WO2018194161A1 - 振盪浮遊培養を用いた間葉系幹細胞の未分化性維持方法 - Google Patents

振盪浮遊培養を用いた間葉系幹細胞の未分化性維持方法 Download PDF

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    • C12N5/0662—Stem cells
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the present invention relates to a mesenchymal stem cell and a culture method thereof.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 In the medical field / dental field, reconstruction / implant treatment or autologous bone transplantation using artificial materials such as ⁇ -TCP, titanium, etc. is performed for bone defects.
  • treatments using artificial materials including autologous bone grafts resorption of regenerated bone that occurs after treatment is a problem (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • membranes that prevent scaffolding and granulation tissue invasion are often required for space making during surgery, and their influence on the regeneration site must also be considered.
  • MSC mesenchymal stem cell
  • MSCs are cells originally defined as cells that have the ability to proliferate by seeding bone marrow cells in plastic culture dishes and to differentiate into mesodermal tissues and cells such as fat, cartilage, and bone. Yes (Non-Patent Document 3).
  • the mouse bone marrow MSC marker was searched, and in 2009, Morikawa et al. Used a flow cytometer to enrich the mouse MSC in the PI ⁇ / CD45 ⁇ / Ter119 ⁇ / Sca-1 + / PDGFR ⁇ + fraction. Have been reported (Non-Patent Documents 4 and 5). Details of this purification technique have been made public by Houlihan et al. (Non-patent Document 6). It has been reported by Mabuchi et al. That human bone marrow MSC is contained in a high concentration in the CD271 (LNGFR) + / CD90 (Thy-1) + fraction (Non-patent Document 7).
  • MSC exists in various tissues, but generally a tissue that can stably acquire many MSCs is bone marrow.
  • MSC is defined as a cell that can adhere to and proliferate by seeding cells in bone marrow in a plastic culture dish and differentiate into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes (Non-patent Document 3). It is attracting attention as a source.
  • the proliferation ability / differentiation ability is reduced by repeating adhesion culture over a long period of time, there is a problem in that there is a difference in results between facilities and patients in clinical practice.
  • Non-patent Documents 8 and 9 it has been found that conventional MSCs have a limited ability to proliferate in an adhesion culture environment and lose their differentiation ability accordingly. It is known that purified MSC also gradually loses its ability to grow in an adherent culture environment (see Non-Patent Document 5, FIG. 1G).
  • Non-patent Document 10 a three-dimensional cell mass (sphere or spheroid) of MSC can be formed in a floating state without adhering to the culture dish.
  • this method cannot be cultivated for a long period of time, and no report has been made as to what kind of change occurs in cells when cultured in a floating environment.
  • the problem to be solved by the present invention is to culture MSC for a long time while maintaining undifferentiation.
  • the present inventors have conducted intensive research, and as a result, it is possible to induce the formation of cell mass by shaking culture of MSC, and that MSC can be cultured for a long time while maintaining undifferentiation. I found.
  • the present invention is based on such novel findings.
  • the present invention provides the method and cell mass shown in the following section.
  • Item 1 A method of culturing MSCs while maintaining undifferentiation, comprising culturing MSCs with shaking.
  • Item 2. The method according to Item 1, wherein the shaking culture is performed at a rotation speed of 20 to 200 rpm, preferably 60 to 120 rpm, more preferably 85 to 95 rpm.
  • Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the shaking culture is performed with an amplitude of 10 to 40 mm, preferably 25 to 40 mm, more preferably 30 to 40 mm.
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the subculture is performed at least twice.
  • Item 5 Any one of Items 1 to 4, wherein the MSC subjected to shaking culture is a cell that has lost the ability to differentiate into a predetermined cell, and the ability to differentiate into the predetermined cell is restored by shaking culture. The method according to item.
  • Item 6. A cell mass obtained by the method according to any one of Items 1 to 5.
  • Item 7. A cell differentiation method comprising the step of culturing the cell mass according to Item 6 in a differentiation induction medium.
  • Item 8 A cell mass differentiated into a predetermined cell by the method according to Item 7.
  • MSC by performing shaking culture, MSC can be led to the formation of a cell mass, and can be cultured for a long time while maintaining its undifferentiation.
  • the differentiation ability can be recovered by shaking culture.
  • it has been thought that physical stimulation rather induces differentiation. Therefore, the above-mentioned effect of the present invention that the undifferentiation can be maintained for a long period of time by performing shaking culture on MSC is unexpected, which cannot be expected from the prior art.
  • FIG. 1 left mouse MSC. Used after 12 adhesion subcultures.
  • FIG. 1 right human MSC. Used after 6 adherent subcultures. It shows about the influence which shaking culture has on differentiation ability maintenance of mouse MSC.
  • Fig. 2a top Adhesive subculture 11 times (Fig. 2a top left osteoblasts, upper middle chondrocytes, upper right adipocytes).
  • Fig. 2a bottom shaking culture after 36 subcultures of adhesion (Fig. 2a bottom left osteoblast, lower right fat cell).
  • Figure 2b Left Adhesive subculture 8 times.
  • Fig. 2b, right Shaking culture after 44 adhesion subcultures.
  • Fig. 1 left mouse MSC. Used after 12 adhesion subcultures.
  • FIG. 1 right human MSC. Used after 6 adherent subcultures. It shows about the influence which shaking culture has on differentiation ability maintenance of mouse MSC.
  • Fig. 2a top Adhesive subculture 11 times (Fig. 2a top left osteoblast
  • FIG. 3 left column osteoblasts.
  • FIG. 3 middle row chondrocytes.
  • FIG. 3 right column fat cells.
  • FIG. 3 top 9 months of adherence subculture and 1 month of shaking culture.
  • FIG. 3 bottom 1 month of shaking culture after 30 adhesion subcultures.
  • 2 shows gene expression analysis (RT-PCR) after induction of differentiation into mesoderm cells.
  • Fig. 4a After induction of bone differentiation.
  • FIG. 4b After induction of cartilage differentiation.
  • FIG. 4c after induction of fat differentiation.
  • the numbers described above FIG. 4a, FIG. 4b and FIG. 4c indicate the number of adherent subcultures (times). It shows about the influence which shaking culture has on differentiation ability maintenance of human MSC.
  • FIG. 5a left column osteoblasts.
  • FIG. 5a right column adipocytes.
  • Fig. 5a top Adhesive subculture 20 times.
  • FIG. 5a middle shaking culture after 6 adherent subcultures.
  • FIG. 5a bottom 20 subcultures of adhesion without induction of bone differentiation.
  • FIG. 5b top 21 adherent subcultures.
  • FIG. 5b bottom shaking culture after 7 adherent subcultures.
  • FIG. 5c The numbers on FIG.
  • FIG. 5c indicate the number of adherent subcultures (times). It shows about the cartilage differentiation ability of human MSC.
  • Fig. 6a top cartilage (toluidine blue staining). Adhesive subculture 9 times.
  • FIG. 6a bottom cartilage (toluidine blue staining).
  • FIG. 6b top cartilage (toluidine blue staining).
  • FIG. 6b bottom cartilage (toluidine blue staining). Shake culture after 19 adhesion subcultures. It shows about the adhesion culture result of the MSC cell mass using the three-dimensional suspension culture container which is a prior art.
  • FIG. 6a top cartilage (toluidine blue staining). Adhesive subculture 9 times.
  • FIG. 6a bottom cartilage (toluidine blue staining).
  • FIG. 6b top cartilage (toluidine blue staining).
  • FIG. 7a Human MSC (used after 9 adherent passages). 7 days in culture.
  • FIG. 7b Mouse MSC.
  • Fig. 7b Upper: Used after 25 times of adhesion subculture (second from left: three-dimensional suspension culture vessel, immediately after seeding. Third from left: three-dimensional suspension culture vessel, culture day 7. Fourth from left: culture dish Re-adhesion, re-adhesion day 7. Fifth from left: re-adhesion to culture dish, induction of fat differentiation).
  • Fig. 7b bottom used after 41 times of adhesion subculture (second from the left: three-dimensional suspension culture vessel, immediately after seeding. Third from the left: three-dimensional suspension culture vessel, day 7 of culture.
  • FIG. 8a Used after 25 passages of adhesive subculture (Fig. 8a left: bone. Fig. 8a right: fat).
  • Fig. 8b Used after 41 times of adhesion subculture (Fig. 8b left: osteoblast.
  • FIG. 9a first from the left in the upper row: seeding of the cell mass in an adherent culture dish, day 0. 2nd from the left in the upper part of FIG. 9a: one day.
  • FIG. 9a third from the top left: 7th.
  • Fig. 9a 4th and 5th from the upper left Adhesion at the time of cell mass (first time).
  • Second from the left in the middle of FIG. 9a 15th.
  • FIG. 9a lower left: 57 days.
  • FIG. 9a lower right 67 days.
  • Fig. 9b Differentiation of migrating cells after the third re-adhesion (Fig. 9b left: osteoblasts; Fig. 9b right: adipocytes).
  • FIG. 10a right mouse purified MSC.
  • FIGS. 10b and c Shaking culture was carried out after two times of adhesion subculture, and after the formation of the cell mass, the cell mass was reattached to the culture dish.
  • FIG. 10b shows the first day of bonding.
  • FIG. 10 c shows adipocytes (fat droplets) after differentiation induction. It shows cell mass formation using a medium for neural stem cells of accoll TM mouse MSC.
  • FIG. 10b shows the first day of bonding.
  • FIG. 10 c shows adipocytes (fat droplets) after differentiation induction. It shows cell mass formation using a medium for neural stem cells of accoll TM mouse MSC.
  • FIG. 11a 9 months of adherent subculture and 1 month of shaking culture.
  • Fig. 11b Nine passages after subculture for 9 months after shaking culture (first from the left in Fig. 11b: bone differentiation; second from the left in Fig. 11b: adipose differentiation; third from the left in Fig. 11b: cartilage differentiation)
  • Fig. 11c neural differentiation .
  • FIG. 11 d shaking culture for 1 month after 39 times of adhesion subculture.
  • Fig. 11e RT-PCR after 1 month of shaking culture (numbers on Fig. 11d are passage numbers)
  • the present invention provides a method for culturing MSC in a cell mass while maintaining undifferentiation, characterized by culturing MSC with shaking.
  • the type of MSC used in the present invention is not particularly limited, and examples include bone marrow-derived cells, dental pulp-derived cells, and adipose tissue-derived cells.
  • the animal species of MSC are not particularly limited, and examples include those derived from mammals such as primates (eg, humans, monkeys, preferably humans), rodents (eg, mice, rats, rabbits, etc.). It is done.
  • the present invention is characterized in that such MSCs are cultured by shaking.
  • the culture vessel is not particularly limited, and can be appropriately set according to the amount of culture solution required, the type of shaking method, and the like.
  • Examples of the shape of the culture vessel include an Erlenmeyer flask and a flask for a seesaw type bioreactor (for example, a flask having a polygonal bottom surface (4 to 8 corners)) as shown in the drawing of WO2015 / 064705.
  • Examples of the capacity of the culture vessel include 125 to 3000 ml, preferably 125 to 500 ml.
  • a non-adhesive culture container for example, a non-adhesive culture dish, a non-adhesive well, a non-adhesive flask, etc.
  • a normal culture vessel not particularly subjected to such treatment may be used.
  • the type of shaking method is not particularly limited, and examples include swiveling, figure eight, reciprocation, and seesaw type.
  • swirl is preferred, but other shaking modes can be employed.
  • the number of rotations is not particularly limited, but can typically be set in the range of, for example, 20 to 200 rpm, preferably 60 to 120 rpm, more preferably 85 to 95 rpm.
  • the swirl type is taken as an example to explain the shaking conditions such as the rotation speed and the amplitude.
  • the same physical stimulation can be applied to the stem cells.
  • an 8-shaped, reciprocating, seesaw type or the like can be adopted.
  • the culture vessel is shaken through two substantially circular orbits that touch at one point.
  • the conditions can be set so as to be amplitude.
  • the number of reciprocations per minute can be set to 20 to 250 reciprocations / minute, and the amplitude can be appropriately set within a range of 10 to 40 mm.
  • the shaking culture angle can be appropriately set within the range of 2 ° to 12 ° and the shaking cycle in the range of 5 to 60 rpm.
  • the medium to be used is not particularly limited as long as it is a liquid medium suitable for stem cell culture.
  • a medium include Minimum Essential Medium (MEM) medium.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • the medium may contain an additive that is included in the normal stem cell culture, if necessary.
  • Specific examples of the additive include fetal bovine serum, amino acids (eg, L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine, etc.), antibiotics (eg, penicillin, streptomycin, etc.), and the like.
  • a preferred embodiment of the culture of the present invention includes subculture.
  • stem cells are collected before reaching the confluent state.
  • about 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 7 cells (cells) / ml, preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ Cells are seeded in a new medium so as to be about 10 6 cells / ml.
  • it is preferable to change the medium appropriately for example, every 1 to 5 days, preferably every 3 to 4 days).
  • MSC can be subcultured in an undifferentiated state without losing its differentiation ability.
  • the subculture can be performed by shaking culture, for example, once or more, preferably 3 times or more, preferably 5 times or more.
  • the upper limit of subculture by shaking culture is not particularly limited.
  • subculture can be performed 3 times or less, preferably 2 times or less, preferably 1 time or less.
  • the time for shaking culture is, for example, preferably about 1 to 90 days (about 24 to 2160 hours), more preferably 10 to 75 days (about 240 to 1800 hours), and 14 to 60 days (about 336 to 1440 hours). Is more preferable.
  • the shaking culture temperature in this step is not particularly limited, and is preferably 30 to 42 ° C, for example, and more preferably 35 to 39 ° C. Such culturing is preferably performed in an atmosphere of 3 to 10% CO 2 .
  • MSC can be cultured while containing an undifferentiated state and a state having differentiation ability.
  • the shaking culture MSCs proliferate and aggregate to form cell clusters. Therefore, in the present invention, the MSC is cultured by shaking culture of MSC, a method for forming a (undifferentiated) cell mass; the MSC is cultured by shaking, a method for inhibiting differentiation of MSC, etc.
  • the cell mass obtained by the method of the present invention has the ability to differentiate into various cells belonging to the mesodermal system, in a preferred embodiment, the cell mass is osteoblast, adipocyte or the like, chondrocyte, or more. Preferably, it has the ability to differentiate into adipocytes. As described in the Examples, in the conventional adhesion culture, the ability to differentiate into adipocytes is lost, and thus this embodiment is preferable.
  • undifferentiated means that the cell is in an undifferentiated state and has the ability to differentiate.
  • the undifferentiated nature of MSC can typically be confirmed by, for example, whether or not it has the ability to differentiate into both osteoblasts and adipocytes, as shown in the Examples of the present application.
