WO2018199465A1 - 재귀반사 현상을 이용한 분자 비콘 기반의 광학 유전자 바이오센서 및 이를 이용한 핵산 분자의 정량 분석 방법 - Google Patents

재귀반사 현상을 이용한 분자 비콘 기반의 광학 유전자 바이오센서 및 이를 이용한 핵산 분자의 정량 분석 방법 Download PDF

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light
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nucleic acid
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윤현철
김재호
한용덕
전형진
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아주대학교산학협력단
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Definitions

  • a fluorescent dye is modified at one end of an oligonucleotide, and a quencher capable of absorbing and quenching fluorescence derived from the fluorescent dye at another end thereof. Is modified.
  • fluorescent dyes provide a valid signal only for excitation light spectroscopically at a specific wavelength
  • conventional biosensors have a halogen-based lamp that provides all wavelengths as a light source and a monochrome that can selectively irradiate specific wavelengths therefrom.
  • Monochromators must be used in combination, or high power lasers and LEDs providing short wavelengths should be used. In this case, since these light sources are very expensive and require high power consumption, there is a problem that miniaturization, portability, and commercialization are difficult.
  • the oligonucleotide is a loop section having a nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid molecule, a first stem section extending from the first end of the loop section and the first compound is bonded to the end and the loop And a second stem section extending from the second end of the section and having a base sequence complementary to the first stem section and bound to the substrate.
  • the loop section may include 20 to 40 base sequences
  • the first and second stem sections may include 4 to 8 base sequences, respectively.
  • the first compound may comprise biotin, in which case the molecular beacon moiety is an alkyl body having from 4 to 10 carbons that bonds the first compound to the end of the first stem segment or It may further comprise a first spacer compound comprising about 4 to 10 (mer) mini-poly (ethylene glycol).
  • the optical label portion is a transparent core particle; A total reflection inducing layer covering a part of the surface of the core particle and formed of a material having a refractive index smaller than that of the core particle in a visible light wavelength range of at least 360 nm to 820 nm; A modified layer formed on the total reflection inducing layer; And a second compound bonded to the modifying layer and selectively bonding to the first compound.
  • the core particles may have an average diameter of 600nm or more and 2 ⁇ m or less, and the total reflection inducing layer may cover an area of 30% or more and 70% or less of the surface of the core particles.
  • the total reflection inducing layer may have a thickness of 10 to 100nm.
  • the modifying layer may be formed of one or more materials selected from the group consisting of platinum (Pt), gold (Au) and silver (Ag).
  • the first compound of the molecular beacon portion may include a ligand molecule group
  • the second compound of the optical label unit may include a protein compound capable of selectively binding to the ligand molecule group.
  • the first compound of the molecular beacon portion may include one or more selected from biotin, dinitrophenyl (DNP), digoxigenin (DIG), and the like.
  • the two compounds may include protein compounds that can selectively bind to them.
  • the second compound of the optical labeling portion is avidin and streptavidin capable of selectively binding to the biotin.
  • the second compound of the optical label portion may be selectively bound to the dinitrophenyl (DNP) anti-DNP antibody (anti- DNP antibody) may be included.
  • the first compound of the molecular beacon portion includes digoxigenin (DIG)
  • the second compound of the optical label portion may bind to the digoxigenin (DIG). DIG antibody) may be included.
  • the optical label may further include a magnetic layer disposed between the total reflection inducing layer and the modifying layer and formed of a magnetic material.
  • the light receiving unit may include an image generating unit for receiving and imaging the retroreflective light signal and an image analyzing unit analyzing the image information generated by the image generating unit.
  • the image analyzer may analyze the concentration of the target nucleic acid molecule by counting the number of the optical markers from the image or quantifying the amount of light of the retroreflective signal shown in the image.
  • a quantitative analysis method of a nucleic acid molecule includes the first step of reacting the target nucleic acid molecule to the molecular beacon portion fixed to the substrate; Selectively binding the optical label portion to a molecular beacon portion to which the target nucleic acid molecule is bound; A third step of irradiating light to an optical label attached to the molecular beacon; And a fourth step of generating and analyzing an image of the light retroreflected by the optical label.
  • the optical label portion may be irradiated with white light, in this case, the quantitative analysis of the target nucleic acid molecule may be performed based on the retroreflective signal for the white light.
  • the optical indicator is coupled to the molecular beacon unit, and quantitative analysis is performed on the target nucleic acid molecule using light retroreflected from the optical indicator.
  • quantitative analysis of the target nucleic acid molecules can be performed with high sensitivity without using expensive and bulky optical equipment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an optical gene biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining a molecular beacon unit shown in FIG. 1.
  • 3A and 3B are cross-sectional views illustrating the optical marker shown in FIG. 1.
  • FIG. 4 is a schematic diagram for describing a positional relationship between the light source unit and the light receiving unit shown in FIG. 1.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating a method for quantitative analysis of nucleic acid molecules according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of genetic analysis according to Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of genetic analysis according to Example 2.
  • first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • the first component may be referred to as the second component, and similarly, the second component may also be referred to as the first component.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an optical gene biosensor according to an exemplary embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a molecular beacon unit shown in FIG. 1
  • FIGS. 3A and 3B are optical diagrams shown in FIG. 1.
  • 4 are cross-sectional views illustrating markers
  • FIG. 4 is a schematic diagram for describing a positional relationship between a light source unit and a light receiver unit illustrated in FIG. 1.
  • the optical gene biosensor 100 may quantitatively analyze a target nucleic acid molecule 10 to be detected through an optical method.
  • the optical gene biosensor 100 may include a molecular beacon unit 110, a substrate 120, an optical labeling unit 130, a light source unit 140, and a light receiving unit 150.
  • the molecular beacon unit 110 may include an oligonucleotide 111 that selectively binds to the target nucleic acid molecule 10, and a first compound 112 that selectively binds to the optical label unit 120. have.
  • the oligonucleotide 111 may include a loop section 111a, a first stem section 111b, and a second stem section 111c.
  • the loop section 111a may selectively bind to the target nucleic acid molecule 10.
  • the loop section 111a may hybridize with the target gene 10 by having a base sequence complementary to the target nucleic acid molecule 10.
  • the loop section 111a may include a base sequence of about 20 to 40 in consideration of the base sequence of the target nucleic acid molecule (10).
  • the first stem section 111b may include a plurality of first base sequences extending from a first end of the loop section 111a, and the second stem section 111c may face the first end. It may include a plurality of second base sequence extending from the second end of the loop section 111a, wherein the first base sequence of the first stem section 111b is the second of the second stem section 111c It may be complementary to the base sequence. Therefore, when the target nucleic acid molecule 10 is not bound to the loop section 111a, the oligonucleotide 111 may be formed of the first and second stem sections 111b, as shown on the left side of FIG. 111c) may hybridize with each other to have a hairpin structure. In one embodiment, the first and second stem sections 111b and 111c may comprise about 4 to 8 complementary base sequences.
  • the first compound 112 may be bonded to the end of the first stem section 111b and may specifically bind to the optical label unit 120. Specifically, when the first and second stem sections 111b and 111c are hybridized with each other, the optical label unit 120 may not bind to the first compound 112 due to steric hindrance, but the target When the nucleic acid molecule 10 hybridizes to the loop section 111a and the hybridization of the first and second stem sections 111b and 111c is released, the optical labeling portion 120 may perform the first compound 112. Can be coupled to.
  • the substrate 120 is not particularly limited if the molecular beacon unit 110 can be fixed, the material, shape, etc. of the substrate 120.
  • the substrate 120 may be formed of glass, silicon, polymer, metal, or the like, and may have a flat upper surface to which the molecular beacon unit 110 is coupled.
  • the polymer may include polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), olefin copolymer (COC), polydimethylsiloxane (PDMS), and the like
  • the metal may include gold (Au), platinum (Pt), Precious metals such as silver (Ag).
  • the substrate 120 when the substrate 120 is formed of one of glass and silicon polymer, and the functional group 113 of the molecular beacon unit 110 is an amine group, the substrate 120 may be subjected to plasma treatment or ultraviolet exposure. After activation of the surface treated with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) to expose the amine group, and then treated with an amine reactive crosslinking agent such as glutaraldehyde (glutaraldehyde) after the functional group of the molecular beacon unit 110 The molecular beacon unit 110 may be fixed to the substrate 120 by covalently bonding an amine group with an amine group of the 3-aminopropyltriethoxysilane.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • glutaraldehyde glutaraldehyde
  • a succinimide group is exposed on the surface of the substrate 120.
  • an amine-reactive self-assembled monolayer SAM
  • DTSSP 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) or DTSP (Dithiobis (succinimidyl propionate)
  • DTSSP 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) or DTSP (Dithiobis (succinimidyl propionate)
  • the optical label unit 130 may selectively bind to the first compound of the molecular beacon unit 110, and may retroreflect light emitted from the light source unit 140 in the direction of the light source unit 140. .
  • the core particles 131 may have an average diameter of about 600 nm or more and 2 ⁇ m or less, in consideration of a relationship with a wavelength of light emitted from the light source unit 140 and operability of bio sensing.
  • the core particles 131 may be formed of a transparent material that can transmit incident light.
