WO2018143840A1 - Биоцидный пептид и препарат на его основе - Google Patents

Биоцидный пептид и препарат на его основе Download PDF

Info

Publication number
WO2018143840A1
WO2018143840A1 PCT/RU2018/000037 RU2018000037W WO2018143840A1 WO 2018143840 A1 WO2018143840 A1 WO 2018143840A1 RU 2018000037 W RU2018000037 W RU 2018000037W WO 2018143840 A1 WO2018143840 A1 WO 2018143840A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phe
pro
arg
peptide
peptides
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000037
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ирина Васильевна АФОНИНА
Александр Александрович КОЛОБОВ
Николай Иванович КОЛОДКИН
Мария Павловна СМИРНОВА
Людмила Ивановна СТЕФАНЕНКО
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА"
Priority to CN201880003993.4A priority Critical patent/CN110650970B/zh
Priority to EP18747340.0A priority patent/EP3578566B1/en
Priority to US16/483,879 priority patent/US11059860B2/en
Publication of WO2018143840A1 publication Critical patent/WO2018143840A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine, namely to new peptides possessing biocidal, in particular, antibacterial, antifungal and antiviral properties and preparations based on them.
  • the disadvantage of these peptides is insufficient activity against fungi and viruses.
  • the closest in structure to the claimed peptide is the indolycidine peptide [Selsted M.E., Novotny M.J., et al /, Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neurophils. // J. Biol. Chemistry. - vol. 267. - Jis 7. - 1992. - p.4292-4295], having the structure:
  • This peptide has an antimicrobial effect against a fairly wide range of bacteria, but is ineffective against viral infections.
  • Another disadvantage of indolicidin is the presence of high hemolytic activity.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • the disadvantage of these drugs is their relatively low biocidal activity, the use of a mixture of peptides, usually of natural origin, often without a specific composition of ingredients.
  • ALLOMEDIN gel which contains the Allostatia peptide as the active principle, and carbopol: water as excipients; allantoin: phenoxyethanol; ethylhexylglycerol; sodium hydroxide.
  • the disadvantage of the gel is the limited scope (only viral infections of the skin).
  • X 4-nitrophenylalanine - Phe (N0 2 ) or 4-chlorophenylalanine - Phe (Cl) or 4-methoxyphenylalanine - Phe (OCH 3 ) or D-phenylalanine - D-Phe or 4-aminophenylalanine - (4-NH 2 ) Phe or 4-aminobenzoylphenylalanine - (4-NHBz) Phe or homophenylalanine - homoPhe or 4-tert-butylphenylalanine - (4-Bu ') Phe or 2-methylphenylalanine - (2-Me) Phe or 4-fluorophenylalanine - (4-F) Phe or pentafluorophenylalanine - Phe (F 5 ) or 2-trifluoromethylphenylalanine
  • Y H or - palmitoyl - Pal, or aminodecanoyl - HN 2 - (CH 2 ) 10 —CO—.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Peptides are prepared by standard solid phase peptide synthesis technology [JMSteward and JDYoung, “Solid Phase Peptide Synthesis”, WH Freeman Co., San Francisco, 1969], followed by cleavage of the protecting groups and purification of the final product.
  • the tert-butyloxycarbonyl group is used as an intermediate protection of the ⁇ -amino group of amino acids in the solid-phase synthesis method.
  • Arginine guanogroups were blocked by the mesitylenesulfonyl or nitro group, the ⁇ -amino group of the lysine with the -2-chlorobenzidylcarbonyl protection.
  • the peptide chain was increased using 1-hydroxybenzotriazole esters with neutralization. The completeness of the reaction was monitored by the ninhydrin test or bromophenol blue (proline). The peptides were cleaved from the resin and the protective groups were removed by hydrogen fluoride in the presence of scavengers. The synthesized peptides were purified by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC). The purity of the preparations obtained was more than 95%. All of them had a satisfactory amino acid analysis and correct mass spectroscopy data.
  • HPLC reverse phase high performance liquid chromatography
  • a possible mechanism of bacterial inactivation by peptides is associated with the formation of multiple micropores in the shell, leading to equalization of the osmotic pressure, leakage of the contents and destruction of the nucleoid.
  • the synthesized peptides did not cause hemolysis in doses exceeding 200 ⁇ g / ml.
  • these peptides influenced immunocompetent cells. So, in the dose range of 2-10 ⁇ g / ml, they significantly increased the spontaneous proliferation of splenocytes and reduced the inclusion of H-thymidine by spleen cells.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the preparation is a transparent homogeneous gel for topical application, free from foreign particles.
  • the gel has the following composition (% mass): active ingredient (peptide) - 0.001-0.1; auxiliary additives - 99.999-99.9.
  • Peptides 2, 6 or 1 1 are used as an active principle.
  • Solvents for example, water or water-alcohol solutions, flavorings, antioxidants, as well as other substances that help optimize the use of the peptide as a biocidal drug, can be used as auxiliary agents. directionality.
  • the gel contains at least one substance from the group consisting of carbopol, allantion, phenoxyethanol, ethylene hexyl glycerol, sodium hydroxide, sodium hyaluronate, lavender or castor oil, glycerin, sodium carmellose, citric acid, alpha -tocopherol acetate, benzoic acid and the like.
  • the preparation of the drug was carried out according to standard technologies for the creation of pharmaceutical dosage forms, using as active
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of the ingredient in a pharmaceutically acceptable salt of the peptide, which does not cause undesirable local and systemic side effects, and as adjuvants, appropriate additives provide a certain structural viscosity, have pseudoplastic, plastic and thixotropic properties and optimize the bioavailability of the active ingredient.
  • a nitro group was used to protect the g ⁇ function of arginine, and the lysine ⁇ -amino group was used as the chlorocarbobenzoxy group.
  • a reaction vessel was charged with 0.2 g of tert-butyloxycarbonyl-N -nitro-arginil- with metilbenzgidrilaminopolimera in 10 ml of dimethylformamide.
  • the arginine content is 1.0 mmol / g of polymer.
  • the peptide chain was further expanded from the C-terminus according to the program shown in table 2.
  • the peptidyl polymer in the reaction vessel was treated with 5 ml of 50% trifluoroacetic acid in methylene chloride, washed with 5 ml of methylene chloride, filtered, removed from the vessel and transferred to a filter funnel. Washed on the filter three times with 5 ml of isopropyl alcohol and three times with 5 ml of absolute ether. The resulting peptidyl polymer was dried in a vacuum desiccator over phosphorus pentoxide and 0.2 g of the product was finally released according to the program shown in Table 3.
  • a mesitylenesulfonyl group was used to protect the Msh function of arginine.
  • 0.2 g of ⁇ -tert-butyloxycarbonyl-1H ) mesitylene sulfonyl arginyl methylbenzhydryl aminopolymer in 10 ml of dimethylformamide was loaded into the reaction vessel.
  • the peptide chain was further expanded from the C-terminus according to the program shown in Table 2, adding at the last stage palmitic acid (15) or Boc-11-aminodecanoic acid (2).
  • MIC was determined as the values of the segments on the x axis of the regression line of the values of the diameters of the zones obtained by serial dilution of samples of peptides. All measurements were carried out in a triplet. The test results are shown in table 5.
  • Antifungal activity was evaluated by the method similar to that of Example 4 for Candida albicans 820 strain. The results are shown in Table 6.
  • peptides 2, 4, 6, 8, 11, and 13 were shown to exhibit biocidal activity against molds and yeasts, significantly exceeding the activity of indolicidin.
  • erythrocytes were isolated from heparinized blood by centrifugation and washed three times with veronal-medial buffer (0.15 M, pH 7.4). Then the mixture was diluted with phosphate (PBS) buffer (0.015 M Na 2 HPO4, 0.15 M NaCl, pH 7.4). Samples of peptides of a certain concentration in PBS were placed in the cells of a 96-well plate, and erythrocyte suspension in PBS was added. The concentration of red blood cells is 1%. PBS was used as a negative control (lack of hemolysis). As a positive (100% hemolysis) - 0.1% triton X-100 in PBS.
  • PBS phosphate
  • the plates were incubated for 3 hours at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 and centrifuged. The supernatant was transferred to a clean plate.
  • the intensity of hemoglobin release from destroyed red blood cells was determined using a Victor-2 plate spectrophotometer (Finland) at ⁇ - 450 nm. MB 50 was defined as the lowest concentration at which 50% hemolysis occurred. All measurements were performed in a triplet. The test results are shown in Table 7.
  • peptides 2, 6, 11 did not cause hemolysis in doses exceeding 200 ⁇ g / ml.
  • H3N2 influenza virus (HBV, strain A Pert / 16); adenovirus of the 3rd serotype (AB, strain Z / Voronezh / 2174/82); Parainfluenza virus type 3 (SCV, Wok strain).
