 10-membered ring having 1-3 heteroatoms has a substituent, the substituent is not particularly limited, but include those described above, for example, hydroxyl, amino group, alkyl, halogen, aryl, arylcarbonyl, aryloxy, thioaryl, and unsaturated heterocyclic group having 5 to 10-membered ring having a substituted or unsubstituted 1-3 hetero atom.
  • R 1 is not particularly limited.
  • R 1 an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 to 3), an amino group, halogen, aryl, arylcarbonyl, aryloxy, thioaryl, substituted Or a 5- to 10-membered unsaturated heterocyclic group having 1 to 3 hetero atoms and the like, and the like; hydrogen, aryl, aryloxy, thioaryl and the like are preferable, and hydrogen, aryl, aryloxy and the like are more preferable. preferably, hydrogen is particularly preferred.
  • R 6 represents a substituent.
  • m represents a natural number of 0 to 5. when m is 2 or more, R 6 may be the same or different. It is preferably a group represented by.
  • R 2 is a group represented by the above general formula (A1)
  • the substituent represented by R 6 is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxyl group, an amino group, halogen, aryl, arylcarbonyl, thioaryl and the like. And halogen, aryl, arylcarbonyl, thioaryl and the like are preferable, and hydroxyl group, amino group, halogen, aryl, arylcarbonyl and the like are more preferable.
  • m is 2 or more in the general formula (A1), it is preferable that at least one R 6 be present at the para position and one or two at the meta position.
  • n is 2 in the general formula (A1) is more preferably R 6 is present, one for para and meta position, in the general formula (A1) m is 2 R 6 is para and more preferably a meta-position to the presence to which and R 5 are bonded one by one.
  • R 5 is a group represented by the general formula (A1-1), as the R 5, there may be mentioned those described above, in the embodiment, it is preferred that R 5 is -O-.
  • R 2 is a group represented by formula (A1-1), examples of substituents represented by R 6, there may be mentioned those described above, in the embodiment, R 6 is a halogen there it is preferable.
  • R 2 is a group represented by general formula (A1)
  • R 6 and R 8 are the same or different and are each a substituent.
  • m ' represents a natural number of 1 to 5.
  • n is an integer of 0 to 4; If m'-1 is 2 or more, R 6 may be the same or different. when n is 2 or more, R 8 may be the same or different.
  • It may be a group represented by
  • R 2 is a group represented by the general formula (A2), as is R 5, there may be mentioned such as those mentioned for the case of a group foregoing R 2 is represented by the general formula (A1), In such embodiments, R 5 is preferably a bond.
  • R 6 is halogen (e.g., fluorine, etc.) it is preferable and the like.
  • R 8 When R 2 is a group represented by general formula (A2), examples of R 8 include a hydroxyl group, an amino group, a halogen, an aryl, an arylcarbonyl, a thioaryl and the like, with a hydroxyl group and the like being preferable.
  • R 2 is a group represented by general formula (A2)
  • m is a natural number of 1 to 5, preferably 1 to 3, and more preferably 1 to 2.
  • n is an integer of 0 to 4, preferably 0 to 1, and more preferably 0.
  • examples of substituents represented by R 3 are not particularly limited, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 to 3, more preferably 1) amino group and the like, carbon C 1-6 alkyl group (preferably 1 to 3, more preferably 1) amino groups are preferable, 1 to 6 carbon atoms alkyl groups are more preferable (preferably 1 to 3, more preferably 1) .
  • R 2 is a group represented by the above general formula (A1)
  • examples of a combination of R 1 , R 2 and R 3 include R 1 is hydrogen, hydroxyl, amino, halogen, aryl, arylcarbonyl, or a thioaryl
  • Is a group R 2 is represented by the general formula (A2)
  • Number R 3 is C 1 -C 6 alkyl group (preferably 1 to 3, more preferably 1), a hydroxyl group, an amino group, a halogen, aryl, arylcarbonyl, or combinations are thioaryl is preferred
  • R 1 is hydrogen
  • Is a group R 2 is represented by the general formula (A2)
  • More preferred is a combination wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 to 3 and more preferably 1).
  • R 2 and R 3 may form a ring structure together with the carbon atoms to which they are attached.
  • a ring structure is not particularly limited as long as it has one carbon atom corresponding to ⁇ carbon, and may be a hydrocarbon ring or a heterocycle having at least one carbon atom. More specifically, for example, as such a ring structure, in a 3- to 6-membered hydrocarbon ring such as cyclopentane, cyclobutane, cyclopentane, cyclohexane, cyclohexene, dihydroquinoline and the like, one of the hydrocarbon rings has.
  • the following formula together with the carbon atom to which R 2 and R 3 which they are attached (A3) [Wherein, R 9 represents hydrogen or a substituent. ] And may form a ring structure represented by
  • the substituent represented by R 9, a substituted or unsubstituted 1-3 5-10 membered unsaturated heterocyclic ring group having a hetero atom, 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 And 3) alkyl groups of ⁇ , hydroxyl group, amino group, halogen, aryl, arylcarbonyl, thioaryl and the like, and substituted or unsubstituted 5- to 10-membered unsaturated heterocyclic group having 1 to 3 hetero atoms etc. are preferred.
  • R 9 is, in the case of unsaturated heterocyclic group having 5 to 10-membered ring having 1-3 heteroatoms having a substituent, 5-10-membered ring having 1-3 heteroatoms unsaturated heterocycle the group, benzothiazole and the like.
  • the substituent is not particularly limited, and examples thereof include aryl, hydroxyl group and the like, and hydroxyl group etc. are preferred.
  • R 9 is And a group represented by
  • R 4 has the following general formula Wherein, R 10 and R 11 are the same or different and are each a hydrogen or an alkyl group.
  • -O-R 12 is a hydroxyl group, a phosphoric acid group-containing functional group or a sulfonic acid group.