  • the core particles 131 may be formed of a transparent oxide or a transparent polymer material.
  • the transparent oxide may include, for example, silica, glass, and the like, and the transparent polymer material may include, for example, polystyrene and polymethyl methacrylate. )) And the like.
  • the total reflection inducing layer 132 may be formed on the surface of the core particles 131 to cover an area of about 30% or more and 70% or less of the surface of the core particles 131.
  • the total reflection inducing layer 132 covers less than 30% of the surface of the core particle 131, the amount of light leaked without rereflection is increased among the light incident inside the core particle 131.
  • the sensitivity of 100 may decrease, and when the total reflection inducing layer 132 covers more than 70% of the surface of the core particle 131, the amount of light incident into the core particle 131 is reduced. This may cause a problem that the sensitivity of the gene biosensor 100 is lowered.
  • the total reflection inducing layer 132 may be formed on the surface of the core particle 131 to cover about 40% or more and 60% or less of the surface of the core particle 131.
  • the total reflection induction layer 132 is the core particles to totally reflect at least a portion of the light traveling inside the core particles 131 to increase the amount of light retroreflected in the direction of the light source unit 140. It may be formed of a material having a refractive index smaller than that of 131. In one embodiment, the core particles 131 may be formed of a material having a refractive index of about 1.4 or more in the visible light wavelength range of at least 360 nm to 820 nm, and the total reflection inducing layer 132 may be less than the core particles 131. It may be formed of a material having a small refractive index.
  • the total reflection inducing layer 132 may be formed of a metal material having a smaller refractive index.
  • the total reflection inducing layer 132 may include gold (Au) having a refractive index of about 0.22, silver (Ag) having a refractive index of about 0.15, and aluminum (Al) having a refractive index of about 1.0 for light having a wavelength of 532 nm. , Copper (Cu) having a refractive index of about 0.4, zinc (Zn) having a refractive index of about 1.2, and the like.
  • the total reflection induction layer ( 132 ) in order to improve the adhesion between the total reflection induction layer 132 and the core particles 131, after applying chromium (Cr) to the surface of the core particles 131, the total reflection induction layer ( 132 may be formed.
  • the chromium in order to prevent the retroreflective performance from being lowered, the chromium is preferably applied in a thickness of about 2 nm to 5 nm or less.
  • the total reflection inducing layer 132 itself may be formed of a material having strong adhesive strength with the core particles 131.
  • the total reflection inducing layer 132 may be formed of aluminum (Al) or copper (Cu).
  • the total reflection inducing layer 132 may have a thickness of about 10 to 100nm to prevent light leakage due to light transmission and to improve the dispersibility of the optical label 130.
  • the total reflection inducing layer 132 is less than 10 nm in thickness, some of the light incident inside the core particles 131 may pass through the total reflection inducing layer 132 and may leak.
  • the thickness of 132 exceeds 100 nm, the weight of the optical label 130 may increase, resulting in a decrease in the dispersibility of the optical label 130 in the liquid.
  • the modification layer 133 may be formed on a surface of the total reflection inducing layer 132.
  • the modification layer 133 may be formed of a metal material which is easily bonded to a biological material.
  • the modification layer 133 may be formed of a noble metal such as platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag), etc., which are easily modified by a biomaterial and have excellent oxidation stability.
  • the modification layer 133 may be formed as a separate layer independent of the total reflection induction layer 132.
  • the modified layer 133 may be a precious metal material layer covering the total reflection inducing layer 132.
  • the modification layer 133 and the total reflection inducing layer 132 may be integrally formed.
  • the total reflection inducing layer 132 is formed of a noble metal having a lower refractive index than the core particles such as gold (Au), silver (Ag), or the like
  • the total reflection inducing layer 132 may be a modified layer 133. Can also function.
  • the second compound 135 may be directly or indirectly bonded to the modifying layer 133 and may selectively bind to the first compound 112 of the molecular beacon unit 110.
  • the second compound 135 may be changed according to the first compound 112 and may include one or more selected from proteins, nucleic acids, ligands, and the like.
  • the first compound 112 of the molecular beacon unit 110 includes biotin
  • the second compound 135 may bind to biotin selectively.
  • One or more protein compounds selected from streptavidin, Neutravidin and the like One or more protein compounds selected from streptavidin, Neutravidin and the like.
  • the first compound 112 of the molecular beacon unit 110 includes dinitrophenyl (DNP)
  • the second compound 135 may selectively bind the dinitrophenyl (DNP). It may include an anti-DNP antibody compound.
  • the first compound 112 of the molecular beacon unit 110 includes digoxigenin (DIG)
  • the second compound 135 may bind to the
  • the second compound 135 may be formed to be bonded only to the surface of the modification layer 133 and not to be exposed to the exposed surface of the core particle 131.
  • the molecular beacon unit 110 may be formed. Part of the exposed core particles 131 in the state coupled to the light source unit 140, which can induce a more powerful retroreflective signal, thereby significantly improving the sensitivity of the gene biosensor 100 You can.
  • the optical label portion 130 is disposed between the total reflection induction layer 132 and the modification layer 133, a magnetic layer formed of a magnetic material ( 134) may be further included.
  • the magnetic layer 134 may be formed of a magnetic material such as iron (Fe), nickel (Ni), manganese (Mn), a sintered body thereof, or an oxide thereof.
  • the optical label 130 further includes the magnetic layer 134, by applying a magnetic field from the outside, it is possible to induce a stronger retroreflective signal by adjusting the orientation direction of the optical label 130.
  • the optical label part 130 which is not combined with the molecular beacon part 110 may be easily separated using an external magnetic field.
  • the light source unit 140 may be disposed on the optical label unit 130 and irradiate light to the optical label unit 110 coupled to the molecular beacon unit 110.
  • the light source of the light source unit 140 is not particularly limited.
  • a light source of the light source unit 140 a light source for generating light in which light of various wavelengths is mixed or a light source for generating monochromatic light of a specific wavelength may be used without limitation.
  • the light source of the light source unit 140 may be a halogen group lamp, a mercury lamp, a fluorescent lamp, a light emitting diode (LED), a laser, or the like without limitation.
  • the light receiving unit 150 is disposed above the optical label unit 130 to be spaced apart from the light source unit 140, and the optical label unit of the light generated by the light source unit 140 and irradiated to the optical label unit 130.
  • the light retroreflected by 130 may be accommodated to quantitatively analyze information on the presence, concentration, and the like of the target nucleic acid molecule 10. If the retroreflected light can be accommodated to analyze the information on the target nucleic acid molecule 10, the configuration of the light receiver 150 is not particularly limited.
  • the light receiving unit 150 may include an image generating unit for imaging the retroreflected optical signal and an image analyzing unit analyzing the image information generated by the image generating unit.
  • a known image generating apparatus such as a digital camera may be applied to the image generating unit without limitation, and a known image analyzing system may be applied to the image analyzing unit without limitation.
  • the light receiving unit 150 may measure the amount of light retroreflected by the optical labeling unit 130 by the image analyzing unit from the image generated by the image generating unit. Concentration can be quantified.
  • the sensitivity is reduced by the interference of the light irradiated from the light source unit 140 and the light retroreflected by the optical label unit 130, and the substrate 120 is minimized.
  • the light receiving portion is arranged to receive retroreflected light incident within an angle range of about ⁇ 10 ° to + 10 ° with respect to a normal of the surface of the substrate 121 to prevent a decrease in sensitivity caused by the mirror reflected light.
  • the light source unit 140 may be arranged to irradiate light in a direction inclined to less than about 0 ° and less than 45 ° with respect to the traveling direction of the retroreflected light.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating a method for quantitative analysis of nucleic acid molecules according to an embodiment of the present invention, and the method for quantitative analysis of nucleic acid molecules according to an embodiment of the present invention is an optical gene biosensor described with reference to FIGS. 1 to 4. It can be performed using (100).
  • a method for quantitative analysis of nucleic acid molecules includes reacting a target nucleic acid molecule 10 to a molecular beacon unit 110 fixed to a substrate 120.
  • a loop of the molecular beacon unit 110 by applying a solution sample containing the nucleic acid molecules 10 on the substrate 120 to which the molecular beacon unit 110 is fixed
  • the section 111a may be coupled to the nucleic acid molecule 10.
  • the loop section 111a since the loop section 111a has a nucleotide sequence complementary to the nucleic acid molecule 10, it may selectively bind to the nucleic acid molecule.
  • the solution sample containing the nucleic acid molecule 10 may be heated to a temperature of about 35 °C to 45 °C.
  • the heating temperature at this time is based on the length of the base sequence of the molecular beacon unit 110 and the target nucleic acid molecule 10 and the ratio of guanine (G) and cytosine (C) present in the base sequence. Subject to change.
  • the solution sample may be cooled to about 1 to 5 ° C. for a predetermined time and then maintained at room temperature.
  • the optical label 130 may be selectively coupled.
  • the first compound 112 of the molecular beacon unit 110 may selectively bind to the second compound 135 of the optical markers 130.
  • the oligonucleotides 111 of each of the molecular beacon portions 110 are formed at both ends of the loop section 111a and have a base sequence complementary to each other and the first and second stem sections ( 111b and 111c, the oligonucleotide 111 combined with the nucleic acid molecule 10 maintains a linear structure in which an end portion at which the first compound 112 is bound to the substrate 120 is directed upward.
