WO2018203539A1 - 金属の回収方法、並びに金属回収用担体及びこれを用いた金属の回収用バイオリアクター - Google Patents

金属の回収方法、並びに金属回収用担体及びこれを用いた金属の回収用バイオリアクター Download PDF

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metal
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metal recovery
amino acid
seq
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兼由 山本
裕可里 三宅
文歌 小島
美祐 吉多
美紀 大沢
北川　寿美子
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学校法人法政大学
Tdk株式会社
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/40—Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P10/00—Technologies related to metal processing
    • Y02P10/20—Recycling

Definitions

  • the present invention relates to a metal recovery method, a metal recovery carrier used therefor, and a metal recovery bioreactor using the metal recovery carrier.
  • Catalysts used in oil refining processes, active ingredients for preservatives, additives for industrial oils, electrical / electronic equipment, antibacterial agents used in the medical field include transition metals, precious metals, simple metals such as rare earths, or These metal oxides or sulfides are widely used. Some of these metals have high rarity value.
  • Industrial wastewater and domestic wastewater may contain heavy metals or heavy metal compounds that are toxic to the human body at high concentrations. When soil and water quality are polluted by such waste water, it is necessary to remove a single metal or a metal compound.
  • the sludge generated in the treatment process of the sewage treatment plant or the waste liquid treatment process of the factory, or the sludge of the metal magnet may contain rare earth with a high rare value.
  • a simple metal or a metal compound hereinafter, these may be collectively referred to simply as “metal”) or a method for efficiently recovering these ions is required.
  • Patent Documents 1 and 2 describe a method in which a metal uptake gene or a metal binding gene is introduced into Escherichia coli and a transition metal or heavy metal is taken into the cells of the obtained transformant. Further, Non-Patent Document 1 describes a method of imparting cadmium binding ability to E. coli by modifying the E. coli cell transmembrane protein OmpA.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 a genetically modified microorganism is used. Such a recombinant microorganism is greatly limited in its applicable range from the viewpoint of safety. Furthermore, in the methods described in Patent Documents 1 and 2, the metal is collected by accumulating the target metal in the cells of the recombinant microorganism. In this case, it is necessary to make the microorganisms survive in order to incorporate metal ions into the cell, but the proliferation ability and growth ability of the recombinant microorganism are reduced by the toxicity of the incorporated metal and the amount of metal exceeding the limit value for accumulation. There is a case.
  • an object of the present invention is to provide a metal recovery method that can be used under a wide range of conditions without being restricted by the applicable range.
  • Another object of the present invention is to provide a metal recovery carrier that can be suitably used in the metal recovery method.
  • the present inventors have intensively studied.
  • the present inventors introduced a metal ion-binding peptide motif into a region that does not impair the porin function in the amino acid sequence that constitutes a porin that penetrates the cell membrane of a Gram-negative bacterium, and expresses the metal ion-binding peptide motif on the surface layer.
  • Recombinant microorganisms were produced.
  • the resulting recombinant microorganism had binding ability and resistance to metal ions.
  • Non-life activities such as dead cells of microorganisms that have lost viability and vesicles that have the same surface structure as the cell membrane (phospholipid bilayer membrane) of the original recombinant microorganisms. It has been found that the body can be suitably used in a metal recovery method without being restricted by the applicable range.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the above-described problems of the present invention have been solved by the following means. (1) contacting a metal recovery carrier with a medium containing metal ions; Binding metal ions contained in the medium to the outer layer surface of the metal recovery carrier; Separating the metal recovery carrier from the medium; A metal recovery method comprising:
  • the metal recovery carrier is a non-life activity substance whose outer layer is composed of a phospholipid bilayer membrane, A porin derived from a gram-negative bacterium penetrates the phospholipid bilayer membrane, In the amino acid sequence of the porin, a metal ion-binding peptide motif is introduced into a region that does not impair the porin function in the gram-negative bacterium, The metal ion-binding peptide motif is presented on the surface of the phospholipid bilayer; Metal recovery method.
  • the site where the metal ion-binding peptide motif is introduced into the porin is any region in the region from position 38 to 54 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a region corresponding thereto, and SEQ ID NO: 8
  • Metal recovery method is
  • the site for introducing the metal ion-binding peptide motif into the porin is any region in the region from position 43 to 53 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a region corresponding thereto, and SEQ ID NO: 9
  • the item (1) or (2) which is at least one site selected from the group consisting of the region from the 339th to the 358th positions of the amino acid sequence represented by or an arbitrary site in the region corresponding thereto.
  • Metal recovery method (5) The metal recovery method according to any one of (1) to (4), wherein the metal recovery carrier is a vesicle. (6) The metal recovery method according to any one of (1) to (4), wherein the metal recovery carrier is a dead cell of Gram-negative bacteria.
  • the non-life activity body whose outer layer is composed of a phospholipid bilayer membrane, A porin derived from a gram-negative bacterium penetrates the phospholipid bilayer membrane, In the amino acid sequence of the porin, a metal ion-binding peptide motif is introduced into a region that does not impair the porin function in the gram-negative bacterium, The metal ion-binding peptide motif is presented on the surface of the phospholipid bilayer membrane, Metal recovery carrier.
  • the introduction site of the metal ion-binding peptide motif to the porin is any region in the region from position 38 to 54 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a region corresponding thereto, and SEQ ID NO: 8
  • the site of introduction of the metal ion-binding peptide motif into the porin is any region in the region from position 43 to 53 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a region corresponding thereto, and SEQ ID NO: 9
  • the item (7) or (8) which is at least one site selected from the group consisting of the region from the 339th to the 358th position of the amino acid sequence represented by or an arbitrary site in the region corresponding thereto.
  • Metal recovery carrier (11) The metal recovery carrier according to any one of (7) to (10), which is a vesicle. (12) The metal recovery carrier according to any one of (7) to (10), which is a dead cell of a Gram-negative bacterium. (13) A metal recovery bioreactor on which the metal recovery carrier according to any one of (7) to (12) is immobilized.
  • the metal recovery method of the present invention can be used under a wide range of conditions without being restricted by the applicable range.
  • the metal recovery carrier of the present invention is not limited in the applicable range and can be suitably used in the metal recovery method.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing a preferred embodiment of the metal recovery carrier of the present invention or a precursor thereof
  • FIG. 1B is a schematic diagram showing another preferred embodiment of the metal recovery carrier of the present invention.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the alignment analysis of the amino acid sequence of OmpA, OmpC, and OmpF performed between bacterial species and between various porins. It is a figure which shows the operation flow of the genome edit using a CRISPR-Cas9 system. It is a plasmid map of pEX-A2-sgRNA produced as a general-purpose vector for guide RNA cloning.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing a preferred embodiment of the metal recovery carrier of the present invention or a precursor thereof
  • FIG. 1B is a schematic diagram showing another preferred embodiment of the metal recovery carrier of the present invention.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the alignment analysis of the amino acid sequence of OmpA, OmpC, and OmpF
  • FIG. 4 is a diagram showing the insertion position ( ⁇ ) of a metal ion-binding peptide motif gene into the ompA gene in the transformant produced in Test Example 1. It is the schematic which shows the preparation methods of the DNA fragment which codes Cu ion binding peptide motif. It is the schematic which shows the preparation methods of the DNA fragment which codes Tb ion binding peptide motif. It is the schematic which shows the preparation methods of the DNA fragment which codes Tb ion binding peptide motif. 1 is a schematic diagram showing the structure of OmpA of transformants YM0501, YM0901 and YM1001 prepared in Examples. FIG.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of OmpA of transformants YM0701, YM1101 and YM1201 prepared in Examples.
  • FIG. 3 is a graph showing the proliferation ability and growth ability of transformants YM0501, YM0901 and YM1001 prepared in Examples.
  • 2 is a graph showing the proliferation ability and growth ability of transformants YM0701, YM1101 and YM1201 prepared in Examples. It is a graph which shows the growth ability in the presence of a metal ion of the transformant YM0501 produced in the Example and its parent strain.
  • FIG. 14 (A) is a drawing-substituting photograph showing a state where the transformant YM0501 produced in the example was stained with FM4-64, and FIG.
  • FIG. 14 (B) is a photograph showing a vesicle produced from the transformant YM0501 with FM4-64. It is a drawing substitute photograph which shows a dyeing
  • FIG. 18 is a diagram showing the insertion position ( ⁇ ) of the metal ion binding peptide motif gene into the ompC gene in the transformant prepared in Test Example 4.
  • FIG. 19A is a plasmid map of the plasmid pBADompC1-TBpep2 prepared in Test Example 4.
  • FIG. 19B is a plasmid map of the plasmid pBADompC18-TBpep2 prepared in Test Example 4.
  • FIG. 20 (A) is a schematic diagram showing the structure of OmpC of a transformant prepared in Test Example 4 and containing plasmid pBADompC1-TBpep2.
  • FIG. 20 (B) is a schematic diagram showing the structure of OmpC of a transformant comprising plasmid pBADompC18-TBpep2 prepared in Test Example 4.
  • FIG. 21 (A) is a drawing-substituting photograph showing the results of SDS-PAGE performed using the outer membrane fraction of the transformant prepared in Test Example 4.
  • FIG. 21 (B) is a drawing-substituting photograph showing the results of Western blotting performed using the outer membrane fraction of the transformant prepared in Test Example 4.
  • the identity of the base sequence and amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing analysis with a unit size to compare (ktup) of 2 using the homology analysis (Search homology) program of the genetic information processing software Genetyx-Win.
  • the metal recovery carrier of the present invention (hereinafter also simply referred to as “carrier”) is a non-life active substance having a phospholipid bilayer membrane, and the outer layer of the carrier is composed of the phospholipid bilayer membrane.
  • a porin derived from a Gram-negative bacterium also referred to as “transmembrane protein” penetrates the phospholipid bilayer membrane.
  • a metal ion-binding peptide motif is presented on the surface of the phospholipid bilayer membrane via this porin.
  • the metal ion-binding peptide motif is introduced into a region of the amino acid sequence of porin that does not impair the porin function in Gram-negative bacteria and has low amino acid sequence conservation between bacterial species.
  • non-life activity substance refers to a substance that does not have proliferative ability and metabolic ability. Specific examples include dead cells of microorganisms that have lost their viability, and vesicles (liposomes) that are closed by lipid bilayers and do not contain DNA inside.
  • microorganisms used for biosorption are greatly limited in their applicable range from the viewpoint of safety.
  • the metal recovery carrier of the present invention is a non-life activity body, the applicable range is not limited and the industrial use is easy.
  • the conventional microorganisms used for biosorption sometimes have reduced proliferation ability and growth ability due to accumulation of metal in the cells.
  • a microorganism serving as a precursor of the metal recovery carrier of the present invention has a metal ion-binding peptide motif introduced at a site that does not affect the function as a microorganism (porin function). Therefore, the function as a microorganism is not impaired, and its proliferation ability and growth ability can be maintained.
  • the microorganism can be grown in a favorable environment for growth.
  • metal includes a single metal and a metal compound. Although there is no restriction
  • Sc (scandium), Ti (titanium), V (vanadium), Cr (chromium), Mn (manganese), Fe (iron), Co (cobalt), Ni (nickel), Cu (copper), Zn (zinc), Y (yttrium), Zr (zirconium), Nb (niobium), Mo (molybdenum), Tc (technetium), Ru (ruthenium), Rh (rhodium), Pd (palladium), Ag (silver), Cd (cadmium), La (lanthanum), Ce (cerium), Pr (praseodymium), Nd (neodymium), Pm (promethium), Sm (samarium), Eu (europium), Gd (gadolinium), Tb (terbium), Dy (dysprosium), Ho (holmium), Er (erbium), Tm (thulium), Yb (ytterbium), Lu (luteti) ), Hf (hafnium),
  • Proteins having specific binding properties to various metal ions are generally functionally classified into metal enzymes, metal chaperones, and metal sensors (Nature, 2009, vol. 460 (7257), p. 823). -830).
  • metal chaperones and metal sensors are known to have peptide motifs that bind specifically to metal ions, which are widely conserved in living organisms (Chem. Biol., 2002, vol. 9 (6), p. 673-677; Science, 2003, vol. 301 (5638), p. 1383-1387; Science, 2003, vol. 301 (5638), p. 1383-1387; Sci. Rep., 2016, vol. 6, p 33391; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, vol.
  • the carrier of the present invention is appropriately selected from such metal ion-binding peptide motifs and used depending on the target metal.
  • the metal ion-binding peptide motif used in the present invention is preferably composed of 20 to 30 residues. Specific examples of metal ion-binding peptide motifs that can be used in the present invention are shown in Table 1 below. However, the present invention is not limited to these.
  • porin in the present invention is a general term for proteins that form permeation pores (diffusion channels) existing in the outer membrane of Gram-negative bacteria.
  • Porin is rich in ⁇ sheet structure and has a ⁇ sheet on the cytoplasm side and a loop connecting the ⁇ sheets.
  • the ⁇ sheet is antiparallel and has a cylindrical ⁇ barrel structure with a nonpolar group on the outer surface and a polar group on the inside.
  • a porin having such a structure penetrates a phospholipid bilayer membrane such as the outer membrane of a Gram-negative bacterium.
  • the porins that can be used in the present invention can be appropriately selected from various porins derived from Gram-negative bacteria.
  • OmpA OmpA
  • OmpC OmpF
  • PhoE PhoE
  • LamB LamB
  • OprD2 OprE1
  • OmpA, OmpC, or OmpF is preferable
  • OmpA that is constantly expressed on the surface layer of the cell membrane regardless of osmotic pressure conditions is more preferable.
  • the aforementioned metal ion-binding peptide motif is introduced into a predetermined site of porin by a conventional method.
  • a metal ion-binding peptide motif may be introduced into a porin by inserting or adding a metal ion-binding peptide motif at a predetermined site of the porin.
  • all or part of amino acid residues in a predetermined region of porin may be substituted with a metal ion-binding peptide motif.
  • a metal ion-binding peptide motif is introduced into a specific part of the porin that does not impair the function of the porin.
  • “does not impair the function of the porin” means that the three-dimensional structure of the porin is maintained and the function as a diffusion channel is maintained. Determination of whether the three-dimensional structure of porin is maintained and the function as a diffusion channel is maintained can be made by alignment of amino acid sequences, measurement of proliferation ability, and growth ability.
  • the site where the metal ion-binding peptide motif is introduced is preferably a site corresponding to the extracellular domain in Gram-negative bacteria in the amino acid sequence of porin.
  • a metal ion-binding peptide motif into a region where amino acid sequence conservation is low between bacterial species and between various porins.
  • a region having low amino acid sequence conservation between bacterial species and various porins can be determined by performing alignment according to a conventional method.
  • the amino acid sequence of the extracellular domain of the porin used in the present invention is identified from various databases containing amino acid sequence information of various porins, and a continuous region of about 10 to 20 residues is selected from the identified amino acid sequences. To do.
  • alignment of the amino acid sequence of the selected region is performed between different bacterial species and various porins. In the aligned region, the number of the same or similar amino acid residues is 3 or less, preferably 2 or less, more preferably 1 or less, more preferably 0, between different bacterial species or between various porins.
  • the homology of the amino acid sequence of the region selected as the extracellular domain is 25% or less, preferably 17% or less, between different bacterial species and various porins. More preferably, the region of 9% or less, more preferably 0%, can be determined as the introduction site of the metal peptide motif.
  • the similarity of amino acid residues is judged from the polarity (nonpolar, positive charge, negative charge) of the side chain of the amino acid residue. Those having the same side chain polarity are classified as “similar amino acid residues”.
