DE102017108022B4

DE102017108022B4 - Messbox zur Analyse von Substanzen

Info

Publication number: DE102017108022B4
Application number: DE102017108022.8A
Authority: DE
Inventors: Wolfram Miekisch; Jochen Schubert; Pritam Sukul; Peter Oertel; Ann-Christin Bischoff
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2019-01-17
Anticipated expiration: 2037-04-14
Also published as: WO2018189306A1; DE102017108022A1

Abstract

Messbox zur Analyse von volatilen organischen Substanzen über biologischen Proben (insb. Zell- oder Bakterien- oder Gewebekulturen), mit
- einer trogartigen Seitenwände (3) aufweisenden Schale (1) aus inertem Material, die
- zur Aufnahme mindestens eines üblichen Zellkulturträgers (8) ausgebildet ist,
- einem als Platte ausgebildeten Deckel (5),
- einer Verschließeinrichtung (6) zwischen dem Rand der Schale (1) und dem Deckel (5) zum hermetischen Verschließen der Messbox, sowie mit
- mindestens einer luftdicht verschließbaren Durchführungseinrichtung (9) in einer Seitenwand (3) der Schale (1) zum Einführen eines Entnahmewerkzeugs.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung von volatilen organischen Substanzen als Biomarker im Ultraspurenbereich im Luftraum über biologischen Proben bzw. Kulturen. Die Analyse von volatilen organischen Substanzen von Zell- oder Bakterienkulturen kann das grundlegende Verständnis von biochemischen Vorgängen fördern und helfen, in vitro Strategien zu entwickeln. Die Messung von volatilen organischen Substanzen in der Spurenanalytik und das Monitoring von kleinsten Konzentrationsveränderungen setzen ein kontrolliertes, qualifiziertes und verlässliches Set-up voraus.
Zur Durchführung derartiger Messungen ist die Dampfraumanalyse, auch Head-Space-Technik genannt, bekannt. Beispielsweise werden die Proben in 20 ml Standardfläschchen bei 40-60 °C mindestens 15 Minuten inkubiert. Aus diesen Behältern werden Proben aus dem Dampfraum mithilfe von Spritzen entnommen und die Proben in den Gaschromatografen eingegeben (Analytische Methoden, Head-Space-Technik, Sammelmethode Bd2).
Weitere Beispiele sind aus: „Dynamic collection and analysis of volatile organic compounds from the headspace of cell cultures" (Autoren: A Baranska, A Smolinska, A W Boots, J W Dallinga and F J van Schooten, Journal of Breath Research 9 (2015) 047102) bekannt. Zellkulturkolben enthalten einen Verschlussstopfen, durch den ein Zuleitungsrohr und ein Absaugrohr hindurchgeführt werden. Durch das Zuleitungsrohr wird eine Mischung aus Stickstoff, Sauerstoff und CO₂ in den Kolben eingeleitet, und aus dem Absaugvorgang wird das Gas mit den zu messenden Anteilen entnommen.
Ebenfalls bekannt ist es („Headspace measurements of irradiated in vitro cells using PTR-MS", Radiat Environ Biophys (2011) 50:209-217), Kulturkolben, die die Zellen und die Kulturen enthalten, während der gesamten Messung in einer Bestrahlungskammer zu platzieren. anzuordnen. Durch ein Rohr aus PTFE wird Gas von der einen Seite in den Kulturkolben eingeleitet, und das Gas wird auf der gegenüberliegenden Seite durch ein Rohr ebenfalls aus PTFE in die Messeinrichtung abgeleitet.
Eine weitere bekannte Möglichkeit („Release and uptake of volatile organic compounds by human hepatocellular carcinoma cells in vitro", Mochalski et al., Cancer Cell International 2013, 13:72) besteht darin, das Medium mit den Zellkulturen in einem Kulturkolben unterzubringen. Durch einen Verschlussstopfen wird ein Rohr aus PTFE in das Innere des Kolbens eingesetzt, durch das sterile Luft in das Innere des Kolbens geleitet wird. Durch den Verschlussstopfen wird ein zweites Rohr geführt, durch das das zu messende Gasgemisch aus dem Kolben herausgepumpt wird.
Die aktuellen Systeme zeigen hauptsächlich zwei große Schwächen: Zum einen wird der Gasraum über den Kulturproben durch Zuführung von Luftgemischen verdünnt und somit die ohnehin geringen Konzentration der zu detektierenden Substanzen stark herabgesetzt und damit evtl. aus dem detektierbaren Bereich entfernt. Zum anderen sind diese Systeme auf definierte Zellkulturträger festgelegt. Dadurch ist ein universeller Einsatz für die Erforschung von beispielsweise Bakterien, Zell-und Gewebeproben nicht möglich. Außerdem ist die notwendige Standardisierung im Hinblick auf Temperatur, Flussrate, Abschirmung von äußeren Einflüssen usw. für die Vergleichbarkeit der Probennahme oftmals nicht gegeben. Dies kann daher zu stark schwankenden Messergebnissen führen. Die verwendeten Kunststoffmaterialien emittieren Substanzen, die die Analyse stören können, und verhindern nicht das Eindringen von Kontaminationen aus der Umgebungsluft, beispielsweise Lösungsmittel, Plastikmaterialien und andere Kulturen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Möglichkeit zu schaffen, mit der die Probenentnahme aus dem Head-Space biologischer Proben flexibel für unterschiedliche Zellkulturträger unter standardisierten Bedingungen reproduzierbar möglich wird. Dabei soll ein Konzentrationsverlust durch Verdünnung, Kondensation oder Diffusion der Gasproben vermieden werden. Auch Einflüsse der Umgebung, zum Beispiel Laborluft, Lösungsmittel usw., auf das untersuchte System sollen komplett unterbunden werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung eine Messbox mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen und die Verwendung der Messbox für die Analyse der zu untersuchenden organischen Substanzen vor. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand von Unteransprüchen.