  • Influenza virus is obtained from the collection of viruses of the Institute of Influenza, RAS; parainfluenza virus and adenovirus were obtained from the State Museum Virus Collection.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 1 mg of each preparation was dissolved in 2 ml of DMSO and introduced into vials with a supporting medium (2 Needles MEM and 199, taken in equal proportions) at a final concentration of 20.0 ⁇ g / ml; 2.0 ⁇ g / ml, 0.2 ⁇ g / ml and 0.02 ⁇ g / ml.
  • a monolayer of cell cultures was obtained in culture mattresses with a useful area of 25 cm 2 . Before infection, the growth medium was removed, the cell monolayer was washed once with Hanks solution. The transplanted HEp-2 cell culture was infected with adenovirus or type 3 parainfluenza viruses; cell culture MDCK - influenza virus, using in each case a multiplicity of infection equal to 0.1 - 0.01 TCD50 / cell.
  • a support medium (PS) was added that did not contain the studied drugs (virus control) or containing the studied peptides 2, 6, 1 1, which showed the highest activity against bacteria and fungi, in doses in doses 20.0 ⁇ g / ml; 2.0 ⁇ g / ml, 0.2 ⁇ g / ml and 0.02 ⁇ g / ml.
  • a similar PS composition was introduced into uninfected cell cultures (drug control).
  • Peptide-free PS (cell control) was added to another portion of uninfected cell cultures.
  • VSL virus-containing culture fluid
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) "To work with cell culture.” After 24-48 hours of monolayer formation, VSL was introduced into the cells at a dilution of 1: 10 to 1: 1,000,000 with a coefficient of 10 in the growth medium and 0.1 ml of each dilution was placed in 4 wells of the plate. Six wells were left as a control of the cells, introducing 0.1 ml of medium into them. And a controlling Infected cells were incubated in an incubator with 5% C0 2 in a stationary position at 34.5 ⁇ 0.5 ° C. Implementing the titration results was performed after 3 days (influenza virus), or 4 days (parainfluenza, adenovirus) by the presence of a direct cytopathogenic effect (JPC) of the virus on the cells.
  • JPC direct cytopathogenic effect
  • Viral reproduction activity was evaluated by the value of infectious titers calculated by the method of Reed, Muench. The results of the study of antiviral activity of the drugs are presented in table 8.
  • the tested peptides caused a significant (more than 100-1000 times) decrease in the infectious activity of the H3N2 influenza virus (HBV, strain A Pert / 16), adenovirus of the 3rd serotype (AB, strain Z / Voronezh / 2174/82) and parainfluenza virus type 3 (VW, strain Wok).
  • H3N2 influenza virus H3N2 influenza virus
  • AB adenovirus of the 3rd serotype
  • VW parainfluenza virus type 3
  • Thymus mice were taken under aseptic conditions, homogenized, suspended in RPMI-1640 medium (Sigma) and filtered through two layers of gauze. The resulting cell suspension was washed twice with RPMI-1640 medium (Sigma) and resuspended in RPMI-1640 culture medium containing 2 mM L-glutamine (Sigma) and 80 ⁇ g / ml gentamicin. The number of cells was counted in a Goryaev chamber. The cell concentration was adjusted to 10x10 6 / ml with culture medium containing 4% fetal serum (FCS) (Sigma).
  • FCS fetal serum
  • Mouse spleens were taken under aseptic conditions, homogenized in RPMI-1640 medium (Sigma) and filtered through two layers of sterile gauze. Received
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) the mogenate was centrifuged and then erythrocytes were lysed using a 0.83% solution of ammonium chloride. Splenocytes were washed twice with RPMI-1640 medium (Sigma). The number of cells was counted in a Goryaev chamber. The concentration of spleen cells was adjusted to 5 10 6 in one milliliter of RPMI-1640 medium (Sigma) supplemented with 2 mM L-glutamine (Sigma), 80 ⁇ g / ml gentamicin and 20% FCS.
  • lipopolysaccharide (Sigma) was used at a final concentration of 0.2 and 0.02 ⁇ g / ml.
  • concentration range from 10 to 0.016 ⁇ g / ml.
  • N-thymidine (Isotope) was added to all wells of the tablet at a final concentration of 5 cS1 / ml.
  • cell cultures were harvested onto filters using a harvester, the filters were dried, and the amount of 3 H-thymidine incorporated was measured using a liquid scintillation counter (Rackbeta 1217). The results were expressed in pulses per minute (cpm). The data are shown in tables 9-12.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) RAW-264.7 cells were cultured for 16 hours in the wells of a 48 well culture plate at a concentration of 1x10 6 / ml, 0.5 ml per well in DMEM / F-12 culture medium (Sigma) supplemented with 2 mM L-glutamine ( Sigma), 80 ⁇ g / ml gentamicin and 10% FCS in a C0 2 incubator. At the end of the incubation time in all wells of the plate, the culture medium was replaced with 0.25 ml of fresh medium.
  • the studied preparations at concentrations of 40, 8, 1.6 ⁇ g / ml were preincubated with LPS (0.8 and 0.16 ⁇ g / ml) for two hours in a C0 2 incubator.
  • Polymyxin B (Calbiochem) (PMB) at the same concentrations was used as a positive control of the inhibition of the action of LPS.
  • PMB Polymyxin B
  • the prepared mixture of 0.25 ml was added to the wells of the culture plate in at least two parallels.
  • a mixture of LPS with culture medium was added to the control wells.
  • Cells were cultured for 24 hours in a C0 2 incubator. NO production was measured by the total nitrite level in the culture medium using the Griss reaction using a commercial reagent (Sigma) according to the manufacturer's instructions. The results are shown in tables 13-14.
  • Peptides 2, 6, 1 1 influenced immunocompetent cells. So, in the range of doses of 2-10 ⁇ g / ml, they significantly increased the spontaneous proliferation of splenocytes and reduced the inclusion of H-thymidine by spleen cells.
  • peptides in doses of 0.4-2.0 ⁇ g / ml peptides inhibited the effect of LPS.
  • at doses of 10–0.4 ⁇ g / ml they inhibited LPS stimulated NO production by macrophage RAW 264.7 cells. The specificity of peptide binding to LPS was also confirmed by the fact that the inhibition efficiency of NO production increased with decreasing stimulating doses of LPS.
  • Example 8 Obtaining a gel for the prevention and treatment of diseases of the skin and mucous membranes.
  • the result is a transparent homogeneous gel for external (local) use, free from foreign particles.
  • the gel has the following composition (% mass): peptide - 0.001-0.1; service additives - 99.999-99.9.
  • the characteristics of the obtained gel preparations containing peptides are given in table 15.
  • Example 9 Antiviral activity of peptide-based drugs against human herpes simplex virus type 2 in experiments in vivo
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) group 3 - infected with herpes simplex virus type 2 without the use of pharmaceuticals (virus control)
  • Herpes simplex virus type 2 strain G (ATCC VR-734, USA) was used in the work.
  • the virus was cultured in a T-98G cell culture (glioblastoma of the human brain), then adapted to the body of mice with two consecutive intracerebral passages in mice of different groups.
  • T-98G cell culture glioblastoma of the human brain
  • mice were intracerebrally infected with brain tissue homogenate from the second passage, mice were sacrificed on day 4 after infection, the brain was extracted, homogenate was prepared, Vero cells were infected and incubated for 48 hours at 37 ° C and 5% C0 2 using culture fluid in which the infectious titer of the virus was previously determined as an infectious material.
  • Zovirax (Acyclovir in the form of a 5% ointment, Glaxo Welcome) was used as a comparison drug.
  • Damage to the vaginal epithelium of mice was performed using a scarifier for vaginal smears, after which animals of groups 1 and 2 were infected with the virus at a dose of 10 b TSH 50 in a volume of 30 ⁇ l.
  • the preparations were applied to animals on a wound according to the treatment regimen: 1, 2, 3, 4 and 5 days after infection once a day.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The protective activity of the peptides was evaluated by reducing specific mortality and increasing the life expectancy of animals compared with the control group not receiving treatment. Data on the protective activity of the peptides are shown in table 16.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) also viruses. The best results were obtained using peptides 2, 6, 11. Peptide-based gels can be used to treat bacterial, viral, and associated infectious diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к новым пептидам, обладающим биоцидными, в частности, антибактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами и препаратам на их основе. Предлагается биоцидный пептид общей формулы Y-Ile-Leu-Pro-X-Lys-X-Pro-X-X-Pro-X-Arg-Arg-NH2 где X = 4-нитрофенилаланин; 4-хлорфенилаланин; 4-метоксифенилаланин; D-фенилаланин; 4-аминофенилаланин; 4-аминобензоилфенилаланин; гомофенилаланин; 4-третбутилфенилаланин; 2-метилфенилаланин; 4-фторфенилаланин; пентафторфенилаланин или 2-трифторметилфенил-аланин; Y = Н или пальмитоил или аминодеканоил и препарат в форме геля, обладающий биоцидными свойствами, содержащий в качестве активного начала пептид в концентрации 0,001-0,1% масс. Заявляемые пептиды проявляют биоцидные свойства по отношению к бактериям, включая споровые, плесневым грибам, а также вирусам. Гели на основе пептидов могут быть использованы для лечения, бактериальных, вирусных и сочетанных инфекционных заболеваний.