  • the first and second stem sections 111b and 111c are bonded to each other to have a hairpin structure. As a result, the first compound 112 is bound. End is directed toward the substrate 120.
  • the optical label portion is included in the first compound 112 of the oligonucleotide 111 having the linear structure.
  • (130) is easily accessible to form a bond 135 between the first compound 112 of the oligonucleotide 111 and the second compound of the optical label portion 130, but having the hairpin structure
  • the first compound 112 of the oligonucleotide 111 has limited access to the optical label 130 by steric hindrance, and as a result, the first compound 112 of the oligonucleotide 111 and the Coupling between the second compound 135 of the optical label 130 may not occur.
  • the light may be irradiated to the optical label unit 130 coupled to the molecular beacon unit 110 using the light source unit 140.
  • the optical label unit 130 since the second compound 135 of the optical label unit 130 is bonded only to the surface of the modification layer 133 and not to the exposed surface of the core particle 131, the optical label unit 130 is When coupled to the molecular beacon unit 110, an exposed surface of the core particle 131 of the optical label unit 130 is oriented in the direction of the light source unit 140, and as a result, light irradiation of the light source unit 140 is performed. It can generate a stronger retroreflective signal for.
  • the light receiving unit 150 generates an image of the substrate 120 to which the optical label unit 110 is coupled while the light source unit 140 emits light. You can analyze this.
  • the light receiver 150 may generate an image of the substrate 120 through an image generator, and count the number of the optical markers 130 from the image through the image analyzer. The image can be analyzed.
  • the optical marker is bound to the molecular beacon portion, and quantitative analysis is performed on the target nucleic acid molecule using light retroreflected from the optical marker.
  • quantitative analysis of the target nucleic acid molecules can be performed with high sensitivity without using expensive and bulky optical equipment.
  • the antibiotic-resistant Staphylococcus aureus Gene sensing for the FemA gene was performed. Specifically, a cDNA fragment of the FemA gene having a base sequence of 5 ′ ′ was synthesized and used as a target nucleic acid molecule.
  • the structure of the molecular beacon portion is designed as 5 ' 2- (CH 2 ) 6 -GTGAGCTCATAACCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGGCTCAC- (CH 2 ) 6 -Biotin-3', the stem section of 6 x 2 base pairs (bp) and 30 base pairs (bp) It is configured to have a loop section of.
  • the substrate having the molecular beacon unit fixed As the substrate having the molecular beacon unit fixed, a chip for particle counting in which a gold thin film was patterned on a glass substrate was used. Specifically, the gold thin film pattern was manufactured such that 16 squares having an area of 340 ⁇ m ⁇ 340 ⁇ m exist.
  • Example 6 is a graph showing the results of genetic analysis according to Example 1, which is the average of the results of three replicate experiments.
  • target nucleic acid molecules can be measured more accurately than biosensing methods using conventional expensive optical equipment. Able to know.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the verification nucleic acid molecule is DNA that differs from the target nucleic acid molecule in three base pairs.
  • Table 1 is a result showing the intensity ratio of the signal of the verification nucleic acid molecule to the signal of the target nucleic acid molecule according to the concentration calculated from FIG.
  • the intensity of the signal for the verifying nucleic acid molecule is significantly reduced compared to the signal for the target nucleic acid molecule.
  • the retroreflective signal for the validation nucleic acid molecule was found to be only about 38% of the retroreflective signal for the target nucleic acid molecule.
  • optical gene biosensor according to the present invention can be used in the field of genetic mutation screening.
  • optical gene biosensor 110 molecular beacon part
  • oligonucleotide 112 first compound
  • core particle 132 total reflection inducing layer
  • modified layer 134 magnetic layer

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Abstract

광학 유전자 바이오센서가 개시된다. 광학 유전자 바이오센서는 기판, 타겟 핵산 분자와 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 및 이의 말단에 제1 화합물을 구비하고 기판에 고정된 분자 비콘부, 제1 화합물과 선택적으로 결합하고 조사된 광을 재귀반사시킬 수 있는 광학 표지부, 광학 표지부에 광을 조사하는 광원부 및 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 수광부를 구비한다. 이러한 광학 유전자 바이오센서에 따르면 비분광 광원 및 분광 광원 모두에 대해서 타겟 핵산 분자의 정확한 정량 분석을 수행할 수 있다.

Description

재귀반사 현상을 이용한 분자 비콘 기반의 광학 유전자 바이오센서 및 이를 이용한 핵산 분자의 정량 분석 방법
본 발명은 광학적인 방법을 통해 타겟 핵산 분자에 대해 정량 분석이 가능한 광학 유전자 바이오센서 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것이다.
분자 비콘(molecular beacon)은 자가-상보적인 구간을 갖는 스템-루프(stem-loop) 구조의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서, 양 단에 위치한 스템(stem) 구간은 상보적인 서열을 갖도록 구성되며 그 사이에 존재하는 루프(loop)구간은 검출하고자 하는 핵산 분자(DNA, RNA 등)에 상보적인 서열을 갖도록 구성된다.
이러한 분자 비콘 기반의 종래의 바이오센서의 경우, 통상적으로 올리고뉴클레오티드 일단에는 형광염료(fluorophore)가 수식되고, 타 단에는 상기 형광염료로부터 유도되는 형광을 흡수하여 소광시킬 수 있는 소광체(quencher)가 수식된다.
타겟 핵산 분자가 존재하지 않을 경우, 자가 상보성을 가지는 스템 구간이 자가 혼성화되어 분자 비콘은 헤어핀 구조를 나타내게 되는데, 이러한 구조에서 분자 비콘의 양말단에 존재하는 형광염료와 소광체는 인접하게 되며 결과적으로 형광염료의 형광이 에너지 전이현상(fluorescence resonance energy transfer)을 통해 소광체로 전이되어 소광(quenching) 된다. 이와 달리, 상보적인 타겟 핵산 분자가 존재할 경우, 이들 타겟 핵산 분자가 분자 비콘의 루프 혼성화되어 이중 나선을 형성하게 되고, 그 결과 비틀림 힘(torsional force)이 작용하여 분자 비콘의 스템 구간이 풀리게 되고, 결과적으로, 형광염료와 소광체의 거리가 멀어지게 되어 형광염료와 소광체 사이의 에너지 전이 현상이 해소되어 형광염료 고유의 형광신호가 발산하게 된다. 이러한 조건에서 발산되는 형광신호의 세기는 타겟 핵산 분자의 농도에 비례하게 되므로 형광신호 변화의 추적을 통해 타겟 핵산 분자의 유무, 또는 농도를 정량/정성적으로 분석할 수 있게 된다.
상기한 바와 같이, 종래의 분자 비콘 기반의 바이오센서는 형광염료를 사용하기 때문에 분광학에 기반한 형광분석 장비를 반드시 요구된다.
구체적으로, 형광염료의 경우 특정한 파장으로 분광된 여기광에 대해서만 유효한 신호를 제공하기 때문에, 종래의 바이오센서에는 광원으로써 모든 파장을 제공하는 할로겐족 램프와 그로부터 특정 파장을 선별하여 조사할 수 있는 모노크로메이터(monochromator)를 필수적으로 조합하여 사용하거나 단파장을 제공하는 고출력 레이저 및 LED를 사용하여야 한다. 이 경우, 이들 광원은 매우 고가이고 높은 전력사용량을 요구하기 때문에 소형화, 휴대화 및 상용화가 어려운 문제점이 있다.
그리고, 종래의 바이오센서에 따르면, 형광염료들로부터 유도되는 형광신호를 조사해준 여기광으로부터 선택적으로 분리하여 검출하기 위해서 필수적으로 광학 필터(emission filter)가 요구될 뿐만 아니라 형광신호의 민감한 검출을 위해서는 광증배관(photomultiplier tube, PMT)과 같은 고가의 수광 장비가 필수적으로 요구되고, 이에 더하여 이들 광학부품들 사이의 매우 정교한 배열과 조립이 요구되는 문제점이 있다.