  • the introduction site of the metal ion-binding peptide motif is the region from position 38 to position 54 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or an arbitrary region corresponding thereto, the amino acid represented by SEQ ID NO: 8 Arbitrary part of the region from position 79 to 95 of the sequence or an equivalent region thereof, Arbitrary part of region from position 125 to 137 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or an equivalent region thereof, and sequence It is preferably at least one site selected from the group consisting of the region from position 164 to 181 of the amino acid sequence represented by No. 8 or an arbitrary portion of the region corresponding thereto, represented by SEQ ID No. 8.
  • a region from position 38 to position 54 of the amino acid sequence or any part of the region corresponding thereto, and 79-9 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 Any site region or regions corresponding thereto of up position, and more preferably at least one site selected from the group consisting of.
  • the “region from positions 38 to 54 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8” is the extracellular region 1 of OmpA derived from E. coli described later.
  • the “region from position 79 to 95 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8” is the extracellular region 2 of OmpA derived from E. coli described later.
  • region from position 125 to 137 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is the extracellular region 3 of OmpA derived from E. coli described later. Further, “region from position 164 to 181 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8” is the extracellular region 4 of OmpA derived from E. coli described later. (See FIG. 2, FIG. 9, FIG. 10, and FIG.
  • the introduction site of the metal ion-binding peptide motif is the region from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 to the 43rd to 53rd position or any region corresponding thereto, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 Any region in the region from position 85 to 91 or a region corresponding thereto, any region in the region from position 116 to 141 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a region corresponding thereto, SEQ ID NO: 9 Arbitrary region of the amino acid sequence represented by positions 172 to 200 or the region corresponding thereto, any region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 to positions 220 to 241 or any region corresponding thereto Site, an arbitrary region of the region from position 258 to 269 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a region corresponding thereto, represented by SEQ ID NO: 9 Arbitrary part of the region from position 300 to 318 of the amino acid sequence or a region corresponding thereto, and the amino acid sequence represented by S
  • the “region from position 43 to position 53 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 1 of OmpC derived from E. coli described later.
  • the “region from the 85th to the 91st position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 2 of OmpC derived from E. coli described later.
  • the “region from position 116 to position 141 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 3 of OmpC derived from E. coli described later.
  • the “region from positions 172 to 200 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 4 of OmpC derived from E. coli described later.
  • the “region from position 220 to position 241 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 5 of OmpC derived from Escherichia coli described later.
  • the “region from position 258 to position 269 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 6 of OmpC derived from E. coli described later.
  • the “region from position 300 to position 318 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 7 of OmpC derived from E. coli described later.
  • region from position 339 to 358 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9” is the extracellular region 8 of OmpC derived from E. coli described later. (See FIG. 2, FIG. 16, FIG.
  • the introduction site of the metal ion-binding peptide motif may be one place or two places or more.
  • region has low preservability of the amino acid sequence between microbial species and between various porins. Furthermore, even if a metal ion-binding peptide motif is introduced into these regions, the porin function is not impaired.
  • the metal ion-binding peptide motif introduced into these regions is presented on the surface of the phospholipid bilayer membrane.
  • the “corresponding region” refers to comparing the target amino acid sequence with a reference sequence and aligning (aligning) the sequences so as to give the maximum homology to conserved amino acid residues present in each amino acid sequence.
  • the alignment can be performed using known algorithms, the procedures of which are known to those skilled in the art. For example, the alignment can be performed manually based on the above-mentioned Lippman-Person method, etc., but the Clustal W multiple alignment program (Nucleic Acids Res., 1994, Vol. 22, p. 4673-4680) is set as default. Can be used.
  • Clustal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI, [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the Japan DNA Data Bank (DDBJ, [ It can be used on the website of www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]).
  • EBI European Bioinformatics Institute
  • DDBJ Japan DNA Data Bank
  • the microorganism that is the precursor of the carrier of the present invention can be produced by genetic engineering techniques.
  • the host microorganism is transformed so that a gene encoding a metal ion-binding peptide motif (hereinafter referred to as “metal ion-binding peptide motif gene”) is introduced into a predetermined site of DNA encoding porin.
  • the target precursor is obtained by expressing the porin by which the metal ion binding peptide motif was introduce
  • the precursor obtained by such a method is also referred to as a recombinant microorganism.
  • a gram negative bacterium is preferable and the bacterium described in Microbiology, 2014, vol. 160, p. 2109-2121 is more preferable.
  • Gram-negative bacteria which can be preferably used in the present invention, Esukerikia (Escherichia) bacteria, Shigella (Shigella) bacteria, Salmonella (Salmonella) bacteria, Neisseria (Neisseria) bacteria, Legionella (Legionella) bacteria, Acinetobacter (Acinetobacter) bacteria, Helicobacter (Helicobacter) bacteria, Francisella (Francisella) bacteria belonging to the genus, Edward Sierra (Edwardsiella) bacteria belonging to the genus Pseudomonas (Pseudomonas) bacteria, Staphylococcus aureus (Staphylococcus) bacteria belonging to the genus Klebsiella (Klebsiella) bacteria belonging to the genus , Porphyromonas (Porphyromonas) bacteria, Campylobacter (Campylobacter) bacteria, Bacteroides (Bacteroides) bacteria include Vibrio (Vibrio) bacteria.
  • Escherichia coli Shigella flexneri , Salmonella enterica , Neisseria meningitidis , Legionella pneumophila , Acinetobacter baumannii , Helicobacter pylori (Helicobacter pylori), mucus bacteria (Myxococcus xanthus), Francisella Firomirajia (Francisella philomiragia), Francisella tularensis (Francisella tularensis), Edward Sierra Taruda (Edwardsiella tarda), Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae), Pseudomonas syringae (Pseudomonas syringae), Francisella Nobisaida (Fr
  • Escherichia bacteria Escherichia bacteria, Shigella bacteria and Salmonella bacteria are preferred, Escherichia coli, Flexner Shigella and Salmonella are more preferred, and Escherichia coli is even more preferred.
  • the recombinant microorganism is excellent in specificity and binding ability to a specific metal and maintains cell homeostasis.
  • the precursor produced as described above can be suitably used for producing the carrier of the present invention. Furthermore, if the genetically modified microorganism as a precursor maintains the growth ability, the growth can be continued, and a large amount of the carrier of the present invention can be produced.
  • Preferable forms of the carrier of the present invention include genomic DNA and vesicles that have lost characteristics of microorganisms such as proliferation ability and metabolic ability, prepared from the precursor according to a conventional method.
  • vesicle refers to a vesicle having a structure closed by a phospholipid bilayer membrane. Vesicles do not have genetic information and are not genetically modified microorganisms that are a major limitation in industrial applications. Therefore, from the viewpoint of safety, the outer membrane vesicle, which is a non-biological material, can be used for recovery and removal of metals even under conditions where the above-described recombinant microorganisms cannot be applied. Is easy to use.
  • the vesicle 20 is produced from the outer membrane 1 of the recombinant microorganism 10 as shown in FIG. 1A and is closed without containing DNA.
  • a vesicle having a membrane structure is produced on the surface of the outer layer of vesicle 20 (outer membrane 1 composed of a phospholipid bilayer membrane).
  • metal ions introduced into the amino acid sequence of porin 3 are the same as the surface of outer membrane 1 of recombinant microorganism 10.
  • the binding peptide motif 4 is presented.
  • the vesicle of the present invention can be prepared from a recombinant microorganism prepared by the above-described method and presenting a metal ion-binding peptide motif on the surface of a cell membrane (phospholipid bilayer membrane).
  • a step of producing a recombinant microorganism 10 in which a metal ion-binding peptide motif 4 is presented on the surface of a cell membrane (outer membrane 1 composed of a phospholipid bilayer) by the above-described method Can be produced by culturing and producing vesicle 20, centrifuging the culture solution, removing the recombinant microorganisms by filter filtration, separating the vesicles in the culture solution by ultracentrifugation, and concentrating steps.
  • a method for producing the vesicle of the present invention PLos ONE, 2016, vol. 11 (12), e0169186; J. Bacteriol., 1995, vol. 177 (14), p.
  • Another preferred form of the carrier of the present invention is a dead cell produced by killing the precursor (recombinant microorganism 10), as described with reference to FIG. 1 (A). If it is killed dead cells, its use is rarely restricted from the viewpoint of safety, and industrial use is easy. Dead cells can be prepared by autoclaving the precursor microorganisms according to a conventional method.
  • the metal can be recovered by bringing the carrier of the present invention into contact with a metal or a medium containing ions thereof, binding the metal ions contained in the medium to the surface of the carrier of the present invention, and separating the carrier of the present invention.
  • a metal or a medium containing ions thereof binding the metal ions contained in the medium to the surface of the carrier of the present invention, and separating the carrier of the present invention.
  • the method for extracting the metal bound to the surface of the carrier of the present invention or its ions for example, modification of the secondary structure of metal ion-binding peptide motif by high temperature (about 100 ° C) treatment, metal ion detachment from metal ion binding peptide motif by high salt concentration (several M) solution treatment, irreversible metal ion binding peptide This can be done by decomposing the motif.
  • Metals recovered from natural water environments such as rivers and seas, urban mines, aqueous solutions in which metal magnet sludge is dissolved with acid, media made from metal-contaminated soil dispersion, etc. Can be reused for catalysts used in petroleum refining processes, preservative active ingredients, industrial oil additives, electrical and electronic equipment, antibacterial agents used in the medical field, and the like.
  • the carrier after separation from the metal can be reused when the structure of the metal ion-binding peptide motif is not completely destroyed. Further, by the above method, environmental water contaminated with metal and metal contained in soil can be removed, and water quality and soil can be purified.
  • immobilizing the carrier of the present invention on a suitable support or the like it is possible to provide a bioreactor derived from a microorganism material (for example, a column or film for recovering or removing a metal, or a metal recovering or removing agent). it can.
  • a bioreactor derived from a microorganism material for example, a column or film for recovering or removing a metal, or a metal recovering or removing agent.
  • a bioreactor derived from a microorganism material for example, a column or film for recovering or removing a metal, or a metal recovering or removing agent.
  • a bioreactor derived from a microorganism material for example, a column or film for recovering or removing a metal, or a metal recovering or removing agent.
  • foams or resins such as polyvinyl alcohol, polyurethane foam, polystyrene foam, polyacrylamide, polyvinyl formal resin porous body, silicon foam, and cellulose porous body.
  • Test Example 1 Production of recombinant Escherichia coli presenting metal ion-binding peptide motif on the surface of extracellular layer (1) Examination of target region of Escherichia coli extracellular layer presenting metal ion-binding peptide motif Metal ion-binding peptide on the surface of E. coli extracellular layer In order to present the motif, attention was paid to proteins localized in the outermost layer of the cell. Biological membranes of phospholipids surrounding Gram-negative bacteria such as E. coli are double, and the outer side is called the outer membrane and the inner side is called the inner membrane.
  • OmpA SEQ ID NO: 8
  • OmpC SEQ ID NO: 9
  • OmpF SEQ ID NO: 10
  • OmpA is constitutively expressed in gram-negative bacteria and is a major outer membrane protein.
  • OmpA derived from Escherichia coli has eight transmembrane regions and, as a result, has four extracellular regions presented outside the cell.
  • the four extracellular regions are respectively referred to as “extracellular region 1 (Extracellular-1)”, “extracellular region 2 (Extracellular-2)”, “extracellular region 3 (Extracellular-3)”, and “extracellular region”. (Extracellular-4) "(see FIGS. 2 and 15).
  • OmpA, OmpC and OmpF derived from E. coli OmpA derived from Shigella flexneri (SEQ ID NO: 32), OmpC (SEQ ID NO: 33) and OmpF (SEQ ID NO: 34), and OmpA derived from Salmonella (SEQ ID NO: 35) prepared by ClustalW From the alignment of the amino acid sequences of OmpC (SEQ ID NO: 36) and OmpF (SEQ ID NO: 37), it was found that there are no identical amino acid residues and similar amino acid residues in the extracellular region 1 (see FIG. 2). ). Further, there was no identical amino acid residue in extracellular region 2, and only one similar amino acid residue was present (see FIG. 2). On the other hand, each of the extracellular regions 3 and 4 had two identical amino acid residues and one similar amino acid residue (see FIG. 2).
  • extracellular region 1 and extracellular region 2 which have extremely low amino acid sequence conservation between bacterial species and various porins, are not important for the function of porin, preferably OmpA function.
  • This region was used as a target for inserting a metal ion-binding peptide motif.
  • a plasmid that expresses a target gene-specific guide RNA is introduced into E. coli into which pCas has been introduced, so that Cas9 expressed in the cell and a plasmid that expresses the target gene-specific guide RNA form a complex. Then, the DNA double strand is cleaved at the target position on the genome, causing cell death.
  • Typical guide RNA expression plasmid is cleaved and removed by Cas9. Furthermore, since pCas has a temperature-sensitive replication origin, it is a system that can be easily removed by culturing the transformant at 37 ° C or 42 ° C.
  • a vector incorporating the designed crRNA sequence was prepared.
  • the restriction enzyme Not I is located on the 5 ′ side of the tracrRNA sequence in this sequence.
  • PEX-A2-sgRNA was constructed by inserting the sequence into which the recognition site was inserted into the pEX-A2 vector using the artificial gene synthesis service of Eurofin Genomics (see SEQ ID NO: 11, FIG. 4).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 the nucleotide sequence at positions 86-147 is “tracrRNA”, the nucleotide sequence at positions 155-227 is “Pj23119 promoter”, and the nucleotide sequence at positions 255-370 is It is “lac promoter”, the base sequence at positions 587-1260 is “pMB1 ori”, and the base sequence at positions 1405-2266 is “bla”.
  • oligonucleotide ompA1_sgRNA_N20 (SEQ ID NO: 12, 5'- CCGCAGCGGTTTCAG TGTTGATGAAACCAGTGTCA GTTTTAGAGCTAGAA- 3 ', underlined is a homologous sequence with pEX-A2-sgRNA) and its complementary oligonucleotide ompA1_sgRNA_com (SEQ ID NO: 13, 5'- TTCTAGCTCTAAAAC TGACACTGGTTTCATCAACC CTGG Is a double-stranded DNA fragment by annealing the homologous sequence to pEX-A2-sgRNA, and pEX-A2-sgRNA cleaved with Not I using In-Fusion HD
  • oligonucleotide ompA2_sgRNA_N20 (SEQ ID NO: 14, 5'- CCGCAGCGGTTTCAG TGTTGATGAAACCAGTGTCA GTTTTAGAGCTAGAA -3 ', underlined pEX-A2- A homologous sequence with sgRNA) and its complementary oligonucleotide ompA2_sgRNA_com (SEQ ID NO: 15, 5'- TTCTAGCTCTAAAAC TTGTACGGCATACGACCTAA CTGAAACCGCTGCGG- 3 ', underlined is a homologous sequence with pEX-A2-sgRNA) to form a double-stranded DNA fragment PsgRNA-ompA2-29 was constructed from pEX-A2-sgRNA cleaved with Not I using In-Fusion HD Cloning
  • psgRNA-ompA1-14 ampicillin resistance
  • psgRNA-ompA2-29 ampicillin resistance
  • E. coli W3110 typeA into which pCas (kanamycin resistance) was introduced.
  • pCas kanamycin resistance
  • an E. coli transformant having ampicillin resistance could not be obtained. From these results, it was confirmed that the psgRNA-ompA1-14 and psgRNA-ompA2-29 cleave the target ompA gene site on the genome in a Cas9-dependent manner.
  • Cu ion-binding peptide motif into E. coli outer membrane protein non-conserved region
  • the Cu ion-binding peptide motif of CueR is composed of 21 amino acid residues ( 2 HN-CPGDDSADCPILENLSGCCHH-COOH, SEQ ID NO: 4) (Science, 2003, vol. 301 (5638), p. 1383-1387)
  • a 27 amino acid residue sequence in which 3 glycine residues were added to each end was introduced into OmpA. Details are shown below.
  • OpA1_cueRpep_F (SEQ ID NO: 17, 5'- TAAACTGGGCTGGTCCCAGTACCATGACACTGGTTTCATC GGCGGCGGCTGCCCTGGCGATGAC-3 ', underlined is the extracellular region of the ompA gene on the genome