Description

БИОЦИДНЫЙ ПЕПТИД И ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ
Область техники
Изобретение относится к области медицины, а именно к новым пептидам, об- ладающим биоцидными, в частности, антибактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами и препаратам на их основе.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время наблюдается рост устойчивых к действию антимикробных препаратов возбудителей инфекционных заболеваний, что приводит к снижению эф- фективности лечения социально значимых инфекционных заболеваний. Кроме того, значимым патогенетическим фактором становится сочетанная бактериальная и ви- русная инфекция. В этой связи актуальной задачей является поиск новых альтерна- тивных подходов к их терапии.
Известно, что в процесс защиты высших эукариотов от инфекции организм включает секрецию эндогенных соединений пептидной природы, которые синтези- руются в результате процессинга предшественников в виде активного защитного компонента, причем их образование происходит гораздо быстрее и требует меньше энергетических затрат, чем образование антител или специфических фагоцитарных клеток. [Mangoni, М. L. Host-defense peptides: from biology to therapeutic strategies // Cell. Mol. Life Sci.- 2011.-68.-p. 2157-2159].
Создание лекарственных препаратов на основе таких эндогенных пептидных соединений является одним из возможных путей решения проблемы толерантности микроорганизмов к существующим антибиотикам. В настоящее время подобные ле- карственные средства уже применяются в практической медицине или проходят кли-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) нические испытания [Brogden, N. К., and Brogden, К. A. Will new generations of mod- ified antimicrobial peptides improve their potential as pharmaceuticals?// Int. J. Antimicrob. Agents.- 2011.-38.-p. 217-225. Yeung, A. T. Y., Gellatly, S. L., and Hancock, R. E. W. Multifunctional cationic host defense peptides and their clinical applications // Cell. Mol. Life Sci..- 2011.-68.-p. 2161-2176].
Известны, в частности, ранее созданные авторами [RU 2183643, 2002] пепти- ды общей формулы
H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH2 , где
а = -Не- или -Lys-; b= -Pro - или -Lys-; с, d = -Lys- или -Trp-; e=Arg или Ala, Недостатком этих пептидов является недостаточно высокая активность в отноше- нии грибов и вирусов.
Наиболее близким по строению к заявляемому пептиду является пептид индо- лицидин [Selsted М.Е., Novotny M.J., et al/, Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neurophils. // J.Biol.Chemistry. - vol.267. - Jis 7. - 1992. - p.4292-4295], имеющий структуру:
H-IIe-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2 .
Этот пептид обладает антимикробным действием по отношению к достаточно широкому кругу бактерий, однако малоэффективен против вирусных инфекций. Еще одним недостатком индолицидина является наличие высокой гемолитической актив- ности.
Известно большое число лекарственных форм для наружного применения на основе пептидов, обладающих биоцидным действием. К ним относятся, в частно- сти, «Пептид-актив» [http://tiu.ru/Gel-dlya-litsa-s-peptidami.html? no_redirect=l ]; ком- плекс «Жизнь тела» [http://lifehappiness.narod. ru/screens/ cosmetics/gels.htm]; произ- водные гемина с аминокислотами и пептидами [RU2415868, 2011].
Все вышеуказанные препараты состоят из активного начала пептидного проис- хождения и вспомогательных ингредиентов.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Недостатком этих препаратов является относительно невысокая биоцидная ак- тивность, использование смеси пептидов, как правило, природного происхождения, часто не имеющих конкретного состава ингредиентов.
Наиболее близким к заявляемому препарату является гель АЛЛОМЕДИН, со- держащий в качестве активного начала пептид Аллостатии, а в качестве вспомога- тельных веществ - карбопол: воду; аллантоин: феноксиэтанол; этилгексилглицерин; натрия гидроксид. [www.stada.ru/press/.../allomedin-preparat-novogo-pokoleniya-protiv- ge esa-0.html; http://www.biomedservice.ru/ price/goods /62/2582].
Недостатком геля является ограниченная область применения (только вирусные инфекции кожных покровов).
Сущность изобретения
Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящего изобретения, явля- лась разработка пептидов, обладающих более эффективным воздействием на различ- ные группы микроорганизмов и готовой лекарственной формы для наружного приме- нения на его основе.
Было найдено, что поставленная выше задача решается путем создания анало- гов индолицидина, особенностью которых является наличие в их составе аминокис- лотных остатков производных фенилаланина, содержащих в ароматическом кольце электроно-донорные и электроно-акцепторные заместители.
Заявляемые пептиды имеют общую формулу:
Y-Ile-Leu-Pro-X-Lys-X-Pro-X-X-Pro-X-Arg-Arg-NH2 , где X = 4-нитрофенилаланин - Phe(N02) или 4-хлорфенилаланин - Phe(Cl) или 4- метоксифенилаланин - Phe(OCH3) или D-фенилаланин - D-Phe или 4-аминофе- нилаланин - (4-NH2)Phe или 4-аминобензоилфенилаланин - (4-NHBz)Phe или го- мофенилаланин - homoPhe или 4-третбутилфенилаланин - (4-Bu')Phe или 2- метилфенилаланин - (2-Me)Phe или 4-фторфенилаланин - (4-F)Phe или пентафторфе- нилаланин - Phe(F5) или 2-трифторметилфенилаланин - (2-CF3)Phe, а
Y = Н или - пальмитоил - Pal, или аминодеканоил - HN2-(CH2)10-CO-.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Пептиды получают стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе [J.M.Steward and J.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969] с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конеч- ного продукта. В качестве промежуточной защиты α-аминогруппы аминокислот при твердофазном методе синтеза используют трет-бутилоксикарбонильную группу. Гуа- ногруппы аргинина блоктровали мезитиленсульфонильной или нитрогруппой, ε- аминогруппы лизина -2-хлорбензидлкарбонильнлй защитой.
Наращивание пептидной цепи осуществляли с помощью 1- гидроксибензотриазоловых эфиров с нейтрализацией. Полноту протекания реакции контролировали нингидриновым тестом или бромфеноловым голубым (пролин). От- щепление пептидов от смолы и удаление защитных групп проводили фтористым во- дородом в присутствии скавенджеров. Очистку синтезированных пептидов проводи- ли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) на обращенной фазе. Чистота полученных препаратов была более 95%. Все они имели удовлетворительный аминокислотный анализ и корректные данные масс- спектроскопии.