본 발명의 일 목적은 재귀반사 가능한 광학 표지자를 구비하여 비분광 방식으로 타겟 핵산 분자의 유무, 농도 등을 감지할 수 있는 광학 유전자 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 광학 유전자 바이오센서를 이용하여 타겟 핵산 분자에 대한 정량 분석을 수행하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 광학 유전자 바이오센서는 기판; 타겟 핵산 분자와 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 및 상기 올리고뉴클레오티드의 제1 말단에 결합된 제1 화합물을 구비하고, 상기 기판에 고정된 분자 비콘부; 상기 제1 화합물과 선택적으로 결합하고, 조사된 광을 재귀반사시킬 수 있는 광학 표지부; 상기 광학 표지부에 광을 조사하는 광원부; 및 상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 수광부를 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 타겟 핵산 분자와 상보적인 염기서열을 갖는 루프 구간, 상기 루프 구간의 제1 말단으로부터 연장되고 말단에 상기 제1 화합물이 결합된 제1 스템 구간 및 상기 루프 구간의 제2 말단으로부터 연장되고 상기 제1 스템 구간과 상보적인 염기 서열을 가지며 상기 기판에 결합되는 제2 스템 구간을 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 루프 구간은 20 내지 40개의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 제1 및 제2 스템 구간은 각각 4 내지 8개의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 화합물은 비오틴을 포함할 수 있고, 이 경우, 상기 분자 비콘부는 상기 제1 화합물을 상기 제1 스템 구간의 말단에 결합시키는 4 내지 10의 탄소를 갖는 알킬체인 또는 약 4 내지 10 개(mer)의 미니-폴리에틸렌글리콜(mini-poly(ethylene glycol))을 포함하는 제1 스페이서 화합물을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 분자 비콘부는 상기 기판과 공유결합을 형성하는 작용기 및 상기 작용기를 상기 제2 스템 구간의 말단에 결합시키고 4 내지 10의 탄소를 갖는 알킬체인 또는 약 4 내지 10 개(mer)의 미니-폴리에틸렌글리콜(mini-poly(ethylene glycol))을 포함하는 제2 스페이서 화합물을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부는 투명한 코어 입자; 상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 적어도 360nm 내지 820nm의 가시광선 파장 영역에서 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층; 상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및 상기 수식층에 결합되고, 상기 제1 화합물과 선택적으로 결합하는 제2 화합물을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자는 상기 가시광선 파장 영역에서 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질 중 실리카(silica), 글라스(glass), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 물질로 형성될 수 있다. 그리고, 상기 전반사 유도층은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag) 및 아연(Zn)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자는 600nm 이상 2㎛ 이하의 평균 직경을 가질 수 있고, 상기 전반사 유도층은 상기 코어 입자의 표면 중 30% 이상 70% 이하의 면적을 피복할 수 있다. 한편, 상기 전반사 유도층은 10 내지 100nm의 두께를 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 분자 비콘부의 제1 화합물은 리간드(ligand) 분자단을 포함할 수 있고, 상기 광학 표지부의 제2 화합물은 상기 리간드 분자단과 선택적으로 결합할 수 있는 단백질 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 분자 비콘부의 제1 화합물은 비오틴(biotin), 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNP), 디곡시게닌(digoxigenin, DIG) 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있고, 상기 광학 표지부의 제2 화합물은 이들과 선택적으로 결합할 수 있는 단백질 화합물을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 분자 비콘부의 제1 화합물이 비오틴(biotin)을 포함하는 경우, 상기 광학 표지부의 제2 화합물은 상기 비오틴(biotin)과 선택적으로 결합할 수 있는 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 뉴트라아비딘(NeutrAvidin) 등으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 화합물을 포함할 수 있다. 다른 예로, 상기 분자 비콘부의 제1 화합물이 디니트로페닐(DNP)을 포함하는 경우, 상기 광학 표지부의 제2 화합물은 상기 디니트로페닐(DNP) 선택적으로 결합할 수 있는 항-DNP 항체(anti-DNP antibody) 화합물을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 분자 비콘부의 제1 화합물이 디곡시게닌(DIG)을 포함하는 경우, 상기 광학 표지부의 제2 화합물은 상기 디곡시게닌(DIG)과 결합할 수 있는 항-DIG 항체 (anti-DIG antibody) 화합물을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부는 상기 전반사 유도층과 상기 수식층 사이에 배치되고, 자성 물질로 형성된 자성층을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 광원부는 상기 광학 표지부의 상부에 배치되고, 상기 광학 표지부에 복수의 파장의 혼합 광 또는 단색 파장의 광을 조사할 수 있고, 상기 수광부는 상기 광원부와 이격되도록 상기 광학 표지부 상부에 배치되고, 상기 광원부에서 생성되어 상기 광학 표지부에 조사된 광 중 상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용할 수 있다. 이 경우, 상기 광원부는 상기 재귀반사된 광의 진행방향에 대해 0°초과 45°이하로 기울어진 방향으로 광을 조사할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수광부는 상기 재귀반사 광 신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 화상 분석부는 상기 이미지로부터 상기 광학 표지부의 개수를 계수하거나 상기 이미지에 나타난 재귀반사 신호의 광량을 정량하여 상기 타겟 핵산 분자의 농도를 분석할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 핵산 분자의 정량 분석 방법은 기판에 고정된 분자 비콘부에 타겟 핵산 분자를 반응시키는 제1 단계; 상기 타겟 핵산 분자가 결합된 분자 비콘부에 광학 표지부를 선택적으로 결합시키는 제2 단계; 상기 분자 비콘부에 결합된 광학 표지부에 광을 조사하는 제3 단계; 및 상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성하여 분석하는 제4 단계를 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 타겟 핵산 분자를 함유하는 용액 시료를 상기 분자 비콘부가 고정된 상기 기판 상에 도포하여 상기 분자 비콘부 중 상기 타겟 핵산 분자와 상보적인 염기서열을 갖는 루프 구간에 상기 타겟 핵산 분자를 반응킬 수 있다. 그리고, 상기 용액 시료가 존재하는 상기 기판 상에 상기 광학 표지자들을 도포하여 상기 분자 비콘부들 중 상기 타겟 핵산 분자가 결합된 분자 비콘부에 상기 광학 표지부를 선택적으로 결합시킬 수 있으며, 상기 광학 표지부들 중 상기 분자 비콘부에 결합되지 않은 미반응 광학 표지부를 제거할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부에는 백색광이 조사될 수 있고, 이 경우, 상기 백색광에 대한 재귀반사신호를 기초로 상기 타겟 핵산 분자에 대한 정량 분석이 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 분자 비콘부에 타겟 핵산 분자를 결합시킨 후 광학 표시자를 분자 비콘부에 결합시키고, 상기 광학표시자로부터 재귀반사되는 광을 이용하여 타겟 핵산 분자에 대한 정량 분석을 수행하므로, 종래의 형광 염료를 이용하는 바이오센서에 비해 고가이면서 부피가 큰 광학 장비를 사용하지 않고도 고감도로 상기 타겟 핵산 분자에 대한 정량분석을 수행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 광학 유전자 바이오센서를 설명하기 위한 모식도이다.
도 2는 도 1에 도시된 분자 비콘부를 설명하기 위한 모식도이다.
도 3a 및 도 3b는 도 1에 도시된 광학 표지자를 설명하기 위한 단면도들이다.
도 4는 도 1에 도시된 광원부와 수광부의 위치 관계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 분자의 정량 분석 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 6은 실시예 1에 따른 유전자 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 2에 따른 유전자 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 광학 유전자 바이오센서를 설명하기 위한 모식도이고, 도 2는 도 1에 도시된 분자 비콘부를 설명하기 위한 모식도이고, 도 3a 및 도 3b는 도 1에 도시된 광학 표지자를 설명하기 위한 단면도들이며, 도 4는 도 1에 도시된 광원부와 수광부의 위치 관계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 1 내지 도 4를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 광학 유전자 바이오센서(100)는 광학적 방식을 통해 검출하고자 하는 타겟 핵산 분자(10)를 정량적으로 분석할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 광학 유전자 바이오센서(100)는 분자 비콘부(110), 기판(120), 광학 표지부(130), 광원부(140) 및 수광부(150)을 포함할 수 있다.
상기 분자 비콘부(110)는 타겟 핵산 분자(10)와 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)(111) 및 상기 광학 표지부(120)와 선택적으로 결합하는 제1 화합물(112)을 포함할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드(111)는 루프 구간(111a), 제1 스템 구간(111b) 및 제2 스템 구간(111c)을 포함할 수 있다.
상기 루프 구간(111a)은 상기 타겟 핵산 분자(10)와 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 상기 루프 구간(111a)은 상기 타겟 핵산 분자(10)와 상보적인 염기 서열을 가져서 상기 타겟 유전자(10)와 혼성화될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 루프 구간(111a)은 상기 타겟 핵산 분자(10)의 염기서열을 고려하여 약 20 내지 40의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 제1 스템 구간(111b)은 상기 루프 구간(111a)의 제1 말단으로부터 연장된 복수의 제1 염기 서열을 포함할 수 있고, 상기 제2 스템 구간(111c)은 상기 제1 말단과 대향하는 상기 루프 구간(111a)의 제2 말단으로부터 연장된 복수의 제2 염기 서열을 포함할 수 있으며, 상기 제1 스템 구간(111b)의 제1 염기 서열은 상기 제2 스템 구간(111c)의 제2 염기 서열과 서로 상보적일 수 있다. 따라서, 상기 타겟 핵산 분자(10)가 상기 루프 구간(111a)에 결합되지 않은 경우, 상기 올리고뉴클레오티드(111)는 도 3의 좌측에 도시된 바와 같이 상기 제1 및 제2 스템 구간들(111b, 111c)이 서로 혼성화되어 헤어핀(hairpin) 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 제1 및 제2 스템 구간들(111b, 111c)은 약 4 내지 8개의 서로 상보적인 염기 서열을 포함할 수 있다.
상기 제1 스템 구간(111b)의 말단은 상기 제1 화합물(112)에 결합될 수 있고, 상기 제2 스템 구간(111c)의 말단은 상기 기판(130)에 고정될 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.