  • “maintaining undifferentiated” includes not only the state in which MSC originally maintains without losing the differentiation ability, but also MSC can originally differentiate (as described above). Although the differentiation ability to at least one of the cells once decreased or lost in the culturing process before the shaking culture, the state in which the differentiation ability was recovered by shaking culture is also included.
  • a predetermined cell for example, fat cell
  • MSCs that have lost their differentiation ability are also included in the range of “maintaining undifferentiation” by restoring the differentiation ability to the cells by shaking culture. Therefore, the present invention also provides a method for recovering the differentiation ability to the predetermined cell, characterized in that, in the embodiment, MSC that has lost the differentiation ability to the predetermined cell is cultured by shaking.
  • the method of the present invention is characterized by culturing MSCs with shaking
  • static culture may be combined as long as the effects of the present invention are obtained.
  • the cell mass may be subjected to stationary culture.
  • Such stationary culture may be performed by adhesion culture or non-adhesion culture.
  • the medium, culture temperature, CO 2 concentration, and the like in the stationary culture can be appropriately selected from the same conditions as in the shake culture described above.
  • a non-adhesive culture container for example, a non-adhesive culture dish, a non-adhesive well, a non-adhesive flask, etc.
  • a normal culture vessel not particularly subjected to such treatment may be used.
  • the number of subcultures in static culture is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained.
  • the number of subcultures is 2 times or more, preferably 3 times or more, preferably 5 times or more, It can be cultured.
  • the upper limit of the subculture in the static culture is not particularly limited.
  • the subculture can be performed 5 times or less, preferably 3 times or less, preferably 1 time or less.
  • the time for stationary culture is, for example, preferably about 0.1 to 60 days, more preferably 1 to 30 days, and more preferably 3 to 14 days.
  • the stationary culture time is preferably about 2.4 to 1440 hours, more preferably about 24 to 720 hours, and more preferably about 72 to 336 hours.
  • the present invention provides a cell mass obtained by the culture method of the present invention described above.
  • the cell mass means a mass of cells having a three-dimensional spread rather than a group of cells grown in a plane along the bottom surface and / or wall surface of the inner wall of the culture vessel by adhesion culture or the like.
  • a cell mass can also be called a sphere, a spheroid, etc.
  • the cell mass of the present invention exhibits an effect that it is in an undifferentiated state and has not lost its differentiation ability even after long-term culture.
  • all cells constituting the cell cluster may be maintained undifferentiated, but used as a stem cell pool that continues to supply stem cells that retain undifferentiatedness; As long as it can be used for applications such as application, cells that are maintained undifferentiated may be contained in the cell mass.
  • the preferred shaking method in shaking culture for obtaining a cell mass has been exemplified by the swirling shaking culture.
  • “by swirling shaking culture” In the range of ⁇ cell mass obtained '', not only the cell mass actually obtained by swirling shaking culture, but also a cell mass that is undifferentiated and has not lost its differentiation ability, Naturally, those cultured by shaking in other methods can also be included.
  • the cell mass of the present invention may be positive for markers such as PDGFR ⁇ , Sca-1, both of these, preferably PDGFR ⁇ .
  • the cell mass of the present invention may be positive for markers such as CD90 and CD106. That the marker is positive means, for example, that the proportion of the positive fraction in the cell mass is 50% or more when measured according to the method described in the Examples of the present application.
  • the present invention provides a cell differentiation method including the step of culturing the above-described cell mass of the present invention in a differentiation induction medium.
  • differentiation from MSC to cells belonging to the mesodermal system can be induced.
  • cells belonging to the mesodermal system or mesenchymal system include adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, bone cells, cardiomyocytes, tendon cells, dental pulp cells, odontoblasts, and preferably osteoblasts.
  • examples include cells and fat cells.
  • the cell mass of the present invention can also be applied to the culture of purified MSCs containing neural crest-derived cells (Non-Patent Document 4), and cells belonging to the neural crest, such as nerve cells, glial cells, smooth muscle cells, Examples include dental pulp cells, odontoblasts, cementoblasts, periodontal ligament cells and the like (preferably nerve cells, odontoblasts, more preferably nerve cells).
  • a medium suitable for inducing differentiation into a desired type of cells can be appropriately used.
  • a medium suitable for inducing differentiation into a desired type of cells include a DMEM medium (eg, Nacalai Tesque, sodium pyruvate-free DMEM medium, etc.); ⁇ MEM medium (eg, gibco, MEM Alpha (1 ⁇ ) medium, etc.) Takara Bio, Mesenchymal stem cell growth media; LONZA Co., MSCGM TM Mesenchymal stem cell growth medium, hMSC-Human Mesenchymal stem cell osteogenic Differentiation medium BullkKit TM, hMSC-Human Mesenchymal stem cell Chondrogenic Differentiation medium BullkKit TM, hMSC-Huma Mesenchymal Stem cell Adipogenic Differentiation Medium BullkKit TM, and the like. These media may be used alone or in combination of two or more.
  • the medium may be blended with a differentiation induction promoter for the type of cells desired.
  • adipogenic differentiation induction promoter examples include insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine, and the like. These agents for promoting differentiation into adipocytes may be used singly or in combination of two or more.
  • ascorbic acid for example, ascorbic acid-2-phosphate, ⁇ -glycerophosphate, dexamethasone, hydrocortisone hemisuccinate, statin, isoflavone derivative, 3-benzothiepine derivative TAK-778 (( 2R, 4S)-( ⁇ )-N- [4- (diethoxyphosphorylmethyl) phenyl] -1,2,4,5-tetrahydro-4-methyl-7,8-methylenedioxy-5-oxo-3 -Benzothiepin-2-carboxamide, helioxanthin derivative TH (4- (4-methoxyphenyl) pyrido [40,30: 4,5] thieno [2,3-b] pyridine-2-carboxamide), phenamyl (3,5 -Diamino-6-chloro-N- [imino (phenylamino) methyl] pyrazine-2-carboxamide Harmin and its analogs,
  • differentiation induction promoter for chondrocytes examples include BMP-6, TGF- ⁇ 3, dexamethasone, ascorbic acid and the like. These chondrocyte differentiation induction promoters may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the differentiation induction promoter for cardiomyocytes include KY03I, KY02111, ⁇ FGF, and the like. These cardiomyocyte differentiation induction promoters may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the differentiation-inducing promoter for tendon cells include PDGF, VEGF, and the like. These tendon cell differentiation induction promoters may be used alone or in combination of two or more.
  • the present invention provides a cell mass differentiated into a predetermined cell by the differentiation induction method of the present invention described above.
  • the differentiation-induced cell mass according to the present invention uses an undifferentiated cell mass obtained by the above-described method of the present invention as a raw material.
  • the undifferentiated cell mass of the present invention as a raw material is different from the conventional MSC cell mass, and is in an undifferentiated state and has lost its differentiation ability even after a long-term subculture. It has the unexpected effect of not being. Therefore, it is clear that the cell mass induced to differentiate into a desired cell using such an undifferentiated cell mass as a raw material is also different from the conventional cell mass.
  • Non-Patent Document 6 C57 / BL6 male 4 weeks old (CLEA JAPAN) 5 femurs and tibias were crushed with a mortar pestle, 2% FBS (Cat. # SH3099103: Hyclone), 10 mM HEPES (Cat. # 346-01373: Dojindo) ), And 1% Penicillin / Streptomycin (P / S: Cat. # 168-23191, Wako) and suspended in HBSS + (Cat. # 14025134: Gibco) (hereinafter referred to as HBSS + adjustment solution) was removed. Shredded bones were crushed for 1 hour at 37 ° C. with 0.2% collagenase (Cat.
  • the collected 1 ⁇ 10 7 cells were suspended in 1 ml of HBSS + adjustment solution, and PE-conjugated CD45 (30-F11: Cat. # 12-0451-83, 0.2 mg / ml, eBioscience), TER119 (TER- 119: Cat. # 12-5921-83, 0.2 mg / ml, eBioscience), APC-conjugated PDGFR ⁇ (APA5: Cat. # 17-1401-81, 0.2 mg / ml, eBioscience) and FITC-conjugated Sca- 1 (Ly6A / E: Cat.
  • Cell samples subcultured in FACS analysis adhesion culture of mouse MSC were washed twice with PBS, and then 1 ml of cell dissociation buffer. Cells were detached using (Cat. # 13151014: Gibco), HBSS + adjustment solution was added, centrifuged at 280 G for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed, and the precipitated cells were collected.
  • Cell mass sample formed by shaking culture Considering that it is difficult to separate and collect single cells without damaging each cell or cell surface antigen of the cell mass, once an average of 10 cell masses was allowed to stand in a 10 cm culture dish (Cat. # 664160-013: CELLSTAR) for 7 days, and cells migrated from the cell mass adhered to the culture dish were washed twice with PBS. After removing the PBS, 1 ml of Cell dissociation buffer (Cat. # 13151014: Gibco) was added to the culture dish and allowed to act for 2 to 3 minutes to detach the cells.
  • Cell dissociation buffer Cat. # 13151014: Gibco
  • the mixture was centrifuged at 280 G for 7 minutes at 4 ° C., adjusted with a HBSS + adjustment solution to obtain a cell suspension of 1 ⁇ 10 7 cells / ml, and analyzed using Aria III (BD Bioscience). In the analysis of cell mass-derived cells, no subculture was performed, and cells that migrated from the cell mass were directly used for analysis.
  • Non-Patent Document 7 Human MSCs handed over from Tokyo Medical and Dental University were PE-conjugated CD271 (LNGFR: Cat. # 130-091-885, Miltenyi Biotec), FITC-conjugated CD90 (Thy-1: Cat. #) From a 19-year-old male femur bone marrow. (328110, Biolegend) antibody and sorted with MoFlo (BECKMAN COULTER) (Non-patent Document 7). PI was used for the labeling of dead cells, and after the negative fraction was sorted as a living cell, cells that had been passaged twice were donated.
  • the mixture was centrifuged at 280 G for 5 minutes at 4 ° C., adjusted with HBSS + adjustment solution so as to obtain a cell suspension of 1 ⁇ 10 7 cells / ml, and analyzed using Aria III (BD Bioscience).
  • Human MSC is a 20% FBS (Cat. # SH309910: Hyclone), 1% P / S (Cat. # 168-23191: Wako), 10 mM HEPES (Cat. # 346-01373: Dojindo) as a growth maintenance medium. , And 20 ng / ml ⁇ FGF (Cat. # 084-05384: WAKO) and DMEM (Cat. # 0859-64: Nacalai tesque).
  • Mouse or human MSCs were seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / dish in a 10 cm culture dish (Cat. # 664160-013: CELLSTAR) in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 for 4-7.
  • the cells were cultured for a day and subcultured in a state of 80% confluence.
  • the serum component was removed with 1 ⁇ PBS after the medium was aspirated, and the cells were treated with 0.25% trypsin EDTA (Cat. # 201-16945: Wako) for 2 minutes.
  • the dish was gently tapped, and as soon as the cells came off, a growth maintenance medium was added and the cells were collected.
  • the growth maintenance medium was added to the precipitated cells from which the supernatant was removed by suction, and the cells were seeded at 1 ⁇ 10 6 cells / dish in a new 10 cm culture dish.
  • OriCell TM Strain C57BL / 6 mouse MSCs (MUBMX-01001: Cyagen) have already been subcultured 6 times by the manufacturer at the time of purchase. Purchased cells are shipped after confirmation of CD29, CD44, CD31, Sca-1 positive (> 70%) and CD117 negative ( ⁇ 5%) by the manufacturer. In addition, the manufacturer recommends the use of subcultures of 10 times or less, and subsequent subcultures do not guarantee the properties of the cells at the time of purchase. In addition, the use of OriCell TM Mouse MSC Growth Medium (MUXMX90001: Cyagen) is recommended for cell maintenance culture.
  • MSITEC shake suspension culture TAITEC BR-40LF bio-shaker was used for shake culture.
  • a cell suspension of mouse or human MSC prepared with 20 ml of growth maintenance medium was prepared in a 125 ml erlenmeyer flask (Cat. # 431405: Corning).
  • 20 ng / ml ⁇ FGF (Cat. # 064-05384: WAKO) was added to the growth maintenance medium.
  • the number of cells per flask at the start of shaking culture was 1.0 ⁇ 10 7 cells with OriCell TM mouse MSC, 5.0 ⁇ 10 5 cells with purified mouse MSC, 1.0 ⁇ 10 6 cells with human MSC, or 1 It adjusted so that it might become 0.0 * 10 ⁇ 7 > pieces.
  • the shaking culture was performed while rotating at 37 ° C., 5% CO 2 , 85 to 95 r / min, and amplitude of 40 mm, and the medium was changed once every 3 to 4 days. In the medium exchange, first, the whole medium containing cells was transferred to a 50 ml centrifuge tube (Cat. # TR2004: True Line) and centrifuged at 280 G for 5 minutes at 4 ° C.
  • the medium for neural stem cells contains 1% P / S (Cat. # 168). -23191: Wako) and 10 mM HEPES (Cat. # 346-01373: Dojindo), 1 ⁇ N2 (Cat. # 17502-048: Gibco), 20 ng / ml EGF (Cat. # 059-07873: WAKO), 20 ng / Advanced DMEM / F12 (Cat. 12491015: Gibco) containing ml FGF (Cat. # 064-05384: WAKO), 1 ⁇ B27 (Cat.
  • a cell suspension of mouse MSC (thoughll TM mouse MSC: 1.0 ⁇ 10 7 cells) was prepared with 20 ml of neural stem cell medium and prepared in a 125 ml erlenmeyer flask (Cat. # 431405: Corning). These cell suspensions were subjected to shaking culture using a TAITEC BR-40LF bio-shaker while swirling at 37 ° C., 5% CO2, 85 to 95 r / min, and amplitude of 40 mm. The medium was changed once every 3 to 4 days. For medium exchange, first, the whole medium containing cells was transferred to a 50 ml centrifuge tube (Cat.
  • Differentiation induction method staining method (see Non-Patent Document 6) Differentiation induction into osteoblasts and adipocytes was performed by seeding cells in a 12-well plate (Cat. # 665-180: CELLSTAR) at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / well in adhesion culture. For cell mass-derived migrating cells, 2 to 3 cell masses were seeded in each well of the same 12-well plate, and cells migrated and amplified from the cell mass were used. After seeding, the cell adhesion state was confirmed, and osteoblast differentiation inducing medium (Cat. # PT3002: Lonza) and adipocyte differentiation inducing medium (Cat. # PT3004: 60-70% confluent (cultured for about 7 days).
  • osteoblast differentiation inducing medium Cat. # PT3002: Lonza
  • adipocyte differentiation inducing medium Cat. # PT3004: 60-70% confluent (cultured for about 7 days).
  • medium was changed once every 3 to 4 days to induce differentiation for a maximum of 21 days.
