WO2018189306A1 - Messbox zur analyse von substanzen - Google Patents

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WO2018189306A1 PCT/EP2018/059415 EP2018059415W WO2018189306A1 WO 2018189306 A1 WO2018189306 A1 WO 2018189306A1 EP 2018059415 W EP2018059415 W EP 2018059415W WO 2018189306 A1 WO2018189306 A1 WO 2018189306A1
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measuring
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Wolfram Miekisch
Jochen Schubert
Pritam SUKUL
Peter Oertel
Ann-Christin BISCHOFF
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Universität Rostock
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/22—Devices for withdrawing samples in the gaseous state
    • G01N1/2226—Sampling from a closed space, e.g. food package, head space
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    • G01N2001/2229—Headspace sampling, i.e. vapour over liquid

Definitions

  • the invention relates to a device for measuring volatile organic substances as biomarkers in the ultratrace region in the air space over biological samples or cultures.
  • the analysis of volatile organic substances from cell or bacterial cultures can promote the basic understanding of biochemical processes and help to develop in vitro strategies.
  • the measurement of volatile organic substances in trace analysis and the monitoring of minute changes in concentration require a controlled, qualified and reliable set-up.
  • the vapor space analysis also known as head-space technology
  • the samples are incubated in 20 ml standard vials at 40-60 ° C for at least 15 minutes. From these containers, samples are taken from the vapor space using syringes and the samples are entered into the gas chromatograph (analytical methods, head-space technique, collection method Bd2).
  • Cell culture flasks contain a stopper through which a feed tube and a suction tube are passed. Through the supply pipe, a mixture of nitrogen, oxygen and CO 2 is introduced into the flask, and from the suction, the gas is removed with the proportions to be measured.
  • the current systems mainly show two major weaknesses: On the one hand, the gas space above the culture samples is diluted by supplying air mixtures and thus greatly reduces the already low concentration of the substances to be detected and thus possibly removed from the detectable area. On the other hand, these systems are defined on defined cell culture carriers. As a result, a universal use for the research of, for example, bacteria, cell and tissue samples is not possible. In addition, the necessary standardization with regard to temperature, flow rate, shielding of external influences, etc. for the comparability of sampling is often not given. This can therefore lead to greatly fluctuating measurement results.
  • the plastic materials used emit substances that can interfere with the analysis and do not prevent the ingress of contaminants from the ambient air, such as solvents, plastics and other cultures.
  • the invention is based on the object of providing a possibility with which the sampling from the headspace of biological samples is flexibly reproducible for different cell culture carriers under standardized conditions. In this case, a loss of concentration by dilution, condensation or diffusion of the gas samples should be avoided. Even influences of the environment, such as laboratory air, solvents, etc., on the system under investigation should be completely prevented.
  • the invention proposes a measuring box with the features mentioned in claim 1 and the use of the measuring box for the analysis of the organic substances to be investigated. Further developments of the invention are Subject of dependent claims.
  • the measuring box proposed by the invention contains a shell of inert polymer material (Teflon) with a glass lid, which is also an inert material. Therefore, there is no danger that the measuring box will react with the sample placed inside.
  • the dimensions of the dish are chosen so that a wide variety of different cell culture carriers can be placed in the dish. Furthermore, the inner volume can be varied by different sized inserts of inert material and adapted to the experimental requirements.
  • the shell can be hermetically sealed to the glass lid by means of an externally mounted closure system which allows optical control of the biological samples during the measurement.
  • the accesses in the side walls allow the sample to be accessed using tools.
  • a needle trap device NTD
  • access may be by solid micro-extraction (SPME).
  • SPME solid micro-extraction
  • the invention can be used for both static and dynamic sampling.
  • a shape for the shell in particular a cuboid shape has been found to be useful, which thus has four side walls which are parallel to each other in pairs run.
  • the closing device acts on two opposite side walls of the shell or of the cover.
  • the closing device may be made of metal or rigid plastic.
  • the passage means are designed as threaded adapters, for example in the form of a compatible with clinical materials Luer-lock connection. These are hermetically sealed and preferably attached to two opposite locations. Therefore, it is possible to control the air composition in the interior of the measuring box by flushing with a defined gas mixture by using these feeders before measuring the biological sample. As a result, standardized conditions can be created before taking or measuring the sample.
  • one or more insert bodies of inert material can be inserted into the measuring box in order to vary the volume of the interior of the measuring box ,
  • the substantial improvement of the measuring box compared to conventional systems lies in the universal applicability for the most different cell culture carriers, in the non-influence of the biological sample and in the missing dilution effect of the measurable substances.
  • the samples in the measuring box they are not affected in their growth, metabolism and behavior since the cell culture carrier is not changed for the measurement but can be embedded in the measuring system.
  • FIG. 1 shows a schematic longitudinal section through a measuring box proposed by the invention.
  • the section through the measuring box proposed by the invention shown in Figure 1 shows a trough-like shell (1), which is made of an inert material, for example made of PTFE.
  • the shell (1) has a flat bottom (2) and four side walls (3), of which only two opposite side walls (3) can be seen in the longitudinal section of FIG.
  • the side walls (3) are approximately perpendicular to the bottom (2) and in pairs to each other. They are attached to the edge of the floor (2).
  • the side walls (3) At their edge region facing away from the bottom (2), the side walls (3) each have an outwardly directed flange (4) which runs around the shell (1) and lies in a plane parallel to the bottom (2).
  • a lid (5) is placed on the flange (4) a lid (5) is placed.
  • blocks (7) made of inert material, preferably also made of PTFE, are used in the example shown, which vary the volume of the interior.
  • the biological sample is placed inside a cell culture carrier (8).
  • Both the right and the left side wall (3) have below the flange (4) on an airtight sealable passage means (9).
  • a passage device (9) By such a passage device (9), a tool for sampling can be performed, with the help of a certain amount of gas from the interior of the measuring box can be removed.
  • the advantages of the invention are the more sensitive measurement of volatile organic substances in the ultra trace range, the applicability with a variety of biological sample carrier forms, in the possible adaptation of the measurement volume to the sample to be measured, in the lesser influence of confounders by a hermetically closed system.