상기 제1 화합물(112)은 상기 제1 스템 구간(111b)의 말단에 결합될 수 있고, 상기 광학 표지부(120)와 특이 결합할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 및 제2 스템 구간들(111b, 111c)이 서로 혼성화된 경우에는 입체적 장애에 의해 상기 광학 표지부(120)가 상기 제1 화합물(112)에 결합할 수 없으나, 상기 타겟 핵산 분자(10)가 상기 루프 구간(111a)에 혼성화됨으로써 상기 제1 및 제2 스템 구간들(111b, 111c)의 혼성화가 풀리는 경우에는 상기 광학 표지부(120)가 상기 제1 화합물(112)에 결합될 수 있다.
상기 광학 표지부(120)의 특정 화합물과 선택적으로 결합할 수 있다면 상기 제1 화합물(112)은 특별히 제한되지 않는다. 일 실시예로, 상기 광학 표지부(120)가 상기 제1 화합물(112)은 리간드(ligand) 분자단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 광학 표지부(120)가 상기 제1 화합물(112)은 비오틴(biotin), 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNP), 디곡시게닌(digoxigenin, DIG) 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 화합물(112)은 제1 스페이서 화합물(114)을 통해 상기 제1 스템 구간(111b)의 말단에 결합될 수 있다. 즉, 상기 제1 화합물(112)은 상기 제1 스페이서 화합물(114)의 일 말단에 결합될 수 있고, 상기 제1 스페이서 화합물(114)의 다른 말단은 상기 제1 스템 구간(111b)의 말단에 결합될 수 있다. 상기 제1 화합물(112)은 상기 제1 스템 구간(111b)의 말단에 직접 결합될 수도 있으나, 이 경우 상기 분자 비콘부(110)에 의한 구조장애 및 입체장애로 인하여 상기 제1 화합물(112)과 광학 표지부(130)의 제2 화합물(135) 사이의 결합 수율이 저하될 수 있다. 하지만, 상기 제1 스페이서 화합물(114)을 통해 상기 제1 화합물(112)을 상기 제1 스템 구간(111b)의 말단에 결합시키는 경우, 상기 제1 스페이서 화합물(114)에 의해 상기 제1 화합물(112)이 상기 기판(120)으로부터 보다 멀리 이격되어 상기 타겟 핵산 분자(10)를 포함하는 시료 용액에 노출될 수 있을 뿐만 아니라 상기 시료 용액 내에서의 유동성이 향상되므로, 상기 제1 화합물(112)과 상기 광학 표지부(130)의 제2 화합물(135) 사이의 결합 수율을 향상시킬 수 있다.
일 실시예로, 상기 제1 스페이서 화합물(114)은 약 4 내지 10의 탄소를 갖는 알킬체인 또는 약 4 내지 10 개(mer)의 미니-폴리에틸렌글리콜(mini-poly(ethylene glycol))을 포함할 수 있다.
한편, 상기 기판(130)에 고정되기 위하여, 상기 제2 스템 구간(111c)의 말단에는 작용기(113)가 수식될 수 있다. 상기 기판(130)과 화학적 결합을 형성하여 상기 분자 비콘부(110)를 상기 기판(130)에 고정할 수 있다면, 상기 작용기(113)는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 작용기(113)는 아민기(-NH2)를 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 작용기(113)는 제2 스페이서 화합물(115)을 통해 상기 제2 스템 구간(111c)의 말단에 결합될 수 있다. 상기 분자 비콘부(110)가 상기 제2 스페이서 화합물(115)을 포함하는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드(111)가 상기 기판(120)으로부터 보다 멀리 이격되어 상기 타겟 핵산 분자(10)를 포함하는 시료 용액에 노출될 수 있을 뿐만 아니라 상기 시료 용액 내에서의 유동성이 향상되므로, 상기 올리고뉴클레오티드(111)의 루프 구간(111a)과 상기 타겟 핵산 분자(10) 사이의 혼성화 수율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 상기 제2 스페이서 화합물(115)이 상기 제1 스페이서 화합물(114)와 유사하게 작용하여 상기 제1 화합물(112)과 상기 광학 표지부(130)의 제2 화합물(135) 사이의 결합 수율을 향상시킬 수 있다.
일 실시예로, 상기 제2 스페이서 화합물(115)은 약 4 내지 10의 탄소를 갖는 알킬체인 또는 약 4 내지 10 개(mer)의 미니-폴리에틸렌글리콜(mini-poly(ethylene glycol))을 포함할 수 있다.
상기 기판(120)은 상기 분자 비콘부(110)가 고정될 수 있다면 상기 기판(120)의 재료, 형상 등은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 기판(120)은 유리, 실리콘, 폴리머, 금속 등으로 형성되고, 상기 분자 비콘부(110)가 결합되는 편평한 상부면을 구비할 수 있다. 상기 폴리머는 폴리스티렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 올레핀공중합체(COC), 폴리디메틸실록산(PDMS) 등을 포함할 수 있고, 상기 금속은 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag) 등의 귀금속을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 기판(120)이 유리, 실리콘 폴리머 중에 하나로 형성되고 상기 분자 비콘부(110)의 작용기(113)가 아민기인 경우, 플라즈마 처리 또는 자외선 노광 등을 통해 상기 기판(120) 표면을 활성화시킨 후 아민기가 노출되도록 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 처리하고, 이어서 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 등의 아민 반응성 가교제를 처리한 후 상기 분자 비콘부(110)의 작용기인 아민기와 상기 3-아미노프로필트리에톡시실란의 아민기를 공유 결합시킴으로써 상기 분자 비콘부(110)를 상기 기판(120)에 고정할 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 상기 기판(120)이 귀금속으로 형성되고 상기 분자 비콘부(110)의 작용기(113)가 아민기인 경우, 상기 기판(120) 표면에 숙신이미드기(succinimide group)가 노출되도록 DTSSP(3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)) 또는 DTSP(Dithiobis(succinimidyl propionate)) 등의 물질을 이용하여 아민반응성(amine-reactive) 자기조립단분자막(self-assembled monolayer, SAM)을 형성한 후 상기 분자 비콘부(110)의 아민 작용기(113)와 상기 숙신이미드기(succinimide group)를 아미드 결합(amide bond)으로 공유결합 시킴으로써 상기 분자 비콘부(110)를 상기 기판(120)에 고정할 수 있다.
한편, 상기의 2가지 경우에 있어서, 상기 분자 비콘부(110)를 상기 기판(120)에 결합시킨 후 에탄올아민(ethanolamine) 등과 같은 아민기를 포함하는 분자를 이용하여 상기 기판 표면에 잔류하는 잔여 반응 잔기, 예를 들면, 알데하이드 또는 숙신이미드기 등을 블록할 수 있다.
상기 광학 표지부(130)는 상기 분자 비콘부(110)의 제1 화합물과 선택적으로 결합할 수 있고, 상기 광원부(140)로부터 조사된 광을 상기 광원부(140)의 방향으로 재귀반사시킬 수 있다.
일 실시예에 있어서, 도 3a에 도시된 바와 같이, 상기 광학 표지부(130)는 투명한 코어 입자(131), 상기 코어 입자(131)의 일부를 피복하는 전반사 유도층(132), 상기 전반사 유도층(132) 상에 형성된 수식층(133) 및 상기 수식층(133)에 직접 또는 간접적으로 결합된 제2 화합물(135)을 포함할 수 있다.
상기 코어 입자(131)는 구형의 형상을 가질 수 있다. 본 발명에 있어서 ‘구형’이라 함은 중심으로부터 표면의 모든 지점까지의 반지름들이 동일한 완벽한 구형뿐만 아니라 최대 반지름과 최소 반지름의 차이가 약 10% 미만인 실질적인 구형체도 포함하는 것으로 정의된다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(131)는 상기 광원부(140)로부터 조사되는 광의 파장과의 관계, 바이오 센싱의 운용성 등을 고려하여, 약 600nm 이상 2㎛ 이하의 평균 직경을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(131)는 입사광을 투과시킬 수 있는 투명 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자(131)는 투명 산화물이나 투명 고분자 물질 등으로 형성될 수 있다. 상기 투명 산화물은, 예를 들면, 실리카(silica), 글라스(glass) 등을 포함할 수 있고, 상기 투명 고분자 물질은, 예를 들면, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate)) 등을 포함할 수 있다.
상기 전반사 유도층(132)은 상기 코어 입자(131)의 표면 중 일부를 피복하도록 형성되고, 상기 코어 입자(131) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원부(140)의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시킬 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층(132)은 상기 코어 입자(131)의 표면 중 약 30% 이상 70% 이하의 면적을 피복하도록 상기 코어 입자(131)의 표면 상에 형성될 수 있다. 상기 전반사 유도층(132)이 상기 코어 입자(131) 표면의 30% 미만을 피복하는 경우, 상기 코어 입자(131) 내부에 입사된 광 중 재귀반사되지 않고 누설되는 광량이 많아 상기 유전자 바이오센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 발생할 수 있고, 상기 전반사 유도층(132)이 상기 코어 입자(131) 표면을 70% 초과하여 피복하는 경우, 상기 코어 입자(131) 내부로 입사되는 광량이 감소하여 상기 유전자 바이오센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 발생할 수 있다. 일 실시예로, 상기 전반사 유도층(132)은 상기 코어 입자(131) 표면의 약 40% 이상 60% 이하를 피복하도록 상기 코어 입자(131)의 표면 상에 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(131) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원부(140)의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시키기 위해, 상기 전반사 유도층(132)은 상기 코어 입자(131)보다 굴절률이 작은 물질로 형성될 수 있다. 일 실시예로, 상기 코어 입자(131)는 적어도 360nm 내지 820 nm의 가시광선 파장 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있고, 상기 전반사 유도층(132)은 코어 입자 (131)보다 작은 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 코어 입자(131)가 가시광선 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 투명 산화물 또는 투명 고분자 물질로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(132)은 그보다 작은 굴절률을 갖는 금속 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(132)은 532nm 파장의 광에 대해 약 0.22의 굴절률을 갖는 금(Au), 약 0.15의 굴절률을 갖는 은(Ag), 약 1.0의 굴절률을 갖는 알루미늄(Al), 약 0.4의 굴절률을 갖는 구리(Cu), 약 1.2의 굴절률을 갖는 아연(Zn) 등으로부터 선택된 하나 이상의 금속으로 형성될 수 있다.