  • adherent cells and formed lipid droplets sometimes floated and peeled off. In that case, the culture was terminated at that time.
  • Alkaline phosphatase (ALP) staining was used to confirm osteoblast differentiation, and oil red O staining was used to confirm adipocyte differentiation. In both staining methods, hematoxylin staining was not performed.
  • chondrocytes For differentiation induction into chondrocytes, cells were pelleted at 150 G in a 15 ml centrifuge tube, 10 ng / ml transforming growth factor- ⁇ 3 (Cat. # PT4124: LONZA), 500 ng / ml bone morphogenic protein-6 (Cat. #) Culturing was performed using a chondrocyte induction medium (Cat. # PT3003: Lonza) supplemented with 6325-BM-020: R & D Systems. The medium was changed twice a week and cultured for 21 days. Differentiation of the induced chondrocytes was confirmed by toluidine blue staining (Cat. # 209-14545: Wako). Hematoxylin staining was not performed.
  • ALP staining see Non-Patent Document 6 Histofine assay kit (Cat. # 415161: Nichirei) was used for staining. PFA was washed with PBS, the reagents in the kit were mixed and adjusted immediately before staining, stained with a staining solution filtered with a syringe filter (Cat. # SLGP033RS: Merck Millipore) having a pore size of 0.22 ⁇ m, and washed with water. As the negative control (NC), MSC before induction of osteoblast differentiation was simultaneously ALP-stained.
  • Toluidine blue staining (see Non-Patent Document 6) The cell pellet after differentiation induction was embedded in paraffin, and a section was prepared on a slide glass. Toluidine blue staining solution (Cat. # 209) filtered with a syringe filter (Cat. # SLGP033RS: Merck Millipore) having a pore size of 0.22 ⁇ m after deparaffinization with xylene and dexylene with 100% alcohol and treatment with 80% alcohol. -14545: Wako) for 30 minutes. After dyeing, it was dehydrated with 100% alcohol, and after xylene treatment, it was sealed with marinol (Cat. # 2009-3: Muto pure Chemicals).
  • Nerve cell induction (see Non-Patent Document 4)
  • the cell mass shake-cultured in the neural stem cell medium was removed from the neural stem cell medium, removed from EGF, FGF, 1 ⁇ B27, and transferred to a medium supplemented with 10% FBS (Cat. # SH309910: Hyclone).
  • Chamber slide (Cat. # SCS-NO8 treated with fibronectin (Cat. # 062-05701: WAKO; 37 ° C, 12 hours) after treatment with L-ornithine (Cat. # 163-27421: WAKO; 37 ° C, 12 hours) : MATUNAMI) (2-3 cell clumps / well).
  • Cells migrated from the cell mass 7 days after seeding were fixed with 4% PFA (Cat. # 163-20145: WAKO) and used for observation of fluorescent immunostaining.
  • Fluorescent immunostaining (see Non-Patent Document 4) The sample fixed with PFA was washed with 1 ⁇ PBS, then treated with 0.3% Triton-X100 (Cat. # 160-24751: WAKO) at room temperature for 5 minutes, and washed again with 1 ⁇ PBS. Washed cells were treated with blocking buffer (0.01% Triton-X100 (Cat. # 160-24751: WAKO), 5% Bovine Serum Albumin (Cat. # 23208: Thermoscientific) 1 ⁇ PBS) for 30 minutes. Thereafter, primary staining (4 ° C., overnight) was performed using an anti- ⁇ III-Tublin antibody (Cat. # Ab18207: abcom) diluted 500-fold.
  • Triton-X100 Cat. # 160-24751: WAKO
  • Bovine Serum Albumin Cat. # 23208: Thermoscientific
  • the cells were washed with 1 ⁇ PBS and subjected to secondary staining (1 hour at room temperature) using Donkey Anti-Rabbit IgG H & L (Alexa Floor (registered trademark) 488; Cat # ab150073: abcom) diluted 1000 times.
  • the cell sample was washed with 1 ⁇ PBS, encapsulated using VECTASHIELD mounting medium with DAPI (Cat # H-1200: VECTOR), and observed using a confocal laser scanning microscope (LSM780: Zeiss).
  • RNA extraction Trizol (Cat. # 15596108: Invitrogen) and RNeasy Mini Kit (Cat. # 74106: Quiagen) were used (extracted according to the Qiagen Kit protocol), and DNase I (Cat. # AM2222: Ambion) was used. DNA was removed. Reverse transcription system (Cat. # A3500: Promega) was used for the reverse transcription reaction, and random primers (Cat. # C118B: Promega), AMV reverse transcriptase (Cat. # M900B: Promega) and MgCl2 (Cat.) Were used according to the protocol procedure. # A351H: Promega). In the PCR reaction, cDNA was amplified using Go Taq Green Master Mix (Cat.
  • FIG. 1 Mouse and human MSC cell mass formation by shaking culture OriCell TM mouse MSC (MUBMX-01001: Cyagen) and human MSC (MSC purified from 19-year-old male bone marrow) were subcultured in adhesion culture, Cells having a small number and a large number of subcultures were prepared and subjected to shaking culture.
  • Mouse MSCs could be subcultured by adhesion culture up to 50 times after purchase (56 counts before shipment).
  • Human MSCs could be subcultured by adhesion culture up to 20 times after donation (22 counts from before donation).
  • the OriCell TM mouse MSC used this time has already been subcultured 6 times by the manufacturer at the time of purchase, and the human-derived MSC has already been subcultured twice at the time of donation. It has been broken.
  • the number of subcultures indicates the number of counts continued before shipment and before donation (including the number of subcultures before shipment and before donation).
  • the number of cell masses formed by shaking culture by human MSC is 14 months later when the number of cells at the start of shaking culture is 1.0 ⁇ 10 6. 3 ⁇ 2.0 and 20.7 ⁇ 2.1 in 2 months.
  • the number of cells at the start of shaking culture was 1.0 ⁇ 10 7 cells, it was 15.0 ⁇ 1.0 after 1 month and 11.7 ⁇ 2.5 after 2 months (3 The average value of the results of the experiment ⁇ standard deviation). That is, even when the number of cells at the start of shaking culture was increased from 1.0 ⁇ 10 6 to 10 times, there was no significant difference in the number of cells formed.
  • the size of the cell mass formed by shaking culture of human MSC with 7 subcultures is 433.3 ⁇ in one month when the number of cells at the start of shaking culture is 1.0 ⁇ 10 6. It was 103.3 ⁇ m and 533.3 ⁇ 150.6 ⁇ m in 2 months. When the number of cells at the start of the shaking culture was 1.0 ⁇ 10 7 cells, it was 783.3 ⁇ 248.3 ⁇ m after 1 month and 833.3 ⁇ 186.1 ⁇ m after 2 months (6 times Mean value ⁇ standard deviation of experimental results).
  • the number of cell masses formed by shaking culture for one month with a large number of subcultures (19 times) was 14 when the number of cells at the start of shaking culture was 1.0 ⁇ 10 6. In the case of 1.0 ⁇ 10 7 , it was 15 (result of one experiment).
  • the size of the cell mass formed by shaking culture of human MSC with 19 passage cultures for one month is 500 ⁇ when the number of cells at the start of shaking culture is 1.0 ⁇ 10 6. In the case of 126.5 ⁇ m and 1.0 ⁇ 10 7 cells, it was 766.7 ⁇ 206.6 ⁇ m (average value of 6 cell mass ⁇ standard deviation).
  • Fig. 2 Influence of shaking culture on maintenance of differentiation ability of mouse MSC The influence of shaking culture on maintenance of differentiation ability of mouse MSC was examined.
  • OriCell TM mouse MSCs maintained differentiation potential into osteoblasts (positive ALP staining) and differentiation into chondrocytes (positive toluidine blue staining) at a relatively low stage of 11 subcultures. However, it had already lost its ability to differentiate into fat and was negative for oil red O staining (FIG. 2-a: upper panel).
  • Non-patent Documents 4 and 5 It is known that mouse MSCs co-expressing PDGFR ⁇ and Sca-1 on the cell surface are high-quality MSCs that maintain an undifferentiated state.
  • OriCell TM mouse MSCs subcultured 7 times in adherent culture retained about 90% of PDGFR ⁇ + / Sca-1 + (co-positive fraction) (not shown), but when subculture was repeated as is This co-positive fraction decreased to 46.1% after 8 passages (FIG. 2-b: left figure), and decreased to 25.0% after 23 passages (not shown). ).
  • OriCell TM mouse MSCs cultured in adhesion culture expressed high levels of the PDGFR ⁇ gene when the number of subcultures was 9, but the number of subcultures was as high as 25 or 41 times. As a result, the expression of the PDGFR ⁇ gene markedly decreases, suggesting the possibility of loss of undifferentiated ability.
  • FIG. 3 shows the results of induction of differentiation into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes, which are mesodermal cells, after one month of shaking culture.
  • Both the cells with low passage number (9 passages) and the cells with many passages (30 passages) induced to differentiate after shaking culture are osteoblasts (ALP positive), chondrocytes (toluidine blue positive), adipocytes The ability to differentiate into (oil red O positive) was shown.
  • FIG. 4 Tissue-specific gene expression analysis during differentiation induction into mesoderm cells (RT-PCR) Using purelyll TM mouse MSC, cells with a low number of adherent passages (passage number 8-9) and cells with a high passage number (passage number 30) were prepared. Using RT-PCR, we analyzed the expression of genes related to osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes in cells that had undergone differentiation induction immediately after adhesion culture and in cells that had undergone shaking culture after adhesion culture. did.
  • Fig. 5 Influence of shaking culture on maintenance of differentiation ability of human MSC The influence of shaking culture on maintenance of differentiation ability of human MSC was examined. In adhesion culture, human MSCs showed differentiation ability into osteoblasts (positive ALP staining) after 20 subcultures, but lost the differentiation ability into adipocytes (oil red O staining negative) ( Fig. 5-a: Top).
  • Non-patent Document 7 which is a cell surface marker of high-quality MSC
  • the expression of human MSC cells subcultured 21 times in adhesion culture is 6.0 to 7.5%.
  • FIG. 5-b upper right figure
  • the expression was 59 in cells that had migrated and proliferated from the cell mass formed by shaking culture of human MSC that had been subcultured 7 times in adhesion culture for 2 months. It was maintained at 6% to 87.1% (FIG. 5-b: lower right figure).
  • Fig. 6 Cartilage differentiation ability of human MSC Using human MSC, cells with a small number of adhesion subcultures (9 passages) and cells (19 passages) were prepared and differentiated into chondrocytes. Performance analysis was performed.
  • FIG. 7 Adhesion culture of MSC cell mass using 3D suspension culture vessel (prior art) Low adhesion 3D culture vessel (Kuraray Elplasia RB 500 400) used in the existing method of forming MSC cell mass NA Plate) was inoculated with 3 ⁇ 10 6 cells / ml of human MSC (number of subcultures: 9 times) or OriCell TM mouse MSC (number of subcultures: 25 times and 41 times) maintained in adhesion culture. . As a result, human MSCs adhered to the culture dish, and no cell mass was formed even after 7 days (FIG. 7-a). On the other hand, in mouse MSC, as reported by Baraniak et al.
  • Non-Patent Document 10 a cell mass was formed after 7 days of culture in an incubator (FIG. 7-b). The cell mass collected at this time was transferred again to the culture dish and allowed to stand in an adhesion culture environment. As a result, the cell mass adhered to the culture dish and cells migrated around, but the cell mass did not maintain its shape. It disappeared after a day, and the ability to differentiate into adipocytes was lost (oil red O staining was negative and no lipid droplets were observed) (FIG. 7-b).
  • Figure 8 Differentiation analysis of accoma TM mouse MSC cell mass using 3D suspension culture vessel (prior art). Adhesion to low adhesion 3D suspension culture vessel (Kuraray Elplasia RB 500 400 NA Plate). accomboll TM mouse MSC (number of subcultures: 25 times and 41 times) maintained in culture was seeded at 3 ⁇ 10 6 cells / ml. The cell mass formed after 7 days was seeded on a 12-well plate (Cat. # 665-180: CELLSTAR, greiner bio-one) to shift to adhesion culture, and osteoblasts of cells migrated from the adhered cell mass and Differentiation into adipocytes was verified.
  • Fig. 9 Morphology retention and cell supply ability of human MSC cell mass cultured by shaking As a result of leaving the cell mass formed by shaking culture of human MSC subcultured 7 times in adhesion culture for 2 months on a culture dish, On the next day, cell migration around the cell mass was observed, and after 7 days, the cells grew to fill the culture dish (FIG. 9-a: upper panel). Moreover, the reattached cell mass maintained its form after 7 days, and it was possible to mechanically peel off the cell mass and leave it in a new culture dish (first reattachment).
  • FIG. 9-a two photos on the left in the middle row. Even if this cell mass is mechanically peeled off and left to stand in a new culture dish four more times (reattachment 2 to 5), cell migration around the cell mass is also observed and within 14 days. In addition, the cells grew to fill the culture dish, and the cell mass retained its morphology (FIG. 9-a: middle three right photos to lower).
  • the MSC cell mass according to the present invention has a strong adhesive force between cells, and even if the cells are returned to the adhesion culture environment, the MSC cell mass continues to supply undifferentiated MSC to the culture dish without destroying the shape of the cell mass. I understood.
  • FIG. 10 Cell mass formed by shaking culture of mouse-purified MSC It was examined whether or not a cell mass purified by shaking culture was also subjected to shaking culture to form a cell cluster similar to that of OriCell TM mouse MSC.
  • the mouse purified MSC after sorting was subcultured twice by adhesion culture in order to secure the number of cells.
  • shaking culture of mouse purified MSC 5.0 ⁇ 10 5 cells / flask
  • a cell mass similar to that of OriCell TM mouse MSC was formed (not shown).
  • FIG. 10 Cell mass formed by shaking culture of mouse-purified MSC
  • Figure 11 Cell mass formation using — — — — — — — — — — ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • FIG. 11-a As a result of culturing cells with few adhesion subcultures (9 passages) in a neural stem cell culture medium, formation of cell clusters was observed within one month (FIG. 11-a).
  • cell clusters could be formed using the neural stem cell medium (FIG. 11-d).
  • the cells of this cell cluster markedly expressed neural crest stem cell markers Nestin and Twist and mesenchymal stem cell marker PDGFR ⁇ (FIG. 11-e).
  • MSCs that had lost undifferentiation could be restored again to a cell mass of a highly undifferentiated MSC population.
  • the MSC cell mass formed by shaking culture retains undifferentiated properties, and at the same time has a strong form-retaining ability, and supplies undifferentiated MSCs by re-adhering to a new culture dish. Can do.
  • a strong three-dimensional MSC mass (sphere) that maintains its differentiation ability and maintains its form can be formed by culturing MSC from an adhesion environment by a completely new stirring and shaking culture method.
