WO2018168779A1 - 慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー - Google Patents

慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー Download PDF

Info

Publication number
WO2018168779A1
WO2018168779A1 PCT/JP2018/009529 JP2018009529W WO2018168779A1 WO 2018168779 A1 WO2018168779 A1 WO 2018168779A1 JP 2018009529 W JP2018009529 W JP 2018009529W WO 2018168779 A1 WO2018168779 A1 WO 2018168779A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
apolipoprotein
chronic obstructive
obstructive pulmonary
pulmonary disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/009529
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
吉人 武田
淳 熊ノ郷
太郎 木庭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Publication of WO2018168779A1 publication Critical patent/WO2018168779A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for chronic obstructive pulmonary disease, use thereof and the like.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD biomarkers In the ECLIPSE study, fibrinogen, CC16, SP-D, CCL-18, and sRAGE are shown to be useful as COPD biomarkers.
  • COPD patients not only increased in inflammatory biomarkers such as CRP, fibrinogen, IL-6, IL-8, etc. in peripheral blood, but also a group of COPD patients (phenotype) showing chronic inflammation was acute It has been shown that there are many exacerbations and poor prognosis.
  • high fibrinogen levels not only reflect the pathology of COPD but also correlate with symptoms and exacerbations, and that fibrinogen increases also during acute exacerbations.
  • Non-Patent Document 1 a recent paper on biomarkers that can distinguish COPD and asthma (Non-Patent Document 1) tries to analyze dozens of patients, but the analysis is based on the old mass spectrometry (MS) technique based on two-dimensional electrophoresis.
  • MS mass spectrometry
  • Extracellular vesicles are membrane vesicles that are secreted from cells, and carry information between cells locally and throughout the body by transporting intracellular proteins and genetic information (mRNA, microRNA, etc.) to the outside of the cell. ing. In recent years, extracellular vesicles have attracted attention as cancer test samples, but their usefulness as test samples for respiratory diseases and further COPD chronic obstructive pulmonary disease is not known.
  • An object of the present invention is to provide a biomarker for chronic obstructive pulmonary disease and a method for using the same.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for testing chronic obstructive pulmonary disease comprising: (1) Protein group (A) in extracellular vesicles of body fluid collected from the subject: (A) Apolipoprotein (a), Elongation factor 1-alpha 2, Apolipoprotein D, Apolipoprotein M, Prostaglandin G / H synthase 1, Apolipoprotein CI, Apolipoprotein C-III, Apolipoprotein C-II, Complement factor H-related protein 5, Cytochrome b-245 heavy chain, Oncoprotein-induced transcript 3 protein, EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, Zinc finger protein basonuclin-2, Apolipoprotein E, HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain, CD99 antigen, Complement factor H-related protein 1, Apolipoprotein A-II, Kininogen-1, Serum paraoxonase / arylesterase 1, Fibulin-1, Integrin beta-2, Alpha-lactalbumin
  • Item 3 Item 2.
  • the cut-off value is 1 to 1.5 times the value of the amount or concentration of the corresponding protein in extracellular vesicles of body fluid collected from a subject not suffering from chronic obstructive pulmonary disease Inspection method described in 1.
  • Item 4. The examination method according to any one of Items 1 to 3, wherein the body fluid is at least one selected from the group consisting of whole blood, plasma, and serum.
  • the protein (A) group is (A1) Apolipoprotein (a), Elongation factor 1-alpha 2, Apolipoprotein D, Apolipoprotein M, Prostaglandin G / H synthase 1, Apolipoprotein CI, Apolipoprotein C-III, Apolipoprotein C-II, Complement factor Item 5.
  • the examination method according to any one of Items 1 to 4, which is a group consisting of H-related protein 5 and Cytochrome b-245 heavy chain.
  • the protein (A) group is (A2) Fibulin-1, Integrin beta-2, CD99 antigen, Peroxiredoxin-2, Clusterin, Prostaglandin G / H synthase 1, Vesicle-associated membrane protein 3, Ras-related protein Rab-5C, And EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 Item 5.
  • the inspection method according to any one of Items 1 to 4.
  • Item 7. The examination method according to any one of Items 1 to 6, wherein the subject is a human.
  • Item 11 Prevention of chronic obstructive pulmonary disease when the value of the indicator is lower than the amount or concentration of the corresponding protein in the extracellular vesicles of a body fluid collected from an animal not treated with the test substance Item 11.
  • the screening method according to Item 10 which comprises a step of selecting as an active ingredient of a therapeutic agent.
  • a biomarker for chronic obstructive pulmonary disease can be provided.
  • a test for chronic obstructive pulmonary disease and the like can be performed more simply, more efficiently, and at a lower cost.
  • the use of the biomarker may enable prevention or treatment of chronic obstructive pulmonary disease, screening of an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease, and the like.
  • the number of particles and the particle size of the extracellular vesicle fraction are shown (Test Example 1).
  • Normal shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a healthy subject
  • COPD shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a subject with chronic obstructive pulmonary disease.
  • An electron microscope observation image of the extracellular vesicle fraction is shown (Test Example 1).
  • Normal shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a healthy subject
  • COPD shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a subject with chronic obstructive pulmonary disease.
  • the result of the western blotting of an extracellular vesicle fraction is shown (Test Example 1).
  • Normal shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a healthy subject
  • COPD shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a subject with chronic obstructive pulmonary disease.
  • the antigen of the primary antibody used is shown on the left side of the band photograph.
  • the result of the Western blot of an extracellular vesicle fraction is shown (Test Example 3). Healthy shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a healthy subject, and COPD shows the result of the extracellular vesicle fraction obtained from a subject with chronic obstructive pulmonary disease.
  • the antigen of the primary antibody used is shown on the left side of the band photograph.
  • the result of immunostaining of Tissue array is shown (Test Example 4).
  • Control shows the result of Tissue array derived from healthy subjects
  • COPD shows the result of TissueTarray derived from subjects with chronic obstructive pulmonary disease
  • pulmonary fibrosis shows the results of TissueTarray derived from subjects with pulmonary fibrosis.
  • the antigen of the primary antibody used is shown on the left side of the stained photograph.
  • the present invention is a method for testing chronic obstructive pulmonary disease, comprising: (1) A test method (in this specification, including a step (step 1) of detecting at least one protein selected from the protein group (A) in an extracellular vesicle of a body fluid collected from a subject. It may be referred to as “the method for examining chronic obstructive pulmonary disease of the present invention” This will be described below.
  • the “chronic obstructive pulmonary disease” to be examined is not particularly limited, and may be either emphysema type or non-emphysema type.
  • the subject is a target organism of the inspection method of the present invention, and its species is not particularly limited.
  • the biological species of the subject include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, and preferably mice.
  • the state of the subject is not particularly limited.
  • the subject for example, it is unknown whether or not it suffers from chronic obstructive pulmonary disease, it has already been determined by another method that it suffers from acute pulmonary inflammatory disease, but chronic obstructive pulmonary disease and acute Specimens that have already been determined by another method as having pulmonary inflammatory disease, Specimens that have already been determined by another method as not having chronic obstructive pulmonary disease, Treatment of chronic obstructive pulmonary disease Samples in the inside.
  • Body fluid is not particularly limited.
  • the body fluid include whole blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, joint fluid, urine, tissue fluid (including bronchoalveolar lavage fluid), sweat, tears, sputum, nasal discharge, and preferably whole blood, serum. , Plasma and cerebrospinal fluid, and more preferably whole blood, serum and plasma.
  • Body fluids may be used alone or in combination of two or more.
  • Body fluid can be collected from the subject by methods known to those skilled in the art.
  • whole blood can be collected by blood collection using a syringe or the like.
  • Serum is a portion obtained by removing blood cells and a specific blood coagulation factor from whole blood, and can be obtained, for example, as a supernatant after coagulating whole blood.
  • Plasma is a part obtained by removing blood cells from whole blood, and can be obtained, for example, as a supernatant when subjected to centrifugation under conditions that do not coagulate whole blood.
  • Extracellular vesicles are not particularly limited as long as they are membrane vesicles secreted and released from cells.
  • Extracellular vesicles are usually defined as membrane vesicles that carry information between cells locally and throughout the body by transporting intracellular proteins and genetic information (mRNA, microRNA, etc.) to the outside of the cell.
  • the Examples of extracellular vesicles include exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, ectosomes, microparticles, and secretory microvesicles.
  • Extracellular vesicles can be purified, separated, concentrated, etc. from body fluids according to or according to known methods.