  • OmpA1_cueRpep3_R (SEQ ID NO: 18, 5'- CAGCGCCCAGTTGGTTTTCATGGGTCGGGCCATTGTTGTT GCCGCCGCCATGATGACAGCAGCC-3 ', underlined is homologous to the corresponding sequence in the extracellular region 1 of the ompA gene on the genome) Toyobo) PCR was performed.
  • a DNA fragment encoding a 161 bp Cu ion-binding peptide motif (hereinafter referred to as “ompA1cueRpep3”) that can be recombinantly introduced into the extracellular region 1 of OmpA was amplified (see FIG. 6).
  • the amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • the base sequence at positions 96-974 is “ araC ”
  • the base sequence at positions 1004-1019 is “ araO2 ”
  • the base sequence at positions 1161-1172 is ⁇ ⁇ AraO1 ''
  • the nucleotide sequence at positions 1203-1216 is ⁇ CAP_BS ''
  • the nucleotide sequence at positions 1213-1251 is ⁇ ⁇ AraI1I2 ''
  • the nucleotide sequence at positions 1248-1276 is ⁇ ARA_promoter ''
  • the base sequence at position 1760 is “ cueR ”
  • the base sequence at positions 1761-1784 is “FLAG tag”
  • the base sequence at positions 1878-2035 is “rrnB_terminator”
  • the base sequence at positions 2001-2044 is “ rrnB_T1_terminator ''
  • the nucleotide sequence at positions 2176-2203 is ⁇ rrnB_T2_terminator ''
  • ompA2_cueRpep_F (SEQ ID NO: 19, 5'- AATGGGTTACGACTGGTTAGGTCGTATGCCGTACAAAGGC GGCGGCGGCTGCCCTGGCGATGAC-3 ', underlined is homologous to the corresponding sequence in the extracellular region 2 of the ompA gene on the genome, and CGpGTCTT, CTTT 3 ', underlined is a 161 bp Cu ion-binding peptide motif DNA fragment that can be recombinantly introduced into the extracellular region 2 of OmpA by PCR using the primer corresponding to the corresponding sequence in the extracellular region 2 of the ompA gene on the genome.
  • ompA2cueRpep3 was amplified (see FIG. 6). The amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • competent cells for electroporation of E. coli W3110 type A J. Bacteriol., 1997, vol. 179 (3), p. 959-963 having pCas were prepared.
  • transformation was performed using a guide RNA expression plasmid psgRNA-ompA1-14 for specific cleavage of the extracellular region 1 of the ompA gene and a recombination DNA fragment ompA1cueRpep3. It was applied to LB agar medium (10 g / L tryptone (Difco), 5 g / L yeast extract (Difco), 171 mM NaCl, 15 g / L agar) and cultured at 30 ° C.
  • YM0501 showed ampicillin sensitivity.
  • amplification was not observed in W3110 type A, whereas amplification of the target fragment was observed in YM0501.
  • transformation was performed using a guide RNA expression plasmid psgRNA-ompA2-29 for specific cleavage of ompA gene extracellular region 2 and a DNA fragment for recombination ompA2cueRpep3.
  • the resultant was applied to an LB agar medium and cultured at 30 ° C. overnight to obtain a transformant YM0701.
  • Tb ion-binding peptide motif into E. coli outer membrane protein non-conserved region Ca ion-binding EF-hand motif (Trends Biochem. Sci., 1996, vol. 21, p. 14-17) (Chembiochem., 2003, vol. 4 (4), p. 272-276).
  • Mutant Tb ion-binding peptide motif consisting of 17 amino acid residues 2 HN-YIDTNNDGWYEGDELLA-COOH, SEQ ID NO: 6) (Chembiochem., 2003, vol. 4 (4), p. 272-276)
  • a sequence of 23 amino acid residues each having 3 glycine residues added thereto was introduced into OmpA. Details are shown below.
  • pGEX-4T-1-TbB-peptide1 plasmid (see SEQ ID NO: 22, see FIG. 7) from which the Tb ion-binding peptide motif gene is cloned as a template, ompA1_TbBpep1_F (SEQ ID NO: 23, 5′- TAAACTGGGCTGGTCCCAGTACCATGACACTGGTTTCATCGGCGGCGGC TATATTGATACCAAC-3 ′, underlined corresponding sequences homologous) and ompA1_TbBpep1_R extracellular region 1 of the ompA gene on the genome (SEQ ID NO: 24,5'- CAGCGCCCAGTTGGTTTTCATGGGTCGGGCCATTGTTGTTGCCGCCGCC CGCCAACAATTCATC-3 ', underlined and the corresponding sequence of the extracellular domain 1 of ompA gene on the genome PCR was performed using KOD-Plus-Neo (Toyobo) using primers.
  • a DNA fragment encoding a 149 bp Tb ion-binding peptide motif (hereinafter referred to as “ompA1TbBpep1”) that can be recombinantly introduced into the extracellular region 1 of OmpA was amplified (see FIG. 7).
  • the amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • the base sequence at positions 184-212 is “ tac promoter ”, the base sequence at positions 258-944 is “GST-a”, and the base positions at positions 945-953
  • the sequence is “ Glycine ”
  • the base sequence at positions 954-1004 is “TbB-peptide1”
  • the base sequence at positions 1005-1007 is “Glycine”
  • the base sequence at positions 1008-1026 is “GST-b”
  • the base sequence at positions 1422-2282 is “bla”
  • the base sequence at positions 2438-3056 is “pBR322 ori”
  • the base sequence at positions 3354-4445 is “lac I”.
  • ompA2_TbBpep1_F (SEQ ID NO: 25, 5'- AATGGGTTACGACTGGTTAGGTCGTATGCCGTACAAAGGCGGCGGCGGC TATATTGATACCAAC-3 ', underlined is homologous to the sequence corresponding to the extracellular region 2 of the ompA gene on the genome, and CGp CGTCTT, CTCG ', Underlined is a 149-bp Tb ion-binding peptide motif DNA fragment (hereinafter referred to as “recombinantly introduced into the extracellular region 2 of OmpA”) by PCR using the primer corresponding to the sequence corresponding to the extracellular region 2 of the ompA gene on the genome. , “OmpA2TbBpep1”) (see FIG. 7). The amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • transformation was performed using the guide RNA expression plasmid psgRNA-ompA2-29 for specific cleavage of the extracellular region 2 of the ompA gene and the recombination DNA fragment ompA2TbBpep1 to obtain a transformant YM1101.
  • Tb ion-binding peptide motif different from the Tb ion-binding peptide motif a Tb ion-binding peptide motif having different mutations consisting of 17 amino acid residues ( 2 HN-ACVDWNNDGWYEGDECA-COOH, SEQ ID NO: 7) (Chembiochem., 2003, vol. 4 (4), p. 272-276), a sequence of 23 amino acid residues with 3 glycine residues added to each end was introduced into OmpA.
  • OpA1_TbBpep2_F (SEQ ID NO: 28, 5'- TAAACTGGGCTGGTCCCAGTACCATGACACTGGTTTCATCGGCGGCGGC GCGTGCGTGGATTGG-3 ', underlined using the pGEX-4T-1-TbB-peptide2 plasmid (see SEQ ID NO: 27, FIG.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as “ompA1TbBpep2”) encoding a 149 bp Tb ion-binding peptide motif that can be recombinantly introduced into the extracellular region 1 of OmpA was amplified.
  • the amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • the base sequence at positions 184-212 is “ tac promoter ”, the base sequence at positions 258-944 is “GST-a”, and the base positions at positions 945-953
  • the sequence is “ Glycine ”
  • the base sequence at positions 954-1004 is “TbB-peptide2”
  • the base sequence at positions 1005-1007 is “Glycine”
  • the base sequence at positions 1008-1026 is “GST-b”
  • the base sequence at positions 1422-2282 is “ bla ”
  • the base sequence at positions 2438-3056 is “pBR322 ori”
  • the base sequence at positions 3354-4445 is “ lac I ”.
  • ompA2_TbBpep2_F (SEQ ID NO: 30, 5- AATGGGTTACGACTGGTTAGGTCGTATGCCGTACAAAGGCGGCGGCGGC GCGTGCGTGGATTGG-3 ', underlined is homologous to the sequence corresponding to the extracellular region 2 of the ompA gene on the genome
  • ompA2_TbBpep2_R (SEQ ID GTC TGTC Underlined is a 149-bp Tb ion-binding peptide motif DNA fragment (hereinafter referred to as “the homologous sequence corresponding to the extracellular region 2 of the ompA gene” on the genome) that can be recombinantly introduced into the extracellular region 2 of OmpA.
  • “OmpA2TbBpep2”) was amplified (see FIG. 8).
  • the amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • the extracellular region of the ompA gene was electroporated into E. coli W3110 typeA (J. Bacteriol., 1997, vol. 179 (3), p. 959-963) having pCas in the same manner as described above. Transformation with the guide RNA expression plasmid psgRNA-ompA1-14 for specific cleavage of 1 and the DNA fragment for recombination ompA1TbBpep2 was performed to obtain a transformant YM1001.
  • transformation using the guide RNA expression plasmid psgRNA-ompA2-29 for specific cleavage of the extracellular region 2 of the ompA gene and the DNA fragment for recombination ompA2TbBpep2 was performed to obtain a transformant YM1201.
  • FIG. 1 An outline of the structures of the transformants YM0501, YM0901, and YM1001 prepared as described above is shown in FIG. Moreover, the outline of the structure of transformants YM0701, YM1101, and YM1201 is shown in FIG.
  • Test Example 2 Growth of Recombinant Presenting a Metal Ion Binding Motif on the Surface of the E. coli Outer Layer
  • Each of the transformants prepared in Test Example 1 was M9 glucose medium (0.4 mM Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 2 mM KH).
  • 2 PO 4 0.8 mM NaCl, 0.1 mM CaCl 2 .2H 2 O, 20 mM NH 4 Cl, 1 mM MgCl 2 .6H 2 O, 0.25 mM K 2 SO 4 , 10 mM D-(+)-glucose) at 37 ° C.
  • OD 600nm was measured over time. The results are shown in FIGS. As shown in FIGS.
  • the E. coli transformant YM0501 in which a Cu ion binding motif is inserted into the extracellular region 1 of the ompA gene is in a state in which the Cu ion binding motif is presented on the surface of the extracellular layer.
  • This transformant YM0501 and its parent strain were each 37 ° C in LB liquid medium (10 g / L tryptone (Difco), 5 g / L yeast extract (Difco), 171 mM NaCl) supplemented with 5 mM CuCl 2. And OD 600nm was measured.
  • the OD 600nm value of the parent strain W3110 type A was 0.410
  • the OD 600nm value of the transformant YM0501 was 1.299, which was higher than that of the parent strain (see FIG. 13). From this, it was proved that the Cu ion tolerance of the transformant YM0501 was improved by binding the Cu ion binding motif presented on the surface of the extracellular layer to Cu ions in the environment.
  • Test Example 3 Preparation of Vesicles from Recombinant E. coli
  • the transformant YM0501 was cultured overnight at 37 ° C. in 1 L of LB liquid medium (10 g / L tryptone (Difco), 5 g / L yeast extract (Difco), 171 mM NaCl).
  • the cells were removed by centrifuging the culture and filtering using a ⁇ 0.45 ⁇ m filter. Then, naturally generated vesicles present in the solution were separated and concentrated by ultracentrifugation (150,000 ⁇ g, 1 hour) of the filtrate.
  • a precipitate containing vesicles was suspended in a phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a vesicle solution.
  • FIG. 14A A micrograph of the transformant YM0501 stained with FM4-64 is also shown in FIG. FM4-64 is a hydrophobic red fluorescent substance that stains lipid bilayers.
  • FM4-64 was used to stain phospholipid bilayers of E. coli and vesicles.
  • FIG. 14B the cells of E. coli as seen in FIG. 14A were not confirmed.
  • FIG. 14B the cells of E. coli as seen in FIG. 14A were not confirmed.
  • Test Example 4 Recovery of metal using dead cells of recombinant Escherichia coli with a metal ion-binding peptide motif displayed on the surface of the extracellular layer OmpC derived from Escherichia coli has 16 transmembrane regions, and as a result, it is presented extracellularly. It has eight extracellular regions. Hereinafter, the eight extracellular regions are referred to as “extracellular region 1 (Extracellular-1)”, “extracellular region 2 (Extracellular-2)”, “extracellular region 3 (Extracellular-3)”, and “extracellular region”, respectively.
  • a primer OmpC_BAD_R (SEQ ID NO: 39) having a total of 70 bases including 25 bases excluding the end codon of the ompC gene, 30 bases including the FLAG sequence and the stop codon, and 15 bases homologous to pBAD33 was designed.
  • PCR was performed using the above-described primers OmpC_BAD_F- and OmpC_BAD_R, using the genome of E. coli W3110 Type A (J. Bacteriol. 1997, vol. 179 (3), p. 959-963) as a template DNA to amplify the ompC gene region. .
  • ExTaq polymerase Takara bio
  • the PCR product was confirmed by 2% agarose gel electrophoresis, amplification of the target DNA fragment (1177 bp) was confirmed. Therefore, the DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Cherey-Nagel).
  • the obtained ompC fragment containing a homologous sequence with pBAD33 was designated as OmpC-BAD fragment.
  • the pBAD33 was digested with Hin dIII and Sac I, and ligated by homologous recombination OmpC-BAD fragment by In-Fusion HD Cloning Kit (Takara bio), was introduced into E. coli DH5 ⁇ by transformation with the CaCl 2 method, Colonies were obtained on LB agar medium containing chloramphenicol.
  • a plasmid was extracted from the appearing colonies using the FavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit (Favorgen), the DNA sequence of the extracted plasmid was determined, and the plasmid pBADompC-FLAG was obtained (see FIG. 17).
  • the primer ompC1a_TbBpep2_F-2 (5'-TCTGACAACAAAGATGGCGGCGGCGCGTGCGTGGATTGG-3 ', SEQ ID NO: 42) and the primer ompC1a_TbBpep2_R-2 (5' -GGTCTGGTCGCCATCGCCGCCGCCCGCGCATTCATCGCC-3 ', SEQ ID NO: 43) was used for PCR with KOD-Plus-Neo (Toyobo).
  • ompC1TbBpep2 a 99 base pair DNA fragment encoding the Tb ion-binding peptide motif 2 (hereinafter referred to as “ompC1TbBpep2”) that can be introduced into the extracellular region 1 of OmpC was amplified.
  • the amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • Qiagen a QIA quick PCR purification kit
  • a linear vector of pBADompC-FLAG and ompC1TbBpep2 were ligated by homologous recombination with In-Fusion HD Enzyme, introduced into E. coli DH5 ⁇ by transformation by the CaCl 2 method, and colonies were obtained on an LB agar medium containing chloramphenicol.
  • Plasmids were extracted from the appearing colonies using the FavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit (Favorgen), the DNA sequence of the extracted plasmids was determined, and plasmid pBADompC1-TBpep2 was obtained (see FIG. 19A).
  • Tb-binding peptide motif 2 (H 2 N-ACVDWNNDGWYEGDECA-COOH, SEQ ID NO: 7) was additionally introduced into the coding region of OmpC extracellular region 8 of pBADompC1-TBpep2.
  • the linear DNA of the pBADompC1-TBpep2 was prepared by inverse PCR.
  • the primer ompC8f_TbBpep2_F-2 (5'-CTGGACGACAACCAGGGCGGCGGCGCGTGCGTGGATTGG-3 ', SEQ ID NO: 46) and the primer ompC8f_TbBpep2_R-2 (5' -GCCAGCGTCACGAGTGCCGCCGCCCGCGCATTCATCGCC-3 ', SEQ ID NO: 47) was used for PCR with KOD-Plus-Neo (Toyobo).
  • ompC8TbBpep2 a 99 base pair DNA fragment encoding the Tb ion-binding peptide motif 2 (hereinafter referred to as “ompC8TbBpep2”) that can be introduced into the extracellular region 8 of OmpC was amplified.
  • the amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR purification kit (Qiagen).
  • Qiagen a QIA quick PCR purification kit
  • a linear vector of pBADompC-FLAG and ompC8TbBpep2 were ligated by homologous recombination with In-Fusion HD Enzyme, introduced into E. coli DH5 ⁇ by transformation by the CaCl 2 method, and colonies were obtained on an LB agar medium containing chloramphenicol.
  • Plasmids were extracted from the appearing colonies using FavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit (Favorgen), and the DNA sequence of the extracted plasmids was determined to obtain plasmid pBADompC18-TBpep2 (see FIG. 19B).
  • the constructed plasmids pBADompC1-TBpep2, pBADompC18-TBpep2, pBADompC-FLAG and plasmid pBAD33 were introduced into E. coli JW2203 (ompC :: Kmr) (Mol. Syst. Biol. 2006, Vol. 2, 2006.0008.).
  • E. coli JW2203 (ompC :: Kmr) (Mol. Syst. Biol. 2006, Vol. 2, 2006.0008.).
  • Prepare competent cells for Escherichia coli JW2203 for CaCl2 add pBADompC1-TBpep2, pBADompC18-TBpep2, pBADompC-FLAG, and pBAD33 plasmid solutions, perform transformation by the CaCl 2 method, and run on LB agar medium containing chloramphenicol.
  • the obtained transformant (see FIGS. 20 (A) and (B)) was cultured in LB medium containing chloramphenicol and arabinose (final concentration 0.002%), and after cell collection, cell suspension solution (20 mM Tris -HCl pH 8.0 / 20% sucrose). Lysozyme (200 ⁇ g / mL) and EDTA (final concentration 0.1 M) were added to the cell suspension and allowed to stand on ice for 40 minutes.
  • spheroplast precipitate obtained by centrifugation 10,000rpm, 20min, 4 ° C
  • spheroplast suspension solution 10mM Tris-HCl pH8.0
  • ultrasonic treatment Amplitude 15%, Pulse ON / OFF 10 seconds, total 90 seconds
  • the solution is centrifuged (10,000 rpm, 15 minutes, 4oC), then the supernatant is ultracentrifuged twice (30,000 rpm, 60 minutes), freeze-thawed, and the resulting membrane fraction is 1% Suspended with N-lauroylsarcinosinate (final concentration 0.5%). After incubating at 25 ° C.
  • the outer membrane fraction was dissolved in an outer membrane soluble solution (20 mM Tris-HCl pH 8.0 / 20% sucrose / 2% SDS), and the amount of protein was quantified by the Bradford method.
  • the transferred PVDF membrane was washed with TBS containing skim milk (final concentration 1%), shaken for 2 hours with TBS containing skim milk (final concentration 1%) with HRP-conjugated mouse IgG antibody added, and then secondary antibody An immune reaction was performed. Immunized transcription PVDF membrane is washed with TBS containing skim milk (final concentration 1%) and purified water, and HRP chemiluminescence on the membrane is detected by Chemilmi One Super (Nacalai Tesque) to detect LAS-4000 (Fujifilm) did.
  • the E. coli transformant was cultured in an LB medium containing chloramphenicol and arabinose (final concentration 0.002%), and the cells were killed by autoclaving. The adsorption behavior of this dead cell was evaluated.
  • dead cells were suspended in 1 mL of pure water, the amount of liquid that became turbidity of 1.0 OD (Optical Density) at a wavelength of 660 nm was collected by centrifugation.
  • the collected dead cells are suspended in 1 mL of 50 mM MES (pH 4.5) aqueous solution containing 100 ⁇ M TbCl 3, and then stirred for 30 minutes so as not to re-precipitate, and then centrifuged to separate the cells. Separated into supernatant. This supernatant was used as a supernatant after adsorption.
  • Each solution of the metal solution stock solution (MES aqueous solution containing TbCl 3 ) before suspending dead cells and the supernatant after adsorption is diluted 10-fold with 5% nitric acid, and then ICP-AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic)
  • MES aqueous solution containing TbCl 3 aqueous solution containing TbCl 3
  • ICP-AES Inductively Coupled Plasma-Atomic
  • E. coli strain 1 As shown in Table 2, the amount of Tb 3+ ions adsorbed in E. coli strain 1 is considered to be due to nonspecific adsorption of Tb 3+ ions to the surface layer of E. coli.
  • E. coli strains 2 and 3 in which the Tb ion-binding peptide motif is displayed on the outer membrane show a higher Tb 3+ ion adsorption rate than E. coli strain 1. Therefore, in E. coli strains 2 and 3, which express OmpC1a-TbBpep2 or OmpC1aC8f-Tbpep2 on the outer membrane, Tb 3+ ions are superior to E. coli strain 1 which is a dead cell that is not expressed. It was confirmed that OmpC1a-TbBpep2 or OmpC1aC8f-Tbpep2 possesses the ability to adsorb Tb 3+ ions.