  • stem cell pool that continues to supply stem cells that retain undifferentiated properties.
  • the cell mass itself is expected to promote the regeneration of stem cells by making a space at the defect site as a scaffold.

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Abstract

間葉系幹細胞を振盪培養することを特徴とする、未分化性を維持したまま間葉系幹細胞を細胞塊で培養する方法。

Description

振盪浮遊培養を用いた間葉系幹細胞の未分化性維持方法
　本発明は、間葉系幹細胞及びその培養方法に関する。
　医科領域・歯科領域において骨組織の実質欠損に対しては、β－ＴＣＰなどの人工材料やチタンによる再建・インプラント治療や自家骨移植が行われる。自家骨移植を含めた人工材料を用いた治療では、治療後に起こる再生骨の吸収が問題となっている（非特許文献１、２）。また骨再生の分野では、手術時のスペースメーキングのためにスキャホールドや肉芽組織の侵入を防ぐメンブレンが必要なことが多く、再生の場におけるそれらの影響も考慮しなければならない。
　また近年では、自己由来細胞を用いた研究・治療も行われてきており、その代表が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である（以降も、本明細書において、間葉系幹細胞を略してＭＳＣと示す）。
　ＭＳＣは、元々、骨髄細胞をプラスチック培養皿に播種することで張り付き増殖し、脂肪・軟骨・骨という中胚葉系の組織・細胞に分化する能力を有している細胞として定義付けされた細胞である（非特許文献３)。
　マウス骨髄ＭＳＣのマーカー探索が行われ、２００９年に森川らによりフローサイトメーターを用い、ＰＩ-／ＣＤ４５-／Ｔｅｒ１１９-／Ｓｃａ－１+／ＰＤＧＦＲα+分画中にマウスＭＳＣが濃縮されていることが報告された(非特許文献４、５)。この純化技術はＨｏｕｌｉｈａｎらにより詳細が公にされている（非特許文献６）。ヒト骨髄ＭＳＣは馬渕らにより、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）+／ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）+分画中に高濃度に含まれることが報告されている（非特許文献７）。
　ＭＳＣは様々な組織中に存在するが、一般的に安定的に多くのＭＳＣを獲得可能な組織は骨髄である。ＭＳＣは骨髄中の細胞をプラスチック培養皿に播種することで、貼り着き増殖し、骨芽細胞・軟骨細胞・脂肪細胞へ分化可能な細胞と定義され（非特許文献３）、再生医療の細胞供給源として着目されている。しかしながら長期に及ぶ接着培養を繰り返すことで増殖能・分化能が低下することから、臨床においては施設間や患者間で結果に差が生じることが問題となっている。
　具体的には、従来のＭＳＣは接着培養環境下でその増殖能に限界があり、それに応じて分化能も喪失することが分かっている(非特許文献８、９)。純化ＭＳＣも接着培養環境では徐々に増殖能が落ちることが知られている（非特許文献５　Ｆｉｇ　１Ｇ参照）。
　近年、ＭＳＣを特殊な培養皿上で培養すると、培養皿に接着することなく浮遊状態でＭＳＣの３次元的な細胞塊（スフェアあるいはスフェロイド）を形成できることが報告されている（非特許文献１０)。しかしながら、この方法では長期間培養することはできず、浮遊環境で培養することで細胞にどのような変化が起こるかについては報告がされていない。
Hatano et al. Clin Oral Impl Res, vol.15, p339～345, 2004 Verhoeven et al. Clin Oral Impl Res, vol.11, p583～594, 2000 Pittenger et al. Science, vol 284 2 April, 1999 Morikawa et al. BBRC, vol.379, p1114～1119, 2009. Morikawa et al. JEM, vol.206, p2483～2496, 2009. Houlihan et al. Nature Protocol, vol.7(12), p2103～2111, 2012. Mabuchi et al. Stem cell reports, vol.1(2), p152～165, 2013 Bonab et al. BMC Cell Biol, vol.7, p14, 2006. Bork et al. Aging Cell, vol.9(1), p54～63, 2010. Baraniak et al. Cell Tissue Res, vol.347(3), p701～711, 2012 Doetsch et al. Cell, 97 (6), p703～716, 1999. Laura et al. Protoc Exch, Doi:10.1038/nprot.2006.215, 2006
　本発明が解決しようとする課題は、未分化性を維持したままＭＳＣを長期間培養することにある。
　かかる状況の下、本発明者らは、鋭意研究した結果、ＭＳＣを振盪培養することによって細胞塊の形成を導くことが可能であり、未分化性を維持したままＭＳＣを長期間培養することできることを見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。
　従って、本発明は以下の項に示す方法及び細胞塊を提供する。
　項１．ＭＳＣを振盪培養することを特徴とする、未分化性を維持したままＭＳＣを培養する方法。
　項２．前記振盪培養が回転数２０～２００ｒｐｍ、好ましくは６０～１２０ｒｐｍ、より好ましくは８５～９５ｒｐｍで行われる、項１に記載の方法。
　項３．前記振盪培養が振幅１０～４０ｍｍ、好ましくは２５～４０ｍｍより好ましくは３０～４０ｍｍで行われる、項１又は２に記載の方法。
　項４．２回以上、継代培養を行う、項１～３のいずれか１項に記載の方法。
　項５.振盪培養に供する前記ＭＳＣが所定の細胞への分化能を喪失している細胞であり、かつ該所定の細胞への分化能が振盪培養により回復する、項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　項６．項１～５のいずれか１項に記載の方法により得られる細胞塊。
　項７．分化誘導培地中で項６に記載の細胞塊を培養する工程を含む、細胞分化方法。
　項８．項７に記載の方法により所定の細胞に分化した細胞塊。
　本発明によれば、振盪培養を行うことにより、ＭＳＣを細胞塊の形成に導き、その未分化性を維持したまま長期間培養することができる。また、本発明によれば、従来の接着培養等を長期間行うことにより分化能を失ったＭＳＣを用いた場合、これを振盪培養することにより、その分化能を回復することもできる。本発明が属する幹細胞の分野においては、物理的刺激はむしろ分化を誘導すると考えられてきた。従って、ＭＳＣに対し振盪培養を行うことによって未分化性を長期間維持できるという本発明の上記効果は、従来技術から予想し得ない意外なものである。
振盪培養（２ヶ月間）によるマウス及びヒトＭＳＣの細胞塊形成について示す。図１左：マウスＭＳＣ。接着継代培養１２回後に使用。図１右：ヒトＭＳＣ。接着継代培養６回後に使用。 振盪培養がマウスＭＳＣの分化能維持に及ぼす影響について示す。図２ａ上段：接着継代培養１１回（図２ａ　上段左　骨芽細胞、上段中央軟骨細胞、上段右　脂肪細胞）。図２ａ下段：接着継代培養３６回後に振盪培養（図２ａ下段左　骨芽細胞、下段右脂肪細胞）。図２ｂ　左：接着継代培養８回。図２ｂ　右：接着継代培養４４回後に振盪培養。図２ｃ：接着継代培養９回、２５回、４１回および接着継代培養１１回、３７回後に振盪培養を２ヶ月行なった細胞塊のＰＤＧＦＲαの発現解析（ＲＴ－ＰＣＲ）。 振盪培養を行なったＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣの中胚葉系分化能について示す。図３左列：骨芽細胞。図３中央列：軟骨細胞。図３右列：脂肪細胞。図３上段：接着継代培養９回後に振盪培養１ヶ月。図３下段：接着継代培養３０回後に振盪培養１ヶ月。 中胚葉系細胞への分化誘導後の遺伝子発現解析（ＲＴ－ＰＣＲ）を示す。図４ａ：骨分化誘導後。図４ｂ：軟骨分化誘導後。図４ｃ：脂肪分化誘導後。図４ａ、図４ｂ、図４ｃの上に記載された数字は、接着継代培養数（回）を示す。 振盪培養がヒトＭＳＣの分化能維持に及ぼす影響について示す。図５ａ左列：骨芽細胞。図５ａ右列：脂肪細胞。図５ａ上段：接着継代培養２０回。図５ａ中段：接着継代培養６回後に振盪培養。図５ａ下段：骨分化誘導していない接着継代培養２０回。図５ｂ上段：接着継代培養２１回。図５ｂ下段：接着継代培養７回後に振盪培養。図５ｃ：図５ｃ上の数字は接着継代培養数（回）を示す。 ヒトＭＳＣの軟骨分化能について示す。図６ａ上段：軟骨（トルイジンブルー染色）。接着継代培養９回。図６ａ下段：軟骨（トルイジンブルー染色）。接着継代培養９回後に振盪培養。図６ｂ上段：軟骨（トルイジンブルー染色）。接着継代培養１９回。軟骨ペレット形成せず。図６ｂ下段：軟骨（トルイジンブルー染色）。接着継代培養１９回後に振盪培養。 先行技術である三次元浮遊培養容器を用いたＭＳＣ細胞塊の接着培養結果について示す。図７ａ：ヒトＭＳＣ（接着継代培養９回後に使用）。培養７日。図７ｂ：マウスＭＳＣ。図７ｂ上段：接着継代培養２５回後に使用（左から２番目：三次元浮遊培養容器、播種直後。左から３番目：三次元浮遊培養容器、培養７日目。左から４番目：培養皿に再接着、再接着７日目。左から５番目：培養皿に再接着、脂肪分化誘導）。図７ｂ下段：接着継代培養４１回後に使用（左から２番目：三次元浮遊培養容器、播種直後。左から３番目：三次元浮遊培養容器、培養７日目。左から４番目：培養皿に再接着、再接着７日目。左から５番目：培養皿に再接着、脂肪分化誘導）。 三次元浮遊培養容器（先行技術）を用いたＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣ細胞塊の分化能解析を示す。図８ａ：接着継代培養２５回後に使用（図８ａ左：骨。図８ａ右：脂肪）。図８ｂ：接着継代培養４１回後に使用（図８ｂ左：骨芽細胞。図８ｂ右：脂肪細胞） 振盪培養したヒトＭＳＣ細胞塊の形態保持及び細胞供給能力について示す。図９ａ上段左から１番目：細胞塊を接着培養皿へ播種、０日。図９ａ上段左から２番目：１日。図９ａ上段左から３番目：７日。図９ａ上段左から４及び５番目：細胞塊の際接着（１回目）。図９ａ中段左から１番目：１２日。図９ａ中段左から２番目：１５日。図９ａ中段左から３番目：２７日。図９ａ中段左から４番目：４４日。図９ａ中段左から５番目：５４日。図９ａ下段左：５７日。図９ａ下段右：６７日。図９ｂ：再接着3回目後の遊走細胞を分化誘導（図９ｂ左：骨芽細胞。図９ｂ右：脂肪細胞）。 マウス純化ＭＳＣの振盪培養によって形成された細胞塊について示す。図１０ａ右：マウス純化ＭＳＣ。図１０ｂ、ｃ：接着継代培養２回後に振盪培養をし、細胞塊形成後、細胞塊を培養皿に再接着させた。図１０ｂは接着１日目。分化誘導後の脂肪細胞（脂肪滴）を図１０ｃに示す。 ＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣの神経幹細胞用培地を用いた細胞塊形成について示す。図１１ａ：接着継代培養９回後１ヵ月振盪培養。図１１ｂ：接着継代培養９回後１ヵ月振盪培養（図１１ｂ左から１番目：骨分化。図１１ｂ左から２番目：脂肪分化。図１１ｂ左から３番目：軟骨分化。）図１１ｃ神経分化。図１１ｄ：接着継代培養３９回後１ヵ月振盪培養。図１１ｅ：振盪培養１ヵ月後のＲＴ－ＰＣＲ（図１１ｄ上の数字は継代数）
　未分化性を維持したままＭＳＣを培養する方法
　本発明は、ＭＳＣを振盪培養することを特徴とする、未分化性を維持したまま細胞塊でＭＳＣを培養する方法を提供する。
　本発明において用いるＭＳＣの種類としては、特に限定されず、骨髄由来の細胞、歯髄由来の細胞、脂肪組織由来の細胞等が挙げられる。また、ＭＳＣの動物種も特に限定されず、例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル等、好ましくはヒト）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）等の哺乳類由来のものが挙げられる。
　本発明は、かかるＭＳＣを振盪培養することを特徴とする。培養容器としては特に限定されず、必要とされる培養液の量、振盪方法の種類等に応じて適宜設定することができる。培養容器の形状としては、例えば、三角フラスコ、ＷＯ２０１５／０６４７０５の図に示されるような、シーソー型バイオリアクター用フラスコ（例えば、底面が多角形（４～８角形）のフラスコ）等が挙げられる。培養容器の容量としては、例えば、１２５～３０００ｍｌ、好ましくは１２５～５００ｍｌ等のものが挙げられる。培養容器としては、容器内壁の底面等への細胞の接着が抑制されるような処理がされた非接着性培養容器（例えば、非接着性培養皿、非接着性ウェル、非接着性フラスコ等）を用いてもよいし、かかる処理を特に行っていない通常の培養容器を用いてもよい。
　振盪方法の種類も特に限定されず、旋回、８の字、往復、シーソー型等が挙げられる。本発明においては、旋回が好ましいが、他の振盪様式を採用することができる。旋回による振盪培養の場合、回転数は特に限定されないが、典型的には、例えば、２０～２００ｒｐｍ、好ましくは６０～１２０ｒｐｍ、より好ましくは８５～９５ｒｐｍの範囲で設定することができる。上記回転数の範囲で振盪培養することにより、培養容器内部の側面にも、底面（床部）にもスフェアが張り付きにくくなるため、好ましい。
　本明細書においては、好ましい実施形態として旋回型を例に挙げて回転数、振幅等の振盪条件の説明を行ったが、幹細胞に対しこれと同様の物理的刺激を与えることができるものであれば、８の字型、往復、シーソー型等を採用することができる。例えば、８の字型の振盪培養の場合、一点で接する２つの略円形の軌道を通って培養容器が振盪されるため、８の字を形成する各円について、上記旋回型で例示した回転数、振幅となるよう条件を設定することができる。また、例えば、往復型の場合、１分間当たりの往復回数を、２０～２５０往復／分とし、振幅を１０～４０ｍｍの範囲で適宜設定することができる。例えば、シーソー型の場合、振盪培養の角度を２°～１２°、振盪の周期を５～６０ｒｐｍの範囲で適宜設定することができる。
　用いる培地は、幹細胞の培養に適した液体培地であれば特に限定されるものではない。このような培地として、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地等が挙げられる。培地は、必要に応じて通常の幹細胞の培養の際に含める添加剤を含むものであってもよい。添加剤の具体例として、牛胎児血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）、アミノ酸（例えば、L-グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）などが挙げられる。
　本発明の培養の好ましい態様として、継代培養が挙げられる。継代培養においては、コンフルエント状態に到達する前に幹細胞を回収し、例えば、ＭＳＣの場合は１×１０3～１×１０7細胞（個）／ｍｌ程度、好ましくは１×１０5～１×１０6細胞（個）／ｍｌ程度となるように細胞を新しい培地に播種する。また、本発明の培養において、培地を適宜（例えば、１～５日毎に、好ましくは３～４日毎に）交換することが好ましい。本発明の方法によれば、ＭＳＣを、未分化の状態でかつその分化能を失うことなく継代培養することができる。本発明においては、振盪培養により、例えば、１回以上、好ましくは３回以上、好ましくは５回以上、継代培養することができる。また、本発明において振盪培養による継代培養の上限も特に限定されないが、例えば、３回以下、好ましくは２回以下、好ましくは１回以下、継代培養することができる。
　振盪培養の時間としては、例えば、約１～９０日間（約２４～２１６０時間）が好ましく、１０～７５日間（約２４０～１８００時間）がより好ましく、１４～６０日間（約３３６～１４４０時間）がより好ましい。本工程における振盪培養温度は特に限定されず、例えば、３０～４２℃が好ましく、３５～３９℃がより好ましい。かかる培養は、３～１０％ＣＯ2の雰囲気下で行うことが好ましい。