  • p represents a natural number of 1 to 6.
  • q is an integer of 0 to 5.
  • r represents a natural number of 1 to 6. ] In group and the like represented.
  • p is an integer of 1 to 6, preferably 1 to 3, more preferably shows a 2.
  • q represents an integer of 0 to 5, preferably 1 to 3, more preferably shows a 2.
  • r represents an integer of 1 to 6, preferably 1 to 3, more preferably shows a 2.
  • R 10 and R 11 are the same or different, hydrogen or an alkyl group (preferably having a carbon number of 1 to 6, more preferably 1 to 3 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 1 carbon atom) It is shown.
  • the phosphate group-containing functional group is a phosphate group
  • the following general formula (C1) [Wherein, s represents a natural number of 1 to 3.
  • X represents an optionally nucleoside group optionally substituted with a phosphate group. ] In group and the like represented.
  • a nucleoside group means a monovalent group in which a hydrogen contained in a hydroxyl group at the 5-position of a nucleoside is released. Accordingly, in the group represented by the general formula (C1), when X is a nucleoside group, The moiety attached to the 5-position of the nucleoside group.
  • the nucleoside group include an adenosyl group, a guanosyl group, a uridyl group, a cytidyl group and the like.
  • s represents an integer of 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 2.
  • nucleoside groups may be substituted with a phosphate group.
  • 2-position of the hydroxyl groups of these nucleoside groups may be substituted with a phosphate group.
  • -S-R 4 is -S-CoA, and thus -S-R 4 is a group represented by the following formula:
  • the thioester compound having an asymmetric carbon at the alpha position represented by the general formula (I) is subjected to enzymatic hydrolysis by at least one acyl CoA esterase selected from the group consisting of ACOT7 and ACOT13.
  • acyl CoA esterase selected from the group consisting of ACOT7 and ACOT13.
  • a mixture of optical isomers is a mixture of a predetermined chiral substance and its optical isomer, and typically, the excess of a predetermined chiral substance is 20% or less, for example, 10%. ee or less, more typically racemic.
  • the predetermined chiral substance in the mixture of optical isomers is 0% or less, -10% or less, -20% or less, etc. in excess of the predetermined chiral substance. it may be.
  • asymmetric synthesis means that the ratio of one kind of chiral substance among mixtures of optical isomers including optical isomers is significantly higher than that of other isomers, typically is more ee an excess of a given chiral 50%, preferably at least ee 75% more preferably 90% ee or more, more preferably means that a higher 99% ee.
  • chiral objects can be calculated from the following equation: .
  • the acyl-CoA esterase used in the present invention includes, for example, acyl-coenzyme A thioesterase 7 (ACOT7).
  • ACOT7 is a kind of human acyl-CoA thioesterase, and can be prepared by E. coli, yeast, protein expression system by animal cells, or cell-free protein expression system.
  • ACOT7 includes those having the amino acid sequence shown in Genbank Accession No. NP — 009205.
  • ACOT7 those having the amino acid sequence shown below:
  • ACOT7 is known to have a characteristic motif in the following amino acid sequence (i): (I) RPDDANVAGN VHGGTILKMI EEAGAIISTR HCNSQNGERC VAALARVERTDFLSPMCIGE VAHVSAEITY TSKHSVEVQV NVMSENI and (SEQ ID NO: 2) LHGFVHGGVT MKLMDEVAGI VAARHCKTNI VTASVDAINF HDKIRKGCVI TISGRMTFTS NKSMEIEVLV DA (SEQ ID NO: 3) Therefore, in the present invention, as the acyl CoA esterase ACOT7, one having the amino acid sequence shown in the above (i) can also be used.
  • ACOT7 includes not only amino acid sequences represented by Genbank Accession No. NP — 009205; amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1; or amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2 and 3; To the extent that the effects of the invention can be obtained, one or several (for example, 1 to 5, 1 to 3, 1 etc.) amino acids in the amino acid sequence of any of these can be deleted, substituted, inserted or Also included are those containing added amino acid sequences.
  • the acyl-CoA esterase used in the present invention also includes, for example, acyl-coenzyme A thioesterase 13 (ACOT13).
  • ACOT13 is a kind of human acyl-CoA thioesterase and can be prepared by a protein expression system using E. coli.
  • the ACOT13 those having the amino acid sequence shown in Genbank Accession No. NP_060943. More specifically, ACOT 13 includes those having the amino acid sequence shown below:
  • ACOT 13 is not limited to those having the amino acid sequence represented by Genbank Accession No. NP — 060943; or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and the like, as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • amino acid sequences include amino acid sequences in which one or several (eg, 1 to 5, 1 to 3, 1 etc.) amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • Ru thioesterases
  • various ones can be used, such as those derived from mammals such as humans, mice and rats; from fish such as zebra fish and medaka; insects such as silkworms, Drosophila and stamens.
  • the method of the present invention comprises a step of a thioester compound, subjected to enzymatic hydrolysis with an asymmetric carbon position ⁇ represented by the following general formula (I).
  • the reaction is usually carried out in a solution prepared by dissolving or dispersing the thioester compound in a solvent such as water.
  • a solvent such as water.
  • the density of the thioester compound is not particularly limited, for example, 0.1 ⁇ 1000 mM, preferably, can be appropriately set within a range of 10 ⁇ 100 mM.
  • an enzyme in the reaction system for example, 1 ng / mL ⁇ 1 mg / mL, preferably, can be appropriately set in the range of 10 ng / mL ⁇ 1 ⁇ g / mL.
  • reaction time particularly even, for example, 5 to 60 minutes, preferably, can be appropriately set in the range of 10 to 30 minutes.
  • reaction temperature is not particularly limited, for example, 20 ⁇ 40 ° C., preferably, can be appropriately set within a range of 30 ⁇ 37 ° C..