Die von der Erfindung vorgeschlagene Messbox enthält eine Schale aus inertem Polymermaterial (Teflon)_mit einem Deckel aus Glas, bei dem es sich ebenfalls um ein inertes Material handelt. Daher besteht keine Gefahr, dass die Messbox mit der in ihrem Inneren angeordneten Probe reagiert. Die Dimensionen der Schale sind so gewählt, dass eine große Auswahl an verschiedenen Zellkulturträgern in der Schale platziert werden kann. Des Weiteren kann das innere Volumen durch verschieden große Einsätze aus inertem Material variiert und an die Versuchsanforderungen angepasst werden.
Die Schale kann durch ein von außen angebrachtes Verschließsystem hermetisch mit dem Glasdeckel, durch den eine optische Kontrolle der biologischen Proben während der Messung möglich bleibt abgedichtet werden.
Durch die in den Seitenwänden angebrachten Zugänge kann mithilfe von Werkzeugen auf die Probe zugegriffen werden. Beispielsweise kann ein needle trap device (NTD) verwendet werden, oder der Zugriff kann durch eine Feststoffmikroextraktion (SPME) erfolgen. Durch diese Probenentnahmetechniken werden die Gasproben innerhalb der abgedichteten Schale nicht verdünnt und die biologische Probe im Innern der Messbox nicht beeinflusst.
Bei ausreichend hoher Emission der biologischen Probe, ist auch ein kontinuierliches Monitoring denkbar. Dazu kann mittels eines Anschlusses ein definierte Menge Gasgemisch zugeführt werden, während über den anderen Zugang das Probengas entnommen wird. Damit kann die Erfindung sowohl für eine statische, als auch für eine dynamische Probennahme verwendet werden.
Als eine bevorzugte Möglichkeit für ein inertes Material der trogartigen Schale hat sich PTFE herausgestellt.
Als Form für die Schale hat sich insbesondere eine Quaderform als sinnvoll herausgestellt, die also vier Seitenwände aufweist, die paarweise zueinander parallel verlaufen.
In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Verschließeinrichtung an zwei einander gegenüberliegenden Seitenwänden der Schale bzw. des Deckels angreift. Insbesondere kann die Verschließeinrichtung aus Metall oder starrem Kunststoff hergestellt sein.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Durchführungseinrichtungen als Gewindeadapter ausgebildet sind, beispielsweise in Form einer mit klinischen Materialien kompatiblen Luer-Lock Verbindung. Diese sind luftdicht verschließbar und vorzugsweise an zwei einander gegenüberliegenden Stellen angebracht. Daher ist es möglich, durch Verwendung dieser Durchführungseinrichtungen vor der Messung der biologischen Probe die Luftzusammensetzung im Inneren der Messbox durch Spülen mit einem definierten Gasgemisch zu kontrollieren. Dadurch lassen sich standardisierte Bedingungen vor der Entnahme bzw. Messung der Probe schaffen.
Um auch bei stark unterschiedlichen Probenträgern bzw. Zellkulturträgern kein zu großes Luftvolumen im Innern der Messbox vorzuhalten, kann erfindungsgemäß in Weiterbildung vorgesehen sein, dass in die Messbox ein oder mehrere Einsatzkörper aus inertem Material eingesetzt werden können, um das Volumen des Innenraums der Messbox zu variieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die wesentliche Verbesserung der Messbox im Vergleich zu herkömmlichen Systemen in der universellen Einsetzbarkeit für die unterschiedlichsten Zellkulturträger, in der Nichtbeeinflussung der biologischen Probe und in dem fehlenden Verdünnungseffekt der messbaren Substanzen liegt. Durch das Anordnen der Proben in der Messbox werden diese in ihrem Wachstum, Stoffwechsel und Verhalten nicht beeinflusst, da der Zellkulturträger für die Messung nicht verändert wird, sondern in das Messsystem eingebettet werden kann.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorzüge der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und der Zusammenfassung, deren beider Wortlaut durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht wird, der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung sowie anhand der Zeichnung. Hierbei zeigt:

1 einen schematischen Längsschnitt durch eine von der Erfindung vorgeschlagene Messbox.