　当該本発明の方法により、未分化の状態であり、かつ分化能を有した状態のものを含んだままＭＳＣを培養することができる。また、当該振盪培養により、ＭＳＣが増殖及び凝集をして、細胞塊が形成される。従って、本発明は、ＭＳＣの培養は、ＭＳＣを振盪培養することを特徴とする、（未分化の）細胞塊の形成方法；ＭＳＣを振盪培養することを特徴とする、ＭＳＣの分化抑制方法等も提供する。尚、本発明の方法により得られる細胞塊は、中胚葉系に属する種々の細胞への分化能を有するが、好ましい実施形態において、当該細胞塊は骨芽細胞、脂肪細胞等、軟骨細胞、より好ましくは脂肪細胞等への分化能を有する。実施例に記載のように、従来の接着培養においては、脂肪細胞への分化能を喪失してしまうため、かかる実施形態が好ましい。
　尚、本発明において、未分化性とは、細胞が未分化の状態でかつその分化能を有していることを意味する。本発明において、ＭＳＣの未分化性は、典型的には、例えば、本願実施例に示すように、骨芽細胞及び脂肪細胞の両方への分化能を示すか否か等により確認することができる。また、本発明において、「未分化性の維持」には、ＭＳＣが当初有していた分化能を失うことなく維持している状態だけでなく、ＭＳＣが本来分化し得る（前述したような）細胞のうち少なくとも１種への分化能が、振盪培養以前の培養過程において、一旦、低下し又は失われたものの、振盪培養をすることにより当該分化能が回復した状態も包含される。従って、本発明においては、例えば、本願実施例に示すように、振盪培養以外の方法（例えば、接着培養等）により継代培養を重ねた結果、所定の細胞（例えば、脂肪細胞等）への分化能を喪失したＭＳＣに対し、振盪培養することによって、当該細胞への分化能を回復した状態も「未分化性の維持」の範囲に包含される。従って、本発明は、当該実施形態において、所定の細胞への分化能を喪失したＭＳＣを、振盪培養することを特徴とする、当該所定の細胞への分化能を回復する方法も提供する。
　また、本発明の方法は、ＭＳＣを振盪培養することを特徴とするが、本発明の効果が得られる限りにおいて、静置培養を組み合わせてもよい。例えば、本願実施例に示すように、一定期間、振盪培養を行うことにより未分化性を保持した細胞塊を形成した後、かかる細胞塊を静置培養に供してもよい。かかる静置培養は、接着培養で行っても、非接着培養で行ってもよい。かかる静置培養における培地、培養温度、ＣＯ2濃度等は、前述の振盪培養と同様の条件を適宜採用できる。培養容器としては、容器内壁の底面等への細胞の接着が抑制されるような処理がされた非接着性培養容器（例えば、非接着性培養皿、非接着性ウェル、非接着性フラスコ等）を用いてもよいし、かかる処理を特に行っていない通常の培養容器を用いてもよい。静置培養における継代培養の回数は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されないが、例えば、本発明においては、２回以上、好ましくは３回以上、好ましくは５回以上、継代培養することができる。また、静置培養を行う場合、静置培養における継代培養の上限も特に限定されないが、例えば、５回以下、好ましくは３回以下、好ましくは１回以下、継代培養することができる。かかる実施形態において、静置培養の時間としては、例えば、約０.１～６０日間が好ましく、１～３０日間がより好ましく、３～１４日間がより好ましい。また、本発明の当該実施形態において、静置培養の時間としては、例えば、約２．４～１４４０時間が好ましく、約２４～７２０時間がより好ましく、約７２～３３６時間がより好ましい。
　未分化性を保持した細胞塊
　本発明は、前述した本発明の培養方法により得られる細胞塊を提供する。本明細書において、細胞塊とは、接着培養等により培養容器内壁の底面及び／又は壁面にそって平面的に増殖した一群の細胞ではなく、３次元的な広がりを有する細胞の塊を意味する。細胞塊は、スフェア、スフェロイド等と言い換えることもできる。本発明の細胞塊は、長期間の培養を経ても未分化の状態でかつその分化能を失っていないという効果を示す。ここで、本発明においては、細胞塊を構成する全ての細胞が未分化性を維持していてもよいが、未分化性を保持した幹細胞を供給し続ける幹細胞プールとしての使用；再生医療への応用等の用途に用いることができる範囲で、未分化性が維持された細胞が細胞塊に含まれていればよい。
　本願発明にかかる細胞塊が長期間の培養を経ても未分化性を維持するという効果は、上述した振盪培養を行うことにより獲得されたものであることは本願実施例等から明らかである。しかし、かかる細胞塊が有する特徴を、上記工程の記載を用いずに細胞塊自体の構造又は特性により文言をもって特定することは非常に困難である。
　尚、前述した本発明の方法に関する説明において、細胞塊を得るための振盪培養における好ましい振盪方法の種類として、旋回式の振盪培養を挙げたが、例えば、本発明における「旋回式の振盪培養により得られる細胞塊」の範囲には、実際に旋回式の振盪培養により得られた細胞塊だけでなく、これと同様に未分化の状態でかつその分化能を失っていない細胞塊であれば、他の方法で振盪培養がされたものも当然に包含され得る。
　また、本発明の細胞塊は、例えば、マウスＭＳＣの場合、ＰＤＧＦＲα、Ｓｃａ－１、これらの両方等、好ましくはＰＤＧＦＲα等といったマーカーが陽性であってもよい。また、本発明の細胞塊は、例えば、ヒトＭＳＣの場合、ＣＤ９０、ＣＤ１０６等のマーカーが陽性であってもよい。かかるマーカーが陽性であるとは、例えば、本願実施例に記載の方法に準じて測定した場合、細胞塊のうち陽性画分の割合が５割以上であることを意味する。
　分化誘導方法
　本発明は、分化誘導培地中で前述した本発明の細胞塊を培養する工程を含む、細胞分化方法を提供する。
　本発明の方法により、ＭＳＣから中胚葉系に属する細胞への分化を誘導することができる。中胚葉系や間葉系に属する細胞としては、例えば、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、骨細胞、心筋細胞、腱細胞、歯髄細胞、象牙芽細胞等が挙げられ、好ましくは、骨芽細胞、脂肪細胞等が挙げられる。また、本発明の細胞塊は神経堤由来細胞を含む純化ＭＳＣ（非特許文献４）の培養にも応用が可能であり、神経堤に属する細胞、例えば、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、歯髄細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、歯根膜細胞等（好ましくは、神経細胞、象牙芽細胞、より好ましくは神経細胞）が挙げられる。
　当該工程に用いる培地としては、求める種類の細胞への分化誘導に適した培地を適宜使用することができる。かかる培地としては、例えば、ＤＭＥＭ培地（例えば、ナカライテスク社製、ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ非含有ＤＭＥＭ培地等）；αＭＥＭ培地（例えばｇｉｂｃｏ社製、ＭＥＭ　Ａｌｐｈａ（１×）培地等）タカラバイオ社製、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ培地；ＬＯＮＺＡ社製、ＭＳＣＧＭTM　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ培地、ｈＭＳＣ－Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｋＫｉｔTM、ｈＭＳＣ－Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｋＫｉｔTM、ｈＭＳＣ－Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｋＫｉｔTM等が挙げられる。これらの培地は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせもよい。
　本工程において、培地には、求める種類の細胞への分化誘導促進剤等を配合してもよい。
　脂肪細胞への分化誘導促進剤としては、例えば、インシュリン、デキサメタゾン、３-イソブチル-１-メチルキサンシン等が挙げられる。これらの脂肪細胞への分化誘導促進剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせもよい。
　骨芽細胞への分化誘導促進剤としては、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸－２－リン酸、β－グリセロリン酸、デキサメタゾン、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、スタチン、イソフラボン誘導体、３－ベンゾチエピン誘導体ＴＡＫ－７７８（（２Ｒ，４Ｓ）－（－）－Ｎ－〔４－（ジエトキシホスホリルメチル）フェニル〕－１，２，４，５－テトラヒドロ－４－メチル－７，８－メチレンジオキシ－５－オキソ－３－ベンゾチエピン－２－カルボキサミド、ヘリオキサンチン誘導体ＴＨ（４－（４－メトキシフェニル）ピリド［４０，３０：４，５］チエノ［２，３－ｂ］ピリジン－２－カルボキサミド）、フェナミル（３，５－ジアミノ－６－クロロ－Ｎ－［イミノ（フェニルアミノ）メチル］ピラジン－２－カルボキサミド、ハルミン及びその類縁体、アセロゲニン及び類縁体、レスベラトロール等の化合物；骨形成に関与するタンパク質〔ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）-２、ＢＭＰ－４、ＩＧＦ（Insulin-like growth factor）‐1、βＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＴＧＦ（Transforming Growth Factor）－β１、ＰＴＨ（parathyroid hormone）、Ｗｎｔｓ等〕等が挙げられる。これらの骨芽細胞への分化誘導促進剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせもよい。
　軟骨細胞への分化誘導促進剤としては、例えば、ＢＭＰ-６、ＴＧＦ-β３、デキサメタゾン、アスコルビン酸等が挙げられる。これらの軟骨細胞への分化誘導促進剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせもよい。
　心筋細胞への分化誘導促進剤としては、例えば、ＫＹ０３Ｉ、ＫＹ０２１１１、βＦＧＦ等が挙げられる。これらの心筋細胞への分化誘導促進剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせもよい。
　腱細胞等への分化誘導促進剤としては、例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ等が挙げられる。これらの腱細胞への分化誘導促進剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせもよい。
　分化誘導された細胞塊
　本発明は、前述した本発明の分化誘導方法により所定の細胞に分化した細胞塊を提供する。
　本発明にかかる分化誘導された細胞塊は、原料として前述した本発明の方法により得られた未分化の細胞塊を用いる。前述したように、原料となる本発明の未分化細胞塊は、従来のＭＳＣの細胞塊とは相違し、かつ長期間の継代培養を経ても未分化の状態でかつその分化能を失っていないという予想外の効果を奏している。従って、かかる未分化の細胞塊を原料として、所望の細胞に分化誘導された細胞塊も、従来の細胞塊と異なるものであることは明らかである。
　以下実施例を挙げて、本発明の実施の形態をさらに具体的に説明するとともに本発明による作用効果を例証する。これらの実施例は例示及び具体的説明のためのものであり、本発明はこれらの実施例に限定されない。
　実験方法
　以下の方法に従い、実験を行った。
　マウスＭＳＣの純化ソーティング(非特許文献６参照)
　Ｃ５７／ＢＬ６雄４週齢（ＣＬＥＡ　ＪＡＰＡＮ）５匹の大腿骨・脛骨を乳鉢乳棒にて砕き、２％ＦＢＳ(Ｃａｔ．＃ＳＨ３０９１０．０３：Ｈｙｃｌｏｎｅ)，１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｃａｔ．＃３４６－０１３７３：Ｄｏｊｉｎｄｏ），及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ：Ｃａｔ．＃１６８－２３１９１，Ｗａｋｏ）を添加したＨＢＳＳ+（Ｃａｔ．＃１４０２５１３４：Ｇｉｂｃｏ）（以下ＨＢＳＳ+調整溶液とする）にて懸濁し、赤血球を除去した。粉々に砕いた骨を１時間３７℃で０．２％ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｃａｔ．＃０３４－１０５３３：Ｗａｋｏ）の１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｃａｔ．＃３４６－０１３７３：Ｄｏｊｉｎｄｏ）及び１％Ｐ／Ｓ（Ｃａｔ．＃１６８－２３１９１：Ｗａｋｏ）含有ＤＭＥＭ（Ｃａｔ．＃０８４５９－６４：Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）溶液にて酵素処理した。酵素処理した骨を４０μm径のｃｅｌｌ　ｓｔｒａｉｎｅｒ (Ｃａｔ．＃３５２３４０：Ｆａｌｃｏｎ) に通し、２８０Ｇで７分、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を回収した。標準的には１匹から１×１０7～３×１０7個の細胞が回収できる。回収した細胞１×１０7個を１ｍｌのＨＢＳＳ+調整溶液に懸濁し、ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＣＤ４５（３０－Ｆ１１：Ｃａｔ．＃１２－０４５１－８３, ０．２ｍｇ／ｍｌ， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）,ＴＥＲ１１９ (ＴＥＲ－１１９：Ｃａｔ．＃１２－５９２１－８３，０．２ｍｇ／ｍｌ, ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)，ＡＰＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＰＤＧＦＲα（ＡＰＡ５：Ｃａｔ．＃１７－１４０１－８１, ０．２ｍｇ／ｍｌ, ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｓｃａ－１（Ｌｙ６Ａ／Ｅ：Ｃａｔ．＃１１－５９８１－８５, ０．５ｍｇ／ｍｌ, ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を各２μl加え、遮光、４℃の環境で３０分間静置した。次に、２８０Ｇで７分、４℃で遠心分離し、１×１０7個／１ｍｌの細胞懸濁液となるようＨＢＳＳ+調整溶液で調整し、最終濃度１μg／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰI：Ｃａｔ．＃１６９－２６２８１，ＷＡＫＯ）染色により死細胞を標識後、Ａｒｉａ　ＩＩＩ　ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ(ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)を用いてＰＩ-／ＣＤ４５-／Ｔｅｒ１１９-／ＰＤＧＦＲα+／Ｓｃａ－１+の細胞をソーティングした（図６－ａ）。
　マウスＭＳＣのＦＡＣＳ解析
　接着培養で継代培養した細胞試料：１０ｃｍ培養皿（Ｃａｔ．＃６６４１６０－０１３：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）に接着培養した細胞を、２度ＰＢＳを用いて洗浄した後、１ｍｌのＣｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．＃１３１５１０１４：Ｇｉｂｃｏ）を用い細胞を剥がし、ＨＢＳＳ+調整溶液を加え、２８０Ｇで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、沈殿した細胞を回収した。