  • the pressure during the reaction is not particularly limited, normal pressure, under pressure, may be carried out either under reduced pressure.
  • thioester moiety of the thioester compound represented by the general formula (I) is a carboxyl group.
  • thioester reaction to proceed preferentially to one of the general formulas optical isomer contained in the mixture of the optical isomers of the thioester compound represented by the formula (I) the chiral Carboxylic acids can be asymmetrically synthesized.
  • the reaction proceeds, the proportion of the other thioester compounds remaining relative Can be high.
  • the thioester of a carboxylic acid having an asymmetric carbon in ⁇ -position, stereoselectively by hydrolyzing only one of the optical isomers can be synthesized chiral carboxylic acid .
  • the chiral carboxylic acid obtained in this way can be used as intermediates for the preparation of fine chemicals, or their various pharmaceuticals and physiologically active substances and a chiral liquid crystal material.
  • asymmetric synthesis methods of the present invention, for producing these compounds are useful.
  • thioester compounds having a structure similar CoA or to (in the present specification may indicate a CoA thioester compound) or the like can be readily racemized in comparison with carboxylic acid It is preferable because it exists.
  • thioester compound represented by a compound liable racemized compound of who thioester hydrolysis hardly proceeds in the optical isomers by racemization, the other optical isomer. Accordingly, in such embodiments, since the optical resolution proceeds accompanied by racemization, it can be performed an optical resolution at a higher resolution, preferred. Further, in a preferred embodiment of the present invention, it is also possible to promote racemization of thioester compound further represented by formula (I) by epimerase.
  • Racemic a CoA thioester compounds are capable of organic synthesis from racemic carboxylic acid and CoA as a source, if stereoselectively hydrolyzing this compound, to synthesize a chiral carboxylic acid without the use of ATP it can. If the resulting carboxylic acid is insoluble in water, it is possible to separate the intended enzyme by liquid phase separation from the aqueous reaction solution containing CoA, etc., it can be provided a less expensive asymmetric synthesis system become.
  • thioester hydrolase (thioesterase) has not been reported with having stereoselectivity.
  • the CoA thioester compound is capable of readily racemized in comparison with carboxylic acid, it is also possible to further promote racemization by epimerase.
  • the thioesterase having stereoselectivity constructed without optical resolution accompanied by racemization, the so-called Dynamic Kinetic Resolution of (DKR) reaction system, using a stereoselective CoA ligase it also becomes possible, to synthesize an optically active carboxylic acid in a theoretical yield of 100% is also possible, therefore, the present invention is very useful from this point to.
  • DKR Dynamic Kinetic Resolution of
  • Example 1 Add 10 ⁇ L of 2 mM flurbiprophenyl-CoA aqueous solution and 100 L of 0.1 M Tris-HCl [pH 8] buffer to a 1.5 mL plastic tube and mix, add 10 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL ACOT7 aqueous solution to that, and bring to room temperature I left for 2 hours.
  • ACOT7 uses an entry clone (FLJ32606AAAN) in which the ORF sequence is cloned, and a destination vector for N-terminal side GST-tag, FLAG-tag fusion, according to the method described in Non-patent Document 1, wheat germ extract (WEPRO7240G , it was carried out protein synthesis using a cell-free Science).
  • R- flurbiprofen is selectively produced by the addition of the enzyme ACOT7, its enantiomer excess was 100% ee.
  • ACOT2 instead of enzyme ACOT7, ACOT4, ACOT8, ACOT9, ACOT11, ACOT12 except for using, generating flurbiprofen in the same manner as described above, were analyzed optical purity.
  • the enantiomeric excess of the ACOT9 is a mere ee 46%.
  • ACOT2, ACOT4, ACOT8, ACOT11, and for ACOT12 the reaction itself did not proceed.
  • the enzyme luciferase was prepared by introducing an expression vector into which a gene derived from Genji firefly was introduced into E.

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Abstract

下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物のラセミ体から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ－Ｓ－Ｒ4は互いに異なる。]

Description

チオエステル結合加水分解酵素を用いたキラルなカルボン酸化合物の不斉合成方法
　本発明は、カルボン酸化合物の不斉合成方法に関する。
　光学活性な生体物質などは、片方のエナンチオマーのみが有用あるいは有害であることがあり、光学異性体を含まないキラルな物質として合成する必要がある。その方法のひとつとして不斉合成があり、立体選択的な化学反応により、光学異性体を作り分ける方法として実用化されている（例えば非特許文献１）。
　一方、化学合成産業では、反応選択性が高い反応、あるいは水溶液中（有機溶剤を使わない）で高い活性を有する化学反応系が求められており、水溶液中で高い選択性、活性を有する、酵素反応が開発され、実用化されている（例えば非特許文献2）。
　また、キラルな化合物を合成する不斉合成反応のひとつとして、触媒となる酵素の立体選択性を利用した酵素不斉合成反応がある。その一つとして、α位に不斉炭素を有するカルボン酸化合物（以下カルボン酸）およびその誘導体の不斉合成法として、ATP依存性アシルコエンザイムAリガーゼ（アシルCoAリガーゼ）を用いた方法がある（例えば特許文献１）。この方法では、ラセミ体のカルボン酸をアシルCoAリガーゼにより補酵素A（CoA）と脱水縮合したCoAチオエステル化合物に変換する際、カルボン酸の片方の光学異性体が選択的に反応することにより、キラルなCoAチオエステル化合物を合成する。この方法は水溶液中で進行するため、有機溶剤が不要であるなどのメリットがある。
　しかしこの酵素反応は補因子として高価なATPが必要である。また反応生成物であるキラルなCoAチオエステル化合物がエノール化によりラセミ化しやすく、光学純度を高い状態で維持できない場合がある。このような場合は、未反応で残ったカルボン酸のみがキラルであり利用可能であるが、必然的に回収率は50%以下となる。反応生成物であるCoAチオエステル化合物がラセミ化しにくく、キラルな化合物として利用できる場合でも、CoAチオエステル化合物が水溶性であるため、その分離精製が煩雑になり多くの時間と費用が必要になるという問題もある。
　アシルCoAリガーゼによる酵素反応に、チオエステル加水分解酵素（チオエステラーゼ）を組合せ、ラセミ化を伴いながらの光学分割、いわゆるDynamic Kinetic Resolution(DKR)反応系を構築することにより、理論上100%の収率にて光学活性なカルボン酸を合成する方法もある（非特許文献３および非特許文献４）。しかしこれらの方法では、立体選択性を有さないあるいは極めて低いチオエステラーゼを用いているため、アシルCoAリガーゼによる立体選択的酵素反応を繰り返す必要があり、多量のアシルCoAリガーゼの添加が必要である。更に中間体となるCoAチオエステル化合物のラセミ化が進行しにくい場合、エピメラーゼを加える必要があり、この場合３種類の酵素を共存下での反応となり、反応条件の最適化および制御が必要で、多くの時間と費用が必要となるという問題がある。
加藤太一郎, 太田博道, 宮本憲二, 場家幹雄 「ルシフェラーゼを用いる光学活性なカルボン酸の製造方法」特開2007-29017.