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Abstract

Eine Vorrichtung zur Analyse von volatilen organischen Substanzen von Zell- oder Bakterienkulturen enthält eine Schale aus PTFE mit einem mit dieser Schale luftdicht verschließbaren Deckel. In mindestens einer Seitenwand ist mindestens eine luftdicht verschließbare Durchführungseinrichtung für ein Entnahmewerkzeug angeordnet, durch die hindurch das Entnahmewerkzeug in den Innenraum eingeführt werden kann, um von dort Gasproben zu entnehmen.

Description

Messbox zur Analyse von Substanzen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung von volatilen organischen Substanzen als Biomarker im Ultraspurenbereich im Luftraum über biologischen Proben bzw. Kulturen. Die Analyse von volatilen organischen Substanzen von Zell- oder Bakterienkulturen kann das grundlegende Verständnis von biochemischen Vorgängen fördern und helfen, in vitro Strategien zu entwickeln. Die Messung von volatilen organischen Substanzen in der Spurenanalytik und das Monitoring von kleinsten Konzentrationsveränderungen setzen ein kontrolliertes, qualifiziertes und verlässliches Set-up voraus.
Zur Durchführung derartiger Messungen ist die Dampfraumanalyse, auch Head-Space- Technik genannt, bekannt. Beispielsweise werden die Proben in 20 ml Standardfläschchen bei 40-60 °C mindestens 15 Minuten inkubiert. Aus diesen Behältern werden Proben aus dem Dampfraum mithilfe von Spritzen entnommen und die Proben in den Gaschromatografen eingegeben (Analytische Methoden, Head-Space-Technik, Sammelmethode Bd2).
Weitere Beispiele sind aus: "Dynamic collection and analysis of volatile organic Compounds from the headspace of cell cultures" (Autoren: A Baranska, A Smolinska, A W Boots, J W Dallinga and F J van Schooten, Journal of Breath Research 9 (2015) 047102) bekannt. Zellkulturkolben enthalten einen Verschlussstopfen, durch den ein Zuleitungsrohr und ein Absaugrohr hindurchgeführt werden. Durch das Zuleitungsrohr wird eine Mischung aus Stickstoff, Sauerstoff und CO2 in den Kolben eingeleitet, und aus dem Absaugvorgang wird das Gas mit den zu messenden Anteilen entnommen.
Ebenfalls bekannt ist es („Headspace measurements of irradiated in vitro cells using PTR- MS", Radiat Environ Biophys (201 1 ) 50:209-217), Kulturkolben, die die Zellen und die Kulturen enthalten, während der gesamten Messung in einer Bestrahlungskammer zu platzieren, anzuordnen. Durch ein Rohr aus PTFE wird Gas von der einen Seite in den Kulturkolben eingeleitet, und das Gas wird auf der gegenüberliegenden Seite durch ein Rohr ebenfalls aus PTFE in die Messeinrichtung abgeleitet. Eine weitere bekannte Möglichkeit ("Release and uptake of volatile organic Compounds by human hepatocellular Carcinoma cells in vitro", Mochalski et al., Cancer Cell International 2013, 13:72) besteht darin, das Medium mit den Zellkulturen in einem Kulturkolben unterzubringen. Durch einen Verschlussstopfen wird ein Rohr aus PTFE in das Innere des Kolbens eingesetzt, durch das sterile Luft in das Innere des Kolbens geleitet wird. Durch den Verschlussstopfen wird ein zweites Rohr geführt, durch das das zu messende Gasgemisch aus dem Kolben herausgepumpt wird.
Die aktuellen Systeme zeigen hauptsächlich zwei große Schwächen: Zum einen wird der Gasraum über den Kulturproben durch Zuführung von Luftgemischen verdünnt und somit die ohnehin geringen Konzentration der zu detektierenden Substanzen stark herabgesetzt und damit evtl. aus dem detektierbaren Bereich entfernt. Zum anderen sind diese Systeme auf definierte Zellkulturträger festgelegt. Dadurch ist ein universeller Einsatz für die Erforschung von beispielsweise Bakterien, Zell-und Gewebeproben nicht möglich. Außerdem ist die notwendige Standardisierung im Hinblick auf Temperatur, Flussrate, Abschirmung