Структуры синтезированных пептидов приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Первичная структура полученных аналогов индолицидина
Figure imgf000006_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) H-Ile-Leu-Pro-(4-NH2)Phe-Lys-(4-NH2)Phe-Pro-(4-NH2)Phe-(4-NH2)Phe-Pro- 7 (4-NH2)Phe-Arg-Arg -NH2
H-Ile-Leu-Pro-(4-NHBz)Phe-Lys-(4-NHBz)Phe-Pro-(4-NHBz)Phe-(4-NHBz) Phe-Pro- 8 (4-NHBz)Phe-Arg-Arg-NH2
H-Ile-Leu-Pro-homoPhe-Lys-homoPhe-Pro-homoPhe-homoPhe-Pro-homoPhe-Arg- 9 Arg-NH2
H-Ile-Leu-Pro-(4-Bu')Phe-Lys-(4-But)Phe-Pro-(4-Bu')Phe-(4-Bu/)Phe-Pro-(4-Bu') Phe- 10 Arg-Arg-NH2
H-Ile-Leu-Pro-(2-Me)Phe-Lys-(2-Me)Phe-Pro-(2-Me)Phe-(2-Me)Phe-Pro-(2-Me) Phe- 11 Arg-Arg -NH2
H-Ile-Leu-Pro-(4-F)Phe-Lys-(4-F)Phe-Pro-(4-F)Phe-(4-F)Phe-Pro-(4-F)Phe-Arg-Arg- 12 NH2
H-Ile-Leu-Pro-Phe(F5)-Lys-Phe(F5)-Pro-Phe(F5)-Phe(F5)-Pro-Phe(F5)-Arg-Arg-NH2 13
H-Ile-Leu-Pro-(2-CF3)Phe-Lys-(2-CF3)Phe-Pro-(2-CF3)Phe-(2-CF3)Phe-Pro- (2- 14 CF3)Phe-Arg-Arg -NH2
Pal-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH2 15
Проведенные испытания показали, что полученные пептиды совмещают анти- бактериальную активность с биоцидной активностью в отношении плесневых грибов и дрожжей, а также в отношении вирусов.
Возможный механизм инактивации бактерий пептидами связан с формировани- ем множественных микропопор в оболочке, приводящих к выравниванию осмотиче- ского давления, вытеканию содержимого и разрушению нуклеоида.
Лучшие результаты были получены при использовании пептидов 2, 6 и 1 1, структура которых приведена ниже:
(2) HN2-(CH2)10-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg- NH2
(6) H-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH2
(11) H-Ile-Leu-Pro-(2-Me)Phe-Lys-(2-Me)Phe-Pro-(2-Me)Phe-(2-Me)Phe-Pro- (2-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Me)Phe-Arg-Arg-NH2 .
На фоне высокой антибактериальной активности, которая проявлялась в интер- вале доз 1-5 мкг/мл, синтезированные пептиды не вызывали гемолиз в дозах, превы- шающих 200 мкг/мл. Кроме того, данные пептиды оказывали влияние на иммуноком- петент- ные клетки. Так, в интервале доз 2-10 мкг/мл они достоверно усиливали спон- тайную пролиферацию спленоцитов и снижали включение Н-тимидина клетками се- лезенки. При стимуляции пролиферации спленоцитов липополисахаридом (ЛПС) пептиды в дозах 0,4-2,0 мкг/мл пептиды ингибировали действие ЛПС. В дозах 10 - 0,4 мкг/мл они ингибировали продукцию NO, стимулированную ЛПС, клетками макро- фагальной линии RAW 264.7. Специфичность связывания пептидов с ЛПС подтвер- ждалась также тем, что эффективность ингибирования продукции NO увеличивалась при уменьшении стимулирующей дозы ЛПС.
Промышленная применимость
На основе разработанных пептидов был получен препарат для местного приме- нения, обладающий биоцидной активностью. Препарат представляет собой прозрач- ный гомогенный гель для местного применения, свободный от посторонних частиц. Гель имеет следующий состав (%масс): активный ингредиент (пептид) - 0,001-0,1; вспомогательные добавки - 99,999-99,9. В качестве активного начала используются пептиды 2, 6 или 1 1. В качестве вспомогательных добавок могут быть растворители, например, вода или водно-спиртовые растворы, ароматизаторы, антиоксиданты, а также иные вещества, способствующие оптимизации использования пептида в каче- стве лекарственного средства биоцидной направленности. В частности, в качестве вспомогательных добавок в состав геля входит, по крайней мере, одно вещество из группы, включающей карбопол, аллантион, феноксиэтанол, этиленгексилглицерин, гидроксид натрия, гиалуронат натрия, лавандовое или касторовое масло, глицерин, кармелозу натрия, лимонную кислоту, альфа-токоферола ацетат, бензойную кислоту и т.п.
Получение лекарственного препарата осуществляли по стандартным техноло- гиям создания лекарственных форм фармпрепаратов, используя в качестве активного
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ингредиента фармацевтически подходящую соль пептида, не вызывающую нежела- тельных местных и системных побочных эффектов, а в качестве вспомогательных веществ - соответствующие добавки, обеспечивающие определенную структурную вязкость, обладающие псевдопластическими, пластическими и тиксотропными свой- ствами и оптимизирующие биодоступность активного ингредиента.
Практическая применимость изобретения иллюстрируется следующими при- мерами.
Пример 1. Синтез пептидов 1 и 3-14
В качестве защиты г^-функции аргинина использовали нитрогруппу, ε- аминогруппы лизина - хлоркарбобензокси-группу. Для синтеза пептида загружали в реакционный сосуд 0.2 г -трет-бутилоксикарбонил-Нсо-нитро-аргинил- метилбензгидриламинополимера в 10 мл диметилформамида. Содержание аргинина - 1.0 ммол/г полимера. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 2.
Таблица 2 - Программа присоединения одного аминокислотного остатка
Figure imgf000009_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 6 Конденсация 1,0 ммол оксибензотри- 1 30 5
золового эфира соот- ветсвующего вос- производного амино- кислоты
7 Промывка Диметилформамид 3 1 10
8 Нингидрино- вый тест /
бромфеноло- вый голубой- Рго/
При положительном нингидриновом тесте, повторяли конденсацию, начиная с п.З.
По завершении синтеза пептидил-полимер в реакционном сосуде обрабатывали 5 мл 50% трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, промывали 5 мл хлори- стого метилена, фильтровали, извлекали из сосуда и переносили на фильтрующую воронку. Промывали на фильтре трижды по 5 мл изопропилового спирта и трижды по 5 мл абсолютного эфира. Высушивали полученный пептидил-полимер в вакуум- эксикаторе над пятаокисью фосфора и 0.2 г продукта окончательно деблокировали по программе, приведенной в таблице 3.
Таблица 3 Программа деблокирования пептидил-полимера и отщепления пептида от полимерной матрицы
Figure imgf000010_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ние пептида от по- крезол
лимерной матрицы (10:1, по объему)
2 Фильтрование
3 Промывка Абсолютный эфир 3 5 25
4 Смывка с фильтра Трифторуксусная 3 1 кислота
5 Высаживание Эфир диэтиловый 100
6 Фильтрование
7 Промывка Эфир диэтиловый 3 10
Полученные грубые продукты подвергали очистке обращенно-фазовой высоко- эффективной хроматографией на колонке С18 Nova Pack, 19x300мм, 300А0 в градиен- те 0-70% ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного ве- щества - пептидов последовательности 1, 3-14 - по данным оптической плотности, со- ставляло не менее 98%. Аминокислотный состав каждого пептида и его молекуляр- ная масса соответствовали теоретическим. Суммарные аналитические характеристики полученных соединений приведены в таблице 4. Пример 2. Синтез пептидов 2 и 15