  • methods for purifying, separating and concentrating extracellular vesicles include, for example, ultracentrifugation (eg, pellet down method, sucrose cushion method, density gradient centrifugation method, etc.), a method using an immunoaffinity carrier, gel filtration, Examples thereof include a flow fractionation method and a FACS method.
  • purification, separation, concentration and the like of extracellular vesicles can be performed using a commercially available kit. These methods may be employed singly or in combination of two or more.
  • the detection target in step (1) is at least one protein selected from the protein group (A) (in the present specification, these may be collectively referred to as “target protein”).
  • Protein group (A) consists of (A) Apolipoprotein (a), Elongation factor 1-alpha 2, Apolipoprotein D, Apolipoprotein M, Prostaglandin G / H synthase 1, Apolipoprotein CI, Apolipoprotein C-III, Apolipoprotein C-II, Complement factor H-related protein 5, Cytochrome b-245 heavy chain, Oncoprotein-induced transcript 3 protein, EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, Zinc finger protein basonuclin-2, Apolipoprotein E, HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain, CD99 antigen, Complement factor H-related protein 1, Apolipoprotein A-II, Kininogen-1, Serum paraoxonase / arylesterase 1, Fibulin-1, Integrin beta-2, Alpha-lactalbumin, Clusterin, Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D, 60S ribosom
  • Protein group (A) is a biomarker specific to chronic obstructive pulmonary disease, and it can be used as an index to distinguish chronic obstructive pulmonary disease.
  • Apolipoprotein (a) Elongation factor 1-alpha 2, Apolipoprotein D, Apolipoprotein M, Prostaglandin G / H synthase 1, Apolipoprotein CI , Apolipoprotein C-III, Apolipoprotein C-II, Complement factor H-related protein 5, Cytochrome b-245 heavy chain, etc., more preferably Apolipoprotein (a), Elongation factor 1-alpha 2, Apolipoprotein D, Apolipoprotein M , Prostaglandin G / H synthase 1 and the like.
  • Fibulin-1 Fibulin-1, Integrin beta-2, CD99 antigen, Peroxiredoxin-2, Clusterin, Prostaglandin G / H synthase are preferable from the viewpoint of relationship with inflammation and membrane protein.
  • Vesicle-associated membrane protein 3 Ras-related protein Rab-5C, EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 and the like.
  • EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 is preferable from the viewpoint of being more promising as a common biomarker for mice and humans.
  • Proteins of the protein group (A) are proteins specified by UniProtKB accession numbers shown in Table 1 in the examples described later in the case of humans. In the case of other species, it is the ortholog of the protein specified by the UniProtKB accession number shown in Table 1.
  • the number of target proteins may be only one type or a combination of two or more types.
  • more detection targets for example, 2, 5, 10, 20, and 30 or more types
  • Detecting is usually performed by measuring the amount or concentration of the target protein.
  • the “density” is not limited to the absolute density, but may be a relative density, a weight per unit volume, or raw data measured to know the absolute density.
  • the method for detecting the target protein is not particularly limited as long as it is a method capable of specifically detecting a part or all of the target protein.
  • Specific examples of the detection method include a mass spectrometry method for detecting a peptide constituting the target protein, and an immunological measurement method using an antibody that specifically recognizes the target protein.
  • the amino acid sequence information of the target protein can be obtained by searching the EBI (http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html) database based on the UniProtKB accession number.
  • an immunohistochemical staining method As the immunological measurement method, an immunohistochemical staining method, ELISA method, sandwich ELISA method, EIA method, RIA method, Western blotting method and the like can be preferably exemplified.
  • a peptide sample is turned into gaseous ions using an ion source (ionization), and the peptide sample ionized by moving it in a vacuum and using electromagnetic force or by a time-of-flight difference in the analysis section is mass-charged.
  • ionization ionization
  • This is a measurement method using a mass spectrometer that can be separated and detected according to the ratio.
  • Ionization using an ion source includes the EI method, CI method, FD method, FAB method, MALDI method, and ESI method.
  • the method of separating ionized peptide samples in the analysis section can be selected as appropriate.
  • a separation method such as an ion cyclotron resonance type can be appropriately selected.
  • tandem mass spectrometry (MS / MS) or triple quadrupole mass spectrometry combining two or more mass spectrometry methods can be used.
  • the sample contains a phosphorylated peptide
  • the sample can be concentrated using iron ion-immobilized affinity chromatography (Fe-IMAC) before introducing the sample into the mass spectrometer.
  • the peptide which comprises target protein can be isolate
  • a detection part and a data processing method can also be selected suitably.
  • a peptide labeled with a stable isotope having a known amino acid sequence and having a known concentration is used as an internal standard. can do.
  • Such a stable isotope labeled peptide is a stable isotope labeled peptide in which at least one of the amino acids in the peptide constituting the target protein to be detected contains at least one of 15 N, 13 C, 18 O, and 2 H. If necessary, the type, position, number, etc. of amino acids can be appropriately selected.
  • Such stable isotope-labeled peptides can be obtained by F-moc method (Amblard., Et al. Methods) using amino acids labeled with stable isotopes.
  • Mol Biol. 298: 3-24 (2005) can be chemically synthesized by iTRAQ (registered trademark) reagent, ICAT (registered trademark) reagent, ICPL (registered trademark) reagent, NBS (registered trademark). (Trademark) It can also produce using labeling reagents, such as a reagent.
  • the amount and / or concentration of the target protein that is a detection index of chronic obstructive pulmonary disease can be provided, thereby detecting chronic obstructive pulmonary disease, etc. Can assist.
  • Test results of the test method of the present invention including the step (1) are as follows: therapeutic effect determination, elucidation of the pathology of chronic obstructive pulmonary disease, prognosis prediction of chronic obstructive pulmonary disease (respiratory function decline group, acute aversion), patient group , Selection of treatment method (individualized medicine, treatment responsiveness), intractable chronic obstructive pulmonary disease, evaluation of remodeling, differentiation of chronic obstructive pulmonary disease histology and phenotype, etc. .
  • the inspection method of the present invention further includes, as one aspect, (2) A step of determining that the subject is suffering from chronic obstructive pulmonary disease when the amount or concentration of the protein detected in the step (1) is not less than a cutoff value (step 2) It is preferable to include. According to the test method of the present invention including the step 2, it becomes possible to determine chronic obstructive pulmonary disease.
  • the cut-off value can be appropriately set by those skilled in the art from the viewpoint of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, and the like, for example, collected from a subject not suffering from chronic obstructive pulmonary disease. Based on the amount and / or concentration of the target protein in the extracellular vesicles of the collected body fluid, a predetermined value or a predetermined value can be obtained.
  • the cut-off value is, for example, the amount and / or concentration of the target protein in the extracellular vesicles of body fluid collected from a subject not suffering from chronic obstructive pulmonary disease (in the case of multiple subjects, the average value, For example, it can be 1 to 1.5 times the median value.
  • the cutoff value is determined, for example, the amount and / or concentration of the protein of interest in a past sample for the same sample.
  • the therapeutic effect can be determined by setting the value based on the above.
  • the test method of the present invention is used. Further, by combining the steps of applying diagnosis by a doctor of chronic obstructive pulmonary disease, it is possible to diagnose chronic obstructive pulmonary disease with higher accuracy. In addition, since the test method of the present invention can more accurately detect chronic obstructive pulmonary disease, the above-described steps are combined with the test method of the present invention more efficiently and more accurately. Can be diagnosed.
  • test method of the present invention including the treatment step (2) of chronic obstructive pulmonary disease is determined to cause the subject to suffer from chronic obstructive pulmonary disease, in addition to the test method of the present invention or the above When it is diagnosed that the patient is suffering from chronic obstructive pulmonary disease as described in "2. Diagnosis with higher accuracy of chronic obstructive pulmonary disease” And (3) subjecting the subject to be diagnosed or diagnosed as suffering from chronic obstructive pulmonary disease, by treating the subject with the disease, Can be treated.
  • the test method of the present invention can detect chronic obstructive pulmonary disease more accurately, the test method of the present invention or a combination of the test method of the present invention and a step of applying a diagnosis by a doctor. By combining step 3, a subject suffering from chronic obstructive pulmonary disease can be treated more efficiently and reliably.
  • the method for treating chronic obstructive pulmonary disease is not particularly limited, but typically includes medication.
  • the drug used for the drug treatment is not particularly limited, but for example, anticholinergic drugs such as Spiriva, Seeburi, Enclasse, Ecrila, Atrovent, Telcigan, etc .; ⁇ 2-stimulating drugs such as Serebent, Ombres, Auxis, Sultanol, Meptin; Ultimolo, Anolo And anti-cholinergic / ⁇ 2-stimulant combination drugs such as sport; steroid drugs such as cuvard, flutide, palmicoat, olvesco, and azmanex; steroid drugs / beta-stimulant combination drugs such as adair, simbicoat, and lerbea.