　振盪培養によって形成した細胞塊試料：細胞塊の各細胞または細胞表面抗原に障害を与えずにｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌに分離して回収することが困難であることを考慮し、一旦、平均１０個の細胞塊を１０ｃｍ培養皿（Ｃａｔ．＃６６４１６０－０１３：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）に７日間静置し、培養皿に接着した細胞塊から遊走した細胞を、２度ＰＢＳを用いて洗浄した。ＰＢＳを除去後、培養皿に１ｍｌのＣｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．＃１３１５１０１４：Ｇｉｂｃｏ）を添加し、２～３分間作用させて細胞を剥がした。続いて、９ｍｌのＨＢＳＳ+調整溶液を加え、２８０Ｇで５分、４℃で遠心分離し、上清を破棄し、沈殿した細胞を回収した。回収した細胞１×１０7個を１ｍｌのＨＢＳＳ+調整溶液に懸濁し、ＡＰＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｓｃａ－１（Ｌｙ６Ａ／Ｅ：Ｃａｔ．＃１１－５９８１－８５, ０．５ｍｇ／ｍｌ, ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を各２μl加え、遮光、４℃の環境で３０分間静置した。次に、２８０Ｇで７分、４℃で遠心分離し、１×１０7個／１ｍｌの細胞懸濁液となるようＨＢＳＳ+調整溶液で調整し、Ａｒｉａ　ＩＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて解析した。なお、細胞塊由来細胞の解析では継代培養は１度も行わず、細胞塊から遊走した細胞を直接解析に用いた。
　供与されたヒトＭＳＣの純化ソーティング（非特許文献７参照）
　東京医科歯科大学より譲り受けたヒトＭＳＣは、１９歳男性大腿骨骨髄よりＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＣＤ２７１　（ＬＮＧＦＲ：Ｃａｔ．＃１３０－０９１－８８５，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＣＤ９０　（Ｔｈｙ－１：Ｃａｔ．＃３２８１１０，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体を用いて、ＭｏＦｌｏ（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ）でソーティングされたものである（非特許文献７）。死細胞の標識にはＰＩを用い、陰性分画を生細胞としてソーティング後、２度継代した細胞を供与された。
　ヒトＭＳＣのＦＡＣＳ解析
　マウス細胞の解析と同様、接着細胞は１０ｃｍ培養皿（Ｃａｔ．＃６６４１６０－０１３：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）で培養した細胞を２度ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＣｅｌｌ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．＃１３１５１０１４：Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を剥がし、９ｍｌのＨＢＳＳ+調整溶液を加え、２８０Ｇで５分、４℃で遠心分離し上清を除去し、細胞を回収した。細胞塊の解析では、平均１０個の細胞塊を１０ｃｍ培養皿（Ｃａｔ．＃６６４１６０－０１３：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）に７日間静置し、培養皿に接着した細胞塊から遊走した細胞を２度ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＣｅｌｌ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．＃１３１５１０１４：Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を剥がし、９ｍｌのＨＢＳＳ+調整溶液を加え、２８０Ｇで５分、４℃で遠心分離し上清を除去し、細胞を回収した。なお、細胞塊由来細胞の解析では継代培養は１度も行わず、細胞塊から遊走した細胞を直接解析に用いた。接着培養した場合、及び細胞塊由来の接着培養の場合共に、１０ｃｍ培養皿１枚から７×１０6～１×１０7個の細胞が回収可能であった。回収した細胞１×１０7個を１ｍｌのＨＢＳＳ+調整溶液に懸濁し、（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＬＮＧＦＲ：Ｃａｔ．＃１３０－０９１－８８５，５．５μｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ），ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｔｈｙ－１：Ｃａｔ．＃３２８１１０, ０．２ｍｇ／ｍｌ, Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びＡＰＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）：Ｃａｔ．＃３０５８１０，０．５ｍｇ／ｍｌ, Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体を各２μl加え、遮光、４℃の環境で３０分間静置した。次に、２８０Ｇで５分、４℃で遠心分離し、１×１０7個／１ｍｌの細胞懸濁液となるようＨＢＳＳ+調整溶液で調整し、Ａｒｉａ　ＩＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて解析した。
　マウスおよびヒトＭＳＣの接着培養
　ＯｒｉＣｅｌｌTM　Ｓｔｒａｉｎ　Ｃ５７ＢＬ／６　マウスＭＳＣｓ（ＭＵＢＭＸ-０１００１：ＣＹＡＧＥＮ）およびマウス純化ＭＳＣは、増殖維持培地として１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ．＃ＳＨ３０９１０．０３：Ｈｙｃｌｏｎｅ），１％Ｐ／Ｓ（Ｃａｔ．＃１６８-２３１９１：Ｗａｋｏ）及び１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｃａｔ．＃３４６-０１３７３：Ｄｏｊｉｎｄｏ）を含むＭＥＭ－α＋ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｃａｔ．＃３２５６１-１０２：Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。
　ヒトＭＳＣは、増殖維持培地として２０％ＦＢＳ（Ｃａｔ．＃ＳＨ３０９１０．０３：Ｈｙｃｌｏｎｅ），１％Ｐ／Ｓ（Ｃａｔ．＃１６８-２３１９１：Ｗａｋｏ），１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｃａｔ．＃３４６-０１３７３：Ｄｏｊｉｎｄｏ），及び２０ｎｇ／ｍｌ　βＦＧＦ（Ｃａｔ．＃０６４-０５３８４：ＷＡＫＯ）を含むＤＭＥＭ（Ｃａｔ．＃０８４５９－６４：Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）を用いて培養した。
　マウスあるいはヒトＭＳＣは、３７℃、５％ＣＯ2の環境下で１０ｃｍ培養皿（Ｃａｔ．＃６６４１６０-０１３：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）に１×１０6細胞（個）／皿の濃度で播種して４～７日間培養し、８０％コンフルエントの状態で継代培養を行なった。継代培養は、培地を吸引後１×ＰＢＳにて血清成分を除去し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ（Ｃａｔ．＃２０１-１６９４５：Ｗａｋｏ）にて２分間細胞を処理した。優しくディッシュをタッピングし、細胞が剥がれてきたら直ちに増殖維持培地を加え、細胞を回収した。２５０×ｇにて５分間遠心後、上清を吸引除去した沈殿細胞に増殖維持培地を加え、新たな１０ｃｍ培養皿に細胞を１×１０6個／皿で播種した。
　尚、ＯｒｉＣｅｌｌTM　Ｓｔｒａｉｎ　Ｃ５７ＢＬ／６　ｍｏｕｓｅ　ＭＳＣｓ（ＭＵＢＭＸ-０１００１：Ｃｙａｇｅｎ）は購入時にすでに製造元にて継代培養を６回行われたものである。また、購入細胞は製造元にてＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ３１，Ｓｃａ－１陽性（＞７０％）ＣＤ１１７陰性（＜５％）を確認し出荷されている。また、製造者は継代培養数１０回以下での使用を推奨しており、それ以降の継代培養は購入時の細胞の性質を保証していない。また、細胞の維持培養にはＯｒｉＣｅｌｌTMＭｏｕｓｅ　ＭＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＵＸＭＸ９００１１：Ｃｙａｇｅｎ）の使用が推奨されている。
　ＭＳＣ振盪浮遊培養
　振盪培養にはＴＡＩＴＥＣ　ＢＲ－４０ＬＦ　ｂｉｏ－ｓｈａｋｅｒを用いた。１２５ｍｌ　ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（Ｃａｔ．＃４３１４０５：Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に、２０ｍｌの増殖維持培地で調整したマウスあるいはヒトＭＳＣの細胞懸濁液を用意した。マウスＭＳＣ（ＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣ及び純化したマウスＭＳＣ）の振盪培養時には、増殖維持培地に２０ｎｇ／ｍｌ　βＦＧＦ（Ｃａｔ．＃０６４-０５３８４：ＷＡＫＯ）を添加した。振盪培養開始時のフラスコあたりの細胞数は、ＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣで１．０×１０7個、純化したマウスＭＳＣで５．０×１０5個、ヒトＭＳＣで１．０×１０6個あるいは１．０×１０7個になるように調整した。振盪培養は３７℃，５％ＣＯ2，８５～９５ｒ／ｍｉｎ，振幅４０ｍｍで旋回しながら行い、３～４日に１度培地交換を行った。培地交換は、まず細胞を含む全培地を５０ｍｌ遠沈管（Ｃａｔ．＃ＴＲ２００４：Ｔｒｕｅ　Ｌｉｎｅ）に移し、２８０Ｇで５分、４℃で遠心分離した。上清を除去後、２５ｍｌピペット（Ｃａｔ．＃７６０１８０：ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ）を用いて新たな培地を２０ｍｌ加え、２～３回ピペッティングを行いフラスコに移した。振盪培養を開始して１０～１４日後には肉眼による細胞塊の形成が確認できた。
　神経幹細胞用培地を用いたマウスＭＳＣ振盪浮遊培養
神経幹細胞用培地（非特許文献４、非特許文献１１、非特許文献１２参照）には、１％Ｐ／Ｓ（Ｃａｔ．＃１６８－２３１９１：Ｗａｋｏ）及び１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｃａｔ．＃３４６－０１３７３：Ｄｏｊｉｎｄｏ）、１×Ｎ２（Ｃａｔ．＃１７５０２－０４８：Ｇｉｂｃｏ）、２０ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ（Ｃａｔ．＃０５９－０７８７３：ＷＡＫＯ）、２０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ（Ｃａｔ．＃０６４－０５３８４：ＷＡＫＯ）、１×Ｂ２７（Ｃａｔ．＃１７５０４－０４４：Ｇｉｂｃｏ）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｃａｔ．１２４９１０１５：Ｇｉｂｃｏ）を用いた。
マウスＭＳＣ（ＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣ：１．０×１０７個）の細胞懸濁液を２０ｍｌの神経幹細胞用培地で調整し、１２５ｍｌ　ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（Ｃａｔ．＃４３１４０５：Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に用意した。これら細胞懸濁液を、ＴＡＩＴＥＣ　ＢＲ－４０ＬＦ　ｂｉｏ－ｓｈａｋｅｒを用いて３７℃，５％ＣＯ２，８５～９５ｒ／ｍｉｎ，振幅４０ｍｍで旋回しながら振盪培養を行った。培地交換は３～４日に１度行った。培地交換は、まず細胞を含む全培地を５０ｍｌ遠沈管（Ｃａｔ．＃ＴＲ２００４：Ｔｒｕｅ　Ｌｉｎｅ）に移し、２８０Ｇで５分、４℃で細胞を遠心分離した。上清を除去後、２５ｍｌピペット（Ｃａｔ．＃７６０１８０：Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ）を用いて新たな培地を２０ｍｌ加え、２～３回ピペッティングを行いフラスコに移した。振盪培養を開始して１０～１４日後には肉眼による細胞塊の形成が確認された。
　既存の三次元浮遊培養容器を用いたＭＳＣ細胞塊の形成
　接着培養したマウスあるいはヒトＭＳＣを、３×１０6細胞（個）／ｍｌの細胞懸濁濃度でＫuｒａｒａｙ三次元培養容器（Ｅｌｐｌａｓｉａ　Ｃａｔ．＃ＲＢ　５００　４００　ＮＡ　Ｐｌａｔｅ：Ｋｕｒａｒａｙ）に播種した。培養には、上述のＭＳＣ振盪浮遊培養と同様の増殖維持培地を用い、３～４日に１度の培地交換を行った。
　ＭＳＣ細胞塊の再接着と細胞増幅
　マウスあるいはヒトＭＳＣを振盪培養することで形成された細胞塊を、増殖維持培地の入ったプラスチック培養皿へ静置して接着させた。この際、ヒトＭＳＣでは上述の増殖培地からβＦＧＦ除いた培地を用いた。その結果、マウスおよびヒトＭＳＣの細胞増幅が可能であった。培養皿に接着した細胞塊の周囲からは多くの細胞が遊走し、増幅して培養皿の培養表面に広がった。細胞の遊走・増幅後、培養皿に接着した細胞塊の本体は、２００μlピペットチップの先端を用いて、細胞塊の底面を剥ぎとることで容易に回収が可能であった。回収した細胞塊を別の培養皿へ再度静置すると同様の細胞遊走による細胞増幅が可能であった。１０ｃｍ培養皿（Ｃａｔ．＃６６４１６０-０１３：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）あるいは１２ｗｅｌｌプレート（Ｃａｔ．＃６６５-１８０：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）に遊走・増幅させた細胞を、それぞれＦｒｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ解析あるいは分化誘導解析に用いた。分化誘導解析では１２ｗｅｌｌプレートの各ウェルに２～３個の細胞塊を播種した（分化誘導法参照）。１０ｃｍ培養皿での培養では、直径２００μｍを超える８～１２個の細胞塊を、培養皿全体に均等な距離を保つ様静置した。
　分化誘導法、染色法（非特許文献６参照）
　骨芽細胞及び脂肪細胞への分化誘導は、接着培養では細胞を１２ｗｅｌｌプレート（Ｃａｔ．＃６６５-１８０：ＣＥＬＬＳＴＡＲ）へ１×１０5細胞（個）／ｗｅｌｌの濃度で播種して行った。細胞塊由来遊走細胞では、同様の１２ｗｅｌｌプレートの各ウェルに２～３個の細胞塊を播種し、細胞塊からから遊走・増幅した細胞を用いた。播種後細胞の接着状態を確認し、６０－７０％コンフルエントの状態（約７日培養）で骨芽細胞分化誘導培地（Ｃａｔ．＃ＰＴ３００２：Ｌｏｎｚａ）及び脂肪細胞分化誘導培地（Ｃａｔ．＃ＰＴ３００４：Ｌｏｎｚａ）に交換し、以降３～４日に１度培地交換を行い、最大２１日間の分化誘導を行った。誘導期間中約２週間で接着細胞及び形成された脂肪滴が浮遊し剥がれる場合があった。その場合は、その時点で培養を終了した。骨芽細胞分化の確認にはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色を、脂肪細胞分化の確認にはオイルレッドＯ染色を用いた。どちらの染色法においても、ヘマトキシリン染色は行わなかった。
　軟骨細胞への分化誘導は１５ｍｌの遠沈管に細胞を１５０Ｇでペレットを形成し、１０ｎｇ／ｍｌ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β３（Ｃａｔ．＃ＰＴ４１２４：ＬＯＮＺＡ）、５００ｎｇ／ｍｌ　ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－６（Ｃａｔ．＃６３２５-ＢＭ-０２０：Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した軟骨細胞誘導培地（Ｃａｔ．＃ＰＴ３００３：Ｌｏｎｚａ）を用いて培養した。１週間に２回培地交換を行い２１日間の培養を行った。誘導した軟骨細胞はトルイジンブルー染色（Ｃａｔ．＃２０９-１４５４５：Ｗａｋｏ）にて分化の確認を行った。ヘマトキシリン染色は行わなかった。
　染色細胞は全て４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）（Ｃａｔ．＃１６３-２０１４５：Ｗａｋｏ）を用いた固定を行った。
　ＡＬＰ染色（非特許文献６参照）