한편, 일 실시예로, 상기 전반사 유도층(132)과 상기 코어 입자(131)의 접착력을 향상시키기 위해, 상기 코어 입자(131)의 표면에 크롬(Cr)을 도포한 후 상기 전반사 유도층(132)을 형성할 수 있다. 이 경우, 재귀반사능이 저하되는 것을 방지하기 위해, 상기 크롬은 약 2 nm 내지는 5 nm 이하의 두께로 도포되는 것이 바람직하다. 이와 달리, 다른 실시예로, 상기 전반사 유도층(132) 자체를 상기 코어 입자(131)와 접착력이 강한 물질로 형성할 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자(131)가 투명 산화물로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(132)은 알루미늄(Al) 또는 구리(Cu)로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 광 투과에 의한 광 누설을 방지하고 상기 광학 표지부(130)의 분산성을 향상시키기 위하여, 상기 전반사 유도층(132)은 약 10 내지 100nm의 두께를 가질 수 있다. 상기 전반사 유도층(132)의 두께가 10nm 미만인 경우, 상기 코어 입자(131) 내부에 입사된 광 중 일부가 상기 전반사 유도층(132)을 투과하여 누설되는 문제점이 발생할 수 있고, 상기 전반사 유도층(132)의 두께가 100nm를 초과하는 경우, 상기 광학 표지부(130)의 중량이 커져 액체 내에서의 상기 광학 표지부(130)의 분산성이 저하되는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 수식층(133)은 상기 전반사 유도층(132) 표면 상에 형성될 수 있다. 상기 수식층(133)은 생체물질과의 결합이 용이한 금속 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 수식층(133)은 생체물질에 의한 수식이 용이하고 산화 안정성이 우수한 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등과 같은 귀금속으로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층(133)은 상기 전반사 유도층(132)과 독립된 별개의 층으로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(132)이 귀금속이 아닌 금속 물질로 형성된 경우, 상기 수식층(133)은 상기 전반사 유도층(132)을 피복하는 귀금속 물질층일 수 있다.
이와 달리, 다른 실시예에 있어서, 상기 수식층(133)과 상기 전반사 유도층(132)은 일체로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(132)이 금(Au), 은(Ag) 등과 같이 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 귀금속으로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(132)은 상기 수식층(133)으로도 기능할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층(133)은 상기 광학 표지부(130)의 액체 내부에서의 분산성 및 응집 방지를 위해 약 100 nm 이하의 두께를 가질 수 있다.
상기 제2 화합물(135)은 상기 수식층(133)에 직접 또는 간접적으로 결합되고, 상기 분자 비콘부(110)의 제1 화합물(112)과 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 제2 화합물(135)은 상기 제1 화합물(112)에 따라 변경될 수 있고, 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 분자 비콘부(110)의 제1 화합물(112)이 비오틴(biotin)을 포함하는 경우, 상기 제2 화합물(135)은 상기 비오틴(biotin)과 선택적으로 결합할 수 있는 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 뉴트라아비딘(NeutrAvidin) 등으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 화합물을 포함할 수 있다. 다른 예로, 상기 분자 비콘부(110)의 제1 화합물(112)이 디니트로페닐(DNP)을 포함하는 경우, 상기 제2 화합물(135)은 상기 디니트로페닐(DNP) 선택적으로 결합할 수 있는 항-DNP 항체(anti-DNP antibody) 화합물을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 분자 비콘부(110)의 제1 화합물(112)이 디곡시게닌(DIG)을 포함하는 경우, 상기 제2 화합물(135)은 상기 디곡시게닌(DIG)과 결합할 수 있는 항-DIG 항체 (anti-DIG antibody) 화합물을 포함할 수 있다.
한편, 상기 제2 화합물(135)은 상기 수식층(133) 표면에만 결합되고, 상기 코어 입자(131)의 노출 표면에는 결합되지 않도록 형성될 수 있다. 이와 같이, 상기 전반사 유도층(132) 및 상기 수식층(133)에 의해 피복된 코어 입자(131)에 대해 상기 제2 화합물(135)을 위치 선택적으로 형성하는 경우, 상기 분자 비콘부(110)에 결합된 상태에서 상기 노출된 코어 입자(131) 부분이 상기 광원부(140)를 향하므로, 보다 강력한 재귀반사 신호를 유도할 수 있고, 그 결과 상기 유전자 바이오센서(100)의 감도를 현저하게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 도 3b에 도시된 바와 같이, 상기 광학 표지부(130)는 상기 전반사 유도층(132)과 상기 수식층(133) 사이에 배치되고, 자성물질로 형성된 자성층(134)을 더 포함할 수 있다. 상기 자성층(134)은, 예를 들면, 철 (Fe), 니켈 (Ni), 망간 (Mn), 이들의 소성체 또는 산화물 등과 같은 자성물질로 형성될 수 있다. 상기 광학 표지부(130)가 상기 자성층(134)을 더 포함하는 경우, 외부에서 자기장을 인가함으로써 상기 광학 표지부(130)의 배향 방향을 조절하여 보다 강력한 재귀반사 신호를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 광학 표지부(130)들 중 상기 분자 비콘부(110)와 결합하지 않은 광학 표지부(130)를 외부 자기장을 이용하여 용이하게 분리할 수 있다.
상기 광원부(140)는 상기 광학 표지부(130) 상부에 배치되고, 상기 분자 비콘부(110)에 결합된 상기 광학 표지부(110)에 광을 조사할 수 있다. 상기 광원부(140)의 광원은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 광원부(140)의 광원으로는 다양한 파장의 광이 혼합된 광을 생성하는 광원 또는 특정 파장의 단색 광을 생성하는 광원이 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 광원부(140)의 광원은 할로겐족 램프, 수은 램프, 형광등, 발광다이오드(LED), 레이저(Laser) 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 수광부(150)는 상기 광원부(140)와 이격되도록 상기 광학 표지부(130) 상부에 배치되고, 상기 광원부(140)에서 생성되어 상기 광학 표지부(130)에 조사된 광 중 상기 광학 표지부(130)에 의해 재귀반사된 광을 수용하여 상기 타겟 핵산 분자(10)의 유무, 농도 등에 대한 정보를 정량 분석할 수 있다. 상기 재귀반사된 광을 수용하여 상기 타겟 핵산 분자(10)에 대한 정보를 분석할 수 있다면, 상기 수광부(150)의 구성은 특별히 제한되지 않는다. 일 실시예로, 상기 수광부(150)는 상기 재귀반사된 광 신호를 이미지화하는 화상 생성부 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 화상 생성부로는 디지털 카메라 등의 공지의 화상 생성 장치가 제한 없이 적용될 수 있고, 상기 화상 분석부로는 공지의 화상분석 시스템이 제한 없이 적용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수광부(150)는 상기 화상 생성부에 의해 생성된 이미지로부터 상기 화상 분석부가 상기 광학 표지부(130)의 숫자를 계수함으로써 상기 타겟 핵산 분자(10)의 농도를 정량분석할 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 상기 수광부(150)는 상기 화상 생성부에 의해 생성된 이미지로부터 상기 화상 분석부가 상기 광학 표지부(130)에 의해 재귀반사된 광량을 측정함으로써 상기 타겟 핵산 분자(10)의 농도를 정량분석할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 광원부(140)로부터 조사된 광과 상기 광학 표지부(130)에 의해 재귀반사된 광의 간섭에 의한 민감도 저하를 최소화하고, 상기 기판(120)에 의해 거울 반사된 광에 의한 민감도 저하를 방지하기 위해, 상기 수광부는 상기 기판(121) 표면의 법선에 대해 약 -10°내지 +10°의 각도 범위 안에서 입사하는 재귀반사 광을 수용하도록 배치되고, 상기 광원부(140)는 상기 재귀반사된 광의 진행방향에 대해 약 0°초과 45°이하로 기울어진 방향으로 광을 조사하도록 배치될 수 있다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 분자의 정량 분석 방법을 설명하기 위한 순서도이고, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 분자의 정량 분석 방법은 도 1 내지 도 4를 참조하여 설명한 광학 유전자 바이오센서(100)를 이용하여 수행될 수 있다.