  • a pharmaceutical can be used 1 type, 2 types, or 3 or more types in combination.
  • test agent for chronic obstructive pulmonary disease in the present specification, a test agent for chronic obstructive pulmonary disease, comprising a detection agent for at least one protein selected from the protein group (A)) , Sometimes referred to as “inspection drug of the present invention”). This will be described below.
  • Protein group (A), chronic obstructive pulmonary disease and the like are the same as defined in “1. Method for examining chronic obstructive pulmonary disease” above.
  • the detection agent is not particularly limited as long as it can specifically detect the target protein.
  • the detection agent include an antibody against the target protein.
  • the detection agent may be labeled. Examples of the label include fluorescent substances, luminescent substances, dyes, enzymes, gold colloids, and radioisotopes. Further, the detection agent (particularly antibody) may be in a state of being adsorbed on a base material (for example, a plastic base material such as a microwell plate).
  • the antibody is not particularly limited as long as it recognizes the target protein selectively (specifically).
  • “selectively (specifically) recognize” means that the protein of interest can be specifically detected, for example, in Western blotting or ELISA, but is not limited thereto. Any substance can be used as long as it can be determined that the detected substance is derived from the target protein.
  • the antibody includes a part of the above antibody having antigen binding properties such as a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or a Fab fragment or a fragment generated by a Fab expression library.
  • the antibody of the present invention also includes an antibody having an antigen binding property to a polypeptide consisting of at least continuous amino acid sequence of the subject protein, usually 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids.
  • the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12 to 11.13 (2000)).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target protein is synthesized using a target protein expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method, or according to a conventional method.
  • a non-human animal such as a rabbit and obtain it from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • spleen cells obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse with a target protein expressed and purified in Escherichia coli according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target protein and It can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion with myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).
  • the target protein used as an immunizing antigen for antibody production is based on known gene sequence information, DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culture of a transformant, and recovery of the protein from the culture. It can obtain by operation of. These operations are based on methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). Can be done.
  • a recombinant DNA capable of expressing a gene encoding the target protein in a desired host cell is prepared, introduced into the host cell, transformed, and the transformant is cultured.
  • the protein as the immunizing antigen for producing the antibody of the present invention can be obtained by recovering the target protein from the obtained culture.
  • the partial peptide of the target protein can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) in accordance with known gene sequence information.
  • the antibody of the present invention may be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target protein.
  • the oligo (poly) peptide used for the production of such an antibody does not need to have a functional biological activity, but desirably has an immunogenic property similar to that of the target protein.
  • An oligo (poly) peptide preferably having this immunogenic property and consisting of at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the target protein can be exemplified.
  • Such an antibody against an oligo (poly) peptide can also be produced by enhancing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pluronic polyol, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Active substances, human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are included.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a composition.
  • the composition may contain other components as necessary. Examples of other components include a base, a carrier, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a thickener, a moisturizer, a colorant, and a fragrance. And chelating agents.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a kit.
  • the kit may contain a substance that can be used for detection of a target protein in extracellular vesicles of a body fluid of a subject.
  • reagents for example, secondary antibodies, buffers, etc.
  • instruments for example, instruments for purification, separation, and concentration of extracellular vesicles (for example, columns)).
  • the preventive or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease comprising an inhibitor of at least one protein selected from the protein group (A) (In the present specification, it may be referred to as “the agent of the present invention”). This will be described below.
  • the protein group (A) and the like are the same as defined in “1. Method for examining chronic obstructive pulmonary disease” above.
  • the inhibitor is preferably an expression inhibitor of the target protein.
  • the target protein expression inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the expression level of the target protein, its mRNA, etc.
  • gene-specific small interfering RNA (siRNA) of the target protein gene-specificity of the target protein MicroRNA (miRNA), gene-specific antisense nucleic acid of target protein, expression vectors thereof; gene-specific ribozyme of target protein; gene gene editing agent of target protein by CRISPR / Cas system.
  • the expression suppression refers to the expression level of the target protein, its mRNA, etc., for example, 1/2, 1/3, 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/50, 1/100 , 1/200, 1/300, 1/500, 1/1000, 1 / 10,000 or less, and the expression level of these is set to 0.
  • the gene siRNA of the target protein is not particularly limited as long as it is a double-stranded RNA molecule that specifically suppresses the expression of the gene encoding the target protein.
  • the siRNA is preferably 18 or more bases, 19 or more bases, 20 or more bases, or 21 or more bases in length, for example.
  • it is preferable that siRNA is 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, or 22 bases or less, for example. It is assumed that the upper limit value and the lower limit value of the siRNA length described here are arbitrarily combined.
  • the lower limit is 18 bases and the upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases; the lower limit is 19 bases, and the upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases A certain length; a lower limit of 20 bases and an upper limit of 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases; a lower limit of 21 bases and an upper limit of 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 Combinations of lengths that are bases are envisioned.
  • the siRNA may be shRNA (small hairpin RNA).
  • shRNA can be designed so that a part thereof forms a stem-loop structure. For example, if the sequence of a certain region is a sequence a and the complementary strand to the sequence a is a sequence b, these sequences are present in a single RNA strand in the order of sequence a, spacer, and sequence b. And can be designed to be 45-60 bases in total.
  • the sequence a is a sequence of a partial region of the base sequence encoding the target protein to be targeted, and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate.
  • the length of the sequence a is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • the gene-specific siRNA of the target protein may have an additional base at the 5 'or 3' end.
  • the length of the additional base is usually about 2 to 4 bases.
  • the additional base may be DNA or RNA, but the use of DNA may improve the stability of the nucleic acid. Examples of such additional base sequences include ug-3 ', uu-3', tg-3 ', tt-3', ggg-3 ', guuu-3', gttt-3 ', ttttt-3 Examples include, but are not limited to, ', uuuuuu-3'.
  • SiRNA may have a protruding portion sequence (overhang) at the 3 ′ end, and specifically includes those to which dTdT (dT represents deoxythymidine) is added. Further, it may be a blunt end (blunt end) without end addition.
  • the siRNA may have a different number of bases in the sense strand and the antisense strand. For example, the “asymmetrical interfering RNA” in which the antisense strand has an overhang at the 3 ′ end and the 5 ′ end ( aiRNA) ".
  • a typical aiRNA has an antisense strand consisting of 21 bases, a sense strand consisting of 15 bases, and has an overhang structure of 3 bases at each end of the antisense strand.
  • the position of the target sequence of the gene-specific siRNA of the protein of interest is not particularly limited, but in one embodiment, the target is from the 5′-UTR and the start codon to about 50 bases, and from a region other than the 3′-UTR. It is desirable to select the sequence.
  • the selected target sequence candidate group whether or not there is homology in the 16-17 base sequence in the non-target mRNA is determined by BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ It is preferable to check using a homology search software such as) to confirm the specificity of the selected target sequence.
  • a sense strand having a 3 'end overhang of TT or UU at 19-21 bases after AA (or NA), a sequence complementary to the 19-21 bases and TT or A double-stranded RNA consisting of an antisense strand having a 3 ′ end overhang of UU may be designed as an siRNA.
  • an arbitrary linker sequence for example, about 5-25 bases
  • the sense strand and the antisense strand are connected via the linker sequence. It can be designed by connecting.
  • siRNA and / or shRNA can be searched using search software provided free of charge on various websites. Examples of such sites include the following. SiRNA Target Finder provided by Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) Insert design tool for pSilencer® Expression Vector (http://www.ambion.com/ jp / techlib / misc / psilencer_converter.html) GeneSeer provided by RNAi Codex (http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi).