"酵素を用いて鏡像異性体を分ける，創る，速度論的分割の力", 古田未有ら, 生物工学会誌, 2014, 92(6), 298-302. 小宮山眞監修：酵素利用技術体系～基礎・解析から改変・高機能化・産業利用まで～，p.434-438，エヌ・ティー・エス出版 (2010). Juri Maeda, Dai-ichiro Kato, Masatoshi Okuda, Masahiro Takeo, Seiji Negoro, Kazunari Arima, Yuji Ito, Kazuki Niwa, "Biosynthesis-inspired deracemizative production of D-luciferin by combining luciferase and thioesterase" BBA - General Subjects 1861, 2112-2118 (2017) Xiao Qu, Amanda Allan, Grace Chui, Thomas J. Hutchings, Ping Jiao, Lawrence Johnson, Wai Y. Leung, Portia K. Li, Georgina R. Steel, Andrew S. Thompson, Michael D. Threadgill, Timothy J. Woodman, Matthew D. Lloyd, "Hydrolysis of ibuprofenoyl-CoA and other 2-APP-CoA esters by human acyl-CoA thioesterase-1 and -2 and their possible role in the chiral inversion of profens" Biochemical Pharmacology 86, 1621-1625 (2013)
　本発明が解決しようとする課題は、キラル体のカルボン酸を不斉合成する新規の方法を提供することである。
　かかる状況の下、本発明者らは、不斉炭素を含む特定の構造を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物を反応基質とし、これを特定のアシルＣｏＡエステラーゼを用いた酵素加水分解反応に供することにより、キラル体のカルボン酸を不斉合成することができることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。
　従って、本発明は、典型的には、以下の項に規定する発明を提供する：
　項１．下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。
Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。
ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ－Ｓ－Ｒ4は互いに異なる。]。
　項２．Ｒ1が水素である、項１に記載の方法。
　項３．Ｒ4が、下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基を示す。－Ｏ－Ｒ12は、水酸基、リン酸基含有官能基又はスルホン酸基を示す。ｐは１～６の自然数を示す。ｑは０～５の整数を示す。ｒは１～６の自然数を示す。］
で表される基である、項１又は２に記載の方法。
　項４．Ｒ1が水素であり、－Ｓ－Ｒ4が－Ｓ－ＣｏＡである、項１～３のいずれか１項に記載の方法。
　項５．Ｒ2が下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、Ｒ5は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示す。Ｒ6は置換基を示す。ｍは０～５の整数を示す。ｍが２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。］
で表される基である、項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　項６．Ｒ2が下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、Ｒ5及びＲ7は、同一又は異なって、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示す。Ｒ6及びＲ8は、同一又は異なって、置換基を示す。ｍ'は１～５の自然数を示す。ｎは０～４の整数を示す。ｍ'－１が２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。ｎが２以上の場合、Ｒ8は同一でも異なってもよい。］
で表される基である、項５に記載の方法。
　項７．Ｒ2及びＲ3がこれらが結合する炭素原子と共に下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、Ｒ9は水素又は置換基を示す。］
で示される環構造を形成している、項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　項８．Ｒ9が
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 で示される基である、項７に記載の方法。
　項９．Ｒ3が炭素数１～６のアルキル基である、項１～６のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、α位に不斉炭素を有するカルボン酸のチオエステル体の光学異性体の混合物を酵素加水分解反応に供することにより、キラル体のカルボン酸を不斉合成することができる。
本願実施例３の試験結果を示す。 本願実施例４の試験結果を示す。
　本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。
Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ－Ｓ－Ｒ4は互いに異なる。]
を提供する。
　チオエステル化合物
　本発明において、「置換基」としては、本明細書中でそうでないことが明記されない限り、特に限定されず、例えば、水酸基、アミノ基、アルキル、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、アリールオキシ、チオアリール、置換又は無置換の１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基等が挙げられる。
　また、Ｒ2で示される「置換基」には、本明細書中でそうでないことが明記されない限り、前述した一般式（Ａ１）で表される基、前述した一般式（Ａ２）で表される基等も包含される。また、Ｒ4で示される「置換基」には、前述した一般式（Ｂ１）で表される基等も包含される。
　本発明において、アルキルとしては、炭素数１～６の直鎖又は分枝鎖状アルキル基等が挙げられ、より具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル基等を挙げることができる。
　ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
　アリールとしては、炭素数６～１４のアリール基等が挙げられ、より具体的には、例えば、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル等が挙げられる。
　アリールカルボニルとしては、例えば、炭素数６～１４のアリール基がカルボニル基に結合した構造を有する炭素数７～１７のアリールカルボニル基等が挙げられる。より具体的には、アリールカルボニルとしては、前記に列挙したアリールがカルボニル基に結合した構造の基等を挙げることができる。
　アリールオキシとしては、例えば、アリール部分が炭素数６～１４のアリール基であるアリールオキシ等が挙げられる。より具体的には、アリールオキシとしては、アリール部分が前記に列挙したアリール基であるアリールオキシ等を挙げることができる。