도 1 내지 도 4와 함께 도 5를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 분자의 정량 분석 방법은 기판(120)에 고정된 분자 비콘부(110)에 타겟 핵산 분자(10)를 반응시키는 제1 단계(S110); 상기 타겟 핵산 분자(10)가 결합된 분자 비콘부(110)에 광학 표지부(130)를 선택적으로 결합시키는 제2 단계(S120); 상기 분자 비콘부(110)에 결합된 광학 표지부(130)에 광을 조사하는 제3 단계(S130); 및 상기 광학 표지부(130)에 의해 재귀반사된 광에 대한 이미를 생성하여 분석하는 제4 단계(S140)를 포함한다.
상기 제1 단계(S110)에 있어서, 상기 분자 비콘부(110)가 고정된 상기 기판(120) 상에 상기 핵산 분자(10)를 포함하는 용액 시료를 도포하여 상기 분자 비콘부(110)의 루프 구간(111a)과 상기 핵산 분자(10)를 결합시킬 수 있다. 앞에서 설명한 바와 같이, 상기 루프 구간(111a)은 상기 핵산 분자(10)와 상보적인 염기 서열을 가지므로, 상기 핵산 분자에 대해 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 분자 비콘부(110)와 상기 핵산 분자(10)의 결합을 촉진하기 위해, 상기 핵산 분자(10)를 포함하는 용액 시료는 약 35℃ 내지 45℃의 온도로 가열될 수 있다. 다만, 이때의 가열 온도는 상기 분자 비콘부(110)과 상기 타겟 핵산분자(10)의 염기서열의 길이 및 해당 염기서열 내에 존재하는 구아닌(guanine, G)과 시토신(cytosine, C)의 비율에 따라 변경될 수 있다.
한편, 상기 핵산 분자(10)를 포함하는 용액 시료를 상기 기판(120) 상에 도포하여 상기 분자 비콘부(110)와 상기 핵산 분자(10)의 결합을 유도한 후, 상기 핵산 분자(10)와 미반응한 분자 비콘들(110)을 헤어핀 구조로 환원시키기 위해, 상기 용액 시료를 약 1 내지 5℃로 일정시간 동안 냉각한 후 상온에서 유지할 수 있다.
상기 제2 단계(S120)에 있어서, 상기 용액 시료가 존재하는 상기 기판(120) 상에 상기 광학 표지자들(130)을 도포하여 상기 타겟 핵산 분자(10)가 결합된 분자 비콘부(110)에 상기 광학 표지부(130)를 선택적으로 결합시킬 수 있다. 이 경우, 상기 분자 비콘부(110)의 제1 화합물(112)이 상기 광학 표지자들(130)의 제2 화합물(135)과 선택적으로 결합할 수 있다.
한편, 앞에서 설명한 바와 같이, 상기 분자 비콘부들(110) 각각의 올리고뉴클레오티드(111)는 상기 루프 구간(111a)의 양쪽 말단에 각각 형성되고 서로 상보적인 염기서열을 갖는 제1 및 제2 스템 구간(111b, 111c)을 구비하므로, 상기 핵산 분자(10)와 결합한 올리고뉴클레오티드(111)는 상기 기판(120)에 대해 상기 제1 화합물(112)이 결합된 단부가 상부로 향하는 선형 구조를 유지하나, 상기 핵산 분자(10)가 결합하지 않은 올리고뉴클레오티드(111)는 상기 제1 및 제2 스템 구간(111b, 111c)이 서로 결합하여 헤어핀 구조를 갖게 되고, 그 결과 상기 제1 화합물(112)이 결합된 단부가 상기 기판(120)을 향하게 된다. 따라서, 상기 용액 시료가 존재하는 상기 기판(120) 상에 상기 광학 표지자들(130)을 도포하는 경우, 상기 선형 구조의 올리고뉴클로티드(111)의 제1 화합물(112)에는 상기 광학 표지부(130)가 용이하게 접근하여 상기 올리고뉴클로티드(111)의 제1 화합물(112)과 상기 광학 표지부(130)의 제2 화합물 사이의 결합(135)이 형성되나, 상기 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드(111)의 제1 화합물(112)에는 입체 장애에 의해 상기 광학 표지부(130)의 접근이 제한되고, 그 결과, 상기 올리고뉴클로티드(111)의 제1 화합물(112)과 상기 광학 표지부(130)의 제2 화합물(135) 사이의 결합이 발생하지 않을 수 있다.
한편, 상기 타겟 핵산 분자(10)가 결합된 분자 비콘부(110)에 상기 광학 표지부(130)를 결합시킨 후, 상기 분자 비콘부(110)에 결합되지 않은 미반응 광학 표지부(130)를 제거할 수 있다. 이러한 미반응 광학 표지부(130)의 제거는 세척 용액을 이용하여 상기 용액 시료의 용매 및 기타 미반응 물질들을 제거하는 방식으로 수행될 수 있다.
상기 제3 단계(130)에 있어서, 상기 광원부(140)를 이용하여 상기 분자 비콘부(110)에 결합된 상기 광학 표지부(130)에 광을 조사할 수 있다. 이 경우, 상기 광학 표지부(130)의 제2 화합물(135)은 상기 수식층(133) 표면에만 결합되고 상기 코어 입자(131)의 노출 표면에는 결합되지 않으므로, 상기 광학 표지부(130)가 상기 분자 비콘부(110)에 결합되는 경우, 상기 광학 표지부(130) 중 상기 코어 입자(131)의 노출 표면이 상기 광원부(140) 방향으로 배향되고, 그 결과 상기 광원부(140)의 광 조사에 대해 더 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있다.
상기 제4 단계(140)에 있어서, 상기 수광부(150)는 상기 광원부(140)가 광을 조사하는 상태에서 상기 광학 표지부(110)가 결합된 상기 기판(120)에 대한 이미지를 생성하고, 이에 대한 분석을 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 수광부(150)는 화상 생성부를 통해 상기 기판(120)에 대한 이미지를 생성할 수 있고, 상기 화상 분석부를 통해 상기 이미지로부터 상기 광학 표지부(130)의 숫자를 계수하는 방식으로 상기 이미지를 분석할 수 있다.
본 발명에 따르면, 분자 비콘부에 타겟 핵산 분자를 결합시킨 후 광학 표지자를 분자 비콘부에 결합시키고, 상기 광학 표지자로부터 재귀반사되는 광을 이용하여 타겟 핵산 분자에 대한 정량 분석을 수행하므로, 종래의 형광 염료를 이용하는 바이오센서에 비해 고가이면서 부피가 큰 광학 장비를 사용하지 않고도 고감도로 상기 타겟 핵산 분자에 대한 정량분석을 수행할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예에 대해 상술한다. 하기 실시예들은 본 발명의 일부 실시 태양에 불과한 것으로서, 본 발명이 하기의 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
[실시예 1]
본 발명을 통해 개발된 재귀반사원리를 채용한 분자 비콘 기반 유전자 바이오센싱 기술의 실제 핵산 마커 측정에의 응용 가능성을 입증하고 그 분석능을 확인하고자 감염성 미생물인 항생제 내성 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 FemA 유전자에 대한 유전자 센싱을 수행하였다. 구체적으로, 타겟 핵산 분자로는 5’’의 염기서열을 갖는 FemA 유전자의 cDNA 프래그먼트(fragment)를 합성해 사용하였다.
분자 비콘부의 구조는 5’2-(CH2)6-GTGAGCTCATAACCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGGCTCAC-(CH2)6-Biotin-3’로 설계 되었으며, 6 x 2 염기쌍(base pair, bp)의 스템 구간과 30 염기쌍(bp)의 루프 구간을 갖도록 구성되었다.
상기 분자 비콘부가 고정된 기판으로는 유리기판에 금박막이 패턴된 입자계수전용 칩(chip)을 사용하였다. 구체적으로, 금 박막 패턴은 340 ㎛ x 340 ㎛의 면적을 갖는 정사각형이 16개 존재하도록 제작하였다.
DTSSP를 이용하여 아민 반응성 자기조립단분자막(Amine-reactive SAM)를 형성시킨 금 박막 패턴 표면에 상기 분자 비콘부를 수식한 후 다양한 농도(0 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1.0 nM, 10.0 nM 및 100 nM)의 상기 FemA 유전자의 cDNA 프래그먼트(fragment)를 반응시켰다. 이어서, 상기 분자 비콘부의 비오틴(Biotin)과 선택적으로 결합하는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 수식된 광학 표지부 입자들을 상기 분자 비콘부에 결합시킨 후 상기 광학 표지부 입자들에 백색 LED 광원을 이용하여 백색광을 조사한 상태에서 0.065의 개구수를 갖는 대물렌즈가 연결된 디지털 카메라를 이용하여 상기 기판에 대한 이미지를 생성하였고, 이어서 Image J 프로그램을 이용하여 상기 광학 표지부 입자들의 숫자를 계수하는 방식으로 상기 이미지를 분석하였다.
[실험예 1]
도 6은 실시예 1에 따른 유전자 분석의 결과를 나타내는 그래프이고, 이 그래프는 3회 반복 실험 결과를 평균한 결과이다.
도 6을 참조하면, cDNA 프래그먼트(fragment)의 농도가 증가할수록 이미지에서 광학표지부 입자들의 수가 증가함을 알 수 있다. 즉, 실시예 1에 따라 타겟 핵산 분자에 대한 정량 분석을 수행할 경우, 유효하게 타겟 핵산 분자에 대한 농도를 측정할 수 있음을 알 수 있다.