  • the siRNA is synthesized by synthesizing a sense strand and an antisense strand of a target sequence on mRNA with a DNA / RNA automatic synthesizer, denatured at about 90 to about 95 ° C. for about 1 minute in an appropriate annealing buffer, It can be prepared by annealing at about 30 to about 70 ° C. for about 1 to about 8 hours. It can also be prepared by synthesizing shRNA, which is a precursor of siRNA, and cleaving it with an RNA-cleaving protein dicer.
  • the gene-specific miRNA of the target protein is arbitrary as long as the translation of the gene encoding the target protein is inhibited.
  • an miRNA may pair with the 3 'untranslated region (UTR) of the target and inhibit its translation, rather than cleaving the target mRNA like an siRNA.
  • the miRNA may be any of pri-miRNA (primary miRNA), pre-miRNA (precursor miRNA), and mature miRNA.
  • the length of miRNA is not particularly limited, the length of pri-miRNA is usually several hundred to several thousand bases, the length of pre-miRNA is usually 50 to 80 bases, and the length of mature miRNA is usually 18 ⁇ 30 bases.
  • the gene-specific miRNA of the protein of interest is preferably a pre-miRNA or a mature miRNA, more preferably a mature miRNA.
  • a gene-specific miRNA of the target protein may be synthesized by a known technique or purchased from a company that provides synthetic RNA.
  • the gene-specific antisense nucleic acid of the target protein is a nucleic acid containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the mRNA encoding the target protein, or a part thereof, and specific to the mRNA. It is a nucleic acid having a function of suppressing target protein synthesis by forming and binding an ideal and stable duplex.
  • the antisense nucleic acid may be any of DNA, RNA, and DNA / RNA chimera.
  • the antisense nucleic acid is DNA
  • the RNA DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA is recognized by endogenous ribonuclease H (RNase H) and causes selective degradation of the target RNA.
  • the target sequence may be not only the sequence in mRNA but also the sequence of the intron region in the initial translation product of the gene of interest protein.
  • the intron sequence can be determined by comparing the genomic sequence with the cDNA base sequence of the target protein gene using a homology search program such as BLAST or FASTA.
  • the length of the target region of the gene-specific antisense nucleic acid of the target protein is not limited as long as the antisense nucleic acid is hybridized and consequently translation into the target protein is inhibited.
  • the gene-specific antisense nucleic acid of the target protein may be the entire sequence or a partial sequence of mRNA encoding the target protein.
  • an oligonucleotide consisting of about 10 to about 40 bases, particularly about 15 to about 30 bases is preferable, but is not limited thereto.
  • a 3 ′ end hairpin loop or the like can be selected as a preferred target region of the antisense nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the gene-specific antisense nucleic acid of the target protein not only hybridizes with the mRNA or initial transcription product of the target protein gene and inhibits translation into the protein, but also binds to these genes that are double-stranded DNA. It may be a substance capable of forming a triplex and inhibiting transcription to RNA (antigene).
  • the nucleotide molecules constituting the gene-specific siRNA of the target protein, the gene-specific miRNA of the target protein, and the gene-specific antisense nucleic acid of the target protein have stability (chemical and / or anti-enzyme) and specific activity ( Various chemical modifications may be included in order to improve (affinity with RNA).
  • a phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting an antisense nucleic acid is selected from, for example, phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithio. It can be substituted with a chemically modified phosphate residue such as a phosphorodithioate.
  • the 2′-position hydroxyl group of the sugar (ribose) of each nucleotide is represented by —OR (R ⁇ CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2 , CH 2 CONHCH 3 , or CH 2 CH 2 CN) may be substituted.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • pyrimidine, purine may be chemically modified, for example, introduction of a methyl group or a cationic functional group at the 5-position of the pyrimidine base, or substitution of the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl. May be applied.
  • a part of nucleotide molecules constituting siRNA or miRNA may be replaced with natural DNA.
  • Gene-specific siRNA of the target protein, gene-specific miRNA of the target protein, and gene-specific antisense nucleic acid of the target protein are targets of mRNA or early transcript based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of the target protein gene It can be prepared by determining the sequence and synthesizing a complementary sequence using a commercially available DNA / RNA automatic synthesizer.
  • any of the above-described antisense nucleic acids containing various modifications can be chemically synthesized by a known method.
  • the expression vector comprises a promoter sequence and a gene-specific siRNA of the protein of interest, a gene-specific miRNA of the protein of interest, or a coding sequence of a gene-specific antisense nucleic acid of the protein of interest (optionally further A polynucleotide containing a transcription termination signal sequence) and optionally other sequences.
  • the promoter is not particularly limited, and examples thereof include RNA-polymerase II (polII) promoters such as CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter; mouse and human U6-snRNA promoters, Examples include human H1-RNase P ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ RNA promoter, human valine-tRNA promoter, and other RNA polymerase III (polIII) promoters. Among these, polIII promoters can be used for accurate transcription of short RNAs. preferable.
  • Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be included in the expression vector can be employed. Examples of such sequences include the origin of replication and drug resistance genes. Examples of the drug resistance gene and the vector include those described above.
  • RNA-specific ribozyme of the target protein is a gene-specific ribozyme of the target protein.
  • “Ribozyme” in a narrow sense means RNA having an enzyme activity for cleaving nucleic acid, but in the present application, it includes DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleaving activity.
  • the most versatile ribozyme nucleic acid is self-splicing RNA found in infectious RNA such as viroid and virusoid, and hammerhead type and hairpin type are known.
  • the hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and several bases at both ends (about 10 bases in total) adjacent to the part having the hammerhead structure are made complementary to the desired cleavage site of mRNA.
  • ribozyme nucleic acid has an advantage that it does not attack genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • the target sequence is single-stranded by using a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase.
  • ribozymes when used in the form of expression vectors containing the DNA that encodes them, they should be hybrid ribozymes in which tRNA-modified sequences are further linked in order to promote the transfer of transcripts to the cytoplasm. [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • the application target of the agent of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats and deer. .
  • the form of the agent of the present invention is not particularly limited, and can take a form normally used in each application depending on the application of the agent of the present invention.
  • the form when the use is a medicine, health enhancer, nutritional supplement (eg supplement), etc., for example, tablets (inner disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly-like drops, etc.) ), Pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), and jelly preparations suitable for oral intake Forms (oral dosage forms), nasal drops, inhalants, rectal suppositories, inserts, enemas, jellies, injections, patches, lotions, creams, etc. Oral dosage form).
  • tablets inner disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly-like drops, etc.
  • Pills granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), and jelly preparations suitable for oral intake Forms (oral dosage forms), nasal drops,
  • a liquid, gel or solid food such as juice, soft drink, tea, soup, soy milk, salad oil, dressing, yogurt, jelly, pudding, sprinkle, infant formula , Cake mix, powdered or liquid dairy products, bread, cookies and the like.
  • an oral composition for example, liquid (solution, emulsion, suspension, etc.), semi-solid (gel, cream, paste, etc.), solid (tablet, particulate agent, capsule, Film, kneaded material, molten solid, waxy solid, elastic solid, etc.), more specifically, dentifrice (toothpaste, liquid toothpaste, liquid toothpaste, powder toothpaste etc.), mouthwash,
  • a coating agent for example, chewing gum, tablet candy, candy, gummi, film, troche, etc.
  • the agent of the present invention may further contain other components as necessary.
  • Other components are not particularly limited as long as they are components that can be blended in, for example, pharmaceuticals, food compositions, oral compositions, health enhancers, nutritional supplements (such as supplements), etc. , Carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, fragrances, chelating agents, and the like.
  • the content of the inhibitor of the target protein of the agent of the present invention depends on the type of inhibitor, application, use mode, application target, application target state, and the like, and is not limited. For example, 0.0001 to 100 % By weight, preferably 0.001 to 50% by weight.
  • the amount of application (eg, administration, ingestion, inoculation, etc.) of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an effective amount that exhibits a medicinal effect, and is generally 0.1 to 1000 per day as the weight of the active ingredient. mg / kg body weight.