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Abstract

【課題】適用可能範囲の制約を受けることなく、幅広い条件下で使用できる、金属の回収方法を提供する。 【解決手段】金属回収用担体と、金属イオンを含有する媒体とを接触させ、　前記媒体に含まれる金属イオンを前記金属回収用担体の外層表面に結合させて、　前記媒体から前記金属回収用担体を分離する、 金属の回収方法であって、 前記金属回収用担体は、外層がリン脂質二重膜から構成される非生命活動体であり、 グラム陰性菌由来のポリンが、前記リン脂質二重膜を貫通し、 前記ポリンのアミノ酸配列中、前記グラム陰性菌においてポリン機能を損なわない領域に、金属イオン結合ペプチドモチーフが導入されており、 前記金属イオン結合ペプチドモチーフが、前記リン脂質二重膜の表面に呈示される、 金属の回収方法。

Description

金属の回収方法、並びに金属回収用担体及びこれを用いた金属の回収用バイオリアクター
　本発明は、金属の回収方法及びこれに用いる金属回収用担体、並びに金属回収用担体を用いた金属の回収用バイオリアクターに関する。
　石油精製プロセスに用いられる触媒、防腐剤の有効成分、工業用オイルの添加剤、電気・電子機器、医療分野で用いられる抗菌剤には、遷移金属、貴金属、レア・アース等の単体金属、又はこれらの金属の酸化物若しくは硫化物が広く用いられている。これらの金属の中には希少価値の高いものも含まれている。
　工業用廃水や生活用廃水には、人体に対して毒性のある重金属又は重金属化合物が高濃度で含まれる場合がある。このような廃水によって土壌や水質が汚染された場合、単体金属又は金属化合物を除去する必要がある。一方で、下水処理場の処理過程や工場の廃液処理過程などで生じる汚泥や、金属磁石のスラッジには、希少価値の高いレア・アースが含まれる場合がある。
　このような理由から、単体金属若しくは金属化合物（以下、これらをまとめて単に「金属」ということがある）、又はこれらのイオンを効率的に回収する方法が求められている。
　従来、金属の回収方法としては、化学的に金属を回収する方法が一般的であった。しかし、金属の化学的な回収方法は多くのエネルギーが必要であり、環境に対する負荷が大きい。そのため、エネルギーの消費が少なく、環境に対する負荷が少ない、金属の回収方法が求められている。
　エネルギーの消費が少なく、環境に対する負荷が少ない金属又はそのイオンの回収方法として、微生物を用いた回収方法（バイオソープション）が近年注目されている。
　例えば特許文献１及び２には、金属取込み遺伝子や金属結合性遺伝子を大腸菌（Escherichia coli）に導入し、得られた形質転換体の細胞内に遷移金属や重金属を取り込む方法が記載されている。さらに、非特許文献１には、大腸菌の細胞膜貫通タンパク質OmpAを改変することにより大腸菌にカドミウム結合能を付与する方法が記載されている。
特開２００４－３５７５６６号公報 特開２０１４－２３９６７８号公報
Protein Engineering, 1998, vol. 11(6), p. 489-494
　しかし特許文献１及び２、並びに非特許文献１に記載の方法では、遺伝子組換え微生物を使用する。このような組換え微生物は、安全性の観点から、その適用可能な範囲が大きく制限される。
　さらに特許文献１及び２に記載の方法では、目的の金属を組換え微生物の細胞内に蓄積させることで、金属の回収を行う。この場合、細胞内に金属イオンを取り込むには微生物を生存させる必要があるが、取込んだ金属の毒性や蓄積可能な限界値を超える金属量により組換え微生物の増殖能や生育能が低下する場合がある。
　そこで本発明は、上記問題を解決するものであり、適用可能範囲の制約を受けることなく、幅広い条件下で使用できる、金属の回収方法の提供を課題とする。
　また本発明は、上記金属の回収方法に好適に使用できる、金属回収用担体の提供を課題とする。
　これまで、環境から単離された微生物の生物吸着（バイオソープション）によって、金属を濃縮する技術開発が行われている。バイオソープションによる金属回収技術は、化学的な回収方法よりも省エネルギーかつ高い効率で回収が期待されている。しかし、バイオソープションは微生物自体を使用する方法であるため、安全性の観点から、適用可能な範囲が制限される。
　このような状況を鑑み、本発明者らは鋭意検討を行った。
　まず本発明者らが、グラム陰性菌の細胞膜を貫通するポリンを構成するアミノ酸配列のうちポリン機能を損なわない領域に、金属イオン結合ペプチドモチーフを導入し、金属イオン結合ペプチドモチーフを表層に発現させた組換え微生物を作製した。その結果得られた組換え微生物は、金属イオンに対する結合能と耐性を有していた。
　そして、このような組換え微生物から作製した、生育能を喪失した微生物の死菌体や、元の組換え微生物の細胞膜（リン脂質二重膜）と同じ表面構造を有するベシクルなどの非生命活動体は、適用可能範囲の制約を受けることなく、金属の回収方法に好適に用いることができることを見い出した。
　本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
　本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
（１）金属回収用担体と、金属イオンを含有する媒体とを接触させて、
　前記媒体に含まれる金属イオンを前記金属回収用担体の外層表面に結合させ、
　前記媒体から前記金属回収用担体を分離する、
金属の回収方法であって、
前記金属回収用担体は、外層がリン脂質二重膜から構成される非生命活動体であり、
グラム陰性菌由来のポリンが、前記リン脂質二重膜を貫通し、
前記ポリンのアミノ酸配列中、前記グラム陰性菌においてポリン機能を損なわない領域に、金属イオン結合ペプチドモチーフが導入されており、
前記金属イオン結合ペプチドモチーフが、前記リン脂質二重膜の表面に呈示される、
金属の回収方法。
（２）前記ポリンがOmpA、OmpC又はOmpFである、前記（１）項に記載の金属の回収方法。
（３）前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号８で表されるアミノ酸配列の３８～５４位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号８で表されるアミノ酸配列の７９～９５位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、前記（１）又は（２）項に記載の金属の回収方法。
（４）前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号９で表されるアミノ酸配列の４３～５３位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号９で表されるアミノ酸配列の３３９～３５８位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、前記（１）又は（２）項に記載の金属の回収方法。
（５）前記金属回収用担体がベシクルである、前記（１）～（４）のいずれか１項に記載の金属の回収方法。
（６）前記金属回収用担体がグラム陰性菌の死菌体である、前記（１）～（４）のいずれか１項に記載の金属の回収方法。
（７）外層がリン脂質二重膜から構成される非生命活動体であり、
グラム陰性菌由来のポリンが、前記リン脂質二重膜を貫通し、
前記ポリンのアミノ酸配列中、前記グラム陰性菌においてポリン機能を損なわない領域に、金属イオン結合ペプチドモチーフが導入されており、
前記金属イオン結合ペプチドモチーフが、前記リン脂質二重膜の表面に呈示されている、
金属回収用担体。
（８）前記ポリンがOmpA、OmpC又はOmpFである、前記（７）項に記載の金属回収用担体。
（９）前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号８で表されるアミノ酸配列の３８～５４位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号８で表されるアミノ酸配列の７９～９５位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、前記（７）又は（８）項に記載の金属回収用担体。
（１０）前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号９で表されるアミノ酸配列の４３～５３位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号９で表されるアミノ酸配列の３３９～３５８位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、前記（７）又は（８）項に記載の金属回収用担体。
（１１）ベシクルである、前記（７）～（１０）のいずれか１項に記載の金属回収用担体。
（１２）グラム陰性菌の死菌体である、前記（７）～（１０）のいずれか１項に記載の金属回収用担体。
（１３）前記（７）～（１２）のいずれか１項に記載の金属回収用担体が固定化されている、金属の回収用バイオリアクター。
　本発明の金属の回収方法は、適用可能範囲の制約を受けることなく、幅広い条件で使用できる。
　また、本発明の金属回収用担体は適用可能範囲の制約がなく、上記金属の回収方法に好適に使用できる。
　本発明の上記および他の特徴および利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明の金属回収用担体又はその前駆体の好ましい態様を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、本発明の金属回収用担体の別の好ましい態様を示す模式図である。 菌種間及び各種ポリン間で行った、OmpA、OmpC及びOmpFのアミノ酸配列のアライメント解析の結果を示す図である。 CRISPR-Cas9システムを利用したゲノム編集の操作フローを示す図である。 ガイドRNAクローニングの汎用ベクターとして作製したpEX-A2-sgRNAのプラスミドマップである。 試験例１で作製した形質転換体における、ompA遺伝子への金属イオン結合ペプチドモチーフ遺伝子の挿入位置（▲印）を示す図である。 Cuイオン結合ペプチドモチーフをコードするDNA断片の作製方法を示す概略図である。 Tbイオン結合ペプチドモチーフをコードするDNA断片の作製方法を示す概略図である。 Tbイオン結合ペプチドモチーフをコードするDNA断片の作製方法を示す概略図である。 実施例で作製した形質転換体YM0501、YM0901及びYM1001のOmpAの構造を示す概略図である。 実施例で作製した形質転換体YM0701、YM1101及びYM1201のOmpAの構造を示す概略図である。 実施例で作製した形質転換体YM0501、YM0901及びYM1001の増殖能、生育能を示すグラフである。 実施例で作製した形質転換体YM0701、YM1101及びYM1201の増殖能、生育能を示すグラフである。 実施例で作製した形質転換体YM0501とその親株の、金属イオン存在下での増殖能を示すグラフである。 図１４（Ａ）は実施例で作製した形質転換体YM0501をFM4-64で染色した様子を示す図面代用写真であり、図１４（Ｂ）は形質転換体YM0501から作製したベシクルをFM4-64で染色した様子を示す図面代用写真である。 菌種間及び各種ポリンで行った、OmpAのアミノ酸配列のアライメント解析の結果を示す図である。 菌種間及び各種ポリンで行った、OmpCのアミノ酸配列のアライメント解析の結果を示す図である。 実施例で作製したompC遺伝子発現用プラスミドのプラスミドマップである。 図１８は、試験例４で作製した形質転換体における、ompC遺伝子への金属イオン結合ペプチドモチーフ遺伝子の挿入位置（▲印）を示す図である。 図１９（Ａ）は、試験例４で作製したプラスミドpBADompC1-TBpep2のプラスミドマップである。図１９（Ｂ）は、試験例４で作製したプラスミドpBADompC18-TBpep2のプラスミドマップである。 図２０（Ａ）は、試験例４で作製した、プラスミドpBADompC1-TBpep2を含んでなる形質転換体のOmpCの構造を示す概略図である。図２０（Ｂ）は、試験例４で作製した、プラスミドpBADompC18-TBpep2を含んでなる形質転換体のOmpCの構造を示す概略図である。 図２１（Ａ）試験例４で作製した形質転換体の外膜画分を用いて行ったSDS-PAGEの結果を示す図面代用写真である。図２１（Ｂ）試験例４で作製した形質転換体の外膜画分を用いて行ったウエスタンブロッティングの結果を示す図面代用写真である。
　本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search　homology）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　本発明の金属回収用担体（以下単に「担体」ともいう）は、リン脂質二重膜を有する非生命活動体であり、担体の外層が前記リン脂質二重膜から構成される。そして、グラム陰性菌由来のポリン（「膜貫通タンパク質」ともいう）が、前記リン脂質二重膜を貫通する。さらに、このポリンを介して、リン脂質二重膜の表面に金属イオン結合ペプチドモチーフが呈示される。本発明の担体において、金属イオン結合ペプチドモチーフは、ポリンのアミノ酸配列中、グラム陰性菌においてポリン機能を損なわず、菌種間でのアミノ酸配列の保存性の低い領域に導入されている。
　本明細書において「非生命活動体」とは、増殖能及び代謝能を持たない物質を指す。具体例としては、生育能を喪失した微生物の死菌体や、脂質二重膜により閉じた構造を有する小胞であって、内部にＤＮＡを含まないベシクル（リポソーム）などが挙げられる。
　バイオソープションに用いられる従来の微生物、特に組換え微生物は、安全性の観点から、その適用可能な範囲が大きく制限されている。これに対して本発明の金属回収用担体は非生命活動体であるため、適用範囲が制限されることがなく、産業上利用が容易である。
　さらに、バイオソープションに用いられる従来の微生物は、その細胞内に金属を蓄積させることに起因して、その増殖能や生育能が低下する場合があった。これに対して本発明の金属回収用担体の前駆体となる微生物は、微生物としての機能（ポリンの機能）に影響することのない部位に金属イオン結合ペプチドモチーフが導入されている。そのため、微生物としての機能が損なわれず、その増殖能や生育能を維持することができる。さらに、本発明の金属回収用担体の前駆体となる微生物を金属イオンが存在する環境下におく必要が無いため、増殖にとって好環境下で前記微生物を増殖させることができる。
　本明細書において「金属」とは、単体金属及び金属化合物を包含する。
　単体金属としては特に制限はないが、遷移金属、貴金属、アルカリ金属、アルカリ土類金属、半金属が挙げられる。具体的には、Ｓｃ（スカンジウム）、Ｔｉ（チタン）、Ｖ（バナジウム）、Ｃｒ（クロム）、Ｍｎ（マンガン）、Ｆｅ（鉄）、Ｃｏ（コバルト）、Ｎｉ（ニッケル）、Ｃｕ（銅）、Ｚｎ（亜鉛）、Ｙ（イットリウム）、Ｚｒ（ジルコニウム）、Ｎｂ（ニオブ）、Ｍｏ（モリブデン）、Ｔｃ（テクネチウム）、Ｒｕ（ルテニウム）、Ｒｈ（ロジウム）、Ｐｄ（パラジウム）、Ａｇ（銀）、Ｃｄ（カドミウム）、Ｌａ（ランタン）、Ｃｅ（セリウム）、Ｐｒ（プラセオジム）、Ｎｄ（ネオジム）、Ｐｍ（プロメチウム）、Ｓｍ（サマリウム）、Ｅｕ（ユウロピウム）、Ｇｄ（ガドリニウム）、Ｔｂ（テルビウム）、Ｄｙ（ジスプロシウム）、Ｈｏ（ホルミウム）、Ｅｒ（エルビウム）、Ｔｍ（ツリウム）、Ｙｂ（イッテルビウム）、Ｌｕ（ルテチウム）、Ｈｆ（ハフニウム）、Ｔａ（タンタル）、Ｗ（タングステン）、Ｒｅ（レニウム）、Ｏｓ（オスミウム）、Ｉｒ（イリジウム）、Ｐｔ（白金）、Ａｕ（金）、Ｈｇ（水銀）、Ｎａ（ナトリウム）、Ｋ（カリウム）、Ｍｇ（マグネシウム）、Ａｓ（ヒ素）が挙げられる。
　また、金属化合物としては、前記単体金属の酸化物、硫化物、オキソアニオン若しくはこれらの塩などが挙げられる。
　各種金属のイオンに対して特異的な結合性を有するタンパク質は通常、金属酵素、金属シャペロン、及び金属センサーに機能的に大別される（Nature, 2009, vol. 460(7257), p. 823-830）。このうち、金属シャペロンと金属センサーでは、生物で広く保存されている、金属イオンと特異的に結合するペプチドモチーフが知られている（Chem. Biol., 2002, vol. 9(6), p. 673-677; Science, 2003, vol. 301(5638), p. 1383-1387; Science, 2003, vol. 301(5638), p. 1383-1387; Sci. Rep., 2016, vol. 6, p. 33391; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2011, vol. 108, p. 5045-5050）。本発明の担体では、目的の金属に応じて、このような金属イオン結合ペプチドモチーフから適宜選択して利用する。本発明で用いる金属イオン結合ペプチドモチーフは、２０～３０残基からなることが好ましい。
　本発明で利用可能な金属イオン結合ペプチドモチーフの具体例を下記表１に示す。しかし本発明は、これらに制限されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明における「ポリン」とは、グラム陰性菌の外膜に存在する、透過孔（拡散チャネル）を形成するタンパク質の総称である。ポリンはβシート構造に富み、細胞質側のβシートと、βシートを連結するループを有する。βシートは逆平行であり、外表面に無極性基、内部に極性基を持つ、円筒形のβバレル構造をとる。このような構造のポリンは、グラム陰性菌の外膜等のリン脂質二重膜を貫通する。
　本発明で用いることができるポリンは、グラム陰性菌由来の各種ポリンから適宜選択することができる。具体例としては、OmpA、OmpC、OmpF、PhoE、LamB、OprD2、OprE1が挙げられる。このうち、OmpA、OmpC又はOmpFが好ましく、浸透圧条件によらず細胞膜の表層に恒常的に発現しているOmpAがより好ましい。
　ポリンの所定の部位に、前述の金属イオン結合ペプチドモチーフを常法により導入する。
　本発明では、ポリンの所定の部位に金属イオン結合ペプチドモチーフを挿入又は付加することで、ポリンに金属イオン結合ペプチドモチーフを導入してもよい。あるいは、ポリンの所定の領域のアミノ酸残基の全部又は一部を金属イオン結合ペプチドモチーフに置換してもよい。
　本発明では、ポリンの機能を損なわないポリンの特定部位に、金属イオン結合ペプチドモチーフを導入する。ここで「ポリンの機能を損なわない」とは、ポリンの立体構造が保たれ、拡散チャネルとしての機能が維持されていることをいう。ポリンの立体構造が保たれ、拡散チャネルとしての機能が維持されているかどうかの判断は、アミノ酸配列のアライメントや、増殖能、生育能の測定により行うことができる。