한편, 실시예 1에 따라 재귀반사 신호를 기초로 타겟 핵산 분자를 검출할 경우, 검출민감도(limit of detection)는 34 pM로 계산되었고, 이는 하기 인용논문에 개시된 형광염료를 채용한 분자 비콘 기반의 종래의 바이오 센싱의 검출민감도인 10 nM보다 현저하게 향상된 결과이다.
인용논문: Sensitivity and Specificity of Metal Surface-Immobilized “Beacon”Biosensors, J. Am. Chem. Soc., 2005, vol.127, pp.79327940
이상의 결과로부터, 본 발명에 따를 경우에는 비분광 백색광원 및 디지털 카메라와 같은 최소한의 광학 장치만을 이용하더라도 종래의 고가의 광학장비를 사용하는 바이오 센싱 방법보다 타겟 핵산 분자를 더욱 정확하게 측정할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 2]
본 발명을 통해 개발된 재귀반사원리 기반 유전자 바이오센싱 기술이 분자 비콘 본래의 주된 활용분야인 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석에도 적용이 가능한지 확인하기 위해 다음의 두 가지 유전자(‘gene’과 ‘gene’에 대해 실시예 1과 동일한 분자 비콘부 및 광학 표지자를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 정량분석을 수행하였다.
(i) 타겟 핵산 분자(target gene): 5’’
(ii) 검증 핵산 분자(verification gene): 5’’
상기 검증 핵산 분자는 타겟 핵산 분자와 3개의 염기쌍(base pair)이 다른 DNA이다.
[실험예 2]
도 7은 실시예 2에 따른 유전자 분석의 결과를 나타내는 그래프이고, 하기 표 1은 도 7로부터 산출된 농도에 따른 타겟 핵산 분자의 신호에 대한 검증 핵산 분자의 신호의 강도 비를 나타내는 결과이다.
농도 0.01nM 0.1nM 1nM 10nM 100nM 평균
신호 비율 24.0％ 20.0％ 43.6％ 48.6％ 53.4％ 37.9％
도 6 및 표 1을 참조하면, 단지 3개의 염기쌍(base pair)만이 차이가 남에도 불구하고, 타겟 핵산 분자에 대한 신호에 비해 검증 핵산 분자에 대한 신호의 강도가 크게 감소함을 확인할 수 있다. 구체적으로, 검증 핵산 분자에 대한 재귀반사 신호는 타겟 핵산 분자에 대한 재귀반사 신호의 약 38% 수준에 불과한 것으로 나타났다.
이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 광학 유전자 바이오센서는 유전자 변이 스크리닝 분야 등에도 활용될 수 있음을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
[부호의 설명]
100: 광학 유전자 바이오센서 110: 분자 비콘부
111: 올리고뉴클레오티드 112: 제1 화합물
120: 기판 130: 광학 표지부
131: 코어 입자 132: 전반사 유도층
133: 수식층 134: 자성층
135: 제2 화합물 140: 광원부
150: 수광부

Claims (25)

  1. 기판;
    타겟 핵산 분자와 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 및 상기 올리고뉴클레오티드의 제1 말단에 결합된 제1 화합물을 구비하고, 상기 기판에 고정된 분자 비콘부;
    상기 제1 화합물과 선택적으로 결합하고, 조사된 광을 재귀반사시킬 수 있는 광학 표지부;
    상기 광학 표지부에 광을 조사하는 광원부; 및
    상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 수광부를 포함하는, 광학 유전자 바이오센서.
  2. 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 타겟 핵산 분자와 상보적인 염기서열을 갖는 루프 구간, 상기 루프 구간의 제1 말단으로부터 연장되고 말단에 상기 제1 화합물이 결합된 제1 스템 구간 및 상기 루프 구간의 제2 말단으로부터 연장되고 상기 제1 스템 구간과 상보적인 염기 서열을 가지며 상기 기판에 결합되는 제2 스템 구간을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 루프 구간은 20 내지 40개의 염기서열을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 스템 구간은 각각 4 내지 8개의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제1 화합물은 비오틴(biotin), 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNP) 및 디곡시게닌(digoxigenin, DIG)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 분자 비콘부는 상기 제1 화합물을 상기 제1 스템 구간의 말단에 결합시키는 제1 스페이서 화합물을 더 포함하고,
    상기 제1 스페이서 화합물은 4 내지 10의 탄소를 갖는 알킬체인 또는 약 4 내지 10 개(mer)의 미니-폴리에틸렌글리콜(mini-poly(ethylene glycol))을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 분자 비콘부는 상기 기판과 공유결합을 형성하는 작용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 분자 비콘부는 상기 작용기를 상기 제2 스템 구간의 말단에 결합시키는 제2 스페이서 화합물을 더 포함하고,
    상기 제2 스페이서 화합물은 4 내지 10의 탄소를 갖는 알킬체인 또는 약 4 내지 10 개(mer)의 미니-폴리에틸렌글리콜(mini-poly(ethylene glycol))을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 광학 표지부는,
    투명한 코어 입자;
    상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 적어도 360nm 내지 820nm의 가시광선 파장 영역에서 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층;
    상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및
    상기 수식층에 결합되고, 상기 제1 화합물과 선택적으로 결합하는 제2 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 코어 입자는 상기 가시광선 파장 영역에서 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질 중 실리카(silica), 글라스(glass), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 전반사 유도층은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag) 및 아연(Zn)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 코어 입자는 600nm 이상 2㎛ 이하의 평균 직경을 갖고,
    상기 전반사 유도층은 상기 코어 입자의 표면 중 30% 이상 70% 이하의 면적을 피복하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 전반사 유도층은 10 내지 100nm의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 수식층은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 제1 화합물은 비오틴(biotin), 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNP) 및 디곡시게닌(digoxigenin, DIG)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하고,
    상기 제1 화합물이 상기 비오틴을 포함하는 경우, 상기 제2 화합물은 상기 비오틴(biotin)과 선택적으로 결합할 수 있는 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin) 및 뉴트라아비딘(NeutrAvidin)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하고,
    상기 제1 화합물이 상기 디니트로페닐을 포함하는 경우, 상기 제2 화합물은 상기 디니트로페닐(DNP) 선택적으로 결합할 수 있는 항-DNP 항체(anti-DNP antibody) 화합물을 포함하며,
    상기 제1 화합물이 상기 디곡시게닌을 포함하는 경우, 상기 제2 화합물은 기 디곡시게닌(DIG)과 결합할 수 있는 항-DIG 항체 (anti-DIG antibody) 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  15. 제8항에 있어서,
    상기 광학 표지부는 상기 전반사 유도층과 상기 수식층 사이에 배치되고, 자성 물질로 형성된 자성층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 광원부는 상기 광학 표지부의 상부에 배치되고, 상기 광학 표지부에 복수의 파장의 혼합 광 또는 단색 파장의 광을 조사하고,
    상기 수광부는 상기 광원부와 이격되도록 상기 광학 표지부 상부에 배치되고, 상기 광원부에서 생성되어 상기 광학 표지부에 조사된 광 중 상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 광원부는 상기 재귀반사된 광의 진행방향에 대해 0°초과 45°이하로 기울어진 방향으로 광을 조사하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 수광부는 상기 재귀반사 광 신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부; 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 화상 분석부는 상기 이미지로부터 상기 광학 표지부의 개수를 계수하여 상기 타겟 핵산 분자의 농도를 분석하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 화상 분석부는 상기 이미지로부터 상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광량을 측정하여 상기 타겟 핵산 분자의 농도를 분석하는 것을 특징으로 하는, 광학 유전자 바이오센서.
  21. 기판에 고정된 분자 비콘부에 타겟 핵산 분자를 반응시키는 제1 단계;
    상기 타겟 핵산 분자가 결합된 분자 비콘부에 광학 표지부를 선택적으로 결합시키는 제2 단계;
    상기 분자 비콘부에 결합된 광학 표지부에 광을 조사하는 제3 단계; 및
    상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성하여 분석하는 제4 단계를 포함하는, 핵산 분자의 정량 분석 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 타겟 핵산 분자를 함유하는 용액 시료를 상기 분자 비콘부가 고정된 상기 기판 상에 도포하여 상기 분자 비콘부 중 상기 타겟 핵산 분자와 상보적인 염기서열을 갖는 루프 구간에 상기 타겟 핵산 분자를 반응시키는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자의 정량 분석 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 용액 시료가 존재하는 상기 기판 상에 상기 광학 표지자들을 도포하여 상기 분자 비콘부들 중 상기 타겟 핵산 분자가 결합된 분자 비콘부에 상기 광학 표지부를 선택적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자의 정량 분석 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제2 단계 후 상기 제3 단계 전에 상기 광학 표지부들 중 상기 분자 비콘부에 결합되지 않은 미반응 광학 표지부를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자의 정량 분석 방법.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 제3 단계에서 백색광이 상기 광학 표지부에 조사되고,
    상기 제4 단계에서 상기 백색광에 대한 재귀반사신호를 기초로 상기 타겟 핵산 분자에 대한 정량 분석이 수행되는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자의 정량 분석 방법.
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