  • the above dose is preferably administered once a day or divided into 2 to 3 times a day, and can be appropriately increased or decreased depending on age, disease state, and symptoms.
  • Chronic prophylaxis of obstructive pulmonary disease or therapeutic agent screening method the invention of the active ingredient, in one aspect thereof, in the extracellular vesicles fluid taken from animals treated with test substance, protein group (A)
  • a method for screening an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease using the amount or concentration of at least one protein selected from the above as an index (hereinafter referred to as “the active ingredient screening method of the present invention”) May also be indicated). This will be described below.
  • Body fluid, extracellular vesicles, protein group (A), chronic obstructive pulmonary disease, measurement of the amount or concentration of the target protein, etc. are the same as defined in “1. Method for examining chronic obstructive pulmonary disease” above. .
  • Species of animal species are not particularly limited. Examples of animal species include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, and preferably mice.
  • test substance can be widely used regardless of whether it is a naturally occurring compound or a man-made compound.
  • composition which mixed not only the refined compound but various compounds, and the extract of animals and plants can also be used.
  • the compounds include not only low molecular compounds but also high molecular compounds such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides.
  • the active ingredient screening method of the present invention is such that the value of the index is the amount or concentration of the corresponding protein in the extracellular vesicles of a body fluid collected from an animal not treated with the test substance (control value).
  • the test substance is selected as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease (or a candidate substance for an active ingredient of prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease) Including.
  • Corresponding protein means the same protein as the target protein used as an index.
  • Low means, for example, that the index value is 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 of the control value.
  • the present invention is selected from the protein group (A) in an extracellular vesicle of a body fluid collected from an animal treated with a test substance.
  • a method for evaluating the induction or malignancy of chronic obstructive pulmonary disease using the amount or concentration of at least one kind of protein as an index (in this specification, sometimes referred to as “the toxicity evaluation method of the present invention”). ) This will be described below.
  • Chronic obstructive pulmonary disease For body fluids, extracellular vesicles, protein group (A), chronic obstructive pulmonary disease, measurement of the amount or concentration of the target protein, animal species, test substances, etc., see “1. Chronic obstructive pulmonary disease” above. The definition is the same as in the “examination method” and “6. screening method for active ingredients of preventive or therapeutic agents for chronic obstructive lung disease”.
  • the value of the above-mentioned index is the amount or concentration of the corresponding protein in the extracellular vesicles of body fluid collected from an animal that has not been treated with the test substance (control value).
  • the test substance is determined to have induction or malignancy of chronic obstructive pulmonary disease.
  • Corresponding protein means the same protein as the target protein used as an index.
  • “High” means, for example, that the index value is 2 times, 5 times, 10 times, 20 times, 50 times, 100 times the control value.
  • Test Example 1 Preparation of extracellular vesicle fraction
  • the cyst fraction was prepared.
  • the extracellular vesicle fraction was prepared by stepwise ultracentrifugation. Specifically, it was performed as follows.
  • the serum obtained in Test Examples 1 and 2 and the serum of normal mice (11-week-old C57BL6 / J male mice) were diluted with PBS and centrifuged (2000 g, 4 ° C., 30 minutes). The supernatant was passed through a 0.22 ⁇ m filter and ultracentrifuged (100,000 g, 4 ° C., 90 minutes).
  • the pellet was washed with PBS and then ultracentrifuged under the same conditions. This washing-ultracentrifugation step was repeated twice in total.
  • the finally obtained pellet was suspended in PBS to obtain an extracellular vesicle fraction.
  • the number and particle diameter of the extracellular vesicles were measured for the obtained extracellular vesicle fraction.
  • the measurement was carried out using a nanosite (Nippon Quantum Design Co., Ltd., Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3 Build 0025). This is an analysis based on the difference in Brownian motion speed for each particle size, tracking (tracking) each individual scattered light reflected on the screen, and using each moving speed (diffusion coefficient) in the liquid.
  • the particle diameter (hydrodynamic diameter) can be calculated. The results are shown in FIG.
  • extracellular vesicles were observed by immunoelectron microscopy. Specifically, it was performed as follows. 5 to 8 ⁇ L of the fixed extracellular vesicle solution was placed on the grid and allowed to stand for 15 minutes to fix the extracellular vesicles to the form bar of the grid. After washing 3 times with PBS, blocking reaction (1% BSA / PBS, 10 minutes) followed by primary antibody reaction (Invitrogen AHS0902 Mouse (monoclonal) Anti-Human Leukemia and Platelet Associated Antigen CD9 Clone: MM2 / 57, (100-fold dilution, 2.5 hours, room temperature).
  • exosomes are present in the obtained fraction, and the number and particle diameters of the fractions are substantially different between healthy subjects and chronic obstructive pulmonary disease subjects. I found that there was no.
  • TMT label-LC-MS / MS proteomics analysis was performed according to a previously reported document (Journal of Proteome Research., 2017, 16 (2), pp 1077-1086.). The outline is as follows. The peptide sample obtained by trypsin digesting the protein in the extracellular vesicle fraction obtained in Test Example 1 was labeled with TMT 10-plex reagent. The labeled sample was fractionated with an SCX column and subjected to LC-MS / MS analysis using a mass spectrometer (LTQ-Orbitrap XL, manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the obtained raw data is analyzed using an analysis program (Proteome Discoverer ver.1.3 (Thermo Fisher Scientific) equipped with Mascot v2.3.1 (Matrix Science) for UniProt / SwissProt) to quantify various proteins. I got the data.
  • COPD group Protein in the extracellular vesicle fraction of COPD patients (COPD group) was significantly higher than the amount in the extracellular vesicle fraction of healthy subjects (control group). It was determined that it had a certain degree of effectiveness as a marker and was selected. Table 1 shows the amount ratio of the selected protein and the control group.
  • Test Example 3 Detection of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Biomarker in Extracellular Vesicle Fraction by Western Blot Western blot using an antibody against the chronic obstructive pulmonary disease biomarker (Test Example 2) Blotted.
  • the primary antibodies used were anti-Fibulin-1 antibody (Abcam, ab211536), anti-EFEMP-1 antibody (GeneTex, GTX111657), anti-CD99 antibody (Abcam, ab108297), anti-CD18 antibody (Abcam, ab185723), anti-OIT 3 antibody (MyBioSource, MBS2028378), anti-VAMP3 (Cellubrevin) antibody (Abcam, ab181749), and anti-CD81 (TAPA-1) antibody (Abcam, ab155760).
  • antibodies against exosome markers anti-Flotillin-1 antibody (BD Bioscience, 610821) and anti-CD63 antibody (Proteintech, 12632-1-AP) were also used as controls. The results are shown in FIG.
  • the chronic obstructive pulmonary disease biomarker can be detected even by Western blotting, and the expression level difference can be confirmed between the healthy subject and the chronic obstructive pulmonary disease subject. .
  • Test Example 4 Detection of chronic obstructive pulmonary disease biomarkers in lung tissue by immunostaining Tissue array (BMX, Lung disease and normal tissue array, 16 cases / 48 cores; Lung disease spectrum tissue array, including TNM and pathology grade, 24 cases / 48 cores ) was immunostained with an antibody against a chronic obstructive pulmonary disease biomarker (Test Example 2).
  • the primary antibodies used were anti-Fibulin-1 antibody (Abcam, ab211536), anti-EFEMP-1 antibody (GeneTex, GTX111657), anti-CD99 antibody (Abcam, ab108297), anti-CD18 antibody (Abcam, ab185723), and anti-CD81 ( TAPA-1) antibody (Abcam, ab155760). The results are shown in FIG.
  • the examined chronic obstructive pulmonary disease biomarker is also expressed in the lung tissue and specifically highly expressed in the lung tissue of the chronic obstructive pulmonary disease subject. I understood. No increase in expression was observed in lung tissues of healthy subjects and pulmonary fibrosis subjects.
  • Test Example 5 Evaluation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Biomarker AUC, cutoff value, sensitivity, and specificity were calculated for the chronic obstructive pulmonary disease biomarker (Test Example 2). Specifically, it is as follows. JMP v. 8.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA) was used. Sensitivity is plotted on the vertical axis and (1-specificity) is plotted on the horizontal axis. As for the ROC curve of multi-marker, logistic regression analysis was performed on Fibulin-1 and SSC5D, the prediction probability was calculated, and the ROC curve was similarly drawn from the prediction probability. The results are shown in Table 2.
  • Test Example 6 Analysis of relationship between chronic obstructive pulmonary disease biomarker and respiratory function
  • Vital capacity When I inhaled all the air and exhaled it, I examined how much air was exhaled.
  • % Vital capacity (VC) The ratio of the measured vital capacity to the predicted vital capacity (reference value) calculated from age and sex was examined.
  • Forced vital capacity (FVC) The amount of air exhaled and breathed out was examined.
  • 1 second amount The amount of air exhaled during the first second of the forced vital capacity was examined.
  • 1 second rate The ratio of the 1 second amount to the forced vital capacity was examined.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