В качестве защиты Мш-функции аргинина использовали мезитиленсульфониль- ную группу. Для синтеза пептида загружали в реакционный сосуд 0.2 г Ν-трет- бутилоксикарбонил-1Чй)-мезитиленсульфонил-аргинил-метилбензгидрил аминополи- мера в 10 мл диметилформамида. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 2, присоединяя на последней стадии пальмитино- вую кислоту (15) или Boc-11-аминодекановую кислоту (2).
Полученный пептидил-полимер обрабатывали безводным фтористым водоро- дом и выделяли грубый продукт в соответствии с программой, приведенной в таблице 3. При ВЭЖХ очистке использовали градиент ацетонитрила 12-90% в 0,1% трифто- руксусной кислоте. Аналитические характеристики пептидов 2 и 15 приведены в
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) таблице 4.
Пример 3. Биоцидная активность синтезированных пептидов в от- ношении бактерий.
Для определения антимикробной активности использовали метод радиальной диффузии в агарозных гелях. При проведении эксперимента около 4х106 CFU в сред- не-логарифмической фазе роста диспергировали в 10 мл на слой геля (10 тМ фосфата натрия, 0.3 мг порошка гидролизата соевого бульона на мл и 1% (вес/об) агарозы). Готовили серии разбавлений пептидов в 0,01% уксусной кислоты, содержащей 0.1% человеческий сывороточный альбумин. 8-μ1 образца пептида наносили на слой геля. Через 3 часа после нанесения пептидов наносили верхний слой ( 10 мл гидролизат со- евого агар, 60 г/л). После ночи инкубации измеряли просветленные зоны с точностью до 0,1 мм. Активность пептидов выражали в относительных единицах 1мм=10 U.
MIC определялась как значения отрезков на оси х линии регрессии значений диаметров зон, полученных при серийном разбавлении образцов пептидов. Все изме- рения осуществлялись в триплете. Результаты испытаний приведены в таблице 5.
Полученные результаты свидетельствуют, что при воздействии на бактериаль- ные штаммы, включающих и антибиотикоустойчивые, все пептиды имели высокую биоцидную активность, которая в ряде случаев превышала эффективность пептида 1 (индолицидина).
Лучшие результаты достигались при использовании пептидов 2, 6 и 11
Пример 4. Биоцидная активность в отношении плесневых грибов и дрожжей
Противогрибковая активность была оценена по методике, аналогичной приме- ру 4, на штамме Candida albicans 820. Результаты приведены в таблице 6.
Показано, что в дозах 3-10 мкг/мл пептиды 2, 4 6, 8, 11 и 13 проявляют био- цидную активность в отношении плесневых грибов и дрожжей, существенно превы- шающую активность индолицидина.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) И
Пример 5. Гемолитическая активность полученных пептидов.
При определении гемолитической активности эритроциты изолировали из ге- паринизированнолй крови путем центрифугирования и трижды промывали веронал- мединальным буфером (0,15 М, рН 7,4). Затем разбавляли смесь фосфатным (PBS) буфером (0,015 М Na2HPO4, 0,15 М NaCl, рН 7,4). Образцы пептидов определенной концентрации в PBS, помещали в ячейки 96-луночной планшеты и прибавляли сус- пензию эритроцитов в PBS. Концентрация эритро- цитов - 1%. В качестве негативного контроля (отсутствие гемолиза) использовали PBS. В качестве положительного (100% гемолиз) - 0.1% triton Х-100 в PBS.
Планшеты инкубировали в течение 3 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2 и центрифугировали. Супернатант переносили в чистую планшету. Интенсивность вы- деления гемоглобина из разрушенных эритроцитов определяли с помощью планшет- ного спектрофотометра "Victor-2" (Finland) при λ - 450 nm. МШ50 определяли как са- мую низкую концентрацию, при которой наступал 50% гемолиз. Все измерения осу- ществлялись в триплете. Результаты испытаний приведены в Таблице 7.
На фоне высокой антибактериальной активности, которая проявлялась в интер- вале доз 1-5 мкг/мл, пептиды 2, 6, 11 не вызывали гемолиз в дозах, превышающих 200 мкг/мл.
Пример 6. Противовирусная активность полученных пептидов
Для оценки действия пептидов использовались следующие штаммы: вирус гриппа H3N2 (ВГ, штамм A Pert/16); аденовирус 3-его серотипа (АВ, штамм З/Воронеж/ 2174/82); вирус парагриппа 3 типа (ВПЗ, штамм Вок). Вирус гриппа полу- чен из коллекции вирусов НИИ гриппа РАН; вирус парагриппа и аденовирус получе- ны из Государственной коллекции музейных вирусов.
В работе использовали перевиваемые культуры клеток карциномы гортани че- ловека Нер-2 и клетки почки собаки MDCK.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 1 мг каждого препарата растворяли в 2 мл DMSO и вносили во флаконы с под- держивающей средой (2ИГЛА MEM и 199, взятые в равных соотношениях) в конеч- ной концентрации 20,0 мкг/мл; 2,0 мкг/мл, 0,2 мкг/мл и 0,02 мкг/мл.
Монослой клеточных культур получали в культуральных матрасах полезной площадью 25 см2. Перед заражением ростовую среду удаляли, монослой клеток одно- кратно промывали раствором Хенкса. Перевиваемую культуру клеток НЕр-2 заражали аденовирусом или вирусами парагриппа 3 типа; культуру клеток MDCK - вирусом гриппа, используя в каждом случае множественность инфицирования, равную 0,1 - 0,01 ТЦД50 / клетка.
Параллельно с инфицированными, в опыте использовали аналогичные культу- ральные матрасы с неинфицированными культурами клеток Нер-2 и MDCK, часть ко- торых использовали как контроль клеток, а часть - для определения возможного ток- сического действия препаратов на клетки.
В матрасы с инфицированными культурами клеток добавляли поддерживаю- щую среду (ПС), не содержащую изучаемые препараты, (контроль вируса) или со- держащие изучаемые пептиды 2, 6, 1 1, показавшие наиболее высокую активность против бактерий и грибков, в дозах в дозах 20,0 мкг/мл; 2,0 мкг/мл, 0,2 мкг/мл и 0,02 мкг/мл. Аналогичную по составу ПС вносили в неинфицированные культуры клеток (контроль препарата). В другую часть неинфицированных клеточных культур добав- ляли ПС, не содержащую пептиды (контроль клеток).
Наблюдение проводили в течение 3 - 4 суток в зависимости от развития цитопа- тического действия вируса в контрольных матрасах {контроль вируса). Возможное токсическое действие препаратов на клетки оценивали ежедневной микроскопией не инфицированных клеточных культур с ПС содержащей или не содержащей пептиды (контроль препарата). По окончанию периода наблюдения образцы вируссодержа- щей культуральной жидкости (ВСЖ) титровали для определения инфекционной ак- тивности в опытных и контрольных пробах.