　染色にはＨｉｓｔｏｆｉｎｅ　ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃４１５１６１：ニチレイ）を用いた。ＰＦＡをＰＢＳで洗浄し、染色直前にｋｉｔ中の試薬を混合調整し、孔径０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｃａｔ．＃ＳＬＧＰ０３３ＲＳ：Ｍｅｒｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した染色液で３０分染色し、水洗した。ネガティブコントロール（ＮＣ）は骨芽細胞分化誘導前のＭＳＣを同時にＡＬＰ染色したものを用いた。
　オイルレッドＯ染色（非特許文献６参照）
　ＰＦＡをＰＢＳで洗浄後、６０％イソプロピルアルコールで１分処理し、孔径０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｃａｔ．＃ＳＬＧＰ０３３ＲＳ：Ｍｅｒｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過したオイルレッドＯ染色液（Ｃａｔ．＃４０４９２：Ｍｕｔｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にて３０分染色した。染色後染色液を除去し、再び６０％イソプロピルアルコールで１分処理した後、水洗した。
　トルイジンブルー染色（非特許文献６参照）
　分化誘導後の細胞ペレットをパラフィン包埋し、スライドガラス上に切片を作製した。キシレンによる脱パラフィン、１００％アルコールによる脱キシレンを行い、８０％アルコールで処理した後、孔径０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｃａｔ．＃ＳＬＧＰ０３３ＲＳ：Ｍｅｒｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過したトルイジンブルー染色液（Ｃａｔ．＃２０９－１４５４５：　Ｗａｋｏ）にて３０分染色した。染色後、１００％アルコールにて脱水し、キシレン処理後マリノール（Ｃａｔ．＃２００９－３：　Ｍｕｔｏ　ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にて封入した。
　神経細胞誘導（非特許文献４参照）
神経幹細胞用培地で振盪培養した細胞塊を、神経幹細胞用培地中からＥＧＦ、ＦＧＦ、１×Ｂ２７を取り除き、１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ．＃ＳＨ３０９１０．０３：Ｈｙｃｌｏｎｅ）を加えた培地に移し、ポリ－Ｌ－オルニチン（Ｃａｔ．＃１６３－２７４２１：ＷＡＫＯ；３７℃，１２時間）処理後、フィブロネクチン（Ｃａｔ．＃０６２－０５７０１：ＷＡＫＯ；３７℃，１２時間）処理したチャンバースライド（Ｃａｔ．＃ＳＣＳ－ＮＯ８：ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）へ播種した（２～３個の細胞塊／ｗｅｌｌ）。播種７日後に細胞塊から遊走した細胞を４％ＰＦＡ（Ｃａｔ．＃１６３－２０１４５：ＷＡＫＯ）を用いて固定し、蛍光免疫染色観察に用いた。
　蛍光免疫染色（非特許文献４参照）
ＰＦＡで固定した試料を１×ＰＢＳで洗浄後、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（Ｃａｔ．＃１６０－２４７５１：ＷＡＫＯ）を用いて室温で５分間処理し、再度１×ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞はブロッキングバッファー（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（Ｃａｔ．＃１６０－２４７５１：ＷＡＫＯ）、５％Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｃａｔ．＃２３２０８：Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した１×ＰＢＳ）にて３０分間処理後、５００倍に希釈した抗βＩＩＩ－Ｔｕｂｌｉｎ抗体（Ｃａｔ．＃ａｂ１８２０７：ａｂｃｏｍ）を用いて一次染色（４℃，オーバーナイト）を行った。その後１×ＰＢＳにて洗浄し、１０００倍に希釈したＤｏｎｋｅｙ　Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ（登録商標）４８８；Ｃａｔ＃ａｂ１５００７３：ａｂｃｏｍ）を用いて二次染色（室温１時間）を行った。細胞試料を１×ＰＢＳにて洗浄し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ　ｍｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ　（Ｃａｔ＃Ｈ－１２００：ＶＥＣＴＯＲ）を用いて封入し、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ７８０：Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。
　ＲＴ－ＰＣＲ
　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出にはＴｒｉｚｏｌ（Ｃａｔ．＃１５５９６１０８：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃７４１０６：Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用し（Ｑｕｉａｇｅｎ　Ｋｉｔプロトコールに従い抽出）、ＤＮａｓｅ　Ｉ　（Ｃａｔ．＃ＡＭ２２２２：Ａｍｂｉｏｎ）にてｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡを除去した。逆転写反応にはＲｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．＃Ａ３５００：Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、プロトコール手順に従いランダムプライマー（Ｃａｔ．＃C１１８Ｂ：Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（Ｃａｔ．＃M９００Ｂ：Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＭｇＣｌ２（Ｃａｔ．＃Ａ３５１Ｈ：Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ＰＣＲ反応はｃＤＮＡをＧｏ　Ｔａｑ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｃａｔ．＃Ｍ７１２３：Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅した（Ｐｒｏｍｅｇａ　プロトコール手順に従った）。ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓは１．０～１．５％アガロースゲルに泳動した：
　マウス
ＰＤＧＦＲα；２７０ｂｐ，６０℃，３５サイクル
　Ｆ：　５'-ＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡ-３'（配列番号１）
　Ｒ：　５'-ＡＡＧＧＴＴＡＴＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＴ-３'（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ；４１８ｂｐ，アニーリング６７℃，２６サイクル
　Ｆ：　５'-ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧ-３'（配列番号３）
　Ｒ：　５’－ＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧ－３’（配列番号４）
ＯＰＮ；４３７ｂｐ，６２℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＧＡＴＧＡＧＴＣＴＧ－３’（配列番号１１）
　Ｒ：　５’－ＡＣＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣ－３’ （配列番号１２）
ＯＣＮ；２９２ｂｐ，６２℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴＡＡＧＧＴ－３’ （配列番号１３）
　Ｒ：　５’－ＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣ－３’ （配列番号１４）
Ａｄｉｐｓｉｎ；４３３ｂｐ，６４℃，４０サイクル
　Ｆ：　５’－ＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＣ－３’ （配列番号１５）
　Ｒ：　５’－ＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＡＡＣＣＡＣＡＣＣＴ－３’ （配列番号１６）
ＰＰＡＲγ；４６０ｂｐ，５６℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＧＴＧＣＧＡＴＣＡＡＡＧＴＡＧＡＡＣＣＴＧＣ－３’（配列番号１７）
　Ｒ：　５’－ＣＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＣＧ－３’（配列番号１８）
Ａｇｒｉｃａｎ；１４６ｂｐ，６４℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＣＧＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＡ－３’（配列番号１９）
　Ｒ：　５’－ＴＣＡＴＴＣＡＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＧ－３’（配列番号２０）
Ｓｏｘ９；１３２ｂｐ，６１℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＣＴＡＣＡＧＣ－３’ （配列番号２１）
　Ｒ：　５’－ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＣ－３’（配列番号２２）
Ｃｏｌ２Ａ１；１２１ｂｐ，６１℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＣＣＴＣＣＧＴＣＴＡＣＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡ－３’（配列番号２３）
　Ｒ：　５’－ＡＴＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡ－３’（配列番号２４）
Ｎｅｓｔｉｎ；４９２ｂｐ，６０℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＧＡＣ－３’（配列番号２５）
　Ｒ：　５’－ＴＡＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧ－３’（配列番号２６）
Ｔｗｉｓｔ；２２５ｂｐ，６４　℃，３５サイクル
　Ｆ：　５’－ＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２７）
　Ｒ：　５’－ＴＧＴＧＣＣＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣ－３’（配列番号２８）
　ヒト
Ｓｏｘ２；１５１ｂｐ，６４℃，４０サイクル
　Ｆ：　５'-ＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧ-３'（配列番号５）
　Ｒ：　５'-ＴＴＧＣＧＴＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧ-３'（配列番号６）
Ｏｃｔ３／４：１４４ｂｐ，６８℃，４０サイクル
　Ｆ：　５'-ＧＡＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＧＧ-３'（配列番号７）
　Ｒ：　５'-ＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＣＡＡＡＣ-３'（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ；６１３ｂｐ，５６℃，３５サイクル
　Ｆ：　５'-ＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡ-３'（配列番号９）
　Ｒ：　５'-ＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧ-３（配列番号１０）
　結果
　図１：振盪培養によるマウス及びヒトＭＳＣの細胞塊形成
　ＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣ（ＭＵＢＭＸ-０１００１：Ｃｙａｇｅｎ）及びヒトＭＳＣ（１９歳男性骨髄から純化したＭＳＣ）を接着培養にて継代培養を重ね、継代培養数の少ない細胞及び多い細胞を用意して振盪培養に供した。マウスＭＳＣは購入後最大５０回（出荷前からのカウントでは５６回）まで接着培養による継代培養が可能であった。ヒトＭＳＣは供与後２０回（供与前からのカウントで２２回）まで接着培養による継代培養が可能であった。
　フラスコ内に１．０×１０6個のマウスＭＳＣ（出荷前からの合計継代培養数：１２回）、あるいは１．０×１０7個のヒトＭＳＣ（供与前からの合計継代培養数：６回）を用意し、振盪培養を２カ月間行った結果、マウス及びヒトＭＳＣはどちらも細胞塊を形成した（図１－ａ）。また、同様の振盪培養条件で、出荷前からの継代培養数が４４回のマウスＭＳＣ、及び供与前からの継代培養数が２２回のヒトＭＳＣを用いて振盪培養を２カ月間行った結果、マウスおよびヒトＭＳＣどちらも細胞塊を形成した（図示せず）。
　尚、前述したように、今回使用したＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣは購入時にすでに製造元にて継代培養が６回行われており、ヒト由来ＭＳＣは供与された時点ですでに継代培養が２回行われている。本実施例においては、以降、継代培養数は出荷前及び供与前から継続したカウント数（出荷前及び供与前の継代培養数を含む数）を示す。
　ヒトＭＳＣ（継代培養数：６～７回）が振盪培養によって形成した細胞塊の数は、振盪培養開始時の細胞数が１．０×１０6個の場合には、１ヶ月後で１４．３±２．０個、２ヶ月で１０．７±２．１個であった。振盪培養開始時の細胞数が１．０×１０7個の場合には、１ヶ月後で１５．０±１．０個、２ヶ月後で１１．７±２．５個であった（３回の実験結果の平均値±標準偏差）。つまり、振盪培養開始時の細胞数を１．０×１０6個から１０倍に増やしても細胞塊の形成数に大きな差は生じなかった。
　継代培養数が７回のヒトＭＳＣが振盪培養によって形成した細胞塊の大きさは、振盪培養開始時の細胞数が１．０×１０6個の場合には、１ヶ月で４３３．３±１０３．３μｍ、２ヶ月で５３３．３±１５０．６μｍであった。振盪培養開始時の細胞数が１．０×１０7個の場合には、１ヶ月後で７８３．３±２４８．３μｍ、２ヶ月後で８３３．３±１８６．１μｍであった（６回の実験結果の平均値±標準偏差）。
　継代培養数が多い（１９回）ヒトＭＳＣが１ヶ月間の振盪培養によって形成した細胞塊の数は、振盪培養開始時の細胞数が１．０×１０6個の場合には、１４個、１．０×１０7個の場合には１５個であった（１回の実験結果）。また、継代培養数が１９回のヒトＭＳＣが１ヶ月間の振盪培養によって形成した細胞塊の大きさは、振盪培養開始時の細胞数が１．０×１０6個の場合には５００±１２６．５μｍ、１．０×１０7個の場合には７６６．７±２０６．６μｍであった（６個の細胞塊の平均値±標準偏差）。
　図２：振盪培養がマウスＭＳＣの分化能維持に及ぼす影響
　振盪培養がマウスＭＳＣの分化能維持に及ぼす影響を検討した。接着培養においてＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣは、継代培養数が１１回という比較的少ない段階では、骨芽細胞への分化能（ＡＬＰ染色陽性）及び軟骨細胞への分化能（トルイジンブルー染色陽性）を保っているが、すでに脂肪への分化能は喪失しており、オイルレッドＯ染色に対して陰性を示した（図２－ａ：上段）。