von äußeren Einflüssen usw. für die Vergleichbarkeit der Probennahme oftmals nicht gegeben. Dies kann daher zu stark schwankenden Messergebnissen führen. Die verwendeten Kunststoffmaterialien emittieren Substanzen, die die Analyse stören können, und verhindern nicht das Eindringen von Kontaminationen aus der Umgebungsluft, beispielsweise Lösungsmittel, Plastikmaterialien und andere Kulturen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Möglichkeit zu schaffen, mit der die Probenentnahme aus dem Head-Space biologischer Proben flexibel für unterschiedliche Zellkulturträger unter standardisierten Bedingungen reproduzierbar möglich wird. Dabei soll ein Konzentrationsverlust durch Verdünnung, Kondensation oder Diffusion der Gasproben vermieden werden. Auch Einflüsse der Umgebung, zum Beispiel Laborluft, Lösungsmittel usw., auf das untersuchte System sollen komplett unterbunden werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung eine Messbox mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen und die Verwendung der Messbox für die Analyse der zu untersuchenden organischen Substanzen vor. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand von Unteransprüchen.
Die von der Erfindung vorgeschlagene Messbox enthält eine Schale aus inertem Polymermaterial (Teflon) mit einem Deckel aus Glas, bei dem es sich ebenfalls um ein inertes Material handelt. Daher besteht keine Gefahr, dass die Messbox mit der in ihrem Inneren angeordneten Probe reagiert. Die Dimensionen der Schale sind so gewählt, dass eine große Auswahl an verschiedenen Zellkulturträgern in der Schale platziert werden kann. Des Weiteren kann das innere Volumen durch verschieden große Einsätze aus inertem Material variiert und an die Versuchsanforderungen angepasst werden.
Die Schale kann durch ein von außen angebrachtes Verschließsystem hermetisch mit dem Glasdeckel, durch den eine optische Kontrolle der biologischen Proben während der Messung möglich bleibt, abgedichtet werden.
Durch die in den Seitenwänden angebrachten Zugänge kann mithilfe von Werkzeugen auf die Probe zugegriffen werden. Beispielsweise kann ein needle trap device (NTD) verwendet werden, oder der Zugriff kann durch eine Feststoffmikroextraktion (SPME) erfolgen. Durch diese Probenentnahmetechniken werden die Gasproben innerhalb der abgedichteten Schale nicht verdünnt und die biologische Probe im Innern der Messbox nicht beeinflusst.
Bei ausreichend hoher Emission der biologischen Probe, ist auch ein kontinuierliches Monitoring denkbar. Dazu kann mittels eines Anschlusses ein definierte Menge Gasgemisch zugeführt werden, während über den anderen Zugang das Probengas entnommen wird. Damit kann die Erfindung sowohl für eine statische, als auch für eine dynamische Probennahme verwendet werden.
Als eine bevorzugte Möglichkeit für ein inertes Material der trogartigen Schale hat sich PTFE herausgestellt.
Als Form für die Schale hat sich insbesondere eine Quaderform als sinnvoll herausgestellt, die also vier Seitenwände aufweist, die paarweise zueinander parallel verlaufen.
In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Verschließeinrichtung an zwei einander gegenüberliegenden Seitenwänden der Schale bzw. des Deckels angreift. Insbesondere kann die Verschließeinrichtung aus Metall oder starrem Kunststoff hergestellt sein.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Durchführungseinrichtungen als Gewindeadapter ausgebildet sind, beispielsweise in Form einer mit klinischen Materialien kompatiblen Luer-Lock Verbindung. Diese sind luftdicht verschließbar und vorzugsweise an zwei einander gegenüberliegenden Stellen angebracht. Daher ist es möglich, durch Verwendung dieser Durchführungseinrichtungen vor der Messung der biologischen Probe die Luftzusammensetzung im Inneren der Messbox durch Spülen mit einem definierten Gasgemisch zu kontrollieren. Dadurch lassen sich standardisierte Bedingungen vor der Entnahme bzw. Messung der Probe schaffen.
Um auch bei stark unterschiedlichen Probenträgern bzw. Zellkulturträgern kein zu großes Luftvolumen im Innern der Messbox vorzuhalten, kann erfindungsgemäß in Weiterbildung vorgesehen sein, dass in die Messbox ein oder mehrere Einsatzkörper aus inertem Material eingesetzt werden können, um das Volumen des Innenraums der Messbox zu variieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die wesentliche Verbesserung der Messbox im Vergleich zu herkömmlichen Systemen in der universellen Einsetzbarkeit für die unterschiedlichsten Zellkulturträger, in der Nichtbeeinflussung der biologischen Probe und in dem fehlenden Verdünnungseffekt der messbaren Substanzen liegt. Durch das Anordnen der Proben in der Messbox werden diese in ihrem Wachstum, Stoffwechsel und Verhalten nicht beeinflusst, da der Zellkulturträger für die Messung nicht verändert wird, sondern in das Messsystem eingebettet werden kann. Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorzüge der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und der Zusammenfassung, deren beider Wortlaut durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht wird, der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung sowie anhand der Zeichnung. Hierbei zeigt:
Figur 1 einen schematischen Längsschnitt durch eine von der Erfindung vorgeschlagene Messbox.
Der in Figur 1 dargestellte Schnitt durch die von der Erfindung vorgeschlagene Messbox zeigt eine trogartige Schale (1 ), die aus einem inerten Material hergestellt ist, beispielsweise aus PTFE. Die Schale (1 ) weist einen ebenen Boden (2) und vier Seitenwände (3) auf, von denen in dem Längsschnitt der Figur 1 nur zwei gegenüberliegende Seitenwände (3) zu sehen sind. Die Seitenwände (3) verlaufen angenähert senkrecht zu dem Boden (2) und paarweise zueinander. Sie sind am Rand des Bodens (2) angesetzt. An ihrem dem Boden (2) abgewandten Randbereich weisen die Seitenwände (3) jeweils einen nach außen gerichteten Flansch (4) auf, der um die Schale (1 ) herumläuft und in einer Ebene parallel zum Boden (2) liegt. Auf den Flansch (4) ist ein Deckel (5) aufgelegt. Durch das Aufliegen des Deckels auf dem ebenfalls ebenen Flansch (4) der Schale (1 ) ergibt sich eine abdichtbare Auflage des Deckels (5) auf dem Flansch (4). Im Bereich des rechts und links in der Figur 1 zu sehenden Rands ist der Deckel (5) mit dem Flansch (4) mithilfe einer nur schematisch angedeuteten Verschließeinrichtung (6) abgedichtet verbunden.
Innerhalb der Schale sind im dargestellten Beispiel mehrere Blöcke (7) aus inertem Material, vorzugsweise ebenfalls aus PTFE, eingesetzt, die das Volumen des Innenraums variieren. Auf den Blöcken (7) ist die biologische Probe innerhalb eines Zellkulturträgers (8) aufgesetzt.
Sowohl die rechte als auch die linke Seitenwand (3) weisen unterhalb des Flansches (4) eine luftdicht abdichtbare Durchführungseinrichtung (9) auf. Durch eine solche Durchführungseinrichtung (9) kann ein Werkzeug zur Probennahme durchgeführt werden, mit dessen Hilfe eine bestimmte Menge Gas aus dem Inneren der Messbox entnommen werden kann.
Da zwei einander gegenüberliegende Durchführungseinrichtungen (9) vorhanden sind, kann hiermit auch ein Durchspülen des Innenraums der Messbox durchgeführt werden.
Die Vorteile der Erfindung liegen in der empfindlicheren Messung von volatilen organischen Substanzen im Ultraspurenbereich, in der Anwendbarkeit mit einer Vielzahl an biologischen Probenträgerformen, in der möglichen Adaption des Messvolumens an die zu messende Probe, in dem geringeren Einfluss von Störfaktoren durch ein hermetisch geschlossenes System.

Claims

Patentansprüche
1. Messbox zur Analyse von volatilen organischen Substanzen über biologischen Proben (insb. Zell- oder Bakterien- oder Gewebekulturen), mit
- einer trogartigen Seitenwände (3) aufweisenden Schale (1 ) aus inertem Material, die
- zur Aufnahme mindestens eines üblichen Zellkulturträgers (8) ausgebildet ist,
- einem als Platte ausgebildeten Deckel (5),
- einer Verschließeinrichtung (6) zwischen dem Rand der Schale (1 ) und dem
Deckel (5) zum hermetischen Verschließen der Messbox, sowie mit
- mindestens einer luftdicht verschließbaren Durchführungseinrichtung (9) in einer Seitenwand (3) der Schale (1 ) zum Einführen eines Entnahmewerkzeugs.
2. Messbox nach Anspruch 1 , bei der die Schale (1 ) aus PTFE besteht.
3. Messbox nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Schale (1 ) Quaderform mit vier Seitenwänden (2) aufweist.
4. Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die
Verschließeinrichtung (4) an zwei gegenüberliegenden Seitenwänden (3) der Schale (1 ) bzw. des Deckels (5) angreift.
5. Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die
Durchführungseinrichtung (9) als Gewindeadapter mit einer Gewindebohrung ausgebildet ist, vorzugsweise als Luer-Lock.
6. Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit zwei
Durchführungseinrichtungen (9), die vorzugsweise in einander
gegenüberliegenden Seitenwänden (3) der Schale (1 ) angeordnet sind. Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit mindestens einem in der Größe und Form an die Messbox angepassten Einsatzkörper (7) aus inertem Material zur Variierung des Volumens des Innenraums der Messbox.
Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die
Verschließeinrichtung (4) aus Metall oder starrem Kunststoff besteht.
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