Для этого по 0,1 мл суспензии клеток Нер-2 или MDCK, приготовленной в по- севной концентрации, помещали в лунки полистероловых планшетов, маркированных
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) «для работы с культурой клеток». Через 24-48 часов формирования монослоя, в клет- ки вносили ВСЖ в разведении от 1 :10 до 1 :1000000 с коэффициентом 10 в ростовой среде и помещали по 0,1 мл каждого разведения в 4 лунки планшета. Шесть лунок ос- тавляли в качестве контроля клеток, внося в них по 0,1 мл среды. Зараженные и кон- трольные клетки инкубировали в термостате с 5% С02 в стационарном положении при 34,5 ±0,5° С. Учет результатов титрования проводили через 3 суток (вирус гриппа), или 4 суток (вирусы парагриппа, аденовирус) по наличию прямого цитопатогенного дей- ствия (ЦПД) вируса на клетки.
Активность вирусной репродукции оценивали по величине инфекционных тит- ров, рассчитанных по методу Reed, Muench. Результаты изучения противовирусной активности препаратов представлены в таблице 8.
Показано, что в дозах 20 мкг/мл или 2,0 мкг/мл испытанные пептиды вызывали существенное (более чем в 100-1000 раз) снижение инфекционной активности вируса гриппа H3N2 (ВГ, штамм A Pert/16), аденовируса 3-его серотипа (АВ, штамм З/Воронеж/ 2174/82) и вируса парагриппа 3 типа (ВПЗ, штамм Вок). Применение пеп- тидов в дозе 0,2 мкг/мл в меньшей степени, но также достоверно (более чем в 10-100 раз) снижало инфекционную активность вируса гриппа и аденовируса.
Пример 7. Влияние пептидов на иммунокомпетентные клетки
Исследовали влияние пептидов на спонтанную и стимулированную митогеном пролиферацию клеток тимуса и селезенки мышей. Тимусы мышей забирали в асепти- ческих условиях, гомогенизировали, суспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma) и фильтровали через два слоя марли. Полученную взвесь клеток дважды отмывали сре- дой RPMI-1640 (Sigma) и ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640, со- держащей 2мМ L-глутамина (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Концентрацию клеток доводили до 10х106/мл куль- туральной средой, содержащей 4% фетальной сыворотки (FCS) (Sigma).
Селезенки мышей забирали в асептических условиях, гомогенизировали в среде RPMI-1640 (Sigma) и фильтровали через два слоя стерильной марли. Полученный го-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) могенат центрифугировали и затем лизировали эритроциты, используя 0,83% раствор хлористого аммония. Спленоциты дважды отмывали средой RPMI-1640 (Sigma). Ко- личество клеток подсчитывали в камере Горяева. Концентрацию клеток селезенки до- водили до 5 106 в одном миллилитре среды RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 2мМ L- глутамина (Sigma), 80 мкг/мл гентамицина и 20% FCS.
Для стимуляции пролиферации клеток тимуса и селезенки использовали липо- полисахарид (Sigma) в конечной концентрации 0,2 и 0,02 мкг/мл. При исследовании in vitro влияния синтетических аналогов индолицидина на пролиферацию лимфоцитов, исследование проводили на фоне различных концентраций препаратов (диапазон кон- центраций от 10 до 0,016 мкг/мл). Для постановки теста использовали плоскодонные 96-луночные планшеты для культивирования (Costar). Культуру клеток инкубировали при 37° С в атмосфере, содержащей 5% С02 в течение 72 часов. За 16 часов до окон- чания периода культивирования во все лунки планшета вносили Н-тимидин (Изотоп) в конечной концентрации 5 цС1/мл. По окончании культивирования культуры клеток с помощью харвестера переносили на фильтры, фильтры высушивали и измеряли коли- чество включенного 3Н-тимидина, используя жидкостной сцинтилляционный счетчик (Rackbeta 1217). Результаты выражали количеством импульсов в минуту (имп/мин). Данные приведены в таблицах 9-12.
Таблица 9 - Влияние пептидов на спонтанную пролиферацию клеток тимуса
Figure imgf000016_0001
* р<0.05 **р<0.01
Таблица 10 - Влияние пептидов на спонтанную пролиферацию клеток селезенки
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Концентрация, мкг/мл
Пептид Контроль
10 2 0.4 0.08
1 1754± 382 2552 ±560 2188 +690 1454 1465
2 1174±282** 1225+474* 1791+219 24391526
6 3279+177** 18541236 16151248 15301510 20161438
11 1155±182 18491157 21491474 17241608
PMB 2051±456 2051+167 1548И40 14881497
* р<0.05 **р<0.01
Таблица 11 - Влияние пептидов на пролиферацию клеток селезенки, стимулирован- ных ЛПС (0,02 мкг/мл)
Figure imgf000017_0001
* р<0.05 **р<0.01
Таблица 12 - Влияние пептидов на пролиферацию клеток селезенки, стимулирован- ных ЛПС (0,2 мкг/мл)
Figure imgf000017_0002
* р<0.05 **р<0.01
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Клетки линии RAW-264.7 культивировали в течение 16 часов в лунках 48 лу- ночного планшета для культивирования в концентрации 1х106/мл по 0,5 мл на лунку в культуральной среде DMEM/F-12 (Sigma) с добавлением 2мМ L-глутамина (Sigma), 80 мкг/мл гентамицина и 10% FCS в С02-инкубаторе. По окончании времени инкуба- ции во всех лунках планшета культур альную среду замещали 0,25 мл свежей среды. Исследуемые препараты в концентрациях 40, 8, 1,6 мкг/мл преинкубировали с ЛПС (0,8 и 0,16 мкг/мл) в течение двух часов в С02-инкубаторе. В качестве положительно- го контроля ингибиции действия ЛПС использовали полимиксин В (Calbiochem) (РМВ) в тех же концентрациях. Затем приготовленную смесь по 0,25 мл добавляли в лунки культурального планшета не менее чем в двух параллелях. В контрольные лун- ки добавляли смесь ЛПС с культуральной средой. Клетки культивировали в течение суток в С02-инкубаторе. Продукцию NO измеряли по суммарному уровню нитрита в культуральной среде с помощью реакции Грисса с использованием коммерческого реагента (Sigma) по инструкции изготовителя. Результаты приведены в таблицах 13- 14.
Таблица 13 - Влияние пептидов на продукцию NO клетками макрофагальной линии RAW 264.7, стимулированными 0,2 мкг/мл ЛПС (ингибиция продукции NO в %)
Figure imgf000018_0001
Таблица 14 - Влияние пептидов на продукцию NO клетками макрофагальной линии RAW 264.7, стимулированными 0,04 мкг/мл ЛПС (ингибиция продукции NO в %)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Концентрация, мкг/мл
Пептид
10 2 0.4
1 36 0 0
2 94 52 16
6 8 1 0
11 52 12 7
PMB 94 85 44
Пептиды 2, 6, 1 1 оказывали влияние на иммунокомпетентные клетки. Так в ин- тервале доз 2-10 мкг/мл они достоверно усиливали спонтанную пролиферацию спле- ноцитов и снижали включение Н-тимидина клетками селезенки. При стимуляции пролиферации спленоцитов липополисахаридом пептиды в дозах 0,4-2,0 мкг/мл пеп- тиды ингибировали действие ЛПС. Кроме того, в дозах 10 - 0,4 мкг/мл они ингибиро- вали продукцию NO, стимулированную ЛПС, клетками макрофагальной линии RAW 264.7 Специфичность связывания пептидов с ЛПС подтверждалась также тем, что эф- фективность ингибирования продукции NO увеличивалась при уменьшении стимули- рующей дозы ЛПС.
Пример 8. Получение геля для профилактики и лечения заболеваний кожи и слизистых.
Для приготовления геля используют химический реактор с мешалкой. В смеси- тель загружают компоненты геля согласно рецептуре (мас.%): карбопол (1,5-2,0%), дистиллированную воду, раствор NaOH (1,5-2,0%), перемешивают, выдерживают в течение 30 мин. Затем титруют раствором лимонной кислоты до рН 6 и порционно при перемешивании вводят водный раствор пептида, содержащий консерванты, в ка- честве которых используют метилпарабен в количестве 0,01-0,2 мас.% и пропилпара- бен в количестве 0,002-0,01 мас.%. В полученную смесь вводят глицерин в количестве 1,5-2,5 мас.%). Систему перемешивают в течение 10 мин и измеряют величину рН. По-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) лученный однородный гель оставляют в покое для созревания на одни сутки. Затем гель вновь перемешивают и однородную массу фасуют в тару (тюбики).
В результате получают прозрачный гомогенный гель для наружного (местного) применения, свободный от посторонних частиц. Гель имеет следующий состав (% масс): пептид - 0,001-0,1; служебные добавки - 99,999-99,9. Характеристика получен- ных гелевых препаратов, содержащих пептиды, приведена в таблице 15.
Таблица 15. Состав гелевых препаратов, содержащих пептиды
Figure imgf000020_0001
Пример 9. Противовирусная активность препаратов на основе пептидов в отношении вируса простого герпеса человека 2 типа в опытах in vivo
Для проведения эксперимента были сформированы 3 группы животных по 15 особей каждая:
группа 1 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа с применением пептидных препаратов (опытная группа);
группа 2 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа с применением
Ацикловира (контроль препарата)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) группа 3 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа без применения фармпрепаратов (контроль вируса)
Экспериментальная герпесвирусная инфекция. В работе был использован вирус простого герпеса 2 типа штамм G (АТСС VR-734, США). Вирус культивиро- вали в культуре клеток T-98G (глиобластома головного мозга человека), далее адаптировали к организму мышей двумя последовательными интрацеребральными пассажами у мышей разных групп. Для подготовки итогового инфицирующего ма- териала животных интрацеребрально заражали гомогенатом мозговой ткани от второго пассажа, на 4 сутки после инфицирования мышей забивали, извлекали мозг, готовили гомогенат, инфицировали им клетки Vero и инкубировали 48 часов при 37°С и 5% С02, используя культуральную жидкость, в которой предваритель- но определяли инфекционный титр вируса, в качестве инфицирующего материала.
В качестве препарата сравнения использовали Зовиракс (Ацикловир в форме 5% мази, Glaxo Welcome).
Повреждение вагинального эпителия мышей осуществляли при помощи ска- рификатора для влагалищных мазков, после чего животных 1 и 2 групп инфицирова- ли вирусом в дозе 10б ТСШ50 в объеме 30 мкл. Препараты наносили животным на рану по лечебной схеме: через 1, 2, 3, 4 и 5 суток после заражения один раз в день.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 18 дней. Об окончании смертности судили по отсутствию в группах мышей с признаками герпетического вагинита (выделения из влагалища) и его осложнений (пареза задних конечностей). Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (Mr, отношение числа павших на момент контроля животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты (IP, отношение раз- ницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертно- сти в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (СПЖ) на каждый день исследования в соответствии со следующими формулами:
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Протективную активность пептидов оценивали по снижению специфической смертности и увеличению продолжительности жизни животных по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения. Данные по протективной активности пептидов приведены в таблице 16.
Таблица 16 - Протективная активность препаратов при летальной герпетической инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 2 типа у мышей при вагинальном заражении (п
Figure imgf000022_0001
Лучшие результаты были получены при использовании препаратов 2с и 26
Проведенные исследования показали, что заявляемые пептиды проявляют био- цидные свойства по отношению к бактериям, включая споровые, плесневым грибам, а
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) также вирусам. Лучшие результаты были получены при использовании пептидов 2, 6, 11. Гели на основе пептидов могут быть использованы для лечения, бактериальных, вирусных и сочетанных инфекционных заболеваний.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Биоцидный пептид общей формулы
Y-Ile-Leu-Pro-X-Lys-X-Pro-X-X-Pro-X-Arg-Arg-NH2 где X = 4-нитрофенилаланин; 4-хлорфенилаланин; 4-метоксифенилаланин; D- фенилаланин; 4-аминофенилаланин; 4-аминобензоилфенилаланин; гомофенилала- нин; 4-третбутилфенилаланин; 2-метилфенилаланин; 4-фторфенилаланин; пентаф- торфенилаланин или 2-трифторметилфенил-аланин; Y = Н или пальмитоил или аминодеканоил,
обладающий антимикробной активностью.
2. Биоцидный пептид по п.1 общей формулы:
H-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH2
3. Биоцидный пептид по п.1 общей формулы:
H-Ile-Leu-Pro-(2-Me)Phe-Lys-(2-Me)Phe-Pro-(2-Me)Phe-(2-Me)Phe-Pro-(2-Me)Phe- Arg-Arg NH2
4. Биоцидный пептид по п.1 общей формулы:
HN2-(CH2)10-CO- Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg- Arg-NH2
5. Препарат в форме геля, обладающий биоцидными свойствами, содержащий в ка- честве активного начала пептид и вспомогательные вещества, отличающийся тем, что он содержит пептид, выбранный из группы пептидов по пп.2, 3 или 4 в концен- трации 0,001-0,1% масс.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2018/000037 2017-02-06 2018-01-29 Биоцидный пептид и препарат на его основе WO2018143840A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201880003993.4A CN110650970B (zh) 2017-02-06 2018-01-29 抗菌肽及其药品
EP18747340.0A EP3578566B1 (en) 2017-02-06 2018-01-29 Biocidal peptide and preparation based thereon
US16/483,879 US11059860B2 (en) 2017-02-06 2018-01-29 Biocidal peptide and preparation based thereon