　しかしながら、接着培養で多くの継代培養（３６回）を重ねたＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣであっても、振盪培養に２カ月間供して細胞塊を形成させることで、細胞塊から遊走・増殖した細胞は骨芽細胞への分化能（ＡＬＰ染色陽性）だけでなく、脂肪細胞への分化能（図２－ａの矢印に示される脂肪滴）を保持・回復していた（図２－ａ：下段）。
　細胞表面にＰＤＧＦＲα及びＳｃａ－１を共発現しているマウスＭＳＣは未分化な状態を維持した良質のＭＳＣであることが知られている（非特許文献４、５）。接着培養で７回継代培養したＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣは、ＰＤＧＦＲα+／Ｓｃａ－１+（共陽性分画）を約９０％保持していた（図示せず）が、そのまま継代培養を繰り返すと、この共陽性分画は８回の継代培養で４６．１％に減少し（図２－ｂ：左図）、２３回の継代培養では２５．０％にまで低下した（図示せず）。
　しかしながら接着培養で多くの継代培養（４４回）を重ねたＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣであっても、振盪培養に２カ月間供して細胞塊を形成させることで、細胞塊から遊走・増殖した細胞の共陽性分画は６８．３％に回復した（図２－ｂ：右図）。
　ＲＴ－ＰＣＲ解析の結果、接着培養で培養したＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣは、継代培養数が９回の時点ではＰＤＧＦＲα遺伝子を高発現しているが、継代培養数が２５回、４１回と多くなるにつれてＰＤＧＦＲα遺伝子の発現は著明に低下し、未分化能が喪失している可能性が示唆される。
　しかしながら、継代培養を３７回重ねたＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣであっても、振盪培養に２カ月間供して細胞塊を形成させることで、ＰＤＧＦＲα遺伝子の発現は高い状態に回復することが確認された（図２－Ｃ）。
　図３：振盪培養を行なったＯｒｉｃｅｌｌ TM 　マウスＭＳＣの中胚葉系分化
ＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣを用い、接着培養継代数の少ない細胞（継代数９回）及び多い細胞（継代数３０回）を用意し、振盪培養を１か月行った後に中胚葉系の細胞である骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞へ分化誘導した結果を図３に示す。
　振盪培養後に分化誘導した接着培養継代数の少ない細胞（継代数９回）及び多い細胞（継代数３０回）のどちらも、骨芽細胞（ＡＬＰ陽性）、軟骨細胞（トルイジンブルー陽性）、脂肪細胞（オイルレッドＯ陽性）への分化能を示した。
　図４：中胚葉系細胞への分化誘導時における組織特異的遺伝子発現解析（ＲＴ－ＰＣＲ）
ＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣを用い、接着継代数の少ない細胞（継代数８～９回）及び多い細胞（継代数３０回）を準備した。接着培養後すぐに分化誘導を行なった細胞と接着培養後に振盪培養し分化誘導を行なった細胞で、それぞれ骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に関連する遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲを用いて解析した。
骨芽細胞に２１日間分化誘導した場合、接着培養継代数の少ない細胞（継代数８～９）では、振盪培養細胞の方が接着培養細胞と比較して骨芽細胞マーカーであるＯＣＮ、ＯＰＮの発現が高かった。接着継代培養数の多い細胞（継代数３０回）では、振盪培養細胞の方が接着培養細胞と比較してＯＰＮの発現が高かった（図４－ａ）。
　軟骨細胞に２１日間分化誘導した場合、接着培養継代数の少ない細胞（継代数８～９）では、振盪培養細胞の方が接着培養細胞と比較して軟骨細胞マーカーであるＡｇｒｉｃａｎ、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２Ａ１の発現が高かった。接着継代培養数の多い細胞（継代数３０回）では、振盪培養細胞の方が接着培養細胞と比較してＡｇｒｉｃａｎ、Ｓｏｘ９の発現が高かった（図４－ｂ）。
　脂肪細胞に２１日間分化誘導した場合、接着培養した細胞は継代数にかかわらず脂肪細胞マーカーであるＡｄｉｐｓｉｎおよびＰＰＡＲγを発現しなかった。一方、接着継代数の少ない細胞（継代数９回）を振盪培養するとＡｄｉｐｓｉｎおよびＰＰＡＲγの著明な発現を認め、接着継代数の多い細胞（継代数３０回）細胞を振盪培養するとＰＰＡＲγの発現を認めた（図４－ｃ）。
　図５：振盪培養がヒトＭＳＣの分化能維持に及ぼす影響
　振盪培養がヒトＭＳＣの分化能維持に及ぼす影響を検討した。接着培養においてヒトＭＳＣは、継代培養を２０回重ねると骨芽細胞への分化能（ＡＬＰ染色陽性）は示すが、脂肪細胞への分化能は喪失していた（オイルレッドＯ染色陰性）（図５－ａ：上段）。
　しかしながら、接着培養で６回継代培養したヒトＭＳＣを振盪培養に２カ月間供して細胞塊を形成させることで、細胞塊から遊走・増殖した細胞は骨芽細胞への分化能（ＡＬＰ染色陽性）だけでなく、脂肪細胞への高い分化能（オイルレッドＯ染色陽性）を保持していた（図５－ａ：中段）。特に培養皿に接着した細胞塊の周囲に遊走した細胞は脂肪滴を多く形成し、未分化性が高い可能性が示された。尚、６回継代培養したヒトＭＳＣに対して、振盪培養と同様の２ヵ月間を接着培養した場合、その継代培養数は１２回に達し、脂肪への分化能はすでに喪失していた（オイルレッドＯ染色陰性：図示せず）。
　細胞表面にＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）及びＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）を発現しているヒトＭＳＣは未分化な状態を維持した良質のＭＳＣであることが知られている（非特許文献７）。接着培養で２１回継代培養したヒトＭＳＣはＣＤ９０を高発現していた（図５－ｂ：左上図）。同様に、接着培養にて７回継代培養したヒトＭＳＣを２ヵ月間振盪培養して形成した細胞塊から遊走・増殖した細胞も、ＣＤ９０の発現を９７．９％～９８．０％の高さで維持していた（図５－ｂ：左下図）。一方、接着培養で７回継代培養したヒトＭＳＣにおけるＣＤ２７１の発現はすでに低下し、振盪培養においてもその発現が回復することはなかった（図示せず）。
　しかしながら、高品質なＭＳＣの細胞表面マーカーであるＣＤ１０６（非特許文献７）についてＦＡＣＳ解析した結果、接着培養で２１回継代培養したヒトＭＳＣ細胞ではその発現は６．０～７．５％まで低下していたが（図５－ｂ：右上図）、接着培養にて７回継代培養したヒトＭＳＣを２ヵ月間振盪培養して形成した細胞塊から遊走・増殖した細胞ではその発現は５９．６％～８７．１％に維持されていた（図５－ｂ：右下図）。
　ＲＴ－ＰＣＲ解析の結果、接着培養で培養したヒトＭＳＣは、継代培養数が７回の時点では未分化な幹細胞マーカーとして知られるＯｃｔ３／４遺伝子を発現しているが、継代培養数が１９回と多くなるとその発現は低下し、未分化能が喪失している可能性が示唆される。しかしながら、継代培養を１９回重ねたヒトＭＳＣであっても、振盪培養に２カ月間供して細胞塊を形成させることで、幹細胞関連マーカーとして知られるＳｏｘ２やＯｃｔ３／４遺伝子の発現は高い状態に回復することが確認された（図５－Ｃ）。
　図６：ヒトＭＳＣの軟骨分化能
ヒトＭＳＣを用い、接着継代培養数の少ない細胞（継代数９回）と多い細胞（継代数１９回）を準備し、軟骨細胞への分化能解析を行なった。
　接着培養後すぐに分化誘導を行った接着継代培養数の少ない細胞（継代数９回）を２１日間軟骨へ分化誘導した場合、ペレット形成は認めたが軟骨基質を染めるトルイジンブルーに陽性の細胞はわずかであった。一方、接着継代培養数の少ない細胞（継代数９回）を振盪培養した後に軟骨へ分化誘導した場合、トルイジンブルー陽性細胞によるペレット形成を認めた（図６－ａ）。
　接着培養後すぐに分化誘導を行った接着継代培養数の多い細胞（継代数１９回）を軟骨へ２１日間分化誘導した場合、ペレット形成を認めなかった。一方、接着継代培養数の多い細胞（継代数１９回）を振盪培養した後に軟骨へ分化誘導した場合、トルイジンブルー陽性細胞によるペレット形成を認めた（図６－ｂ）。
　図７：三次元浮遊培養容器（先行技術）を用いたＭＳＣ細胞塊の接着培養
　ＭＳＣの細胞塊を形成する既存の方法に用いられている低接着性の三次元培養容器（Ｋｕｒａｒａｙ　Ｅｌｐｌａｓｉａ　ＲＢ　５００　４００　ＮＡ　Ｐｌａｔｅ）に、接着培養で維持培養したヒトＭＳＣ（継代培養数：９回）あるいはＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣ（継代培養数：２５回および４１回）を３×１０6個／ｍｌで播種した。結果、ヒトＭＳＣにおいては培養皿に接着してしまい、７日経っても細胞塊の形成は得られなかった（図７－ａ）。一方マウスＭＳＣにおいては、Ｂａｒａｎｉａｋらの報告（非特許文献１０）と同様、培養器中で培養７日後には細胞塊を形成した（図７－ｂ）。この時点で回収した細胞塊を再度培養皿に移して接着培養環境下に静置した結果、細胞塊は培養皿に接着し周囲に細胞が遊走したが、細胞塊はその形態を保つことなく７日後には消失し、脂肪細胞への分化能は失われていた（オイルレッドＯ染色陰性かつ脂肪滴を認めず）（図７－ｂ）。
　図８：三次元浮遊培養容器（先行技術）を用いたＯｒｉｃｅｌｌ TM 　マウスＭＳＣ細胞塊の分化能解析
低接着性の三次元浮遊培養容器（Ｋｕｒａｒａｙ　Ｅｌｐｌａｓｉａ　ＲＢ　５００　４００　ＮＡ　Ｐｌａｔｅ）に、接着培養で維持培養したＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣ（継代培養数：２５回および４１回）を３×１０6個／ｍｌで播種した。７日後に形成された細胞塊を１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｃａｔ．＃６６５－１８０：ＣＥＬＬＳＴＡＲ，ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ）に播種することで接着培養へ移行し、接着した細胞塊から遊走した細胞の骨芽細胞および脂肪細胞への分化を検証した。
　接着継代培養２５回後及び４１回後のＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣを骨芽細胞へ２１日間分化誘導した結果、どちらもＡＬＰ陽性を示し、骨芽細胞への分化能が確認された（図８－ａ）。一方、接着継代培養２５回後及び４１回後のＯｒｉｃｅｌｌTM　マウスＭＳＣを脂肪細胞へ２１日間分化誘導した結果、オイルレッドＯ陽性の脂肪滴の形成は認めなかった（図８－ｂ）。
　図９：振盪培養したヒトＭＳＣ細胞塊の形態保持及び細胞供給能力
　接着培養にて７回継代培養したヒトＭＳＣを２ヵ月間振盪培養して形成した細胞塊を培養皿に静置した結果、翌日には細胞塊周囲への細胞の遊走を認め、７日後には細胞は培養皿を満たすように増殖した（図９－ａ：上段）。また、再接着した細胞塊は７日後にもその形態を保持しており、細胞塊を機械的に剥がして新たな培養皿に静置することが可能であった（再接着１回目）。再度細胞塊を静置した翌日には、先述同様に細胞塊周囲への細胞の遊走を認め、１０日以内に細胞は培養皿を満たすように増殖し、細胞塊はその形態を保持していた（図９－ａ：中段左2枚の写真）。この細胞塊を機械的に剥がして新たな培養皿に静置することをさらに４回繰り返しても（再接着２～５回目）、同様に細胞塊周囲への細胞の遊走を認め、１４日以内に細胞は培養皿を満たすように増殖し、細胞塊はその形態を保持していた（図９－ａ：中段右3枚の写真～下段）。
　また、この細胞塊を剥がして再度培養皿に接着させる工程を３回行うことで遊走した細胞は、骨芽細胞への分化能（ＡＬＰ染色陽性）および脂肪細胞への分化能（脂肪滴およびオイルレッドＯ染色陽性）を示し、従って、未分化性を維持していることが明らかとなった（図９－ｂ）。従って、本発明によるＭＳＣ細胞塊は、細胞同士が強靭な接着力を持ち、再度接着培養環境に戻しても、その細胞塊の形態を崩すことなく培養皿に未分化なＭＳＣを供給し続けることが分かった。
　図１０：マウス純化ＭＳＣの振盪培養によって形成された細胞塊
　純化したマウスＭＳＣにおいても振盪培養に供することによってＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣの場合と同様の細胞塊を形成するか否かを検討した。ソーティング後のマウス純化ＭＳＣは、細胞数を確保するため、接着培養にて２回継代培養を行った。この２回継代したマウス純化ＭＳＣ（５．０×１０5個／フラスコ）を２ヶ月間振盪培養した結果、ＯｒｉＣｅｌｌTM　マウスＭＳＣの場合と同様の細胞塊を形成した（図示せず）。形成した細胞塊を新たな培養皿に静置した結果、翌日には細胞塊周囲への細胞の遊走を認め（図１０－ｂ：左図）、遊走した細胞は１０日以内に培養皿を満たすように増殖した。なお、この際も細胞塊は形を崩すことはなくその形態を保持していた。また、遊走・増殖した細胞は、脂肪細胞へ分化誘導すると１４日後には脂肪滴を産生したことから（図１０－ｃ）、脂肪細胞への分化能を保持していることが明らかとなった。
　図１１：ＯｒｉｃｅｌｌＴＭ　マウスＭＳＣの神経幹細胞用培地を用いた細胞塊形成
ＯｒｉｃｅｌｌＴＭマウスＭＳＣを用い、神経幹細胞用培地中で同様の振盪培養を行った場合にも細胞塊が形成されるか否かを検証した。また、得られた細胞塊における中胚葉系細胞（骨、脂肪、軟骨）および神経細胞への分化能について検証した。さらに、ＲＴ－ＰＣＲにて神経堤幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｔｗｉｓｔの発現および間葉系幹細胞マーカーであるＰＤＧＦＲαの発現を解析した。
　接着継代培養の少ない細胞（継代数９回）を神経幹細胞用培地中で振盪培養した結果、１か月以内に細胞塊の形成を認めた（図１１－ａ）。
この細胞塊を用いて骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞へ分化誘導した結果、ＡＬＰ陽性の骨芽細胞、オイルレッドＯ陽性の脂肪滴を示す脂肪細胞、トルイジンブルー陽性細胞による軟骨ペレットの形成を認めた（図１１－ｂ）。また、この細胞塊を用いて神経細胞へ分化誘導した結果、βＩＩＩ－Ｔｕｂｌｉｎ陽性の神経細胞を認めた（図１１－ｃ）。
　さらに、接着継代培養の多い細胞（継代数３９回）であっても、神経幹細胞用培地を用いることで細胞塊の形成は可能であった（図１１－ｄ）。ＲＴ－ＰＣＲ解析の結果、この細胞塊の細胞は神経堤幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｔｗｉｓｔおよび間葉系幹細胞マーカーであるＰＤＧＦＲαを著明に発現していた（図１１－ｅ）。
　まとめ
　上記結果から明らかなように、振盪培養を用いることにより、未分化性を失ったＭＳＣを再び高い未分化性ＭＳＣ集団の細胞塊へと回復させることができた。また、振盪培養にて形成されたＭＳＣ細胞塊は未分化性を保持すると同時に、強靭な形態保持能力を有しており、新たな培養皿に再度接着させることで未分化なＭＳＣを供給することができる。
　本発明の方法によれば、ＭＳＣを接着環境から全く新しい攪拌振盪培養法にて培養することで、分化能を維持させ形態を維持した強靭な三次元的ＭＳＣ塊（スフェア）を形成できる。
　従って、未分化性を保持した幹細胞を供給し続ける幹細胞プールとしての有用性があることが示唆される。
また再生医療への応用の観点では、この細胞塊はそれ自体がスキャホールドとして欠損部位のスペースメーキングし、幹細胞の組織再生を促すことが期待される。

Claims (8)

  1. 　間葉系幹細胞を振盪培養することを特徴とする、未分化性を維持したまま間葉系幹細胞を培養する方法。
  2. 　前記振盪培養が回転数２０～２００ｒｐｍで行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記振盪培養が振幅１０～４０ｍｍで行われる、請求項１に記載の方法。
  4. 　２回以上、継代培養を行う、請求項１に記載の方法。
  5. 　振盪培養に供する前記間葉系幹細胞が所定の細胞への分化能を喪失している細胞であり、かつ該所定の細胞への分化能が振盪培養により回復する、請求項１に記載の方法。
  6. 　請求項１に記載の方法により得られる細胞塊。
  7. 　分化誘導培地中で請求項６に記載の細胞塊を培養する工程を含む、細胞分化方法。
  8. 　請求項７に記載の方法により所定の細胞に分化した細胞塊。
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