　１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基としては、例えば、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子（好ましくは窒素及び／又は硫黄）を１～３個（好ましくは１～２個、より好ましくは２個）有する５～１０員環の不飽和複素環基等が挙げられる。より具体的には、１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基としては、チエニル、ピロリル、フリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、トリアゾロピリジル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル（例えば、ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル等）キノリル、イソキノリル等が挙げられる。
　１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基は、置換基を有していても、無置換であってもよい。１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基が置換基を有する場合、置換基としては、特に限定されず、前述のものが挙げられるが、例えば、水酸基、アミノ基、アルキル、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、アリールオキシ、チオアリール、置換又は無置換の１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基等が挙げられる。１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基が置換基としてさらに「置換基を有する１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基」を有する場合、当該不飽和複素環基に置換基として結合した不飽和複素環基がさらに有する置換基としては、前述の置換基のうち、「置換又は無置換の１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基」以外のものを挙げることができる。
　本発明において、Ｒ1としては、特に限定されないが、例えば、水素、炭素数１～６（好ましくは１～３）のアルキル基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、アリールオキシ、チオアリール、置換又は無置換の１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基等が挙げられ、水素、アリール、アリールオキシ、チオアリール等が好ましく、水素、アリール、アリールオキシ等がより好ましく、水素が特に好ましい。
　本発明において、Ｒ2としては、例えば、下記一般式（Ａ１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ［式中、Ｒ5は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示す。Ｒ6は置換基を示す。ｍは０～５の自然数を示す。ｍが２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。］で表される基であることが好ましい。
　Ｒ2が上記一般式（Ａ１）で表される基である場合、Ｒ5は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－であり、好ましくは、結合、－Ｏ－又は－Ｓ－であり、より好ましくは結合又は－Ｏ－であり、さらに好ましくは結合である。
　Ｒ2が上記一般式（Ａ１）で表される基である場合、Ｒ6で示される置換基としては、特に限定されないが、例えば、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が挙げられ、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が好ましく、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル等がより好ましい。一般式（Ａ１）においてｍが２以上の場合、Ｒ6は、少なくともパラ位に１個及びメタ位に１又は２個、存在していることが好ましい。また、一般式（Ａ１）においてｍが２でありＲ6がパラ位及びメタ位に１個ずつ存在していることがより好ましく、一般式（Ａ１）においてｍが２でありＲ6がパラ位及びメタ位に１個ずつ存在しておりかつＲ5が結合であることがさらに好ましい。
　本発明の上記実施形態において、好ましくは、Ｒ2は、下記一般式（Ａ－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［式中、Ｒ5は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示す。Ｒ6は置換基を示す。］
で表される基を示す。
　Ｒ2が一般式（Ａ１－１）で表される基である場合、Ｒ5としては、前述のものが挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ5は－Ｏ－であることが好ましい。
　また、Ｒ2が一般式（Ａ１－１）で表される基である場合、Ｒ6で示される置換基としては、前述のものが挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ6はハロゲンであることが好ましい。
　また、Ｒ2が一般式（Ａ１）で表される基である場合における別の好ましい実施形態としては、Ｒ2は下記一般式（Ａ２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［式中、Ｒ5及びＲ7は、同一又は異なって、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示す。Ｒ6及びＲ8は、同一又は異なって、置換基を示す。ｍ'は１～５の自然数を示す。ｎは０～４の整数を示す。ｍ'－１が２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。ｎが２以上の場合、Ｒ8は同一でも異なってもよい。］
で表される基であってもよい。
　Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ5としては、前述のＲ2が一般式（Ａ１）で表される基である場合について挙げたもの等が挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ5は結合であることが好ましい。
　Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ6で示される置換基としては、ハロゲン等が挙げられるが、当該実施形態においては、Ｒ6はハロゲン（例えば、フッ素等）等であることが好ましい。
　Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ7は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示し、結合又は－Ｃ（＝Ｏ）－が好ましい。
　Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、Ｒ8としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が挙げられ、水酸基等が好ましい。
　Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、ｍは、１～５の自然数を示し、１～３が好ましく、１～２がより好ましい。
　Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、ｎは、０～４の整数を示し、０～１が好ましく、０がより好ましい。
　Ｒ2が一般式（Ａ２）で表される基である場合、ｍ'、Ｒ6及びＲ7の好ましい組み合わせとしては、ｍ'が１であり（従ってＲ6が存在しない）かつＲ7が－Ｃ（＝Ｏ）－である組み合わせ；ｍ'が２～３（好ましくは２）であり、Ｒ6が前記ハロゲンでありかつＲ7が結合である組み合わせ等が挙げられる。
　本発明において、Ｒ3で示される置換基としては、特に限定されないが、例えば、炭素数１～６（好ましくは１～３、より好ましくは１）のアルキル基、アミノ基等が挙げられ、炭素数１～６（好ましくは１～３、より好ましくは１）のアルキル基、アミノ基等が好ましく、炭素数１～６（好ましくは１～３、より好ましくは１）のアルキル基等がより好ましい。
　本発明のうち、Ｒ2が前記一般式（Ａ１）で表される基である実施形態において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の組み合わせとしては、
Ｒ1が水素、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、又はチオアリールであり、
Ｒ2が前記一般式（Ａ２）で表される基であり、
Ｒ3が炭素数１～６（好ましくは１～３、より好ましくは１）のアルキル基、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、又はチオアリールである組み合わせが好ましく；
Ｒ1が水素であり、
Ｒ2が前記一般式（Ａ２）で表される基であり、
Ｒ3が炭素数１～６（好ましくは１～３、より好ましくは１）のアルキル基である組み合わせがより好ましい。
　また、本発明の別の実施形態においては、Ｒ2及びＲ3は、これらが結合する炭素原子と共に環構造を形成してもよい。かかる環構造は、α炭素に対応する炭素原子を１個有している限り特に限定されず、炭化水素環でも炭素原子を少なくとも１個有する複素環でもよい。より具体的には、例えば、かかる環構造としては、シクロペンタン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、ジヒドロキノリン等の３～６員環の炭化水素環において、当該炭化水素環が有する１個の炭素に結合する２個の水素が外れてなる二価の基；ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、チアゾリン、ピロリジン等の１～３個のヘテロ原子を有し、（α炭素に対応する）－ＣＨ2－構造を含む５～１０員環の不飽和複素環等が挙げられる。好ましい実施形態においては、Ｒ2及びＲ3がこれらが結合する炭素原子と共に下記一般式（Ａ３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 ［式中、Ｒ9は水素又は置換基を示す。］
で示される環構造を形成してもよい。
　当該実施形態において、Ｒ9で示される置換基としては、置換又は無置換の１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基、炭素数１～６（好ましくは１～３）のアルキル基、水酸基、アミノ基、ハロゲン、アリール、アリールカルボニル、チオアリール等が挙げられ、置換又は無置換の１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基等が好ましい。
　Ｒ9が、置換基を有する１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基の場合、１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基としては、ベンゾチアゾール等が挙げられる。１～３個のヘテロ原子を有する５～１０員環の不飽和複素環基がさらに置換基を有する場合、当該置換基としては、特に限定されないが、例えば、アリール、水酸基等が挙げられ、水酸基等が好ましい。
　本発明の好ましい実施形態において、Ｒ9としては、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 で示される基が挙げられる。
　本発明の好ましい実施形態において、Ｒ4としては、下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 ［式中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基を示す。－Ｏ－Ｒ12は、水酸基、リン酸基含有官能基又はスルホン酸基を示す。ｐは１～６の自然数を示す。ｑは０～５の整数を示す。ｒは１～６の自然数を示す。］
で表される基等が挙げられる。
　ｐは１～６の自然数を示し、好ましくは１～３を示し、より好ましくは２を示す。ｑは０～５の整数を示し、好ましくは１～３を示し、より好ましくは２を示す。ｒは１～６の自然数を示し、好ましくは１～３を示し、より好ましくは２を示す。ｒが２以上の場合、複数のｐは同一でも異なっても良い。またｒが２以上の場合、複数のｑは同一でも異なっても良い。
　式（Ｂ１）中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基（好ましくは炭素数１～６、より好ましくは炭素数１～３、さらに好ましくは炭素数１のアルキル基）を示す。
　リン酸基含有官能基としては、リン酸基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 下記一般式（Ｃ１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 ［式中、ｓは、１～３の自然数を示す。Ｘは、リン酸基で置換されていてもよいヌクレオシド基を示す。］
で表される基等が挙げられる。
　本発明において、ヌクレオシド基とは、ヌクレオシドの５位の水酸基に含まれる水素が外れてなる一価の基を意味する。従って、一般式（Ｃ１）で表される基において、Ｘがヌクレオシド基の場合、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 の部分は、当該ヌクレオシド基の５位に結合する。
ヌクレオシド基としては、アデノシル基、グアノシル基、ウリジル基、シチジル基等が挙げられる。
　ｓは、１～３の自然数を示し、好ましくは１～２であり、より好ましくは２である。
　また、これらのヌクレオシド基は、リン酸基で置換されていてもよい。典型的には、これらのヌクレオシド基の２位の水酸基がリン酸基で置換されていてもよい。
　本発明において、－Ｓ－Ｒ4が、－Ｓ－ＣｏＡであること、従って、－Ｓ－Ｒ4が、下記式で示される基であることが好ましい：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　酵素加水分解反応
　本発明の方法においては、一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物をＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応に供することにより、上記チオエステル化合物の光学異性体の混合物からキラル体のカルボン酸を不斉合成することができる。
　本発明において、光学異性体の混合物とは、所定のキラル体とその光学異性体との混合物であって、典型的には、所定のキラル体の過剰率が20%ee以下、例えば、10%ee以下、より典型的にはラセミ体を示す。また、別の実施形態において本発明において光学異性体の混合物中の所定のキラル体が、所定のキラル体の過剰率が0%ee以下、-10%ee以下、-20%ee以下等であってもよい。本発明において、不斉合成とは、光学異性体を含む光学異性体の混合物から、そのうちの１種類のキラル体の割合を、その他の異性体より有意に高くすることを意味し、典型的には、所定のキラル体の過剰率を50%ee以上、好ましくは75%ee以上、より好ましくは90%ee以上、さらに好ましくは99%ee以上とすることを意味する。ここでキラル体の過剰率は、以下の式から算出することができる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000024