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017103887 2017-02-06
RU2017103887A RU2678985C2 (ru) 2017-02-06 2017-02-06 Биоцидный пептид и препарат на его основе

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018143840A1 true WO2018143840A1 (ru) 2018-08-09

Family

ID=63040214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000037 WO2018143840A1 (ru) 2017-02-06 2018-01-29 Биоцидный пептид и препарат на его основе

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11059860B2 (ru)
EP (1) EP3578566B1 (ru)
CN (1) CN110650970B (ru)
RU (1) RU2678985C2 (ru)
WO (1) WO2018143840A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11174288B2 (en) 2016-12-06 2021-11-16 Northeastern University Heparin-binding cationic peptide self-assembling peptide amphiphiles useful against drug-resistant bacteria
RU2673807C2 (ru) * 2017-05-05 2018-11-30 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА" Средство, обладающее биоцидным действием
RU2730021C1 (ru) * 2019-10-08 2020-08-14 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" Средство местного применения для лечения инфекционных вагинитов

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2183643C1 (ru) 2000-12-18 2002-06-20 Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Пептид, обладающий биоцидной активностью
RU2415868C1 (ru) 2009-09-10 2011-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180604B1 (en) * 1996-08-21 2001-01-30 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
US6303575B1 (en) * 1998-05-12 2001-10-16 The Regents Of The University Of California Indolicidin analogs and methods of using same
WO2000026344A1 (en) * 1998-10-30 2000-05-11 Interlink Biotechnologies Llc Peptides with enhanced stability to protease degradation
CN100390194C (zh) * 2004-02-27 2008-05-28 沛进生物科技股份有限公司 低溶血性的抗菌胜肽及其使用方法
AU2007288080B2 (en) * 2006-08-21 2013-07-04 The University Of British Columbia Small cationic antimicrobial peptides
CA2691645A1 (en) * 2007-06-25 2008-12-31 Lipopeptide Ab New medical products

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2183643C1 (ru) 2000-12-18 2002-06-20 Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Пептид, обладающий биоцидной активностью
RU2415868C1 (ru) 2009-09-10 2011-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALLOMEDIN: "Allomedin in the radar directory", 30 September 2016 (2016-09-30), pages 1 - 5, XP055622991, Retrieved from the Internet <URL:https://www.rlsnet.ru/pcr_tn_id_40677.htm> *
BROGDEN, N. K.BROGDEN, K. A.: "Will new generations of modified antimicrobial peptides improve their potential as pharmaceuticals?", INT. J. ANTIMICROB. AGENTS, vol. 38, 2011, pages 217 - 225, XP028257948, doi:10.1016/j.ijantimicag.2011.05.004
J.M. STEWARDJ.D. YOUNG: "Solid Phase Peptide Synthesis", 1969, W.H. FREEMAN CO.
MANGONI, M. L.: "Host-defense peptides: from biology to therapeutic strategies", CELL. MOL. LIFE SCI., vol. 68, 2011, pages 2157 - 2159, XP019914570, doi:10.1007/s00018-011-0709-3
RYGE, T. S. ET AL.: "New indolicidin analogues with potent antibacterial activity", JOURNAL OF PEPTIDE RESEARCH, vol. 64, no. 5, 2004, pages 171 - 185, XP002996017 *
SELSTED M.E.NOVOTNY M.J. ET AL.: "Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neu-rophils", J.BIOI.CHEMISTRY, vol. 267, 1992, pages 4292 - 4295
STAUBITZ, PETRA ET AL.: "Structure-function relationships in the tryptophan-rich, antimicrobial peptide indolicidin", JOURNAL OF PEPTIDI SCIENCE, vol. 7, no. 10, 2001, pages 552 - 564, XP009021949, DOI: 10.1002/psc.351 *
TSAI, CHING-WEI ET AL.: "Coupling Molecular Dynamics Simulations with Experiments for the Rational Design of Indolicidin-Analogous Antimicrobial Peptides", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 392, no. 3, 2009, pages 837 - 854, XP055531776 *
YEUNG, A. T. Y.GELLATLY, S. L.HAN-COCK, R. E. W.: "Multifunctional cationic host defense peptides and their clinical applications", CELL. MOL. LIFE SCI., vol. 68, 2011, pages 2161 - 2176, XP019914567, doi:10.1007/s00018-011-0710-x

Also Published As

Publication number Publication date
EP3578566A1 (en) 2019-12-11
RU2678985C2 (ru) 2019-02-05
US20200071358A1 (en) 2020-03-05
CN110650970A (zh) 2020-01-03
EP3578566A4 (en) 2020-02-19
RU2017103887A (ru) 2018-08-06
EP3578566B1 (en) 2023-07-19
EP3578566C0 (en) 2023-07-19
CN110650970B (zh) 2023-06-02
US11059860B2 (en) 2021-07-13
RU2017103887A3 (ru) 2018-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4536918B2 (ja) 免疫調整機能を有するγ−グルタミルとβ−アスパルチル化合物および免疫調節剤
US9273096B2 (en) Amphiphilic peptides comprising the formula I: (X1Y1X2Y2)n, and uses thereof
ES2468250T3 (es) Compuestos antimicrobianos
WO2018143840A1 (ru) Биоцидный пептид и препарат на его основе
JP2010517987A (ja) 塩基性ペプチド及びその複合型抗細菌−抗真菌剤としての使用
WO2017181179A1 (en) Antimicrobial compositions
US9090655B2 (en) Low hemolytic antimicrobial peptide, pharmaceutical composition and use thereof
RU2673807C2 (ru) Средство, обладающее биоцидным действием
IE63842B1 (en) Substitution analogues of magainin peptides
JP2013523661A (ja) 低赤血球溶解性の抗微生物ペプチド、医薬組成物およびその使用
WO2012046922A1 (en) Novel use of antimicrobial peptides in regeneration of skin cells
CN104039824A (zh) 具有抗菌和抗病毒活性的氯高铁血红素之新衍生物
CN112724198A (zh) 一种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗菌肽及其制备方法和应用
CA2122024A1 (en) Pharmaceutical lysine-containing polypeptide compositions and methods of use thereof
CN114349826B (zh) 抗菌肽cgs7及其制备方法和应用
KR102608336B1 (ko) Pep27 펩타이드로부터 유래한 신규 펩타이드 및 이의 용도
CN115010788B (en) N-terminal fatty acid modified low-toxicity broad-spectrum antibacterial peptide analogue with antibacterial film activity and application thereof
CN113698460A (zh) 一种大肠杆菌lipid A结合基元PCK及其制备方法与应用
MX2013008867A (es) Aminoacidos de n-fulereno hidratados, metodo para producir los mismos, y composiciones farmaceuticas con base en los mismos.
CN117126239A (zh) 一种抗铜绿假单胞菌的多肽药物及其应用
CA2127275A1 (en) Pharmaceutical pentapeptide compositions and methods of use thereof
MXPA99007281A (en) Process for preparing synthetic soil-extract materials and medicaments based thereon

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18747340

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018747340

Country of ref document: EP

Effective date: 20190906