Der in 1 dargestellte Schnitt durch die von der Erfindung vorgeschlagenen Messbox zeigt eine trogartige Schale (1), die aus einem inerten Material hergestellt ist, beispielsweise aus PTFE. Die Schale (1) weist einen ebenen Boden (2) und vier Seitenwände (3) auf, von denen in dem Längsschnitt der 1 nur zwei gegenüberliegende Seitenwände (3) zu sehen sind. Die Seitenwände (3) verlaufen angenähert senkrecht zu dem Boden (2) und paarweise zueinander. Sie sind am Rand des Bodens (2) angesetzt. An ihrem dem Boden (2) abgewandten Randbereich weisen die Seitenwände (3) jeweils einen nach außen gerichteten Flansch (4) auf, der um die Schale (1) herumläuft und in einer Ebene parallel zum Boden (2) liegt. Auf den Flansch (4) ist ein Deckel (5) aufgelegt. Durch das Aufliegen des Deckels auf dem ebenfalls ebenen Flansch (4) der Schale (1) ergibt sich eine abdichtbare Auflage des Deckels (5) auf dem Flansch (4). Im Bereich des rechts und links in der 1 zu sehenden Rands ist der Deckel (5) mit dem Flansch (4) mithilfe einer nur schematisch angedeuteten Verschließeinrichtung (6) abgedichtet verbunden.
Innerhalb der Schale sind im dargestellten Beispiel mehrere Blöcke (7) aus inertem Material, vorzugsweise ebenfalls aus PTFE, eingesetzt, die das Volumen des Innenraums variieren. Auf den Blöcken (7) ist die biologische Probe innerhalb eines Zellkulturträgers (8) aufgesetzt.
Sowohl die rechte als auch die linke Seitenwand (3) weisen unterhalb des Flansches (4) eine luftdicht abdichtbare Durchführungseinrichtung (9) auf. Durch eine solche Durchführungseinrichtung (9) kann ein Werkzeug zur Probennahme durchgeführt werden, mit dessen Hilfe eine bestimmte Menge Gas aus dem Inneren der Messbox entnommen werden kann.
Da zwei einander gegenüberliegende Durchführungseinrichtungen (9) vorhanden sind, kann hiermit auch ein Durchspülen des Innenraums der Messbox durchgeführt werden.
Die Vorteile der Erfindung liegen in der empfindlicheren Messung von volatilen organischen Substanzen im Ultraspurenbereich, in der Anwendbarkeit mit einer Vielzahl an biologischen Probenträgerformen, in der möglichen Adaption des Messvolumens an die zu messende Probe, in dem geringeren Einfluss von Störfaktoren durch ein hermetisch geschlossenes System.

Claims

Messbox zur Analyse von volatilen organischen Substanzen über biologischen Proben (insb. Zell- oder Bakterien- oder Gewebekulturen), mit - einer trogartigen Seitenwände (3) aufweisenden Schale (1) aus inertem Material, die - zur Aufnahme mindestens eines üblichen Zellkulturträgers (8) ausgebildet ist, - einem als Platte ausgebildeten Deckel (5), - einer Verschließeinrichtung (6) zwischen dem Rand der Schale (1) und dem Deckel (5) zum hermetischen Verschließen der Messbox, sowie mit - mindestens einer luftdicht verschließbaren Durchführungseinrichtung (9) in einer Seitenwand (3) der Schale (1) zum Einführen eines Entnahmewerkzeugs.
Messbox nach Anspruch 1, bei der die Schale (1) aus PTFE besteht.
Messbox nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Schale (1) Quaderform mit vier Seitenwänden (2) aufweist.
Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Verschließeinrichtung (4) an zwei gegenüberliegenden Seitenwänden (3) der Schale (1) bzw. des Deckels (5) angreift.
Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Durchführungseinrichtung (9) als Gewindeadapter mit einer Gewindebohrung ausgebildet ist, vorzugsweise als Luer-Lock.
Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit zwei Durchführungseinrichtungen (9), die vorzugsweise in einander gegenüberliegenden Seitenwänden (3) der Schale (1) angeordnet sind.
Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit mindestens einem in der Größe und Form an die Messbox angepassten Einsatzkörper (7) aus inertem Material zur Variierung des Volumens des Innenraums der Messbox.
Messbox nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Verschließeinrichtung (4) aus Metall oder starrem Kunststoff besteht.