 。
　本発明において用いるアシルＣｏＡエステラーゼとしては、例えば、acyl-coenzyme A thioesterase 7（ＡＣＯＴ７）が挙げられる。ＡＣＯＴ７はヒトのアシルＣｏＡチオエステラーゼの一種で、大腸菌や酵母、動物細胞によるタンパク質発現系、あるいは無細胞タンパク質発現系により調製できる。ＡＣＯＴ７としては、Genbank Accession No. NP_009205で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。より具体的には、ＡＣＯＴ７としては、下記に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
 　ここで、ＡＣＯＴ７は、下記アミノ酸配列（ｉ）の部分に特徴的なモチーフを有することが知られている：
（ｉ）RPDDANVAGN VHGGTILKMI EEAGAIISTR HCNSQNGERC VAALARVERTDFLSPMCIGE VAHVSAEITY TSKHSVEVQV NVMSENI及び（配列番号２）LHGFVHGGVT MKLMDEVAGI VAARHCKTNI VTASVDAINF HDKIRKGCVI TISGRMTFTS NKSMEIEVLV DA（配列番号３）
　従って、本発明においては、アシルＣｏＡエステラーゼＡＣＯＴ７として、上記（ｉ）で示されるアミノ酸配列を有するもの等を用いることもできる。また、本発明において、ＡＣＯＴ７には、Genbank Accession No. NP_009205で示されるアミノ酸配列；配列番号１で示されるアミノ酸配列；または配列番号２及び３で示されるアミノ酸配列を有するもの等だけでなく、本発明の効果が得られる範囲において、これらのいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、１～５個、１～３個、１個等）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものも包含される。
　また、本発明において用いるアシルＣｏＡエステラーゼとしては、例えば、acyl-coenzyme A thioesterase 13（ＡＣＯＴ１３）も挙げられる。ＡＣＯＴ１３はヒトのアシルＣｏＡチオエステラーゼの一種で、大腸菌を用いたタンパク質発現系により調製できる。ＡＣＯＴ１３としては、Genbank Accession No. NP_060943で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。より具体的には、ＡＣＯＴ１３としては、下記に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
 　また、本発明において、ＡＣＯＴ１３には、Genbank Accession No. NP_060943で示されるアミノ酸配列；又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するもの等だけでなく、本発明の効果が得られる範囲において、これらのいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、１～５個、１～３個、１個等）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものも包含される。これらのチオエステラーゼとしては、ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物由来；ゼブラフィッシュ、メダカ等の魚類由来；カイコ、ショウジョウバエ、コクゾウムシ等　昆虫由来等、様々なものを用いることができる。
　ここで、ＡＣＯＴシリーズのタンパク質としてはＡＣＯＴ１～１３の１３種類が知られている。下記表３にＡＣＯＴシリーズのタンパク質の相同性計算の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
 　本発明者らは、多種多様な酵素を用いた反応を鋭意検討した結果、ＡＣＯＴシリーズのうち、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３を用い、反応基質として前述の化合物を用いた場合に、立体選択性が非常に高い反応を実現できることを見出した。
上記表１に示すように、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３は、いずれも他のＡＣＯＴシリーズに対し相同性が低く、構造的に大きく異なっている。また、本願実施例に示すように、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３は、いずれも他のＡＣＯＴシリーズと比較して、機能（反応性、立体選択性）の点でも大きく異なる。
　本発明の方法は、下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物を、酵素加水分解反応に供する工程を含む。
　当該反応は、通常、水等の溶媒に上記チオエステル化合物を溶解又は分散した液で行われる。上記チオエステル化合物の濃度は特に限定されないが、例えば、0.1 ～1000 ｍＭ、好ましくは、10 ～100 ｍＭの範囲で適宜設定できる。また、反応系中の酵素の配合量も特に限定されないが、例えば、1 ng/mL～1 mg/mL、好ましくは、10 ng/mL～1 μg/mLの範囲で適宜設定できる。反応時間も特に限定されないが、例えば、5～60分、好ましくは、10～30分の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、20～40℃、好ましくは、30～37℃の範囲で適宜設定できる。反応時の圧力も特に限定されず、常圧、加圧下、減圧下のいずれで行ってもよい。
　当該反応により、一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物のチオエステル部分がカルボキシル基になる。ここで、本発明においては、チオエステル反応は、一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物の光学異性体の混合物に含まれる光学異性体のうち一方に対し優先的に進行するため、キラル体のカルボン酸を不斉合成することができる。また、本発明において、前記チオエステル化合物の光学異性体の混合物に含まれる光学異性体のうち一方に対し優先的に進行するため、反応が進むと、残存するもう一方のチオエステル化合物の割合が相対的に高くなり得る。
　従って、本発明によれば、α位に不斉炭素を有するカルボン酸のチオエステル体を、立体選択的に片方の光学異性体のみを加水分解することで、キラルなカルボン酸を合成することができる。このように得られるキラルなカルボン酸は、各種医薬品・生理活性物質やキラル液晶材料などのファインケミカル、又はそれらを製造するための中間体として用いられ得る。従って、本発明の不斉合成方法は、それらの化合物を製造するのに、有用である。
　本発明において、例えば、ＣｏＡ又はこれに類似する構造を有するチオエステル化合物（本明細書においてＣｏＡチオエステル化合物と示すこともある）等は、一般的に、カルボン酸に比べて容易にラセミ化が可能であるため好ましい。一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物がラセミ化し易い化合物である場合、光学異性体のうちチオエステル加水分解が進行しにくい方の化合物がラセミ化により、もう一方の光学異性体となる。従って、かかる実施形態においては、光学分割がラセミ化を伴いながら進むため、より高い分離能で光学分割を行うことができ、好ましい。また、本発明の好ましい実施形態において、更にエピメラーゼにより一般式（Ｉ）で表されるチオエステル化合物のラセミ化を促進させることもできる。