慢性閉塞性肺疾患のバイオマーカー及びその利用方法を提供すること。 被検体から採取された体液の細胞外小胞におけるタンパク質群（A）。

Description

慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー
　本発明は、慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー、その利用等に関する。
　慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、喫煙や大気汚染が原因の気流閉塞を主体とする肺の炎症性疾患である。COPDは、2020年には世界死因の第3位になると推定されており、高齢化に伴い患者数の増加が予想されている。COPDは、多様な表現型を含む全身性疾患と考えられているものの、その診断は呼吸機能の評価のみに依存しており、このため、診断、鑑別、治療等に利用可能なバイオマーカーの開発が急務である。
　また、COPD患者は、世界では2億人、日本では530万人の患者が推定されているものの、治療を受けている患者はわずかほんの5%に過ぎない（福地ら　Nippon NICE study）。このような事態を受けて国が『次期国民健康づくり運動プラン』（続・健康日本21）を掲げて、癌、循環器疾患、糖尿病と並ぶ主要取組疾患にCOPDを挙げた。しかし有効なスクリーニングバイオマーカーが存在しないため、未診断、未治療患者が多いだけでなく、根本的かつ有効な治療薬が存在しないのが現状である。
　ECLIPSE studyにおける検討では、COPDバイオマーカーとして、fibrinogen、CC16、SP-D、CCL-18、及びsRAGEが有用であると示されている。この検討においては、COPD患者において末梢血液中のCRP、fibrinogen、IL-6、IL-8等の炎症性バイオマーカーが増加するだけでなく、慢性炎症を示すCOPD患者群（表現型）は、急性増悪が多く予後不良であることが示されている。また、fibrinogen高値はCOPDの病態を反映するだけでなく、症状や増悪と相関することが示されており、さらに急性増悪時にもfibrinogenが増加することが示されている。これらのことから、COPDにおいて急性炎症を捉えることは、予後に影響を与える急性増悪の予測に、慢性炎症を捉えることは予後不良群の予測に役立つ可能性があることが示唆された。しかし、COPDを含む多くの生活習慣病の発症基盤には慢性炎症が関与するものの、慢性炎症を捉える手法は確立されていない。
　血清は、非侵襲的に繰り返し採取可能であるので理想的な検査試料と考えられるものの、そこに含まれる99%以上のタンパク質はバイオマーカーの観点から夾雑物とされる多量タンパク（アルブミン等）であるため、プロテオミクスの観点からは、検査資料としての有用性は低い。例えば、COPDと喘息を鑑別可能なバイオマーカーに関する最近の論文（非特許文献１）では、患者数十人の解析を試みるも、解析が2次元電気泳動法による古い質量分析(MS)技術によるものであっただけでなく、大量夾雑物を含む血清を用いたものであったため、見出されたバイオマーカーはプロトロンビンを含む血清夾雑物のみで、COPD特異的バイオマーカーとは程遠いものであった。
　細胞外小胞は、細胞から分泌される膜小胞であり、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている。近年、がんの検査試料として細胞外小胞が注目を集めているものの、呼吸器疾患、さらにはCOPD慢性閉塞性肺疾患の検査試料としての有用性については知られていない。
Am J Respir Crit Care Med. 2011 Jun 15;183(12):1633-43.
　本発明は、慢性閉塞性肺疾患のバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、被検体から採取された体液の細胞外小胞における特定のタンパク質群が、慢性閉塞性肺疾患のバイオマーカーとして有用であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　
慢性閉塞性肺疾患を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）：
（A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。
　項２．　
さらに、（2）前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程を含む、項１に記載の検査方法。
　項３．　
前記カットオフ値が、慢性閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度の値の、1～1.5倍の値である、項２に記載の検査方法。
　項４．　
前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～３のいずれかに記載の検査方法。
　項５．　
前記タンパク質（A）群が（A1）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、及びCytochrome b-245 heavy chainからなる群である、項１～４のいずれかに記載の検査方法。
　項６．　
前記タンパク質（A）群が（A2）Fibulin-1、Integrin beta-2、CD99 antigen、Peroxiredoxin-2、Clusterin、Prostaglandin G/H synthase 1、Vesicle-associated membrane protein 3、Ras-related protein Rab-5C、及びEGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1からなる群である、
項１～４のいずれかに記載の検査方法。
　項７．　
前記被検体がヒトである、項１～６のいずれかに記載の検査方法。
　項８．　
タンパク質群（A）：
（A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、慢性閉塞性肺疾患の検査薬。
　項９．　
タンパク質群（A）：
（A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤を含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤。
　項１０．　
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）：
（A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
　項１１．　
前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程を含む、項１０に記載のスクリーニング方法。
　項１２．　
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）：
（A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、慢性閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。
　本発明によれば、慢性閉塞性肺疾患のバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、慢性閉塞性肺疾患の検査等を、より簡便、より効率的、且つより低コストで行うことができる。さらに、該バイオマーカーを利用することにより、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング等も可能になり得る。
細胞外小胞画分の粒子数及び粒子径を示す（試験例1）。Normalは健常被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示し、COPDは慢性閉塞性肺疾患被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示す。 細胞外小胞画分の電子顕微鏡観察像を示す（試験例1）。Normalは健常被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示し、COPDは慢性閉塞性肺疾患被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示す。 細胞外小胞画分のウェスタンブロットの結果を示す（試験例1）。Normalは健常被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示し、COPDは慢性閉塞性肺疾患被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示す。バンドの写真の左側に、使用した一次抗体の抗原を示す。 細胞外小胞画分のウェスタンブロットの結果を示す（試験例3）。健常は健常被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示し、COPDは慢性閉塞性肺疾患被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示す。バンドの写真の左側に、使用した一次抗体の抗原を示す。 Tissue arrayの免疫染色の結果を示す（試験例4）。Controlは健常被検体由来のTissue arrayの結果を示し、COPDは慢性閉塞性肺疾患被検体由来のTissue arrayの結果を示し、肺線維症は肺線維症被検体由来のTissue arrayの結果を示す。染色写真の左側に、使用した一次抗体の抗原を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．慢性閉塞性肺疾患の検査方法
　本発明は、その一態様において、慢性閉塞性肺疾患を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程（工程1）を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の慢性閉塞性肺疾患検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　1-1．工程（1）
　検査対象である「慢性閉塞性肺疾患」は、特に制限されず、気腫型、非気腫型のいずれでもよい。
　被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはマウスが挙げられる。
　被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば慢性閉塞性肺疾患に罹患しているかどうか不明な検体、急性肺炎症性疾患に罹患していると既に別の方法により判定されているが、慢性閉塞性肺疾患及び急性肺炎症性疾患に罹患していると既に別の方法により判定されている検体、慢性閉塞性肺疾患に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、慢性閉塞性肺疾患の治療中の検体等が挙げられる。
　体液は、特に制限されない。体液としては、例えば全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、尿、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁などが挙げられ、好ましくは全血、血清、血漿、髄液が挙げられ、より好ましくは全血、血清、血漿が挙げられる。体液は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　体液は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。血清は、全血から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、全血から血球を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。
　細胞外小胞は、細胞から分泌、放出等される膜小胞である限り特に制限されない。細胞外小胞は、通常は、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている膜小胞として定義される。細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。
　細胞外小胞は、体液から、公知の方法に従って又は準じて、精製、分離、濃縮等することができる。細胞外小胞を精製、分離、濃縮等する方法としては、例えば超遠心法（例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等）、イムノアフィニティー担体を用いる方法、ゲルろ過法、フィールド・フロー分画法、FACS法等が挙げられる。また、細胞外小胞の精製、分離、濃縮等は、市販のキットを用いて行うことも可能である。これらの方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　工程（1）の検出対象は、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（本明細書において、これらをまとめて「対象タンパク質」と示すこともある。）である。
　タンパク質群（A）は、（A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群である。
　タンパク質群（A）は、慢性閉塞性肺疾患特異的なバイオマーカーであり、これを指標とすることにより慢性閉塞性肺疾患を鑑別可能である。
　タンパク質群（A）の中でも、正常検体に対する量比がより高いという観点からは、好ましくはApolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain等が挙げられ、より好ましくはApolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1等が挙げられる。
　タンパク質群（A）の中でも、炎症との関連性や膜タンパク質であること等の観点からは、好ましくはFibulin-1、Integrin beta-2、CD99 antigen、Peroxiredoxin-2、Clusterin、Prostaglandin G/H synthase 1、Vesicle-associated membrane protein 3、Ras-related protein Rab-5C、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1等が挙げられる。
　タンパク質群（A）の中でも、マウスとヒトとの共通バイオマーカーとしてより有望であるという観点から、好ましくはEGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1が挙げられる。
　タンパク質群（A）のタンパク質は、ヒトの場合であれば、後述の実施例における表1に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質である。他の生物種の場合であれば、表1に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質のオーソログである。
　工程（1）における対象タンパク質の数は、1種のみでもよいが、2種以上の組み合わせであってもよい。より多く（例えば2種、5種、10種、20種、30種以上）の検出対象を組み合わせることにより、慢性閉塞性肺疾患の検査等を、より正確に行うことが可能になる。
　検出は、通常は、対象タンパク質の量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。
　対象タンパク質を検出する方法としては、対象タンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、対象タンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法、対象タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法等を挙げることができる。なお、対象タンパク質のアミノ酸配列情報は、UniProtKBアクセッション番号を基に、EBI（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。
　免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ELISA法、サンドイッチELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。
　質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、EI法、CI法、FD法、FAB法、MALDI法、ESI法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、2以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（MS／MS）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、サンプルがリン酸化したペプチドを含む試料の場合、質量分析計へのサンプル導入前に、サンプルを鉄イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（Fe-IMAC）を用いて濃縮することができる。また、液体クロマトグラフ（LC）やHPLCにより、対象タンパク質を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて対象タンパク質を構成するペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する対象タンパク質を構成するペプチドにおけるアミノ酸の1個以上が、15N，13C，18O，及び2Hのいずれか1以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてF-moc法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、iTRAQ（登録商標）試薬、ICAT（登録商標）試薬、ICPL（登録商標）試薬、NBS（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、慢性閉塞性肺疾患の検出指標である対象タンパク質の量及び／又は濃度を提供することができ、これにより慢性閉塞性肺疾患の検出などを補助することができる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、治療効果判定、慢性閉塞性肺疾患の病態解明、慢性閉塞性肺疾患の予後予測（呼吸機能低下群、急性憎悪）、患者層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）、慢性閉塞性肺疾患における難治化や、リモデリングの評価、慢性閉塞性肺疾患の組織型や表現型等の鑑別等に利用し得る。
　1-2．工程（2）
　本発明の検査方法は、一態様として、さらに、
（2）前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程（工程2）を含むことが好ましい。該工程2を含む本発明の検査方法によれば、慢性閉塞性肺疾患を判定することが可能となる。
　カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、慢性閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、慢性閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対象タンパク質の量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば1～1.5倍の値とすることができる。
　工程（2）の好ましい一態様においては、被検体が慢性閉塞性肺疾患の治療中の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、治療効果を判定することができる。
　2．慢性閉塞性肺疾患のより高い精度での診断
　工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに慢性閉塞性肺疾患の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で慢性閉塞性肺疾患を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に慢性閉塞性肺疾患を検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「慢性閉塞性肺疾患に罹患している」と診断できる。
　3．慢性閉塞性肺疾患の治療
　工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．慢性閉塞性肺疾患のより高い精度での診断」に記載の様に慢性閉塞性肺疾患に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に慢性閉塞性肺疾患を検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、慢性閉塞性肺疾患に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。
　慢性閉塞性肺疾患の治療方法は、特に制限されないが、代表的には投薬治療が挙げられる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えばスピリーバ、シーブリ、エンクラッセ、エクリラ、アトロベント、テルシガン等の抗コリン薬；　セレベント、オンブレス、オーキシス、サルタノール、メプチン等のβ2刺激薬；　ウルティブロ、アノーロ、スピオルト等の抗コリン薬・β2刺激薬配合剤；　キュバール、フルタイド、パルミコート、オルベスコ、アズマネックス等のステロイド薬；　アドエア、シムビコート、レルベア等のステロイド薬・β2刺激薬配合剤等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。
　4．慢性閉塞性肺疾患の検査薬