　本発明において金属イオン結合ペプチドモチーフが導入される部位は、ポリンのアミノ酸配列において、グラム陰性菌において細胞外ドメインに相当する部位であることが好ましい。さらに本発明では、菌種間及び各種ポリン間でアミノ酸配列の保存性が低い領域に、金属イオン結合ペプチドモチーフを導入することが好ましい。菌種間及び各種ポリン間でアミノ酸配列の保存性が低い領域は常法に従いアライメントを行うことで決定できる。
　ポリンのアミノ酸配列における、金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位の決定方法について、好ましい態様に基づいて具体的に説明する。しかし本発明は、これに制限されるものではない。
　まず、各種ポリンのアミノ酸配列の情報が含まれる各種データベースから、本発明で用いるポリンの細胞外ドメインのアミノ酸配列を特定し、特定したアミノ酸配列のうち１０～２０残基程度の連続した領域を選択する。次に、選択した領域のアミノ酸配列のアライメントを、異なる菌種間や各種ポリン間で行う。そして、アライメントを行った領域において、異なる菌種間や各種ポリン間で、同一又は類似のアミノ酸残基の個数が３個以下、好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下、より好ましくは０個、である領域を、金属ペプチドモチーフの導入部位として決定できる。あるいは、異なる菌種間や各種ポリン間において、細胞外ドメインとして選択した領域のアミノ酸配列の相同性（類似のアミノ酸残基に置換されている場合も含む）が２５％以下、好ましくは１７％以下、より好ましくは９％以下、より好ましくは０％、である領域を、金属ペプチドモチーフの導入部位として決定できる。
　なお、本明細書においてアミノ酸残基の類似性は、アミノ酸残基の側鎖の極性（非極性、正電荷、負電荷）から判断する。そして、側鎖の極性が同じものを、「類似するアミノ酸残基」として分類する。
　本発明において、金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位は、配列番号８で表されるアミノ酸配列の３８～５４位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号８で表されるアミノ酸配列の７９～９５位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号８で表されるアミノ酸配列の１２５～１３７位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号８で表されるアミノ酸配列の１６４～１８１位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位であることが好ましく、配列番号８で表されるアミノ酸配列の３８～５４位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号８で表されるアミノ酸配列の７９～９５位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位であることがより好ましい。ここで、「配列番号８で表されるアミノ酸配列の３８～５４位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpAの細胞外領域１である。また「配列番号８で表されるアミノ酸配列の７９～９５位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpAの細胞外領域２である。また「配列番号８で表されるアミノ酸配列の１２５～１３７位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpAの細胞外領域３である。さらに「配列番号８で表されるアミノ酸配列の１６４～１８１位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpAの細胞外領域４である。（以上、図２、図９、図１０、図１５参照。）
　あるいは、金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位は、配列番号９で表されるアミノ酸配列の４３～５３位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号９で表されるアミノ酸配列の８５～９１位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号９で表されるアミノ酸配列の１１６～１４１位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号９で表されるアミノ酸配列の１７２～２００位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号９で表されるアミノ酸配列の２２０～２４１位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号９で表されるアミノ酸配列の２５８～２６９位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、配列番号９で表されるアミノ酸配列の３００～３１８位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号９で表されるアミノ酸配列の３３９～３５８位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位であってもよい。本発明においては、配列番号９で表されるアミノ酸配列の４３～５３位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号９で表されるアミノ酸配列の３３９～３５８位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位であることがより好ましい。ここで、「配列番号９で表されるアミノ酸配列の４３～５３位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域１である。また「配列番号９で表されるアミノ酸配列の８５～９１位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域２である。また「配列番号９で表されるアミノ酸配列の１１６～１４１位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域３である。また「配列番号９で表されるアミノ酸配列の１７２～２００位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域４である。また「配列番号９で表されるアミノ酸配列の２２０～２４１位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域５である。また「配列番号９で表されるアミノ酸配列の２５８～２６９位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域６である。また「配列番号９で表されるアミノ酸配列の３００～３１８位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域７である。さらに「配列番号９で表されるアミノ酸配列の３３９～３５８位までの領域」は、後述する大腸菌由来のOmpCの細胞外領域８である。（以上、図２、図１６、図２０（Ａ）及び（Ｂ）参照。）
　本発明において、金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位は、１か所であっても、２か所以上であってもよい。
　後述の実施例でも示すように、前記の各領域は、菌種間及び各種ポリン間でのアミノ酸配列の保存性が低い。さらに、これらの領域に金属イオン結合ペプチドモチーフを導入しても、ポリン機能は損なわれない。そして、これらの領域に導入された金属イオン結合ペプチドモチーフは、リン脂質二重膜の表面に呈示される。
　なお、本明細書において「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン・パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Clustal Wマルチプルアラインメントプログラム（Nucleic Acids Res., 1994, Vol. 22, p. 4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Clustal Wは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI, [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ, [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
　本発明の担体の前駆体となる微生物は、遺伝子工学的手法により作製できる。例えば、ポリンをコードするDNAの所定の部位に、金属イオン結合ペプチドモチーフをコードする遺伝子（以下、「金属イオン結合ペプチドモチーフ遺伝子」という）が導入されるよう、宿主微生物の形質転換を行う。そして、得られた形質転換体において金属イオン結合ペプチドモチーフが導入されているポリンを発現させることで、目的の前駆体が得られる。本明細書において、このような方法により得られる前駆体を組換え微生物ともいう。遺伝子工学的手法により金属イオン結合ペプチドモチーフをポリンに導入して組換え微生物を作製する方法としては特に制限はなく、Appl. Environ. Microbiol., 2015, vol. 81(7), p. 2506-2514; Protein Eng., 1998, vol. 11(6), p. 489-494; Appl. Biochem. Biotechnol., 2013, vol. 169(4), p. 1188-1196; Appl. Biochem. Biotechnol., 2011, vol. 165(7-8), p. 1674-1681; Biotechnol. Appl. Biochem., 2004, vol. 40, p. 209-228等に記載の方法を参照することができる。
　前記組換え微生物を作製するための宿主微生物としては特に制限されないが、グラム陰性菌が好ましく、Microbiology, 2014, vol. 160, p. 2109-2121に記載の細菌がより好ましい。
　本発明で好ましく用いることができるグラム陰性菌としては、エスケリキア（Escherichia）属細菌、赤痢菌（Shigella）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、ナイセリア（Neisseria）属細菌、レジオネラ（Legionella）属細菌、アシネトバクター（Acinetobacter）属細菌、ヘリコバクター（Helicobacter）属細菌、フランシセラ（Francisella）属細菌、エドワードシエラ（Edwardsiella）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、ブドウ球菌（Staphylococcus）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、ポルフィロモナス（Porphyromonas）属細菌、カンピロバクター（Campylobacter）属細菌、バクテロイデス（Bacteroides）属細菌、ビブリオ（Vibrio）属細菌が挙げられる。具体例としては、大腸菌、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、サルモネラ（Salmonella enterica）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、粘液細菌（Myxococcus xanthus）、フランシセラ・フィロミラジア（Francisella philomiragia）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、エドワードシエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、フランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、及びコレラ菌（Vibrio cholerae）が挙げられる。これらのうち、エスケリキア属細菌、赤痢菌属細菌、及びサルモネラ属細菌が好ましく、大腸菌、フレクスナー赤痢菌及びサルモネラがより好ましく、大腸菌がさらに好ましい。
　後述の実施例でも示すように、前記組換え微生物は、特定の金属に対する特異性及び結合能が優れ、かつ細胞恒常性が維持されている。
　前述のように作製した前駆体は、本発明の担体の作製に好適に用いることができる。さらに、前駆体である遺伝子組換え微生物が増殖能を維持していれば増殖を続けることができ、本発明の担体を大量に生成することができる。
　本発明の担体の好ましい形態としては、前記前駆体から常法に従い作製した、ゲノムDNAや、増殖能、代謝能といった微生物が有する特徴を喪失したベシクルが挙げられる。ここで「ベシクル」とは、リン脂質二重膜により閉じた構造を有する小胞をいう。ベシクルは遺伝情報を持たず、産業応用において主な制約となる遺伝子組換え微生物ではない。よって、安全性の観点から前述の組換え微生物を適用できない環境下、条件下であっても、非生物素材である外膜ベシクルであれば金属の回収や除去などに用いることができ、産業上の利用が容易である。
　図１（Ａ）及び（Ｂ）を参照して説明すると、ベシクル２０は、図１（Ａ）に示すような前記組換え微生物１０の外膜１から産生され、内部にはＤＮＡを含まない閉じた膜構造を有するベシクル（小胞）である。そしてベシクル２０の外層（リン脂質二重膜から構成される外膜１）の表面には、組換え微生物１０の外膜１の表面と同様に、ポリン３のアミノ酸配列中に導入された金属イオン結合ペプチドモチーフ４が呈示されている。
　本発明のベシクルは、前述の方法により作製した、金属イオン結合ペプチドモチーフを細胞膜（リン脂質二重膜）の表面に呈示させた組換え微生物から作製することができる。具体的には、前述の方法により金属イオン結合ペプチドモチーフ４を細胞膜（リン脂質二重膜から構成される外膜１）の表面に呈示させた組換え微生物１０を作製する工程、組換え微生物１０を培養し、ベシクル２０を産生させる工程、培養液の遠心、フィルター濾過による組換え微生物の除去工程、超遠心による培養液中のベシクルの分離、濃縮工程により作製できる。本発明のベシクルを作製する方法としては、PLos ONE, 2016, vol. 11(12), e0169186; J. Bacteriol., 1995, vol. 177(14), p. 3998-4008; Annu. Rev. Microbiol., 2010, vol. 64, p. 163-184; J. Bacteriol., 1998, vol. 180(18), p. 4872-4878; Proteomics., 2014, vol. 14(2-3), p. 222-229等に記載の方法を参照することができる。
　本発明の担体の別の好ましい形態としては、図１（Ａ）を参照して説明すると、前記前駆体（組換え微生物１０）を死滅させて作製した、死菌体が挙げられる。死滅させた死菌体であれば、安全性の観点から、その使用を制限されることが少なく、産業上の利用が容易である。死菌体は、常法に従い前駆体微生物をオートクレーブ滅菌することで作製することができる。
　本発明の担体と金属又はそのイオンを含有する媒体とを接触させ、媒体に含まれる金属イオンを本発明の担体の表面に結合させ、本発明の担体を分離することで、金属を回収できる。
　本発明の担体の表面に結合した金属又はそのイオンの取り出し方法に特に制限はない。例えば、高温（100℃程度）処理による金属イオン結合ペプチドモチーフの二次構造の変性、高塩濃度（数M）溶液処理による金属イオン結合ペプチドモチーフからの金属イオン乖離、不可逆的な金属イオン結合ペプチドモチーフの分解、等により行うことができる。このような方法により、河川や海などの自然水域環境や、都市鉱山、金属磁石スラッジを酸などで溶解させた水溶液、金属で汚染された土壌の分散物などから作製した媒体などから回収した金属は、石油精製プロセスに用いられる触媒、防腐剤の有効成分、工業用オイルの添加剤、電気・電子機器、医療分野で用いられる抗菌剤などに再利用できる。金属と分離した後の担体は、金属イオン結合ペプチドモチーフの構造が完全に破壊されていない場合、担体を再利用できる。
　また、上記方法により、金属で汚染された環境水や土壌に含まれる金属を除去でき、水質や土壌の浄化も可能となる。
　本発明の担体を適当な支持体などに固定化することで、微生物素材由来のバイオリアクター（例えば、金属を回収又は除去するためのカラム若しくはフィルム、金属の回収又は除去剤）を提供することができる。本発明で用いることができる支持体に特に制限はないが、水又は特定の溶媒に対して不溶性の物質が挙げられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォーム、セルロース多孔質体等の発泡体又は樹脂が挙げられる。なお、本明細書において「固定化」とは、本発明の担体が遊離の状態ではなく、支持体に結合若しくは付着した状態、又は支持体内部に取り込まれた状態をいう。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例１　金属イオン結合ペプチドモチーフを細胞外層の表面に呈示する組み換え大腸菌の作製
（１）金属イオン結合ペプチドモチーフを呈示する大腸菌細胞外層の標的領域の検討
　大腸菌の細胞外層の表面に金属イオン結合ペプチドモチーフを呈示するため、細胞最外層に局在するタンパク質に注目した。
　大腸菌のようなグラム陰性細菌を囲うリン脂質の生体膜は２重であり、その外側を外膜、内側を内膜と呼ぶ。大腸菌の外膜には主に３種類のポリン（OmpA（配列番号８）、OmpC（配列番号９）、OmpF（配列番号１０））が局在する。このうち、グラム陰性細菌ではOmpAが恒常的に発現し、主要な外膜タンパク質である。大腸菌由来のOmpAは８箇所の膜貫通領域をもち、結果として細胞外側に呈示される４つの細胞外領域を有している。以下、４つの細胞外領域をそれぞれ、「細胞外領域１（Extracellular-1）」、「細胞外領域２（Extracellular-2）」、「細胞外領域３（Extracellular-3）」、「細胞外領域（Extracellular-4）」という（図２、図１５参照）。
　ClustalWにより作成した、大腸菌由来のOmpA、OmpC及びOmpF、フレクスナー赤痢菌由来のOmpA（配列番号３２）、OmpC（配列番号３３）及びOmpF（配列番号３４）、並びにサルモネラ由来のOmpA（配列番号３５）、OmpC（配列番号３６）及びOmpF（配列番号３７）のアミノ酸配列のアライメントから、細胞外領域１には、同一のアミノ酸残基及び類似するアミノ酸残基は存在しないことがわかった（図２参照）。また、細胞外領域２にも同一のアミノ酸残基はなく、類似するアミノ酸残基が１つ存在するのみあった（図２参照）。
　一方、細胞外領域３及び４にはそれぞれ、同一のアミノ酸残基が２つ、類似するアミノ酸残基が１つ存在した（図２参照）。
　以上の結果から、菌種間及び各種ポリン間でのアミノ酸配列の保存性が極めて低い細胞外領域１と細胞外領域２が、ポリンの機能、好ましくはOmpA機能に重要ではないと考えた。そしてこの領域を、金属イオン結合ペプチドモチーフを挿入する標的とした。
（２）CRISPR-CasシステムにおけるガイドRNAクローニングの汎用ベクター構築
　まず、Jiangらによって構築されたCRISPR-Cas9システムを利用したゲノム編集法を応用した（Appl. Environ. Microbiol., 2015, vol. 81(7), p. 2506-2514）（図３参照）。
　この系では、まず化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来Cas9エンドヌクレアーゼ、λ-Redリコンビナーゼ（アラビノース誘導）、及び複製起点pMB1を標的とするガイドRNA（IPTG誘導）をコードする温度感受性プラスミドpCasを大腸菌に導入する。次にpCasを導入した大腸菌に、標的遺伝子に特異的なガイドRNAを発現するプラスミドを導入することで、細胞内で発現したCas9と標的遺伝子特異的ガイドRNAを発現するプラスミドとが複合体を形成し、ゲノム上の標的位置でDNA二本鎖を切断し、細胞死を引き起こす。しかし、ガイドRNA発現プラスミドの導入と共に、組換えを起こさせたい鋳型DNA断片の導入と、アラビノース存在下での培養を行うと、アラビノースによって発現が誘導されたλ-Redリコンビナーゼの作用により、ゲノム上の標的位置で切断されたDNAと鋳型DNA断片での相同組み換えが起きる。結果として、ゲノムが修復され、ゲノム上に鋳型DNA断片が組み込まれた大腸菌細胞を得ることができる。
　また、pCasにはIPTGにより誘導されるpMB1複製起点特異的sgRNAがコードされており、ゲノム相同組み換えの後、獲得した形質転換体をIPTG存在下で培養することでpMB1複製起点を持つ標的遺伝子特異的なガイドRNA発現プラスミドはCas9によって切断され、除去される。
　さらに、pCasは温度感受性複製起点を持つことから、培養温度を37℃あるいは42℃に上げて形質転換体を培養することにより容易に除去することができるシステムとなっている。
　まず、ガイドRNA発現プラスミドの構築のため、設計したcrRNA配列を組み込むベクターの作製を行った。QiらによるtracrRNA配列及びガイドRNAの構成発現プロモーター配列（Cell, 2013, vol. 152(5), p. 1173-1183）を参考に、この配列中のtracrRNA配列の5’側に制限酵素NotIの認識部位を挿入した配列をユーロフィンジェノミクスの人工遺伝子合成サービスを利用してpEX-A2ベクターに挿入したpEX-A2-sgRNAを構築した（配列番号１１、図４参照）。
　なお、配列番号１１で表される塩基配列において、86-147位の塩基配列は「tracrRNA」であり、155-227位の塩基配列は「Pj23119 promoter」であり、255-370位の塩基配列は「lac promoter」であり、587-1260位の塩基配列は「pMB1 ori」であり、1405-2266位の塩基配列は「bla」である。
（３）ゲノム編集を用いた大腸菌外膜タンパク質非保存領域の特異的切断
　次に、前述のOmpAの細胞外領域１を標的としたcrRNA配列を持つガイドRNA発現プラスミドを構築するため、オリゴヌクレオチドompA1_sgRNA_N20（配列番号１２、5’-CCGCAGCGGTTTCAGTGTTGATGAAACCAGTGTCAGTTTTAGAGCTAGAA-3’、下線はpEX-A2-sgRNAとの相同配列）とその相補鎖オリゴヌクレオチドompA1_sgRNA_com（配列番号１３、5’-TTCTAGCTCTAAAACTGACACTGGTTTCATCAACACTGAAACCGCTGCGG-3’、下線はpEX-A2-sgRNAとの相同配列）をアニーリングして2本鎖DNA断片とし、NotIで切断したpEX-A2-sgRNAへIn-Fusion HD Cloning kit（Takara bio社製）を用いpsgRNA-ompA1-14を構築した（図５参照）。
　同様に、OmpAの細胞外領域２を標的としたcrRNA配列を持つガイドRNA発現プラスミドを構築するため、オリゴヌクレオチドompA2_sgRNA_N20（配列番号１４、5’-CCGCAGCGGTTTCAGTGTTGATGAAACCAGTGTCAGTTTTAGAGCTAGAA-3’、下線はpEX-A2-sgRNAとの相同配列）とその相補鎖オリゴヌクレオチドompA2_sgRNA_com（配列番号１５、5’-TTCTAGCTCTAAAACTTGTACGGCATACGACCTAACTGAAACCGCTGCGG-3’、下線はpEX-A2-sgRNAとの相同配列）をアニーリングして2本鎖DNA断片とし、NotIで切断したpEX-A2-sgRNAへIn-Fusion HD Cloning kit（Takara bio社製）を用いpsgRNA-ompA2-29を構築した（図５参照）。
　pCas（カナマイシン耐性）を導入した大腸菌W3110 typeAに、psgRNA-ompA1-14（アンピシリン耐性）又はpsgRNA-ompA2-29（アンピシリン耐性）を導入した。しかし、アンピシリン耐性能をもつ大腸菌形質転換体を得ることができなかった。
　これらの結果より、前記psgRNA-ompA1-14及びpsgRNA-ompA2-29は、Cas9依存的にゲノム上のそれぞれ標的とするompA遺伝子部位を切断することを確認した。
（４）大腸菌外膜タンパク質非保存領域へのCuイオン結合ペプチドモチーフの導入
　外膜表面に呈示されるCuイオン結合ペプチドモチーフとして大腸菌転写因子CueRのCu結合モチーフ（配列番号４）に着目した。
　CueRのCuイオン結合ペプチドモチーフは２１個のアミノ酸残基（2HN-CPGDDSADCPILENLSGCCHH-COOH、配列番号４）で構成されており（Science, 2003, vol. 301(5638), p. 1383-1387）、この両端側にそれぞれ３個ずつグリシン残基を付加した２７アミノ酸残基の配列をOmpAに導入した。その詳細を下記に示す。
　CueR遺伝子がクローンされるpBAD33_cueRプラスミド（配列番号１６、図６参照）を鋳型として、ompA1_cueRpep_F（配列番号１７、5’-TAAACTGGGCTGGTCCCAGTACCATGACACTGGTTTCATCGGCGGCGGCTGCCCTGGCGATGAC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域１の相当する配列と相同）とompA1_cueRpep3_R（配列番号１８、5’-CAGCGCCCAGTTGGTTTTCATGGGTCGGGCCATTGTTGTTGCCGCCGCCATGATGACAGCAGCC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域１の相当する配列と相同）をプライマーとしたKOD-Plus-Neo（Toyobo）によるPCRを行った。この操作により、OmpAの細胞外領域１に組み換え導入できる、161bpのCuイオン結合ペプチドモチーフをコードするDNA断片（以下、「ompA1cueRpep3」という）を増幅した（図６参照）。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　なお、配列番号１６で表される塩基配列において、: 96-974位の塩基配列は「araC」であり、1004-1019位の塩基配列は「araO2」であり、1161-1172位の塩基配列は「araO1」であり、1203-1216位の塩基配列は「CAP_BS」であり、1213-1251位の塩基配列は「AraI1I2」であり、1248-1276位の塩基配列は「ARA_promoter」であり、1356-1760位の塩基配列は「cueR」であり、1761-1784位の塩基配列は「FLAG tag」であり、1878-2035位の塩基配列は「rrnB_terminator」であり、2001-2044位の塩基配列は「rrnB_T1_terminator」であり、2176-2203位の塩基配列は「rrnB_T2_terminator」であり、2244-2272位の塩基配列は「bla_promoter」であり、2441-2725位の塩基配列は「bla (576-860)」であり、2784-3083位の塩基配列は「f1_origin」であり、3777-4436位の塩基配列は「CAT/CamR」であり、4798-5637位の塩基配列は「p15A_origin」である。
　同様に、ompA2_cueRpep_F（配列番号１９、5’-AATGGGTTACGACTGGTTAGGTCGTATGCCGTACAAAGGCGGCGGCGGCTGCCCTGGCGATGAC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域２の相当する配列と相同）とompA2_cueRpep3_R（配列番号２０、5’-GTTGAACGCCCTGAGCTTTGTATGCACCGTTTTCAACGCTGCCGCCGCCATGATGACAGCAGCC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域２の相当する配列と相同）をプライマーとしたPCRを行い、OmpAの細胞外領域２に組み換え導入できる161bpのCuイオン結合ペプチドモチーフDNA断片（以下、「ompA2cueRpep3」という）を増幅した（図６参照）。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　つぎに、pCasを有する大腸菌W3110 typeA（J. Bacteriol., 1997, vol. 179(3), p. 959-963）のエレクトロポレーション用コンピテント細胞を作製した。そして、ompA遺伝子の細胞外領域１の特異的切断のためのガイドRNA発現プラスミドpsgRNA-ompA1-14と、組み換え用DNA断片ompA1cueRpep3を用いた形質転換を行った。LB寒天培地（10g/L tryptone（Difco）、5g/L yeast extract（Difco）、171mM NaCl、15g/L agar）に塗布して30℃で終夜培養し、形質転換体YM0501を得た。
　YM0501はアンピシリン感受性を示した。このアンピシリン感受性を示した株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、組換えompA遺伝子のみを特異的に増幅するプライマーセットompA_F（配列番号２１、5’-GCAGATCCCCCGGTGAAGGA-3’）とompA1_cueRpep3_R（配列番号１８）を用いてPCRを行った。その結果、W3110 typeAでは増幅が見られなかったのに対し、YM0501では目的断片の増幅が見られた。
　また同様に、ompA遺伝子の細胞外領域２特異的切断のためのガイドRNA発現プラスミドpsgRNA-ompA2-29と、組み換え用DNA断片ompA2cueRpep3を用いた形質転換を行った。LB寒天培地に塗布して30℃で終夜培養し、形質転換体YM0701を得た。
（５）大腸菌外膜タンパク質非保存領域へのTbイオン結合ペプチドモチーフの導入
　外膜表面に呈示されるTbイオン結合ペプチドモチーフとしてCaイオン結合EF-handモチーフ（Trends Biochem. Sci., 1996, vol. 21, p. 14-17参照）由来の変異体（配列番号６）に着目した（Chembiochem., 2003, vol. 4(4), p. 272-276）。
　１７個のアミノ酸残基から成る変異のTbイオン結合ペプチドモチーフ（2HN-YIDTNNDGWYEGDELLA-COOH、配列番号６）（Chembiochem., 2003, vol. 4(4), p. 272-276）の両端側にそれぞれ３個ずつグリシン残基を付加した２３アミノ酸残基の配列をOmpAに導入した。その詳細を下記に示す。
　Tbイオン結合ペプチドモチーフ遺伝子がクローンされるpGEX-4T-1-TbB-peptide1プラスミド（配列番号２２、図７参照）を鋳型として、ompA1_TbBpep1_F（配列番号２３、5’-TAAACTGGGCTGGTCCCAGTACCATGACACTGGTTTCATCGGCGGCGGCTATATTGATACCAAC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域１の相当する配列と相同）とompA1_TbBpep1_R（配列番号２４、5’-CAGCGCCCAGTTGGTTTTCATGGGTCGGGCCATTGTTGTTGCCGCCGCCCGCCAACAATTCATC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域１の相当する配列と相同）をプライマーとしたKOD-Plus-Neo（Toyobo）によるPCRを行った。この操作により、OmpAの細胞外領域1に組み換え導入できる149bpのTbイオン結合ペプチドモチーフをコードするDNA断片（以下、「ompA1TbBpep1」という）を増幅した（図７参照）。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　なお、配列番号２２で表される塩基配列において、184-212位の塩基配列は「tac promoter」であり、258-944位の塩基配列は「GST-a」であり、945-953位の塩基配列は「Glycine」であり、954-1004位の塩基配列は「TbB-peptide1」であり、1005-1007位の塩基配列は「Glycine」であり、1008-1026位の塩基配列は「GST-b」であり、1422-2282位の塩基配列は「bla」であり、2438-3056位の塩基配列は「pBR322 ori」であり、3354-4445位の塩基配列は「lac I」である。
　同様にompA2_TbBpep1_F（配列番号２５、5’-AATGGGTTACGACTGGTTAGGTCGTATGCCGTACAAAGGCGGCGGCGGCTATATTGATACCAAC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域２の相当する配列と相同）とompA2_TbBpep1_R（配列番号２６、5’-GTTGAACGCCCTGAGCTTTGTATGCACCGTTTTCAACGCTGCCGCCGCCCGCCAACAATTCATC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域２の相当する配列と相同）をプライマーとしたPCRを行い、OmpAの細胞外領域２に組み換え導入できる149bpのTbイオン結合ペプチドモチーフDNA断片（以下、「ompA2TbBpep1」という）を増幅した（図７参照）。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　つぎに、前述の方法と同様にして、pCasを有する大腸菌W3110 typeA（J. Bacteriol., 1997, vol. 179(3), p. 959-963）にエレクトロポレーションによって、ompA遺伝子の細胞外領域１の特異的切断のためのガイドRNA発現プラスミドpsgRNA-ompA1-14と、組み換え用DNA断片ompA1TbBpep1を用いた形質転換を行い、形質転換体YM0901を得た。
　同様に、ompA遺伝子の細胞外領域２の特異的切断のためのガイドRNA発現プラスミドpsgRNA-ompA2-29と、組み換え用DNA断片ompA2TbBpep1を用いた形質転換を行い、形質転換体YM1101を得た。
　さらに、前記Tbイオン結合ペプチドモチーフとは異なるTbイオン結合ペプチドモチーフとして、１７個のアミノ酸残基から成る変異の異なるTbイオン結合ペプチドモチーフ（2HN-ACVDWNNDGWYEGDECA-COOH、配列番号７）（Chembiochem., 2003, vol. 4(4), p. 272-276）の両端側にそれぞれ３個ずつグリシン残基を付加した２３アミノ酸残基の配列をOmpAに導入することとした。
　このTbイオン結合ペプチドモチーフ遺伝子がクローンされるpGEX-4T-1-TbB-peptide2プラスミド（配列番号２７、図８参照）を鋳型として、ompA1_TbBpep2_F（配列番号２８、5’-TAAACTGGGCTGGTCCCAGTACCATGACACTGGTTTCATCGGCGGCGGCGCGTGCGTGGATTGG-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域１の相当する配列と相同）とompA1_TbBpep2_R（配列番号２９、5’-CAGCGCCCAGTTGGTTTTCATGGGTCGGGCCATTGTTGTTGCCGCCGCCCGCGCATTCATCGCC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域１の相当する配列と相同）をプライマーとしたKOD-Plus-Neo（Toyobo）によるPCRを行った。この操作により、OmpAの細胞外領域１に組み換え導入できる149bpのTbイオン結合ペプチドモチーフをコードするDNA断片（以下、「ompA1TbBpep2」という）を増幅した。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　なお、配列番号２７で表される塩基配列において、184-212位の塩基配列は「tac promoter」であり、258-944位の塩基配列は「GST-a」であり、945-953位の塩基配列は「Glycine」であり、954-1004位の塩基配列は「TbB-peptide2」であり、1005-1007位の塩基配列は「Glycine」であり、1008-1026位の塩基配列は「GST-b」であり、1422-2282位の塩基配列は「bla」であり、2438-3056位の塩基配列は「pBR322 ori」であり、3354-4445位の塩基配列は「lac I」である。
　同様にompA2_TbBpep2_F（配列番号３０、5-AATGGGTTACGACTGGTTAGGTCGTATGCCGTACAAAGGCGGCGGCGGCGCGTGCGTGGATTGG-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域２の相当する配列と相同）とompA2_TbBpep2_R（配列番号３１、5’-GTTGAACGCCCTGAGCTTTGTATGCACCGTTTTCAACGCTGCCGCCGCCCGCGCATTCATCGCC-3’、下線はゲノム上のompA遺伝子の細胞外領域２の相当する配列と相同）をプライマーとしたPCRを行い、OmpAの細胞外領域２に組み換え導入できる149bpのTbイオン結合ペプチドモチーフDNA断片（以下、「ompA2TbBpep2」という）を増幅した（図８参照）。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　つぎに、前述の方法と同様にして、pCasを有する大腸菌W3110 typeA（J. Bacteriol., 1997, vol. 179(3), p. 959-963）にエレクトロポレーションによって、ompA遺伝子の細胞外領域１の特異的切断のためのガイドRNA発現プラスミドpsgRNA-ompA1-14と、組み換え用DNA断片ompA1TbBpep2を用いた形質転換を行い、形質転換体YM1001を得た。
　同様に、ompA遺伝子の細胞外領域２の特異的切断のためのガイドRNA発現プラスミドpsgRNA-ompA2-29と、組み換え用DNA断片ompA2TbBpep2を用いた形質転換を行い、形質転換体YM1201を得た。
　以上のように作製した、形質転換体YM0501、YM0901、及びYM1001の構造の概略を図９に示す。また、形質転換体YM0701、YM1101、及びYM1201の構造の概略を図１０に示す。
試験例２　金属イオン結合モチーフを大腸菌外層の表面に呈示される組み換え体の増殖
　試験例１で作製した各形質転換体をそれぞれ、M9グルコース培地（0.4mM Na2HPO4・12H2O、2mM KH2PO4、0.8mM NaCl、0.1mM CaCl2・2H2O、20mM NH4Cl、1mM MgCl2・6H2O、0.25mM K2SO4、10mM D-(+)-glucose）にて37℃で培養し、継時的にOD600nmを測定した。その結果を図１１及び図１２に示す。
　図１１及び図１２に示すように、いずれの形質転換体についても、親株のW3110 typeAと同様の増殖曲線が得られた。これらの結果より、本発明の形質転換体は、その増殖に影響することなく、細胞外層の表面に金属イオン結合ペプチドモチーフを呈示できることを証明した。
　ompA遺伝子の細胞外領域１にCuイオン結合モチーフを挿入した大腸菌形質転換体YM0501は、細胞外層の表面にCuイオン結合モチーフを提示した状態となっている。
　この形質転換体YM0501とその親株（W3110 typeA）とをそれぞれ、5mM CuCl2を添加したLB液体培地（10g/L tryptone（Difco）、5g/L yeast extract（Difco）、171mM NaCl）にて37℃で終夜培養し、OD600nmを測定した。
　その結果、親株のW3110 typeAのOD600nmの値は0.410であったのに対し、形質転換体YM0501のOD600nmの値は1.299と親株よりも高い値を示した（図１３参照）。
　このことから、細胞外層の表面に提示されたCuイオン結合モチーフが環境中のCuイオンと結合することにより、形質転換体YM0501のCuイオン耐性が向上していることが証明された。
試験例３　組み換え大腸菌からのベシクルの作製
　前記形質転換体YM0501をLB液体培地（10g/L tryptone（Difco）、5g/L yeast extract（Difco）、171mM NaCl）1Lにて37℃で終夜培養した。培養液を遠心、及びφ0.45μmフィルターを用いたフィルター濾過により、菌体を除去した。そして、濾過液の超遠心（150,000×g、1時間）により、溶液中に存在する、自然生成したベシクルを分離及び濃縮した。ベシクルを含む沈殿物をリン酸緩衝液（pH7.0）で懸濁し、ベシクル溶液を作製した。
　ベシクルはFM4-64（商品名：SynapseRed C2（equivalent to FM4-64）、タカラバイオより入手）により染色し、共焦点レーザー顕微鏡Zeiss LSM510 META（Carl Zeiss）を用いて確認した。その結果を図１４（Ｂ）に示す。また、FM4-64で染色した形質転換体YM0501の顕微鏡写真を図１４（Ａ）に併せて示す。なお、FM4-64は疎水性の赤色蛍光物質であり、脂質二重膜を染色する。本試験例では、大腸菌及びベシクルのリン脂質二重膜を染色するために、FM4-64を使用した。
　図１４（Ｂ）では、図１４（Ａ）に見られるような大腸菌の菌体が確認されなかった。実際、図１４（Ｂ）では直径数百nm程の小胞（ベシクル）が多数見られ、大腸菌から産生されるベシクルの直径は一般に数十～数百nmであることと一致した。さらに、Bradford法によりベシクル溶液中にタンパク質が含まれていることを確認した。
　以上の結果は、前述の操作により、形質転換体からベシクルの調製に成功したことを示している。
試験例４　金属イオン結合ペプチドモチーフを細胞外層の表面に呈示される組み換え大腸菌の死菌体を用いた金属の回収
　大腸菌由来のOmpCは１６箇所の膜貫通領域をもち、結果として細胞外に呈示される８つの細胞外領域を有している。以下、８つの細胞外領域をそれぞれ、「細胞外領域１（Extracellular-1）」、「細胞外領域２（Extracellular-2）」、「細胞外領域３（Extracellular-3）」、「細胞外領域４（Extracellular-4）」、「細胞外領域５（Extracellular-5）」、「細胞外領域６（Extracellular-6）」、「細胞外領域７（Extracellular-7）」、「細胞外領域８（Extracellular-8）」という（図１６参照）。
　このうち、細胞外領域１と細胞外領域８に金属イオン結合ペプチドモチーフを挿入する標的とした（図１８参照）。
　まず、ompC遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　pBAD33（J. Bacteriol. 1995, vol. 177(14), p. 4121-4130）にompC領域を挿入するため、プライマーの設計を行ｓった。pBAD33との相同配列15塩基にS.D.配列を含む14塩基、標的遺伝子ompCの開始コドンから25塩基を含む計54塩基のプライマーOmpC_BAD_F（配列番号３８）を設計した。また、上流からompC遺伝子の終始コドンを除いた25塩基、FLAG配列と終始コドンを含む30塩基、pBAD33との相同配列15塩基を含む計70塩基のプライマーOmpC_BAD_R（配列番号３９）を設計した。
　大腸菌W3110 Type Aのゲノム（J. Bacteriol. 1997, vol. 179(3), p. 959-963）を鋳型DNAとして、前記プライマーOmpC_BAD_Fー及びOmpC_BAD_Rを用いてPCRを行い、ompC遺伝子領域を増幅した。ExTaq polymerase（Takara bio）を用いてPCRを行い、2%アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を確認したところ、目的DNA断片（1177 bp）の増幅が確認できた。そこで、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit（Cherey-Nagel）を用いてDNA断片を精製した。得られたpBAD33との相同配列を含むompC断片をOmpC-BAD fragmentとした。
　その後、HindIII及びSacIで制限酵素処理したpBAD33と、OmpC-BAD fragmentをIn-Fusion HD Cloning Kit（Takara bio）によって相同組み換えにより連結し、CaCl2法による形質転換によって大腸菌DH5αに導入し、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地においてコロニーを獲得した。出現したコロニーからFavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit（Favorgen）によってプラスミドを抽出し、抽出したプラスミドのDNA塩基配列決定を行い、プラスミドpBADompC-FLAGを獲得した（図１７参照）。
　つぎに、pBADompC-FLAGの細胞外領域１のコーディング領域にTb結合ペプチドモチーフ２（H2N-ACVDWNNDGWYEGDECA-COOH、配列番号７）を導入するため、Inverse PCRにより前記pBADompC-FLAGプラスミドの線状DNAを調製した。
　プライマーompC1a_inv_F（5’-ATCTTTGTTGTCAGAGAAATAGTGC-3’、配列番号４０）及びプライマーompC1a_inv_R（5’-GATGGCGACCAGACCTACATGCGTC-3’、配列番号４１）を用いて、Pfu Ultra High Fidelity DNA Polymerase AD（Agilent）を用いたPCRにより目的のDNA（6452塩基対）を増幅した。その後、PCR産物をDpnIで消化し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kitを用いてDNA精製を行った。
　Tbイオン結合ペプチドモチーフ２遺伝子がクローンされるpGEX-4T-1-TbB-peptide2プラスミドを鋳型として、プライマーompC1a_TbBpep2_F-2（5’-TCTGACAACAAAGATGGCGGCGGCGCGTGCGTGGATTGG-3’、配列番号４２）とプライマーompC1a_TbBpep2_R-2（5’-GGTCTGGTCGCCATCGCCGCCGCCCGCGCATTCATCGCC-3’、配列番号４３）を用いてKOD-Plus-Neo（Toyobo）によるPCRを行った。この操作により、OmpCの細胞外領域１に導入できる、Tbイオン結合ペプチドモチーフ２をコードする99塩基対のDNA断片（以下、「ompC1TbBpep2」という）を増幅した。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　pBADompC-FLAGの線状ベクターとompC1TbBpep2をIn-Fusion HD Enzymeによって相同組み換えにより連結し、CaCl2法による形質転換によって大腸菌DH5αに導入し、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地においてコロニーを獲得した。出現したコロニーからFavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit（Favorgen）によってプラスミドを抽出し、抽出したプラスミドのDNA塩基配列決定を行い、プラスミドpBADompC1-TBpep2を獲得した（図１９（Ａ）参照）。
　さらに、pBADompC1-TBpep2のOmpC細胞外領域８のコーディング領域にTb結合ペプチドモチーフ２（H2N-ACVDWNNDGWYEGDECA-COOH、配列番号７）を追加導入した。Inverse PCRにより前記pBADompC1-TBpep2の線状DNAを調製した。
　プライマーompC8f_inv_F（5’-CTGGTTGTCGTCCAGCAGGTTGATT-3’、配列番号４４）、プライマーompC8f_inv_R（5’-ACTCGTGACGCTGGCATCAACACTG-3’、配列番号４５）を用いて、Pfu Ultra High Fidelity DNA Polymerase AD（Agilent）を用いたPCRにより目的のDNAを増幅した。その後、PCR産物をDpnIで消化し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kitを用いてDNA精製を行った。
　Tbイオン結合ペプチドモチーフ２遺伝子がクローンされるpGEX-4T-1-TbB-peptide2プラスミドを鋳型として、プライマーompC8f_TbBpep2_F-2（5’-CTGGACGACAACCAGGGCGGCGGCGCGTGCGTGGATTGG-3’、配列番号４６）とプライマーompC8f_TbBpep2_R-2（5’-GCCAGCGTCACGAGTGCCGCCGCCCGCGCATTCATCGCC-3’、配列番号４７）を用いてKOD-Plus-Neo（Toyobo）によるPCRを行った。この操作により、OmpCの細胞外領域８に導入できる、Tbイオン結合ペプチドモチーフ２をコードする99塩基対のDNA断片（以下、「ompC8TbBpep2」という）を増幅した。増幅したDNA断片は、QIA quick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。
　pBADompC-FLAGの線状ベクターとompC8TbBpep2をIn-Fusion HD Enzymeによって相同組み換えにより連結し、CaCl2法による形質転換によって大腸菌DH5αに導入し、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地においてコロニーを獲得した。出現したコロニーからFavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit（Favorgen）によってプラスミドを抽出し、抽出したプラスミドのDNA塩基配列決定を行い、プラスミドpBADompC18-TBpep2を獲得した（図１９（Ｂ）参照）。
　構築したプラスミドpBADompC1-TBpep2、pBADompC18-TBpep2、pBADompC-FLAG及びプラスミドpBAD33を大腸菌JW2203（ompC::Kmr）（Mol. Syst. Biol. 2006, Vol. 2, 2006.0008.）へ導入した。
　大腸菌JW2203 のCaCl2用コンピテントセルを作成し、pBADompC1-TBpep2、pBADompC18-TBpep2、pBADompC-FLAG、pBAD33プラスミド溶液を加え、CaCl2法による形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上でコロニーを獲得した。得られた形質転換体（図２０（Ａ）及び（Ｂ）参照）をクロラムフェニコールとアラビノース（終濃度0.002%）を含むLB培地で培養し、集菌後、細胞懸濁溶液（20mM Tris-HCl pH 8.0/20% sucrose）で懸濁した。細胞懸濁液にリゾチーム（200μg/mL）とEDTA（終濃度0.1M）を添加し、氷上で40分静置した。その後、MgCl2（終濃度0.5M）を加え、遠心分離（10,000rpm、20分、4℃）によって得られたスフェロプラストの沈殿をスフェロプラスト懸濁溶液（10mM Tris-HCl pH8.0）で懸濁後、超音波（Amplitude 15%、Pulse ON/OFF 10秒、全90秒間）処理を行った。
　溶液を遠心分離（10,000 rpm、15分、4oC）し、その後上清を超遠心分離（30,000 rpm、60分）を2度行い、凍結融解を行った後、得られた膜画分を1% N-lauroylsarcinosinate（終濃度0.5%）で懸濁した。25℃で20分保温した後、再度超遠心分離（30,000 rpm、90分）を行い、得られた沈殿を外膜画分とした。外膜画分は外膜可溶溶液（20mM Tris-HCl pH 8.0/20% sucrose/2%SDS）で溶解し、Bradford法によってタンパク質量を定量した。
　これらの外膜に対して、尿素（終濃度7.5%）を含むアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで分析した結果、45kDa付近にpBAD33をもつ大腸菌JW2203株では確認できないが（図２１（Ａ）のレーン１参照）、pBADompC-FLAGをもつ大腸菌JW2203株で確認するOmpCと推定されるタンパク質バンドを検出した（図２１（Ａ）のレーン２参照）。また、このタンパク質バンドはpBADompC1-TBpep2をもつJW2203株では少し移動度が遅いものであったことから、Tbイオン結合ペプチドモチーフ２を含むOmpCであると推定した（図２１（Ａ）のレーン３参照）。
　上記結果を確認するために、FLAG抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。各形質転換体由来の外膜画分に対して、尿素（終濃度7.5%）を含むアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで電気泳動し、ゲル中のタンパク質をiBlot Gel Transfer Stacks PVDF（Invitrogen）へ転写した。転写PVDF膜はスキムミルク（終濃度3%）を含むTBS溶液（50mM Tris/150mM NaCl/1M HCl pH7.5）でブロッキングし、FLAG抗体（Sigma）を加えたスキムミルク（終濃度1%）を含むTBSに一晩振とうして晒することで、一次抗体によるPVDF上の免疫反応を行った。その後、転写したPVDF膜はスキムミルク（終濃度1%）を含むTBSで洗浄し、HRP結合マウスIgG抗体を加えたスキムミルク（終濃度1%）を含むTBSに2時間振とうし、二次抗体による免疫反応を行った。免疫反応させた転写PVDF膜はスキムミルク（終濃度1%）を含むTBSと精製水で洗浄し、Chemilmi One Super（ナカライテスク株式会社）によって膜上のHRP化学発光をLAS-4000（Fujifilm）を検出した。その結果、45kDa付近にpBADompC-FLAGをもつ大腸菌JW2203株でバンドを検出し、pBADompC1-TBpep2をもつ大腸菌JW2203株では少し移動度が遅いバンドを検出した（図２１（Ｂ）のレーン２及び３参照）。しかし、pBAD33をもつ大腸菌JW2203株ではバンドを確認できなった（図２１（Ｂ）のレーン１参照）。
　これらの結果より、pBADompC1-TBpep2は大腸菌細胞内でTbイオン結合ペプチドモチーフ２を含むOmpCを外膜上に発現させることを確証した。
　大腸菌形質転換体をクロラムフェニコールとアラビノース（終濃度0.002%）を含むLB培地で培養し、オートクレーブにより菌体を死滅させた。この死菌体の吸着挙動の評価を実施した。
　死菌体を純水１ｍＬで懸濁した際に、６６０ｎｍの波長で１．０ＯＤ（Optical Density）の濁度になる液量を遠心で集菌した。集めた死菌体を、１００μＭの濃度のTbCl３を含んだ５０ｍＭ濃度のＭＥＳ（ｐＨ４．５）水溶液１ｍＬに懸濁したのち、再沈殿しないよう攪拌を３０分間続けた後、遠心して菌体と上清とに分離した。この上清を吸着後上清とした。
　死菌体を懸濁する前の金属溶液原液（TbCl３を含んだＭＥＳ水溶液）と吸着後上清の各溶液について、５％硝酸で１０倍に希釈し、ＩＣＰ－ＡＥＳ（Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy）によってそれぞれのTb3+イオン濃度を求め、死菌体に吸着したTb3+イオンの吸着率を算出した。吸着率は以下の式より算出した。
 
（吸着率/%）＝
（１-（吸着後上清のTb3+イオン濃度）/（金属溶液原液のTb3+イオン濃度））
 
　その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、大腸菌株１でのTb3+イオンの吸着量は、大腸菌体表層へのTb3+イオンの非特異吸着によるものと考えられる。一方で、Tbイオン結合ペプチドモチーフが外膜に呈示されている大腸菌株２及び３では、大腸菌株１よりも大きいTb3+イオン吸着率を示している。
　よって、外膜上にOmpC1a-TbBpep2又はOmpC1aC8f-Tbpep2を発現している死菌体の大腸菌株２及び３では、発現してない死菌体である大腸菌株１に比べて優位なTb3+イオンの吸着をしていることから、OmpC1a-TbBpep2又はOmpC1aC8f-Tbpep2はTb3+イオンを吸着する能力を保有することが確認できた。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、２０１７年５月２日に日本国で特許出願された特願２０１７－０９１５０３に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
１　外膜
２　内膜
３　ポリン
４　金属イオン結合ペプチドモチーフ
１０　組換え微生物又はその死菌体
２０　ベシクル

Claims (13)

  1. 　金属回収用担体と、金属イオンを含有する媒体とを接触させて、
    　前記媒体に含まれる金属イオンを前記金属回収用担体の外層表面に結合させ、
    　前記媒体から前記金属回収用担体を分離する、
    金属の回収方法であって、
    前記金属回収用担体は、外層がリン脂質二重膜から構成される非生命活動体であり、
    グラム陰性菌由来のポリンが、前記リン脂質二重膜を貫通し、
    前記ポリンのアミノ酸配列中、前記グラム陰性菌においてポリン機能を損なわない領域に、金属イオン結合ペプチドモチーフが導入されており、
    前記金属イオン結合ペプチドモチーフが、前記リン脂質二重膜の表面に呈示される、
    金属の回収方法。
  2. 　前記ポリンがOmpA、OmpC又はOmpFである、請求項１に記載の金属の回収方法。
  3. 　前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号８で表されるアミノ酸配列の３８～５４位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号８で表されるアミノ酸配列の７９～９５位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、請求項１又は２に記載の金属の回収方法。
  4. 　前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号９で表されるアミノ酸配列の４３～５３位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号９で表されるアミノ酸配列の３３９～３５８位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、請求項１又は２に記載の金属の回収方法。
  5. 　前記金属回収用担体がベシクルである、請求項１～４のいずれか１項に記載の金属の回収方法。
  6. 　前記金属回収用担体がグラム陰性菌の死菌体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の金属の回収方法。
  7. 　外層がリン脂質二重膜から構成される非生命活動体であり、
    グラム陰性菌由来のポリンが、前記リン脂質二重膜を貫通し、
    前記ポリンのアミノ酸配列中、前記グラム陰性菌においてポリン機能を損なわない領域に、金属イオン結合ペプチドモチーフが導入されており、
    前記金属イオン結合ペプチドモチーフが、前記リン脂質二重膜の表面に呈示されている、
    金属回収用担体。
  8. 　前記ポリンがOmpA、OmpC又はOmpFである、請求項７に記載の金属回収用担体。
  9. 　前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号８で表されるアミノ酸配列の３８～５４位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号８で表されるアミノ酸配列の７９～９５位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、請求項７又は８に記載の金属回収用担体。
  10. 　前記ポリンへの前記金属イオン結合ペプチドモチーフの導入部位が、配列番号９で表されるアミノ酸配列の４３～５３位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、並びに配列番号９で表されるアミノ酸配列の３３９～３５８位までの領域若しくはこれに相当する領域の任意の部位、からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位である、請求項７又は８に記載の金属回収用担体。
  11. 　ベシクルである、請求項７～１０のいずれか１項に記載の金属回収用担体。
  12. 　グラム陰性菌の死菌体である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の金属回収用担体。
  13. 　請求項７～１２のいずれか１項に記載の金属回収用担体が固定化されている、金属の回収用バイオリアクター。
     
     
     
     
     
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