　ラセミなCoAチオエステル化合物は元となるラセミなカルボン酸とCoAから有機合成することが可能であり、このものを立体選択的に加水分解できれば、ATPを用いることなくキラルなカルボン酸を合成することができる。生成するカルボン酸が非水溶性であれば、このものを液相分離により酵素、CoA等を含む反応水溶液から分離することが可能であり、より安価な不斉合成反応系を提供することが可能になる。
　これまで、チオエステル加水分解酵素（チオエステラーゼ）が立体選択性を有するとの報告はされていなかった。またCoAチオエステル化合物はカルボン酸に比べて容易にラセミ化が可能であり、更にエピメラーゼによりラセミ化を促進させることも可能である。このような特性を利用すれば、立体選択性を有するチオエステラーゼにより、ラセミ化を伴いながらの光学分割、いわゆるDynamic Kinetic Resolution(DKR)反応系を、立体選択的なCoAリガーゼを使用することなく構築することも可能となり、理論上100%の収率にて光学活性なカルボン酸を合成することも可能であり、従って、本発明はかかる点からも非常に有用である。
　実施例１
　２　ｍＭフルルビプロフェニル－ＣｏＡ水溶液１０μＬと、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８］バッファー１００Ｌを１．５ｍＬのプラスチックチューブに入れて混合し、そこに１０μｇ／ｍＬのＡＣＯＴ７水溶液を１０μＬ　加え、室温に２時間置いた。ＡＣＯＴ７はＯＲＦ配列がクローン化されたエントリークローン（ＦＬＪ３２６０６ＡＡＡＮ）と、Ｎ末端側ＧＳＴ－ｔａｇ，　ＦＬＡＧ－ｔａｇ融合用デスティネーションベクターとを用い、非特許文献１記載の方法に従って、コムギ胚芽抽出液（ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ、セルフリーサイエンス社）を用いてタンパク質合成を行った。
　この反応液に10倍量の2 Nの塩酸を加え、反応を停止させ、ジエチルエーテルによる溶媒抽出、乾燥を行った。このものを、ダイセル社製キラルカラムCHIRALCEL OD-Hを用いた高速液体カラムクロマトグラフィー（HPLC）により、生成したフルルビプロフェンの光学純度を分析した(hexane/i-PrOH/TFA = 95/5/0.1%, 1 mL/min, 210 nm)。対照実験として、酵素非添加の溶液も同様の操作で分析を行った。結果を図１に示す。
　その結果、酵素ACOT７の添加によりＲ-フルルビプロフェンが選択的に生成し、その鏡像体過剰率は100%eeであった。酵素ACOT７に代えてACOT2、ACOT4、ACOT8、ACOT9、ACOT11 、ACOT12を用いる以外、上記と同様にしてフルルビプロフェンを生成し、光学純度を分析した。その結果、ACOT9の鏡像体過剰率は46%eeに止まった。また、ACOT2、ACOT4、ACOT8、ACOT11、及びACOT12については、反応自体が進まなかった。
　実施例２
　０．０５ｍＭのルシフェリル－ＣｏＡ（ラセミ体）に、１０μｇ／ｍＬの酵素ＡＣＯＴ１３を添加し、生成したルシフェリンの光学純度をダイセル社製キラルカラムCHIRALCEL OD-RHを用いてHPLC分析した(H2O/acetonitrile/TFA = 73/27/0.1%, 1 mL/min, ex330 nm, em510 nm)。その結果、L-ルシフェリンの鏡像体過剰率が100%eeとなった。酵素ルシフェラーゼは、ゲンジボタル由来の遺伝子を導入した発現ベクターを大腸菌に導入して調製し、酵素ACOT13は実施例1のACOT7と同じ方法で調整した。対照実験として、酵素ACOT13非添加の溶液も同様の操作で分析を行った。図２に結果を示す。さらに、酵素ACOT１３に代えてTESB、ACOT2、ACOT4、ACOT7、ACOT8、ACOT9、ACOT11又はACOT12を用いる以外、上記と同様にしてルシフェリンを生成し、光学純度を分析した。その結果、ACOT7については鏡像体過剰率は77%eeに達した。これに対し、ACOT9の鏡像体過剰率は31%eeに止まった。また、ACOT2、ACOT4、ACOT8、ACOT11及びACOT12については、反応自体が進まなかった。

Claims (9)

  1. 　下記一般式（Ｉ）で表されるα位に不斉炭素を有するチオエステル化合物の光学異性体の混合物から、ＡＣＯＴ７及びＡＣＯＴ１３からなる群より選択される少なくとも一種のアシルＣｏＡエステラーゼによる酵素加水分解反応により、キラル体のカルボン酸を不斉合成する方法：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、水素又は置換基を示す。
    Ｒ2及びＲ3はこれらが結合する炭素原子と共に置換又は無置換の環構造を形成してもよい。
    ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＣＯ－Ｓ－Ｒ4は互いに異なる。]。
  2. 　Ｒ1が水素である、請求項１に記載の方法。
  3. 　Ｒ4が、下記一般式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ10及びＲ11は、同一又は異なって、水素又はアルキル基を示す。－Ｏ－Ｒ12は、水酸基、リン酸基含有官能基又はスルホン酸基を示す。ｐは１～６の自然数を示す。ｑは０～５の整数を示す。ｒは１～６の自然数を示す。］
    で表される基である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　Ｒ1が水素であり、－Ｓ－Ｒ4が－Ｓ－ＣｏＡである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　Ｒ2が下記一般式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ5は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示す。Ｒ6は置換基を示す。ｍは０～５の整数を示す。ｍが２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。］
    で表される基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　Ｒ2が下記一般式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｒ5及びＲ7は、同一又は異なって、結合、－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（＝Ｏ）－を示す。Ｒ6及びＲ8は、同一又は異なって、置換基を示す。ｍ'は１～５の自然数を示す。ｎは０～４の整数を示す。ｍ'－１が２以上の場合、Ｒ6は同一でも異なってもよい。ｎが２以上の場合、Ｒ8は同一でも異なってもよい。］
    で表される基である、請求項５に記載の方法。
  7. 　Ｒ2及びＲ3がこれらが結合する炭素原子と共に下記一般式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、Ｒ9は水素又は置換基を示す。］
    で示される環構造を形成している、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　Ｒ9が
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     で示される基である、請求項７に記載の方法。
  9. 　Ｒ3が炭素数１～６のアルキル基である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
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