　本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、慢性閉塞性肺疾患の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　タンパク質群（A）、慢性閉塞性肺疾患等については、上記「1．慢性閉塞性肺疾患の検査方法」における定義と同様である。
　検出剤は、対象タンパク質を特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象タンパク質に対する抗体が挙げられる。検出剤は、標識されたものであってもよい。標識としては、例えば蛍光物質、発光物質、色素、酵素、金コロイド、放射性同位体などが挙げられる。また、検出剤（特に抗体）は、基材（例えばマイクロウェルプレート等のプラスチック基材）に吸着した状態であってもよい。
　抗体は、対象タンパク質を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばウェスタンブロット法やELISA法において、対象タンパク質が特異的に検出できることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物が対象タンパク質に由来するものであると判断できるものであればよい。
　抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。対象タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
　これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12～11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質、あるいは対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11）。
　抗体の作製に免疫抗原として使用される対象タンパク質は、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
　具体的には、対象タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また対象タンパク質の部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
　また本発明の抗体は、対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、対象タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ対象タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
　かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
　本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の体液の細胞外小胞における対象タンパク質の検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば二次抗体、緩衝液等）、器具（例えば細胞外小胞の精製、分離、濃縮用器具（例えばカラム等））等が挙げられる。
　5．慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤
　本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤を含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　タンパク質群（A）等については、上記「1．慢性閉塞性肺疾患の検査方法」における定義と同様である。
　抑制剤としては、好ましくは対象タンパク質の発現抑制剤が挙げられる。
　対象タンパク質の発現抑制剤としては、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば対象タンパク質の遺伝子特異的small interfering RNA（siRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的microRNA（miRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター；　対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイム；　CRISPR/Casシステムによる対象タンパク質の遺伝子遺伝子編集剤などが挙げられる。
　なお、発現抑制とは、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
　対象タンパク質の遺伝子siRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
　siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45～60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となる対象タンパク質をコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19～25塩基、好ましくは19～21塩基である。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2～4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19－21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19－21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
　siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
　siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百～数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50～80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18～30塩基である。一実施形態において、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このような対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
　対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸とは、対象タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、対象タンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、対象タンパク質の遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、対象タンパク質の遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として対象タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、対象タンパク質の遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
　対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質の遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
　上記した対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate; PS)、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）などの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、又はCH2CH2CNなど）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などを施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸などは、対象タンパク質の遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、又は対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の発現ベクターについては、対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、又は対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現ベクターは、プロモーター配列、及び対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、又は対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター；　マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられ、これらの中でも、短いRNAの転写を正確に行うことができるという観点から、polIII系プロモーターが好ましい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。
　対象タンパク質の遺伝子発現抑制剤の別の例としては、対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。対象タンパク質の遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
　本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
　本発明の剤の形態は、特に限定されず、本発明の剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
　形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
　形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
　形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
　本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
　本発明の剤の対象タンパク質の抑制剤の含有量は、抑制剤の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1～1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
　6．慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、慢性閉塞性肺疾患、対象タンパク質の量又は濃度の測定等については、上記「1．慢性閉塞性肺疾患の検査方法」における定義と同様である。
　動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはマウスが挙げられる。
　被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
　本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分（或いは、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。
　対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。
　「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
　7．慢性閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、慢性閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、慢性閉塞性肺疾患、対象タンパク質の量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．慢性閉塞性肺疾患の検査方法」及び「6．慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。
　本発明の毒性評価方法は、より具体的には、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を慢性閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。
　対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。
　「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．細胞外小胞画分の調製
　慢性閉塞性肺疾患（COPD）であると診断されたヒト被検体（10名）それぞれの血清、及び健常ヒト被検体（6名）それぞれの血清から、細胞外小胞画分の調製した。細胞外小胞画分の調製は段階的超遠心法により行った。具体的には次のようにして行った。試験例1及び2で得られた血清、並びに正常マウス（11週齢のC57BL6/J雄マウス）の血清をPBSで希釈して、遠心（2000 g、4℃、30分間）した。上清を0.22μmのフィルターに通して、超遠心（100000 g、4℃、90分間）した。ペレットをPBSで洗浄した後、さらに同条件で超遠心した。この洗浄－超遠心工程を計2回繰り返して行った。最終的に得られたペレットをPBSで懸濁して、細胞外小胞画分を得た。
　続いて、得られた細胞外小胞画分について、細胞外小胞の粒子数及び粒子径を測定した。具体的には、ナノサイト（日本カンタム・デザイン株式会社、Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3 Build 0025）を使用して測定した。これは、粒子径ごとのブラウン運動速度の違いをもとに解析するものであり、画面に映る散乱光１つ１つの動きを追尾（トラッキング）し、各々の移動速度（拡散係数）から液中における粒子径（流体力学径）を算出することができる。結果を図１に示す。
　さらに、細胞外小胞を免疫電子顕微鏡法によって観察した。具体的には、次のようにして行った。固定済み細胞外小胞溶液を5～8μLずつグリッドへ載せ15分静置して、グリッドのフォルムバールへ細胞外小胞を定着させた。PBSで3回洗浄した後、ブロッキング反応（1%BSA/PBS、10分）を行い、続いて一次抗体反応（Invitrogen AHS0902  Mouse (monoclonal) Anti-Human Leukemia and Platelet Associated Antigen CD9 Clone: MM2/57、100倍希釈、2時間半、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、二次抗体反応（CRL EMGMHL10 Anti-IgG (H＋L), Mouse, Goat-Poly, Gold 10 nm, EM、200倍希釈、1時間、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、1%GA/PBSで15分間処理し、さらにPBSで3回洗浄した。水洗し、0.5% UA（酢酸ウラニル）で処理して、乾燥させて、電子顕微鏡で観察した。得られた結果を図２に示す。
　またさらに、細胞外小胞画分について、エクソソームマーカーに対する抗体（抗Flotillin-1抗体（BD Bioscience、610821）、抗HSP70抗体（Santa Cruz, clone=W27）、及び抗CD9抗体（Invitrogen, clone=MM2/57）を用いて、ウェスタンブロットした。結果を図３に示す。
　図１～３に示されるように、得られた画分にはエクソソームが存在しており、その粒子数及び粒子径は、健常被検体と慢性閉塞性肺疾患被検体とでほぼ差が見られないことが分かった。
　試験例2．プロテオミクス解析（TMTラベル、LC-MS/MS）
　既報の文献（Journal of Proteome Research., 2017, 16 (2), pp 1077-1086.）に従って、TMTラベル-LC-MS/MSプロテオミクス解析を行った。概要は次のとおりである。試験例1で得られた細胞外小胞画分中のタンパク質をトリプシン消化して得られたペプチドサンプルを、TMT 10-plex試薬でラベルした。ラベル化サンプルをSCXカラムで分画し、質量分析計（LTQ-Orbitrap XL、Thermo Fisher Scientific社製）を用いてLC-MS/MS解析した。得られた生データを、解析プログラム（UniProt/SwissProtに対するMascot v2.3.1（Matrix Science社製）を備える、Proteome Discoverer ver.1.3（Thermo Fisher Scientific社製））を用いて解析し、各種タンパク質の定量データを得た。
　COPD患者の細胞外小胞画分における量（COPD群）が、健常被検者の細胞外小胞画分における量（コントロール群）よりも有意に高かったタンパク質を、慢性閉塞性肺疾患のバイオマーカーとして一定程度の有効性があると判定し、選択した。選択されたタンパク質、及びコントロール群に対する量比を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　試験例3．ウェスタンブロットによる細胞外小胞画分における慢性閉塞性肺疾患バイオマーカーの検出
　細胞外小胞画分（試験例1）について、慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー（試験例2）に対する抗体を用いてウェスタンブロットした。使用した一次抗体は、抗Fibulin-1抗体（アブカム、ab211536）、抗EFEMP-1抗体（GeneTex、GTX111657）、抗CD99抗体（アブカム、ab108297）、抗CD18抗体（アブカム、ab185723）、抗OIT 3抗体（MyBioSource、MBS2028378）、抗VAMP3(Cellubrevin)抗体（アブカム、ab181749）、及び抗CD81(TAPA-1)抗体（アブカム、ab155760）である。さらに、コントロールとして、エクソソームマーカーに対する抗体（抗Flotillin-1抗体（BD Bioscience、610821）及び抗CD63抗体（Proteintech、12632-1-AP））も使用した。結果を図４に示す。
　図４に示されるように、慢性閉塞性肺疾患バイオマーカーは、ウェスタンブロットでも検出可能であり且つ健常被検体と慢性閉塞性肺疾患被検体との間で発現量の差を確認できることが分かった。
　試験例4．免疫染色による肺組織における慢性閉塞性肺疾患バイオマーカーの検出
　Tissue array（BMX、Lung disease and normal tissue array, 16 cases/48 cores；Lung disease spectrum tissue array, including TNM and pathology grade, 24 cases/48 cores）を、慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー（試験例2）に対する抗体を用いて免疫染色した。使用した一次抗体は、抗Fibulin-1抗体（アブカム、ab211536）、抗EFEMP-1抗体（GeneTex、GTX111657）、抗CD99抗体（アブカム、ab108297）、抗CD18抗体（アブカム、ab185723）、及び抗CD81(TAPA-1)抗体（アブカム、ab155760）である。結果を図５に示す。
　図５に示されるように、調べた慢性閉塞性肺疾患バイオマーカーは、肺組織内でも発現しており、且つ慢性閉塞性肺疾患被検体の肺組織内で特異的に高発現していることが分かった。健常被検体及び肺線維症被検体の肺組織内では発現増加がみられなかった。
　試験例5．慢性閉塞性肺疾患バイオマーカーの評価
　慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー（試験例2）について、AUC、カットオフ値、感度、及び特異度を算出した。具体的には、次のとおりである。JMP v. 8.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA) を用いた。感度を縦軸、(1-特異度)を横軸にプロットした。マルチマーカーのROCカーブは、Fibulin-1とSSC5Dに関してロジスティック回帰分析を行い、予測確率を算出し、その予測確率から同様にROC曲線を描画した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試験例6．慢性閉塞性肺疾患バイオマーカーと呼吸機能との関連性の解析
　まず、被検体の呼吸機能をスパイロメーターで測定した。測定内容は以下のとおりである。
肺活量…空気を胸いっぱいに吸い込んで、それを全て吐き出したとき、どれだけの量の空気を吐き出したかを調べた。 
％肺活量（VC）…年齢や性別から算出された予測肺活量（基準値）に対しての、実測肺活量の比率を調べた。 
努力性肺活量(FVC)…胸いっぱいに息を吸い込み、一気に吐き出した空気の量を調べた。 
1秒量…努力性肺活量のうちの最初の1秒間に吐き出された空気の量を調べた。 
1秒率…努力性肺活量に対する1秒量の比率を調べた。
　呼吸機能の測定結果と試験例2の生データに基づいて、慢性閉塞性肺疾患バイオマーカーの血清細胞外小胞中の量と呼吸機能とが負に相関すること（つまり、バイオマーカー量が高い程、呼吸機能が低いこと、或いはバイオマーカー量が低い程、呼吸機能が高いこと）の有意差を、t検定によって算出した。結果を表３～６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006

Claims (12)

  1. 慢性閉塞性肺疾患を検査する方法であって、
    （1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）：
    （A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。
  2. さらに、（2）前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
  3. 前記カットオフ値が、慢性閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度の値の、1～1.5倍の値である、請求項２に記載の検査方法。
  4. 前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～３のいずれかに記載の検査方法。
  5. 前記タンパク質（A）群が（A1）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、及びCytochrome b-245 heavy chainからなる群である、請求項１～４のいずれかに記載の検査方法。
  6. 前記タンパク質（A）群が（A2）Fibulin-1、Integrin beta-2、CD99 antigen、Peroxiredoxin-2、Clusterin、Prostaglandin G/H synthase 1、Vesicle-associated membrane protein 3、Ras-related protein Rab-5C、及びEGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1からなる群である、
    請求項１～４のいずれかに記載の検査方法。
  7. 前記被検体がヒトである、請求項１～６のいずれかに記載の検査方法。
  8. タンパク質群（A）：
    （A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、慢性閉塞性肺疾患の検査薬。
  9. タンパク質群（A）：
    （A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤を含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤。
  10. 被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）：
    （A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
  11. 前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
  12. 被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）：
    （A）Apolipoprotein(a)、Elongation factor 1-alpha 2、Apolipoprotein D、Apolipoprotein M、Prostaglandin G/H synthase 1、Apolipoprotein C-I、Apolipoprotein C-III、Apolipoprotein C-II、Complement factor H-related protein 5、Cytochrome b-245 heavy chain、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Zinc finger protein basonuclin-2、Apolipoprotein E、HLA class I histocompatibility antigen, B-38 alpha chain、CD99 antigen、Complement factor H-related protein 1、Apolipoprotein A-II、Kininogen-1、Serum paraoxonase/arylesterase 1、Fibulin-1、Integrin beta-2、Alpha-lactalbumin、Clusterin、Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D、60S ribosomal protein L8、Ras-related protein Rab-5C、Peroxiredoxin-2、Vesicle-associated membrane protein 3、CD81 antigen、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1、及びCalmodulinからなるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、慢性閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。
PCT/JP2018/009529 2017-03-14 2018-03-12 慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー Ceased WO2018168779A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-048171 2017-03-14
JP2017048171A JP2020079708A (ja) 2017-03-14 2017-03-14 慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018168779A1 true WO2018168779A1 (ja) 2018-09-20

Family

ID=63522176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/009529 Ceased WO2018168779A1 (ja) 2017-03-14 2018-03-12 慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2020079708A (ja)
WO (1) WO2018168779A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110108886A (zh) * 2019-04-22 2019-08-09 东南大学 针对现场快速筛查慢性阻塞性肺炎病人的prdx2抗体胶体金检测试纸条

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184046A1 (en) * 2008-11-12 2010-07-22 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
WO2015168393A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Northwestern University Nanostructures for modulating intercellular communication and uses thereof
WO2016185385A1 (en) * 2015-05-18 2016-11-24 The University Of British Columbia Methods and systems of detecting plasma protein biomarkers for diagnosing acute exacerbation of copd

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184046A1 (en) * 2008-11-12 2010-07-22 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
WO2015168393A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Northwestern University Nanostructures for modulating intercellular communication and uses thereof
WO2016185385A1 (en) * 2015-05-18 2016-11-24 The University Of British Columbia Methods and systems of detecting plasma protein biomarkers for diagnosing acute exacerbation of copd

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREU Z ET AL.: "Extracellular vesicles as a source for non-invasive biomarkers in bladder cancer progression", EUROPIAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 98, 15 October 2016 (2016-10-15), pages 70 - 79, XP029892428, DOI: doi:10.1016/j.ejps.2016.10.008 *
KADOTA, T ET AL.: "EXTRACELLULAR VESICLES IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 17, no. 11, 27 October 2016 (2016-10-27), pages E1801 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110108886A (zh) * 2019-04-22 2019-08-09 东南大学 针对现场快速筛查慢性阻塞性肺炎病人的prdx2抗体胶体金检测试纸条

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020079708A (ja) 2020-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Surfaceome of exosomes secreted from the colorectal cancer cell line SW480: peripheral and integral membrane proteins analyzed by proteolysis and TX114
US20130059903A1 (en) Compositions and Methods for Characterizing Breast Cancer
JP5078100B2 (ja) 循環癌細胞におけるステロイド受容体の検出および処置
JP6588893B2 (ja) 卵巣がんの自己抗体バイオマーカー
US20130017206A1 (en) Mcam modulation and uses thereof
KR20200003830A (ko) 자궁내막증의 치료를 위한 gpr84의 억제제 및 길항제
US20220170114A1 (en) Biomarkers of chronic lymphocytic leukemia and use thereof
JP2019158753A (ja) リンパ脈管筋腫症バイオマーカー
JP7677664B2 (ja) 尿路上皮がんを検査する方法
JP2010014689A (ja) プロテオミクス解析を用いたメラノーママーカーの同定
WO2018168769A1 (ja) 組織線維化バイオマーカー
JP7175526B2 (ja) 細胞遊走調節に関する疾患の予防・治療剤および肺間質の疾患の疾患活動性判定・予後評価
WO2023027186A1 (ja) 肺線維化疾患バイオマーカー
JP2021156577A (ja) 閉塞性肺疾患バイオマーカー
JP2018151276A (ja) 老化バイオマーカー
JP2020079708A (ja) 慢性閉塞性肺疾患バイオマーカー
WO2025028453A1 (ja) 肺がんバイオマーカー
WO2020162441A1 (ja) 肉芽腫性疾患バイオマーカー
JP2024005979A (ja) 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット
JP2023000812A (ja) 悪性胸膜中皮腫バイオマーカー
WO2023153496A1 (ja) 好酸球増多症又は気管支喘息バイオマーカー
WO2018168768A1 (ja) 閉塞性肺疾患バイオマーカー
EP2752665B1 (en) Novel biomarker for diagnosis of lung cancer
EP3133400B1 (en) Use of ak6 and gpx5 male fertility related proteins or combination thereof
WO2022085687A1 (ja) 呼吸器疾患の予防又は治療剤、検査方法、検査薬、予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法、及び誘発性又は増悪性の評価方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18767579

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18767579

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP